KR20170041222A - Mmp9에 특이적 항체 - Google Patents

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KR20170041222A
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욘란드 슈바치코 미소텐
로렌스 고핀
올리비에 레저
스티븐 엠. 던
크리스틴 포베르
킨세이 먼드렐
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칼립소 바이오텍 에스에이
메르크 파텐트 게엠베하
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Abstract

본 발명은, MMP9에 결합하고, 항체의 적어도 하나 조각의 중사슬 가변 영역 및/또는 적어도 하나 조각의 경사슬 가변 영역를 포함하는 새로운 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 따른 MMP9 결합 단백질은 MMP9 활성을 중화할 수 있고, 염증성 및/또는 자가면역 질환 또는 암의 예방 및/또는 치료에 유용하다. 특히, 상기 본 발명에 따른 MMP9 결합 단백질은 MMP9-관련 질병의 진단에 유용하다.

Description

MMP9에 특이적 항체{ANTIBODIES SPECIFIC FOR MMP9}
본 발명은 항체 및 상기 단백질에 특이적으로 결합하고 상기 단백질의 활성을 중화시키는 이들의 조각뿐만 아니라, 치료법 또는 진단법으로서의 이들의 용도에 관한 것이다.
매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 패밀리는 적어도 23 구조적으로 관련된, 용해성 또는 막 결합된 아연-종속 엔도펩티데이즈로 이루어지며, 상기 엔도펩티데이즈는 세포외 매트릭스 (ECM)의 리모델링 및 다양한 생리활성 분자의 기능적 조절과 광범위하게 관련되어 있다.
모든 MMP들은 불활성 형태의 MMP를 유지하는 프로-도메인 및 세포외 매트릭스 성분들의 폭넓은 스펙트럼에 작용하는 촉매적 도메인을 포함하는 프로토타입 구조들을 포함한다.
매트릭스 메탈로펩티다아제 9(MMP9)는, 또한 92 kDa 타입 IV 콜라게나아제 또는 젤라티나아제 B (GELB)으로 알려져있으며, 변성 및 기저 막 콜라겐의 감성(degradation) (Agrawal et al., 2006 J. Exp . Med . 203, 1007-1019), 및 프로테아제 저해제( Liu et al., 2000, J. Exp . Med . 188, 475-482.), 케모카인(Van den Steen et al., 2000, Lancet Neurol . 2, 747-756), 및 시토카인( Nelissen et al., 2003, Brain, 1371- 1381)를 포함하는 용해성 단백질의 가공에 의한 염증의 촉진에 책임이 있는 MMP 패밀리의 구성원이다. MMP9는 또한 막 결합된 분자, 유사 성장인자 전구체 및 수용체, 티로신 키나아제 수용체 (TKRs), 세포 부착 분자( Bauvois , 2012, Biochim Biophys Acta . 1825(1):29-36.)의 단백질 가수분해에 의해 종양 세포의 이송, 침해 및 전이를 제어한다. 질병에서, MMP9는, 백혈구 e.g. 호중구(neutrophils), 단핵구/대식세포, 및 림프구뿐만 아니라, 섬유아세포, 근섬유아세포, 상피세포, 민무늬 근육 세포, 내피세포, 파골세포 및 종양 세포를 포함하는 많은 세포 타입에 의해 분비된다( Vandooren et al., 2013, Crit . Rev. Biochem . Mol. Biol. 48(3):222-72).
MMP9의 일반적 도메인 구조는 분비성 선도 시퀀스(secretory leader sequence), 촉매적 잠복에 필요한 저해성 프로-도메인, 함께 콜라겐 결합 도메인(CBD)를 형성하는 3개의 피브로넥틴 타입 II-유사 반복 루프(repeat loop)들을 포함하는 '스플릿(split)' 촉매 도메인, 초글리코실화된 프롤린-풍부한 링커(또한 OG 도메인이라 함), 및 헤모펙신-유사 C-터미널 도메인(PEX)을 포함한다.
매트릭스 메탈로펩티다아제 2 (MMP2)는, 또한 72 kDa 타입 IV 콜라게나아제 또는 젤라티나아제 A (GELA)로 알려져 있고, MMP9와 동일한 패밀리에 속하는 효소이다. MMP2 및 MMP9는 높은 아미노산 시퀀스 아이덴티디(전체 길이 단백질의 45.9% 및 촉매 도메인의 63.2%)를 나타내고, 매우 유사한 3D-구조, 특히 이들의 촉매 도메인에서 매우 유사한 3D-구조를 공유한다. 그러므로, 이 높은 구조적 및 아미노산 시퀀스 유사성으로 인하여 인간 MMP2에 대해 선택적인 저해성 항-인간 MMP9을 동정하는 것이 매우 어렵다( Morgunova et al., 1999, Science, 284: 1667 -1670).
많은 급성 염증성 및 자가면역 질환 상태, 섬유증 상태 및 침습성 암은 과량의 MMP9의 존재와 관련이 있고(Hu et al, 2007, Nature Reviews Drug Discovery, 6, 480-498; Ram et al, 2006, J. Clin . Immunol ., (26)4: 2 99 -307; Ai Zheng , 2003, Chinese journal of cancer, 22(2):178-84; Baugh et al, 1999, Gastroenterology, 117:814-822; Santos et al, 2013, Biochem Biophys Res Commun ., 438(4):760-4); Hersze?nyi et al, 2012, Int . J. Mol . Sci ., 13, 13240-13263; Lijnen , 2001, Thromb Haemost , 86: 324 -33　; Rosell et al., 2005, Stroke 36: 1415 -20; Whatling et al., 2004, Arterioscler Thromb Vasc Biol ., 24: 10 -11; Yasmin et al., 2005, Arterioscler Thromb Vasc Biol ., 25:372-8; Vassiliadis et al., 2011, BMC Dermatol., 11: 6), 그러므로, 이 효소는 치료적 개입에 대한 기대 목표로서 상당한 주목을 받아왔다.
강력한 임상 및 실험 증거는, 암 진행, 전이 및 짧아진 환자 생존과 함께 MMP9의 준위가 상승된 것과의 관련성을 나타내고 있으며, 이는 이것이 기저 막 및 세포외 매트릭스 성분들을 분해시켜 종양 세포 침입 및 전이에서 중요한 역할을 하기 때문이다. 인간 호중구 내 MMP9에 공유적으로 결합된, 호중구 젤라티나아제-관련 리포칼린(NGAL)(Triebel et al., 1992, FEBS Lett., 314, 386-388)은, MMP9이 단백질 가수분해적 감성(proteolytic degradation)이 되는 것을 방지하고, MMP9의 효소 활성을 증가시키고 연속해서 종양적 침입성 및 확산성을 증가시킨다(Yan et al., 2001, J. Biol . Chem ., 276, 37258- 37265). 혈청 내 MMP9/NGAL의 높은 농도는, 투명 신세포암(clear cell renal carcinoma) 내에서 보다 짧은 무진행 생존율(progression-free survival) 및 좋지 못한 전체 생존율과 관련되어 있다 (Perrin et al., 2011, Prog . En Urol . J. Assoc . Fr . Urol . Soci?t ? Fr . Urol ., 21, 851-858).
구체적으로 MMP-9의 역할은, 대장암 (Hersz?nyi et al., 2012, Int J Mol Sci,. 13(10):13240-63), 췌장암 ( Gao et al., 2015, Med Oncol . 32(1): 418 ), 유방암 (Kim et al., 2014, BMC Cancer. 14(1):959), 폐암 (Ruiz-Morales et al., Tumour Biol . 36(5):3601-10), ), 난소암 ( Naylor et al., 1994, Int J Cancer, 58: 50-6), 방광암 (Szarvas et al., 2011, Nat Rev Urol ., 8(5):241-54) 및 위암 (Chen et al., 2015, Int J Clin Exp Med . 8(1):546- 57)와 관련되어 있다.
MMP9의 역할은 면역 병리학 및 특히 염증성 장 질환(IBD)에 나타났으며, 여기서 MMP9는 활성적으로 염증이 생긴 장 점막 내에 가장 풍부하게 발현된 MMP로서 보고되며, 이들의 발현은 질병 활성과 큰 연관이 있다(Naito 및 Yoshikawa , 2005, 26:379-390). IBD에서, MMP9는 염증전 시토카인 및 케모카인의 부적당한 조직 리모델링 및 활성화에서 중요한 역할을 하여, 이로 인하여 활성화된 백혈구의 점증이 가능해지는 것으로 생각된다(Nuala et al., 2014, Inflamm . Bowel 0:1-15). 보다 구체적으로, 누공 생체 검사(fistula biopsy)에서 항문 주변의 누공의 누공 트랙에 따른 MMP9 발현의 증가 및 MMP9 활성의 증가가 크론병(CD) 환자에서 보고되었으며, 이는 MMP9가 CD의 심각한 합병증을 나타내는 누공의 형성에 기여한다는 가설을 뒷받침한다(Efsen, et al., 2011, Basic Clin Pharmacol Toxicol . 109(3):208-16). 게다가, 감소된 NGAL/MMP9 혈청 준위는 또한 인플릭시맵으로 처리된 궤양성 대장염 환자에서 점막 치료와 관련이 있었다(de Bruyn et al., 2014, Inflamm . Bowel Dis., 20, 1198-1207).
MMP9의 역할은, 다양한 신경 질환, 예를 들어 알츠하이머병 (Mroczko et al., 2013, J. Alzheimers Dis ., 37(2): 273 -278), 다발성 경화증 (Mirshafiey et al., 2014, Sultan Qaboos Univ Med J,, 14(1) , 13-25), 신경염증 또는 뇌경색 (Candelario-Jalil et al., 2009, Neuroscience 158(3):983- 94)과 관련이 되어있었다. 알츠하이머병에서, 전략 뇌 영역(strategic brain region) 내에서 타우 올리고머 형성에 대한 응집전 영향은 MMP9의 잠재적 신경 독 부작용일 수 있다(Wang et al., 2014 BioMed Res. Int ., 2014, ID 908636: 1 - 8). 증가된 MMP9-매개 감성의 결과로서, 세포외 공간에서 mNGF를 분해시키는 성숙한 신경 성장 인자(mNGF)의 감소는, 경도인지 장애(mild cognitive impairment)에서 인지 결손 및 알츠하이머병 내에서 부분적으로 발병의 기저를 이룰 수 있다는 것을 암시하였다(Bruno et al., 2009, J Neuropathol . Exp . Neurol ., 68(12): 1309 -1318).
MMP9의 역할은, 섬유증 질환, 예를 들어 전신 경화증, 다병소성 섬유경화증(multifocal fibrosclerosis), 골수 이식 수용체 내 경피증성 이식편대 숙주병(sclerodermatous versus host disease), 신성 전신 섬유화증뿐만 아니라, 기관-특이적 질환(organ-specific disorder), 예를 들어 폐, 간, 및 신장 섬유증과 관련되어 있다( Piera - Velazquez et al., 2011, Am J Pathol ., 179(3):1074-80, Peng et al., 2012, J. Clin . Immunol ., 32(6):1409-14). 예를 들어 최근 연구는, MMP들, 특히 MMP9는, 레지던트 섬유아세포(resident fibroblast)의 관형 세포 상피 간질 세포 전이(tubular cell epithelial-mesenchymal transition) 및 활성화, 상피 간질 세포 전이 및 및 주피세포-근섬유아세포 전환분화(transdifferentiation)를 통한 신장 섬유증의 개시 및 진행과 관련이 있다 ( Zhao et al., 2013, World J Nephrol., 2(3):84-9).
다양한 눈 질환의 병리생리학은 MMP9 활성과 관련되어 있다. 일부 예들은 다음을 포함한다: 렌즈의 섬유증 병리학(Nathu et al., 2009, Ex. Eye Res., 88(2): 323 -330), MMP9의 상향 조절과 관련된 각막 질환(Sakimoto et al., 2012, Cornea 31, Suppl 1:S50 -6), 환자 망막 및 유리체 내 증가된 MMP9를 나타내는 당뇨망막병증(diabetic retinopathy) (Kowluru et al., 2012, Expert Opin Investig Drugs, 21(6):797-805) 및 MMP9가 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 보여지는 노인황반변성 (Nita et al., 2014, Med Sci Monit , 20:1003- 16).
심혈관계 질환은, 세포외 매트릭스의 재편성 및 MMP9의 활성화에 관련된 염증 및 변형된 조직 리모델링에 관련되어 있다. 그러므로, MMP9는 심장병 , 예를 들어 고혈압증, 죽상등맥경화증, 심근경색증, 심부전 및 관상동맥질환(coronary artery disease)의 병리생리학과 관련되어 있다고 생각된다( Yabluchanskiy et al., 2013, Physiology, 28(6):391-403).
게다가, MMP9의 역할은 다양한 집단의 질병들, 예를 들어 피부병( Mezentsev et al., 2014, Gene, 540(1):1-10), 패혈증 및 급성 염증성 쇼크 증후군( Lorento et al., 2014, PLoS One 9(4):e94318 ; Qui et al. 2012, Comb Chem High Throughput Screen., 15(7):555-70), 골관절염(osteoarthritis) ( Bian et al., 2012, Front Biosci (Elite Ed). 4:74-100), 화학요법 유도 점막염 (Al- Dasooqi et al., 2009, Cancer Chemother Pharmacol ., 64: 1 -9), 경구 병 (Al- Azri et al., 2013, Oral Diseases, 19: 347 -359), 골경화증 ( Teti et al., 1999, J Bone Miner Res. 14(12):2107-17), 자궁내막증(endometriosis) ( Pitsos et al., 2009, Reprod Sci., 16(8):717-26) 또는 시가스병(Chagas disease) (Geurts et al., 2012, Pharmacol Ther ., 133(3):257- 79)과 관련되어 있다.
MMP9의 단량체 및 이합체 형태 모두 다양한 정상 및 종양 세포(Goldberg et al., 1992, J. Biol . Chem ., 267, 4583-4591) 및 생물학적 유체 및 조직 내에서 확인되었으며, 이는 두 형태 모두 생리학적으로 관련되어 있다는 것을 나타낸다. 단백질 가수분해에 추가로, 헤모펙신 도메인을 통한 MMP9의 이합체화는 MMP9 증가된 세포 이동(Dufour et al., 2010, J. Biol . Chem ., 285, 35944- 35956)에 필요한 것으로 나타나며, 다양한 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 샘육종 및 백혈병 세포주 내에서 MMP9 단량체 및 이합체의 분비 패턴의 연구는, 높은 MMP9 및 특히 이합체 분비 준위가 가장 공격적인 암세포주와 관련이 있다는 것을 밝혔다 (Roomi et al., 2014, Int . J. Oncol . 44, 986-992). 이들 관찰 사항들 모두 함께, MMP9 및 보다 특히 MMP9 이합체의 모든 자연 형태 및 NGAL/MMP9 복합체를 효과적으로 저해하여 매우 공격적인 전이성 암(metastatic cancer)을 치료하는데 MMP9 중화제에 대한 중요성을 강조하고 있다.
역사적으로, MMP 봉쇄에 대한 전략은, 활성화된 효소의 촉매 사이트와 친밀하게 상호작용하는 소분자 저해제를 디자인하는데 초점이 맞추어졌다. 현재까지, 이러한 접근은, 용량-제한 독성 및 심각한 부작용, 예를 들어, 근골격 증후군으로 인하여 부분적으로 기대한 임상적 유용성으로 바꾸는데 실패하였다. MMP9 촉매 사이트의 구조물은 MMP 패밀리 전체를 거쳐 매우 잘 보존되어 있기 때문에, 이 사용금지 사유는 치료적 용량에서 MMP 표적 선택성이 결핍되게 할 수 있다.
항체 또는 항체 조각은, 보다 높은 표적 저해적 선택성을 제공하는 활성-사이트 지향성 소분자보다 더 큰 부분의 MMP9 구조체와 상호작용하고, 차단하는 경향이 있다.
MMP9 특이적 일부 항체는 선행 문헌에 설명되어 있으며, 예를 들어 마우스 AB0041 및 인간화 AB0045(WO 2013/130078)뿐만 아니라, 인간 539A-M0240-B03 (US 2009/0311245), M0166-F10 (US 2009/0311245 US 2011/0135573), 539A-M0237-D02 (US 2009/0297449 및 US 2011/0135573), 마우스 REGA-3G12 (Martens et al., 2007, Biochim. Biophys . Acta 1770, 178- 186)이 있다. 선행 문헌의 일부 항체들은 MMP9 및 MMP2 모두에 결합하고 있다는 것으로 설명되어 있다.
그러므로, MMP9에 대한 높은 친화성 및 특이성을 나타내고 다른 MMP들, 예를 들어 MMP2에 대한 약하거나 또는 제한된 친화성 및/또는 특이성을 나타내는 새로운 치료제의 개발에 대한 필요성이 있으며, 예를 들어 MMP2는, 비인간 MMP9 오솔로그(ortholog)에 대해 개선된 교차-반응성을 나타내며, 다른 추가적인 성질, 예를 들어 인간 내 감소된 면역원성 및/또는 보다 높은 안정성을 갖게 되어, 인간 내에 치료적 응용에 이들을 특히 적당하게 만든다.
본 발명은, MMP9, 특히 인간 MMP9에 결합하는 단백질에 관한 것으로, 여기 설명된 중사슬 가변 영역의 적어도 하나의 조각 및/또는 항체의 경사슬 가변 영역의 적어도 하나의 조각을 포함한다.
본 발명의 제1 양상은 MMP9 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 또는 조각은, SEQ ID NO: 41로 이루어진 영역 내 적어도 하나의 아미노산, SEQ ID NO: 42로 이루어진 영역 내의 적어도 하나의 아미노산 및 SEQ ID NO: 43으로 이루어진 영역 내의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 에피토프와의 상호작용에 의해 MMP9에 결합하며, 상기 영역은 인간 MMP9의 촉매 도메인 내에 있다.
본 발명의 제2 양상은 다음 단계를 포함하는 중사슬 가변 영역를 포함하는 MMP9 특이적 분리 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 제공한다:
(i) SEQ ID NO: 2의 중사슬 CDR1, 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR1의 1, 2 또는 3 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 3의 중사슬 CDR2, 또는 이들의 변이체로서 CDR2의 1, 2, 또는3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(iii) SEQ ID NO: 4의 중 사슬 CDR3 또는 이들의 변이체로서 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체.
본 발명의 보다 특정 양상은, 다음으로부터 선택된 경사슬 가변 영역를 더 포함하는 상기 기술된 분리된 항체를 제공한다:
a) 다음 영역을 포함하는 경사슬 가변영역:
(i) SEQ ID NO: 21의 경사슬 CDR1, 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되고;
(ii)SEQ ID NO: 22의 경사슬 CDR2, 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며;
(iii) SEQ ID NO: 23의 경사슬 CDR3, 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며, 또는
b) 다음을 포함하는 경사슬 가변 영역:
(i)SEQ ID NO: 26의 경사슬 CDR1, 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며;
(ii)SEQ ID NO: 27의 경사슬 CDR2, 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며;
(iii) SEQ ID NO: 28의 경사슬 CDR3, 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된다.
본 발명의 제3 양상은 여기 설명된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 암호화하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 제4 및 제5 양상은, 각각 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 제6 양상은, 여기 설명된 항체 또는 이들의 조각을 제조하는 방법으로서, 상기 항체 또는 이들의 조각의 발현을 촉진하기에 충분한 조건하에서 상기 항체 또는 이들의 조각을 암호화하는 핵산 시퀀스를 포함하는 발현 벡터로 변형된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제7 양상은, 여기 설명된 것처럼, 하나 이상의 (i) MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각, (ii) 핵산 시퀀스, (iii) 벡터, 및/또는 (iv) 숙주 세포, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 제8 양상은 여기 설명된 하나 이상의 항-MMP9 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함하는 영상화 조성물 또는 진단 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제9 양상은 여기 설명된 하나 이상의 항-MMP9 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함하는 키트이다.
본 발명의 제10 양상은 MMP9 관련 질병, 예를 들어 염증성 및/또는 자가면역 질환 또는 암 또는 종양 또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료의 용도로서 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 제형에 관한 것이다.
제11 양상은 MMP9 관련 질환, 예를 들어 염증성 및/또는 자가면역 질환 또는 암 또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 치료가 필요한 대상에 치료학적으로 효과적인 함량의 상기 항체 또는 이들의 조각 또는 상기 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 양상은, 약제로서 사용되는 본 발명의 항-MMP9 항체 또는 이들의 제형에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
도 1은, 인간 MMP9 단백질의 분자 도메인 구조의 개략적 다이아그램을 나타낸다. 번호들은 성숙 MMP9 단백질 아미노산 시퀀스 상의 아미노산 위치를 나타낸다.
도 2(도 2a 내지 도 2c)는, 인간, Cynomologus 몽키 (cyno), 랫트 및 마우스 MMP9의 아미노산 시퀀스의 얼라이먼트를 나타낸다. (*)는 단일의 완전히 보전된 잔기를 갖는 위치들을 나타내고, (:)는 Gonnet PAM 250 매트릭스 내에서 강하게 유사한 성질들-스코어링 > 0.5의 집단들 사이의 보전을 나타내며, (.)는 Gonnet PAM 250 매트릭스 내에서 약하게 유사한 성질들-스코어링 ≤ 0.5의 집단들 사이의 보존을 나타낸다.
도 3(도 3a 및 도 3b)은, 본 발명에 따른 항-MMP9 항체의 인간 중사슬 불변 영역 및 인간 중사슬 가변 영역을 포함하는 예시적 인간 중사슬 항체 조작의 시퀀스 얼라이먼트를 나타낸다. 중사슬 항체 조각 시퀀스는 이름 앞의 *가 포함된 가변 중사슬 영역의 시퀀스 이름으로 표지된다: *F20-VH, *F20-VH-GL1, *F20-VH-GL1-V1-V9, *F20-VH-GL1-V1-V9-V14, *F20-VH-GL1-V4-V9, *F20-VH-GL1-V4-V9-V14. CDR들은 밑줄로 표시된다. 약어는 도 2에 설명된 것들과 동일하다.
도 4는 본 발명에 따른 항-MMP9 항체의 인간 경사슬 불변 영역 및 인간 경사슬 가변 영역를 포함하는 예시적 인간 경사슬 항체 조각의 시퀀스 얼라이먼트를 나타낸다. 경사슬 항체 조각 시퀀스는 이름 앞의 *으로 포함된 가변 경사슬 영역의 시퀀스 이름으로 표지된다: *B03-VL, *B03-VL-GL1. CDR들은 밑줄로 표시된다. 약어는 도 2에 설명된 것들과 동일하다.
도 5는, 본 발명에 따른 항-MMP9 항체의 인간 경사슬 불변 영역 및 인간 경사슬 가변 영역를 포함하는 예시적 인간 경사슬 항체 조각의 시퀀스 얼라이먼트를 나타낸다. 경사슬 항체 조각 시퀀스는 이름 앞의 *로 포함된 가변 경사슬 영역의 시퀀스 이름으로 표지된다: *B08-VL, *B08-VL-GL6. CDR들은 밑줄로 표시된다. 약어는 도 2에 설명된 것들과 동일하다.
도 6은, 인간 proMMP9 (A, B) 및 인간 성숙 MMP9 (C, D)의 쪽으로 본 발명에 따른 예시적 항-MMP9 항체(F20-VH/B03-VLc 및 F20-VH/B08-VLc 변이체)의 중화 능력(neutralizing activity)의 적정을 나타낸다. F20-VH/B03-VLc 변이체 (A, C), F20-VH/B08-VLc 변이체 (B, D).
도 7은, 다양한 재조합 인간 매트릭스 메탈로프로테이나제의 촉매 도메인 쪽으로의 본 발명에 따른 예시적 항-MMP9 항체의 중화 능력을 나타낸다.
도 8은, 호중구-유래 인간 이합체 MMP9 (원), 인간 단량체 MMP9 (삼각형) 및 인간 NGAL-MMP9 복합체 (사각형) 쪽으로의 본 발명에 따른 예시적 항-MMP9 항체(F20-VH/B08-VLc 변이체; 실선 및 닫힌 기호) 또는 동종 대조군(파선 및 열림 기호)의 중화 능력의 적정을 나타낸다.
도 9는, 인간 호중구로부터 유래된 MMP3-활성화된 인간 단량체 MMP9 (삼각형), 이합체 MMP9 (원) 및 NGAL-MMP9 복합체(사각형)로의 본 발명에 따른 예시적 항-MMP9 항체 (F20-VH/B08-VLc 변이체; 실선 및 닫힌 기호) 또는 항-MMP9 비교 항체 1(파선 및 열린 기호)의 중화 능력의 적정을 나타낸다.
도 10은, 재조합 인간 MMP9 항원에 대한 항-MMP9 항체의 결합의 동역학을 나타낸다. MMP3-활성화된 MMP9 (패널 A 및 B) 및 pro-MMP9 (패널 C 및 D)는 BIAcore 센서 칩 위에서 적정되었고, 이 위로 항-MMP9 항체, F20-VH/B08-VLc 변이체 (패널 A 및 C) 및 비교 항체 1 (패널 B 및 D)이 1차적으로 고정되었다. 결합 동력학의 센서 그람이 보고된다. 공명 단위(RU). 모든 y 축-반응(RU): 모든 x 축-시간(s).
도 11은, 인간 MMP9에 대한 항-MMP9 항체의 직접적 및 경쟁적 결합을 나타낸다. pro-MMP9 (패널 A) 또는 MMP3-활성화된 MMP9 (패널 B)쪽으로의 다양한 농도의 바이오틴화된 항-MMP9 항체 F20-VH/B08-VLc 변이체 (닫힌 원) 및 비교 항체 1 (개방 원)의 직접적 결합 능력은, 표준 ELISA 프로토콜을 사용하여 평가되었다. MMP9 항원은 2.5㎍/ml으로 코팅되었다. 대조군은 스트렙타비딘-HRP 단독 (닫힌 삼각형), 또는 인간 IgG4 동종 대조군 더하기 바이오틴화된 항-인간-IgG 2차 단계 Fab 항체 (닫힌 사각형)이었다.
비교 결합 실험(패널 C)를 위하여, 완충제(없음) 또는 정제된 F20-VH/B08-VLc 변이체 또는 비교 항체 1(둘 다 50 ㎍/mL로 사용됨)로 사전 배양 후, 최적 용량의 바이오틴화된 비교 항체 1 (2.5㎍/mL) 또는 F20-VH/B08-VLc 변이체 (50㎍/mL)을 사용하여, 코팅된 MMP3-활성화된 MMP9가 밝혀졌다. 패널 A, B, C에 대하여, 결과들은 이중으로 수행된 각 조건들에 대하여 정정된 흡광도(A450-A620)의 평균 ± SD으로서 표현된다.
도 12는 Matrigel-코팅된 trans웰을 통해 암세포주 침입에 대한 항-MMP9 항체 (F20-VH/B08-VLc 변이체)의 효과를 나타낸다. MGC803 인간 위암 세포는 Phorbol 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 및 광범위한 화학적 저해제인 MMPs (GM-6001), 항-MMP9 항체 (F20-VH/B08-VLc), 동종 대조군 또는 배지 단독으로 배양되었다. 침입하는 세포는 Calcein-AM을 사용하여 16시간 후에 정량화되었다. 각 조건들은 이중으로 수행되었고 형광 단위의 평균 및 SD가 보고되었다.
도 13는, DSS-유도된 마우스 대장염의 내시경 스코어를 나타낸다. DSS 유도 후 6일에, 마우스가 항-MMP9 항체(F20-VH/B08-VLc 변이체)에 의해 또는 동종 대조군 항체에 의해 처리되었다. F20-VH/B08-VLc 변이체의 효과는 흑색 막대로서, 동종 대조군은 빗금 막대로서 나타낸다. 내시경 스코어의 평균 및 SD는 처리된 마우스(n=5, F20-VH/B08-VLc; n=6, 동종 대조군)의 두 집단들에 대하여 보고되며; 집단 데이터(DSS 유도 후 14일에 F20-VH/B08-VLc vs 동종 대조군)의 통계적 비교는, Graph Pad Prism을 사용하는 투-웨이의, 쌍을 이루지 않은 T 시험을 사용하여 수행되었다. *p= 0.005.
