KR20170005793A - Ｉｌ-15 부분 및 중합체의 접합체 - Google Patents

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Abstract

IL-15 부분과, 하나 이상의 비펩티드 수용성 중합체의 접합체가 제공된다. 통상적으로 비펩티드 수용성 중합체는 폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체이다. 또한 특히 접합체를 포함하는 조성물, 접합체를 제조하는 방법, 및 조성물을 개체에 투여하는 방법이 제공된다.

Description

ＩＬ-15 부분 및 중합체의 접합체{CONJUGATES OF AN IL-15 MOIETY AND A POLYMER}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C.§119(e)에 따라서 2014년 4월 3일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 61/974,914의 우선권의 이익을 주장하며, 이의 개시 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.
기술분야
특히, 본 발명의 하나 이상의 구현예는 일반적으로 IL-15 부분(즉, 인간 IL-15의 활성과 유사한 활성을 적어도 일부 가지는 부분)과, 수용성 비펩티드 중합체를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 덧붙여, 본 발명은 (특히) 접합체를 포함하는 조성물, 이 접합체를 합성하기 위한 방법, 그리고 이 조성물을 투여하는 방법에 관한 것이다.
인터루킨-15(“IL-15”)는 Grabstein 외 다수에 의해 처음 보고된 다면 발현성 사이토카인이다[Grabstein et al. (1994) Science 264:965-968]. 162-아미노산 전구체로서 분비된 인간 IL-15는 29 개 아미노산 리더 서열과 19 개 아미노산 전서열을 함유하므로; 성숙한 단백질은 그 길이가 114 개 아미노산이다. 사이토카인의 4 개 α-나선체 다발군에 속하는 IL-15는 이형삼량체 수용체에 결합하는데, 여기서 독특한 α 서브유닛(IL-15Rα)은 IL-15에 수용체 특이성을 부여하고, 이 수용체의 β 및 γ 서브유닛은 기타 다른 사이토카인 수용체 1 개 이상과 공통점을 공유한다. Giri et al. (1995) EMBO J. 14:3654-3663.
사이토카인으로서 IL-15는 선천적 면역계와 적응 면역계 둘 다에 영향을 준다. DiSabitino et al. (2011) Cytokine Growth Factor Rev. 22:19-33. (일반적으로 숙주를 외래 침입 물질로부터 방어하는) 선천적 면역계에 대하여, IL-15는, 특히 자연 살해 세포(“NK 세포”) 및 자연 살해-T 세포(“NK-T 세포”)의 발달을 야기하고 이들 세포의 생존을 유지한다. 상기 IL-15의 선천적 면역계에서의 역할과 마찬가지로 NK 세포는 침입하는 병원체를 특이적으로 공격하지 않고; 상기 NK 세포는 오히려 면역 약화된 숙주 세포(예를 들어, 종양 세포 또는 바이러스 감염 세포)를 파괴한다. NK-T 세포는 면역 반응의 일반적인 활성화를 초래하는 면역 조절성 사이토카인, 특히 인터페론-γ를 생성한다.
(숙주가 특정 병원체와 처음 접촉하고 나서, 추후 이 숙주를 특이적 외래 침입 물질로부터 방어하는) 적응 면역계에 대하여, IL-15는 면역 조절성 사이토카인 생성 헬퍼 T 세포의 유지에 필요하다. 중요한 점은, IL-15는 또한 신속하게 증식하는 능력을 가지는,“항원 경험이 있는(antigen-experienced)”기억 T 세포의 장기간 유지를 지지함으로 말미암아, 숙주를 침입한 특정 외래 병원체에 다시 노출되었을 때 더 신속하고 더 강력한 면역 반응을 일으킨다는 점이다.
마지막으로 선천적 및 적응 면역계 안에서의 IL-15의 특이적인 역할들에도 불구하고, 상기 IL-15는 상기 면역계 카테고리 둘 다에 걸쳐 상당하면서도 광범위한 효과들을 나타낸다. 특히 IL-15는 상기 면역계 카테고리 둘 다에 연관된 다수의 세포류(수지상 세포, 호중구, 호산구, 비만 세포, CD4+ T 세포 및 B 세포를 포함함)의 세포자살(또는 세포 사멸)을 억제 또는 감소시킨다.
IL-15는 숙주에 대해 외래의 것(또는 “비자기인 것”)으로서 나타나는 세포들에 대항하여 싸울 수 있는 면역계에서 다수의 세포들의 증식 및 유지를 자극하므로, 상기 IL-15는 암을 앓고 있는 개체들의 치료에 사용될 것이 제안된 바 있다. Steel et al. (2012) Trends Pharmacol . Sci . 33(1):35-41. 예를 들어, IL-15 기반 작동제는 골수종을 치료하는 것으로 제안되었다. Wong et al. (2013) OncoImmunology 2(11), e26442:1-3. 덧붙여, IL-15 약물요법은 바이러스 감염이 발생한 개체들, 예를 들어 HIV 감염이 발생한 개체들을 치료하기 위한 것으로 제안된 바 있다.
다수의 질병이 발병한 개체들의 치료에 있어서 IL-15의 사용 가능성에도 불구하고, IL-15 기반 요법들은 다수의 난제들을 만나게 된다. 예를 들어, IL-15는 빨리 없어지고, 생리적 조건 하에서 비교적 불안정적이다. 임의의 접근법들은 이 IL-15와 IL-15 수용체 알파 서브유닛을 복합체화하여 이러한 한계들을 극복하기 위한 노력을 하고 있다. 그러나 이와 같은 접근법은 다수의 세포류들에서 발현되는 IL-15 수용체 알파를 통해서만 유일무이하게 발생하는, 바람직한 신호전달을 방해할 수 있다. 비교적 작은 분자량(5 kDa)의 숙신이미딜 카보네이트-말단화 중합체와의 비유리성 PEG화(non-releasable PEGylation)가 보고된 바 있지만, 이는 IL-15 생물 활성의 상당한 변경을 초래한다(Pettit et al. (1997) J. Biol . Chem . 272(4):2312-2318).
그러나 이러한 접합체들이 있음에도 불구하고, 개선된 특징과 프로필을 가지는 IL-15의 신규 접합체에 대한 필요성은 남아있다. 그러므로 특히, 본 발명의 하나 이상의 구현예는, 신규하면서 당업계에 전혀 제안되지 않은 것으로 여겨지는 이와 같은 접합체와, 이 접합체를 포함하는 조성물, 그리고 본원에 기술된 바와 같은 관련 방법들에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 하나 이상의 구현예에서, IL-15 부분의 잔기가 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 포함되어 있는 접합체가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서, IL-15 부분의 잔기가 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 포함되어 있는 접합체로서, 상기 IL-15 부분의 잔기가 유리가능한 결합을 통해 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 접합체가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서, IL-15 부분의 잔기가 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 포함되어 있는 접합체로서, 상기 IL-15 부분의 잔기가 비유리성 결합을 통해 수용성 중합체(바람직하게 상기 수용성 중합체는 중량 평균 분자량이 5,000 달톤을 초과함)에 공유적으로 부착되어 있는 접합체가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서, IL-15 부분의 잔기가 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 포함되어 있는 접합체로서, 상기 IL-15 부분이 이황화물 결합에 관여하지 않는 시스테인 잔기가 존재하지 않는 접합체가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서, IL-15 부분의 잔기가 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 포함되어 있는 접합체로서, 상기 IL-15 부분이 인간 IL-15와 비교되었을 때 부가 시스테인 잔기를 가지고, 상기 수용성 중합체가 부가 시스테인 잔기에 공유적으로 부착되어 있는 접합체가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서, IL-15 부분의 잔기가 분지형 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 포함되어 있는 접합체가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서, IL-15 부분의 잔기가 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 포함되어 있는 접합체로서, 상기 IL-15 부분의 아민이 아미드 결합 이외의 결합을 통해 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 접합체가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서, IL-15 부분의 잔기가 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 포함되어 있는 접합체로서, 상기 IL-15 부분의 아민이 아민 결합을 통해 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 접합체가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 본원에 기술된 바와 같은 접합체를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서, IL-15의 잔기와 수용성 중합체의 접합체로 구성된 조성물을 환자에 피하 투여하는 단계를 포함하는, 접합체를 전달하는 방법이 제공된다.
도 1은 IL-15와 20K PEG2-ru-NHS의 접합 반응 혼합물의 SDS-PAGE 겔이다.
도 2는 IL-15와 40K PEG2-ru-NHS의 접합 반응 혼합물의 SDS-PAGE 겔이다.
도 3은 정립된 B16F10 피하 종양에 IL-15(비접합형), 접합된 rIL-15 또는 비히클 대조군이 투여된 후의 마우스 체중 변화%를 나타내는 플롯이다.
본 발명의 하나 이상의 구현예를 상세히 기술하기 전에, 본 발명은 특정 중합체, 합성 기법, IL-15 부분 등으로 제한되지 않고, 이들은 다양화할 수 있음을 이해해야 한다.
본 명세서 및 의도된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형(“a”, “an” 및 “the”)은 문맥이 분명하게 다르게 지시하지 않는다면 복수의 지시대상물을 포함하는 것을 주의해야 한다. 따라서 예를 들어, “중합체”에 대한 언급은 단일의 중합체뿐만 아니라 둘 이상의 동일한 또는 상이한 중합체를 포함하고, “선택적인 부형제”에 대한 언급은 단일의 선택적인 부형제뿐만 아니라 둘 이상의 동일한 또는 상이한 선택적인 부형제 등을 지칭한다.
