KR20170055550A

KR20170055550A - 신규 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170055550A
Application number: KR1020177011035A
Authority: KR
Inventors: 히로노리 나카가미; 류이치 모리시타; 히로시 코리야마; 아키코 텐마
Original assignee: 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2017-05-19
Also published as: US10112978B2; EP3199543A1; JPWO2016047763A1; EP3199543B1; CN106687473B; US20190002505A1; CN106687473A; CA2960653C; AU2015322490B2; US10233215B2; AU2015322490A2; US20170275336A1; WO2016047763A1; KR102498220B1; AU2015322490A1; JP6721901B2; EP3199543A4; CA2960653A1

Abstract

신규 펩타이드를 제공하고, 상기 펩타이드를 유효성분으로서 함유하는 신규의 면역부활제 또는 육모제를 제공한다. 본 발명은 LHRLKRLRKRL(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열, 바람직하게는 LHRLKRLRKRLK(서열번호 9)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 23개 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 상기 펩타이드를 함유하는 면역부활제, 상기 펩타이드를 함유하는 백신용 아주반트, 상기 펩타이드를 함유하는 백신 조성물 및 상기 펩타이드를 함유하는 육모제를 제공한다.

Description

신규 펩타이드 및 이의 용도{NOVEL PEPTIDE AND USE THEREOF}

본 발명은 신규 펩타이드 및 상기 펩타이드를 포함하는 면역부활제(immunostimulator), 백신용 아주반트, 백신 조성물 또는 육모제에 관한 것이다.

아주반트는 항원과 혼합하여 생체에 투여함으로써, 투여한 항원에 대한 면역응답을 증강시키는 물질이다. 아주반트에는 Th1 타입의 반응을 유도하는 것이거나 Th2 타입의 반응을 유도하는 것, 또는 Th1 타입과 Th2 타입 모두를 유도하는 것이 있다. 백신 치료에는 일반적으로 아주반트가 필요하며, 항원을 숙주에게 인식시키기 쉽게 하는 한편, 장기간 국소에 체류하는 성능이 요구된다. 아주반트는 염증을 야기하는 성격이 있기 때문에, 투여 부위의 통증, 종창(腫脹) 등의 부반응이 자주 문제가 되고 있어, 지금까지 임상 응용된 백신 중에도 자주 투여 부위의 부반응이 문제로서 다뤄지고 있다. 예로부터 알럼(수산화알루미늄)이 아주반트로서 사용되고 있으나, 안전성은 비교적 높지만 백신의 효율 향상을 위하여는 더욱 유효한 아주반트가 요구되고 있다.

연령의 증가, 유전적 소인, 사회적 스트레스 등의 원인에 의한 탈모증으로 고민하고 있는 사람은 많고, 발모를 촉진하는 육모제나, 탈모를 방지하는 항탈모제 등이 종종 개발되고 있다.

예를 들면, 특정의 서열을 갖는 대두 단백 유래의 펩타이드를 유효성분으로서 포함하는 항탈모제가 알려져 있다(특허문헌 1).

본 발명자들은, 이전에 혈관신생작용과 항균작용을 동시에 갖는 펩타이드로서, 30 아미노산 잔기로 이루어진 AG30(비특허문헌 1, 특허문헌 2)을 발견하고, 이것에 변경을 가하여 혈관신생작용 및 항균작용의 개량을 수행해 왔다(비특허문헌 2, 특허문헌 3, 특허문헌 4, 특허문헌 5, 특허문헌 6).

특허문헌 1: 일본 특허공개 2008-247874호 공보 특허문헌 2: 국제공개 제2005/090564호 특허문헌 3: 국제공개 제2010/061915호 특허문헌 4: 국제공개 제2010/101237호 특허문헌 5: 국제공개 제2010/137594호 특허문헌 6: 일본 특허공개 2012-14583호 공보

비특허문헌 1: J. Cell. Mol. Med., 2008; 13: 535-46 비특허문헌 2: J. Cell. Mol. Med. Vol 16, No 7, 2012, pp. 1629-1639

본 발명은 면역부활 작용 또는 육모·발모촉진 작용을 갖는 신규 단쇄 펩타이드를 제공하고, 상기 펩타이드를 함유하는 신규의 면역부활제, 백신용 아주반트, 백신 조성물 또는 육모제를 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, AG30을 더욱 변경함으로써 면역부활 작용 또는 육모·발모촉진 작용을 갖는 23개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 펩타이드를 발견하여, 본 발명을 완성시켰다. 본 발명은 이하의 각 발명을 포함한다.

[1] LHRLKRLRKRL(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 23개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩타이드.

[2] LHRLKRLRKRLK(서열번호 9)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 [1]에 기재된 펩타이드.

[3] ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(서열번호 2)의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 펩타이드.

[4] C 말단이 아미드화된 상기 [1] ∼ [3] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드.

[5] N 말단이 아세틸화된 상기 [1] ∼ [4] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드.

[6] 상기 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드를 함유하는 면역부활제.

[7] 백신용 아주반트인, 상기 [6]에 기재된 면역부활제.

[8] 상기 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드 및 적어도 하나의 항원을 함유하는 백신 조성물.

[9] 상기 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드를 함유하는 육모제.

[10] 포유동물에 대하여, 상기 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 면역부활방법.

[11] 포유동물에 대하여, 상기 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 백신 항원의 면역원성 증강 방법.

[12] 면역응답을 부활화시키기 위하여 사용하는 상기 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드.

[13] 백신 항원의 면역원성을 증강시키기 위하여 사용하는 상기 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드.

[14] 면역부활제, 백신용 아주반트 또는 백신 조성물을 제조하기 위한 상기 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드의 사용.

[15] 포유동물에 대하여, 상기 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 육모 또는 발모촉진 방법.

[16] 육모 또는 발모를 촉진하기 위하여 사용하는 상기 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드.

[17] 육모제를 제조하기 위한 상기 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 펩타이드의 사용.

본 발명은 신규 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 신규 펩타이드는 면역부활 작용 및 육모·발모촉진 작용을 갖는다. 본 발명의 신규 펩타이드는 선행 특허 등에 기재되어 있는 유사 펩타이드와 비교하여 현저하게 강한 면역부활 작용을 갖는다. 또한, 상기 펩타이드를 함유하는 신규의 면역부활제, 백신용 아주반트, 백신 조성물 및 육모제를 제공할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 사이토카인의 산생 유도 작용, T세포 활성화 공자극(costimulatory) 분자의 발현 유도 작용, 인플라마좀(inflammasome) 활성화 작용을 갖고, 면역부활제로서 유용하다. 또한, 백신 항원의 면역원성 증강 작용을 갖고, 백신용 아주반트로서 특히 유용하다. 본 발명의 펩타이드를 포함하는 백신용 아주반트는 감염증, 암, 생활습관병 등에 대한 각종 백신 요법에 있어서 효율이 좋은 아주반트로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 아미노산 잔기수가 23 이하의 단쇄 펩타이드는 고효율의 합성법이나 검정법이 확립되어 있기 때문에, 저렴한 비용으로 양산이 가능하다는 장점을 가지고 있다.

본 발명의 펩타이드는 모유두세포 증식 작용 및 모유두세포에 대한 증식 인자 산생 촉진 작용을 가지며, 육모제, 발모촉진제 등으로서 유용하다. 본 발명자 등은 30 아미노산 잔기로 이루어진 AG30에 변경을 가하여 복수의 펩타이드를 합성한 바, 모유두세포 증식 작용 및 모유두세포에 대한 증식 인자의 산생 촉진 작용에 있어서는 본 발명의 펩타이드가 현저하게 강한 활성을 가지고 있다. 또한, 유효성분인 아미노산 잔기수가 23 이하의 단쇄 펩타이드는 고효율의 합성법이나 검정법이 확립되어 있기 때문에, 저렴한 비용으로 양산이 가능하다는 장점을 가지고 있다.

도 1은 LPS로 프라이밍한 THP-1 세포에 OSK-1을 첨가했을 때의 배양 상등액 중의 사이토카인 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 IL-1β, (B)가 IL-18, (C)가 TNFα, (D)가 IL-6의 결과이다.
도 2는 PMA로 분화시킨 THP-1 세포에 OSK-1을 첨가했을 때의 배양 상등액 중의 사이토카인 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 IL-1β, (B)가 IL-18, (C)가 TNFα, (D)가 IL-6의 결과이다.
도 3은 THP-1 세포에 OSK-1, AAP-1∼AAP-6을 첨가했을 때의 CD86 및 CD54의 발현량을 측정한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 CD86, (B)가 CD54의 결과이다.
도 4는 THP-1 세포에 AAP-6, AAP-11 및 AAP-12를 첨가했을 때의 CD86 및 CD54의 발현량을 측정한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 CD86, (B)가 CD54의 결과이다.
도 5는 NLRP3의 발현 수준을 웨스턴 블롯에 의해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 NLRP3에 대한 siRNA 또는 컨트롤 siRNA를 트랜스팩션한 THP-1 세포를 사용하여, OSK-1을 10 μg/mL의 농도로 첨가했을 때의 IL-1β 및 TNFα 산생량을 비교한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 IL-1β, (B)가 TNFα의 결과이다.
도 7은 LPS에 의한 THP-1 세포의 프라이밍 유무에 의한, OSK-1의 IL-1β 산생 작용을 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 카텝신 B(cathepsin B)의 저해제 및 카스페이스-1(caspase-1)의 저해제 유무에 의한, OSK-1의 IL-1β 산생 작용을 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 개에 있어서의 OSK-1의 아주반트 효과를 프로인트 아주반트(FA)의 효과와 비교한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 OSK-1군, (B)가 FA군의 결과이다.
도 10은 마우스에 있어서의 OSK-1의 아주반트 효과를, Alum, 프로인트 아주반트(FA)의 아주반트 효과와 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 인간 모유두세포에 OSK-1, AAP-1∼AAP-6을 작용시켜, 배양 상등액 중의 성장 인자 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 KGF, (B)가 HGF, (C)가 VEGF의 결과이다.
도 12는 THP-1 세포에 대한 OSK-1과 유사 펩타이드의 CD54 발현 유도 작용을 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 OSK-1의 MS 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 OSK-1의 HPLC 해석 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 PMA로 분화시킨 THP-1 세포에 OSK-1을 첨가했을 때의 배양 상등액 중의 사이토카인, 케모카인 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 IL-1β, (B)가 IL-18, (C)가 TNFα, (D)가 IL-6, (E)가 RANTES, (F)가 MIP-1α, (G)가 MIP-1β의 결과이다.
도 16은 LPS로 프라이밍한 RAW264.7 세포에 OSK-1을 첨가했을 때의 배양 상등액 중의 사이토카인 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 IL-1β, (B)가 IL-18, (C)가 TNFα, (D)가 IL-6의 결과이다.
도 17은 마우스 골수 유래 수지상 세포에 OSK-1을 첨가했을 때의 배양 상등액 중의 사이토카인 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 IL-1β, (B)가 IFNγ, (C)가 TNFα, (D)가 IL-6, (E)가 IL-12p70의 결과이다.
도 18은 LPS로 프라이밍한 THP-1 세포에 OSK-1, Alum 또는 CpG 뉴클레오티드를 첨가했을 때의 배양 상등액 중의 사이토카인 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 IL-1β, (B)가 IL-18, (C)가 TNFα, (D)가 IL-6의 결과이다.
도 19는 THP-1 세포에 OSK-1 또는 Alum을 첨가했을 때의 CD86 및 CD54의 발현량을 측정한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 CD86, (B)가 CD54의 결과이다.
도 20은 THP-1 세포에 대한 OSK-1의 NFκB의 활성화 작용을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 21은 OSK-1-안지오텐신II 컨쥬게이트 백신을 마우스에 투여하여 항체 산생 작용을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 22는 OSK-1-안지오텐신II 컨쥬게이트 백신을 마우스에 투여하여 산생된 항체의 서브타입을 해석한 결과를 나타내는 도면이며, (A)는 10배 희석 혈청을 사용한 결과, (B)는 50배 희석 혈청을 사용한 결과이다.
도 23은 인간 모유두세포에 OSK-1, AAP-11을 작용시켜, 배양 상등액 중의 성장 인자 농도를 측정한 결과를 나타내는 도면이며, (A)가 KGF, (B)가 HGF, (C)가 VEGF의 결과이다.
도 24는 마우스에 있어서의 OSK-1의 육모 작용을 확인한 결과를 나타내는 도면이며, (A)는 Day 17의 피모(皮毛)의 길이, (B)는 발모 스코어의 결과를 나타내는 도면이다.