도 14는, 항-MMP9 항체 (F20-VH/B08-VLc 변이체) 또는 동종 대조군 항체로 처리된 DSS-유도 대장염을 갖는 마우스의 큰창자(결장) 부분의 총 조직학 스코어(histology score), 잠입 및 상피 손상 스코어를 나타낸다. (A) 총 조직학 스코어, (B) 잠입 (C) 상피 손상. 각 기준에 대한 개별 값, 평균 및 SD는 2개 집단의 처치된 마우스에 대하여 보고된다(n=5, F20-VH/B08-VLc; n=5 , 동종 대조군).
도 15는 헤마톡실린-에오신으로 착색된 마우스 창자의 외식된 이식편(explanted graft)의 대표적인 단면도를 나타낸다. (A) 0 일 - 개방 루멘 및 전형적인 크립트(crypt) 구조를 갖는 신선하게 분리된 소장 절제부. (B) 동종 대조군 14일 - 동종 대조군-처리된 마우스(n=5) 내에 이식한 14일 후 창자의 루멘의 완전한 폐색. (C) F20-VH/B08-VLc 변이체 14일 - 항-MM9-처리된 마우스(n=5) 내에 이식 14일 후 창자의 루멘의 부분적 폐색.
도 16은, 시리우스 레드로 착색된 마우스 창자의 외식된 이식편의 대표적 단면도 및 콜라겐 층 두께의 정량화를 나타낸다. 신선하게 분리된 소창자 절제(A 및 B). 동종 대조군-처리된 마우스 내 이식 후 14일(C 및 D). 항-MMP9 항체-처리된 마우스 (F20-VH/B08-VLc 변이체) 내 이식 후 14일 (E 및 F). 투과 광 (A, C 및 E), 편광 (B, D 및 F). (G) 항-MMP9- 또는 동종 대조군-처리된 마우스로부터 다른 자리의 창자 이식편에서 콜라겐 층 두께의 정량화. 이식 부분의 콜라겐층 두께의 평균 및 SD는 2개 집단의 처리된 마우스 (72 부분, F20-VH/B08-VLc; 64 부분, 동종 대조군)에 대해 보고된다. 집단 데이터(F20-VH/B08-VLc vs 동종 대조군)의 통계적 비교는, Graph Pad Prism를 사용하는 투 웨이의, 쌍을 이루지 않은 T 시험을 사용하여 수행되었다. ***p < 0.0001.
정의
용어 "매트릭스 메탈로프로테이나제 9", 약어 "MMP9"는 또한, 92 kDa 타입 IV 콜라게나아제, 92 kDa 젤라티나아제 또는 젤라티나아제 B (GELB)로 알려져 있고, 인간에서, NCBI 수납번호(accession number) ENSG00000100985 하에서 시퀀스가 개시되어 있는 MMP9 유전자에 의해 암호화된 효소이다. 인간 MMP9의 형태는, NCBI 수납 번호 NP_004985.2 하에서 이용가능한 총 707 아미노산의 시퀀스를 포함한다(SEQ ID NO: 1). MMP9의 일반적 도메인 구조는 분비 선도 시퀀스(SEQ ID NO: 1 상에 잔기 1-19), 촉매적 잠재성에 대해 필요한 억제적 프로-도메인(SEQ ID NO: 1 상의 잔기 20-106), 콜라겐 결합 도메인(CBD)를 함께 형성하는 3개 피브로넥틴 타입 II-유사 반복 루프들을 포함하는 '스프릿' 촉매 도메인(SEQ ID NO: 1 상 잔기 107-441), 하이퍼글리코실화된 프롤린-풍부한 링커(OG 도메인을 의미함)(SEQ ID NO: 1상의 잔기 442-520), 및 헤모펙신-유사 반복 C-터미널 도메인 (PEX) (SEQ ID NO: 1 상의 잔기 521-707) (Rowsell et al., 2002, J Mol Biol 319:173-81) 을 포함한다(도 1). MMP9는 프로-도메인에 의해, 불활성적, 잠복 형태로서 분비 및 유지된다. 프로-도메인의 단백질 분해적 제거는 MMP9의 효소적 활성을 활성화하고, 이후 MMP9는 "활성 MMP9"라 할 수 있다. 이의 촉매 도메인은 젤라틴-결합 영역을 포함하며, 이는 젤라틴에 대해 특이적 친화성을 제공한다. 젤라틴에 추가로, MMP9는, 콜라겐 (e.g. 콜라겐 IV, 및 콜라겐 V), 엘라스틴, 갈랙틴3, 엔탁틴 및 ICAM-1 (Ram et al, 2006, J. Clin . Immunol . 26, 299-307), 및 시토카인 및 케모카인 (Opdenakker et al, Trends Immunol . 2001: 22 :527- 81)을 포함하는 다양한 기질을 갖는다.
여기에 참조된 용어 "항체"는 항원에 결합하는 폴리펩티드를 지명한다. 이는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 조각을 포함한다. 용어 "항체"는 이의 가장 넓은 의미로 사용되며 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 및 본 발명의 특징적 성질, 특히 표적 항원에 결합하는 능력, 보다 구체적으로 본 발명의 항체에 의해 인식된 것과 동일한 MMP9의 에피토프에 대한 결합 능력이 유지되는 한 추가로 조작된 항체를 포함한다. 항체 및 이들의 조각의 예는 가변 도메인 조각("Fv", 항체의 싱글 암의 VH 및 VL 도메인로 이루어짐), Fab 조각 (VH, VL, CH1 및 CL 도메인로 이루어진 1가 조각), Fab2 조각 (2가), Fab3 조각 (3가), Fab' 조각 (힌지 영역을 갖는 Fab), F(ab')2 조각 (힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개 Fab 조각을 포함하는 2가 조각), Fd 조각 (VH 및 CH1 도메인으로 이루어짐), rIgG (환원된 IgG 또는 half-IgG), 다이어바디(diabody), 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 하나 이상의 항체의 조각을 포함하는 1가 항체, 2가 또는 다가 항체, 단일 사슬 가변 조각 (ScFv), bis-scFv (이중 특이성), 및 항체의 유도체, 예를 들어 디설파이드 안정화된 Fv 조각, CDR-함유 펩티드뿐만 아니라, 상기 임의의 것들의 에피토프-결합 조각를 포함한다( Holliger 및 Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23(9): 1126 -1136). 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된, 적어도 2개의 중(H) 사슬 및 2개의 경(L) 사슬을 포함하는 글리코프로테인, 또는 이들의 항원-결합 조각을 의미한다. 각 중사슬은 중사슬 가변 영역 (VH) 및 중사슬 불변 영역 (CH)을 포함한다. 각 경사슬은 경사슬 가변 영역 (VL) 및 경사슬 불변 영역 (CL)을 포함한다. 포유동물 내에서, 상기 중사슬은, 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (ν) 또는 무(μ)일 수 있으며, 이는 각각 항체 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 류라고 정의한다. 포유동물 내에서, 경사슬은, 람다 (λ) 또는 카파 (κ)일 수 있다. 포유동물 내에서, 항체의 류에 따라서, 중사슬 불변 영역는 3개 면역글로블린 도메인, CH1, CH2, 및 CH3 (IgA, IgD, IgG에 대해) 또는 4개 면역글로블린 도메인, CH1, CH2, CH3, 및 CH4 (IgE 및 IgM에 대해)을 포함한다. 경사슬 불변 영역는 하나의 면역글로블린 도메인, CL을 포함한다. 항체는 IgA, IgG, IgE, IgD 및 IgM의 구조체뿐만 아니라 이들의 임의의 서브타입을 가질 수 있다. 항체는 임의의 공급원, 특히 영장류(인간 및 비-인간 영장류) 및 영장류화된 공급원을 포함하는 임의의 공급원으로부터 얻어질 수 있다.
용어 "가변 도메인" 또는 "가변 영역" (여기 사용된 경사슬의 가변 도메인(VL) 및 중사슬의 가변 도메인(VH))은 항원에 항체를 결합시킬 때 직접적으로 관여하는 경사슬 및 중사슬 도메인 쌍 각각을 의미한다. 가변 경사슬 및 중사슬 도메인은 동일한 일반 구조를 가지며, 각 도메인은, 3개의 "초 가변 영역" 소위 "상보성 결정 영역" 또는 "CDRs"에 의해 연결된, 시퀀스가 광넓게 보존된 4개 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 상기 프레임워크 영역은 β-시트 컨포메이션을 채택하고, 상기 CDRs는 β-시트 구조를 연결하는 루프들을 형성할 수 있다. 각 사슬 내 CDRs는 프레임워크 영역에 의해 이들의 3차원 구조가 유지되고, 다른 사슬들의 CDRs와 함께 항원 결합 사이트를 형성한다. 여기 사용될 때 용어 "항체의 항원-결합 부분"은, 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 항체의 항원-결합 부분은 상보적 결정 영역 또는 CDRs의 아미노산 잔기을 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 여기 정의된 초가변 영역 잔기외 이들 가변 도메인 영역이다. 그러므로, 항체의 경사슬 및 중사슬 가변 도메인은 N- 내지 C- 말단을 포함한다: 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. CDR 및 FR 영역의 잔기는 Kabat et al ( 시퀀스s of 단백질s of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Publication No. 91-3242)의 표준 정의에 따라 종래적으로 넘버링된다. 이 넘버링 시스템은 다르게 지정되는 경우를 제외하고 본 명세서에 사용된다. Kabat 잔기 지정은, 아미노산 잔기의 선형 넘버링에 항상 직접적으로 대응하는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 시퀀스는, 기본 가변 도메인 구조의, 프레임워크나 상보성 결정 영역(CDR)의 구조적 성분의 축약, 또는 이 안으로의 삽입에 대응하는 엄격한 Kabat 넘버링 내에서 보다 더 적거나 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 잔기의 정확한 Kabat 넘버링은, 표준 Kabat 넘버링 시퀀스를 갖는 항체의 시퀀스에서 상동성 잔기의 얼라인먼트에 의해 주어진 항체에 대하여 결정될 수 있다. 중사슬 가변 도메인의 CDRs는, Kabat 넘버링 시스템에 따라 잔기 31-35 (CDR- H1), 잔기 50-65 (CDR-H2) 및 잔기 95-102 (CDR-H3)에 위치된다. 경사슬 가변 도메인의 CDRs는 Kabat 넘버링 시스템에 따라 잔기 24-34 (CDR-L1), 잔기 50-56 (CDR-L2) 및 잔기 89-97 (CDR-L3)에 위치된다.
본 명세서에서, 다르게 설명되지 않으면, 모든 인간 면역 글로블린 중사슬 및 경사슬 도메인에 대하여, 넘버링은 "Kabat 넘버링 시스템" (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), Publication No. 91- 3242)에 따른다.
본 출원에서, 다르게 특정되지 않으면, 모든 인간 면역글로블린 중사슬 불변 도메인에 대하여, 넘버링은 "EU 넘버링 시스템" (Edelman et al, 1969, Proc Natl Acad Sci , 63(1): 78 - 85)에 따른다.
여기 사용된 용어 "모노클론 항체"는 실질적으로 동종의 항체의 개체군으로부터 얻어진 항체를 의미하며, 즉 상기 개체군을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고 동일한 항체를 의미하다. 모노클론 항체는 단일 항원 사이트에 대하여 직접적이며 매우 특이적이다. 변경 유전자(modifier) "모노클론"은, 항체의 실질적으로 동종의 집단체로부터 얻어진 항체의 특성을 나타내며, 이는 임의의 특정 방법에 의해 항체의 제조를 요구하는 것으로 이해되는 것은 아니다.
용어 "키메라 항체"는 일반적으로 하나의 공급원 또는 종의 가변 영역 및 다른 공급원 또는 종들로부터 유래된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체를 의미하며, 통상 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 키메라 항체의 전형적 예는 쥐과 가변 영역 및 인간 불변 영역를 포함하는 것들을 포함한다. 여기 정의된, 이 용어는 또한 제1 인간 항체의 CDRs의 적어도 하나 및 제2 인간 항체의 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체를 포함한다. 이것은 또한, 제1 인간 항체의 중사슬 CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 제2 인간 항체의 경사슬 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "인간화된 항체"는 상기 비-인간종의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로블린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 비-인간 종의 항체를 말한다. 인간화된 항체는 선택적으로 CDRs가 유래된 비인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크 잔기를 더 포함할 수 있다.
용어 "인간 항체" 또는 "완전한 인간 항체"는 중사슬 및 경사슬 모두의 가변 영역 및 불변 영역가 모두 인간 기원, 또는 인간 기원의 시퀀스와 실질적으로 동일한 항체를 의미하나, 필연적으로 동일한 항체는 아니다.
용어 "분리된 항체"는 자연 환경의 성분으로부터 분리된 항체를 의미한다. 예를 들어, 분리된 항체는, 전기영동(e.g. SDS-PAGE, 등전점 전기영동(isoelectric focusing), 모세관 전기이동(capillary electrophoresis)) 또는 크로마토그래피(e.g. 이온 교환 또는 역상 HPLC (고성능 액체 크로마토그래피) 방법을 포함하는 종래 기술의 방법 (see e.g. Flatman et al, 2007, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci , 848: 79 - 87)으로 결정된 것으로서 95% 또는 99% 순도 이상으로 정제되었다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리머를 의미한다. 핵산 분자의 예는, DNA, RNA, 잠금 핵산 (LNA), 상보적 DNA (cDNA)을 포함한다.
"폴리펩티드" 는, 펩티드, 올리고펩티드, 올리고머 또는 단백질로 이해되며, 이들은 정상의 또는 변형된 펩티드 결합, 예를 들어 등전자 펩티드의 경우에 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 아미노산을 포함한다. 폴리펩티드는 유전자 코드에 의해 정해진 20개 아미노산외의 아미노산으로 구성될 수 있다. 폴리펩티드는 자연 가공, 예를 들어 번역 후 성숙 가공에 의해 또는 화학적 가공에 의해 변형된 아미노산으로 동등하게 구성될 수 있으며, 이는 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 그러한 변형은 문헌에 자세하게 설명되어 있다. 이들 변형은 폴리펩티드 내 어느 곳이나 나타날 수 있다: 펩티드 골격 내에서, 곁 사슬 내 또는 카복시- 또는 아미노-말단에서 조차 나타남. 예를 들어, 폴리펩티드 변형은, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유적 고정화, 헴(heme)의 공유적 고정화, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 고정화, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 고정화, 포스파티딜노시톨의 공유적 고정화, 공유 또는 비공유적 가교, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포밀화, 감마-카르복실화, 페길화를 포함하는 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 분해 가공, 인산화, 프레닐환(prenylation), 라세믹화(racemization), 세네로일화(seneloylation), 황산화(sulfatation), 아미노산 추가, 예를 들어 아르기닐화 또는 유비퀴틴화(ubiquitination) 을 포함하는 것으로 이해된다. 그러한 변형은 문헌에 완전히 설명되어 있다(단백질s 구조 및 Molecular Properties (1993) 2 nd Ed., T. E. Creighton , New York; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York; Seifter et al. (1990) Analysis for Protein modifications and nonprotein cofactors, Meth . Enzymol. 182: 626 -646 and Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications 및 Aging, Ann NY Acad Sci , 663: 48 -62).
"분리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "분리된 폴리펩티드" 는, 인간 신체로부터 분리되거나 또는 기술적 방법으로 제조된 이전에 정의된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로서 이해된다.
용어 "변이체"는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드에 적용할 수 있다. 예를 들어, 여기 의미한 펩티드 또는 폴리펩티드의 변이체는 참조된 펩티드 시퀀스에 대해 실질적으로 상동인 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미하나, 하나 이상의 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환 때문에 참조 시퀀스의 것과 다른 아미노산 시퀀스를 갖는 것을 의미한다. 실질적으로 상동은, 적은 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환을 제외하고 참조 펩티드 시퀀스와 동일한 변이체 아미노산 시퀀스를 의미한다. 실질적으로 상동은, 참조 아미노산 시퀀스와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%가 동일한 변이체 아미노산 시퀀스를 의미한다. 변이체 핵산 시퀀스는 참조 핵산 시퀀스와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일할 수 있다. 2개 아미노산 시퀀스 또는 2개 핵산 시퀀스의 아이덴티티는,육안 검사 및/또는 수학적 계산에 의해, 또는 시퀀스 비교를 위해 사용된 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 Clustal package version 1.83을 사용하여 시퀀스 정보를 비교하는 것에 의해 보다 용이하게 결정될 수 있다. 변이체는 적어도 하나의 보전적으로 치환된 아미노산을 갖는 시퀀스를 포함할 수 있으며, 이는 주어진 아미노산 잔기가 유사한 이화학적 특성을 갖는 잔기에 의해 대체되는 것을 의미한다. 일반적으로, 원래의 폴리펩티드 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 치환은 보존적으로 제조되어야만 한다. 보존적 치환의 예는 또 다른 하나의 앨리패틱 잔기, 예를 들어 Ile, Val, Leu, 또는 Ala의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 치환, 예를 들어 Lys 및 Arg; Glu 및 Asp; 또는 Gln 및 Asn 사이의 치환을 포함한다. 다른 그러한 보존적 치환, 예를 들어, 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환이 잘 알려져 있다(Kyte , et al, 1982, J. MoI . Biol ., 157: 105 - 131). 예를 들어, "보존적 아미노산 치환" 는, 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 효과를 거의 미치지 않거나 전혀 미치지 않도록 타고난 아미노산 잔기를 타고나지 않은 잔기로 치환하는 것과 관련될 수 있다. 원하는 아미노산 치환(보존적이거나 비-보존적)은 그러한 치환이 요구되는 시기에 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 예시적 아미노산 치환은 이하 표 1에 제시된다. 용어 "변이체"는 또한 참조된 펩티드 시퀀스에 대해 실질적으로 상동인 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하나, 하나 이상의 아미노산이 화학적으로 변형되거나 또는 아미노산 유사체에 의해 치환되었기 때문에 참조 시퀀스의 것과 다른 아미노산 시퀀스를 갖는다. 이 용어는 또한 글리코실화된 폴리펩티드를 포함한다.
원래의 잔기 치환의 예
Ala (A) Val, Leu, Ile
Arg (R) Lys, Gln, Asn
Asn (N) Gln
Asp (D) Glu
Cys (C) Ser, Ala
Gln (Q) Asn
원래의 잔기 치환의 예
Glu (E) Asp
Gly (G) Pro, Ala
His (H) Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe
Leu (L) Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K) Arg, Gln, Asn
Met (M) Leu, Ile, Phe
Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala, Tyr
Pro (P) Ala, Gly
Ser (S) Thr, Ala, Cys
Trp (W) Phe, Tyr
Thr (T) Ser
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V) Ile, Met, Leu, Phe, Ala
용어 "에피토프"는 항체 또는 이들의 항원 결합 조각에 대해 특이적 결합이 가능한 임의의 항원 결정 요인을 포함한다. 임의의 실시예에서, 에피토프 결정 요인은, 활성 표면 분류화의 분자들, 예를 들어 아미노산, 당 곁 사슬, 포스포릴, 또는 술포닐를 포함하며, 일부 실시예에서는 특이적 3차원 구조적 특성 및/또는 특이적 전하 특성을 포함할 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합된 항원의 영역이다. 일부 에피토프는 항원의 아미노산 시퀀스의 불연속적 부분을 포함하며, 여기서 비-접경 아미노산은 항원의 공간적 구조("구조적 에피도프(conformal epitopes)") 에 의해 서로 밀접하게 위치되거나 또는 항원 아미노산 시퀀스 상의 접경 아미노산("선형 에피토프")의 부분을 포함한다.
여기 사용된 것으로서, 표적 항원에 대한 "결합" 또는 "결합하는"는, 상기 표적 항원(예를 들어 MMP9)과 함께 또는 이에 대하여, 또는 상기 항체에 의해 인식된 에피토프를 포함하는 상기 표적 항원의 조각과 함께 또는 이에 대하여 상기 항체의 적어도 일시적인 상호작용 또는 관련성을 의미한다.
항체에 적용될 때 용어 "선택적으로 결합한다", "특이적으로 결합한다", "에 대한 특이적"은, 항체가 표적 폴리펩티드 또는 에피토프를 우선적으로 인식 및/또는 결합, 즉 임의의 다른 항원 또는 에피토프보다 높은 친화성을 갖는 것, 즉 폴리펩티드에 대한 결합은 다른 항원에 비-특이적 결합과 차별화될 수 있다. 항체의 결합 친화성은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에 의해, 예를 들어 Scatchard 분석법(Scatchard et al., 1949, Ann. N.Y . Acad . 1949. 51, 660- 672)에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
여기 사용된, "결합 친화성"은 일반적으로 분명한 연합 상수 또는 "Ka"을 의미한다. Ka는 해리 상수　"Kd"의 역수이다. 결합 친화성은, 평형 투석법, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명 또는 분광학 (e.g. 형광 분석을 사용)을 포함하는 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 결합 친화성을 평가하는 예시적 조건은 TRIS-완충제 (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2 at pH 7.5) 내 이다. 이들 기술은, 결합 단백질(또는 표적) 농도의 함수로서 결합된 및 유리 결합 단백질의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 결합된 결합 단백질([Bound])의 농도는 유리 결합 단백질([Free])의 농도 및 표적 위 결합 단백질에 대한 결합 사이트의 농도와 관련이 있고, 여기서 (N)는 다음 식에 의해 표적 분자 당 결합 사이트의 수 이다: [Bound]=N x ([Free])/((1/Ka) + [Free]). 2개 항체들 사이의 친화성 비교는 각 항체에 대한 Ka 값을 실질적으로 결정하는 것 없이, 그러나 Ka에 비례하는 친화성의 정량적 측정(ELISA 또는 FACS 분석에 의함) 또는 친화성의 정성적 측정 또는 친화성의 추리(inference) (e.g. 기능적 분석 또는 인비트로 또는 인비보 분석)을 기초로 하여 성립될 수 있다.
용어 항체의 "블로킹" 또는 "중화 능력"은 이의 표적 활성을 저해하는 능력을 의미한다. MMP9에 결합하는 항체에 적용된, 이 용어는, 프로 MMP9의 활성화를 저해하거나 및/또는 이의 기질 중 하나, 예를 들어 실시예 부분에서 설명된 젤라틴 에 대한 활성화된 MMP9의 촉매 활성을 저해하는 것에 의해, MMP9 활성을 일반적으로 중화하는 항체의 능력을 의미한다. 항-MMP9 항체의 중화 능력은 무세포(cell-free) 인비트로 분석, 또는 인비보 분석 또는 인비트로 기능적 분석, 예를 들어 인간 암세포주 침입 분석에 의해 결정될 수 있다. 인간 암 세포주 침입 트랜스웰 분석에서, 암세포는 기저막 매트릭스(Matrigel®)을 통해 분해 및 이동하여, 인근 혈관에서의 종양 세포 혈관 속 이물 주입(intravasation) 및 먼 조직의 혈관외 유출 및 먼 조직 내로 침입의 인비보 과정을 흉내낸다.
항체의 "효능(potency)"은, 주어진 항원 농도에서 반-극대 효과를 생성하는 항체/항원 결합 조각의 농도로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 항체의 "효과(effect)"는 표적의 활성의 저해 또는 중성화일 수 있다. 이 경우에, 반-극대 저해를 만드는 항체 농도는 IC50를 의미하며, 이는 mol/l 또는 M으로 주어진다. 주어진 항원 농도에서, 친화성의 개선으로는 항원의 결합이 더 이상 증가하지 않을 정도(소위 효능 천장) 이상으로 친화성이 도달될 때까지, 효능은 친화성에 의해 통상 영향을 받는다. MMP9에 대한 항체에 적용된, 효능은, 예를 들어 항체의 존재 내에서 젤라틴 기질의 MMP9 종속 소화의 IC50 값을 측정하는 것으로 결정될 수 있다.
중화 항체에 적용된, 용어 "저해의 효험(efficacy of inhibition)" 또는 "중화의 효험"은, 100%으로 정상화된 생물학적 또는 생화학적 활성의 잠재적 총 저해의 퍼센트로서 표현된, 특이적 생물학적 또는 생화학적 기능을 저해하는데 있어서 상기 항체의 효력의 측정이다. MMP9에 결합하는 항체에 적용된, 100% 효험은, 예를 들어 젤라틴 기질의 MMP9-종속 소화의 항체-매개된 총 저해일 수 있다. 여기 사용된 용어 항체 "이펙터 기능(effector function)"은 Fc 수용체 또는 리간드와 항체 Fc 영역의 상호작용의 결과로 나오는 생화학적 사건을 포함한다. 이펙터 기능은, FcνR-매개 이펙터 기능, 예를 들어 ADCC (항체 종속 세포-매개 세포독성) 및 ADCP (항체 종속 세포-매개 식세포작용), 및 보체- 매개 이펙터 기능, 예를 들어 CDC (보체 종속 세포독성)을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은, 이펙터 분자, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체 성분에 대한 항체의 친화성을 변경, 즉 증가 또는 감소, 바람직하게는 증가시키는 것에 의해 변경될 수 있다. Fc 수용체 또는 리간드와 항체 Fc 영역의 결합 친화성은 이펙터 분자 결합 사이트를 변경하는 것에 의해 변형될 수 있다. 이펙터 분자에 대한 항체 상의 결합 사이트를 변경하는 것은 전체 결합 친화성을 크게 변경하지 않고 상호작용의 기하학적 구조를 변경하여, 비생산적 결합 내에서처럼 이펙터 메커니즘을 비효과적이게 한다. 이펙터 분자 결합에 직접적으로 관련이 없으나, 그외는 이펙트 기능의 성능에 관련이 있는 사이트를 변경하는 것에 의해 이펙터 기능을 변경하는 것이 가능하다. 항체의 이펙터 기능을 변경하는 것에 의해, 다양한 양상의 면역 반응을 제어하는 것이 가능하며, 예를 들어,진단 및 치료에서 가능한 유리한 효과를 갖는, 면역 시스템의 다양한 반응들을 증가시키거나 또는 진압하는 것이 가능할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 생물학적으로 달리 바람직하지 않지 않은 물질로 구성된 담체를 의미한다.
용어 "담체"는 활성제외 다른 약제학적 제형 내에 존재하는 임의의 성분을 의미하며, 따라서 희석제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 필러, 착색제, 습윤제 또는 에멀화제, pH 완충화제, 방부제 및 이와 유사한 것을 포함한다.
여기 사용된, "치료" 및 "치료하는" 및 이와 유사한 것은 일반적으로 원하는 약리학적 및 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 효과는 질병, 증후군 또는 이들의 상태를 방지하거나 또는 부분적으로 방지하는 측면에서 예방적일 수 있거나 및/또는 질병, 상태, 증후군 또는 질병에 기여된 역효과의 부분적 또는 완전한 치료의 측면에서 치료적일 수 있다. 여기 사용된 용어 "치료"는 포유동물 내, 특히 인간 내의 질병의 임의적 치료를 포함하며, 다음을 포함한다: (a) 예를 들어 가족력을 기초로 하여, 질병을 갖는 것으로 아직 진단되지 않았지만, 질병을 갖는 성향이 있는 대상에서 발생하는 잘병의 예방; (b) 질병의 저해, 즉 이의 발달을 막거나; 또는 (c) 질병의 완화, 즉 질병 및/또는 이들의 증후군 또는 상태의 퇴행의 야기, 예를 들어 손상의 개선 또는 치료. 예를 들어, 염증성 장 질환의 치료는 질병 또는 질환의 증후를 방지, 감소 또는 제거, 예를 들어 설사, 복통 및 경련, 혈변(blood in the stool), 종기, 궤양 및 누공의 부분적 또는 전체적 완화하는 단계를 포함한다.
여기 정의된 "MMP9-관련 질병"은, MMP9의 발현 및/또는 활성에 의해 적어도 부분적으로 매개 또는 영향받는 질병을 정의한다. MMP-관련 질병의 예는, 염증성 및 자가면역 질환, 암 또는 종양, 폐병, 섬유증 병, 예를 들어 섬유증 폐병, 패혈증, 근육성 이영양증(muscular dystrophy), 알레르기, 신장 섬유증, 피부 경화증, 팽창된 심근증, 시가스병, 심혈관계 질환, 신경정신장애, 당뇨병, 및 눈병을 포함한다.