본 발명의 하나 이상의 구현예를 기술하고 청구하는 것에서, 다음 용어는 하기에 기술된 정의에 따라서 사용될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이 “PEG”, “폴리에틸렌 글리콜” 및 “폴리(에틸렌 글리콜)은 상호교환가능하며 임의의 비펩티드 수용성 폴리(에틸렌 옥사이드)를 포함한다. 통상적으로, 본 발명에 따른 용도에서 PEG는 다음의 구조 “-(OCH2CH2)n-”((n)은 2 내지 4000임)를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, PEG는 또한 말단 산소가 예를 들어 합성 변환(synthetic transformation) 동안에 치환되는지 여부에 따라 “-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-” 및 “-(OCH2CH2)nO-”를 포함한다. 명세서 및 청구항 전체에서, 용어 “PEG”는 다양한 말단 또는 “말단 캐핑(end capping)”기(group) 등을 가지는 구조를 포함하는 것을 기억해야 한다. 또한 용어 “PEG”는 대부분, 즉 50% 초과의 -OCH2CH2- 반복 서브유닛을 포함하는 중합체를 의미한다. 특정 형태에 대하여, PEG는 임의의 수의 다양한 분자량뿐만 아니라, 하기에 보다 상세하게 기술되는 “분지형(branched)”, “선형(linear)”, “갈라진(forked)”, “다기능의(multifunctional)” 등과 같은 구조 또는 기하학적 구조를 취할 수 있다.
용어 “말단 캐핑된(end-capped)” 및 “말단에 캐핑된(terminally capped)”은 본원에서 상호교환적으로 사용되어 말단 캐핑 부분(end-capping moiety)을 가지는 중합체의 말단 또는 종점을 지칭한다. 통상적으로, 필수적이지는 않지만 말단 캐핑 부분은 하이드록시 또는 C1-20 알콕시기, 보다 바람직하게는 C1-10 알콕시기, 보다 더 바람직하게는 C1-5 알콕시기를 포함한다. 따라서, 말단 캐핑 부분의 예는 알콕시(예를 들어, 메톡시, 에톡시 및 벤질옥시)뿐만 아니라, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로, 헤테로사이클로 등을 포함한다. 말단 캐핑 부분은 중합체에서 말단 단량체[예를 들어, CH3O(CH2CH2O)n- 및 CH3(OCH2CH2)n-에서 말단 캐핑 부분 “메톡시”]의 하나 이상의 원자를 포함할 수 있음을 기억해야 한다. 덧붙여, 상기한 것의 각각의 포화, 불포화, 치환 및 비치환된 형태가 생각된다. 게다가, 말단 캐핑기(end-capping group)는 또한 실란일 수 있다. 또한 말단 캐핑기는 유리하게 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 중합체가 검출가능한 표지를 포함하는 말단 캐핑기를 가질 때, 중합체 및/또는 중합체가 결합한 부분(예를 들어, 활성제)의 양 또는 위치는 적합한 검출기를 사용하여 결정할 수 있다. 이와 같은 표지는 이에 한정되지 않지만, 형광물질, 화학발광물질, 효소 표지화에 사용되는 부분, 비색물질(예를 들어, 색소), 금속 이온, 방사성 부분 등을 포함한다. 적합한 검출기는 광도계, 필름, 분광계 등을 포함한다. 또한 말단 캐핑기는 유리하게 인지질을 포함할 수 있다. 중합체가 인지질을 포함하는 말단 캐핑기를 가질 때, 특유의 특성이 중합체 및 생성되는 접합체로 부여된다. 예시적인 인지질은 이에 한정되지 않지만, 포스파티딜콜린으로 불리는 인지질의 종류에서 선택되는 것들을 포함한다. 특이적인 인지질은 이에 한정되지 않지만, 디라우로일포스파티딜콜린(dilauroylphosphatidylcholine), 디올레일포스파티딜콜린(dioleylphosphatidylcholine), 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine), 디스테로일포스파티딜콜린(disteroylphosphatidylcholine), 베헤노일포스파티딜콜린(behenoylphosphatidylcholine), 아라키도일포스파티딜콜린(arachidoylphosphatidylcholine), 및 레시틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다. 말단 캡핑기는 또한 표적화 부분을 포함할 수 있으므로, 중합체(및 이 중합체에 부착된 무엇, 예를 들어 IL-15 부분)는 관심 부위에 우선적으로 국소화될 수 있다.
본원에서 기술된 바와 같이 중합체에 대하여 “자연적으로 생성하지 않는”은 그 전체가 자연에서 발견되지 않는 중합체를 의미한다. 그러나 자연적으로 생성되지 않는 중합체는 전체 중합체 구조가 자연에서 발견되지 않는 한, 자연적으로 생성되는 하나 이상의 단량체 또는 자연적으로 생성되는 단량체의 분절을 포함할 수 있다.
“수용성 중합체” 중합체에서와 같이 용어 “수용성”은 실온에서 물에서 용해성인 임의의 중합체다. 통상적으로, 수용성 중합체는 여과 후에 동일한 용액에 의하여 전송된 (예를 들어, 600 nm 파장의) 빛의 적어도 약 75%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%를 전송할 것이다. 중량 기준으로, 수용성 중합체는 바람직하게 적어도 약 35%(중량으로) 물에서 용해하고, 보다 바람직하게는 적어도 약 50%(중량으로) 물에서 용해하며, 보다 더 바람직하게는 약 70%(중량으로) 물에서 용해하고, 보다 더 바람직하게는 약 85%(중량으로) 물에서 용해할 것이다. 그러나 수용성 중합체가 약 95%(중량으로) 물에서 용해하거나 또는 물에서 완전히 용해하는 것이 가장 바람직하다.
PEG와 같은 수용성 중합체의 맥락에서 분자량은 수 평균 분자량 또는 중량 평균 분자량으로서 표현될 수 있다. 다르게 지시되지 않는다면, 본원에서 분자량에 대한 모든 언급은 중량 평균 분자량을 말한다. 수 평균 및 중량 평균의 두 가지 분자량 결정 모두 겔 투과 크로마토그래피 또는 기타 다른 액체 크로마토그래피 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 또한 말단기(end-group) 분석법의 사용 또는 수 평균 분자량 또는 광 산란 기법의 사용을 결정하는 총괄적 특성(예를 들어, 어는점 하락, 끓는점 상승, 또는 삼투압), 중량 평균 분자량을 결정하는 초원심분리, 또는 점도의 측정과 같은 분자량 값을 측정하는 기타 다른 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 중합체는 통상적으로 다분산이고(즉, 중합체의 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량은 동등하지 않음), 바람직하게는 약 1.2 미만, 보다 바람직하게는 약 1.15 미만, 보다 더 바람직하게는 약 1.10 미만, 훨씬 더 바람직하게는 약 1.05 미만, 및 가장 바람직하게는 약 1.03 미만의 낮은 다분산 값을 가진다.
특정 작용기와 함께 사용될 때 용어 “활성”, “반응성” 또는 “활성화”는 다른 분자 상에서 친전자체(electrophile) 또는 친핵체(nucleophile)와 용이하게 반응하는 반응성 작용기를 말한다. 이는 반응하기 위하여 강한 촉매 또는 매우 비현실적인 반응 조건을 필요로 하는 기들(즉, “비반응성” 또는 “불활성”기)과 반대이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “작용기” 또는 이의 임의의 동의어는 이의 보호된 형태뿐만 아니라 비보호된 형태도 포함하는 것으로 의미한다.
용어 “스페이서 부분”, “결합” 및 “링커”는 본원에서 선택적으로 중합체 시약의 말단 및 IL-15 부분 또는 IL-15 부분의 친전자체 또는 친핵체와 같은 상호 결합하는(interconnecting) 부분을 결합하는데 사용되는 결합 또는 원자 또는 원자의 집합을 지칭하는 것으로 사용된다. 스페이서 부분은 가수분해적으로 안정적일 수 있거나 또는 생리적으로 가수분해되거나 효소로 분해가능한 결합을 포함할 수 있다. 문맥이 다르게 분명하게 지시하지 않는다면, 스페이서 부분은 선택적으로 화합물의 임의의 두 가지 요소 사이에 존재한다(예를 들어, IL-15 부분의 잔기 및 수용성 중합체를 포함하는 제공된 접합체는 직접적으로 또는 스페이서 부분을 통해 간접적으로 부착될 수 있다).
“알킬”은 통상적으로 길이가 약 1 개 내지 15 개 원자의 범위인 탄화수소 사슬을 말한다. 이와 같은 탄화수소 사슬은 필수적이지는 않지만 바람직하게는 포화되어 있고 분지형 또는 직선형 사슬일 수 있지만 통상적으로 직쇄가 바람직하다. 예시적인 알킬기로서는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 3-메틸펜틸 등을 포함한다.
“저급 알킬”은 1 개 내지 6 개의 탄소 원자를 포함하는 알킬기를 말하고, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, 및 t-부틸로 예시되는 바와 같이 직쇄 또는 분지형일 수 있다.
“사이클로알킬”은 가교(bridged), 융합 또는 스피로 사이클릭 화합물을 포함하여 포화 또는 불포화 사이클릭 탄화수소 사슬을 말하며, 바람직하게는 3 개 내지 약 12 개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 3 개 내지 약 8 개의 탄소 원자로 구성된다. “사이클로알킬렌”은 사이클릭 고리계 내 임의의 2 개의 탄소에서 사슬의 결합으로써 알킬 사슬 내로 삽입되는 사이클로알킬기를 말한다.
“알콕시”는 -OR기를 말하며, 여기서 R은 알킬 또는 치환된 알킬, 바람직하게는 C1-6 알킬(예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 등)이다.