[펩타이드]

본 발명은 LHRLKRLRKRL(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 23개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩타이드(이하, 이들을 단지 "본 발명의 펩타이드"라고도 한다.)를 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 있으면 좋다.

본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 또는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단측, C 말단측, 또는 N 말단측 및 C 말단측에 1 이상의 아미노산이 부가된 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드이다. 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단측에 F, IF, LIF, KLIF, LKLIF, ELKLIF 등의 아미노산 서열이 부가된 아미노산 서열을 포함하고 있어도 좋다. 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C 말단측에 K, KR, KRK, KRKL, KRKLR, KRKLRL, KRKLRLW, KRKLRLWH, KRKLRLWHR, KRKLRLWHRK, KRKLRLWHRKR, KRKLRLWHRKRY 등의 아미노산 서열이 부가된 아미노산 서열을 포함하고 있어도 좋다.

본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C 말단측에 K가 부가된 서열, 즉 LHRLKRLRKRLK(서열번호 9)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 23개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 바람직하다. 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열의 C 말단의 K는 L체인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 펩타이드는 LHRLKRLRKRL(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 23개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이며, ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(서열번호 2)의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 더욱 바람직하다. 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드이다. 더욱 바람직한 펩타이드로는, 서열번호 2, 3 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 및 이들 서열을 포함하는 펩타이드가 포함된다.

본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 ELKLIFLHRLKRLRKRLKRKLRLWHRKRY(서열번호 14)로 표시되는 아미노산 서열 중 23개 이하의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드가 더욱 바람직하다.

본 발명의 펩타이드에 아미노산 개수의 하한치는 11개이며, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개이어도 좋다. 본 발명의 펩타이드에 아미노산 개수의 상한치는 23개이며, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개이어도 좋다.

LHRLKRLRKRL(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열의 C 말단의 『L』, 『RL』 또는 『KRL』이 본 발명의 펩타이드의 면역부활 작용 또는 육모 작용에 큰 영향을 준다.

LHRLKRLRKRL(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단의 『L』이 본 발명의 펩타이드의 면역부활 작용 또는 육모 작용에 큰 영향을 준다.

본 발명의 펩타이드는 ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(서열번호 2), ELKLIFLHRLKRLRKRLK(서열번호 3), LKLIFLHRLKRLRKRLKR(서열번호 6), KLIFLHRLKRLRKRLK(서열번호 7), LIFLHRLKRLRKRL(서열번호 8), FLHRLKRLRKRL(서열번호 10) 등으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 펩타이드는 ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(서열번호 2), ELKLIFLHRLKRLRKRLK(서열번호 3), LKLIFLHRLKRLRKRLKR(서열번호 6), KLIFLHRLKRLRKRLK(서열번호 7), LIFLHRLKRLRKRL(서열번호 8), FLHRLKRLRKRL(서열번호 10) 등으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 펩타이드는 ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(서열번호 2), ELKLIFLHRLKRLRKRLK(서열번호 3), LKLIFLHRLKRLRKRLKR(서열번호 6), KLIFLHRLKRLRKRLK(서열번호 7)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 것이 더욱 특히 바람직하다.

본 발명의 펩타이드는 ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(서열번호 2), ELKLIFLHRLKRLRKRLK(서열번호 3), LKLIFLHRLKRLRKRLKR(서열번호 6)로 이루어진 펩타이드인 것이 더욱 특히 바람직하다.

본 발명의 펩타이드는 C 말단이 카르복실기(-COOH), 카르복실레이트(-COO^-), 아미드(-CONH₂) 또는 에스테르(-COOR)의 어느 것이어도 좋다. 에스테르에 있어서의 R로는 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 혹은 n-부틸 등의 C_1-6 알킬기, 예를 들면, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C_3-8 시클로알킬기, 예를 들면, 페닐, α-나프틸 등의 C_6-12 아릴기, 예를 들면, 벤질, 페네틸 등의 페닐-C_1-2 알킬기 혹은 α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C_1-2 알킬기 등의 C_7-14 아르알킬기 외에, 경구용 에스테르로서 범용되는 피발로일옥시메틸기 등을 들 수 있다. 아미드체로는 아미드, C_1-6 알킬기의 1개 또는 2개로 치환된 아미드, 페닐기로 치환된 C_1-6의 알킬기의 1개 또는 2개로 치환된 아미드, 아미드기의 질소 원자를 포함하여 5 내지 7원환의 아자시클로알칸을 형성하는 아미드 등을 들 수 있다. 본 발명의 펩타이드가 C 말단 이외에 카르복실기 또는 카르복실레이트를 가지고 있는 경우, 이들 기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것도 본 발명의 펩타이드에 포함된다. 본 발명의 펩타이드는 C 말단이 아미드화된 것이 바람직하다.

본 발명의 펩타이드는, N 말단의 아미노기가 보호기(예를 들면, 포르밀기, 아세틸 등의 C_2-6 알카노일기 등의 C_1-6 아실기 등)로 보호되어 있는 것, N 말단측이 생체내에서 절단되어 생성되는 글루타밀기가 피로글루타민산화한 것, 분자내의 아미노산의 측쇄상의 치환기(예를 들면, -OH, -SH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등)이 적당한 보호기(예를 들면, 포르밀기, 아세틸기 등의 C_2-6 알카노일기 등의 C_1-6 아실기 등)로 보호되어 있는 것도 포함된다. 본 발명의 펩타이드는 N 말단이 아세틸화된 것이 바람직하다. 본 발명의 펩타이드는 N 말단이 아세틸화되고 또한 C 말단이 아미드화된 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 펩타이드를 구성하는 아미노산은 측쇄가 임의의 치환기로 수식되고 있어도 좋다. 치환기는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 불소원자, 염소원자, 시아노기, 수산기, 니트로기, 알킬기, 시클로알킬기, 알콕시기, 아미노기, 인 산기 등을 들 수 있다. 또한, 측쇄의 치환기는 보호기로 보호되어 있어도 좋다. 또한, 당쇄가 결합한 당 펩타이드도 본 발명의 펩타이드에 포함된다.

본 발명의 펩타이드는 염을 형성해도 좋고, 상기 염으로는 생리학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 생리학적으로 허용되는 염으로는, 예를 들면, 염산, 황산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 옥살산, 사과산, 구연산, 올레인산, 팔미트산, 질산, 인산, 트리플루오로초산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 산과의 염; 나트륨, 칼륨, 칼슘 등의 알칼리 금속 혹은 알칼리 토금속의, 또는 알루미늄의 수산화물 또는 탄산염과의 염; 트리에틸아민, 벤질아민, 디에탄올아민, t-부틸아민, 디시클로헥실아민, 아르기닌 등과의 염 등을 들 수 있다. 이 중에서도 염산염, 초산염, 트리플루오로초산염이 더욱 바람직하다.

본 발명의 펩타이드는, 원래의 펩타이드 특성이 보유되는 한, 비천연 아미노산을 포함해도 좋다. 또한, 본 발명의 펩타이드는, 원래의 펩타이드 특성이 보유되는 한, 펩타이드에 다른 물질을 연결해도 좋다. 펩타이드에 연결가능한 다른 물질로는, 예를 들면, 지질, 당 또는 당쇄, 아세틸기, 천연 또는 합성의 폴리머 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는, 원래의 펩타이드 특성이 보유되는 한, 펩타이드에 당쇄 부가, 측쇄 산화, 인산화 등의 수식을 해도 좋다.

본 발명의 펩타이드는, 공지의 일반적인 펩타이드 합성의 프로토콜을 따라, 고상합성법(Fmoc법, Boc법) 또는 액상합성법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터를 도입한 형질전환체를 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드를 일부에 포함하는 펩타이드를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터를 도입한 형질전환체를 사용하여 펩타이드를 취득하고, 이를 적당한 프로테아제나 펩티다아제로 절단함으로써 제조할 수 있다. 또한, in vitro 전사·번역계를 사용하는 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 사이토카인의 산생 유도 작용, T세포 활성화 공자극(costimulatory) 분자의 발현 유도 작용, 인플라마좀(inflammasome)의 활성화 작용을 가지며, 면역부활제로서 유용하다. 백신용 아주반트로서 특히 유용하다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 모유두세포 증식 작용, 모유두세포에 대한 증식 인자 산생 촉진 작용 등을 가지며, 육모, 양모, 발모촉진에 유용하다.