용어 "염증성 및 자가면역 질환"은 신체 내에 정상적으로 존재하는 물질 및 조직 각각에 대해 대상 신체의 비정상적 면역 반응으로부터 발생하는 면역 시스템 및 질병 또는 질환과 관련이 있거나 또는 관련이 없을 수 있는 염증성 비정상성으로서 여기에 일반적으로 정의되어 있다. 염증성 및 자가면역 질환의 비제한적 예는 크론병(CD)을 포함하는 대부분의 염증성 장 질환(IBD)(특히 크론병을 관통 및 협착), 궤양성 대장염(UC), 미확정성 대장염, 콜라겐성 대장염, 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반 루푸스 (SLE), 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 다발성 근염, 죽상등맥경화증을 포함한다.
용어 "염증성 장 질환(IBD)"는, 소화관(digestive tract) 모두 또는 부분의 만성 염증과 관련된 질병으로 정의된다. IBD의 비제한적 예는 크론병, 특히 비-관통 및 협착 크론병, 관통 및 협착 크론병, 및 누공 크론병, 궤양성 대장염 (UC), 미확정성 대장염, 콜라겐성 대장염, 림프구 대장염 및 창자의 섬유증을 포함한다. 크론병 (CD)은 입에서 항문까지 GI의 임의의 부분과 관련이 있을 수 있는 구역성 병변을 갖는 전층 염증(transmural inflammation)의 질병으로 정의된다. 궤양성 대장염은 결장에 한정된 점막 염증의 질병이다.
여기 정의된 "암" 또는 "종양"은, 신체의 다른 부분으로 침투 또는 퍼질 잠재성을 갖는 비정상적 세포 성장과 관련있는 질병들이다. 용어 "암"은, 이에 한정되지는 않지만, 조혈 암, 뇌 암, 유방암, 대장암, 두부 및 목 암, 췌장암, 난소암, 방광암, 폐암, 간 암, 흑색종, 전립샘 암, 근육 암, 간엽 암, 식도와 위 선암종, 비소세포 폐암(lung squamous cell carcinoma), 폐 편평 세포 암종, 폐 선암종, 위 선암종, 췌장 선암종, 간세포 암종대장암. 간세포 암종, 및 대장암에 의해 예시된 질병들을 지명한다.
용어 "폐병"은, 이에 한정되지 않지만, 천식, 섬유증 폐병, 예를 들어 특발성 폐, 만성 폐쇄성 폐 질병 (COPD) 및 비염(rhinitis)에 의해 예시되는 질병들을 지명한다.
용어 "섬유증 병"은, 영향받은 조직이 염증 또는 손상된 조직 내 또는 그 근처에서 섬유성 결합 조직(세포외 매트릭스의 성분, 예를 들어 콜라겐 및 피브로넥틴)이 과량 축적한 것으로 제시된 질병으로 정의되며, 이것으로 영구적인 상처, 기관 기능부전을 유도하여, 말기 간 질병, 신장병, 특발성 폐 섬유증 (IPF) 및 심부전에서 보여진 것처럼, 궁극적으로는 죽음에 이르게 할 수 있다. 섬유증 질병의 비제한적 예는 전신 경화증, 다병소성 섬유경화증, 골수 이식 수용체 내 피부 경화성 이식 편대 숙주병, 신성 전신 섬유화증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 골수섬유증 및 전신성 홍반 루푸스를 포함한다.
용어 "눈 상태" 또는 "눈병"은, 시력 손실을 유도하는 망막 색소 상피 및 광수용기의 점진적 악화와 관련된 눈의 질병 및/또는 망막 혈관에 대한 손상과 관련된 질병으로 정의된다. 눈 상태의 비제한적 실시예는 렌즈의 섬유증 병변, 각막 질환, 당뇨망막병증, "건성" 또는 "습성" 노인황반변성, 증식유리체망막병(proliferative vitreoretinopathy), 백내장 형성, 익상편(pterygia), 원추각막(keratoconus), 노인황반변성 및 당뇨망막병증을 포함한다. 용어 "심혈관계 질환"은, 염증, 콜라겐 증가에 의한 변형된 조직 리모델링 및 심근경색증의 섬유증 흉터의 축적과 관련이 있는 심혈관계 질병으로 정의된다. 심혈관계 질환의 비제한적 실시예는, 고혈압증, 폐 고혈압증, 폐 또는 오른방실판막 병(tricuspid valve disease), 대동맥 및 왼방실판막 병(mitral valve), 대동맥 협착증, 죽상등맥경화증, 심근경색증, 심부전, 허혈성 심근증(ischemic cardiomyopathy), 팽창된 심근증, 만성 부정맥, 심장 섬유증 및 관상동맥질환을 포함한다.
용어 "신경 질환" 또는 "신경정신장애"는, 치료불가능 및 때때로 치명적인 기능적 결핍을 유도하는 뉴런 기능장애 및 뉴런 세포 사망으로 특징되는 질병들로 정의된다. 신경 질환의 비제한적 예는, 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 알츠하이머병, 다발성 경화증, 신경염증, 뇌경색 및 신경성 동통(neuropathic pain)을 포함한다.
여기 사용된 용어 "대상"은 포유동물을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 의해 고려된 포유동물들은, 인간, 영장류, 가축, 예를 들어 소, 양, 돼지, 말, 실험실 설치류 및 이와 유사한 것들을 포함한다.
본 발명에 따른 치료 또는 방법의 용어 "효험"은, 본 발명에 따른 용도 또는 방법에 대한 반응으로 질병 또는 상태의 과정에서의 변화를 기초로 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 치료 또는 방법의 효험은, 병의 신호 또는 증후에 대한 이것의 영향에 의해 측정될 수 있다. 반응은 환자가 원하지 않은 증후의 부분적 또는 전체적 완화, 또는 축소를 경험할 때 얻어진다.
여기 사용된 용어 "효과적인 함량"은 본 발명에 따른 적어도 하나의 항체, 또는 이들의 약제학적 제형의 함량으로서, 상기 항체가 투여된 대상에서 질병의 증후들을 검출가능하게 줄이는 것을 이끌어내는 함량을 의미하며, 이들 증후들은, 예를 들어 다음을 포함한다: a) 염증성 장 질환 경우에, 설사, 복통및 경련, 혈변, 종기, 궤양 및 누공 또는 b) 대장암의 경우에, 변비 또는 설사, 선홍색 또는 흑적색 혈변(bright red or dark red blood in stools), 체중 손실, 피로, 메스꺼움 및 빈혈.
MMP9 결합 단백질
MMP9 결합 단백질의 일반적 특성
제1 양상에서, 본 발명은, 여기 설명된 MMP9, 특히 인간 MMP9, 또는 이들 조각에 결합하고, 여기 설명된 항체의 중사슬 가변 영역의 적어도 하나의 조각 및/또는 경사슬 가변 영역의 적어도 하나의 조각을 포함하는 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 여기서 설명된 것처럼, MMP9, 특히 인간 MMP9에 특이적 분리된 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각을 제공하며, 중사슬 가변 영역의 적어도 하나의 조작 및 경사슬 가변 영역의 적어도 하나의 조각, 및 선택적으로 불변 영역의 적어도 하나의 조각을 포함한다.
본 발명의 대안적 실시예에서, 여기 설명된 것처럼, MMP9, 특히 인간 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 제공하며, MMP9 상의 에피토프에 대한 이들의 결합에 의해 특징된다.
본 발명에 따른 항체, 또는 이들의 조각에 결합하는 단백질은 임의의 종의 MMP9 단백질일 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 일반적으로 인간 MMP9에 매우 높은 특이성을 나타낸다. 그러나, 다른 종들의 MMP9 상동성들 사이의 시퀀스 아이덴티티의 정도에 따라(도 2), 주어진 항체 또는 항원-결합 조각은 적어도 하나의 다른 종들, 예를 들어 마우스, 랫트, 마모셋, 몽키(e.g. Cynomologus 몽키), 개, 및/또는 토끼의 MMP9와의 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 인간 MMP9쪽으로 지향된 항체에 대하여, 다른 포유 동물 형태의 MMP9와의 어느 정도 준위의 교차-반응성은, 어느 환경 내에서는 바람직할 수도 있으며, 예를 들어 특정 질병의 동물 모델 내에서 항체 시험할 때 또는 독성, 안정성 및 용량 연구를 수행할 때에 바람직할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각은 우선적으로 인간 MMP9에 결합한다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각은 인간 MMP9, Cynomologus 몽키 MMP9, 랫트 MMP9 및, 선택적으로, 마우스 MMP9와의 교차-반응성을 나타낸다.
일부 실시예에서, 인간 MMP9에 대한 본 발명에 따른, 항체, 및 이들 조각의 결합 친화성(e. g. Kd 값에 역으로 관련됨)은, 비-인간 MMP9에 대한 이들의 결합 친화성보다 적어도 2 배, 적어도 5 배, 적어도 10 배, 적어도 50 배, 적어도 100 배, 적어도 500 배, 또는 적어도 1000 배 높다.
한 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각은, MMP9에 우선적으로 결합하고, 선택적으로, 추가적으로 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMPs) , 예를 들어 MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP12, MMP13, MMP14, MMP16, MMP17, MMP19에 대한 약한 결합, 또는 사실상 무결합(즉, 무시가능하거나 검출할 수 없는 결합)을 나타낸다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조작은, MMP9에 우선적으로 결합하고, MMP2에 대해 약하거나 또는 사실상 무결합(즉, 무시가능하거나 또는 검출되지 않음)을 나타낸다.
치료적 용도를 위하여, 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각은 MMP2에 결합하지 않고, 이에 따라서 중화하지 않아 실질적으로 MMP2 활성에 영향을 주지 않는다는 것이 유리할 수 있다. 실로, MMP2는 정상 조직 항상성을 위해 필요하며, 또한 몇가지 질병 모델 내에서 MMP2 녹아웃 마우스가 야생형 마우스보다 나빠진 표현형을 나타내는 관찰에 의해 제시된 것처럼 질병에 대해 보호적 역할을 할수도 있다(Grag et al., 2006, J. Immunol ., 177(6):4103-12).
일부 실시예에서, MMP9에 대한 본 발명에 따른 항체, 및 이들의 조각의 결합 친화성(e.g. 평형 해리 상수 Kd 값에 역으로 관련됨)은, MMP2에 대한 이들의 결합 친화성보다 적어도 2 배, 적어도 5 배, 적어도 10 배, 적어도 50 배, 적어도 100 배, 적어도 500 배, 또는 적어도 1000 배 높다.
결합 친화성은, 평형 투석법, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명 또는 분광학 (e.g. 형광 분석을 사용함)을 포함하는 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있으며 ( Jiang et al. BMC Pharmacology 2010, 10:10) 및 예를 들어, 온-레이트(on-rate), 오프-레이트(off-rate), 해리 상수 (Kd), 평형 상수 (Keq) 또는 당해 기술분야에 사용된 임의의 용어로서 표현될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 및 이들의 조각은 인간 MMP9에 특이적으로 결합하며, 100nM 이하, 특히 10nM 이하, 보다 특히 1nM 이하, 또는 0.5nM 이하, 또는 0.1nM, 또는 0.01nM, 또는 0.005nM 이하인 해리 상수(Kd)를 갖는다.
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각이 결합하는 단백질은 MMP9의 임의의 형태이다: 분비 선도 시퀀스를 포함하는 미성숙 단백질("프레프로-효소") (SEQ ID NO: 1의 잔기 1-707에 대응, 인간 MMP9의 경우), 분비 선도 시퀀스가 결핍한 성숙한 잠복 MMP9("프로효소") (SEQ ID NO: 1의 잔기 20-707에 대응함, 인간 MMP9의 경우), "활성화된 효소" (SEQ ID NO: 1의 잔기 107-707에 대응함, 인간 MMP9의 경우), 또는 MMP9의 임의의 조각.
본 발명에 따른 항체, 또는 이들의 조각은 단백질 내, 예를 들어 프로도메인, 촉매 도메인, 특히 Fn-반복 또는 OG 도메인 링커 내 어느 곳에나 위치한 아미노산을 포함하는 에피토프와의 상호작용에 의해 MMP9에 결합할 수 있으며, 상기 인식된 아미노산은 상기 단백질 내 하나 이상의 사이트에 위치된다.
특정 예에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, MMP9, 특히 인간 MMP9의 촉매 도메인 내에 위치한 아미노산을 포함하는 에피토프와의 상호작용에 의해 MMP9에 결합한다.
보다 더 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, 인간 MMP9의 촉매 도메인 내에 위치한, SEQ ID NO: 41으로 이루어진 영역 내 적어도 하나의 아미노산, SEQ ID NO: 42로 이루어진 영역 내 적어도 하나의 아미노산 및 SEQ ID NO: 43으로 이루어진 영역 내 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 에피토프와의 상호작용에 의해 MMP9에 결합한다.
보다 더 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 항원-결합 조각은, 인간 MMP9의 촉매 도메인 내에 위치된, SEQ ID NO: 41로 이루어진 영역의 아미노산, SEQ ID NO: 42으로 이루어진 영역의 아미노산, SEQ ID NO: 43으로 이루어진 영역의 아미노산을 포함하는 에피토프와의 상호작용에 의해 MMP9에 결합한다.
보다 더 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, 인간 MMP의 촉매 도메인 내에 위치한, SEQ ID NO: 41으로 이루어지는 영역의 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 또는 적어도 다섯의 아미노산, SEQ ID NO: 42으로 이루어진 영역의 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 또는 적어도 다섯 아미노산, 및 SEQ ID NO: 43으로 이루어진 영역의 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 또는 적어도 다섯 아미노산을 포함하는 에피토프와의 상호작용에 의해 MMP9에 결합한다.
그러므로, 한 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이들의 조각은, 촉매적으로 활성 효소에 대한 프레프로효소 및/또는 프로효소의 가공을 저해 및/또는 활성화된 효소의 단백질 가수분해의 활성을 저해하는 것에 의해 MMP9에 결합할뿐만 아니라 MMP9 활성(e.g. MMP9 촉매 활성)을 중화하거나 저해한다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이들의 조각은, 활성화된 MMP9 효소의 단백질 가수분해 활성을 저해하는 것에 의하여 MMP9에 결합할뿐만 아니라, MMP활성(e.g. MMP9 촉매 활성)을 저해하거나 중화한다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 인간 MMP9에 대한 높은 특이성 및 저해적 활성을 나타내며, Cynomologus 몽키 (Macaca fascicularis) MMP9, 랫트 MMP9, 및/또는 마우스 MMP9와의 교차 반응성을 나타낼 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각은 MMP9 활성을 저해하고, 선택적으로, 추가적으로 다른 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMPs) , 예를 들어 MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP12, MMP13, MMP14, MMP16, MMP17, MMP19을 향한 약한 저해 활성, 또는 사실상 무저해활성(no inhibitory activity)(즉, 무시 가능하거나 검출할 수 없는 활성)을 나타낸다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이들의 조각은, MMP9에 향한 중화 능력을 나타내고, MMP2를 향한 약하거나 또는 사실상 없는(즉, 무시가능하거나 또는 검출할 수 없는) 중화 능력을 나타낸다.
표적 단백질의 활성을 차단하거나 또는 중화하는 항체의 능력은 여기 정의된 항체의 효능에 의해 평가될 수 있으며, 이는 그 자체로, 예를 들어 IC50값에 의해 반영된다. 전형적으로, 항-MMP9의 중화 능력은 무세포 인비트로 분석 또는 인비보 분석 또는 인비트로 기능적 분석, 예를 들어 인간 암 세포주 침입 분석에 의해 결정될 수 있다. 인간 암 세포주 침입 트랜스웰 분석에서, 암 세포들은 분해하고 기저 막 매트릭스(Matrigel®)를 통해 이동하여, 인근 혈관에서 종양 세포 혈관속 이물 주입 및 혈관외 유출 및 먼 거리 조직 내로 침입의 인비보 과정을 모방한다.
일부 실시예에서, 인간 MMP9에 대하여 본 발명에 따른 항체, 및 이들의 조각의 저해적 또는 중화 효능(IC50 값에 역으로 관련됨)은, 비-인간 MMP9에 대한 이들의 중화 효능보다 적어도 2 배, 적어도 5 배, 적어도 10 배, 적어도 50 배, 적어도 100 배, 적어도 500 배, 또는 적어도 1000 배 높다.
일부 실시예에서, MMP9에서 본 발명에 따른 항체, 및 이들의 조각의 예를 들어 IC50 값에 역으로 관련된 저해적 또는 중화 효능은, MMP2에 대한 저해적 또는 중화 효능보다 적어도 10 배, 적어도 50 배, 적어도 100 배, 적어도 500 배, 또는 적어도 1000 배 높다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 및 이들의 조각은, 젤라틴에 대한 MMP9 촉매 활성을 저해하기 위하여, 100 nM 이하, 특히 50 nM 이하, 보다 특히 20 nM 이하, 10 nM 이하, 8 nM 이하, 7 nM 이하, 6 nM 이하, 5 nM 이하, 4 nM 이하, 3 nM 이하, 2 nM 이하, 1 nM 이하, 0.5 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하, 또는 0.1 nM 이하의 IC50을 갖는다.
항체가 이들의 표적 단백질의 활성을 차단하거나 또는 중화하는 능력은, 여기 정의된 저해의 효험에 의해 평가될 수 있으며, 이는 예를 들어 저해 값의 퍼센트(%)에 의해 그 자체로 반영된다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 및 이들의 조각은, 예를 들어 실시예 단원에서 설명된 것처럼 젤라틴으로 향하는 MMP9의 촉매 활성을 측정하는 분석법에서 결정된 것처럼, 프레프로효소 및/또는 프로효소의 가공을 저해하기 위하여 및/또는 활성화된 MMP9의 단백질 가수분해 활성을 저해하는 것에 의해 50% 이상, 특히 60% 이상, 특히 70% 이상, 특히 80% 이상, 특히 90% 이상, 특히 95% 이상, 특히 100%의 효험을 갖는다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체, 및 이들의 조각은, 실시예 단원에서 설명된 것처럼, 예를 들어 젤라틴으로 향하는 MMP9의 촉매 활성을 측정하는 분석법으로 결정된 것처럼, 활성화된 MMP9의 단백질 가수분해 활성을 저해하기 위하여, 50% 이상, 특히 60% 이상, 특히 70% 이상, 특히 80% 이상, 특히 90% 이상, 특히 95% 이상, 특히 100%의 효험을 갖는다.
여기 설명된, 본 발명에 따른 항체, 또는 이들의 조각의 임의 변이체는, MMP9에 결합할 수 있고, 선택적으로 MMP9 활성을 중화할 수 있다는 것으로 이해된다. 특정 실시예에서, 그러한 변이체는, 상기 변이체가 유래하는 모항체(parental antibody) 또는 조각에 비하여, MMP9에 대한 같거나 또는 그보다 높은 결합 친화성 및/또는 같거나 또는 그보다 높은 효험 및/또는 MMP9에 대한 같거나 그보다 큰 종-특이성 및/또는 같거나 또는 더 큰 선택성, 및/또는 같거나 또는 그보다 더 큰 효험을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 항체는, 본 발명의 특징적 성질을 유지하는 한, 특히 표적 항원에 대한 결합 능력, 보다 특히 본 발명의 항체에 의해 인식된 것과 동일한 MMP9의 에피토프에 대한 결합 능력, 및 선택적으로 MMP9 활성을 중화하는 능력을 유지하는 한, 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 및 더 조작된 항체일 수 있다.
본 발명의 특정 실시예에서, MMP9에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 MMP9 특이적 항체, 또는 이들의 조각은 모노클론 항체이다.
본 발명의 추가 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 MMP9에 특이적으로 결합하는 이들의 조각은 인간 항체이다.
본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 MMP9에 특이적으로 결합하는 이들의 조각은 표적 단백질과의 상호작용하는 그들의 일부, 특히 이들의 가변 영역로서, 전형적으로 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는 가변 영역에 의해 특징될 수 있다.
MMP9 결합 단백질의 중사슬 가변 영역 와 관련한 MMP9 결합 단백질의 특징들
한 실시예에서, 본 발명은, 다음을 포함하는 중사슬 가변 영역를 포함하는MMP9 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각에 관한 것이다:
(i) SEQ ID NO: 2의 중사슬 CDR1 또는 이들의 변이체로서, 상기 중사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 3의 중사슬 CDR2 또는 이들의 변이체로서, 상기 중사슬 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산은 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(iii) SEQ ID NO: 4의 중사슬 CDR3 또는 이들의 변이체로서, 상기 중사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 중사슬 CDR2의 위치 53 및 61에서의 적어도 하나 아미노산, 및/또는 중사슬 CDR3의 위치 100J에서의 하나 아미노산이 다른 아미노산, 특히 다음 치환기들 중 적어도 하나와 치환된다: N53Q 또는 N53R, D61E, M100JI.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 중사슬 CDR2의 위치 53, 61 및 62에서의 적어도 하나의 아미노산, 및/또는 상기 중사슬 CDR3의 위치 100L에서의 하나의 아미노산이 다른 아미노산, 특히 다음 치환기들 중 적어도 하나와 치환된다: N53Q, N53R, N53K, N53H, D61E, S62T, M100LI 또는 M100LL.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 중사슬 CDR2 변이체는 다음 중으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 갖는다: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 9.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, 상기 중사슬 CDR2 변이체는 다음 중으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 갖는다: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, 및 SEQ ID NO: 51.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, 상기 중사슬 CDR3 변이체는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 10를 갖는다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, 상기 중사슬 CDR3 변이체는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 52을 갖는다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 중사슬 가변 영역, 또는 이들의 변이체로서, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 및 25 이하의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체, 또는 이들의 변이체로서, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12 각각과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 아이덴티를 갖는 변이체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 11의 중사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 및 25 이하의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되는 변이체를 포함하며, 상기 아미노산은 상기 중사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, 중사슬 가변 영역 of SEQ ID NO: 11의 중사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 1, 2, 3, 4 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 상기 아미노산은 상기 중사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 11의 중사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 2 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 여기서 상기 아미노산은 상기 중사슬 가변 영역의 프레임워크 내에서 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 11의 중사슬 가변 영역를 포함하며, 2 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며, 상기 중사슬 가변 영역는 SEQ ID NO: 12의 것이다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 11의 중사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 여기서 상기 아미노산은 상기 중사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에서 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 11의 중사슬 가변 영역을 포함하며, 여기서 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며, 여기 상기 중사슬 가변 영역는 SEQ ID NO: 48의 것이다.
추가 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 변이체를 포함하며, 여기서 중사슬 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3의 적어도 하나의 1, 2, 또는 3 아미노산, 및/또는 중사슬 가변 프레임워크 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된다.
추가 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 변이체를 포함하며, 여기서 중사슬 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3의 적어도 하나의 1, 2, 또는 3 아미노산, 및/또는 중사슬 가변 프레임워크 영역의 11, 12, 13, 14 또는 15 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된다.
특히, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 이들의 조각은, SEQ ID NO: 11의 변이체를 포함하며, 여기서 중사슬 CDR2의 위치 53 및 61에서의 적어도 하나 아미노산, 중사슬 CDR3의 위치 100J에서의 적어도 하나 아미노산, 및 중사슬 가변 프레임워크 영역의 위치 84 및 89 위치에서의 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며, 특히 다음 치환기들 중 적어도 하나와 치환된다: N53Q, N53R, D61E, M100JI, D84A 및 V89L.
특히, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 이들의 조각은, SEQ ID NO: 11의 변이체를 포함하며, 여기서 중사슬 CDR2의 위치 53, 61 및 62에서의 적어도 하나의 아미노산, 중사슬 CDR3의 위치 100L에서의 적어도 하나의 아미노산, 및 중사슬 가변 프레임워크 영역의 위치 84 및 89에서의 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산에 의해, 특히 다음 치환기들 중 적어도 하나와 함께 치환된다: N53Q, N53R, N53K, N53H, D61E, S62T, D84A, V89L, M100LL 및 M100LI.
보다 특히, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 이들의 조각은, SEQ ID NO: 11의 변이체를 포함하며, 상기 중사슬 가변 프레임워크 영역의 위치 84 및 89에서의 아미노산 및 중사슬 CDR2의 위치 53 및 61에서의 적어도 하나의 아미노산, 및 중사슬 CDR3의 위치 100J에서의 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며, 특히 D84A 및 V89L 치환 및 다음 치환기들 중 적어도 하나로 치환된다: N53Q, N53R, D61E, 및 M100JI.
특히, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 이들의 조각은, SEQ ID NO: 11의 변이체를 포함하며, 중사슬 CDR2의 위치 53, 61 및 62에서의 적어도 하나의 아미노산, 중사슬 CDR3의 위치 100L에서의 적어도 하나의 아미노산, 및 중사슬 가변 프레임워크 영역의 위치 30, 84 및 89에서의 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며, 특히 다음 치환기들 중 적어도 하나와 함께 치환된다: N53Q, N53R, N53K, N53H, D61E, S62T, M100LL, M100LI , N30D, D84A 및 V89L.
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각 내에 포함된 중사슬 가변 영역의 특정 예는 다음을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 11의 아미노산 시퀀스,
(ii) SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
(iii) SEQ ID NO: 13의 아미노산 시퀀스
(iv) SEQ ID NO: 14의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 15의 아미노산 시퀀스
(vi) SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스.
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각 내에 포함된 중사슬 가변 영역의 대안적 특정 예는 다음을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스
(ii) SEQ ID NO: 18의 아미노산 시퀀스
(iii) SEQ ID NO: 19의 아미노산 시퀀스
(iv) SEQ ID NO: 20의 아미노산 시퀀스.
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각 내에 포함된 중사슬 가변 영역의 대안적 특정 예는 다음을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 48의 아미노산 시퀀스
(ii) SEQ ID NO: 53의 아미노산 시퀀스
(iii) SEQ ID NO: 54의 아미노산 시퀀스
(iv) SEQ ID NO: 55의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 56의 아미노산 시퀀스.
경사슬 가변 영역와 관련한 MMP9 결합 단백질의 특징들
한 실시예에서, 본 발명은 상술된 것처럼 중사슬 가변 영역를 포함하고 다음을 포함하는 경사슬 가변 영역를 더 포함하는 MMP9 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각에 관한 것이다:
(i) SEQ ID NO: 21의 경사슬 CDR1 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 22의 경사슬 CDR2 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산은 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(iii) SEQ ID NO: 23의 경사슬 CDR3 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체.
본 발명의 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 경사슬 가변 영역, 또는 이들의 변이체로서 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 22 이하 또는 25 이하의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체, 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25 각각과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 아이덴티티를 갖는 이들의 변이체를 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 67의 경사슬 가변 영역, 또는 이들의 변이체로서 SEQ ID NO: 67의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 22 이하 또는 25 이하의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체, 또는 이들의 변이체로서 SEQ ID NO:67와의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 아이덴티티를 갖는 변이체를 포함한다.
추가 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 변이체를 포함하며, 여기서 경사슬 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3의 적어도 하나의 1, 2, 또는 3 아미노산, 및/또는 경사슬 가변 프레임워크 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된다.
추가 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 67의 변이체를 포함하며, 여기서 경사슬 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3의 적어도 어느 하나의 1, 2, 또는 3 아미노산, 및/또는 경사슬 가변 프레임워크 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산은 다른 아미노산에 의해 치환된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 67의 경사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 및 25 이하의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 여기서 상기 아미노산은 상기 경사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 67의 경사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 1, 2, 3, 4 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 여기서 상기 아미노산는 상기 경사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 67의 경사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 1 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 상기 아미노산은 상기 경사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 67의 경사슬 가변 영역를 포함하며, 여기서 1 아미노산은 다른 아미노산으로 치환되며, 여기서 상기 경사슬 가변 영역는 SEQ ID NO: 68의 것이다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 67의 경사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 여기서 상기 아미노산은 상기 경사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 67의 경사슬 가변 영역를 포함하며, 여기서 3 아미노산은 다른 아미노산에 의해 치환되며, 상기 경사슬 가변 영역는 SEQ ID NO: 57의 것이다.