예를 들어 “치환된 알킬”에서와 같이, 용어 “치환된”은 하나 이상의 비간섭(noninterfering) 치환기, 예를 들어 이로 한정되지 않지만 알킬, 예를 들어 사이클로프로필, 사이클로부틸 등과 같은 C3-8 사이클로알킬; 예를 들어 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오드와 같은 할로; 시아노; 알콕시, 저급 페닐; 치환된 페닐; 등으로 치환되는 부분(예를 들어, 알킬기)을 말한다. “치환된 아릴”은 치환기로서 하나 이상의 비간섭기를 가지는 아릴이다. 페닐 고리상에서의 치환에 대하여, 치환기는 임의의 방향(즉, 오르토, 메타 또는 파라)으로 있을 수 있다.
“비간섭 치환기”는 분자 내에 존재할 때 통상적으로 분자 내에 포함되는 기타 다른 작용기와 반응하지 않는 기들이다.
“아릴”은 각각 5 개 또는 6 개의 코어 탄소 원자를 가지는 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 아릴은 나프틸에서와 같이 융합될 수 있거나 또는 바이페닐에서와 같이 융합되지 않을 수 있는 다수의 아릴 고리를 포함한다. 또한 아릴 고리는 하나 이상의 사이클릭 탄화수소, 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클릭 고리와 융합되거나 또는 융합되지 않을 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “아릴”은 헤테로아릴을 포함한다.
“헤테로아릴”은 바람직하게 황, 산소, 또는 질소, 또는 이들의 조합인, 1 개 내지 4 개의 헤테로원자를 포함하는 아릴기이다. 또한 헤테로아릴 고리는 하나 이상의 사이클릭 탄화수소, 헤테로사이클릭, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리와 융합될 수 있다.
“헤테로사이클” 또는 “헤테로사이클릭”은 불포화 또는 방향족 특징을 가지거나 가지지 않으며, 탄소가 아닌 적어도 하나의 고리 원자를 가지는 5 개 내지 12 개 원자, 바람직하게는 5 개 내지 7 개 원자의 하나 이상의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로원자는 황, 산소, 및 질소를 포함한다.
“치환된 헤테로아릴”은 치환기로서 하나 이상의 비간섭기를 가지는 헤테로아릴이다.
“치환된 헤테로사이클”은 비간섭 치환기로 형성된 하나 이상의 측쇄를 가지는 헤테로사이클이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “유기 라디칼”은 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 및 치환된 아릴을 포함할 것이다.
“친전자체(electrophile)” 및 “친전자성기(electrophilic group)”는 친전자성 중심, 즉 전자를 구하고, 친핵체와 반응할 수 있는 중심을 가지는, 이온 또는 이온성일 수 있는 원자 또는 원자들의 집합을 말한다.
“친핵체(nucleophile)” 및 “친핵성기(nucleophilic group)”는 친핵성 중심, 즉 친전자성 중심을 구하거나 또는 친전자체와 반응할 수 있는 중심을 가지는, 이온 또는 이온성일 수 있는 원자 또는 원자들의 집합을 지칭한다.
“효소로 분해가능한 결합”은 하나 이상의 효소에 의한 분해의 대상이 되는 결합을 의미한다.
“가수분해가능한” 결합은 생리적 조건들 하에서 물과 반응하는(즉, 가수분해되는) 결합이다. 어느 결합이 물 속에서 가수분해되는 경향은 2 개의 중심 원자들을 연결하는 결합의 일반적인 유형뿐만 아니라, 이러한 중심 원자들에 부착된 치환기들에 따라서 달라질 것이다. 가수분해에 불안정적이거나 약한 결합으로서 적절한 것으로는 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. “유리가능한 결합”은 임상학적으로 유용한 속도로 생리적 조건 하에서 절단되는 공유 결합으로서, 예를 들어 가수분해가능한 결합과 효소에 의해 분해가능한 결합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
“가수분해에 안정적인” 연결 또는 결합은 실질적으로 물에서 안정적인, 즉 생리적 조건 하에서 길어진 시간 동안 임의의 주목할 만한 정도로 가수분해되지 않는 화학적 결합, 통상적으로 공유 결합을 말한다. 가수분해에 안정적인 결합의 예로서는 이에 한정되지 않지만 탄소-탄소 결합(예를 들어, 지방족 사슬에서), 에테르, 아미드, 우레탄 등을 포함한다. 일반적으로, 가수분해에 안정적인 결합은 생리적 조건 하에서 하루에 약 1% 내지 2% 미만의 가수분해율을 나타내는 것이다. 대표적인 화학 결합의 가수분해율은 대부분의 표준 화학 교과서에서 찾을 수 있다.
“약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체”는 본 발명의 조성물 내에 선택적으로 포함될 수 있고 환자에게 어떤 상당한 부정적인 독성 효과를 야기하지 않는 부형제를 말한다.
“약리학적으로 유효한 양”, “생리적으로 유효한 양” 및 “치료적으로 유효한 양”은 혈류에서 또는 표적 조직에서 중합체-(IL-15) 부분 접합체(또는 이에 상응하는 접합되지 않은 IL-15 부분)의 원하는 수준을 제공하는데 필요한 중합체-(IL-15) 부분 접합체의 양을 의미하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 정확한 양은 다수의 인자, 예를 들어 특정 IL-15 부분, 치료 조성물의 구성요소 및 물리적 특성, 의도된 환자 집단, 개별적인 환자 고려사항 등과 같은 인자에 따라 다를 것이고, 이는 본원에서 제공된 정보에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
“다작용성”은 중합체가 그 내부에 3 개 이상의 작용기를 가지는 경우를 의미하는데, 여기서 작용기들은 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 다작용성 중합체 시약은 통상적으로 약 3 개 내지 100 개의 작용기를 포함할 것이고, 이하의 범위들 중 하나 이상을 만족하는 수의 작용기를 포함할 수 있다: 3 개 내지 50 개의 작용기; 3 개 내지 25 개의 작용기; 3 개 내지 15 개의 작용기; 3 개 내지 10 개의 작용기. 예를 들어, 중합체 골격 내 작용기의 수는 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 및 10 개의 작용기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 “IL-15 부분”은 인간 IL-15 활성을 가지는 펩티드 또는 단백질 부분을 말한다. IL-15 부분은 또한 중합체 시약과의 반응에 적합한 하나 이상의 친전자성기 또는 친핵성기를 가질 것이다. 덧붙여, 용어 “IL-15 부분”은 접합 이전의 IL-15 부분과 접합 후의 IL-15 부분 잔기 둘 다를 포함한다. 하기에서 보다 상세히 설명될 바와 같이, 당업자는 임의의 주어진 부분이 IL-15 활성을 가지는지 여부를 결정할 수 있다. 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 IL-15 부분일 뿐만 아니라, 상기 서열들에 실질적으로 상동성인 임의의 단백질 또는 폴리펩티드이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 “IL-15 부분”은, 예를 들어 부위 지정 돌연 변이 유발법 또는 우발적 통과 돌연 변이(accidentally through mutation)에 의해 고의적으로 변형된 펩티드 및 단백질을 포함한다. 이러한 용어는 또한 1 개 내지 6 개의 부가 글리코실화 부위를 가지는 유사체, 펩티드 또는 단백질의 카복시 말단에 적어도 하나의 부가 아미노산(여기서, 부가 아미노산(들)은 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함함)을 가지는 유사체, 그리고 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함하는 아미노산 서열을 가지는 유사체를 포함한다. 상기 용어는 자연적으로 생성되는 부분, 재조합에 의해 생성되는 부분 및 합성으로 생성되는 부분을 포함한다.
용어 “실질적으로 상동성인”은 특정 주제 서열, 예를 들어 돌연 변이 서열이 하나 이상의 치환, 결실 또는 부가에 의해 기준 서열과 차이가 나지만, 그 순 효과가 기준 서열과 주제 서열 간 비유사성의 기능적 불리함을 가져오지 않는 것을 의미한다. 본 발명을 위하여, 95% 초과의 상동성을 가지고, 생물학적 활성이 동등하며(반드시 생물학적 활성의 세기까지 동등할 필요는 없음), 발현 특징도 동등한 서열은 실질적으로 상동성인 것으로 간주된다. 상동성을 측정하기 위하여, 성숙한 서열의 절단은 무시되어야 한다. 본원에 사용되는 예시적인 IL-15 부분으로서는 서열 번호 1과 실질적으로 상동성인 서열들을 포함한다.
용어 “단편”은 IL-15 부분의 일부 또는 단편의 아미노산 서열을 가지면서, IL-15의 생물학적 활성을 가지는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 IL-15 부분의 단백 분해에 의하여 생산된 단백질 또는 폴리펩티드뿐만 아니라, 당업계의 통상적인 방법에 의한 화학 합성법에 의해 생산된 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.
용어 “환자”는 활성제(예를 들어, 접합체)의 투여로 예방되거나 치료될 수 있는 병태를 겪거나 겪기 쉬운 생물체를 말하고, 인간과 동물 모두 포함한다.
“선택적인” 또는 “선택적으로”는 이후에 기술되는 상황이 일어날 수도 있고 일어나지 않을 수도 있어서, 기술은 상황이 일어나는 경우 및 상황이 일어나지 않는 경우를 포함하는 것을 의미한다.
“실질적으로”는 거의 전부 또는 완전히, 예를 들어 조건의 50% 초과, 51% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 및 95% 이상 중 하나 이상을 만족하는 것을 의미한다.
펩티드 내의 아미노산 잔기는 다음과 같이 축약된다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F이고; 류신은 Leu 또는 L이며; 이소류신은 Ile 또는 I이고; 메티오닌은 Met 또는 M이며; 발린은 Val 또는 V이고; 세린은 Ser 또는 S이며; 프롤린은 Pro 또는 P이고; 트레오닌은 Thr 또는 T이며; 알라닌은 Ala 또는 A이고; 티로신은 Tyr 또는 Y이며; 히스티딘은 His 또는 H이고; 글루타민은 Gln 또는 Q이며; 아스파라긴은 Asn 또는 N이고; 리신은 Lys 또는 K이며; 아스파르트산은 Asp 또는 D이고; 글루탐산은 Glu 또는 E이며; 시스테인은 Cys 또는 C이고; 트립토판은 Trp 또는 W이며; 아르기닌은 Arg 또는 R이고; 글리신은 Gly 또는 G이다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라서 접합체를 제공하며, 상기 접합체는 수용성 중합체에 (직접적으로 또는 스페이서 부분을 통해서) 공유적으로 부착된 IL-15 부분의 잔기를 포함한다. 본 발명의 접합체는 하나 이상의 하기 특성을 가질 것이다.