[면역부활제]

본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로서 함유하는 면역부활제를 제공한다. 바람직하게는 백신용 아주반트를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 함유하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 면역부활제는 본 발명의 펩타이드를 적어도 하나 포함한다. 면역부활을 위하여 사용되는 다른 유효성분을 추가로 포함하고 있어도 좋다. 본 발명의 펩타이드는 면역부활을 위하여 사용되는 다른 유효성분과 조합하여 사용함으로써, 상가적 또는 상승적인 면역부활 작용의 향상을 기대할 수 있다.

또한, 본 발명의 면역부활제는 단독으로 또는 다제와 병용하여 각종 질환을 치료할 수 있다. 예를 들면, 항암제와 병용하여 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 면역부활제는 예를 들면, 사이토카인의 산생 유도 작용, T세포 활성화 공자극 분자의 발현 유도 작용, 인플라마좀의 활성화 작용 등을 가짐으로써, 우수한 면역부활 작용을 나타낸다. 또한, 본 발명의 면역부활제는 Th1 타입, Th2 타입 모두의 면역응답을 부활화하는 점에서 유용하다.

또한, 본 발명의 면역부활제는 백신 항원의 면역원성 증강 작용을 가지며, 우수한 백신용 아주반트로서 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 백신용 아주반트는 본 발명의 펩타이드를 적어도 하나 포함한다. 본 발명의 백신용 아주반트는 다른 아주반트 또는 면역부활을 위하여 사용되는 다른 유효성분을 추가로 포함하고 있어도 좋다. 본 발명의 펩타이드는 아주반트 또는 면역부활을 위하여 사용되는 다른 유효성분과 조합하여 사용함으로써, 상가적 또는 상승적인 아주반트 작용 또는 면역부활 작용의 향상을 기대할 수 있다. 아주반트 또는 면역부활을 위하여 사용되는 다른 유효성분으로는, Alum, 프로인트 아주반트(Freund's Adjuvant, 완전 프로인트 아주반트, 불완전 프로인트 아주반트), TLR 부활제(크레스틴, 리포폴리사카라이드, 플라젤린, CpG 뉴클레오티드) 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 백신용 아주반트는 적어도 하나의 항원을 포함하는 백신과 별도로 포장되어, 사용시 혼합되는 키트 제제이어도 좋다.

백신은 한정되는 것이 아니며, 감염증 예방 백신, 암 백신, 질환의 요인이 되는 생체내 단백질에 대한 면역을 유도하는 백신 등의 모든 백신의 면역원성 증강을 위하여, 본 발명의 백신용 아주반트를 바람직하게 사용할 수 있다. 감염증 예방 백신으로는 인플루엔자, 폴리오, 일본뇌염, 결핵균, 인간 파필로마, 말라리아, SARS, 장티푸스, 파라티푸스, 페스트, 백일해, 발진 티푸스 등의 감염증용 백신을 들 수 있다. 암 백신의 암 항원 또는 암 항원 펩타이드로는, 예를 들면, WT1 펩타이드, MAGE 펩타이드, MUC1 펩타이드, 서바이빈(survivin) 등을 들 수 있다. 질환의 요인이 되는 생체내 단백질로는, 아밀로이드β, 안지오텐신II, DPPIV, IgE, IL-17, PD-1, PD-L1 등을 들 수 있다. 항원은 에피토프 서열과 캐리어 단백질(예를 들면 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH) 등)이 결합한 형태이어도 좋다.

백신용 아주반트로서 특히 바람직한 펩타이드는 서열번호 2, 3, 6, 7, 8 및 10의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이며, 서열번호 2, 3, 6 및 7의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 보다 바람직하고, 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 더욱 바람직하다. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 더욱 바람직하다. 또한, N 말단이 아세틸화되고 또한 C 말단이 아미드화된 펩타이드가 더욱 바람직하다. 본 발명의 백신용 아주반트는, 종래의 알럼이나 유성 아주반트와 비교하여, 동통이나 경결(硬結) 등의 바람직하지 않은 작용이 발생하기 어려운 것으로 생각된다.

또한, 본 발명의 면역부활제는 인간이나 다른 포유동물 등의 조직이나 세포를 그의 체외로 꺼내어 부활화하고, 부활화한 조직이나 세포를 치료 등으로 사용하는 방법에도 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, 암 환자의 단구세포를 꺼내고, 세포의 증식 인자, GM-CSF, IL-4 등을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수지상 세포를 유도하고, 암 항원 또는 암 항원 펩타이드를 수지상 세포에 넣어 체내로 되돌리는 치료방법에 있어서, 암 항원 또는 암 항원 펩타이드와 함께 본 발명의 면역부활제를 사용할 수 있다. 이때에, 아주반트 또는 면역부활을 위하여 사용되는 다른 유효성분과 조합하여 사용할 수 있다. 암 항원 또는 암 항원 펩타이드로는 예를 들면, WT1 펩타이드, MAGE 펩타이드, MUC1 펩타이드, 서바이빈 등을 들 수 있다.

[백신 조성물]

본 발명의 백신 조성물은 적어도 하나의 상기 본 발명의 펩타이드와 적어도 하나의 항원을 포함한다. 상기 백신 조성물은 적어도 하나의 본 발명의 펩타이드와 적어도 하나의 항원이 배합되어 있는 제제의 태양, 및 적어도 하나의 본 발명의 펩타이드와 적어도 하나의 항원이 연결된 연결체를 포함하는 제제의 태양이 포함된다. 연결체로서 예를 들면, 본 발명의 펩타이드와 항원이 1개의 폴리펩타이드가 되어 연결되어 있는 태양을 들 수 있다. 상기 연결체는 항원과 본 발명의 펩타이드가 직접 연결되어도 좋고 또한 스페이서 등을 매개로 연결되어도 좋다. 스페이서로는, 예를 들면 ε-아미노카프론산을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것이 아니다. 스페이서와 본 발명의 펩타이드 혹은 항원 펩타이드를 결합하는 방법은 아미드 결합, 디설피드 결합을 사용할 수 있다. 또한, PEG 또는 임의의 올리고펩타이드를 스페이서로 하는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명의 백신 조성물에 포함되는 항원은 특별히 한정되지 않는다. 상술한 감염증 예방 백신, 암 백신, 질환의 요인이 되는 생체내 단백질에 대한 면역을 유도하는 백신 등의 모든 백신에 사용가능한 항원이라면, 어떠한 항원도 본 발명의 백신 조성물에 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 항원에는 에피토프 서열의 펩타이드를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 항원은 캐리어 단백질과 결합한 형태이어도 좋다. 본 명세서에 있어서, 백신의 항원으로서 사용되는 항원을 「백신 항원」이라고 칭한다.

[사이토카인의 산생 유도제, T세포 활성화 공자극 분자의 발현 유도제, 인플라마좀의 활성화제]

본 발명의 면역부활제는 예를 들면, 사이토카인의 산생 유도 작용, T세포 활성화 공자극 분자의 발현 유도 작용, 인플라마좀의 활성화 작용 등을 가짐으로써, 우수한 면역부활 작용을 나타낸다. 이 때문에, 본 발명의 면역부활제는 사이토카인의 산생 유도제, T세포 활성화 공자극 분자의 발현 유도제, 인플라마좀의 활성화제 등을 포함하는 것이다.

본 발명의 펩타이드의 사이토카인 산생 유도 작용을 확인하는 방법으로는, 예를 들면 실시예 2 및 3에 기재된 방법 등을 들 수 있다. 본 발명의 펩타이드의 T세포 활성화 공자극 분자의 발현 유도 작용을 확인하는 방법으로는 예를 들면 실시예 4에 기재된 방법 등을 들 수 있다. 본 발명의 펩타이드의 인플라마좀의 활성화 작용을 확인하는 방법으로는 예를 들면 실시예 5 및 6에 기재된 방법 등을 들 수 있다. 본 발명의 펩타이드의 아주반트 작용을 확인하는 방법으로는 예를 들면 상기 면역부활 작용(실시예 2∼6) 및 실시예 7 및 8에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

사이토카인의 산생 유도제에는 적어도 하나의 본 발명 펩타이드가 포함된다. 특히 바람직한 펩타이드는 서열번호 2, 3, 6, 7, 8 및 10의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 더욱 바람직하다. 또한, N 말단이 아세틸화되고 또한 C 말단이 아미드화된 펩타이드가 더욱 바람직하다.

본 명세서에 있어서, 사이토카인은 예를 들면, IL-1β, IL-18, TNFα, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-γ, IFN-α, IL-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, iNOS, IL-17, IL-23 등을 들 수 있고, IL-1β, IL-18, TNFα, IL-6 등인 것이 바람직하다.

T세포 활성화 공자극 분자의 발현 유도제에는 적어도 하나의 본 발명 펩타이드가 포함된다. 특히 바람직한 펩타이드는 서열번호 2, 3, 6, 7, 8 및 10의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이며, 서열번호 2, 3, 6 및 7의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 더욱 바람직하고, 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 더욱 바람직하다. 또한, N 말단이 아세틸화되고 또한 C 말단이 아미드화된 펩타이드가 더욱 바람직하다.

본 명세서에 있어서, T세포 활성화 공자극 분자는 예를 들면, CD86, CD54, CD80, CD106, CD40 등을 들 수 있고, CD86, CD54 등인 것이 바람직하다.

인플라마좀의 활성화제에는 적어도 하나의 본 발명 펩타이드가 포함된다. 특히 바람직한 펩타이드는 서열번호 2, 3, 6, 7, 8 및 10의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 더욱 바람직하다. 또한, N 말단이 아세틸화되고 또한 C 말단이 아미드화된 펩타이드가 더욱 바람직하다.

본 발명의 면역제어제, 백신용 아주반트 또는 백신 조성물은 상기 본 발명의 펩타이드를 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 적절히 배합하여 제제화할 수 있다. 구체적으로는 정제(당의정을 포함한다), 피복 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 액제, 현탁제, 유제 등의 경구제; 주사제(예를 들면, 피하 주사제, 정맥내 주사제, 근육내 주사제, 복강내 주사제), 수액, 점적제, 외용제(예를 들면, 경비투여제제, 경피제제, 연고제), 좌제(예를 들면, 직장좌제, 질좌제), 연고, 패치제, 액제 등의 비경구제로 할 수 있다.