추가 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 변이체를 포함하며, 여기서 경사슬 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3의 적어도 하나의 1, 2, 또는 3 아미노산, 및/또는 경사슬 가변 프레임워크 영역의 11, 12, 13, 14 또는 15 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된다.
특히, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 이들의 조각은, SEQ ID NO: 24의 변이체를 포함하며, 경사슬 가변 프레임워크 영역의 위치 104에서의 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산에 의해, 특히 적어도 다음 치환기와 함께 치환된다: V104L.
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각 내에 포함된 가변 영역의 하나의 구체예는 EQ ID NO: 25의 아미노산 시퀀스를 포함한다.
특히, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 이들의 조각은, SEQ ID NO: 67의 변이체를 포함하며, 여기서 경사슬 프레임워크 영역의 위치 104에서의 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산에 의해, 특히 적어도 다음 치환기 V104L을 가지고 치환된다.
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각 내에 포함된 가변 영역의 하나의 구체적 예는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 68을 포함한다.
특히, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 이들의 조각은 SEQ ID NO: 67의 변이체를 포함하며, 여기서 경사슬 프레임워크 영역의 위치 46, 71 및 104에서의 적어도 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해, 특히 적어도 다음 치환기와 함께 치환된다: V46L, V71A 및 V104L.
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각 내에 포함된 가변 영역의 하나의 구체적 예는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 57을 포함한다.
대안적인 실시예에서, 본 발명은, 상술된 중사슬 가변 영역를 포함하며 다음을 포함하는 경사슬 가변 영역를 더 포함하는 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각에 관한 것이다:
(i) SEQ ID NO: 26의 경사슬 CDR1 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 27의 경사슬 CDR2 또는 이들의 변이체로서 상기 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(iii) SEQ ID NO: 28의 경사슬 CDR3 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체.
본 발명의 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 30의 경사슬 가변 영역, 또는 이들의 변이체로서 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:30의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 22 이하 또는 25 이하 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체, 또는 이들의 변이체로서 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 30 각각과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 아이덴티티를 갖는 변이체를 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 69의 경사슬 가변 영역, 또는 이들의 변이체로서 SEQ ID NO: 69의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 22 이하 또는 25 이하의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체, 또는 이들의 변이체로서 SEQ ID NO:69와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 아이덴티티를 갖는 변이체를 포함한다.
추가 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 30의 변이체를 포함하며, 여기서 경사슬 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 중 적어도 하나의 1, 2, 또는 3 아미노산, 및/또는 경사슬 가변 프레임워크 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된다.
추가 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 30의 변이체를 포함하며, 여기서 경사슬 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 중 적어도 하나의 1, 2, 또는 3 아미노산 및/또는 경사슬 가변 프레임워크 영역의 11, 12, 13, 14, 또는 15 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 69의 경사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 및 25 이하의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 여기서 상기 아미노산은 상기 경사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 69의 경사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 3, 4, 5, 6, 7, 8 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 상기 아미노산은 상기 경사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 69의 경사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 4 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 여기서 상기 아미노산은 상기 경사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 69의 경사슬 가변 영역를 포함하며, 여기서 4 아미노산은 다른 아미노산에 의해 치환되며, 상기 경사슬 가변 영역는 SEQ ID NO: 58의 것이다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 69의 경사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 5 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 여기서 상기 아미노산은 상기 경사슬 가변 영역의 프레임워크 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 69의 경사슬 가변 영역를 포함하며, 여기서 5 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며 여기서 상기 경사슬 가변 영역는 SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 및 SEQ ID NO: 61으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 29의 경사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 6 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 여기서 상기 아미노산은 상기 경사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 29의 경사슬 가변 영역를 포함하며, 여기서 6 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며, 여기서 상기 경사슬 가변 영역는 SEQ ID NO: 30의 것이다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 69의 경사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 여기서 6 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 여기서 상기 아미노산은 상기 경사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.30
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 69의 경사슬 가변 영역를 포함하며, 여기서 6 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며, 여기서 상기 경사슬 가변 영역는 SEQ ID NO: 62 및 SEQ ID NO: 70으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 69의 경사슬 가변 영역 또는 이들의 변이체로서 7 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하며, 여기서 상기 아미노산은, 상기 경사슬 가변 영역의 프레임워크 영역 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, SEQ ID NO: 69의 경사슬 가변 영역를 포함하며, 여기서 7 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며, 여기서 상기 경사슬 가변 영역는 SEQ ID NO: 63의 것이다.
특히, MMP9에 대한 특이적 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각은 SEQ ID NO: 29의 변이체를 포함하며, 여기서 경사슬 가변 프레임워크 영역의 위치 8, 19, 47, 60, 79, 및 81 에서의 적어도 하나 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며, 특히 다음 치환기들 중 적어도 하나와 함께 치환된다: R8A, V19I, L47M, T60N, L79Q, 및 A81E.
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각 내에 포함된 가변 영역의 하나의 구체적 예는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 30를 포함한다.
특히, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 이들의 조각은, SEQ ID NO: 69의 변이체를 포함하며, 여기서 경사슬 가변 프레임워크 영역의 위치 8, 19, 47, 60, 79, 81, 86 에서의 적어도 하나 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환되며, 특히 다음 치환기 중 적어도 하나와 함께 치환된다: R8A, V19I, L47M, T60N, L79Q, A81E 및 F86Y.
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각 내에 포함된 가변 영역의 하나의 구체적 예는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 70을 포함한다.
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각 내에 포함된 경사슬 가변 영역의 구체적 예들은 다음을 포함한다:
(i)아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 24,
(ii)아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 25,
(iii) 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 29,
(iv) 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 30,
(v)아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 57,
(vi) 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 58,
(vii) 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 59,
(viii)아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 60,
(ix) 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 61,
(x)아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 62,
(xi) 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 63,
(xii) 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 67,
(xiii) 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 68,
(xiv) 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 69,
(xv) 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 70.
결합 단백질의 불변 영역 에 관련한 MMP9 결합 단백질의 특징들
항체의 불변 영역에 대응하는 부분은, 본 발명에 따른 MMP9에 대해 특이적 분리된 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각 내에 선택적으로 포함된다.
항체의 제안된 기능, 특히 필요한 이펙터 기능에 따라, 항체의 불변 영역이 본 발명에 따른 항체 내에 존재하거나 존재하지 않을 수도 있다.
전형적으로 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 항원-결합 조각 내에 존재할 때, 중사슬 불변 영역 또는 이들의 부분은 임의의 항체 동종체들 중 하나 일 수 있다. 예를 들어, 상기 중사슬 불변 영역 또는 이들의 부분은 IgG (e.g. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA (e.g. IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgM (e.g. IgM1, IgM2)으로부터 선택된 항체의 것일 수 있다. 특히, 불변 영역 또는 이들의 부분은 IgG, 보다 특히 IgG4일 수 있다.
특히, 인간 IgG 불변 영역 도메인은, 항체 분자가 치료적 용도에 대한 것으로 의도될 때 그리고 항체 이펙터 기능이 필요할 때, 특히 IgG1 및 IgG3 동종이 사용될 수 있다. 대안적으로, IgG2 및 IgG4 동종은, 항체 분자가 치료적 목적을 위해 의도되고 항체 이펙터 기능이 필요하지 않을 때, 예를 들어 MMP9 활성을 단순히 차단하기 위하여 이펙터 기능이 필요하지 않을 때 사용될 수 있다.
이들 불변 영역 도메인의 시퀀스 변이체가 또한 사용될 수 있다는 것이 평가될 것이다. 예를 들어, 상기 중사슬 불변 영역 또는 이들의 부분은, 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 40에 대응하는, IgG4의 조작된 변이체, 예를 들어 S228P, R409K을 포함하고 말단 리신이 결실된 IgG4 변이체의 것일 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 항원-결합 조각 내에 존재할 때, 경사슬 불변 영역 또는 이들의 부분은, 임의의 경사슬의 불변 영역의 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 경사슬 불변 영역 또는 이들의 부분은 카파 또는 람다 경사슬의 것일 수 있다.
본 발명의 특정 양상에서, MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, (i) 여기 설명된 가변 영역 및 IgG 항체의 불변영역 또는 이들의 부분을 포함하는 적어도 하나 중사슬, 및 (ii) 여기서 설명된 가변 영역 및 람다(특히 람다 2) 경사슬의 불변 영역 또는 이들의 부분을 포함하는 적어도 하나 경사슬을 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 내에 포함된, 중사슬 및/또는 경사슬의 불변 영역 또는 이들의 부분은, 당해 기술분야에 알려진 방법에 따라, 원래 아미노산 시퀀스에 비하여 변형된 아미노산 시퀀스를 가져 항체의 화학적 안정성을 증가시키고, 이들의 응집을 줄이고, 이들의 제조, 특히 항체-제조 세포(e.g. HEK293 세포, CHO 세포)의 제조를 증가시키고, 및/또는 반-분자들을 교환하여 효과적으로 1가 항체를 가져오는 이들의 능력을 제거한다.
항체의 안정성에 영향을 미치는 항체의 불변 영역의 아미노산 시퀀스의 아미노산의 예들은, 항체의 힌지 도메인(Angal et al, 1993, Molec . Immunol . 30: 105 -108)을 안정화시키고 Fc-Fc 상호작용 (Rispens et al., 2013, Mol . Immunol . 53: 35- 42)을 회피하는 인간 IgG4 중사슬 내에서 S228P 아미노산 돌연변이 (EU 넘버링)를 포함하고, IgG4 내의 CH3-CH3 상호작용 강도(Allberse et al, 2002, Immunology 105: 9 - 19)를 증가시키는 동종이인자형 위치 409(EU 넘버링)에서 Arg(R) 보다는 Lys(K) 을 포함하며, 이들 예는 여기 참조로서 통합되어 있다. 게다가, 모노클론 항체 전하 이질성을 단순히 모니터링하기 위하여, 인간 IgG4 중사슬의 C-말단 리신이 제거될 수 있다.
추가 실시예에서, 본 발명에 따라 MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, 여기 설명된 가변 영역 및 IgG4 항체의 불변 영역 또는 이들의 일부를 포함하는 적어도 하나의 중사슬을 포함하며, 여기서 IgG4 불변 영역의 아미노산 시퀀스는 다음 아미노산 변형을 포함한다: S228P (EU 넘버링), R409K (EU 넘버링), 말단 Lys (K)의 결실, 여기서 상기 변형된 불변 영역은 SEQ ID NO: 40에 의해 대표된다.
추가 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체, 또는 이들의 항원-결합 조각은, 여기 설명된 가변 영역 및 IgG4 항체의 불변 영역 또는 이들의 부분을 포함하는 적어도 하나의 경사슬을 포함하며, 여기서 상기 불변 영역은 SEQ ID NO: 66에 의해 대표된다.
상술한 것으로부터 본 발명은 다음을 포함하는 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 제공하는 것이다:
(1) 다음을 포함하는 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 2의 중사슬 CDR1 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 3의 중사슬 CDR2 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(iii)SEQ ID NO: 4의 중사슬 CDR3 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체; 및
(2) 다음을 포함하는 경사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 21의 경사슬 CDR1 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 22의 경사슬 CDR2 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(iii) SEQ ID NO: 23의 경사슬 CDR3 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 제공한다:
(1) 다음을 포함하는 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 2의 중사슬 CDR1 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 3의 중사슬 CDR2 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(iii) SEQ ID NO: 4의 중사슬 CDR3 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체; 및
(2) 다음을 포함하는 경사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 26의 경사슬 CDR1 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 27의 경사슬 CDR2 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
(iii) SEQ ID NO: 28의 경사슬 CDR3 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, 상기 중사슬 CDR2 변이체는 다음으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 갖는다: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 9.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, 상기 중사슬 CDR2 변이체는 다음으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 갖는다: SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, 및 SEQ ID NO: 51.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, 상기 중사슬 CDR3 변이체는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 10를 갖는다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에서, 상기 중사슬 CDR3 변이체는 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 52을 갖는다.
본 발명의 항체는 적어도 하나의 항원 결합 사이트, e.g. 하나 또는 둘 항원 결합 사이트를 갖는다. 일부 실시예에서, 예를 들어 CDR-함유 펩티드를 위하여, 가변 도메인은 완전한 프레임워크 영역 대신에 보다 짧은 링커 펩티드를 통해 연결된 CDR들만을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 분리된 항체 및 이들의 항원-결합 조각은, 글리코실화된다. 전형적으로 단당류, 예를 들어 N-아세틸글루코사민, 마노스, 글루코오스, 갈락토오스, 푸코오스, 시알산 등은, 항체 상의 개별 글리코실화 반응 사이트에서 올리고당으로 조립된다.
당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이기 때문에, 본 발명의 하나의 양상은 MMP9에 특이적 분리 항체 또는 이들의 항원-결합 조각에 관한 것으로, 이는 상기 모든 특징들을 필수적으로 포함할 필요없이 여기 설명된 일부 특징들에 의해 특징된다.
예를 들어, MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각이 제공되며, 이들은 이들의 가변 영역 및/또는 불변 영역의 시퀀스와 관련한 여기 설명된 특징들에 의해 특징된다.
상기 양상의 특정 실시예에서, 상기 항체 또는 이들의 조각은 여기 설명된 것처럼 MMP9 상의 에피토프와의 상호작용에 의해 MMP9에 대한 이들의 결합에 의해 더 특징되며, 특히 상기 에피토프는, 인간 MMP9의 촉매 도메인 내에 위치한 SEQ ID NO: 41으로 이루어진 영역 내의 적어도 하나의 아미노산, SEQ ID NO: 42로 이루어지는 영역 내의 적어도 하나의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 43로 이루어진 영역 내의 적어도 하나의 아미노산을 포함한다.
대안적 양상에서, 여기 설명된 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각이 제공되며, 이는 인간 MMP9의 촉매 도메인 내에 위치된, MMP9 상의 에피토프, 특히 SEQ ID NO: 41으로 이루어진 영역 내의 적어도 하나의 아미노산, SEQ ID NO: 42으로 이루어진 영역 내의 적어도 하나의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 43로 이루어진 영역 내의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 에피토프와의 상호작용에 의한 MMP9에 대한 이들의 결합에 의해 특징된다.
상기 대안적 양상의 특정 실시예에서, 상기 항체 또는 이들의 조각은, 이들의 가변 영역 및/또는 불변 영역의 시퀀스와 관련한 여기 설명된 특징들에 의해 더 특징된다.
MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 실시예
본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각의 예는 표 2에 표시된 가변 도메인을 포함하는 것들을 포함한다(도 3, 4, 5 참조).
명칭 중사슬 가변 영역 의 시퀀스 경사슬 가변 영역 의 시퀀스
F20-VH /
B03-VL		 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 24
F20-VH-GL1 /
B03-VL		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 24
F20-VH-GL1-V1 /
B03-VL		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 24
F20-VH-GL1-V4 /
B03-VL		 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 24
F20-VH-GL1-V9 /
B03-VL		 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 24
F20-VH-GL1-V14 /
B03-VL		 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 24
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B03-VL		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 24
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /
B03-VL		 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 24
F20-VH-GL1-V4 -V9 /
B03-VL		 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 24
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
B03-VL		 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 24
F20-VH /
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1 /
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1-V1 /
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1-V4 /
B03-VL-GL1 		SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 25
명칭 중사슬 가변 영역 의 시퀀스 경사슬 가변 영역 의 시퀀스
F20-VH-GL1-V9 /
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1-V14 /
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1-V4-V9 /
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 25
F20-VH /
B08-VL		 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1 /
B08-VL		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1-V1 /
B08-VL		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1-V4 /
B08-VL		 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1-V9 /
B08-VL		 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1-V14 /
B08-VL		 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B08-VL		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /
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B08-VL		 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
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F20-VH /
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F20-VH-GL1 /
B08-VL-GL6		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL1-V1 /
B08-VL-GL6		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL1-V4 /
B08-VL-GL6		 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL1-V9 /
B08-VL-GL6		 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL1-V14 /
B08-VL-GL6		 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B08-VL-GL6		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 / B08-VL-GL6 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL1-V4-V9 /
B08-VL-GL6		 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 / B08-VL-GL6 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL2/
B03-VL
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명칭 중사슬 가변 영역 의 시퀀스 경사슬 가변 영역 의 시퀀스
F20-VH-GL1-V2/
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F20-VH-GL1-V3/
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F20-VH-GL1-V11/
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F20-VH-GL1-V13/
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F20-VH-GL2/
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1-V2/
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1-V3/
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1-V11/
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL1-V13/
B03-VL-GL1		 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 25
F20-VH-GL2/
B08-VL		 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1-V2/
B08-VL		 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1-V3/
B08-VL		 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1-V11/
B08-VL		 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL1-V13/
B08-VL		 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 29
F20-VH-GL2/
B08-VL-GL6		 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL1-V2/
B08-VL-GL6		 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL1-V3/
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F20-VH-GL1-V11/
B08-VL-GL6		 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 30
F20-VH-GL1-V13/
B08-VL-GL6		 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 30
F20-VH /
B03-VL-GL2		 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 57
F20-VH-GL1 /
B03-VL-GL2		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 57
F20-VH-GL1-V1 /
B03-VL-GL2		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 57
F20-VH-GL1-V4 /
B03-VL-GL2		 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 57
F20-VH-GL1-V9 /
B03-VL-GL2		 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 57
F20-VH-GL1-V14 /
B03-VL-GL2		 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 57
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B03-VL-GL2		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 57
F20-VH-GL1-V1-V9-V14/ B03-VL-GL2
 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 57
명칭 중사슬 가변 영역 의 시퀀스 경사슬 가변 영역 의 시퀀스
F20-VH-GL1-V4-V9 /
B03-VL-GL2		 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 57
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F20-VH-GL2/
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F20-VH-GL1-V2/
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F20-VH-GL1-V3/
B03-VL-GL2		 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 57
F20-VH-GL1-V11/
B03-VL-GL2		 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 57
F20-VH-GL1-V13/
B03-VL-GL2		 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 57
F20-VH /
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1 /
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1-V1 /
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1-V4 /
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1-V9 /
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1-V14 /
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1-V1-V9-V14/ B08-VL-GL1 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1-V4-V9 /
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 58
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F20-VH-GL2/
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1-V2/
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1-V3/
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1-V11/
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 58
F20-VH-GL1-V13/
B08-VL-GL1		 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 58
F20-VH /
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F20-VH-GL1 /
B08-VL-GL2		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 59
F20-VH-GL1-V1 /
B08-VL-GL2		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 59
F20-VH-GL1-V4 /
B08-VL-GL2		 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 59
F20-VH-GL1-V9 /
B08-VL-GL2
 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 59
명칭 중사슬 가변 영역 의 시퀀스 경사슬 가변 영역 의 시퀀스
F20-VH-GL1-V14 /
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F20-VH-GL1-V4-V9 /
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F20-VH-GL1-V2/
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F20-VH-GL1-V3/
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F20-VH-GL1-V11/
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F20-VH /
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F20-VH-GL1-V1 /
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F20-VH-GL1-V4 /
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F20-VH-GL1-V9 /
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F20-VH-GL1-V14 /
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B08-VL-GL3		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 60
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F20-VH-GL1-V4-V9 /
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F20-VH-GL1-V3 /
B08-VL-GL3		 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 60
F20-VH-GL1-V11 /
B08-VL-GL3		 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 60
F20-VH-GL1-V13 /
B08-VL-GL3		 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 60
F20-VH /
B08-VL-GL4		 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 61
F20-VH-GL1 /
B08-VL-GL4
 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 61
명칭 중사슬 가변 영역 의 시퀀스 경사슬 가변 영역 의 시퀀스
F20-VH-GL1-V1 /
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F20-VH-GL1-V9 /
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B08-VL-GL5		 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 62
F20-VH-GL1-V1-V9 /
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F20-VH-GL1-V4-V9 /
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F20-VH-GL2 /
B08-VL-GL5		 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 62
F20-VH-GL1-V2 /
B08-VL-GL4		 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 62
F20-VH-GL1-V3 /
B08-VL-GL5		 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 62
F20-VH-GL1-V11 /
B08-VL-GL5
 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 62
명칭 중사슬 가변 영역 의 시퀀스 경사슬 가변 영역 의 시퀀스
F20-VH-GL1-V13 /
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F20-VH-GL1-V1 /
B08-VL-GL7		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 63
F20-VH-GL1-V4 /
B08-VL-GL7		 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 63
F20-VH-GL1-V9 /
B08-VL-GL7		 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 63
F20-VH-GL1-V14 /
B08-VL-GL7		 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 63
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B08-VL-GL7		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 63
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 / B08-VL-GL7 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 63
F20-VH-GL1-V4-V9 /
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F20-VH-GL1-V4-V9-V14 / B08-VL-GL7 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 63
F20-VH-GL2 /
B08-VL-GL7		 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 63
F20-VH-GL1-V2 /
B08-VL-GL7		 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 63
F20-VH-GL1-V3 /
B08-VL-GL7		 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 63
F20-VH-GL1-V11 /
B08-VL-GL7		 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 63
F20-VH-GL1-V13 /
B08-VL-GL7		 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 63
F20-VH /
B03-VLc		 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 67
F20-VH-GL1 /
B03-VLc		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 67
F20-VH-GL1-V1 /
B03-VLc		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 67
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B03-VLc		 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 67
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B03-VLc		 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 67
F20-VH-GL1-V14 /
B03-VLc		 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 67
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B03-VLc		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 67
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /
B03-VLc		 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 67
F20-VH-GL1-V4 -V9 /
B03-VLc		 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 67
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
B03-VLc		 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 67
F20-VH /
B03-VL-GL1c
 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 68
명칭 중사슬 가변 영역 의 시퀀스 경사슬 가변 영역 의 시퀀스
F20-VH-GL1 /
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F20-VH-GL1-V1 /
B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1-V4 /
B03-VL-GL1c 		SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1-V9 /
B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1-V14 /
B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /
B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1-V4-V9 /
B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 68
F20-VH /
B08-VLc		 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 69
F20-VH-GL1 /
B08-VLc		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 69
F20-VH-GL1-V1 /
B08-VLc		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 69
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B08-VLc		 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 69
F20-VH-GL1-V9 /
B08-VLc		 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 69
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B08-VLc		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 69
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B08-VLc		 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 69
F20-VH-GL1-V4 -V9 /
B08-VLc		 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 69
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
B08-VLc		 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 69
F20-VH /
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1 /
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1-V1 /
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1-V4 /
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1-V9 /
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1-V14 /
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 / B08-VL-GL6c
 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 70
명칭 중사슬 가변 영역 의 시퀀스 경사슬 가변 영역 의 시퀀스
F20-VH-GL1-V4-V9 /
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 / B08-VL-GL6c SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL2 /
B03-VLc		 SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 67
F20-VH-GL1-V2 /
B03-VLc		 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 67
F20-VH-GL1-V3 /
B03-VLc		 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 67
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B03-VLc		 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 67
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B03-VLc		 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 67
F20-VH-GL2 /
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F20-VH-GL1-V2 /
B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1-V3 /
B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1-V11 /
B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 68
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B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 68
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F20-VH-GL1-V2 /
B08-VLc		 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 69
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F20-VH-GL1-V13 /
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 70
그러므로, 구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9 결합 단백질은, 다음을 포함하는 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함한다:
(1) 다음으로부터 선택된 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 11의 아미노산 시퀀스
(ii) SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
(iii) SEQ ID NO: 13의 아미노산 시퀀스
(iv) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 15 의 아미노산 시퀀스
(vi)SEQ ID NO: 16 의 아미노산 시퀀스
(vii)SEQ ID NO: 17 의 아미노산 시퀀스
(viii)SEQ ID NO: 18 의 아미노산 시퀀스
(ix)SEQ ID NO: 19 의 아미노산 시퀀스
(x) SEQ ID NO: 20 의 아미노산 시퀀스
(xi)SEQ ID NO: 48 의 아미노산 시퀀스
(xii)SEQ ID NO: 53 의 아미노산 시퀀스
(xiii)SEQ ID NO: 54 의 아미노산 시퀀스
(xiv)SEQ ID NO: 55 의 아미노산 시퀀스
(xv)SEQ ID NO: 56 의 아미노산 시퀀스, 및
(2) 다음 중으로부터 선택된 경사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 24의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 25 의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 29 의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 30 의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 57 의 아미노산 시퀀스
(vi)SEQ ID NO: 58 의 아미노산 시퀀스
(vii)SEQ ID NO: 59 의 아미노산 시퀀스
(viii)SEQ ID NO: 60 의 아미노산 시퀀스
(ix)SEQ ID NO: 61 의 아미노산 시퀀스
(x) SEQ ID NO: 62 의 아미노산 시퀀스
(xi)SEQ ID NO: 63 의 아미노산 시퀀스
(xii)SEQ ID NO: 67 의 아미노산 시퀀스
(xiii)SEQ ID NO: 68 의 아미노산 시퀀스
(xiv)SEQ ID NO: 69 의 아미노산 시퀀스
(xv)SEQ ID NO: 70 의 아미노산 시퀀스.
그러므로, 구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9 결합 단백질은, MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 다음을 포함하는 이들의 항원-결합 조각을 포함한다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 11의 아미노산 시퀀스
(ii) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 13 의 아미노산 시퀀스
(iv) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 15 의 아미노산 시퀀스
(vi) SEQ ID NO: 16 의 아미노산 시퀀스
(vii)SEQ ID NO: 17 의 아미노산 시퀀스
(viii)SEQ ID NO: 18 의 아미노산 시퀀스
(ix) SEQ ID NO: 19 의 아미노산 시퀀스
(x)SEQ ID NO: 20 의 아미노산 시퀀스
(xi) SEQ ID NO: 48 의 아미노산 시퀀스
(xii)SEQ ID NO: 53 의 아미노산 시퀀스
(xiii)SEQ ID NO: 54 의 아미노산 시퀀스
(xiv)SEQ ID NO: 55 의 아미노산 시퀀스
(xv) SEQ ID NO: 56 의 아미노산 시퀀스, 및
(2) 다음 중으로부터 선택된 경사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 57 의 아미노산 시퀀스
(ii) SEQ ID NO: 58 의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 59 의 아미노산 시퀀스
(iv) SEQ ID NO: 60 의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 61 의 아미노산 시퀀스
(vi) SEQ ID NO: 62 의 아미노산 시퀀스
(vii)SEQ ID NO: 63 의 아미노산 시퀀스
(viii)SEQ ID NO: 67 의 아미노산 시퀀스
(ix) SEQ ID NO: 68 의 아미노산 시퀀스
(x) SEQ ID NO: 69 의 아미노산 시퀀스
(xi) SEQ ID NO: 70 의 아미노산 시퀀스.
그러므로, 구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9 결합 단백질은 다음을 포함하는 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함한다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 17 의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 18 의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 19 의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 20 의 아미노산 시퀀스, 및
(2) 다음 중으로부터 선택된 경사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 68 의 아미노산 시퀀스
(ii) SEQ ID NO: 70 의 아미노산 시퀀스.
그러므로, 구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9 결합 단백질은, 다음을 포함하는 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함한다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 18 의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 20 의 아미노산 시퀀스, 및
(2) SEQ ID NO: 68의 경사슬 가변 영역 아미노산 시퀀스.
그러므로, 구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9 결합 단백질은, 다음을 포함하는 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함한다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 17 의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 18 의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 19 의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 20 의 아미노산 시퀀스, 및
(2) SEQ ID NO: 70의 경사슬 가변 영역 아미노산 시퀀스.
그러므로, 구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9 결합 단백질은, 다음을 포함하는 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함한다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 11 의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 12 의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 13 의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 14 의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 15의 아미노산 시퀀스
(vi)SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스
(2) 다음 중으로부터 선택된 경사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 24의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 25의 아미노산 시퀀스.
또 다른 구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9 결합 단백질은, 다음을 포함하는 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함한다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 18의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 19의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 20의 아미노산 시퀀스, 및
(2) 다음 중으로부터 선택된 경사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 24의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 25의 아미노산 시퀀스.
보다 특히, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각은 다음을 포함할 수 있다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 18의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 20의 아미노산 시퀀스, 및
(2) EQ ID NO: 25의 아미노산 시퀀스의 경사슬 가변 영역.