IL-15 부분
앞서 진술한 바와 같이, 접합체는 수용성 중합체에 직접적으로 또는 스페이서 부분을 통해 공유적으로 부착된 IL-15 부분의 잔기를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “IL-15 부분”은 접합 전의 IL-15 부분뿐만 아니라 비펩티드 수용성 중합체에 부착한 후의 IL-15 부분도 말할 것이다. 그러나, 원래의 IL-15 부분은 비펩티드 수용성 중합체에 부착할 때, 중합체(들)에의 결합과 연관된 하나 이상의 공유 결합의 존재 때문에 IL-15 부분은 약간 변형된다는 것을 이해할 것이다. 종종 다른 분자에 부착된 IL-15 부분의 약간 변형된 형태는 IL-15 부분의 “잔기”로 지칭된다.
IL-15 부분은 비재조합 방법에서 및 재조합 방법에서 유래할 수 있고 본 발명은 이와 관련하여 한정되지 않는다. 덧붙여, IL-15 부분은 인간 출처, 동물 출처(곤충을 포함함), 진균 출처(효모를 포함함), 및 식물 출처로부터 유래할 수 있다.
IL-15 부분은 Grabstein 외 다수에 의해 기술된 절차에 따라서 수득될 수 있다. 문헌[Grabstein et al. (1994) Science 264:965-968]을 참조한다.
IL-15 부분은 재조합 방법으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어 EP 0 772 624 B2호를 참조한다.
IL-15 부분은, 예를 들어 GenScript USA Inc.(Piscataway, NJ) 및 Peprotech(Rockyhill, NJ)로부터 상업적으로 구입될 수 있다.
IL-15 부분은 박테리아, 예를 들어 이.콜라이(E. coli)[예를 들어, 문헌[Fischer et al. (1995) Biotechnol . Appl . Biotechnol . 21(3):295-311] 참조], 포유류[예를 들어, 문헌[Kronman et al. (1992) Gene 121:295-304] 참조], 효모, 예를 들어 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)[예를 들어, 문헌[Morel et al. (1997) Biochem . J. 328(1):121-129] 참조], 그리고 식물[예를 들어, 문헌[Mor et al. (2001) Biotechnol . Bioeng . 75(3):259-266] 참조] 발현 시스템 내에서 발현될 수 있다. 발현은 외부 발현(숙주 세포가 자연적으로 원하는 유전 암호를 포함할 때)을 통하거나 내부 발현을 통하여 일어날 수 있다.
단백질을 제조하기 위한 재조합에 기초한 방법이 상이할 수 있더라도, 재조합 방법은 통상적으로 원하는 폴리펩티드 또는 단편을 암호화하는 핵산을 구성하는 단계, 상기 핵산을 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계, 숙주 세포(예를 들어, 식물, 박테리아, 효모, 유전자이식 동물 세포, 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포 또는 아기 햄스터 신장 세포와 같은 포유류 세포)를 형질변환시키는 단계, 및 핵산을 발현시켜 원하는 폴리펩티드 또는 단편을 생성하는 단계를 포함한다. 시험관내에서 및 원핵 및 진핵 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드를 생성 및 발현하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
재조합 폴리펩티드의 확인 및 정제를 용이하게 하기 위하여, 에피토프 태그(epitope tag) 또는 기타 다른 친화성 결합 서열에 대하여 암호화하는 핵산 서열은 암호화 서열과 함께 프레임 내에 삽입되거나 부가될 수 있고, 그렇게 함으로써 원하는 폴리펩티드 및 결합에 적합한 폴리펩티드로 구성된 융합 단백질을 생성한다. 융합 단백질은 융합 단백질 내에서 에피토프 태그 또는 기타 다른 결합 서열에 대해 지시된 결합 부분(예를 들어, 항체)을 가지는 친화성 컬럼을 통해 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 먼저 러닝(running)하고 그렇게 하여 컬럼 내에 융합 단백질을 결합시킴으로써 확인 및 정제할 수 있다. 그 후에, 적절한 용액(예를 들어, 산)으로 컬럼을 세척하여 결합된 융합 단백질을 방출시킴으로써 융합 단백질을 회수할 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 또한 숙주 세포를 용균시키고, 폴리펩티드를 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 결합 접근법, 소수성 상호 작용 접근법에 의해 분리한 후, MALDI 또는 웨스턴 블럿에 의해 확인한 다음, 폴리펩티드를 수집함으로써 정제될 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 확인 및 정제하는 상기와 같은 방법과 기타 다른 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 본 발명의 하나 이상의 구현예에서, IL-15 부분은 융합 단백질의 형태가 아니다.
IL-15 활성을 가지는 단백질을 발현하는 데 사용되는 시스템에 따라서, IL-15 부분은 글리코실화되지 않을 수 있거나 글리코실화될 수 있으며, 또한 글리코실화되지 않은 IL-15 부분 또는 글리코실화된 IL-15 부분 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 다시 말해서, IL-15 부분은 글리코실화되지 않을 수 있거나, IL-15 부분은 글리코실화될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 구현예에서, IL-15 부분은 글리코실화되지 않는다.
유리하게, IL-15 부분은 아미노산 측쇄 내부 원자에의 중합체의 용이한 부착을 제공하기 위하여, 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 리신, 시스테인 및/또는 아르기닌을 포함하고/포함하거나 치환하도록 변형될 수 있다. IL-15 부분의 치환에 관한 일례가 미국 특허 번호 6,177,079에 기술되어 있다. 덧붙여, IL-15 부분은 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다. 아미노산 잔기 및 자연적으로 생성되지 않는 아미노산 잔기를 부가하는 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 문헌[J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992)]을 참조한다.
덧붙여, 유리하게 IL-15 부분은 작용기의 부착을 포함하도록 변형될 수 있다(작용기 포함 아미노산 잔기를 부가함으로 인하여 변형되는 경우 제외). 예를 들어, IL-15 부분은 티올기를 포함하도록 변형될 수 있다. 덧붙여, IL-15 부분은 N-말단 알파 탄소를 포함하도록 변형될 수 있다. 덧붙여, IL-15 부분은 하나 이상의 탄수화물 부분을 포함하도록 변형될 수 있다. 덧붙여, IL-15 부분은 알데히드기를 포함하도록 변형될 수 있다. 덧붙여, IL-15 부분은 케톤기를 포함하도록 변형될 수 있다. 본 발명의 몇몇 구현예에서, IL-15 부분은 티올기, N-말단 알파 탄소, 탄수화물, 알데히드기 및 케톤기 중 하나 이상을 포함하도록 변형되지 않는 것이 바람직하다.
예시적인 IL-15 부분들은 본원, 문헌, 그리고, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US 2006/0104945, 문헌[Pettit et al. (1997) J. Biol . Chem . 272(4):2312-2318], 및 [Wong et al. (2013) OncoImmunology 2(11), e26442:1-3]에 기술되어 있다. 바람직한 IL-15 부분들은 서열 번호 1 내지 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열들, 그리고 이 서열들과 실질적으로 상동성인 서열들을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것들을 포함한다(여기서 만일 서열 번호 2 및 3, 그리고 이에 실질적으로 상동성인 서열들이 본원에 제공된 IL-15 부분의 시험관내 활성 기준을 충족하지 않으면, 본 발명을 위해서 상기 서열들은 또한 “IL-15 부분들”인 것으로 이해될 것임). 바람직한 IL-15 부분은 서열 번호 1에 상응하는 아미노산 서열을 가진다.
몇몇 예에서, IL-15 부분은 “단량체” 형태를 가질 것인데, 여기서 상응하는 펩티드의 단일 발현은 불연속적 단위로 조직화된다. 다른 예에서, IL-15 부분은 단백질의 단량체 형태들 2 개가 서로 결합되어 있는 “이량체”(예를 들어, 재조합 IL-15의 이량체)의 형태를 가질 것이다.
덧붙여, 전구체 형태 IL-15는 IL-15 부분으로서 사용될 수 있다. IL-15의 예시적인 전구체 형태는 서열 번호 3의 서열을 가진다.
전술한 서열들 중 임의의 것의 절단된 형태, 잡종 변이체, 그리고 펩티드 모의체도 또한 IL-15 부분으로서 사용될 수 있다. IL-15 활성을 적어도 어느 정도 유지하는 전술한 서열들 중 임의의 것의 생물학적으로 활성인 단편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 부가 변이체도 또한 IL-15 부분으로서 사용될 수 있다.