경구용 고형제(정제, 환제, 캡슐제, 산제, 과립제 등)는 유효성분을 부형제(락토오스, 만니톨, 글루코오스, 미결정 셀룰로오스, 전분 등), 결합제(히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루민산마그네슘 등), 붕해제 (섬유소 글리콜산 칼슘 등), 활택제(스테아린산마그네슘 등), 안정제, 용해 보조제(글루타민산, 아스파라긴산 등) 등과 혼합하고, 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있다. 필요에 따라, 코팅제(백당, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트 등)로 피복해도 좋고, 또한 2 이상의 층으로 피복해도 좋다.

경구용 액제(수제, 현탁제, 유제, 시럽제, 엘릭서제 등)는 유효성분을 일반적으로 사용되는 희석제(정제수, 에탄올 또는 이들의 혼합액 등)에 용해, 현탁 또는 유화하여 제제화된다. 또한, 이러한 액제는 습윤제, 현탁화제, 유화제, 감미제, 풍미제, 방향제, 보존제, 완충제 등을 함유하고 있어도 좋다.

비경구제로는 예를 들면 피부 외용제를 들 수 있다. 피부 외용제는 액제, 크림제, 연고제, 겔제, 에어로졸제 등에 적용할 수 있으나, 외용에 적합한 제형이라면 이들에 한정되는 것은 아니다.

피부 외용제에는, 필요에 따라, 물, 저급 알코올, 용해 보조제, 계면활성제, 유화 안정화제, 겔화제, 점착제, 기타 소망하는 제형을 얻기 위하여 통상 사용되는 기제 성분을 배합할 수 있고, 사용 목적에 따라 혈관확장제, 부신피질호르몬, 보습제, 살균제, 청량화제, 비타민류, 향료, 색소 등을 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위에서 적절히 배합하는 것도 가능하다.

비경구제로는 예를 들면 주사제를 들 수 있다. 주사제는 용액, 현탁액, 유탁액, 및 사용시 용제에 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형의 주사제를 포함한다. 주사제는 유효성분을 용제에 용해, 현탁 또는 유화하여 제제화된다. 용제로서 예를 들면 주사용 증류수, 생리식염수, 식물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올과 같은 알코올류 등 및 이들의 조합을 사용할 수 있다. 또한, 이러한 주사제는 안정제, 용해 보조제(글루타민산, 아스파라긴산, 폴리소르베이트 80(등록상표) 등), 현탁화제, 유화제, 무통화제, 완충제, 보존제 등을 포함해도 좋다. 이들은 최종 공정에 있어서 멸균하거나 무균조작법에 의해 제조된다. 또한 무균의 고형제, 예를 들면 동결건조품을 제조하고, 그 사용 전에 무균화 또는 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용제에 용해하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 면역부활제, 백신용 아주반트 및 백신 조성물의 제제화에 사용하는 담체 또는 첨가제의 배합 비율에 대해서는, 의약품 분야에 있어서 통상 채용되는 범위에 근거하여 적절히 설정하면 좋다. 배합할 수 있는 담체 또는 첨가제는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 물, 생리식염수, 기타의 수성 용매, 수성 또는 유성 기제 등의 각종 담체; 부형제, 결합제, pH 조정제, 붕해제, 흡수촉진제, 활택제, 착색제, 교미제, 향료 등의 각종 첨가제를 들 수 있다.

정제, 캡슐제 등에 혼화할 수 있는 첨가제로는 예를 들면, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라가칸트, 아라비아검과 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수 전분, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아린산마그네슘과 같은 윤활제, 수크로오스, 유당 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 가울테리아 아데노쓰릭스(Gaultheria adenothrix) 오일 및 체리와 같은 향미제 등을 사용할 수 있다. 조제단위형태가 캡슐일 경우에는, 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균 조성물은 통상의 제제 업무(예를 들면 유효성분을 주사용수, 천연 식물유 등의 용매에 용해 또는 현탁시키는 등)에 따라 조제할 수 있다. 주사용 수성액으로는 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타의 보조약을 포함하는 등장액(예를 들면, D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등을 사용할 수 있으며, 적당한 용해 보조제, 예를 들면, 알코올(예, 에탄올), 폴리알코올(예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제(예, 폴리소르베이트 80^TM, HCO-50) 등과 병용해도 좋다. 유성액으로는 예를 들면 참깨유, 대두유 등을 사용할 수 있으며, 용해 보조제인 안식향산벤질, 벤질알코올 등과 병용해도 좋다. 또한, 완충제(예를 들면, 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제(예를 들면, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제(예를 들면, 벤질알코올, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 좋다.

이렇게 하여 얻어지는 제제는, 예를 들면, 인간이나 다른 포유동물(예를 들면, 랫트, 마우스, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등)에 대하여 투여할 수 있다.

투여량은 투여대상, 대상질환, 투여경로 등에 의해 상이하나, 예를 들면, 경구투여하는 경우, 일반적으로 성인(체중 60 kg으로서)에 있어서는 1일당 유효성분을 약 0.1∼100 mg, 바람직하게는 약 1.0∼50 mg, 더욱 바람직하게는 약 1.0∼20 mg 투여한다. 예를 들면, 주사제의 형태로 비경구적으로 투여하는 경우, 일반적으로 성인(체중 60 kg으로서)에 있어서는 1일당 유효성분을 약 0.01∼30 mg 정도, 바람직하게는 약 0.1∼20 mg 정도, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼10 mg 정도를 정맥내 투여한다. 1일당의 총투여량은 단일 투여량이어도 분할 투여량이어도 좋다.

본 발명의 면역부활제, 백신용 아주반트 또는 백신용 조성물의 투여 방법으로는 경피 투여, 경점막 투여, 경구 투여, 피하 주사, 피내 주사, 근육내 주사 등을 들 수 있으나, 피내 주사, 근육내 주사가 더욱 바람직하다. 본 발명의 백신용 아주반트와 백신 항원을 병용하여 투여할 경우, 백신 항원의 투여는 본 발명의 백신용 아주반트와 동시에 투여해도 좋고, 본 발명의 백신용 아주반트를 투여한 후에 백신 항원을 투여해도 좋고, 본 발명의 백신용 아주반트를 투여하기 전에 백신 항원을 투여해도 좋다.

[육모제]

본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로서 함유하는 육모제를 제공한다. 본 발명의 육모제는 예를 들면, 모유두세포 증식 작용, 모유두세포에 대한 증식 인자 산생 촉진 작용, 양모 작용, 발모촉진 작용, 발모 작용, 증모 작용 등을 가짐으로써 우수한 육모 작용을 나타낸다. 이 때문에, 본 발명의 육모제는 모유두세포 증식제, 모유두세포에 대한 증식 인자 산생 촉진제, 양모제, 발모촉진제, 발모제, 증목제 등으로 환언할 수 있다. 본 발명의 육모제는 화장품, 의약부외품, 의약품, 식음료, 서플리먼트 등의 태양으로 실시할 수 있다.

본 발명의 육모제, 모유두세포 증식제, 모유두세포에 대한 증식 인자 산생 촉진제, 양모제, 발모촉진제, 발모제, 또는 증모제는 적어도 하나의 본 발명 펩타이드를 함유한다. 특히 바람직한 펩타이드는 서열번호 2, 3, 6, 7 및 8의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드이며, 서열번호 2, 3, 6 및 7의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 더욱 바람직하고, 서열번호 2, 3, 및 6의 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 더욱 바람직하고, 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 더욱 바람직하다. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 더욱 바람직하다. 또한, N 말단이 아세틸화되고 또한 C 말단이 아미드화된 펩타이드가 더욱 바람직하다.

본 명세서에 있어서, 증식 인자는 예를 들면, KGF(케라티노사이트 증식 인자, keratinocyte growth factor), HGF(간세포 증식 인자, hepatocyte growth factor), VEGF(혈관내피세포 증식 인자, vascular endothelial growth factor), IGF(Insulin growth factor), EGF(Epithelial growth factor), FGF(Fibroblast growth factor), PDGF(Platelet derived growth factor), TGF β1(Transforming growth factor β1) 등을 들 수 있고, KGF, HGF, VEGF 등인 것이 바람직하다.

본 발명의 육모제가 화장품 또는 의약부외품의 태양일 경우, 형태는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 피부 외용제, 샴푸, 컨디셔너, 트리트먼트, 헤어 케어제, 스타일링제의 형태로 할 수 있다.

본 발명의 육모제가 화장품 또는 의약부외품의 경우, 본 발명의 펩타이드 이외에 화장품 또는 의약부외품으로서 일반적으로 사용되는 성분, 예를 들면, 유분, 습윤제, 보습제, 유화제, 자외선흡수제, 계면활성제, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 증점제, 충진제, 금속이온 봉쇄제, 차광제(sunscreen agent), 소포제, 유연제, 착색제, 방부제, 추진제, 산성화 또는 염기성화제, 실리콘, 비타민, 염료, 안료, 나노 안료, 향료, 알코올 등의 유기용매, 물 등을 목적에 따라 적절히 배합할 수 있다.

화장품 또는 의약부외품의 바람직한 형태로서 피부 외용제를 들 수 있다. 피부 외용제는 액제, 크림제, 연고제, 겔제, 에어로졸제 등의 제형을 들 수 있고, 외용에 적합한 제형이라면 이들에 한정되는 것은 아니다.

피부 외용제에는, 필요에 따라, 물, 저급 알코올, 용해 보조제, 계면활성제, 유화안정화제, 겔화제, 점착제, 기타, 소망하는 제형을 얻기 위하여 통상 사용되는 기제 성분을 배합할 수 있고, 사용 목적에 따라 혈관확장제, 부신피질호르몬, 보습제, 살균제, 청량화제, 비타민류, 향료, 색소 등을 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위에서 적절히 배합하는 것도 가능하다.

본 발명의 육모제가 의약품의 태양일 경우, 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 하여 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 적절히 배합하여 제제화할 수 있다. 제형은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 정제(당의정을 포함한다), 피복 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 액제, 현탁제, 유제 등의 경구제; 주사제(예를 들면, 피하 주사제, 정맥내 주사제, 근육내 주사제, 복강내 주사제), 수액, 점적제, 외용제(예를 들면, 경비투여제제, 경피제제, 연고제), 좌제(예를 들면, 직장좌제, 질좌제), 연고, 패치제, 액제 등의 비경구제로 할 수 있다. 바람직하게는 외용제이다.