또 다른 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9 결합 단백질은, 다음을 포함하는 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함한다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 11의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 13의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 14의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 15의 아미노산 시퀀스
(vi)SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스, 및
(2) 다음 중으로부터 선택된 경사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 29의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 30의 아미노산 시퀀스
또 다른 구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9 결합 단백질은, 다음을 포함하는 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함한다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 18의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 19의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 20의 아미노산 시퀀스, 및
(2) 다음 중으로부터 선택된 경사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 29의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 30의 아미노산 시퀀스.
보다 특히, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각은 다음을 포함할 수 있다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역:
(i) SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 18의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 19의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 20의 아미노산 시퀀스, 및
(2) 아미노산 시퀀스 SEQ ID NO: 30의 경사슬 가변 영역.
보다 특히, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각은 SEQ ID NO: 19의 중사슬 가변 영역 및 SEQ ID NO: 70의 경사슬 가변 영역를 포함할 수 있다.
보조 분자를 포함하는 콘주게이트
본 발명의 또 다른 양상에서, 본 발명에 따른 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각은, 악세서리 분자에 선택적으로 콘주게이트되며, 또한 여기서는 "콘주게이트된 항체" 또는 "콘주게이트된 항체 조각"이라 한다.
악세서리 분자는, 항체 또는 항체 조각에 직접적으로 또는 적당한 길이의 스페어서를 통해 콘주게이트될 수 있으며, 예를 들어, Kellogg et al., 2011, Bioconjug Chem , 22: 717 - 27)에 설명되어 있다.
한 실시예에서, 치료 목적을 위해 특히 채용된 악세서리 분자는 치료적 이펙터기, 예를 들어, 세포독성제(e.g. 세균, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원, 또는 이들의 조각의 효소적으로 활성 독소), 또는 방사성 기(i.e 방사성 핵종 또는 방사성 동위원소을 포함하는 기) 또는 소 분자를 포함하는 세포증식억제제 또는 면역조절제일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 악세서리 분자는, 본 발명에 따른 항체 또는 항체 조각에 콘주게이트될 때 2중 특이성 항체를 형성하는 항체의 항원-결합 조각을 포함한다. 특히, 상기 2중 특이성 항체는 2개 다른 MMP들 또는 하나의 MMP의 2개 다른 에피토프, 예를 들어 MMP9의 2개 다른 에피토프에 관한 것 있다.
구체적 실시예에서, 상기 악세서리 분자는, 예를 들어 질병의 치료, 예를 들어 크론병 치료에 대한 것일 수 있다: 본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 조각에 콘주게이트될 때 중간 크론병 내지 심각한 크론병으로 고통받는 대상의 치료를 위한 2중 특이성 항-TNFα/MMP9 항체를 형성할 수 있는 항-TNFα 항체의 가변 영역.
본 발명에 따른 콘주게이트된 항체 및 콘주게이트된 항체 조각은, 콘주게이트된 보조 분자가 질병의 사이트에 치료적 효과를 가질 수 있도록, 질병의 사이트(예를 들어 염증 또는 종양의 사이트)를 표적으로 하여 인비보에서 약제를 표적할 수 있다.
대안적인 실시예에서, 진단 목적을 위해 특히 채용된 악세서리 분자는, 예를 들어 방사성 동위원소(e.g. 3H, 14C, 32P, 35S, I25I)을 포함하는 라벨링기, 발색 라벨, 예를 들어 기질을 검출가능하게 착색되나(e.g. 고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제) 또는 형광된 화합물(e.g. 녹색 형광성 단백질, 적색 형광성 단백질)로 전환시킬 수 있는 효소, 분광법용 라벨 (e.g. 형광성 라벨, 예를 들어 플루오레세인 및 이들 유도체 유사 FITC, 텍사스 레드, 시아닌 염료, 포토시안, 로다민, 또는 비지블 컬러를 나타내는 라벨), 루시페린을 포함하는 발광성 라벨, 라벨에 특이적 추가 화합물에 의해 발전될 수 있고, 검출 및 정량화를 용이하게 하는 친화성 라벨, 또는 표준 ELISA 내에 사용된 임의의 다른 라벨일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산
또 다른 실시예에 따라 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에 따른 분리된 핵산은, 본 발명에 따른 임의의 핵산 분자를 단독 또는 조합하여 포함하는, 예를 들어, 자연 DNA 또는 RNA 또는 재조합 또는 합성 DNA, RNA 또는 LNA 또는 재조합 핵산 분자이다. 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 cDNA이다.
특정 실시예에서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 분리된 핵산이 제공된다:
(1) SEQ ID NO: 2의 중사슬 CDR1, SEQ ID NO: 3의 중사슬 CDR2, SEQ ID NO: 4의 중사슬 CDR3, 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 이들의 변이체를 암호화하는 핵산 시퀀스, 및
(2) (i) SEQ ID NO: 21의 경사슬 CDR1, SEQ ID NO: 22의 경사슬 CDR2, SEQ ID NO: 23의 경사슬 CDR3, 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 암호화하는 핵산, 또는
(2) (ii) SEQ ID NO: 26의 경사슬 CDR1, SEQ ID NO: 27의 경사슬 CDR2, SEQ ID NO: 28의 경사슬 CDR3, 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 암호화하는 핵산.
특정 실시예에서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 분리된 핵산이 제공된다:
(1) 다음 중에서 선택된 중사슬의 가변 영역를 암화화하는 핵산 시퀀스:
(i) SEQ ID NO: 11의 아미노산 시퀀스
(ii) SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
(iii) SEQ ID NO: 13의 아미노산 시퀀스
(iv) SEQ ID NO: 14의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 15의 아미노산 시퀀스
(vi)SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스
(vii)SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스
(viii)SEQ ID NO: 18의 아미노산 시퀀스
(ix)SEQ ID NO: 19의 아미노산 시퀀스
(x)SEQ ID NO: 20의 아미노산 시퀀스
(xi)SEQ ID NO: 48의 아미노산 시퀀스
(xii)SEQ ID NO: 53의 아미노산 시퀀스
(xiii)SEQ ID NO: 54의 아미노산 시퀀스
(xiv) SEQ ID NO: 55의 아미노산 시퀀스
(xv)SEQ ID NO: 56의 아미노산 시퀀스
(2) 다음 중 선택된 경사슬의 가변 영역를 암호화하는 핵산 시퀀스
(i) SEQ ID NO: 24의 아미노산 시퀀스
(ii) SEQ ID NO: 25의 아미노산 시퀀스
(iii) SEQ ID NO: 29의 아미노산 시퀀스
(iv) SEQ ID NO: 30의 아미노산 시퀀스
(v) SEQ ID NO: 57의 아미노산 시퀀스
(vi)SEQ ID NO: 58의 아미노산 시퀀스
(vii) SEQ ID NO: 59의 아미노산 시퀀스
(viii) SEQ ID NO: 60의 아미노산 시퀀스
(ix) SEQ ID NO: 61의 아미노산 시퀀스
(x) SEQ ID NO: 62의 아미노산 시퀀스
(xi) SEQ ID NO: 63의 아미노산 시퀀스
(xii) SEQ ID NO: 67의 아미노산 시퀀스
(xiii) SEQ ID NO: 68의 아미노산 시퀀스
(xiv) SEQ ID NO: 69의 아미노산 시퀀스
(xv) SEQ ID NO: 70의 아미노산 시퀀스.
특정 실시예에서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 분리된 핵산이 제공된다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역를 암호화하는 핵산 시퀀스:
(i)SEQ ID NO: 11의 아미노산 시퀀스,
(ii)SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 13의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 14의 아미노산 시퀀스
(v)SEQ ID NO: 15의 아미노산 시퀀스
(vi)SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스, 및
(2) 다음 중으로부터 선택된 경사슬 가변 영역를 암호화하는 핵산 시퀀스:
(i)SEQ ID NO: 24의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 25의 아미노산 시퀀스.
대안적 특정 실시예에서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역를 암호화하는 핵산 시퀀스:
(i)SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 18의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 19의 아미노산 시퀀스
(v)SEQ ID NO: 20의 아미노산 시퀀스, 및
(2) EQ ID NO: 25의 아미노산 시퀀스의 경사슬 가변 영역를 암호화하는 핵산 시퀀스.
또 다른 특정 실시예에서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 분리된 핵산이 제공된다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역를 암호화하는 핵산 시퀀스:
(i) SEQ ID NO: 11의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 13의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 14의 아미노산 시퀀스
(v)SEQ ID NO: 15의 아미노산 시퀀스
(vi)SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스, 및
(2) 다음 중으로부터 선택된 경사슬 가변 영역를 암호화하는 핵산 시퀀스:
(i) SEQ ID NO: 29 의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 30.의 아미노산 시퀀스.
대안적 특정 실시예에서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 분리된 핵산이 제공된다:
(1) 다음 중 선택된 중사슬 가변 영역를 암호화하는 핵산 시퀀스:
(i)SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
(ii)SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스
(iii)SEQ ID NO: 18의 아미노산 시퀀스
(iv)SEQ ID NO: 19의 아미노산 시퀀스
(v)SEQ ID NO: 20의 아미노산 시퀀스, 및
(2) SEQ ID NO: 30의 아미노산 시퀀스의 경사슬 가변 영역를 암호화하는 핵산 시퀀스.
또 다른 특정 실시예에서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 분리된 핵산이 제공된다:
(1) SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, 및 SEQ ID NO: 33을 포함하는 헥산 시퀀스, 또는 이들의 변이체로서 상기 시퀀스 중 하나와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아이덴티티를 갖는 변이체, 및/또는
(2) 다음으로부터 선택된 핵산 시퀀스:
a) SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, 및 SEQ ID NO: 36을 포함하는 핵산 시퀀스 또는 이들의 변이체로서 상기 시퀀스 중 하나와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아이덴티티를 갖는 변이체,
b) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39를 포함하는 핵산 시퀀스, 또는 이들의 변이체로서 상기 시퀀스 중 하나와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아이덴티티를 갖는 변이체.
본 발명의 폴리펩티드 제조 및 정제를 위한 벡터 및 숙주 세포
한 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하며, 상기 벡터는 선택적으로 발현 대조군 시퀀스를 포함하여, 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 암호화된 폴리펩티드의 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 발현이 가능하게 한다.
수 많은 발현 시스템은 제한없이 염색체, 에피솜, 및 유래 바이러스을 포함하여 사용될 수 있다. 보다 특히, 상기 사용된 재조합 벡터는, 세균 플라스미드, 트랜스포손, 이스트 에피솜, 삽입 요소(insertion element), 이스트 염색체 요소, 바이러스, 예를 들어 바큐로바이러스, 유두종 바이러스, 예를 들어 SV40, 종두증 바이러스, 아데노바이러스, 여우 매독 바이러스, 가성광견병 바이러스, 레트로바이러스로부터 유래될 수 있다.
이들 재조합 벡터는 동등하게 코스미드 또는 파지미드 유도체일 수 있다.
상기 핵산 시퀀스는,당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 의해 재조합 발현 벡터 내에 삽입될 수 있으며, 예를 들어, MOLECULAR CLONING에 설명되어 있다: A LABORATORY MANUAL, Sambrook et al., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001.
상기 재조합 벡터는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 발현 및 전사뿐만 아니라 본 발명의 폴리펩티드의 번역을 제어 또는 조절할 수 있게 하는 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 포함할 수 있으며, 이들 시퀀스는 사용된 숙주 세포에 따라 선택된다.
그러므로, 예를 들어, 적당한 분비 신호를 재조합 벡터 내로 통합하여, 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 폴리펩티드는 소포체(endoplasmic reticulum)의 루멘, 주변세포질 공간(periplasmic space), 막 위 또는 세포외 환경 쪽으로 향하게할 것이다. 적당한 분비 신호를 선택하여, 연속적인 단백질 정제를 용이하게 할 수 있다. 추가 실시예에서, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
숙주 세포 내 재조합 벡터의 도입은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어 BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 2nd ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, 및 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 앞서 언급한, 예를 들어 칼슘 포스페이트에 의한 형질주입, DEAE 덱스트란에 의한 형질주입, 형질주입, 미세주입법, 양이온 지질에 의한 형질주입, 전기천공법, 형질도입 또는 감염이 있다.
상기 숙주 세포는, 예를 들어, 세균 세포들, 예를 들어 E. coli 또는 Streptomyces, 곰팡이의 세포, 예를 들어 Aspergillus 및 이스트, 예를 들어 Saccharomyces, 곤충 세포, 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), C127 마우스 세포주, 시리안 햄스터 세포의 BHK 세포주, 인간 배아 콩팥 293 (HEK 293) 세포일 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 숙주 세포는 CHO 세포 또는 HEK 293 세포이다.
상기 숙주 세포는, 본 발명의 폴리펩티드를 발현하기 위하여 사용될 수 있다. 표준 방법에 의해 정제한 후, 본 발명의 폴리펩티드는 이후 설명된 방법 내에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 재조합 단백질을 분비하는 발현 시스템이 채용될 때, 배양 배지는 상업적으로 이용가능한 단백질 농도 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 초여과 장치를 사용하여 1차적으로 농축될 수 있다. 농축 단계 이후에, 농축물을 정제 매트릭스, 예를 들어 겔 여과 매트릭스에 적용할 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 및/또는 친화성 수지가 사용될 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 단백질 정제시 공통적으로 사용된 다른 종류일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계가 사용될 수 있다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매질을 사용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계가 사용되어 상기 항체 또는 이들의 조각을 더 정제할 수 있다. 다양하게 조합된 이전 정제 단계의 일부 또는 모두는 잘 알려져 있고, 실질적으로 동종의 재조합 단백질을 제공하기 위하여 사용될 수 있다.
세균 배양에서 생성된 재조합 단백질은 숙주 세포의 초기 붕괴(initial disruption), 원심분리, 불용성 폴리펩티드라면 세포 펠릿으로부터 추출, 또는 용해성 폴리펩티드라면 상청 유체로부터 추출, 이후 한번 이상의 농축, 염석(salting-out), 이온 교환, 친화성 정제 또는 사이즈 배제 크로마토그래피 단계에 의해 분리될 수 있다. 미생물 세포는 동결-해동 순환(freeze-thaw cycling), 음파처리, 기계적 붕괴(mechanical disruption), 또는 세포 용혈제의 사용을 포함하여, 임의의 종래 방법에 의해 붕괴될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포를 제조하는 방법을 제공하며, 본 발명에 따른 벡터 또는 핵산으로 세포를 유전적으로 가공하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 폴리펩티드의 발현을 촉진하기에 충분한 조건하에서 상기 항체 또는 이들의 조각을 암호화하는 핵산 시퀀스를 포함하는 발현 벡터로 변환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각은, 사용된 발현 시스템에 따라서, 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 회수된다. 통상의 기술자에게 알려진 것처럼, 재조합 단백질을 정제하기 위한 방법은 사용된 숙주 세포의 종류와 같은 인자에 따라서 변화할 것이며, 재조합 단백질이 상술된 배양 배지 내로 분비되거나 분비되지 않는다.
조성물
본 발명은, 의학적 질병, 및 특히 염증성 및/또는 자가면역 질환 또는 암으로 고통받는 환자, 바람직하게는 포유류 환자, 및 가장 바람직하게는 인간 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법으로서 약제학적 또는 치료적 약제를 제공한다. 대안적으로, 본 발명은, 의학적 질병, 및 특히 염증성 및/또는 자가면역 질환 또는 암을 예방하기 위한 방법을 제공한다.
한 실시예에서, 다음 중의 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다: (i) 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각, (ii) 본 발명에 따른 핵산, (iii) 본 발명에 따른 벡터, 및/또는 (iv) 본 발명에 따른 숙주 세포, 및 적어도 하나의 약제하적으로 허용가능한 담체.
본 발명의 약제학적 조성물은 여기 설명된 임의의 형태로 MMP9 특이적 하나 이상의 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 하나 이상의 약제학적 허용가능한 추가적 성분(들), 예를 들어, 명반, 안정제, 항균제, 완충제, 착색제, 방향제, 아주반트, 및 이와 유사한 것을 포함한다.
본 발명의 화합물은, 종래적으로 사용된 아주반트, 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 약제학적 조성물의 형태 및 이들의 단위 복용 형태로 놓여질 수 있으며, 그러한 형태에서 고체, 예를 들어 정제 또는 충진된 캡슐, 냉동-건조된 형태, 또는 액체, 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀젼, 앨리시르, 또는 동일한 것으로 충진된 캡슐이 모두 경구형 용도로서, 또는 비경구성 용도(피하성 용도 포함)를 위한 멸균의 주사가능한 용액의 형태로 사용될 수 있다. 그러한 약제학적 조성물 및 이들의 단위 복용 형태는 추가적 활성 화합물 또는 원칙과 함께 또는 없이, 종래 비율로 성분들을 포함할 수 있으며, 그러한 단위 복용 형태는, 사용되는 의도된 매일 복용 범위에 비례하여, 활성 성분의 임의의 적당히 효과적인 함량을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 이에 한정되지 않지만, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽, 및 앨리시르를 포함하는 액상 제형일 수 있다. 경구 투여에 적당한 액체 형태는 완충제, 현탁화제 및 분산제, 착색제, 향료 및 이와 유사한 것들과 함께, 적당한 수성 또는 비수성 비이클을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 사용 전에 물 또는 다른 적당한 비이클과 재구성하기 위한 건성 제품으로서 제형화될 수 있다. 그러한 액상 제제는, 이에 한정되지는 않지만, 현탁화제, 에멀젼화제, 비수성 비이클 및 방부제를 포함하는 첨가제를 포함할 수 있다. 현탁화제는, 이에 한정되지는 않지만, 소르비톨 시럽, 메틸셀룰로오스, 글루코오스/당 시럽, 젤라틴, 히드록시에틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 알루미늄 스테아레이트 겔, 및 수소화된 식용 지방을 포함한다. 에멀젼화제는, 이에 한정되지는 않지만, 레시틴, 소르비탄 모노올리에이트, 및 아카시아를 포함한다. 비수성 비이클은, 이에 한정되지는 않지만, 식용 오일, 아몬드유, 븐별화 코코넛 오일, 유성 에스테르, 프로필렌 글리콜, 및 에틸 알코올을 포함한다. 방부제는, 이에 한정되지는 않지만, 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 및 소르빈산을 포함한다. 추가 물질뿐만 아니라 가공 기술 및 이와 유사한 것들은, Part 5 of Remington's The Science 및 Practice of Pharmacy, 22 nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press and the University of the Sciences, Philadelphia College of Pharmacy에 설정되어 있고, 이는 여기 참조로서 통합되어 있다.
본 발명의 고체 조성물은, 종래 방법에 따라 제형화된 정제 또는 로젠즈(lozenge)의 형태일 수 있다. 경구 투여를 위한 정제 및 캡슐은 이에 한정되지는 않지만, 결합제, 필러, 윤활제, 붕해제, 습윤화제를 포함하는 종래 부형제를 포함할 수 있다. 결합제는, 이에 한정되지는 않지만, 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트래거캔스 고무, 전분이 점액 및 폴리비닐피롤리드 하나를 포함한다. 필러는, 이에 한정되지는 않지만, 락토오스, 당, 미정질 셀룰로오스, 옥수수전분, 칼슘 포스페이트, 및 소르비톨를 포함한다. 윤활제는, 이에 한정되지는 않지만, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜, 및 실리카를 포함한다. 붕괴제는, 이에 한정되지는 않지만, 감자 전분 및 소듐 전분 글리콜레이트를 포함한다. 습윤화제는, 이에 한정되지는 않지만, 소듐 라우릴 설페이트를 포함한다. 정제는 당해 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다.
주사가능한 조성물은, 전형적으로 주사가능한 멸균 생리 식염수 또는 포스페이트-완충 생리 식염수 또는 당해 기술분야에 알려진 다른 주사가능한 담체이다.
본 발명의 조성물은, 이에 한정되지는 않지만, 크림, 연고, 로션, 페이스트, 약용 플라스터, 패치 또는 막을 포함하는 수성 또는 비수성 비이클을 포함하는 경피성 제형으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 이에 한정되지는 않지만, 주사 또는 연속 주입(continuous infusion)에 의한 것들을 포함하는, 비경구성 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 주사를 위한 제형은, 유성 또는 수성 비이클 내에 현탁액, 용액 또는 에멀젼 형태일 수 있으며, 이에 한정되지는 않지만, 현탁화제, 안정화제 및 분산제를 포함하는 제형화제를 포함할 수 있다. 조성물은, 이에 한정되지는 않지만, 멸균의, 피로겐-프리 물(pyrogen-free water)을 포함하는 적당한 비이클로 재구성하기 위한 분말 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물이 데폿 제제(depot preparation)로서 제형화될 수 있으며, 이식 또는 근육내 주사에 의해 투입될 수 있다. 상기 조성물은 적당한 폴리머성 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용가능한 오일 중 에멀젼 처럼), 이온 교환 수지, 또는 조금 용해가능한 유도체(예를 들어, 조금 용해가능한 염)으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물은 지효성 형태 또는 지효성 약물 송달 시스템으로 또한 투여될 수 있다. 대표적인 지효성 물질의 설명은 Remington's Pharmaceutical Sciences의 통합된 물질 내에서 발견될 수 있다.
주사가능한 제형은 특히 본 발명에 따른 조성물을 투여하는 데 적당한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 여기 설명된 MMP9 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함하는 영상화 조성물 또는 진단 조성물을 제공한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 대상에서 활성 MMP9의 검출을 위하여 여기 설명된 MMP9 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함하는 진단 조성물을 제공한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 대상 내의 활성 MMP9의 검출을 위하여, 여기 설명된 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조작을 포함하는 진단 조성물을 제공하며, 여기서 상기 항체는 SEQ ID NO: 19의 중사슬 가변 영역 및 SEQ ID NO: 70의 경사슬 가변 영역를 포함한다.
한 실시예에서, 본 발명에 따른 진단 조성물은, 방사성 동위원소, 비오틴, 아비딘, 스트렙아비딘, 발색단, 형광단, 화학발광성 모이어티, 햅텐 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 모이어티에 콘주게이트된, 여기 설명된 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함한다.
본 발명에 따른 영상화 조성물 또는 진단 조성물은, 염증성 및/또는 자가면역 질환 또는 암과 관련된 MMP9의 상승된 준위를 검출하는데 유용하다.
조합
본 발명에 따라, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각은 단독으로, 또는 염증성 및/또는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료에 유용한 공동 약제, 예를 들어 바이오로직스(biologics), 소분자 및 백신을 포함하는 면역 조절 약물과 조합하여 투여될 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각은 단독으로, 또는 암의 치료에 유용한 공동 약제, 예를 들어 항-암성 약물, 예를 들어 세포 독성 약물((Folfox, Xelox, Folfirinox, Folfox6), 카페시타빈, 도세탁셀 (Taxotere), 파클리탁셀 (Taxol), Nab/파클리탁셀, 5-플루오로우라실 (5-FU), 6-메르캅토퓨린 (6-MP), 카페시타빈 (Xeloda), 시타라빈 (Ara-C), 플록수리딘, 플루다라빈, 겜시타빈(Gemzar), 겜시타빈-시스플라틴, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 퍼네트렉세드 (Alimta), 익사베필론 (Ixempra), 빈블라스틴 (Velban), 빈크리스틴 (Oncovin), 및 비노렐빈 (Navelbine), 에스트라무스틴 (Emcyt)), 티로신 키나아제 저해제 (이마티닙 (Gleevec/Glivec), 또는 제피티닙 (Iressa), 또는 엘로티닙 (Tarceva), 아파티닙 (Giotrif), 악시티닙 (Inlyta), 보수티닙(Bosulif), 크리조티닙(Xalkori), 다사티닙(Sprycel), 라파티닙 (Tyverb), 닐로티닙(Tasigna), 파조파닙(Votrient), 소라페닙(Nexavar), 서니티닙(Sutent)) 및 치료적 항체, 예를 들어 트라스츄주맵(Herceptin), 베바시주맵(Avastin), 세툭시맵(Erbitux), 파니투무맵(Vectibix), 페르투주맵 (Perjeta), 이필리무맵(Yervoy), 니볼루맵(Opdivo) 및 펨브로리주맵(Keytruda) 또는 항-CD20 항체 리툭시맵 (Rituxan)와 함께 조합되어 투여될 수 있다.
본 발명은, MMP9 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 투여를 포함하며, 여기서 상기 항체 또는 이들의 조각은, MMP9-관련 질병의 예방 및/또는 치료에 유용한 다른 치료요법 또는 공동 약제, 투여전에, 이와 동시에 또는 연속하여 치료적으로 효과적인 함량으로 개인에게 투여되며, 상기 질병들은 염증성 및 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 암 또는 종양, 섬유증 질병, 심혈관계 질환, 신경 질환, 눈병, 또는 임의의 MMP9-관련 질병 또는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 공동 약제와 동시에 투여되는, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각은, 동일하거나 다른 투여 경로 및 동일하거나 다른 조성물로 투여될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각은, 중간 크론병 내지 심각한 크론병으로 고통받는 대상의 치료를 위하여 항-TNFα 항체와 조합하여 투여될 수 있다.
투여 모드
본 발명의 조성물은 이에 한정되지 않지만, 경구적으로, 비경구적으로, 혀 밑으로, 경피로, 직장으로, 점막경유로, 국소적으로, 흡입을 통해, 구강을 통해 또는 비강 내로 투여 또는 방광 내로, 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 방법으로 투여될 수 있다.
비경구적 투여는, 이에 한정되지 않지만, 정맥으로, 동맥 내로, 복강 내로, 피하로(subcutaneous), 근육내로, 척추 강 내로(intra-thecal), 및 관절 내로(intra-articular)를 포함한다. 본 발명의 조성물은, 상기 조성물을 느리게 방출하게 할뿐만 아니라 느리게 제어된 i.v. 주입하게 하는 이식 형태로 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9 에 특이적 항체 또는 이의 항원-결합 조각은 전신적으로 또는 국소적으로 투여된다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각이 피하 또는 정맥 루트로 투여된다.
단일 또는 다중 복용량으로서 개인에게 투여된 복용량은 다양한 인자들, 약동학적 성질, 환자 상태 및 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증후의 정도, 동시 치료, 치료의 빈도 및 원하는 효과를 포함하는 다양한 인자들에 따라 변할 것이다.
약제학적으로 활성 항체의 전형적으로 치료학적으로 효과적인 함량은 1mg 내지 150mg/kg 체중의 복용량의 범위이다. 만약, 치료법이 연속적인 주입이라면, 이는 0.250mg 내지 20mg/kg 체중의 범위 내일 수 있다.
특히, 약제학적으로 활성 항체의 치료학적으로 효과적인 함량은 1mg 내지 50mg/kg 체중 복용량의 범위이다. 만약 치료법이 연속적인 주입이라면, 0.250mg 내지 13mg/kg 체중의 범위 내일 수 있다.