임의의 주어진 펩티드, 단백질 부분 또는 접합체에 있어서, 해당 펩티드, 단백질 부분 또는 접합체가 IL-15 활성을 가지는지 여부를 측정하는 것이 가능하다. 시험관 내 IL-15 활성을 측정하기 위한 다양한 방법들이 업계에 기술되어 있다. 예시적인 접근법은 pSTAT 분석법을 기반으로 한다. 요약하면, 만일 IL-15 의존적 CTLL-2 세포가 IL-15 활성을 가지는 시험 물질에 노출되면, 정량적으로 측정될 수 있는, 694번 티로신 잔기(Tyr694)에서의 STAT5 인산화를 포함하는 신호전달 캐스케이드가 개시된다. 분석법 프로토콜들과 키트들은 공지되어 있으며, 예를 들어 실시예 1과 연계되어 사용된 MSD Phospho(Tyr694)/Total STATa,b Whole Cell Lysate Kit(Meso Scal Diagnostics, LLC, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)를 포함하고; 이 접근법이 사용되면, 적어도 300 ng/㎖(보다 바람직하게는 적어도 150 ng/㎖)에서 5 분 또는 10 분 중 적어도 하나의 시간에 pSTAT5 EC50값을 나타내는, 제안된 IL-15 부분은 본 발명과 연계되어 “IL-15 부분”으로 간주된다. 그러나, (적어도 5 분 또는 10 분 중 하나의 시간에 pSTAT5 EC50값이 150 ng/㎖ 미만, 예를 들어 적어도 5 분 또는 10 분 중 하나의 시간에 pSTAT5 EC50값이 1 ng/㎖ 미만, 훨씬 더 바람직하게 0.5 ng/㎖ 미만인) 본 발명에 사용된 IL-15 부분이 더욱 강력한 것이 바람직하다. 안정적인 결합을 포함하는 접합체는 10 분에 pSTAT5 EC50값이 적어도 300 ng/㎖(보다 바람직하게 적어도 150 ng/㎖)을 나타내는 것이 바람직하고, 안정적인 결합을 포함하는 접합체는 10 분에 pSTAT5 EC50값 150 ng/㎖ 미만을 나타내는 것이 보다 바람직하다.
전기 분석법, 분광분석법, 크로마토그래피 및 방사 측정 방법을 비롯하여 당업계에 공지된 기타 다른 방법들은 또한 IL-15 기능을 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 부가적 유형의 분석법에 대한 문헌[Ring et al. (2012) Nat. Immunol. 13(12):1187-1195]을 참조한다.
IL-15 부분의 활성을 측정하는 것과 연계하여 사용되는 분석법도 또한 본원에 기술된 접합체의 활성을 측정하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 주어진 접합체의 특성들(예를 들어, 유리가능한 결합의 혼입, 대사를 견딜 수 있는 능력, 증가된 반감기 및 선택적 결합 특성 등)로 말미암아, 접합체는 반드시 본원에 정의된 IL-15 부분의 활성과 동일한 활성을 나타낼 필요는 없다.
수용성 중합체
앞서 검토한 바와 같이, 각각의 접합체는 수용성 중합체에 부착된 IL-15 부분을 포함한다. 수용성 중합체에 대하여, 수용성 중합체는 비펩티드성이고, 비독성이며, 자연적으로 생성되지 않고 생체적합성이다. 생체적합성에 대하여, 물질 단독 또는 살아있는 조직과 관련된 다른 물질(예를 들어, IL-15 부분과 같은 활성제)과의 사용(예를 들어, 환자에게 투여)과 연관된 이로운 효과가 임상의, 예를 들어 내과의가 평가한 바와 같은 임의의 유해한 효과 보다 크다면 그 물질은 생체적합성인 것으로 고려된다. 비면역원성에 대하여, 생체내에서 물질의 의도된 사용이 원하지 않는 면역 반응(예를 들어, 항체 형성)을 생성하지 않는다면 그 물질은 비면역원성인 것으로 고려되고, 또는 면역 반응이 생성되면 그러한 반응은 임상의가 평가한 바와 같은 임상적으로 유의한 또는 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 비펩티드성 수용성 중합체가 생체적합성이고 비면역원성인 것이 특히 바람직하다.
추가적으로, 중합체는 통상적으로 2 개 내지 약 300 개의 종점을 가지는 것으로 특징지어진다. 상기 중합체의 예는 이에 한정되지 않지만 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(“PEG”), 폴리(프로필렌 글리콜)(“PPG”), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(“POZ”)(WO 2008/106186호에 기술되어 있음), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 및 상기한 것 중의 임의의 것의 조합을 포함한다.
수용성 중합체는 특정 구조로 제한되지 않고 선형(예를 들어, 말단 캐핑된, 예를 들어 알콕시 PEG 또는 이기능성 PEG), 분지형 또는 다수의 팔을 가진(multi-armed)(예를 들어, 갈라진 PEG 또는 폴리올 코어에 부착된 PEG), 수지상(또는 별) 구조(architecture)일 수 있으며, 각각은 하나 이상의 분해가능한 결합을 가지거나 가지지 않을 수 있다. 더욱이, 수용성 중합체의 내부 구조는 임의의 수의 상이한 반복 패턴으로 구조화될 수 있고 동종중합체, 교호 공중합체(alternating copolymer), 랜덤 공중합체(random copolymer), 블록 공중합체(block copolymer), 교호 삼중합체(alternating tripolymer), 랜덤 삼중합체(random tripolymer), 및 블록 삼중합체(block tripolymer)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
통상적으로, 활성화된 PEG 및 기타 다른 활성화된 수용성 중합체(즉, 중합체 시약)는 IL-15 부분 상에서 원하는 부위와 결합하는데 적절한, 적합한 활성화기로 활성화된다. 따라서, 중합체 시약은 IL-15 부분과 반응하는 반응기를 가질 것이다. 이들 중합체를 활성 부분에 접합시키는 대표적인 중합체 시약 및 방법은 당업계에 공지되어 있고 문헌[Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly (Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides", Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992)], 및 [Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182]에 더 기술되어 있다. IL-15 부분에 결합하는데 적합한 예시적인 활성화기는 특히 하이드록실, 말레이미드, 에스테르, 아세탈, 케탈, 아민, 카복실, 알데히드, 알데히드 수화물, 케톤, 비닐 케톤, 티온, 티올, 비닐 술폰, 하이드라진을 포함한다.
통상적으로, 접합체에서 수용성 중합체의 중량 평균 분자량은 약 100 달톤 내지 약 150,000 달톤이다. 그러나 예시적인 범위는 5,000 달톤 초과 내지 약 100,000 달톤의 범위로, 약 6,000 달톤 내지 약 90,000 달톤의 범위로, 약 10,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위로, 10,000 달톤 초과 내지 약 85,000 달톤의 범위로, 약 20,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위로, 약 53,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위로, 약 25,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위로, 약 29,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위로, 약 35,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위로, 및 약 40,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위로 중량 평균 분자량을 포함한다. 임의의 주어진 수용성 중합체에 대하여, 분자량이 이들 범위 중 하나 이상인 PEG가 바람직하다.
수용성 중합체에 대하여 예시적인 중량 평균 분자량은 약 100 달톤, 약 200 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 약 600 달톤, 약 700 달톤, 약 750 달톤, 약 800 달톤, 약 900 달톤, 약 1,000 달톤, 약 1,500 달톤, 약 2,000 달톤, 약 2,200 달톤, 약 2,500 달톤, 약 3,000 달톤, 약 4,000 달톤, 약 4,400 달톤, 약 4,500 달톤, 약 5,000 달톤, 약 5,500 달톤, 약 6,000 달톤, 약 7,000 달톤, 약 7,500 달톤, 약 8,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 11,000 달톤, 약 12,000 달톤, 약 13,000 달톤, 약 14,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 22,500 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 약 35,000 달톤, 약 40,000 달톤, 약 45,000 달톤, 약 50,000 달톤, 약 55,000 달톤, 약 60,000 달톤, 약 65,000 달톤, 약 70,000 달톤, 및 약 75,000 달톤을 포함한다. 또한 총 분자량이 상기한 것 중 임의의 것인 수용성 중합체의 분지형 형태(예를 들어, 두 개의 20,000 달톤 중합체로 구성되는 분지형 40,000 달톤의 수용성 중합체)를 사용할 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 접합체는 중량 평균 분자량이 약 6,000 달톤 미만인 PEG와 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 임의의 PEG 부분을 가지지 않을 것이다.
중합체로서 사용될 때, PEG는 통상적으로 많은 (OCH2CH2) 단량체[또는 PEG를 정의한 방법에 따라 (CH2CH2O) 단량체]를 포함할 것이다. 기술 전체에 사용된 바와 같이, 반복 유닛의 수는 “(OCH2CH2)n”에서 아래첨자 “n”으로 확인된다. 따라서, (n)의 값은 통상적으로 2 내지 약 3400, 약 100 내지 약 2300, 약 100 내지 약 2270, 약 136 내지 약 2050, 약 225 내지 약 1930, 약 450 내지 약 1930, 약 1200 내지 약 1930, 약 568 내지 약 2727, 약 660 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 909 내지 약 2730, 및 약 1,200 내지 약 1,900 범위의 하나 이상 내에 해당한다. 분자량이 공지된 임의의 주어진 중합체에 대하여, 중합체의 총 중량 평균 분자량을 반복 단량체의 분자량으로 나눔으로써 반복 유닛의 수(즉, “n”)를 결정하는 것이 가능하다.
또한 하이드록실기를 사용할 수 있지만, 본 발명에서의 사용을 위한 하나의 특히 바람직한 중합체는 말단 캐핑된 중합체, 즉 상대적으로 불활성기, 예를 들어 저급 C1-6 알콕시기와 같은 기로 캐핑된 적어도 하나의 말단을 가지는 중합체이다. 중합체가 PEG일 때, 예를 들어 메톡시-PEG(보통 mPEG로 지칭됨)를 사용하는 것이 바람직하며, 메톡시-PEG는 중합체의 하나의 말단이 메톡시(-OCH3)기인 반면 다른 말단은 하이드록실 또는 선택적으로 화학적으로 변형될 수 있는 기타 다른 작용기인 PEG의 선형 형태이다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에 유용한 하나의 형태에서, 자유 또는 비결합 PEG는 각 말단에서 하이드록실기로 종결되는 선형 중합체이며,
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
여기서 (n)은 통상적으로 0 내지 약 4,000의 범위이다.