비경구제로는 예를 들면, 피부 외용제를 들 수 있다. 피부 외용제는 액제, 크림제, 연고제, 겔제, 에어로졸제 등에 적용할 수 있지만, 외용에 적합한 제형이라면 이들에 한정되는 것은 아니다.

경구용 고형제(정제, 환제, 캡슐제, 산제, 과립제 등)는 유효성분을 부형제(락토오스, 만니톨, 글루코오스, 미결정 셀룰로오스, 전분 등), 결합제(히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루민산마그네슘 등), 붕해제(섬유소 글리콜산 칼슘 등), 활택제(스테아린산마그네슘 등), 안정제, 용해 보조제(글루타민산, 아스파라긴산 등) 등과 혼합하고, 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있다. 필요에 따라, 코팅제(백당, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스프탈레이트 등)으로 피복해도 좋고, 또한 2 이상의 층으로 피복해도 좋다.

경구용 액제(수제, 현탁제, 유제, 시럽제, 엘릭서제 등)은 유효성분을 일반적으로 사용되는 희석제(정제수, 에탄올 또는 이들의 혼합액 등)에 용해, 현탁 또는 유화하여 제제화된다. 또한, 이러한 액제는 습윤제, 현탁화제, 유화제, 감미제, 풍미제, 방향제, 보존제, 완충제 등을 함유해도 좋다.

본 발명의 의약품의 제제화에 사용하는 담체 또는 첨가제의 배합 비율에 대해서는, 의약품 분야에 있어서 통상 채용되는 범위에 근거하여 적절히 설정하면 좋다. 배합할 수 있는 담체 또는 첨가제는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 물, 생리식염수, 기타의 수성 용매, 수성 또는 유성 기제 등의 각종 담체; 부형제, 결합제, pH 조정제, 붕해제, 흡수촉진제, 활택제, 착색제, 교미제, 향료 등의 각종 첨가제를 들 수 있다.

투여량은 투여대상, 대상질환, 투여경로 등에 의해 상이하나, 예를 들면, 피부외용제의 형태로 투여하는 경우, 일반적으로 성인(체중 60 kg으로서)에 있어서는 1일당 유효성분을 약 0.01∼30 mg 정도, 바람직하게는 약 0.1∼20 mg 정도, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼10 mg 정도를 투여한다. 경구투여하는 경우, 일반적으로 성인(체중 60 kg으로서)에 있어서는 1일당 유효성분을 약 0.1∼100 mg, 바람직하게는 약 1.0∼50 mg, 더욱 바람직하게는 약 1.0∼20 mg 투여한다. 예를 들면, 주사제의 형태로 비경구적으로 투여하는 경우, 일반적으로 성인(체중 60 kg으로서)에 있어서는 1일당 유효성분을 약 0.01∼30 mg 정도, 바람직하게는 약 0.1∼20 mg 정도, 더욱 바람직하게는 약 0.1∼10 mg 정도를 정맥내 투여한다. 1일당의 총투여량은 단일 투여량이어도 분할 투여량이어도 좋다.

본 발명의 육모제가 음식품의 태양일 경우, 음식품에는 건강식품, 기능성 식품, 특정 보건용 식품, 환자용 식품, 식품 첨가물 등이 포함된다. 음식품의 형태는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 차음료, 청량음료, 탄산음료, 영양음료, 과실음료, 유산음료 등의 음료, 소바(메밀국수), 우동, 중화면, 즉석면 등의 면류, 엿, 캔디, 껌, 초콜릿, 스낵 과자, 비스킷, 젤리, 잼, 크림, 구운 과자, 빵 등의 과자 및 빵류, 어묵, 햄, 소시지 등의 수산·축산 가공 식품, 가공유, 발효유 등의 유제품, 샐러드유, 튀김유, 마가린, 마요네즈, 쇼트닝, 휘프트 크림(whipped cream), 드레싱 등의 유지 및 유지 가공 식품, 소스, 타레 등의 조미료, 카레, 스튜, 돈부리, 죽, 잡탕죽 등의 레토르트파우치 식품, 아이스크림, 샤베트, 빙수 등의 빙과 등을 들 수 있다.

본 발명의 육모제가 서플리먼트의 태양일 경우, 예를 들면 정제, 과립제, 산제, 드링크제 등의 형태로 제공할 수 있다.

서플리먼트를 제조할 때에는, 예를 들면 덱스트린, 전분 등의 당류; 젤라틴, 대두 단백, 옥수수 단백 등의 단백질; 알라닌, 글루타민, 이소류신 등의 아미노산류; 셀룰로오스, 아라비아검 등의 다당류; 대두유, 중쇄지방산 트리글리세라이드 등의 유지류 등의 임의의 보조제를 첨가하여 임의의 제형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 육모 또는 발모촉진을 위하여 사용되는 다른 유효성분과 조합하여 사용함으로써, 상가적 또는 상승적인 육모 또는 발모촉진 작용의 향상을 기대할 수 있다. 육모 또는 발모촉진을 위하여 사용되는 다른 유효성분으로는 미녹시딜, 피나스테라이드 등을 들 수 있다.

본 발명에는, 추가로 이하의 발명이 포함된다.

(a) 백신용 아주반트, 백신 조성물, 면역부활제 또는 육모제를 제조하기 위한 상기 본 발명의 펩타이드의 사용.

(b) 백신 항원의 면역원성을 증강시키기 위한, 사이토카인의 산생을 유도시키기 위한, T세포 활성화 공자극 분자의 발현을 유도시키기 위한, 인플라마좀을 활성화시키기 위한, 모유두세포를 증식시키기 위한, 또는 모유두세포에 대한 증식 인자 산생을 촉진시키기 위한 상기 본 발명의 펩타이드.

(c) 포유동물에 대하여 상기 본 발명의 펩타이드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 비치료적인 면역부활 또는 육모 혹은 발모촉진 방법.

(d) 포유동물에 대하여 상기 본 발명의 펩타이드의 유효량을 투여하는 것을 특징으로 하는 면역원성 증강, 면역부활 또는 육모 혹은 발모촉진 방법.

(e) 백신 투여가 필요한 포유동물에 대하여 상기 본 발명의 펩타이드의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 항원의 면역원성 증강 방법.

(f) 육모 혹은 발모촉진이 필요한 포유동물에 대하여 상기 본 발명의 펩타이드의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 육모 혹은 발모촉진 방법.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것이 아니다.

[실시예 1: 펩타이드의 합성]

문헌 Solid Phase Peptide Synthesis, pierce (1984), Fmoc solid synthesis: a practical approach, Oxford University Press (2000) 및 제5판 실험화학강좌 16 유기 화합물의 합성 IV 등에 기재된 방법에 따라, 전자동 고상 합성기를 사용하여, 보호 펩타이드 수지를 Fmoc법으로 합성하였다. 얻어진 보호 펩타이드 수지에 트리플루오로초산(TFA)과 스캐빈저(티오아니올, 에탄디티올, 페놀, 트리이소프로필실란, 물 등의 혼합물)을 첨가하여, 수지로부터 절단과 동시에 탈보호하여, 조(crude) 펩타이드를 얻었다. 이 조 펩타이드를 역상 HPLC 컬럼(ODS)을 사용하여, 0.1% TFA-H₂0/CH₃CN의 계로 글라디언트 용출하여 정제를 수행하였다. 목적물을 포함하는 분획을 모아 동결건조하여 원하는 펩타이드를 얻었다. 합성한 펩타이드의 아미노산 서열은 아미노산 시퀀서 G1000A(Helett Packard), PPSQ-23A(시마즈 제작소) 또는 ProciscLC(ABI사)를 사용하여 확인하고, 얻어진 펩타이드의 N 말단을 아세틸화 및 C 말단을 아미드화하였다. 합성한 펩타이드의 서열을 이하에 나타내었다.

합성한 OSK-1의 분자량을 질량분석장치(Voyager DE-Pro serial number 6344)을 사용하여 측정하였다. 매트릭스로서 디히드록시벤조산(dihydroxybenzoic acid, DHB)을 사용하고, 매트릭스 0.5 μL와 샘플 0.5 μL를 스팟하고 건조하였다. MS 해석의 결과를 도 13에 나타내었다.

합성한 OSK-1의 순도를 HPLC 장치에 의해 이하의 분석 조건으로 측정하였다.

HPLC 기종: Waters Alliance 2690

시료용액: 1 mg/mL 수용액

주입량: 20 μL

측정파장: 215 nm

유량: 매분 1.2 mL

컬럼: Discovery, C18, 4.6mm X 250mm, 5 micron

컬럼온도: 실온

이동상 A: 0.1% 트리플루오로초산 수용액

이동상 B: 0.1% 트리플루오로초산 아세토니트릴 용액

글라디언트 조건: 20분간으로 이동상 B의 농도를 직선적 구배로 25%로부터 45%로 한다. (25→45% buffer B in 20 min)

HPLC 해석의 결과를 도 14에 나타내었다.

표 1

[실시예 2: 인간 단구계 세포주(THP-1 세포)에 있어서의 사이토카인 산생에 대한 영향(1)]

(1) 실험 방법

인간 단구계 주화 세포 THP-1 세포(JCRB 등록번호: JCRB0112)를 1 μg/mL 리포폴리사카라이드(LPS) 및 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 1 X 10⁶ cells/mL이 되도록 현탁하고, 3시간 동안 CO₂ 인큐베이터 내에서 정치하여 프라이밍하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고, RPMI1640 배지(10% FBS 함유)에 1 X 10⁶ cells/mL이 되도록 재현탁하고, 24웰 플레이트에 500 μL/well로 파종하였다. 별도로 최종농도의 2배 농도가 되도록 RPMI1640 배지(10% FBS)로 조제한 OSK-1 용액을 500 μL/well로 첨가하였다. 약 16시간 후에 배양 상등액을 회수하고, 상등액 중의 사이토카인 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.

(2) 결과

배양 상등액 중의 IL-1β, IL-18, TNFα 및 IL-6 농도를 측정한 결과를 도 1 (A)∼(D)에 나타내었다.

LPS로 프라이밍한 THP-1 세포에 대하여 OSK-1을 첨가하면, 농도의존적으로 사이토카인의 산생이 유도되는 것을 확인하였다.