환자
전형적으로 본 발명에 따른 환자는 MMP9-관련 질병, 특히 염증성 및 자가면역 질환, 암 또는 종양, 폐병, 섬유증 폐병, 패혈증, 근육성 이영양증, 알레르기, 신장 섬유증, 피부 경화증, 팽창된 심근증, 시가스병, 심혈관계 질환, 신경정신장애, 당뇨병, 및 눈병, 또는 임의의 다른 MMP9-관련 질병 또는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMP9-관련 질병으로 고통받는 환자들이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는 염증성 및/또는 자가면역 질환으로 고통받는 환자들이며, 이러한 질병은 예를 들어, 크론병(CD)를 포함하는 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 대장염 (UC), 미확정성 대장염, 콜라겐성 대장염, 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반 루푸스 (SLE), 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 다발성 근염, 죽상등맥경화증을 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 환자는 염증성 장 질환, 보다 특히 관통형 및 협착형 크론병 및 궤양성 대장염으로 고통받는 환자들이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은, 천식을 포함하는 폐병, 섬유증 폐병, 예를 들어 특발성 폐병, 만성 폐쇄성 폐 병(COPD), 또는 패혈증, 근육성 이영양증, 알레르기, 신장 섬유증, 피부 경화증, 팽창된 심근증, 시가스병, 심혈관계 질환, 신경정신장애, 당뇨병, 및 눈병으로부터 선택된 질병으로 고통받는 환자들이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은, 예를 들어, 조혈암, 뇌암, 유방암, 대장암, 두부 및 목암, 췌장암, 폐암, 난소암, 방광암, 간암, 흑색종, 전립샘암, 근육암, 간엽암, 식도와 위 선암종, 비소 폐암, 폐 편평 세포 암종, 폐 선암종, 위 선암종, 췌장 선암종 및 간세포성 암종을 포함하는 암 또는 종양으로 고통받는 환자들이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은 대장암 또는 선암종으로 고통받는 환자들이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은, 염증성 및 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 암 또는 종양, 섬유증병, 심혈관계 질환, 신경정신장애 또는 눈병으로 이루어진 군으로부터 선택된 병으로 고통받는 환자들이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은, 섬유증병, 예를 들어, 전신 경화증, 다병소성 섬유경화증, 골수 이식 수용체 내 피부 경화성 이식편대숙주병, 신성 전신 섬유화증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 골수섬유증 및 전신성 홍반 루푸스로 고통받는 환자들이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은, 눈병, 예를 들어, 각막 렌즈의 섬유성 병적원인, 각막 질환, 당뇨망막병증, "건성" 또는 "습성" 노인황반변성, 증식유리체망막병, 백내장 형성, 익상편, 원추각막, 노인황반변성 및 당뇨망막병증으로 고통받는 환자들이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은, 심혈관계 질환, 예를 들어, 고혈압증, 죽상등맥경화증, 심근경색증, 심부전 또는 관상동맥질환 고혈압증, 폐 고혈압증, 폐 또는 오른방실판막 병, 대동맥 및 왼방실판막병, 대동맥 협착증, 죽상등맥경화증, 심근경색증, 심부전, 허혈성 심근증, 팽창된 심근증, 만성 부정맥, 심장 섬유증 및 관상동맥질환으로 고통받는 환자들이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 환자들은, 신경 질환, 예를 들어, 근위축성 측삭경화증, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 신경염증, 뇌경색 및 신경성 동통으로 고통받는 환자들이다.
본 발명에 따른 용도 및 방법
본 발명에 따른 MMP9에 대한 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물은, MMP9의 상승된 준위 및/또는 상승된 MMP9 활성과 관련된, 이에 야기된, 또는 이에 동반된 질병의 진단, 예방 또는 치료에서의 사용을 위한 것이다.
한 실시예에서 약제로서 용도를 위하여, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 제공한다.
또 다른 실시예는, 염증성 및 자가면역 질환, 암 또는 종양, 폐병, 섬유증 폐병, 패혈증, 근육성 이영양증, 알레르기, 신장 섬유증, 피부 경화증, 팽창된 심근증, 시가스병, 심혈관계 질환, 신경정신장애, 당뇨병, 및 눈병, 또는 다른 MMP9-관련 질병 또는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMP9 관련 질병의 예방 및/또는 치료에 사용되기 위한 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각을 제공한다.
또 다른 실시예는 염증성 및 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 암 또는 종양, 섬유증병, 심혈관계 질환, 신경정신장애 또는 눈병으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMP9-관련된 질병의 예방 및/또는 치료에서 사용을 위한 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각을 제공한다.
또 다른 실시예는, 염증성 및/또는 자가면역 질환, 특히 크론병(CD)를 포함하는 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 대장염 (UC), 미확정성 대장염, 콜라겐성 대장염, 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반 루푸스 (SLE), 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 다발성 근염, 죽상등맥경화증의 예방 및/또는 치료에 사용되기 위한 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각을 제공한다.
또 다른 특정 실시예는, 천식을 포함하는 폐병, 섬유증 폐병, 예를 들어 특발성 폐, 만성 폐쇄성 폐병(COPD), 또는 패혈증, 근육성 이영양증, 알레르기, 신장 섬유증, 피부 경화증, 팽창된 심근증, 시가스병, 심혈관계 질환, 신경정신장애, 당뇨병, 및 눈병으로부터 선택된 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각을 제공한다.
또 다른 특정 실시예는, 암 또는 종양, 특히 조혈암, 뇌암, 유방암, 두부 및 목암, 췌장암, 난소암, 방광암, 폐암, 간암, 흑색종, 전립샘암, 근육암, 간엽암, 식도와 위 선암종, 비소 폐암, 폐 편평 세포 암종, 폐 선암종, 위 선암종, 췌장 선암종, 간세포성 암종, 보다 특히 대장암 또는 선암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 예방 및/또는 치료에 사용되기 위한 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각을 제공한다.
또 다른 특정 실시예는, 섬유증병, 특히 전신 경화증, 다병소성 섬유경화증, 골수 이식 수용체 내 피부 경화성 이식편대숙주병, 신성 전신 섬유화증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 골수섬유증 및 전신성 홍반 루푸스의 예방 및/또는 치료에 사용되기 위한 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각을 제공한다.
또 다른 특정 실시예는, 눈병, 특히 렌즈의 섬유증 병리 원인, 각막 질환, 당뇨망막병증, "건성" 또는 "습성" 노인황반변성, 증식유리체망막병, 백내장 형성, 익상편, 원추각막, 노인황반변성 및 당뇨망막병증의 예방 및/또는 치료의 용도에 대한 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각을 제공한다.
또 다른 특정 실시예는, 심혈관계 질환, 특히 고혈압증, 폐 고혈압증, 폐 또는 오른방실판막 병, 대동맥 및 왼방실판막 병, 대동맥 협착증, 죽상등맥경화증, 심근경색증, 심부전, 허혈성 심근증, 팽창된 심근증, 만성 부정맥, 심장 섬유증 및 관상동맥질환의 예방 및/또는 치료용 용도로서 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각을 제공한다.
또 다른 특정 실시예는, 신경장애, 특히 근위축성 측삭경화증, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 신경염증, 뇌경색 및 신경성 동통의 예방 및/또는 치료용 용도로서 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각을 제공한다.
또 다른 실시예에서 염증성 및 자가면역 질환, 암 또는 종양, 폐병, 섬유증 폐병, 패혈증, 근육성 이영양증, 알레르기, 신장 섬유증, 피부 경화증, 팽창된 심근증, 시가스병, 심혈관계 질환, 신경정신장애, 당뇨병, 및 눈병, 또는 임의의 다른 MMP9-관련 질병 또는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMP9관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 제공한다.
구체적 실시예에서 염증성 및 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 암 또는 종양, 섬유증병, 심혈관계 질환, 신경정신장애 또는 눈병의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 용도를 제공한다.
하나의 특정 실시예에서, 대상에서 염증성 및/또는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료, 특히 크론병(CD)를 포함하는 염증성 장 질환(IBD), 궤양성 대장염 (UC), 미확정성 대장염, 콜라겐성 대장염, 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증 (MS), 전신성 홍반 루푸스 (SLE), 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 다발성 근염, 죽상등맥경화증의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 용도를 제공한다.
구체적 실시예에서 염증성 장 질환, 특히 관통형 및 협착형 크론병 및 궤양성 대장염의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 용도를 제공한다.
하나의 특정 실시예에서, 천식을 포함하는 폐질환, 섬유증 폐병 예를 들어 특발성 폐병, 만성 폐쇄성 폐 병(COPD), 또는 패혈증, 근육성 이영양증, 알레르기, 신장 섬유증, 피부 경화증, 팽창된 심근증, 시가스병, 심혈관계 질환, 신경정신장애, 당뇨병, 및 눈병으로부터 선택된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 용도를 제공한다.
대안적인 실시예에서, 암 또는 종양의 예방 및/또는 치료, 특히 조혈암, 뇌암, 유방암, 두부 및 목암, 췌장암, 난소암, 방광암, 폐암, 간암, 흑색종, 전립샘 암, 근육암, 간엽암, 식도와 위 선암종, 비소 폐암, 폐 편평 세포 암종, 폐 선암종, 위 선암종, 췌장 선암종, 간세포성 암종, 보다 특히 대장암 또는 선암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 용도를 제공한다.
구체적 실시예에서, 대장암 또는 선암종의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 용도를 제공한다.
구체적 실시예에서, 섬유증병, 특히 전신 경화증, 다병소성 섬유경화증, 골수 이식 수용체 내 피부 경화성 이식편대숙주병, 신성 전신 섬유화증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 골수섬유증 및 전신성 홍반 루푸스의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 용도를 제공한다.
구체적 실시예에서, 눈병, 특히 렌즈의 섬유성 병리 원인, 각막 질환, 당뇨망막병증, "건성" 또는 "습성" 노인황반변성, 증식유리체망막병, 백내장 형성, 익상편, 원추각막, 노인황반변성 및 당뇨망막병증의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 용도를 제공한다.
구체적 실시예에서, 심혈관계 질환, 특히 고혈압증, 폐 고혈압증, 폐 또는 오른방실판막병, 대동맥 및 왼방실판막병, 대동맥 협착증, 죽상등맥경화증, 심근경색증, 심부전, 허혈성 심근증, 팽창된 심근증, 만성 부정맥, 심장 섬유증 및 관상동맥질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 용도를 제공한다.
구체적 실시예에서, 신경장애, 특히 근위축성 측삭경화증, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 신경염증, 뇌경색 및 신경성 동통의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 용도를 제공한다.
또 다른 실시예에서 염증성 및 자가면역 질환, 암 또는 종양, 폐병, 섬유증 폐병, 패혈증, 근육성 이영양증, 알레르기, 신장 섬유증, 피부 경화증, 팽창된 심근증, 시가스병, 심혈관계 질환, 신경정신장애, 당뇨병, 및 눈병, 또는 임의의 다른 MMP9-관련 질병 또는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 MMP9-관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공하며, 이는 치료가 필요한 대상에, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 치료학적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시예에서 염증성 및 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 암 또는 종양, 섬유증병, 심혈관계 질환, 신경정신장애 또는 눈병의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공하며, 치료가 필요한 대상에, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 치료학적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시예에서, 염증성 및/또는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료를 위한, 특히 크론병(CD)를 포함하는 염증성 장질환(IBD), 궤양성 대장염(UC), 미확정성 대장염, 콜라겐성 대장염, 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 전신성 홍반 루푸스(SLE), 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 다발성 근염, 죽상등맥경화증의 예방 또는 치료를 위한 방법을 제공하며, 치료가 필요한 대상에, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 항원-결합 조각의 치료학적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함한다.
구체적 실시예에서, 염증성 장 질환의 예방 및/또는 치료, 특히 관통형 및 협착형 크론병 및 궤양성 대장염의 예방 또는 치료의 방법을 제공하며, 치료가 필요한 대상에, 본 발명에 따른 MMP9 특이적 항체 또는 항원-결합 조각의 치료학적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 특정 실시예에서, 천식을 포함하는 폐병, 섬유증 폐병, 예를 들어 특발성 폐, 만성 폐쇄성 폐 병(COPD), 또는 패혈증, 근육성 이영양증, 알레르기, 신장 섬유증, 피부 경화증, 팽창된 심근증, 시가스병, 심혈관계 질환, 신경정신장애, 당뇨병, 및 눈병으로부터 선택된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공하며, 치료가 필요한 대상에, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각의 치료학적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함한다.
대안적인 실시예에서, 암 또는 종양의 예방 및/또는 치료, 특히 조혈 암, 뇌 암, 유방암, 대장암, 두부 및 목 암, 췌장암, 폐암, 간 암, 흑색종, 전립샘 암, 근육 암, 간엽 암, 식도와 위 선암종, 비소 폐암, 폐 편평 세포 암종, 폐 선암종, 위 선암종, 췌장 선암종, 간세포 암종대장암 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 예방 및/또는 치료의 방법을 제공하며, 치료가 필요한 대상에, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 항원-결합 조각의 치료학적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함한다.
구체적 실시예에서, 대장암 또는 선암종의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공하며, 치료가 필요한 대상에, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 항원-결합 조각의 치료학적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함한다.
구체적 실시예에서, 섬유증병, 특히 전신 경화증, 다병소성 섬유경화증, 골수 이식 수용체 내 피부 경화성 이식편대숙주병, 신성 전신 섬유화증, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 골수섬유증 및 전신성 홍반 루푸스의 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 치료가 필요한 대상에, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 항원-결합 조각의 치료학적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함한다.
구체적 실시예에서, 눈병, 특히 렌즈의 섬유성 병리 원인, 각막 질환, 당뇨망막병증, "건성" 또는 "습성" 노인황반변성, 증식유리체망막병, 백내장 형성, 익상편, 원추각막, 노인황반변성 및 당뇨망막병증의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공하며, 치료가 필요한 대상에, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 항원-결합 조각의 치료학적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함한다.
구체적 실시예에서, 심혈관계 질환, 특히 고혈압증, 폐 고혈압증, 폐 또는 오른방실판막병, 대동맥 및 왼방실판막병, 대동맥 협착증, 죽상등맥경화증, 심근경색증, 심부전, 허혈성 심근증, 팽창된 심근증, 만성 부정맥, 심장 섬유증 및 관상동맥질환의 예방 및/또는 치료를 위한 방법을 제공하며, 치료가 필요한 대상에, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 항원-결합 조각의 치료학적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함한다.
구체적 실시예에서, 신경장애, 특히 근위축성 측삭경화증, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 신경염증, 뇌경색 및 신경성 동통의 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 치료가 필요한 대상에, 본 발명에 따른 MMP9에 특이적 항체 또는 항원-결합 조각의 치료학적으로 효과적인 함량을 투여하는 단계를 포함한다.
대안적인 실시예에서, 생물학적 샘플 내에서 MMP9를 검출하는 방법을 제공하며, 본 발명에 따라 MMP9에 특이적 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 가지고 대상의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다.
여기 사용된 "생물학적 샘플"은, 대상, 특히 염증성 또는 자가면역 질환 및/또는 암 또는 종양 또는 그러한 질병을 발전시킬 높은 위험성으로 의심되는 환자 또는 고통받는 환자로부터 얻어진 세포, 조직 샘플 또는 세포 성분(예를 들어 세포성 막 또는 세포성 성분)을 의미한다.
생물학적 샘플의 예는, 혈액, 혈청, 플라즈마, 뇌척수액, 윤활액, 소변, 대변 및 상기 조직으로부터 분리된 세포를 포함하는 조직 샘플을 포함한다. 조직 샘플은 포말린 고정 또는 냉동된 조직 절편을 포함한다.
MMP9의 검출 및 분석을 위한 임의의 적당한 방법은, 당해 기술분야에 알려진 진단 분석 기술, 예를 들어 경합 결합 분석, 직접적 또는 간접적 샌드위치 분석 및 이종 또는 동종 상 내에서 수행된 면역침강정제법을 포함하여, 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 생물학적 샘플 내 MMP9 단백질의 존재 및/또는 농도를 검출하는 엑소비보 방법을 제공하며, 다음 단계들을 포함한다:
(i) 대상의 생물학적 샘플을 제공하는 단계,
(ii) 항원-항체 상호 작용을 통하여 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 MMP9 단백질을 상기 적어도 하나의 항체 또는 이들의 조각에 결합시키기에 충분한 조건하에서, 상기 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 적어도 하나 항체 또는 이들의 항원-결합 조각과 반응시키는 단계; 및
(iii) 상기 (ii) 단계에서 형성된 항원-항체 복합체의 준위에 비례하는 신호를 검출하는 단계,
여기서 상기 신호의 강도는 생물학적 샘플 내 MMP9 단백질의 농도와 관련이 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 생물학적 샘플 내 활성 MMP9 단백질의 존재 및/또는 농도를 검출하는 엑소비보 방법을 제공하며, 다음 단계들을 포함한다:
(i) 대상의 생물학적 샘플을 제공하는 단계,
(ii) 항원-항체 상호작용을 통하여 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 활성 MMP9 단백질을 상기 적어도 하나의 항체 또는 이들의 조각에 결합시키기에 충분한 조건하에서, 본 발명에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 상기 생물학적 샘플과 반응시키는 단계; 및
(iii) 단계(ii)에서 형성된 항원-항체 복합체의 준위에 비례하하는 신호를 검출하는 단계,
여기서 상기 신호의 강도는 생물학적 샘플 내의 활성 단백질 MMP9 단백질의 농도와 관련이 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은, 생물학적 샘플 내의 활성 MMP9 단백질의 존재 및/또는 농도를 검출하는 엑소 비보 방법을 제공하며, 여기서 본 발명에 따른 적어도 하나 항체 또는 이들의 항원-결합 조각은 SEQ ID NO: 19의 중사슬 가변 영역 및 SEQ ID NO: 70의 경사슬 가변 영역를 포함한다.
보다 특히, 다음 단계들을 포함하는, 대상의 생물학적 샘플로부터 MMP9의 상승된 준위와 관련된 염증성 및/또는 자가면역 질환 또는 암의 예후 또는 진단의 엑소비보 방법을 제공한다:
(a) 대상의 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
(b) 항원-항체 상호작용을 통해 상기 생물학적 유체 샘플 내에 존재하는 MMP9 단백질을 상기 적어도 하나의 항체 또는 이들의 조각에 결합하는데 충분한 조건하에서, 본 발명에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이들의 조각이 결합된 고체 배트릭스와 상기 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계,
(c) 상기 고체 매트릭스의 표면으로부터 결합되지 않은 임의의 MMP9 단백질을 제거하는 단계;
(d) 상기 고체 매트릭스에 결합된 항원-항체 복합체의 준위에 비례하는 신호를 검출하는 단계,
(e) 상기 단계(d)에서 검출된 신호의 준위를 음성 대조군을 가지고 동일한 조건 내에서 검출된 신호의 준위를 비교하는 단계,
여기서 음성 대조군 내에서 검출된 신호의 준위보다 높은, 대상의 샘플 내에서 검출된 신호의 준위는 염증성 및/또는 자가면역 질환 또는 암과 관련된 MMP9의 증가된 준위를 가리킨다.
키트 (Kit)
본 발명의 하나의 양상은, 본 발명에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이들의 항원-결합 조각, 및/또는 상기 항체 또는 이들의 조각을 암호화하는 적어도 하나의 핵산, 및/또는 상기 핵산을 포함하는 적어도 하나의 벡터, 및/또는 본 발명에 따른 적어도 하나의 숙주 세포, 및 선택적으로 지시 재료를 포함하는 키트에 관한 것이다.
특정 실시예에서, 본 발명에 따른 키트는, 고체 매트릭스에 결합되거나 또는 이미 결합된 본 발명에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이들의 항원-결합 조각을 포함한다.
본 발명에 적당한 고체 매트릭스의 예는, 본 발명에 따른 면역분석법 또는 방법을 수행하기에 적당한 임의의 고체상 지지체, 예를 들어, 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 니트로셀룰로오스, 석영, 세라믹, 덱스트란 또는 다른 물질로부터 형성 또는 이것으로 코팅된, 예를 들어 비드, 극미립자, 나노입자, 튜브, 패브릭 또는 플레이트, 필름, 슬라이드, 웰을 포함한다. 예를 들어, 상기 고체 매트릭스는 미세적정기 웰, 예를 들어 96-웰 미세적정기 플레이트의 형태이다.
본 발명에 따른 키트 내에서 상기 고체 매트릭스에 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각을 고정화하는 것은, 고체상 지지체에 대한 흡착 또는 화학적 결합에 의해 수행될 수도 있다. 고체 지지체에 단백질 또는 펩티드를 고정화하기 위한 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각은 기술, 예를 들어 아미드 또는 에스테르 결합 또는 흡착을 통한 공유 결합과 같은 기술에 의해 고체 매트릭스에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 펩티드는 결합 쌍, 예를 들어, 비오틴 및 아비딘 또는 항체 및 항원을 사용하여 결합될 수 있다. 펩티드가 고체 매트릭스에 고정된 후, 고체 매트릭스는 블록킹 용액(블록킹 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민을 포함)으로 배양되어 지지 표면에 대한 시험 샘플 내 항체의 비특이적 흡착을 축소시킬 수 있다. 하나의 양상에 따라, 본 발명에 따른 항체 또는 이들의 조각은 본 발명의 키트의 고체 매트릭스 위에서 직접적으로 합성될 수 있다.
하나의 실시예에 따라, 상기 키트가 고체상 지지체로서 고체 매트릭스에 결합하기 위하여, 본 발명에 따른 적어도 하나의 항체 또는 이들의 조각 또는 이들의 조합을 포함할 때, 상기 키트는 면역분석을 수행하기 위하여 선택적으로 결합 시약 및/또는 고체 매트릭스를 더 포함한다.
또 다른 실시예에 따라, 본 발명에 따른 키트는, 잡음 검출을 피하기 위하여, 검출 전에 결합되지 않은 물질을 세척하기 위한 적어도 하나의 세정 시약을 포함한다. 전형적으로 세정 시약은 당해 기술분야에 알려진 표준 완충제를 포함한다.
여기 인용된 참조 문헌은 전체적으로 참조로서 여기 통합되어 있다. 본 발명은 여기 설명된 특정 실시예에 의해 그 범위가 제한되지 않으며, 본 발명의 개별 양상의 설명으로 의도된 것이며, 기능적으로 동등한 방법 및 성분들이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 사실상, 여기 보여지고 설명된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형은 앞선 설명 및 부가되는 도면들로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 그러한 변형은 첨부된 청구범위 내에 포함되는 것으로 의도된 것이다.
설명되어진 본 발명, 다음 예들은 설명을 위하여 제시된 것이고 제한되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 본 발명에 따른 항- MMP9 항체의 제조 및 분리
본 발명에 따른 항-MMP9 항체는 다음 단계를 수행하여 얻어졌다:
1/ 파지 디스플레이 히트 디스커버리(Hit Discovery, HD)
ScFv 라이브러리가 ScFv 조각의 공급원으로서 사용되었다. 이 라이브러리는, 보통 크기(약 2.5.109 VH/VL 조합들)의, 근원이 순수(즉, 비-면역화된 건강한 인간 공여자의 PBMC를 사용하여 구축됨)하고, 클론에 의해 선택되지 않은, 비-클래스 스위치된 IgM 레퍼토리로부터 유래된 VH 도메인을 포함한다. 이 라이브러리를 사용하여, ScFv 후보자는, 파지 디스플레이에 의해 인간 또는 마우스 MMP9에 대한 이들의 결합(완전한 길이, 프로-, 및 활성화된 형태)을 기초로 1차적으로 선택되었고, 상기 ScFvs는 IgG1 내로 새로 포맷되었고, MMP9 활성의 기능적 중화에 대해 스크린되었다(특히, 중화의 IC50, 종 선택성, 중화의 양상(프로 MMP9 또는 MMP9)을 결정하는 것에 의함). 이 단계는 10 후보자 항체의 확인을 가능하게 하며, 이는 2개의 기계적 분류로 나누어질 수 있다: 잠복성 프로 MMP9의 활성화에 간섭하는 것에 의해 MMP9 활성을 블록킹하는 것들(프로-도메인은 항체에 의해 인식된 에피토프의 일부인 것을 암시함) 및 활성화된 MMP9의 촉매 활성과 직접적으로 간섭하는 것들(CAT fn도메인이 항체에 의헤 인식된 에피토프의 일부라는 것을 암시함).
친화도 성숙을 위한 VL 사슬 셔플링(chain shuffling)에 의한 2/ Hit 최적화 (HO):
이전 단계에서 얻어진 HD 후보들 중 4개는 이들의 효능을 개선하기 위하여 람다 경사슬 셔플링을 통해 히트 최적화하였다. 기본적으로, 부모 HD 클론 VH 사슬이 원래 라이브러리의 전체 VL 람다 내용물에 대하여 교환되어, 몇가지 새로운 클론-특이적 라이브러리를 생성한다.
3/ 선도물질 최적화:
두개의 HO 후보자들(F20-VH/B03-VLc 및 F20-VH/B08-VLc)은, 선도 최적화 및 특성화를 위하여, 작용의 이들의 메커니즘, 즉 MMP9 효소적 활성의 저해를 기초로 선택되었으며, 이는 특히 (i) 생물물리학적 성질을 잠재적으로 개선하고 면역원성 위험을 줄이기 위하여 가장 가까운 인간 생식계열부터의 시퀀스 일탈을 최소화하기 위하여 프레임워크 잔기(Kabat에 의해 정의됨)를 생식계화하여 최적화하고 및 (ii) 항체의 화학적 불안정성 또는 응집을 유도할 수 있는 CDRs 내의 일부 아미노산 또는 아미노산 모티프를 변화시키는 것을 통해 이루어졌다. 이 전략은 상기 표 2에 나타낸 VHVL 영역을 포함하는 항체의 생성을 가능하게 하였다.
다음 실시예에서, 이후 표 3 내 언급된 특이적 VH/VL 영역이 추가 특성화를 위하여 인간 IgG4로서 재포맷되었다. 이 목적을 위하여, HEK293 세포 내의 IgG4의 일시적 공동-발현을 위하여, 관심있는 VH 및 VL 사슬을 암호화하는 핵산은 pTT 벡터(원래 사슬과 접합성을 클로닝하기 위하여 조작됨) 내에 클론화되었다
명칭 중사슬 가변 영역 의 시퀀스 경사슬 가변 영역 의 시퀀스
F20-VH-GL1/
B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /B03-VL-GL1c SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1-V4-V9-V14
/B03-VL-GL1c		 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 68
F20-VH-GL1/
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1-V1-V9/
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /B08-VL-GL6c SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1-V4-V9 /
B08-VL-GL6c		 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 70
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /B08-VL-GL6c SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 70
실시예 2: 인간 MMP3 / MMP9 및 인간 MMP9 활성 분석에서 본 발명에 따른 일부 항-MMP9 항체의 효능 및 효험
본 발명에 따른 일부 항체에 의해 형광원 폴리머 기질 DQ-젤라틴으로 향한 MMP9 촉매 활성의 기능적 중화가 평가되었다.
MMP9(및 MMP2)의 특징적 활성은 젤라틴 감성(gelatin degradation)이다. 젤라틴은, 근본적으로 다양한 콜라겐으로부터 유래된 비가역적으로 변성된 형태이며, 이들의 서너 가지는 MMP9에 대한 중요한 생리학적 기질인 것으로 생각된다. 작은 펩티드 기질과 다르게, MMP9에 의한 젤라틴(콜라겐의 것과 유사함)의 결합 및 인식은 복잡하고, 피브로넥틴 및 PEX 도메인을 포함하는, 활성 사이트외 다른 분자의 영역을 통해 매개되는 것으로 알려져 있다. 이들 생리학적으로 관련된 엑소사이트 상호작용을 유지하고 잠재적 비-전통적 알로스테릭 중화제 류의 분리를 용이하게 하기 위하여, 형광원적으로 소강된 용해성 젤라틴 폴리머(DQ-젤라틴)가, 플레이트-계 스크리닝 및 랭킹 목적을 위한 중요 기질로서 선택되었다. 기질 가수분해는 MMP9의 절단된 조각(즉, 프로-도메인 제거됨)에 의해 매개된다. 분석은 두 가지 모드로 수행되었다.
첫번째 모드, 명칭 "MMP9 분석"은, 프리-활성화된 MMP9(순수한 난할 결합에서 LETD 카스파제 8 인식 모티프를 포함하는 조작된 MMP9로부터의 것)를 이용하였으며, 여기서 상기 프로-도메인은 유도된 카스파제 8 난할을 통해 1차적으로 제거되었다. 두번째 모드, 명칭 "MMP3/MMP9 분석"은, 상기 분석 내의 추가적 연결된 공정으로서 프로-도메인의 제거(즉, 활성화 단계)를 통합하는 것으로 고안되었다. 이것은, 분석 칵테일 내 인간 MMP3(Calbiochem, 444217-5)의 촉매 도메인 및 완전한 길이(잠재적 형태) 프로 MMP9를, DQ-젤라틴 기질 (Lubio Science, D12054) 및 시험 항체와 결합하는 것에 의해 얻어졌다. MMP3은, MMP9의 생리학적으로 관련 활성화자로서 고려된 것으로, 2-단계 연속 메커니즘을 통해 프로-도메인을 제거하는 것으로 보여지며(Ogata et al, 1992, J. Biol . Chem. 267(6): 3581-4), 질병 조직 내 MMP9와 종종 공동 발현된다. 중요하게, 활성화된 MMP3 자체는 DQ-젤라틴 기질을 크게 분열하는 것으로 나타나지 않는다. 그러므로, 이 분석에서 DQ-젤라틴 가수분해는 MMP3-매개 MMP9 활성화 및 본질적인 MMP9 촉매 활성에 종속되며, 이는 다른 과정에 간섭하는 중성화제를 특성화하는 잠재력을 제공한다.