상기 중합체, 알파-, 오메가-디하이드록실폴리(에틸렌 글리콜)은 HO-PEG-OH로서 간단한 형태로 표현될 수 있고, -PEG- 부호는 다음 구조 단위로 표현될 수 있음이 이해되며,
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-
여기서 (n)은 상기에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서 유용한 PEG의 다른 유형은 메톡시-PEG-OH, 또는 간략히 mPEG이고, 이의 하나의 말단은 상대적으로 불활성인 메톡시기인 반면, 다른 말단은 하이드록실기이다. mPEG의 구조는 하기에 주어져 있으며,
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
여기서 (n)은 상기에 기술된 바와 같다.
또한 미국 특허 번호 5,932,462에 기술된 바와 같이, 다수의 팔을 가진 또는 분지형 PEG 분자는 PEG 중합체로서 사용할 수 있다. 예를 들어, PEG는 다음 구조를 가질 수 있으며,
Figure pct00001
여기서,
polya 및 polyb는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 (동일한 또는 상이한) PEG 골격이고;
R”은 H, 메틸 또는 PEG 골격과 같은 비반응성 부분이며;
P 및 Q는 비반응성 결합이다. 바람직한 구현예에서, 분지형 PEG 중합체는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 이치환된 리신이다. 사용된 특이적인 IL-15 부분에 따라서, 이치환된 리신의 반응성 에스테르 작용기는 추가적으로 변형되어 IL-15 부분 내에서 표적기와 반응하기에 적합한 작용기를 형성할 수 있다.
덧붙여, PEG는 갈라진 PEG를 포함할 수 있다. 갈라진 PEG의 예는 다음의 구조로 표현되며,
Figure pct00002
여기서, X는 하나 이상의 원자의 스페이서 부분이고 각각의 Z는 정의된 길이의 원자의 사슬로 CH에 결합된 활성화된 말단기다. 국제 특허 출원 공개 WO 99/45964는 본 발명의 하나 이상의 구현예에서 사용할 수 있는 다양한 갈라진 PEG 구조를 개시한다. 분지화 탄소 원자에 Z 작용기를 결합하는 원자의 사슬은 테더링기(tethering group)의 역할을 하고, 예를 들어 알킬 사슬, 에테르 사슬, 에스테르 사슬, 아미드 사슬 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
PEG 중합체는 PEG 사슬의 말단에서보다 PEG의 길이를 따라 공유적으로 부착된, 카복실과 같은 반응성기를 가지는 펜던트(pendant) PEG 분자를 포함할 수 있다. 펜던트 반응성기는 PEG에 직접적으로 또는 알킬렌기와 같은 스페이서 부분을 통해 부착될 수 있다.
상기 기술한 PEG 형태에 더하여, 또한 상기 중합체는 상기 기술한 임의의 중합체를 포함하여, 중합체에서 하나 이상의 약한 또는 분해가능한 결합으로 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG는 가수분해되는 중합체에서 에스테르 결합으로 제조될 수 있다. 아래에 나타낸 바와 같이, 이러한 가수분해는 낮은 분자량의 단편으로 중합체의 절단을 일으킨다:
Figure pct00003
중합체 골격 내에서 분해가능한 결합으로서 및/또는 IL-15 부분으로의 분해가능한 결합으로서 유용한 기타 다른 가수분해로 분해가능한 결합은 카보네이트 결합; 예를 들어 아민 및 알데히드의 반응으로 생긴 이민 결합(예를 들어, 문헌 [Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3] 참고); 예를 들어 알코올과 포스페이트기와의 반응으로 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 통상적으로 하이드라지드 및 알데히드의 반응으로 형성되는 하이드라존 결합; 통상적으로 알데히드 및 알코올 사이의 반응으로 형성되는 아세탈 결합; 예를 들어, 포르메이트 및 알코올 사이의 반응으로 형성되는 오르토에스테르 결합; 예를 들어 PEG와 같은 중합체의 말단에서 아민기, 및 다른 PEG 사슬의 카복실기에 의해 형성된 아미드 결합; 예를 들어 말단 이소시아네이트기 및 PEG 알코올을 이용한 PEG의 반응으로 형성된 우레탄 결합; 예를 들어 PEG와 같은 중합체의 말단에서 아민기, 및 펩티드의 카복실기에 의해 형성된 펩티드 결합; 및 예를 들어 중합체의 말단에서 포스포라미디트기, 및 올리고뉴클레오티드의 5' 하이드록실기로 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다.
접합체의 이와 같은 선택적인 특성, 즉 중합체 사슬 내로 또는 IL-15 부분으로 하나 이상의 분해가능한 결합의 도입은 투여시 접합체의 최종적인 원하는 약리학적 특성 이상으로 추가적인 제어를 제공할 수 있다. 예를 들어, 크고 상대적으로 불활성인 접합체(즉, 이에 부착된 하나 이상의 고분자량 PEG 사슬, 예를 들어 약 10,000 초과의 분자량을 가지는 하나 이상의 PEG 사슬을 가지며, 여기서 접합체는 근본적으로 어떠한 생물활성을 가지지 않음)가 투여될 수 있고, 가수분해되어 원래의 PEG 사슬의 일부를 가지는 생물활성 접합체를 생성한다. 이러한 방식으로, 접합체의 특성은 더 효과적으로 조정되어 시간이 지남에 따라 접합체의 생물활성의 균형을 이룰 수 있다.
접합체와 결합되어 있는 수용성 중합체도 또한 “유리가능한 것”일 수 있다. 다시 말해서, 상기 수용성 중합체는 (가수 분해, 효소 공정 또는 촉매 공정 등을 통하여) 유리되고, 그 결과, 미접합 IL-15 부분이 생성된다. 몇몇 경우에 있어서, 유리가능한 중합체는 수용성 중합체의 어떠한 단편도 남기지 않고 IL-15 부분으로부터 생체 내 해리된다. 다른 경우에 있어서, 유리가능한 중합체는 수용성 중합체로부터 유래하는, 크기가 비교적 작은 단편(예를 들어, 숙시네이트 태그)을 남기면서 IL-15 부분으로부터 생체 내 해리된다. 예시적인 절단가능한 중합체로서는 카보네이트 결합을 통하여 IL-15 부분에 부착되는 중합체를 포함한다.
비펩티드성 및 수용성 중합체에 관하여 상기한 검토는 결코 총망라한 것이 아니고 단지 예시적인 것이며, 상기 기술된 품질을 가지는 모든 중합체 물질이 고려됨을 당업자는 인지할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “중합체 시약”은 일반적으로 전체 분자를 말하며, 이는 수용성 중합체 분절 및 작용기를 포함할 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 접합체는 IL-15 부분에 공유적으로 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 통상적으로, 임의의 주어진 접합체에 대하여, IL-15 활성을 가지는 하나 이상의 부분에 공유적으로 부착되는 1 개 내지 3 개의 수용성 중합체일 것이다. 그러나 몇몇 경우에서, 상기 접합체는 IL-15 부분에 개별적으로 부착된 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개 또는 그 이상의 수용성 중합체를 가질 수 있다. 임의의 주어진 수용성 중합체는 IL-15 부분의 아미노산에, 또는 IL-15 부분이 (예를 들어) 당단백질일 때, IL-15 부분의 탄수화물에 공유적으로 부착될 수 있다. 탄수화물에의 부착은 예를 들어 시알산-아지드 화학 반응[Luchansky et al. (2004) Biochemistry 43(38):12358-12366] 또는 알데히드기의 도입을 용이하게 하는 글리시돌의 사용과 같은 기타 다른 적합한 접근법[Heldt et al. (2007) European Journal of Organic Chemistry 32:5429-5433]을 이용하여 물질대사 작용화를 사용함으로써 수행할 수 있다
IL-15 활성을 가지는 부분 및 중합체 내에서 특정한 결합은 다수의 인자에 따라 다르다. 상기 인자는, 예를 들어 이용된 특정한 결합 화학 성질, 특정한 IL-15 부분, IL-15 부분 내에서 (중합체로의 부착 또는 적합한 부착 부위로의 전환을 위하여) 이용가능한 작용기, IL-15 부분 내에서 추가적인 반응성 작용기의 존재 등을 포함한다.
본 발명의 접합체는, 반드시 그러하여야 하는 것은 아니지만, 전구 약물일 수 있는데, 이는 중합체와 IL-15 부분 사이의 결합이 가수분해로 유리가능하여, 부모 부분이 유리될 수 있음을 의미한다. 예시적인 유리가능한 결합으로서는 카복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 티올 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이와 같은 결합은 IL-15 부분(예를 들어, 단백질의 카복실기 C 말단 또는 단백질 중에 포함된 아미노산, 예를 들어 세린 또는 트레오닌의 측쇄 하이드록실기, 또는 탄수화물 중 유사한 작용기) 및/또는 중합체 시약을, 당업계에서 통상적으로 이용되는 커플링 방법을 사용하여 적절히 변형함으로써 용이하게 제조될 수 있다. 그러나, 적당히 활성화된 중합체와 IL-15 활성을 가지는 부분 중에 포함된 비변형 작용기의 반응에 의해 용이하게 형성되는 가수분해가능한 결합이 가장 바람직하다.
대안적으로, 아미드, 우레탄(카바메이트로도 알려짐), 아민, 티오에테르(설파이드로도 알려짐), 또는 우레아(카바마이드로도 알려짐) 결합과 같은 가수분해에 안정적인 결합은 또한 IL-15 부분을 결합하기 위하여 결합으로서 이용될 수 있다. 또 한편, 바람직한 가수분해에 안정적인 결합은 아미드이다. 하나의 접근법에서, 활성화된 에스테르를 가지는 수용성 중합체는 IL-15 부분 상에서 아민기와 반응함으로써 아미드 결합을 생성할 수 있다.