[실시예 3: 인간 단구계 세포주(THP-1 세포)에 있어서의 사이토카인 산생에 대한 영향(2)]

(1) 실험 방법

THP-1 세포를 50 ng/mL PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 5 X 10⁵ cells/mL이 되도록 현탁하고, 24웰 플레이트에 5 X 10⁵ cells/well이 되도록 파종하였다. CO₂ 인큐베이터 내에서 2일간 배양하고, 마크로파지로 분화시켰다. 2일 후, 배지를 제거하고, RPMI1640 배지(10% FBS 함유)로 조제한 OSK-1 용액을 웰에 첨가하고, 추가로 하룻밤 배양하였다. 16시간 후에 배양 상등액을 회수하고, 상등액 중의 사이토카인 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.

(2) 결과

배양 상등액 중의 IL-1β, IL-18, TNFα 및 IL-6 농도를 측정한 결과를 도 2 (A)∼(D)에 나타내었다.

PMA로 분화한 THP-1 세포에 OSK-1을 첨가하면, 30 μg/mL의 농도에 있어서 강한 사이토카인 산생 유도 작용이 확인되었다.

[실시예 4: 인간 단구계 세포주(THP-1 세포)에 있어서의 CD86 및 CD54 발현에 대한 영향]

(1) 실험 방법

THP-1 세포는 10% FBS 및 0.05 mM 머캅토에탄올 함유 RPMI1640 배지를 사용하여 75cm² 플라스크에 2.0 X 10⁵ cells/mL의 밀도로 50 mL 첨가하고, 48시간 동안 전배양하였다.

전배양한 THP-1 세포를 원심분리하여 회수하고, 10% FBS 및 0.05 mM 머캅토에탄올 함유 RPMI1640 배지를 사용하여 2.0 X 10⁶ cells/mL의 세포 현탁액을 조제하고, 24웰 플레이트의 각 웰에 500 μL를 파종하였다. 세포 현탁액을 파종한 각 웰에 동일한 배지를 사용하여 조제한 펩타이드를 500 μL 첨가하였다.

하룻밤 배양 후, 세포를 원심분리하여 회수하고, 0.1% BSA 함유 PBS(FACS 버퍼)에 의한 세정을 2회 반복하였다. 그 후, 600 μL의 0.01% 인간 γ 글로불린 용액(Sigma, G2388) 함유 FACS 버퍼에 분산시켜 4℃, 10분 동안 인큐베이션하고, Fc 리셉터의 블로킹을 행하였다.

그 후, 세포 현탁액을 항체반응용으로 180 μL씩 3분할하여 1.5 mL 튜브에 분주한 후, 원심분리하여 회수한 펠렛에 대하여, CD86 항체(Pharmingen; Cat# 555657), CD54 항체(Dako; Cat# F7143) 및 isotype control(Mouse IgG) 항체(Dako; Cat# X0927)의 각 FITC 표지 항체액을 FACS 버퍼로 적정농도로 조제한 액 50 μL를 첨가하고, 4℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 30분간 인큐베이션한 후, 세포를 원심분리하여 회수하고, FACS 버퍼에 의한 세정을 2회 반복하였다. 원심분리하여 회수한 세포를 0.625 μg/mL 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide) 함유 FACS 버퍼 200 μL에 분산시켜, 유세포분석기(flow cytometry)로 생세포(生細胞) 1 X 10⁴ cells를 측정하고, 세포 표면항원의 발현량을 측정하였다. 전방 산란 및 측방 산란에 의한 게이팅(gating)은 하지 않고, 측정한 평균 형광강도(MFI)로부터 아래에 나타낸 식으로 상대 형광 강도(RFI)를 산출하였다.

(2) 결과

THP-1 세포에 OSK-1, AAP-1∼AAP-6을 첨가했을 때의 CD86 및 CD54의 발현량을 도 3 (A), (B)에 나타내었다.

OSK-1을 THP-1 세포에 첨가했을 때, 강한 CD86 및 CD54 발현 유도 활성이 확인되었다. OSK-1의 서열로부터 C 말단의 아미노산(LKRK 또는 KRLKRK)을 결손시킨 서열(AAP-2∼AAP-3)에 있어서, 아미노산수가 적어짐에 따라 CD86 및 CD54 발현 유도 활성이 크게 저하되는 경향이 확인되었다. 특히 CD54에서 현저하였다. OSK-1의 C 말단으로부터 2 아미노산을 결손시킨 서열(AAP-1) 및 OSK-1의 N 말단 및 C 말단으로부터 각각 1 아미노산씩 결손시킨 서열(AAP-4∼AAP-6)에 대해서는, 큰 활성저하는 확인되지 않았다. OSK-1은 아주반트 활성을 가지는 뮤라밀디펩타이드(MDP)와 비교하여 동등 이상의 발현 유도 활성을 갖는 것이 확인되었다(도 9 및 도 10). 이상에 의해, LHRLKRLRKRL(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열의 C 말단의 『L』이 본 발명의 펩타이드의 면역부활 작용에 필요한 것이 시사되었다.

THP-1 세포에 AAP-6, AAP-11 및 AAP-12를 첨가했을 때의 CD86 및 CD54의 발현량을 도 4 (A), (B)에 나타내었다.

OSK-1의 서열 N 말단으로부터 7 아미노산을 결손시킨 서열(AAP-12)에 있어서, CD86 및 CD54 발현 유도 활성이 크게 저하되는 경향이 확인되었다. OSK-1의 N 말단 및 C 말단으로부터 3 아미노산 결손시킨 서열(AAP-6), OSK-1의 N 말단으로부터 5 아미노산 및 C 말단으로부터 3 아미노산 결손시킨 서열(AAP-11)에 대해서는, 큰 활성저하는 확인되지 않았다(도 11 및 도 12). 이상에 의해, LHRLKRLRKRL(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단의 『L』이 본 발명의 펩타이드 면역부활 작용에 필요한 것이 시사되었다.

[실시예 5: OSK-1에 의한 인플라마좀 활성화 작용(1)]

(1) 실험 방법

THP-1 세포에 인플라마좀 구성분자인 NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3)에 대한 siRNA(최종 농도 100 nM, Hs_CIAS1_6 및 Hs_CIAS1_9, QIAGEN사제), 또는 콘트롤 siRNA를 트랜스팩션 시약(6 μL/well, HiPerfect Transfection Reagent, QIAGEN사제)을 사용하여, 트랜스팩션하여 하룻밤 배양한 후, NLRP3의 발현 수준을 웨스턴 블롯법에 의해 확인하였다.

이 THP-1 세포를 1 μg/mL LPS 및 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 1 X 10⁶ cells/mL이 되도록 현탁하고, 3시간 동안 CO₂ 인큐베이터 내에서 정치하여 프라이밍하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고, RPMI1640 배지(10% FBS)에 1 X 10⁶ cells/mL 재현탁한 후, 24웰 플레이트에 500 μL/well로 첨가하고, 최종농도의 2배 농도가 되도록 RPMI1640 배지(10% FBS)로 조제한 OSK-1 용액을 500 μL 첨가하였다. 16시간 후에 배양 상등액을 회수하고, 상등액 중의 IL-1β 및 TNFα 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.

(2) 결과

NLRP3의 발현 수준을 웨스턴 블롯법에 의해 확인한 결과를 도 5에 나타내었다. THP-1 세포에 NLRP3에 대한 siRNA를 THP-1 세포에 트랜스팩션함으로써, NLRP3의 발현을 넉다운 한 것이 확인되었다.

이 THP-1 세포를 사용하여, OSK-1을 10 μg/mL의 농도로 첨가했을 때의 IL-1β 및 TNFα 산생량을 비교한 결과를 도 6 (A), (B)에 나타내었다. NLRP3 발현을 넉다운 하지 않은(콘트롤 siRNA를 트랜스팩션한) 세포에서는 OSK-1에 의한 IL-1β 산생 유도가 확인되었으나, NLRP3 발현을 넉다운한 세포에서는 OSK-1에 의한 IL-1 β 산생 유도는 억제되었다. 한편, 인플라마좀의 활성화에 관여하지 않는 TNFα에 대해서는, NLRP3 발현의 넉다운 유무에 관계없이, OSK-1에 의한 산생 유도가 확인되었다.

[실시예 6: OSK-1에 의한 인플라마좀 활성화 작용(2)]

(1) 실험 방법

THP-1 세포를 1 μg/mL LPS 및 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 1 X 10⁶ cells/mL이 되도록 현탁하고, 3시간 동안 CO₂ 인큐베이터 내에서 정치하여 프라이밍하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고, RPMI1640 배지(10% FBS 함유)에 1 X 10⁶ cells/mL 재현탁한 후 96웰 플레이트에 100 μL/well로 파종하였다. 카텝신 B의 저해제인 Ca-074-Me(최종농도 10 μM), 카스페이스-1의 저해제 Z-YVAD-FMK(최종농도 10 μM) 또는 배지를 첨가하고, 추가로 OSK-1 또는 배지를 첨가한 후, CO₂ 인큐베이터 내에서 배양하였다. 16시간 후에 배양 상등액을 회수하고, 상등액 중의 사이토카인 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.

(2) 결과

LPS에 의한 THP-1 세포의 프라이밍의 유무에 의한, OSK-1의 IL-1β 산생 작용을 비교한 결과를 도 7에 나타내었다. LPS에 의해 프라이밍한 경우만 OSK-1에 의한 IL-1β의 산생이 확인되었다.

카텝신 B의 저해제 및 카스페이스-1의 저해제의 유무에 의한, OSK-1의 IL-1β 산생 작용을 비교한 결과를 도 8에 나타내었다. OSK-1에 의한 IL-1β의 산생 유도는, 인플라마좀을 활성화하는 카텝신 B의 저해제인 Ca-074-Me 또는 인플라마좀 구성분자인 카스페이스-1의 저해제인 Z-YVAD-FMK에 의해 억제되는 것을 확인하였다.

이상에 의해, LPS 프라이밍에 의해 발현된 proIL-1β가, OSK-1에 의해 활성화된 인플라마좀의 구성분자인 카스페이스-1에 의해, IL-1β로 프로세싱되어 세포외로 방출된다는 것이 시사되었다.