그러므로, "MMP3/MMP9 분석" 은 프로 MMP9 활성화 및 이들의 하류 촉매 활성을 중화하는 항-MMP9 항체의 능력을 결정하는데 사용되었다. 간단하게는, 분취량의 재조합 인간 프로 MMP9는 한 시간 동안 다양한 희석액의 시험 항체를 가지고 사전 배양되었다. 인간 MMP3의 재조합 촉매적 도메인을, MMP9-특이적 형광성 기질 DQ-젤라틴와 함께 첨가하는 것으로 소화가 시작되었다. 방출된 형광 신호(485nm의 여기, 520nm의 방출)는 젤라틴 기질의 소화에, 이에 따라 성숙한 MMP9 효소의 촉매 활성에 비례한다. 형광 신호는 항체 농도에 대하여 플롯되었고, 반-최대 저해성 효능(IC50 값)은 비선형 회귀 곡선으로부터 추론되었다.
"MMP9 분석"은, 성숙한 MMP9의 촉매 활성을 직접적으로 중화시키는 항-MMP9 항체의 능력을 결정하는데 사용되었다. 간단하게, 분석은 MMP3/MM9 분석과 유사하나 프로MMP9 대신에 촉매적으로 활성 카스파제-분열된 재조합 MMP9를 사용하며, 따라서, 인간 MMP3의 재조합 촉매적 도메인의 추가가 필요하지 않다.
여기 시험된 본 발명에 따른 모든 항체는 두 가지 효소적 분석에서 DQ-젤라틴의 소화를 효과적으로 감소시킬 수 있었다. 이 결과는, 본 발명에 따른 모든 항체는 촉매적으로 활성 효소에 대한 프로MMP9의 활성화를 차단시키거나 및/또는 MMP9의 촉매 활성을 차단한다는 것을 나타낸다(표 4, 도 6)
인간 프로MMP9의 가공 및/또는 젤라틴 상의 이의 하류 촉매 활성을 중화시키는 항-MMP9 항체의 효능 및 효험
항체 내에 포함된 중/경 가변 영역 인간 MMP9
(i.e. 활성화된 MMP9) 		인간 프로MMP9
IC 50 (nM) 효험 IC 50 (nM) 효험
F20-VH-GL1/B03-VL-GL1c 1.92 100% 9.05 100%
F20-VH-GL1-V1-V9-V14/B03-VL-GL1c 3.16 100% 15.24 100%
F20-VH-GL1-V4-V9-V14/B03-VL-GL1c 1.30 100% 5.48 100%
F20-VH-GL1 /B08-VL-GL6c 3.92 100% 43.99 100%
F20-VH-GL1-V1-V9 /B08-VL-GL6c 2.64 100% 23.74 100%
F20-VH-GL1-V1-V9-V14/B08-VL-GL6c 3.86 100% 38.07 100%
F20-VH-GL1-V4-V9 /B08-VL-GL6c 0.97 100% 9.52 100%
F20-VH-GL1-V4-V9-V14/B08-VL-GL6c 2.92 100% 20.44 100%
본 발명에 따른 항체 F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c은, 높게 정제된 활성화된 MMP9를 가지고 한 MMP9 분석을 사용하여, 비교 항체 1 (AB0041로 알려진 항체, SEQ ID NO: 44의 중사슬의 아미노산 시퀀스 및 SEQ ID NO: 45의 경사슬의 아미노산 시퀀스를 갖음)와 비교되었다. 본 발명에 따른 항체 F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c만이 2.6 nM의 IC50으로 DQ-젤라틴의 소화를 효과적으로 감소시킨 반면에, 비교 항체 1은 불활성이었다. 이 결과는 본 발명에 따른 항체 F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c는 MMP9 효소적 활성의 저해제이나 비교항체 1은 아니라는 것을 나타낸다.
MMP3/MMP9 분석에서, 본 발명에 따른 항체 F20-VH-GL1-V4-V9 /B08-VL-GL6c 및 비교 항체 1은 각각 9.52 nM 및 0.20 nM의 IC50으로 DQ-젤라틴의 소화를 효과적으로 감소시켰다. 이 결과들을 함께 취하면, 이 둘 효소적 분석 결과는, 비교 항체 1는 MMP9 활성화의 저해제인 반면에 항체 F20-VH-GL1-V4-V9 /B08-VL-GL6c는 MMP9 촉매 활성의 저해제 및 아마도 MMP9 활성화의 저해제라는 것을 나타낸다.
실시예 3: MMP3 / MMP9 분석에서 본 발명에 따른 일부 항- MMP9 항체의 종-특이성
항-MMP9 항체의 효소적 저해 활성의 종-특이성은 실시예 2에 설명된 "MMP3/MMP9 분석"을 사용하여 평가되었다. 사용된 효소는 Cynomologus 몽키 (시아노), 랫트, 또는 마우스 proMMP9이었다.
시험되었던, 본 발명에 따른 일부 항체는, Cynomologus 몽키 (시아노), 랫트, 및 마우스 프로MMP9 (표 5, 6, 및 7 각각)의 활성화 및/또는 하류 촉매 활성을 효과적으로 차단할 수 있었다.
MMP3/MMP9 젤라틴 분석에서 cynomolgus 몽키 proMMP9를 중화하는 항-MMP9 항체의 효능 및 효험
항체 내 포함된 중/경 가변 영역 시아노 프로MMP9
IC 50 (nM) 효험
F20-VH-GL1 /
B03-VL-GL1c		 3.85 100%
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 / B03-VL-GL1c 12.49 100%
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
B03-VL-GL1c		 3.75 100%
F20-VH-GL1 /
B08-VL-GL6c		 29.89 100%
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B08-VL-GL6c 		15.79 100%
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /
B08-VL-GL6c		 27.57 100%
F20-VH-GL1-V4-V9 /
B08-VL-GL6c		 5.86 100%
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
B08-VL-GL6c		 10.80 100%
MMP3/MMP9 젤라틴 분석에서 랫트 프로 MMP9를 중화하는 항-MMP9 항체의 효능 및 효험.
항체 내에 포함된 중/경 가변 영역 랫트 proMMP9
IC 50 (nM) 효험
F20-VH-GL1 /
B03-VL-GL1c		 4.99 100%
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /
B03-VL-GL1c		 8.82 100%
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
B03-VL-GL1c		 2.83 100%
F20-VH-GL1 /
B08-VL-GL6c		 17.41 100%
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B08-VL-GL6c 		7.77 100%
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /
B08-VL-GL6c		 12.28 100%
F20-VH-GL1-V4-V9 /
B08-VL-GL6c		 3.16 100%
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
B08-VL-GL6c		 6.19 100%
MMP3/MMP9 및 MMP9 젤라틴 분석 각각에서 마우스 프로MMP9 또는 활성 MMP9를 중화하는 항-MMP9 항체의 효능 및 효험
항체 내에 포함된 중/경 가변 영역 마우스 MMP9 마우스 proMMP9
IC 50 (nM) 효험 IC 50 (nM) 효험
F20-VH-GL1 /
B03-VL-GL1c		 333 100% 38.77 25%
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /
B03-VL-GL1c		 >500 ND > 500 ND
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
B03-VL-GL1c		 164 100% 462 100%
F20-VH-GL1 /
B08-VL-GL6c		 0.86 100% 7.91 100%
F20-VH-GL1-V1-V9 /
B08-VL-GL6c		 1.20 100% 7.69 100%
F20-VH-GL1-V1-V9-V14 /
B08-VL-GL6c		 1.91 100% 11.11 100%
F20-VH-GL1-V4-V9 /
B08-VL-GL6c		 1.27 100% 7.80 100%
F20-VH-GL1-V4-V9-V14 /
B08-VL-GL6c		 2.37 100% 12.67 100%
ND: 결정되지 않음
실시예 4: 인간 MMP 촉매 활성 분석에서 본 발명에 따른 일부 항- MMP9 항체의 MMP 선택성
항-MMP9 항체의 선택성은, MMP 저해제 프로파일링 키트(Enzo, BML-AK308)을 사용하여, 형광원 펩티드 기질, OmniMMP™ RED (Enzo, BML-P277-9090)의 MMP 매개 분열을 평가하는 분석으로 평가되었다. 간단하게, 분취량의 다양한 인간 MMPs (MMP1, MMP2, MMP3, MMP8, MMP9, MMP12, MMP13, MMP14 및 MMP19)의 재조합 촉매적 도메인은, 한 시간 동안 시험 항체의 고정 농도(100nM)으로 사전 배양되었다. MMP저해제 NNGH (Enzo, BML-PI115-9090) 및 항-MMP2/9 (539A-M0237-D02, 비교 항체 3, SEQ ID NO: 64의 중사슬 및 SEQ ID NO: 65의 경사슬의 아미노산 시퀀스를 갖음), 항-MMP9 (539A-M0240-B03, 비교 항체 2, SEQ ID NO: 46의 중사슬 및 SEQ ID NO: 47의 경사슬의 아미노산 시퀀스를 갖음) 및 동종 대조군 (항-HEL IgG1) 항체가 양성 및 음성 대조군으로서 시험에 포함되었다. 형광원 펩티드 기질을 첨가하고, 형광이 측정되었다. 방출된 형광 신호는, 펩티드 기질의 소화, 이에 따라 MMP 촉매적 도메인의 활성에 비례한다. 저해제 부존재에서 형광 신호는 100% 활성으로 정상화되었다. 각 저해제의 존재시 얻어진 신호는 이 값에 대하여 상대적으로 주어지고 남아있는 활성의 퍼센트를 의미한다.
시험되었던 본 발명에 따른 모든 항체는, 인간 MMP9의 촉매 활성을 효율적으로 차단할 수 있었으나, 시험된 8개 다른 인간 MMP의 촉매 활성에 대하여 큰 효과가 없었다(도 7). 본 발명에 따른 모든 항체는, 인간 MMP7, MMP10, MMP16 및 MMP17 의 촉매 활성에 대하여 큰 효과가 없었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 5: 호중구-분비된 자연 형태의 인간 MMP9를 사용하여 활성 분석에서 본 발명에 따른 항- MMP9 항체의 효능
몇가지 자연 형태의 인간 MMP9는 이하 설명되어 있고(단량체 MMP9, 이합체 MMP9, 및 호중구 젤라티나아제 B-관련된 리포칼린 NGAL에 결합된 MMP9 (또한 소위 리포칼린-2)형태), 후자 형태는 또한 NGAL/MMP9라 하며(Rudd et al., 1999, Biochemistry, 38, 13937-13950)), 질병 상태와 관련되어 있는 것으로 나타났다.
본 발명의 항-MMP9 항체의 추가적 특성화는, 호중구-유래 자연 형태의 MMP9의 중화를 포함한다. 이 목적을 위하여, 본 발명에 따른 항체에 의해 형광원 기질 OmniMMPTM RED (ENZO으로부터)을 향한 호중구-유래 MMP9 촉매 활성의 기능적 중화가 평가되었다.
본 발명의 F20-VH/B08-VLc 항-MMP9 항체 변이체(F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c)로 기능적 중화 분석을 하기 전에, 호중구-유래 MMP9 제조에서 프로MMP9 부분의 활성화가 APMA(p-아미노페닐 머큐릭 아세테이트)으로 사전 처리하여 수행되었고, 이로 인하여 MMP9 촉매적 사이트에 접근가능하게 되었다. 간단하게, 분취량의 다양한 APMA-활성화된 호중구-유래 인간 형태의 프로MMP(단량체, 이합체 및 NGAL/MMP9)는 한시간 동안 시험 항체로 배양되었다. 동종 대조군(항-HEL IgG4) 항체가 시험 내에, 음성 대조군으로서 포함되었다. 형광원 펩티드 기질을 이후 첨가하고 형광을 측정하였다. 방출된 형광 신호(540nm에서 여기, 590nm에서 방출)가 펩티드 기질의 소화, 이에 따라 MMP 촉매적 도메인의 활성에 비례한다.
도 8에 도시된 것처럼, 본 발명의 F20-VH/B08-VLc 항체 변이체(F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c)는 다중 생물학적 형태의 인간 MMP9의 활성을 중화한다: 100% 효능을 갖는 단량체 MMP9, 이합체 MMP9 및 NGAL/MMP9.
본 발명의 항체는 실시예 2에 설명된 "MMP3/MMP9 분석"을 사용하여 비교 항체 1에 비교되었다. 본 발명의 F20-VH/B08-VLc 항체 변이체(F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c)는, 단량체 또는 이합체 형태 또는 NGAL에 결합된 형태 어느 것이든 100% 효험으로 인간 호중구-유래 MMP9의 효소적 활성을 저해하는 반면, 비교항체 1는 단지 호중구-유래 MMP9의 모든 형태에 대해 부분적 저해(25% 효험)을 나타낸다(도 9). 본 발명의 항체 변이체 F20-VH/B08-VLc (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c)에 의한 MMP9의 모든 자연 활성 형태의 완전한 중화는, 높은 혈청 준위의 단량체, 이합체 MMP9 및/또는 NGAL/MMP9 복합체를 갖는 환자 내에서 우수한 효험으로 번역되어야만 한다.
실시예 6: 본 발명에 따른 항- MMP9 항체의 프로- 및 활성화된 형태의 인간 MMP9의 결합 동역학 및 친화도
재조합 인간 MMP9 항원을 향한 항-MMP9 항체의 결합은, 표준 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석을 사용하여 특징화되었다. 첫번째 단계에서, 항-MMP9 항체는 BIA코어 센서 칩 위에 고정된 항-인간 Fc 항체에 의해 포획되었다. 두번째 단계에서, 프로-MMP9 또는 MMP3-활성화된 MMP9는 4.7 내지 150nM의 2배 희석액으로 적정되었다. 센소그램은, F20-VH/B08-VLc 변이체 (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) 및 비교 항체 1 모두는 웰을 MMP3-활성화된 MMP9에 결합시킨다는 것을 밝혔다(도 10). 비교 항체 1은 또한 웰을 프로-MMP9에 결합시키나, 최소 신호가 F20-VH/B08-VLc 변이체 (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) 항체에서 관찰되었다(도 10). 도 8은, 재조합 인간 프로-MMP9 및 MMP3-활성화된 MMP9를 향한 본 발명에 따른 F20-VH/B08-VLc 항체 변이체(F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) 및 비교 항체 1의 결합 친화도(KD)를 보고한다. 150nM 항체에서 1% 미만의 결합이 관찰되었기 때문에, 프로-MMP9에 대한 F20-VH/B08-VLc 항체 변이체 (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) 항체의 KD는 15μM보다 큰 것으로 추산되었다.
항체 항원 K D (nM)
F20-VH/
B08-VLc		 프로-MMP9 >15,000
MMP9 11.7
비교 항체-1 프로-MMP9 0.9
MMP9 5.0
Kd-평형 해리 상수, 모두 곡선으로부터 계산됨
실시예 7: 본 발명에 따른 항- MMP9 항체의 에피토프 매핑
본 발명의 항-MMP9 항체의 추가 특성화는 인간 MMP9의 영역의 확인을 포함하며, 이는 항체 결합을 위해 중요하며 이로 인하여 에피토프를 정의한다. 이 특성화는, F20/B08 및 F20/B03 항체, 즉 F20-VH-GL1-V1-V9-V14 / B03-VL-GL1c 및 F20-VH-GL1-V4-V9 / B08-VL-GL6c 각각의 하나의 구성원에서 수행되었다.
본 발명의 항-MMP9 항체에 대해 특이적 결합이 가능한 MMP9 에피도프를 결정하는데 사용된 기술은 화학적 가교 및 질량 분석법을 적용한다 (Peter and Tomer , 2001, Anal. Chem ., 73, 4012-4019; Pimenova et al, 2008, J. Mass Spectrom . JMS , 43, 185-195; Herzog et al., 2012, Science 337, 1348-1352). 일차적으로, 본 발명의 항체 및 프로-MMP9를 용액으로 혼합하고, 특별히 고안된 중수화된 가교제를 사용하여 화학적 가교화하였다. 이후, MMP9 및 공유적으로 결합된 MMP9-항체 복합체를 3개 다른 단백질 가수분해 효소를 사용하여 단백질 가수분해하여, MMP9의 전체 시퀀스를 포함하는 커다란 수의 오버랩핑 펩티드를 생성하였다. MMP9 단독 및 가교된 MMP9-항체 복합체의 펩티드는 고해상도의 질량 분광법(nLC-Orbitrap MS)에 의해 분석되었고 비교되어 면역-복합체의 상호작용하는 펩티드를 결정하였다.
이 분석은, 인간 MMP9(SEQ ID NO1) 및 본 발명의 항체 사이의 상호작용 계면은 다음 MMP9 아미노산 시퀀스를 포함하는 3개의 비연속적 MMP9 에피토프 내에 위치된다는 것을 보여줬다:
SEQ ID NO: 41: 150AVTPLTFTRVYSRDADIVIQF170 (인간 MMP9의 아미노산 위치 150 내지 170에 대응) (여기서 영역 1이라 함),
SEQ ID NO: 42: 198IQGDAHFDDDELWSLGKGVVVPTRFG223 (인간 MMP9의 아미노산 위치 198 내지 223에 대응) (여기서 영역 2라 함), 및
SEQ ID NO: 43: 419MYPMYRFTEGPPLHKDDVNGIR440 (인간 MMP9의 아미노산 위치 419 내지 440에 대응) (여기서 영역 3이라 함).
인간 MMP9이 다양한 재조합 돌연변이가, MMP9에 대한 비교항체 1의 결합에 중요한 아미노산을 결정하는데 사용된다(마우스 모노클론 AB0041, WO 2013/130078). 분석은, 잔기 E111, D113, R162 및 I198이 인간 MMP9에 대한 비교 항체 1의 결합에 중요한 것을 확인하였다. 이들 아미노산들 중 둘, R162 및 I198은, 본 발명의 항-MMP9 항체에 의해 인식된 에피도프 영역(영역 1 및 영역 2)들 내에 존재한다. 그러나, 영역 3은, 본 발명의 항-MMP9 항체에 특이적으로 중요한 새로운 에피토프 영역을 규정한다. 영역 3은, MMP9의 촉매적 도메인 내에 있다. 비교 항체 1과 달리, 본 발명의 항-MMP9 항체가 완전히 성숙한 MMP9의 효소적 활성을 저해하는 반면에, 비교 항체 1은 완전히 성숙한 MMP9에 결합할 수 있기 때문에, 영역 3에 대한 결합이, 본 발명의 항-MMP9 항체에 대해 완전히 성숙한 MMP9의 효소적 활성을 중화시키는 능력을 부여할 수 있게 한다.
게다가, 마우스 모노클론 항체 REGA-3G12 (Martens et al., supra)는 결합 및 경쟁 분석을 사용하여 인간 MMP9의 펩티드 G171 내지 L187에 결합하는 것으로 나타났다. REGA-3G12 항체에 의해 결합된 MMP9 (G171-L187)의 영역은 본 발명의 항-MMP9 항체에 의해 인식된 3 MMP9 영역 밖에 있다.
실시예 8: 프로- 및 활성화된 형태의 인간 MMP9에 대한 항- MMP9 항체의 직접적 결합 및 경쟁적 결합
인간 프로-MMP9 및 MMP3-활성화된 인간 MMP9 각각을 향한 항-MMP9 항체의 직접적 결합 능력은 표준 ELISA 프로토콜을 사용하여 평가되었다. 간단하게, 96-웰 플레이트는 실온에서 16h 동안 어느 형태의 MMP9(2.5㎍/ml)으로 코팅되었다. 다음 2시간 블록킹 완충제(PBS/Tween 중 2% 염소 혈청)으로 배양하고 워시 완중제(PBS/Tween 0.05% v/v)로 4번 세척, 다양한 농도의 바이오틴화된 항-MMP9 항체(비교 항체 1 또는 F20-VH/B08-VLc 변이체 (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c)가 두 번 추가되었고, 1h 동안 배양되었다. 웰은 이후 네 번 세척되었고 결합된 바이오틴화된 항체는 HRP-결합된 스트렙타비딘 및 TMB 기질을 사용하여 밝혀졌다. 흡광도는 각 각 2 번마다 450nm 및 620nm에서 읽었으며 데이터는 정정된 흡광도(A450-A620)로서 표현되었다. 도 11에 나타난 결과들은, 비교항체 1 및 F20-VH/B08-VLc 변이체 (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) 항-MMP9 항체 모두가, 복용-종속 방법으로 MMP3-활성화된 MMP9 (도 11B)에 강하게 결합한다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 비교 항체 1은 복용-종속 방법으로 웰을 프로-MMP9에 결합시키는 반면에(도 11A), F20-VH/B08-VLc 변이체 (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) 항-MMP9 항체만이 시험된 높은 농도에서 프로-MMP9에 대해 강한 결합을 나타낸다(도 11A).
F20-VH/B08-VLc 변이체 (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) 항체가 MMP9에 대한 결합에 대하여 비교 항체 1과 경쟁할 것인지 여부를 시험하기 위하여, 동일한 ELISA 분석이 MMP3-활성화된 MMP9의 코팅을 가지고 사용되었으나 정제된 항체 F20-VH/B08-VLc 변이체 또는 비교 항체 1가 바이오틴화된 항-MMP9 항체의 첨가 전에 2시간 동안 추가되었다. 세척 완충제로 4번 세척한 후, 기정해진 최적 용량의 바이오틴화된 비교 항체 1 또는 F20-VH/B08-VLc가 첨가되고 1h 동안 배양되었다. 도 11 패널 C에 보여진 결과들은, F20-VH/B08-VLc 변이체 (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) 항-MMP9 항체의 첨가가 비교 항체 1가 MMP9에 결합하는 것을 방해하지 않는 반면에, 동일한 농도의 정제된 비교 항체 1은 MMP9에 대한 바이오틴화된 비교 항체 1의 결합을 더 완전히 방해한다는 것을 나타낸다.
이들 결과들 모두 함께, 이들 결합 실험들은, 비교 항체 1과 달리, F20-VH/B08-VLc 변이체 (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) 항-MMP9 항체가 우선적으로 프로MMP9 대한 MMP9의 활성 형태에 결합하며, 이는 MMP9에 대한 결합에서 비교 항체 1와 경쟁하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 9: 암 세포 침입 분석에서 본 발명에 따른 항- MMP9 항체의 효과
암 세포 주 침입은, Matrigel-코팅된 트랜스웰을 사용하여 평가되었다. 트랜스웰의 삽입 막(Cultrex - 3455-024의 키트 내에 제공됨)이 기저막 추출물(BME x0.5; Cultrex's kit 내에 제공됨)로 코팅되고, 37℃에서 24h 시간 동안 배양하였다. 한편, MGC803 (인간 위암 세포주 - Easy-Bio, China)는 혈청이 박탈된 RPMI 배양 배지(굶김 배지)(Gibco - 52400025) 내에서 굶겼다. 세포는 이후 회수되었고 굶김 배지 내에서 0.5 x 106 세포s/ml으로 재현탁되었고, 상기 굶기 배지는 100 ng/ml PMA (Phorbol 12-미리스테이트 13-아세테이트, Sigma 사 - P8139) 및 25μM MMP 저해제 (GM-6001 from Millipore - CC1000), 10 ㎍/ml 항-MMP9 항체 (F20-VH/B08-VLc 변이체 F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c), 10 ㎍/ml 항-IgG4 항체 (동종 대조군) 또는 없는(배지) 것을 포함한다. 100 μl의 처리된 세포는 Matrigel-코팅된 트랜스웰에 파종되었고, 10% FCS 을 포함하는 500 μl의 RPMI 배지는, 트랜스웰의 하부측 내에 첨가되었다. 플레이트는 37℃에서 16 h 동안 배양되었다. 침입 세포는, Calcein-AM으로 트랜스 웰 막의 바닥부의 배양에 의해 정량화되었고, 형광성 Calcein 내로 이들이 분열되는 것은 세포 수와 비례한다. 방출된 형광성 신호(485nm에서의 여기, 520nm에서 방출)는 Matrigel을 통해 세포 침입의 효율을 반영한다.
상기 결과는 항-MMP-9 항체 F20-VH/B08-VLc 변이체 (F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c)가, MMP 저해제 GM-6001에 비교될 때 유사한 효험으로 Matrigel을 통한 MGC803 암 세포의 이동을 저해한다는 것을 나타낸다(도 12). 전이성 세포가, 기저막을 포함하는 주변 조직을 침입하는 것에 의해 이들의 기원 사이트로부터 벗어나기 때문에, 이 결과들은 본 발명의 항-MMP9가 전이성 암에 대한 효과적인 항-이동성 및 항-침입성 약물일 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 대장염의 마우스 모델 내의 본 발명에 따른 항- MMP9 항체의 활성
염증성 장 질환(IBD)의 덱스트란 소듐 설페이트(DSS)-유도 대장염 마우스 모델은 임상적 연구에서 광범위하게 사용된 모델이다. 궤양성 대장염, 예를 들어 스테로이드, 메트로니다졸, 5'-아미노칼리실레이트, 시클로스포린, 및 항-TNFα 면역 치료법에 대한 치료를 위해 승인된 약물들은, DSS 모델에서 질병 심각도를 줄이는데 있어서 효험을 나타내며, 이 모델은 마우스 데이터를 인간 질병으로 번역하기 위한 관련 모델이라는 것을 나타낸다( Perse et al., 2012, J. Biomed . Biotechnol., 2012:718617). 마우스 대장염은, 음용수에 DSS를 첨가하여 결장 점막에 손상을 일으키는 것으로 유도된다. 급성 상의 DSS 대장염의 임상적 특성은 체중 감소 및 설사를 포함할 수 있다. 급성 DSS-대장염의 전형적인 조직학적 변화는 인간 IBD 내에서 관찰된 것과 유사하며, 뮤신 결핍, 상피 악화, 및 상피 세포의 소멸을 유도하는 괴사를 포함한다. 후자의 것은 점막고유층(lamina propria) 및 점막하조직샘(submucosa), 음와염(cryptitis), 움 고름집(crypt abscesse) 및 결장 점막 및 점막하조직샘의 염증 내의 호중구 침입이 수반된다.
본 발명에 따른 항-MMP9 항체의 치료적 효험은 BALB/c 마우스 내 DSS-유도 대장염 모델로 평가되었다. 대장염은 음용수에 포함된 4%(w/v) DSS로 5일 동안 유도되었다. 30 mg/kg F20-VH/B08-VLc (변이체 F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c) 또는 동종 대조군 (IgG4) 항체의 용량은, 6, 9 및 12일에 10 마우스의 집단에 복강 내로 주입되었고, 동물은 14일에 희생시켰다.
질병 과정은 6, 10 및 14일에 하부결장의 비디오 위내시경에 의해 블라인드 형태로 평가되었다. 대장염은 다음과 같이 관련된 조직 및 결장 길이로 존재하는 궤양, 혈관신생 및 입도의 정도를 기초로 0-14 스케일로 가시적으로 점수를 주었다: 궤양(0, 1, 2 또는 3), 혈관신생의 마스킹(0, 1, 2 또는 3), 입도(0, 1, 2 또는 3), 홍반(0, 1, 2 또는 3), 길이 연관(0, 1: 국소화된, 2: 분산된). 각 마우스는 시험된 결장 전체 길이에 걸쳐 관찰된 손상에 대응하여 단일의 내시경 스코어가 할당되었다. 항체 처리 전에, 6일에서 내시경 스코어 <5를 갖는 동물은, 충분한 질병 심각도를 갖는 것으로 생각되지 않으며, 추가 분석에서 배제하였다. 도 13에서 도시된 것처럼, 6일에, 2 집단 모두 유사한 평균 내시경 스코어를 가진 반면에, 연구 종결일 14일에 F20-VH/B08-VLc-처리된 동물은 동종 대조군 항체-처리된 집단에 비하여 평균 내시경 스코어가 크게 개선된 것(p=0.005)을 나타내었다.