접합체(접합되지 않은 IL-15 부분에 반대인 것)는 측정가능한 정도의 IL-15 활성을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있다. 다시 말하면, 본 발명에 따라서 중합체-IL-15 부분 접합체는 변형되지 않은 부모 IL-15 부분의 생물활성의 약 0.1% 내지 약 100%를 어디에서도 가질 것이다. 몇몇 경우에서, 중합체-IL-15 부분 접합체는 변형되지 않은 부모 IL-15 부분의 100% 초과의 생물활성을 가질 것이다. 바람직하게, IL-15 활성을 약간 가지거나 또는 전혀 가지지 않는 접합체는 중합체를 상기 부분과 결합하는 가수분해가능한 결합을 포함하여, 접합체에서 활성의 결여(또는 상대적으로 결여)에 관계없이, 가수분해가능한 결합의 수성 유도 절단시 활성 부모 분자(또는 이의 유도체)가 유리된다. 이용되는 IL-15 활성을 가지는 특정 부분의 공지된 활성에 따라서, 상기 활성은 적합한 생체내 또는 시험관내 모델을 사용하여 결정할 수 있다.
중합체에 대하여 IL-15 활성을 가지는 부분을 결합하는 가수분해에 안정적인 결합을 가지는 접합체에 대하여, 상기 접합체는 통상적으로 측정가능한 정도의 생물활성을 가질 것이다. 예를 들어, 상기 접합체는 통상적으로 접합되지 않은 IL-15 부분의 생물활성에 대한, 적어도 약 2%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 100%, 및 105% 초과(당업계에 익히 공지된 모델과 같은 적합한 모델에서 측정될 때)의 백분율의 하나 이상을 만족하는 생물활성을 가지는 것으로 특징지어진다. 바람직하게, 가수분해에 안정적인 결합(예를 들어, 아미드 결합)을 가지는 접합체는 IL-15 활성을 가지는 변형되지 않은 부모 부분의 적어도 일부 정도의 생물활성을 가질 것이다.
이제, 본 발명에 따른 예시적인 접합체를 기술할 것이다. 통상적으로 상기 IL-15 부분은 서열 번호 1 내지 3 중 적어도 하나에 제공된 서열과 유사한 아미노산 서열을 (적어도 부분적으로) 공유하는 것으로 예측된다. 따라서, 서열 번호 1 내지 3 중 특정 위치 또는 원자를 참고로 하였을 때, 이와 같은 참고는 오로지 편의를 위한 것으로서 당업자는 IL-15 활성을 가지는 기타 다른 부분들 중 상응하는 위치 또는 원자를 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 특히 본원에서 타고난 인간 IL-15에 관하여 제공된 설명은 종종 상기 서열들 중 임의의 것의 단편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 부가 변이체에도 적용될 수 있다.
IL-15 부분 상의 아미노기는 IL-15 부분과 수용성 중합체 사이의 부착점을 제공한다. 서열번호 1 내지 3에서 제공되는 아미노산 서열을 사용하여, 접합체에 대하여 이용가능할 수 있는 ε-아미노산을 가지는 각각에 수 개의 리신 잔기가 있음은 명백하다. 추가적으로 또한 임의의 단백질의 N-말단 아민은 부착점으로서의 역할을 할 수 있다.
IL-15 부분의 이용가능한 아민으로 공유 결합을 형성하는데 유용한 적합한 중합체 시약의 다수의 예가 있다. 상응하는 접합체에 따른 특이적인 예는 하기 표 1에 제공된다. 표에서 변수 (n)은 반복하는 단량체 단위의 수를 나타내고 “-NH-(IL-15)”는 중합체 시약에 접합한 후 IL-15 부분의 잔기를 나타낸다. 표 1에 제시된 각각의 중합체 부분[예를 들어, (OCH2CH2)n 또는 (CH2CH2O)n]이 “CH3”기에서 종결할 때, (H 및 벤질과 같은) 기타 다른 기들로 이를 치환할 수 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
IL-15 부분의 아미노기로 중합체 시약의 접합은 다양한 기법으로 이루어질 수 있다. 하나의 접근법에서, IL-15 부분은 숙신이미딜 유도체(또는 기타 다른 활성화된 에스테르기, 여기서 대안적인 활성화된 에스테르기-함유 중합체 시약에 대하여 기술된 것과 유사한 접근법을 사용할 수 있음)로 작용화된 중합체 시약으로 접합될 수 있다. 이러한 접근법에서, 상이한 반응 조건(예를 들어, 6 내지 7과 같은 낮은 pH, 또는 상이한 온도 및/또는 15℃ 미만 온도)을 사용하여 IL-15 부분 상의 상이한 위치로 중합체의 부착을 일으킬 수 있더라도, 숙신이미딜 유도체를 가지는 중합체는 pH 7 내지 9.0의 수성 매질에서 IL-15 부분에 부착될 수 있다. 덧붙여, 아미드 결합은 아민 종결 비펩티드 수용성 중합체를 활성화 카복실산기를 가지는 IL-15 부분과 반응시킴으로써 형성될 수 있다.
예시적인 접합체는 다음과 같은 구조 내에 포함되며,
Figure pct00011
상기 식중,
(n)은 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이고;
X는 스페이서 부분이며;
R1은 유기 라디칼이고;
IL-15는 IL-15 부분의 잔기이다.
예시적인 접합체는 다음과 같은 구조에 의해 포함되며,
Figure pct00012
여기서, (n)은 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이고, IL-15는 IL-15 부분의 잔기이다.
IL-15 부분을 중합체 시약으로 접합시키는 데 유용한 통상적인 다른 접근법은 IL-15 부분의 1차 아민을 케톤, 알데히드 또는 이의 수화물 형태(예를 들어, 케톤 수화물, 알데히드 수화물)로 작용화된 중합체 시약으로 접합하는 환원적 아미노화(reductive amination)의 사용이다. 이러한 접근법에서, IL-15 부분으로부터의 1차 아민은 알데히드 또는 케톤(또는 수화된 알데히드 또는 케톤의 상응하는 하이드록실-함유 기)의 카보닐기와 반응하며, 이렇게 함으로써 시프 염기(Schiff base)를 형성한다. 그 후 결과적으로 시프 염기는 소듐 보로하이드라이드와 같은 환원제의 사용을 통해 안정적인 접합체로 환원적으로 전환될 수 있다. 특히 케톤 또는 알파-메틸 분지형 알데히드로 및/또는 특이적인 반응 조건(예를 들어, 환원된 pH) 하에서 작용화된 중합체와의 선택적인 반응(예를 들어, N-말단에서)이 가능하다.
수용성 중합체가 분지형인 본 발명의 예시적인 접합체는, 수용성 중합체가 다음과 같은 구조 내에 포함되는 것을 포함하며,
Figure pct00013
여기서, 각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이다.
본 발명의 예시적인 접합체는 다음과 같은 구조 내에 포함되며,
Figure pct00014
여기서,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이고;
X는 스페이서 부분이며;
(b)는 2 내지 6의 값을 가지는 정수이고;
(c)는 2 내지 6의 값을 가지는 정수이며;
각각의 경우, R2는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
IL-15는 IL-15 부분의 잔기이다.
본 발명의 예시적인 접합체는 다음과 같은 구조 내에 포함되며,
Figure pct00015
여기서,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이고;
IL-15는 IL-15 부분의 잔기이다.
본 발명의 기타 다른 예시적인 접합체는 다음과 같은 구조 내에 포함되며,
Figure pct00016
여기서,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이고;
(a)는 0 또는 1이며;
X가 존재할 때, 이 X는 하나 이상의 원자로 구성된 스페이서 부분이고;
(b')는 0이거나 1 내지 10의 값을 가지는 정수이며;
(c)는 1 내지 10의 값을 가지는 정수이고;
각각의 경우, R2는 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이며;
각각의 경우, R3은 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
IL-15는 IL-15 부분의 잔기이다.
본 발명의 또 다른 예시적 접합체는 다음과 같은 구조 내에 포함되며,
Figure pct00017
여기서,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이고;
IL-15는 IL-15 부분의 잔기이다.
유리가능한 결합을 포함하는 예시적인 접합체는, IL-15 부분이 다음과 같은 화학식 내에 포함되는 중합체 시약에 접합되어 있는 것을 포함하며,
Figure pct00018
여기서,
POLY1은 제1 수용성 중합체이고;
POLY2는 제2 수용성 중합체이며;
X1은 제1 스페이서 부분이고;
X2는 제2 스페이서 부분이며;
Hα는 이온화가능한 수소 원자이고;
R1은 H 또는 유기 라디칼이며;
R2는 H 또는 유기 라디칼이고;
(a)는 0 또는 1이며;
(b)는 0 또는 1이고;
Re1이 존재할 때, 이 Re1은 제1 전자 변경기(electron altering group)이며;
Re2가 존재할 때, 이 Re2는 제2 전자 변경기이고;
(FG)는 활성 제제의 아미노기와 반응하여 유리가능한 결합, 예를 들어 카바메이트 결합을 형성할 수 있는 작용기이다. 이러한 화학식들 중, 더 자세히 정의된 구조를 가지는 중합체 시약이 고려되며,
Figure pct00019
여기서, POLY1, POLY2, X1, X2, R1, R2, Hα 및 (FG)는 각각 상기 정의된 바와 같고, Re1은 제1 전자 변경기이며; Re2는 제2 전자 변경기이다.
또 다른 예시적 중합체 시약은 다음과 같은 화학식에 포함되며,
Figure pct00020
Figure pct00021
여기서, 각각의 구조와 각각의 경우에 있어서, (n)은 독립적으로 4 내지 1500의 정수이다.
이러한 유리가능한 결합을 제공하는 중합체 시약은 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0293499에 제시된 방법에 따라서 제조될 수 있다.