[실시예 7: 개에 있어서의 OSK-1의 아주반트(백신 항원의 면역원성 증강) 효과의 확인]

(1) 실험 방법

개에 있어서의 OSK-1의 아주반트 효과를 기존의 프로인트 아주반트(Freund's Adjuvant)의 아주반트 효과와 비교하였다. 백신으로서 AngII-KLH(Angiotensin II Keyhole limpet hemocyanin) (25 μg/마리)을, 또한 아주반트로서 OSK-1(500 μg/마리) 또는 프로인트 아주반트(250 μL/마리)을 사용하여, 2주 간격으로 2회, 비글견에게 피내 투여하였다(1군 2마리). 단, 프로인트 아주반트군은 1회째의 투여에는 완전 프로인트 아주반트를, 2회째의 투여에는 불완전 프로인트 아주반트를 사용하였다. 투여전 및 1회째의 투여로부터 2주 후, 4주 후에 채혈하고, AngII에 대한 항체가를 측정하였다.

AngII-BSA로 코팅한 ELISA용 96웰 플레이트에, 5% 스킴 밀크/PBS를 사용하여 단계 희석한 혈청을 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하였다. PBS-T로 웰을 세정한 후, 5% 스킴 밀크/PBS로 희석한 HRP 표지 항-마우스 IgG 항체를 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 진탕(shaking)하였다. PBS-T로 웰을 세정한 후, TMB 용액을 첨가하여 차광으로 30분간 정치하고, 0.5N H₂SO₄을 가하여 반응을 정지시켰다. 450nm의 흡광도를 측정하고, 항체가를 비교하였다.

(2) 결과

결과를 도 9에 나타내었다. (A)는 OSK-1군의 결과, (B)는 프로인트 아주반트(FA)군의 결과이다. OSK-1군의 개체에서 AngII 항체가의 상승이 확인되었다.

[실시예 8: 마우스에 있어서의 OSK-1의 아주반트(백신 항원의 면역원성 증강) 효과의 확인]

(1) 실험 방법

마우스에 있어서의 OSK-1의 아주반트 효과를 Alum 및 프로인트 아주반트(Freund's Adjuvant)의 아주반트 효과와 비교하였다. 백신으로서 AngII-KLH(2 μg/마리)을, 아주반트로서 OSK-1(100 μg/마리), Alum(400 μg/마리) 또는 프로인트 아주반트(50 μg/마리)를 사용하여, 2주 간격으로 3회, C57/BL6 마우스에 피내 투여하였다(1군 3마리). 단, 프로인트 아주반트군은 1회째의 투여에는 완전 프로인트 아주반트를, 2회째 및 3회째의 투여에는 불완전 프로인트 아주반트를 사용하였다. 투여전 및 1회째의 투여로부터 2주 후, 4주 후, 6주 후, 8주 후에 채혈하고, AngII에 대한 항체가를 측정하였다.

항체가의 측정은 실시예 7과 동일한 방법으로 행하였다.

(2) 결과

OSK-1, Alum, 프로인트 아주반트(FA)의 아주반트 효과를 비교한 결과를 도 10에 나타내었다. OSK-1군에 있어서 프로인트 아주반트(FA)군에는 미치지 못하지만, Alum군과 동일한 정도의 AngII에 대한 항체가의 상승이 확인되었다.

[실시예 9: 모유두세포에 대한 증식 인자 산생 촉진 작용(1)]

(1) 실험 방법

인간 모유두세포를 10% FBS 함유 DMEM 배지를 사용하여 3 X 10⁴ cells/well이 되도록 24웰 플레이트에 파종하고, 하룻밤 CO₂ 인큐베이터 내에서 배양하였다. 다음날, 배지를 제거하고, 1% FBS 함유 DMEM 배지를 사용하여 조제한 펩타이드 용액을 첨가하고 5일간 CO₂ 인큐베이터 내에서 배양하였다. 배양 상등액을 회수하고, KGF, HGF 및 VEGF의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.

(2) 결과

인간 모유두세포에 각종 펩타이드를 작용시켰을 때의, 배양 상등액중의 KGF, HGF, VEGF 농도를 ELISA에 의해 측정한 결과를 도 11 (A)∼(C)에 나타내었다. OSK-1은 농도의존적으로 각 증식 인자의 산생을 촉진하는 것이 확인되었다. AAP-1, AAP-4∼AAP-6에 대해서도, OSK-1과 동일하게 농도의존적으로 각 증식 인자의 산생 작용이 확인되었다. OSK-1의 서열로부터 C 말단의 아미노산(LKRK 또는 KRLKRK)을 결손시킨 서열(AAP-2 및 AAP-3)에 있어서, 각 증식 인자의 산생 작용이 저하되었다. 특히 HGF의 산생 촉진 작용이 저하되었다. 이상에 의해, LHRLKRLRKRL(서열번호 1)로 표시되는 아미노산 서열의 C 말단의 『L』이 본 발명의 펩타이드 증식 인자 산생 촉진 작용에 필요한 것이 시사되었다.

[실시예 10: OSK-1과 유사 펩타이드(SR-07 및 SR-08)의 CD54 발현 유도 작용의 비교]

OSK-1과 유사 펩타이드(SR-07 및 SR-08)의 CD54 발현 유도 작용을 비교하였다. 실험 방법은 실시예 4와 동일하게 행하였다. SR-07 및 SR-08은 WO 2010/137594에 기재되어 있는 펩타이드이며 서열을 이하의 표2에 나타낸다.

표 2

시료 미처리 컨트롤 세포(용매 처리 세포)의 생존율이 90% 이상을 나타낼 때 시험성립이라고 하고, 시험실시시의 각 시료 농도에 있어서의 세포생존율이 50% 보다 낮은 경우는 그 농도에 있어서의 CD54의 값은 판정으로부터 제외하기로 하였다.

결과를 도 12에 나타내었다. SR-07 및 SR-08에 비교하여, OSK-1에 강한 CD54 발현 유도 활성이 확인되었다.

[실시예 11: 인간 단구계 세포주(THP-1 세포)에 있어서의 사이토카인 산생에 대한 영향(3)]

(1) 실험 방법

실시예 3과 동일한 방법으로 실험을 행하여, 배양 상등액 중의 배양 상등액중의 IL-1β, IL-18, TNFα, IL-6, RANTES, MIP-1α 및 MIP-1β 농도를 측정하였다.

(2) 결과

결과를 도 15 (A)∼(G)에 나타내었다. PMA로 분화한 THP-1 세포에 OSK-1을 첨가하면, OSK-1 농도의존적인 케모카인, 사이토카인의 산생 유도 작용이 확인되었다.

[실시예 12: 마우스 마크로파지 세포(RAW264.7 세포)에 있어서의 사이토카인 산생에 대한 영향]

(1) 실험 방법

RAW264.7 세포를 50 ng/mL LPS 및 10% FBS 함유 DMEM 배지에 1 X 10⁶ cells/mL이 되도록 현탁하고, 3시간 동안 CO₂ 인큐베이터 내에서 정치하여 프라이밍하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고, DMEM 배지(10% FBS 함유)에 1 X 10⁶ cells/mL이 되도록 재현탁하고, 24웰 플레이트에 500 μL/well로 파종하였다. 별도로 최종농도의 2배 농도가 되도록 DMEM 배지(10% FBS 함유)로 조제한 OSK-1 용액을 500 μL/well로 첨가하였다. 약 16시간 후에 배양 상등액을 회수하고, 상등액 중의 사이토카인 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.

(2) 결과

배양 상등액 중의 IL-1β, IL-18, TNFα 및 IL-6 농도를 측정한 결과를 도 16 (A)∼(D)에 나타내었다.

LPS로 프라이밍한 RAW264.7 세포에 대하여 OSK-1을 첨가하면, OSK-1 농도의존적인 사이토카인의 산생 유도가 확인되었다.

[실시예 13: 마우스 골수 유래 수지상 세포에 있어서의 사이토카인 산생에 대한 영향]

(1) 실험 방법

C57BL/6 마우스의 대퇴골로부터 골수세포를 채취하고, 골수세포를 20 mg/mL GM-CSF(Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor) 및 10% FBS 함유RPMI1640 배지에 파종하고, 3일간 배양했다. 배양 3일 후에 배지를 추가하고, 추가로 4일간 배양했다. 배양 플레이트에 접착하지 않은 세포를 회수하여 골수 유래 수지상 세포로 하였다. RPMI1640 배지(10% FBS 함유)로 2 X 10⁶ cells/mL이 되도록 세포 현탁액을 조정하고, 24웰 플레이트에 500 μL/well로 파종하였다. 별도로 최종농도의 2배가 되도록 RPMI1640 배지(10% FBS 함유)로 조제한 OSK-1 용액을 500 μL/well로 첨가했다. 약 16시간 후에 배양 상등액을 회수하고, 상등액 중의 사이토카인 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.

(2) 결과

배양 상등액 중의 IL-1β, IFNγ, TNFα, IL-6 및 IL-12p70 농도를 측정한 결과를 도 17 (A)∼(E)에 나타내었다.

마우스 골수 유래 수지상 세포에 대하여 OSK-1을 첨가하면, OSK-1 농도의존적인 사이토카인의 산생 유도가 확인되었다.

[실시예 14: 인간 단구계 세포주(THP-1 세포)에 있어서의 사이토카인 산생에 대한 영향(Alum, CpG 뉴클레오티드와의 비교)]

(1) 실험 방법

THP-1 세포를 1 μg/mL LPS 및 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에 1 X 10⁶ cells/mL이 되도록 현탁하고, 3시간 동안 CO₂ 인큐베이터 내에서 정치하여 프라이밍하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고, RPMI1640 배지(10% FBS 함유)에 1 X 10⁶ cells/mL이 되도록 재현탁하고, 24웰 플레이트에 500 μL/well로 파종하였다. 별도로 최종농도의 2배 농도가 되도록 RPMI1640 배지(10% FBS 함유)로 조제한 OSK-1, Alum(Alhydrogel 2%, InvivoGen) 또는 CpG 뉴클레오티드(CpG ODN 2006, Novus Biologicals) 용액을 500 μL/well로 첨가하였다. 약 16시간 후에 배양 상등액을 회수하고, 상등액 중의 사이토카인 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.

(2) 결과

배양 상등액 중의 IL-1β, IL-18, TNFα, IL-6 농도를 측정한 결과를 도 18 (A)∼(D)에 나타내었다.

LPS로 프라이밍한 THP-1 세포에 대하여 OSK-1을 첨가하면, Alum 및 CpG 뉴클레오티드와 비교하여 IL-1β, IL-18 및 TNFα의 강한 산생 유도 작용이 확인되었다. IL-18에 대해서는, Alum 보다도 약하지만, OSK-1은 유의한 산생 유도가 확인되었다.