연구 종결시(14일), 원부위 결장은 각 마우스로부터 절제되었으며, 포말린 고정 및 파라핀 내에 포함되고 조직학을 위해 절단되었다. 모든 절단부분은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었고, 처치 집단에 대한 것으로 블라인드로 시험되었다. 조직들은 각 파라미터에 대하여 1-4의 스코어 스케일에 따라 상피 손상 및 염증성 세포의 침입에 대하여 점수를 부여하였다. 조직 스코어는 상피 손상 및 염증성 세포의 침입 스코어의 총 합을 나타내므로, 0 내지 8이다. 결과들은 도 14에 나타낸다.
DSS-처리된 마우스는, 상피 과다형성 및 고블릿 세포 결실, 점막 및 하부점막 내로의 염증성 세포의 침입에 의해 특징화된 대장염을 발전시켰다. 움 고름집 및 점막 미란(mucosal erosion) 및 궤양화는 또한 일부 결장 횡단면에서 관찰되었다. 도 13에서 보여진 것처럼, 조직학적 스코어의 분석은 항-MMP9 항체로 처리한 것은 동종 항체 처리된-대조군 집단에 비하여, F20-VH/B08-VLc내 에서의 평균 대장염 심각도 스코어가 감소된 것과 관련이 있다는 것을 나타냈다. 유사하게, 염증성 세포 및 상피 손상의 침입에 대한 평균 스코어는 또한 동종 항체-처리된 대조군 집단에 비교될 때 항-MMP9 항체 처리에 의해 또한 감소되었다.
실시예 11: 창자의 섬유증의 다른 자리의 이식 마우스 모델 내에서 본 발명에 따른 항-MMP9 항체의 활성
심각한 점막 조직 손상은 염증성 장 질환(IBD)의 주요 특징이다. 조직 손상은 주변 세포에 의한 수리 활성의 계기이다. 빠른 상처 닫힘은 창자 벽의 장벽 기능이 수리되는 동안의 시간을 줄이는데 중요하나, 과다한 조직 수리는 섬유증, 크론병(CD) 에서 공통적으로 발생하는 섬유증을 촉진한다. 섬유증은 10~40%의 환자 내에서 협착 형성(Cosnes et al., 2002, Inflamm . Bowel Dis ., 8(4): 244 -50; Freeman, 2003, J. Clin . Gastroenerol ., 37(3): 216 - 9)을 유도하며, 협착된 환자의 약 80% 내에서 수술의 표시(Cosnes et al., 2002, supra)이다.
마우스 내 창자 절제술의 다른 자리 이식은 창자 상피의 소멸을 유도하여, 창자 루멘의 섬유증 폐색으로 끝이 나며, 인간 창자의 섬유증의 조직적 및 분자 특징, 예를 들어 루멘 장벽 비후, 부풀린 콜라겐 퇴적, 및 섬유증 촉진 조절자의 발현을 재현한다.
공여자(녹색 형광성 단백질-마크된 C57BL/6-Tg UBC-GFP 마우스) 소창자 절제술은 수용체 C57BL/6 마우스의 목 내로 피하로 이식되었다. 마우스는 5, 8 및 10일에 본 발명의 30 mg/kg의 항-MMP9 항체 (F20-VH/B08-VLc, 변이체 F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c), 또는 동종 대조군 항체 (IgG4)를, 집단 당 5 마우스의 복강 내 주입하였다. 소창자 이식편은 이식 후 14일에 체외이식하였다. 체외이식 후, 각 이식편은 3개 동등 세그먼트로 나누어졌다. 중심 세그먼트는 4% 포말린으로 고정되고, 조직 병리학적 평가를 위해 준비되었다. 2개의 외부 세그먼트는 액체 질소 내에 스냅 냉동되고 RNA 또는 단백질 추출까지 -70℃에서 저장되었다.
조직적 횡단부는 콜라겐(레드 스테인)을 강조하기 위하여 시리우스 레드로 염색되었다. 콜라겐층 두께는 실험 타입에 대하여 블라인드된 독립 조사자에 의해 결정되었다. 현미경 평가는 Zeiss Axiophot 현미경의 AxioCam MRc5으로 수행되었다. 콜라겐 층의 두께는 AxioVision Release 4.7.2 소프트웨어 (Zeiss)으로 측정되었다. 두께는 100-배 확대로 대표 면적에서 9개 장소(각 시간 포인트에 대해 조사된 8개 샘플 내)로부터 계산되었다. 통계적 분석은 PRISM 6 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 쌍을 이루지 않은 t 시험은 집단들 비교를 위해 사용되었다.
대조군 동종과 비교된, F20-VH/B08-VLc으로 크게 처리한 항-MMP9는 도 15에 보여진 것처럼 다른 자리의 창자 이식편 내 상피구조의 손실에 대하여 보호하고 도 16에 보여진 것처럼 다른 자리의 창자 이식편 내 콜라겐층 두께를 크게 줄인다(p<0.0001). 이 결과는 본 발명의 항-MMP9 항체가 섬유증병 및 누공 크론병에 효과적이라는 것을 나타낸다.
실시예 12: 피하 HCT-116 인간 결장 종양 세포를 갖는 스위스 누드 마우스의 항-MMP9 항체의 효과
인간 결장 암 세포주 HCT-116 (1x107 세포)는 누드 마우스의 우측방으로 피하로 주입되고, 처리 시작전에 ?100 mm3로 성장하게 하였다. 본 발명의 항-MMP9 항체F20-VH/B08-VLc, 변이체 F20-VH-GL1-V4-V9/B08-VL-GL6c 또는 동종 대조군 항체 IgG4는 3주 동안 복강 내로 주입된다. 마우스는 처리의 첫번째에 50 mg/kg로 항체 로딩 복용량을 수용하고 30mg/kg를 주당 2번 복용한다. 마우스는 처리 시작 후 21일에 희생되고, 1차 종양 및 전이 기관이 분석을 위해 수집된다. 1차 종양의 무게 및 크기가 측정되며, 림프절, 간, 폐 및 배막(peritoneum) 내 시각적으로 전이 병소의 수가 계수된다.
시퀀스의 리스트
인간 MMP9의 아미노산 시퀀스 (NCBI 참조 시퀀스: NP_004985.2)
SEQ ID NO: 1
mslwqplvlv llvlgccfaa prqrqstlvl fpgdlrtnlt drqlaeeyly rygytrvaem
rgeskslgpa llllqkqlsl petgeldsat lkamrtprcg vpdlgrfqtf egdlkwhhhn
itywiqnyse dlpravidda farafalwsa vtpltftrvy srdadiviqf gvaehgdgyp
fdgkdgllah afppgpgiqg dahfdddelw slgkgvvvpt rfgnadgaac hfpfifegrs
ysacttdgrs dglpwcstta nydtddrfgf cpserlytqd gnadgkpcqf pfifqgqsys
acttdgrsdg yrwcattany drdklfgfcp tradstvmgg nsagelcvfp ftflgkeyst
ctsegrgdgr lwcattsnfd sdkkwgfcpd qgyslflvaa hefghalgld hssvpealmy
pmyrftegpp lhkddvngir hlygprpepe prppttttpq ptapptvcpt gpptvhpser
ptagptgpps agptgpptag pstattvpls pvddacnvni fdaiaeignq lylfkdgkyw
rfsegrgsrp qgpfliadkw palprkldsv feerlskklf ffsgrqvwvy tgasvlgprr
ldklglgadv aqvtgalrsg rgkmllfsgr rlwrfdvkaq mvdprsasev drmfpgvpld
thdvfqyrek ayfcqdrfyw rvssrselnq vdqvgyvtyd ilqcped
중사슬 F20- VH - CDR1의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 2: DYPMH
중사슬 F20- VH - CDR2의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 3: GISSNSGSVGYADSVKG
중사슬 F20- VH - CDR3의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 4: DKIYYGSGSYDFYYYYGMDV
중사슬 F20- VH - CDR2 -V1의 아미노산 시퀀스 　
SEQ ID NO: 5: GISSQSGSVGYADSVKG
중사슬 F20- VH - CDR2 -V4의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 6: GISSRSGSVGYADSVKG
중사슬 F20- VH - CDR2 -V9의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 7: GISSNSGSVGYAESVKG
중사슬 F20- VH - CDR2 -V1-V9의 아미노산 시퀀스 　
SEQ ID NO: 8: GISSQSGSVGYAESVKG
중사슬 F20- VH - CDR2 -V4-V9의 아미노산 시퀀스 　
SEQ ID NO: 9: GISSRSGSVGYAESVKG
중사슬 F20- VH - CDR3 -V14의 아미노산 시퀀스 　
SEQ ID NO: 10: DKIYYGSGSYDFYYYYGIDV
중사슬 F20- VH의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 11: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISSNSGSVGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
F20- VH -GL1의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 12: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISSNSGSVGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
중사슬 F20- VH -GL1-V1의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 13: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISS Q SGSVGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
중사슬 F20- VH -GL1-V4의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 14: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISS R SGSVGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
중사슬 F20- VH -GL1-V9의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 15: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISSNSGSVGYA E SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
중사슬 F20- VH -GL1-V14 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 16: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISSNSGSVGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYG I DVWGQGTTVTVSS
중사슬 F20- VH -GL1-V1-V9의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 17: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISS Q SGSVGYA E SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
중사슬 F20- VH -GL1-V1-V9-V14의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 18: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISS Q SGSVGYA E SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYG I DVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
중사슬 F20- VH -GL1-V4-V9의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 19: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISS R SGSVGYA E SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
중사슬 F20- VH -GL1-V4-V9-V14의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 20:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISS R SGSVGYA E SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYG I DVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
경사슬 B03- VL - CDR1의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 21: QGDSLRSYYAS
경사슬 B03- VL - CDR2의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 22: GKNNRPS
경사슬 B03- VL - CDR3 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 23: QSRDNIGNHRVVL
경사슬 B03- VL 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 24: SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVVVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTVSLTITGAQAEDEADYYCQSRDNIGNHRVVLFGGGTKVTVLG
경사슬 B03- VL - GL1 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 25: SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVVVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTVSLTITGAQAEDEADYYCQSRDNIGNHRVVLFGGGTKLTVLG
경사슬 B08- VL - CDR1 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 26: TGTSNDVGAYNRVS
경사슬 B08- VL - CDR2 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 27: GVSNRPS
경사슬 B08- VL - CDR3 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 28: TSYSSSTTSYVV
경사슬 B08- VL 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 29: QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSNDVGAYNRVSWYQQHPGKAPKLLIYGVSNRPSGVSTRFSGSKSGNTASLTISGLLAADEADFYCTSYSSSTTSYVVFGGGTKVTVLG
경사슬 B08- VL - GL6 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 30: QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSNDVGAYNRVSWYQQHPGKAPKLMIYGVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADFYCTSYSSSTTSYVVFGGGTKVTVLG
중사슬 F20- VH - CDR1의 핵산 시퀀스
SEQ ID NO: 31: gactaccccatgcac
중사슬 F20- VH - CDR2의 핵산 시퀀스
SEQ ID NO: 32: ggcatctcctccaactccggctccgtgggctacgccgactccgtgaagggc
중사슬 F20- VH - CDR3의 핵산 시퀀스
SEQ ID NO: 33: gacaagatctactacggctccggctcctacgacttctactactactacggcatggacgtg
경사슬 B03- VL - CDR1의 핵산 시퀀스
SEQ ID NO: 34: caaggcgattctctgcgctcatattatgcttct
경사슬 B03- VL - CDR2의 핵산 시퀀스
SEQ ID NO: 35: ggaaaaaacaaccgaccatct
경사슬 B03- VL - CDR3의 핵산 시퀀스
SEQ ID NO: 36: caatctcgagacaatatagggaaccatagagttgttctg
경사슬 B08- VL - CDR1의 핵산 시퀀스
SEQ ID NO: 37: acaggaacgtctaatgatgtgggggcttacaatcgcgtcagt
경사슬 B08- VL - CDR2의 핵산 시퀀스
SEQ ID NO: 38: ggcgtgtctaacaggcctagc
경사슬 B08- VL - CDR3의 핵산 시퀀스
SEQ ID NO: 39: acaagctacagtagcagtaccacatcatatgtcgtc
조작된 인간 IgG4 중사슬 불변 영역의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 40:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
MMP9 에피토프 내에 포함된 영역 1의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 41: AVTPLTFTRVYSRDADIVIQF
MMP9 에피토프 내에 포함된 영역 2의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 42: IQGDAHFDDDELWSLGKGVVVPTRFG
MMP9 에피토프 내에 포함된 영역 3의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 43: MYPMYRFTEGPPLHKDDVNGIR
비교 항체 1의 중사슬의 아미노산 시퀀스(AB0041로 알려짐)
SEQ ID NO: 44:
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGTTNYNSALMSRLSISKDDSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCARYYYGMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
비교 항체 1의 경사슬의 아미노산 시퀀스 (AB0041로 알려짐)
SEQ ID NO: 45:
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVRNTVAWYQQKTGQSPKLLIYSSSYRNTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQQHYITPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
비교 항체 2의 중사슬의 아미노산 시퀀스 (539A-M0240-B03로 알려짐)
SEQ ID NO: 46:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYQMVWVRQAPGKGLEWVSVIYPSGGPTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEDYYDSSGPGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
비교 항체 2의 경사슬의 아미노산 시퀀스 (539A-M0240-B03로 알려짐)
SEQ ID NO: 47:
QYELTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTLVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
중사슬 F20- VH -GL2의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 48:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFD DYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISSNSGSVGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
중사슬 F20- VH - CDR2 -V2의 아미노산 시퀀스 　
SEQ ID NO: 49: GISSHSGSVGYADSVKG
중사슬 F20- VH - CDR2 -V3의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 50: GISSKSGSVGYADSVKG
중사슬 F20- VH - CDR2 -V11　의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 51: GISSNSGSVGYADTVKG
중사슬 F20- VH - CDR3 -V13　의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 52: DKIYYGSGSYDFYYYYGLDV
중사슬 F20- VH -GL1- V2 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 53:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISS H SGSVGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
중사슬 F20-VH-GL1-V3 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 54:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISS K SGSVGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
중사슬 F20-VH-GL1-V11 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 55:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISSNSGSVGYAD T VKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
중사슬 F20-VH-GL1-V13 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 56:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYPMHWVRQAPGKGLEWVSGISSNSGSVGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDKIYYGSGSYDFYYYYG L DVWGQGTTVTVSS
경사슬 B03-VL-GL2 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 57:
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCQSRDNIGNHRVVLFGGGTKLTVL
경사슬 B08-VL-GL1 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 58:
QSALTQPRSVSGSPGQSITISCTGTSNDVGAYNRVSWYQQHPGKAPKLLIYGVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADFYCTSYSSSTTSYVVFGGGTKVTVL
경사슬 B08-VL-GL2 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 59:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSNDVGAYNRVSWYQQHPGKAPKLLIYGVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADFYCTSYSSSTTSYVVFGGGTKVTVL
경사슬 B08-VL-GL3 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 60:
QSALTQPRSVSGSPGQSITISCTGTSNDVGAYNRVSWYQQHPGKAPKLLIYGVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCTSYSSSTTSYVVFGGGTKVTVL
경사슬 B08-VL-GL4 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 61:
QSALTQPRSVSGSPGQSITISCTGTSNDVGAYNRVSWYQQHPGKAPKLMIYGVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADFYCTSYSSSTTSYVVFGGGTKVTVL
경사슬 B08-VL-GL5 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 62:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSNDVGAYNRVSWYQQHPGKAPKLLIYGVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCTSYSSSTTSYVVFGGGTKVTVL
경사슬 B08-VL-GL7 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 63:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSNDVGAYNRVSWYQQHPGKAPKLMIYGVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCTSYSSSTTSYVVFGGGTKVTVL
비교 항체 3의 중사슬의 아미노산 시퀀스(539A-M0237-D02로 알려짐)
SEQ ID NO: 64:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSQYPMWWVRQAPGKGLEWVSYIVPSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRAYGDYVGWNGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
비교 항체 3의 경사슬의 아미노산 시퀀스(539A-M0237-D02로 알려짐)
SEQ ID NO: 65:
DIQMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSFLAWYQQKPGQAPRLLIYDASYRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRGNWPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
조작된 인간 IgG4 경사슬 불변 영역의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 66:
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
경사슬 B03- VLc의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 67: SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVVVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTVSLTITGAQAEDEADYYCQSRDNIGNHRVVLFGGGTKVTVL
경사슬 B03-VL-GL1c 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 68: SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVVVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTVSLTITGAQAEDEADYYCQSRDNIGNHRVVLFGGGTKLTVL
경사슬 B08-VLc 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 69: QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSNDVGAYNRVSWYQQHPGKAPKLLIYGVSNRPSGVSTRFSGSKSGNTASLTISGLLAADEADFYCTSYSSSTTSYVVFGGGTKVTVL
경사슬 B08-VL-GL6c 의 아미노산 시퀀스
SEQ ID NO: 70: QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSNDVGAYNRVSWYQQHPGKAPKLMIYGVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADFYCTSYSSSTTSYVVFGGGTKVTVL
<110> CALYPSO BIOTECH SA MERCK PATENT GMBH <120> ANTIBODIES SPECIFIC FOR MMP9 <130> IP1305CH <150> EP 14180765 <151> 2014-08-13 <160> 70 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 707 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys 1 5 10 15 Cys Phe Ala Ala Pro Arg Gln Arg Gln Ser Thr Leu Val Leu Phe Pro 20 25 30 Gly Asp Leu Arg Thr Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Ala Glu Glu Tyr 35 40 45 Leu Tyr Arg Tyr Gly Tyr Thr Arg Val Ala Glu Met Arg Gly Glu Ser 50 55 60 Lys Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Leu Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu 65 70 75 80 Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr 85 90 95 Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly 100 105 110 Asp Leu Lys Trp His His His Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr 115 120 125 Ser Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val Ile Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala 130 135 140 Phe Ala Leu Trp Ser Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Arg Asp Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly 165 170 175 Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe 180 185 190 Pro Pro Gly Pro Gly Ile Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu 195 200 205 Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly Asn 210 215 220 Ala Asp Gly Ala Ala Cys His Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser 225 230 235 240 Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro Trp Cys 245 250 255 Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe Cys Pro 260 265 270 Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Gln Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys Pro Cys 275 280 285 Gln Phe Pro Phe Ile Phe Gln Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr 290 295 300 Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr 305 310 315 320 Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp Ser Thr 325 330 335 Val Met Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro Phe Thr 340 345 350 Phe Leu Gly Lys Glu Tyr Ser Thr Cys Thr Ser Glu Gly Arg Gly Asp 355 360 365 Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe Asp Ser Asp Lys Lys 370 375 380 Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala 385 390 395 400 His Glu Phe Gly His Ala Leu Gly Leu Asp His Ser Ser Val Pro Glu 405 410 415 Ala Leu Met Tyr Pro Met Tyr Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro Leu His 420 425 430 Lys Asp Asp Val Asn Gly Ile Arg His Leu Tyr Gly Pro Arg Pro Glu 435 440 445 Pro Glu Pro Arg Pro Pro Thr Thr Thr Thr Pro Gln Pro Thr Ala Pro 450 455 460 Pro Thr Val Cys Pro Thr Gly Pro Pro Thr Val His Pro Ser Glu Arg 465 470 475 480 Pro Thr Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro 485 490 495 Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser Pro Val 500 505 510 Asp Asp Ala Cys Asn Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly 515 520 525 Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu 530 535 540 Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp 545 550 555 560 Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Arg Leu Ser 565 570 575 Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly 580 585 590 Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala 595 600 605 Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met 610 615 620 Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln 625 630 635 640 Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly 645 650 655 Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr 660 665 670 Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu 675 680 685 Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys 690 695 700 Pro Glu Asp 705 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain F20-VH-CDR1 <400> 2 Asp Tyr Pro Met His 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain F20-VH-CDR2 <400> 3 Gly Ile Ser Ser Asn Ser Gly Ser Val Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain F20-VH-CDR3 <400> 4 Asp Lys Ile Tyr Tyr 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Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 63 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain B08-VL-GL7 <400> 63 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr 20 25 30 Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 64 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of comparative antibody 3 <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gln Tyr 20 25 30 Pro Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Val Pro Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Ala Tyr Gly Asp Tyr Val Gly Trp Asn Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 65 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain of comparative antibody 3 <400> 65 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Tyr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Asn Trp Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 66 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered human IgG4 light chain constant region <400> 66 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 67 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain B03-VLc <400> 67 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Val Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Arg Asp Asn Ile Gly Asn His 85 90 95 Arg Val Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 68 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain B03-VL-GL1c <400> 68 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Val Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Arg Asp Asn Ile Gly Asn His 85 90 95 Arg Val Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 69 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain B08-VLc <400> 69 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr 20 25 30 Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Thr Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Leu Ala Ala Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 70 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain B08-VL-GL6c <400> 70 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr 20 25 30 Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Thr Ser Tyr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110

Claims (25)

  1. MMP9 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각으로, 여기서 상기 항체 또는 이들의 조각은, SEQ ID NO: 41로 이루어진 영역 내의 적어도 하나의 아미노산, SEQ ID NO: 42 로 이루어진 영역 내의 적어도 하나의 아미노산, 및 SEQ ID NO: 43 로 이루어진 영역 내의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 에피도프와의 상호작용에 의해 MMP9에 결합하며, 여기서 상기 영역은 인간 MMP9의 촉매 도메인 내에 있는 MMP9 특이적 분리된 항체 또는 이들의 항원-결합 조각.
  2. 제1항에 있어서,
    다음을 포함하는 중사슬 가변 영역를 포함하는 분리된 항체 또는 이들의 조각:
    (i) SEQ ID NO: 2의 중사슬 CDR1 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
    (ii) SEQ ID NO: 3의 중사슬 CDR2 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
    (iii) SEQ ID NO: 4의 중사슬 CDR3 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 중사슬 가변 영역이 SEQ ID NO: 11, 또는 이들의 변이체로서 상기 중사슬 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3의 적어도 하나의 1, 2, 또는 3 아미노산, 및/또는 상기 중사슬 가변 프레임워크 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체를 포함하는, 분리된 항체 또는 이들의 조각.
  4. 제2항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 상기 중사슬 가변 영역이 다음으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 분리된 항체 또는 이들의 조각:
    (i) SEQ ID NO: 12의 아미노산 시퀀스
    (ii) SEQ ID NO: 13의 아미노산 시퀀스
    (iii)SEQ ID NO: 14의 아미노산 시퀀스
    (iv) SEQ ID NO: 15의 아미노산 시퀀스
    (v) SEQ ID NO: 16의 아미노산 시퀀스
    (vi)SEQ ID NO: 17의 아미노산 시퀀스
    (vii) SEQ ID NO: 18의 아미노산 시퀀스
    (viii)SEQ ID NO: 19의 아미노산 시퀀스
    (ix)SEQ ID NO: 20의 아미노산 시퀀스,
    (x) SEQ ID NO: 11의 아미노산 시퀀스.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    다음으로부터 선택된 경사슬 가변 영역를 포함하는 분리된 항체 또는 이들의 조각:
    a) 다음을 포함하는 경사슬 가변 영역:
    (i) SEQ ID NO: 21의 경사슬 CDR1 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
    (ii) SEQ ID NO: 22의 경사슬 CDR2 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
    (iii)SEQ ID NO: 23의 경사슬 CDR3 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체, 또는
    b) 다음을 포함하는 경사슬 가변 영역:
    (i) SEQ ID NO: 26의 경사슬 CDR1 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR1의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
    (ii)SEQ ID NO: 27의 경사슬 CDR2 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR2의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체;
    (iii)SEQ ID NO: 28의 경사슬 CDR3 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 경사슬 가변 영역이 다음으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 선택된 항체 또는 이들의 조각:
    (1) SEQ ID NO: 24, 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3의 1, 2, 또는 3 아미노산, 및/또는 경사슬 가변 프레임워크 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체, 및
    (2) SEQ ID NO: 29, 또는 이들의 변이체로서 상기 경사슬 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3의 적어도 하나의 1, 2, 또는 3 아미노산, 및/또는 상기 경사슬 가변 프레임워크 영역 의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 변이체.
  7. 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경사슬 가변 영역이 다음으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 분리된 항체 또는 이들의 조각:
    (i)SEQ ID NO: 67의 아미노산 시퀀스
    (ii)SEQ ID NO: 68의 아미노산 시퀀스
    (iii) SEQ ID NO: 69의 아미노산 시퀀스
    (iv)SEQ ID NO: 70의 아미노산 시퀀스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    MMP9의 촉매 활성을 저해하는 분리된 항체 또는 이들의 조각.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 잇어서,
    상기 분리된 항체가 인간 모노클론 항체인 분리된 항체 또는 이들의 조각.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 SEQ ID NO: 19의 중사슬 가변 영역 및 SEQ ID NO: 70의 경사슬 가변 영역를 포함하는 분리된 항체 또는 이들의 조각.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용되는 분리된 항체 또는 이들의 조각.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 항원 결합 조각을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서,
    다음을 하나 이상 포함하는 분리된 핵산:
    (1) SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, 및 SEQ ID NO: 33을 포함하는 핵산 시퀀스, 또는 이들의 변이체로서 상기 시퀀스 중 하나와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아이덴티티를 갖는 변이체, 및/또는
    (2) 다음으로부터 선택된 핵산 시퀀스:
    a) SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, 및 SEQ ID NO: 36을 포함하는 핵산 시퀀스, 또는 이들의 변이체로서 상기 시퀀스 중 하나와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아이덴티티를 갖는 변이체,
    b) SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39을 포함하는 핵산 시퀀스, 또는 이들의 변이체로서 상기 시퀀스 중 하나와 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 아이덴티티를 갖는 변이체.
  14. 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  15. 제14항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이들의 조각을 제조하는 방법으로서, 상기 항체 또는 이들의 조각의 발현을 촉진하기에 충분한 조건 하에서 상기 항체 또는 이들의 조각을 암호화하는 핵산 시퀀스를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이들의 조각을 제조하는 방법.
  17. 하나 이상의 (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 MMP9 특이적 항체 또는 이들의 결합 조각, (ii) 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 핵산, (iii) 제14항에 따른 벡터, 및/또는 (iv) 제15항에 따른 숙주 세포, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    MMP9-관련 질병의 예방 및/또는 치료에 사용되는 분리된 항체 또는 이들의 조각.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 MMP9-관련 질병이, 염증성 및 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 암 또는 종양, 섬유증병, 심혈관계 질환, 신경 질환, 눈병, 또는 MMP9-관련 질병 또는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리된 항체 또는 이들의 조각.
  20. 다음 단계를 포함하고, 생물학적 샘플 내의 MMP9 단백질의 존재 및/또는 농도를 검출하는 엑소비보(ex- vivo ) 방법:
    (i) 대상의 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 MMP9 단백질을, 항원-항체 상호작용을 통해, 상기 적어도 하나의 항체 또는 이들의 조각에 결합시키기에 충분한 조건 하에서, 상기 생물학적 샘플을, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나 항체 또는 항원-결합 조각과 반응시키는 단계; 및
    (iii) 상기 단계(ii)에서 형성된 항원-항체 복합체의 준위에 비례하는 신호를 검출하는 단계,
    여기서 상기 신호의 강도는 상기 샘물학적 샘플 내 MMP9 단백질의 농도와 관련이 있다.
  21. 제20항에 있어서,
    생물학적 샘플 내 활성 MMP9 단백질의 존재 및/또는 농도를 검출하기 위한 엑소비보 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    적어도 하나의 항체 또는 이들의 항원-결합 조각이 SEQ ID NO: 19의 중사슬 가변 영역 및 SEQ ID NO: 70의 경사슬 가변 영역를 포함하는 엑소비보 방법.
  23. 치료가 필요한 대상에서 MMP9-관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제17항에 따른 약제학적 조성물을 상기 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 MMP9-관련 질병이 염증성 및 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 암 또는 종양, 섬유증병, 심혈관계 질환, 신경 질환, 또는 눈병으로부터 선택되는 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    항체가 SEQ ID NO: 19의 중사슬 가변 영역 및 SEQ ID NO: 70의 경사슬 가변 영역를 포함하는 방법.
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