[실시예 15: 인간 단구계 세포주(THP-1 세포)에 있어서의 CD86 및 CD54 발현에 대한 영향(Alum과의 비교)]

(1) 실험 방법

펩타이드로서 OSK-1을 사용하고, 대조로서 Alum을 사용한 것 이외는 실시예 4와 동일한 방법으로 실험을 행하였다.

(2) 결과

THP-1 세포에 OSK-1 또는 Alum을 첨가했을 때의 CD86 및 CD54의 발현량을 도 19 (A), (B)에 나타내었다.

OSK-1을 THP-1 세포에 첨가했을 때, 강한 CD86 및 CD54 발현 유도 활성이 확인되었다. 한편, Alum을 THP-1 세포에 첨가했을 때, CD86 및 CD54 발현 유도 활성은 확인되지 않았다.

[실시예 16: 인간 단구계 세포주(THP-1 세포)에 있어서의 OSK-1에 의한 NFκB의 활성화]

(1) 실험 방법

THP-1 세포를 RPMI1640 배지(10% FBS 함유)을 사용하여 5 X 10⁵ cells/500 μL이 되도록 조정하고, 24웰 플레이트에 500 μL/well로 파종하였다. RPMI1640 배지(10% FBS 함유)로 조제한 QNZ(Enzo, 최종농도 10 μM), BAY11-7082(Enzo, 최종농도 10 μM) 또는 RPMI1640 배지(10% FBS 함유)를 첨가하여 2.5시간 동안 배양하였다. 최종농도가 100 ng/mL이 되도록 OSK-1을 첨가하여 2시간 동안 배양한 후에 배양 상등액을 회수하고, 상등액 중의 TNFα 농도를 ELISA에 의해 측정하였다.

(2) 결과

결과를 도 20에 나타내었다. OSK-1은 THP-1 세포에 있어서 TNFα의 산생을 유도하였으나, NFκB 저해제인 QNZ 또는 BAY11-7082을 첨가하면 OSK-1에 의한 TNFα의 산생이 억제되었다. 이 결과로부터, OSK-1은 NFκB 활성화 작용을 갖는 것이 확인되었다.

[실시예 17: OSK-1-Angiotensin II conjugate vaccine에 의한 항체 산생]

(1) 실험 방법

OSK-1 펩타이드와 Angiotensin II 펩타이드를, ε-Acp를 스페이서로 하여 컨쥬게이션한 「OSK-1-AngII conjugate vaccine」을 제작하고, 마우스를 사용하여 항체 산생 작용을 평가하였다. 군 구성은 (1) AngII-KLH(5 μg/mouse) + Alum(Alhydrogel 2%, InvivoGen, 0.4 mg/mouse), (2) OSK-1-AngII conjugate vaccine(10 μg/mouse), (3) OSK-1-AngII conjugate vaccine(50 μg/mouse)의 3군으로 하여 2주 간격으로 3회, Balb/c마우스에 피내 투여하였다(각 군 6마리). 투여전 및 1회째의 투여로부터 2주 후, 4주 후, 6주 후, 8주 후에 채혈하고, Angiotensin II에 대한 항체가를 ELISA에 의해 측정하였다. 또한, 산생된 항체의 IgG 서브타입에 대하여 ELISA에 의해 해석했다.

(2) 결과

Angiotensin II에 대한 항체가의 측정 결과를 도 21에 나타내고, 산생된 항체의 IgG 서브타입의 해석 결과는 도 22 (A), (B)에 나타내었다.

OSK-1-AngII conjugate vaccine은 농도의존적으로 Angiotensin II에 대한 항체 산생을 유도하였다.

IgG 서브타입의 해석에서는 Th2 타입의 아주반트로 여겨지는 Alum과 함께 투여된 AngII-KLH vaccine에 의해 산생된 항체에 있어서는 Th2 타입인 IgG1의 산생이 높았지만, OSK-1-AngII conjugate vaccine에 의해 산생된 항체에 있어서는, Th2 타입의 IgG1뿐만 아니라 Th1 타입인 IgG2a, IgG2b 및 IgG3의 산생도 높았다.

[실시예 18: OSK-1-WT1 conjugate vaccine에 의한 WT1 특이적 면역유도]

(1) 실험 방법

OSK-1 펩타이드와 WT1 펩타이드를, ε-Acp를 스페이서로 하여 컨쥬게이션한 「OSK-1-WT1 conjugate vaccine」을 제작하고, 마우스를 사용하여 WT1 특이적인 면역유도 능력을 평가하였다. 군 구성은 (1) 생리식염수, (2) WT1 펩타이드(15 μg/mouse) + Incomplete Freund's Adjuvant(IFA, SIGMA; Cat# F5506, 50 μL/mouse), (3) WT1 펩타이드(15 μg/mouse) + OSK-1(100 μg/mouse), (4) OSK-1-WT1 conjugate vaccine(50 μg/mouse), (5) OSK-1-WT1 conjugate vaccine(300 μg/mouse)의 5군으로 하였다(각 군 3마리). C57BL/6 마우스에 백신을 주당 1회, 4주간 투여하고, 4회째의 투여로부터 2주간 후에 면역시킨 마우스로부터 비장을 적출하여 ELISpot 어세이를 행하였다. 즉, 적출한 비장으로부터 비세포(脾細胞)를 조제하고, 항-IL-4 항체 또는 항-IFNγ 항체를 코팅한 필터 플레이트에 비세포를 파종하였다. WT1 펩타이드 또는 OSK-1-WT1 펩타이드를 첨가하여 3일간 배양한 후, 필터 플레이트의 웰을 염색하고, IL-4 또는 IFNγ 산생 세포의 스팟수를 계측하였다.

(2) 결과

OSK-1을 아주반트로서 첨가한 군(3) 및 OSK-1과 WT1을 컨쥬게이션한 군(4) 및 군(5)에서는, WT1 펩타이드 자극에 대하여 IFNγ을 산생하는 세포가 많이 확인되었다. 특히 군(5)에서 반응성이 높았다. 한편, IFA를 아주반트로서 첨가한 군(2)에서는, WT1 펩타이드의 자극에 반응하여 IL-4를 산생하는 세포가 많이 확인되었다.

[실시예 19: 모유두세포에 대한 증식 인자 산생 촉진 작용(2)]

(1) 실험 방법

펩타이드로서 OSK-1 및 AAP-11을 사용하여, 실시예 9와 동일한 방법으로 KGF, HGF 및 VEGF의 농도를 측정하였다.

(2) 결과

결과를 도 23에 나타내었다. AAP-11은 농도의존적으로 각 증식 인자의 산생을 촉진하였다.

[실시예 20: OSK-1의 육모 작용]

(1) 실험 방법

모휴지기(毛休止期)에 있는 8주령의 웅성 C3H/HeN 마우스의 배부(背部)를 상처나지 않도록 깍기(hair clipper) 및 전기면도기 제모하였다. 제모 영역의 면적은 2 X 4 cm로 하였다. 제모 3일 후로부터 1일 1회 14일간, 0.02 %(w/v), 0.1 %(w/v) 또는 0.5 %(w/v)의 OSK-1 용액을 100 μL씩 도포하였다. 대조군에는 생리식염수, 양성대조군에는 3 %(w/v) 미녹시딜을 도포하였다. 제모일을 Day 0으로 하여, Day 3, Day 7, Day 10, Day 14 및 Day 17에 마우스 제모부의 전면적에 대한 발모부위의 면적을 「0%: 스코어 0」, 「∼20%: 스코어 1」, 「∼40%: 스코어 2」,「∼60%: 스코어 3」,「∼80%: 스코어 4」,「∼100%: 스코어 5」로 스코어화하였다. 또한, Day 17에 마우스의 제모부에 생겨나 있는 피모(皮毛)를 10개 뽑아, 실체현미경을 사용하여 이들 피모의 길이를 측정하고, 그 합계값을 각 개체의 털의 길이(mm)로 하였다.

(2) 결과

결과를 도 24에 나타내었다. (A)는 Day 17의 피모의 길이, (B)는 발모면적 스코어의 결과이다. OSK-1은 농도의존적으로 육모를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 0.5% OSK-1군의 발모 스코어 및 털의 길이는 3% 미녹시딜 군과 거의 동등하였다.

여전히 본 발명은 상술한 각 실시 형태 및 실시예에 한정되는 것이 아니고, 청구항에 나타낸 범위에서 각종 변경이 가능하며, 다른 실시 형태에 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합하여 얻어지는 실시 형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 또한, 본 명세서 중에 기재된 학술문헌 및 특허문헌의 모두가 본 명세서 중에 있어서 참고로서 채용된다.

본 발명의 펩타이드는 면역부활 작용을 가짐으로써, 면역부활제로서 사용할 수 있다. 바람직하게는, 백신용 아주반트로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드를 함유하는 백신 조성물은 더욱 효과가 있는 치료를 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 육모 또는 발모촉진을 목적으로 하는 화장품, 의약부외품, 의약품, 식음료, 서플리먼트의 성분으로서 바람직하게 사용할 수 있다.

<110> OSAKA UNIVERSITY <120> NOVEL PEPTIDE AND USE THEREOF <130> PN0808IM <150> JP 2014-197386 <151> 2014-09-26 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 1 Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 2 Glu Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg 1 5 10 15 Leu Lys Arg Lys 20 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 3 Glu Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg 1 5 10 15 Leu Lys <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 4 Glu Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg 1 5 10 15 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 5 Glu Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 6 Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu 1 5 10 15 Lys Arg <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 7 Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 8 Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 9 Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 10 Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 11 His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg Leu Lys Arg Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 12 Met Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Met Arg Lys Arg 1 5 10 15 Leu Lys Arg Lys 20 <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 13 Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Met Arg Lys Arg Leu 1 5 10 15 Lys Arg Lys <210> 14 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized peptide <400> 14 Glu Leu Lys Leu Ile Phe Leu His Arg Leu Lys Arg Leu Arg Lys Arg 1 5 10 15 Leu Lys Arg Lys Leu Arg Leu Trp His Arg Lys Arg Tyr 20 25

Claims

LHRLKRLRKRLK(서열번호 9)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 23개 이하의 아미노산으로 이루어진 펩타이드.
제1항에 있어서, ELKLIFLHRLKRLRKRLKRK(서열번호 2)의 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, C 말단이 아미드화된 펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, N 말단이 아세틸화된 펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 함유하는 면역부활제.
제5항에 있어서, 백신용 아주반트인 면역부활제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 및 적어도 하나의 항원을 함유하는 백신 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 함유하는 육모제.