유리가능한 결합을 제공하는 중합체 시약을 사용하여 형성된 예시적인 접합체는 다음과 같은 화학식의 것들을 포함하며,
Figure pct00022
여기서,
POLY1은 제1 수용성 중합체이고;
POLY2는 제2 수용성 중합체이며;
X1은 제1 스페이서 부분이고;
X2는 제2 스페이서 부분이며;
Hα는 이온화가능한 수소 원자이고;
R1은 H 또는 유기 라디칼이며;
R2는 H 또는 유기 라디칼이고;
(a)는 0 또는 1이며;
(b)는 0 또는 1이고;
Re1이 존재할 때, 이 Re1은 제1 전자 변경기이며;
Re2가 존재할 때, 이 Re2는 제2 전자 변경기이고;
Y1은 O 또는 S이며;
Y2는 O 또는 S이고;
IL-15는 IL-15 부분의 잔기이다.
예시적인 접합체는 다음과 같은 구조를 가지며,
Figure pct00023
Figure pct00024
여기서,
각각의 구조와 각각의 경우에 있어서, (n)은 독립적으로 4 내지 1500의 정수이고, IL-15는 IL-15 부분의 잔기이다.
카복실기는 IL-15 부분 상의 부착점으로서의 역할을 할 수 있는 다른 작용기를 나타낸다. 구조적으로, 상기 접합체는 하기를 포함할 것이며,
Figure pct00025
여기서 IL-15 및 인접한 카보닐기는 카복실-포함 IL-15 부분에 해당하고, X는 결합, 바람직하게 O, N(H), 및 S로부터 선택되는 헤테로원자이며, POLY는 PEG와 같은 수용성 중합체이고, 선택적으로 말단 캐핑 부분에서 종결된다.
C(O)-X 결합은 말단 작용기를 가지는 중합체 유도체와 카복실-포함 IL-15 부분 사이의 반응으로 생긴다. 상기에서 검토된 바와 같이, 특이적인 결합은 이용되는 작용기의 유형에 따라 다를 것이다. 중합체가 하이드록실기로 말단 작용화되거나 또는 “활성화”되면, 생성되는 결합은 카복실산 에스테르일 것이고 X는 0일 것이다. 중합체 골격이 티올기로 작용화되면, 생성되는 결합은 티오에스테르일 것이고 X는 S일 것이다. 특정한 다수의 팔을 가진, 분지형 또는 갈라진 중합체를 이용할 때, C(O)X 부분, 및 특히 X 부분은 상대적으로 더 복잡할 수 있고 더 긴 결합 구조를 포함할 수 있다.
또한 하이드라지드 부분을 포함하는 수용성 유도체는 카보닐 및 카복실산에서 접합에 유용하다. IL-15 부분이 카보닐 부분 또는 카복실산을 포함하지 않는 정도로, 당업자에게 공지된 기법을 사용하여 추가될 수 있다. 예를 들어, 카복실산(예를 들어, C-말단 카복실산)을 환원시킴으로써 및/또는 IL-15 부분의 글리코실화된 또는 글리케이트된(glycated)(여기서 첨가된 당은 카보닐 부분을 가짐) 형태를 제공함으로써 카보닐 부분을 도입할 수 있다. 카복실산을 포함하는 IL-15 부분에 대하여, PEG-하이드라진 시약은 커플링제(coupling agent)(예를 들어, DCC)의 존재 하에, IL-15 부분에 공유적으로 부착할 수 있다[예를 들어, mPEG-OCH2C(O)NHNH2 + HOC(O)-(IL-15)는 mPEG-OCH2C(O)NHNHC(O)-IL-15를 생성함]. 상응하는 접합체에 따른 하이드라지드 부분을 포함하는 수용성 유도체의 특이적인 예는 하기 표 2에 제공된다. 덧붙여, 활성화된 에스테르(예를 들어, 숙신이미딜기)를 포함하는 임의의 수용성 유도체는, 활성화된 에스테르를 포함하는 수용성 중합체 유도체를 하이드라진(NH2-NH2) 또는 tert-부틸 카바제이트[NH2NHCO2C(CH3)3]와 반응시킴으로써 전환되어 하이드라지드 부분을 포함할 수 있다. 표에서, 변수 (n)은 반복하는 단량체 단위의 수를 나타내고 “-C(O)-(IL-15)”는 중합체 시약으로의 접합 후의 IL-15 부분의 잔기를 나타낸다. 선택적으로, 하이드라존 결합은 적합한 환원제를 사용함으로써 환원될 수 있다. 표 2에 제시된 각각의 중합체 부분[예를 들어, (OCH2CH2)n 또는 (CH2CH2O)n]은 “CH3”기에서 종결하는 한편, (H 및 벤질과 같은) 기타 다른 기들로 이를 치환할 수 있다.
Figure pct00026
Figure pct00027
IL-15 부분 내에 포함된 티올기는 수용성 중합체에 대한 효과적인 부착 부위로서의 역할을 할 수 있다. IL-15 부분이 단백질일 때 특히 시스테인 잔기는 티올기를 제공한다. 그 다음 상기 시스테인 잔기에서 티올기는 티올기, 예를 들어 N-말레이미딜 중합체 또는 미국 특허 번호 5,739,208 및 WO 01/62827에 기술된 바와 같은 기타 다른 유도체와의 반응에 특이적인 활성화된 PEG와 반응할 수 있다. 덧붙여, 보호된 티올은 활성화된 당단백질의 올리고당 측쇄 내로 편입되고, 그 후 티올-반응성 수용성 중합체로 탈보호화된다.
상응하는 접합체에 따른 시약의 특이적인 예는 하기 표 3에 제공된다. 표에서, 변수 (n)은 반복하는 단량체 단위의 수를 나타내고 “-S-(IL-15)”는 수용성 중합체로의 접합 후의 IL-15 부분의 잔기를 나타낸다. 표 3에 제시된 각각의 중합체 부분[예를 들어, (OCH2CH2)n 또는 (CH2CH2O)n]은 “CH3”기에서 종결하는 한편, (H 및 벤질과 같은) 기타 다른 기들로 이를 치환할 수 있다.
예시적인 IL-15 부분들과 상응하는 서열 번호 1 및 2에 있어서, 125번 위치에 시스테인 잔기가 존재하는 것이 확인될 수 있다. 따라서, 예시적인 티올 부착 부위는 125번 위치에 위치하는 시스테인이다. 비록 주어진 IL-15 부분과 결합된 임의의 이황화 결합을 파괴하는 것은 바람직하지 않지만, 이러한 시스테인 잔기들 중 하나 이상의 측쇄 내에 중합체를 부착시켜 활성의 정도를 유지하는 것이 가능할 수 있다. 덧붙여, 통상의 합성 기법을 사용하여 IL-15 부분에 시스테인 잔기를 부가할 수도 있다. 예를 들어, WO 90/12874에 기술된, 시스테인 잔기를 부가하는 절차(이 절차는 IL-15 부분에 맞춰 수정될 수 있음)을 참고한다. 덧붙여, 통상의 유전자 조작 방법도 시스테인 잔기를 IL-15 부분에 도입하는데 사용될 수 있다. 그러나, 몇몇 구현예에서, 부가의 시스테인 잔기 및/또는 티올기를 도입하지 않는 것이 바람직하다.
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
(말레이미드가 IL-15 부분 상의 아민 또는 티올기와 반응하는지 여부와 관계없이) 하나 이상의 말레이미드 작용기를 가지는 수용성 중합체로부터 형성된 접합체에 대하여, 수용성 중합체의 상응하는 말레암산(maleamic acid) 형태(들)는 또한 IL-15 부분과 반응할 수 있다. 특정 조건(예를 들어, 약 pH 7 내지 9 및 물의 존재) 하에서, 말레이미드 고리는 “열려서(open)” 상응하는 말레암산을 형성할 것이다. 결과적으로 말레암산은 IL-15 부분의 아민 또는 티올기와 반응할 수 있다. 예시적인 말레암산에 기초한 반응은 하기에 도식적으로 나타내어져 있다. POLY는 수용성 중합체를 나타내고, IL-15는 IL-15 부분을 나타낸다.
Figure pct00031
본 발명에 따라서 대표적인 접합체는 다음과 같은 구조를 가질 수 있으며,
POLY-L0,1-C(O)Z-Y-S-S-(IL-15)
여기서 POLY는 수용성 중합체고, L은 선택적인 링커이며, Z는 O, NH, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 헤테로원자이고, Y는 C2-10 알킬, C2-10 치환된 알킬, 아릴, 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되며, IL-15는 IL-15 부분이다. IL-15 부분과 반응할 수 있고 접합체의 이러한 유형을 생성할 수 있는 중합체 시약은 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0014903에 기술되어 있다.
앞서 나타낸 바와 같이, 수용성 중합체가 분지형의 형태인 본 발명의 예시적인 접합체는 수용성 중합체의 분지형의 형태가 다음의 구조를 포함하게 할 것이며,
Figure pct00032
여기서, 각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이다.
분지형의 형태로 수용성 중합체를 가지는 예시적인 접합체는 다음의 시약을 사용하여 제조되며,
Figure pct00033
그렇게 함으로써 다음의 구조를 가지는 접합체를 형성하고,
Figure pct00034
여기서,
(각각의 구조에 있어서) 각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이며,
IL-15는 IL-15 부분의 잔기이다.
추가적인 예시적 접합체는 다음의 시약을 사용하여 형성될 수 있으며,
Figure pct00035
그렇게 함으로써 다음의 구조를 가지는 접합체를 형성하고,
Figure pct00036
여기서,
(각각의 구조에 있어서) (n)은 독립적으로 2 내지 4000의 값을 가지는 정수이며;
IL-15는 IL-15 부분의 잔기이다.
접합체는 다수의 방법으로 티올-선택적인 중합체 시약을 사용하여 형성될 수 있고 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 선택적으로 적합한 완충액(원한다면, 아민-함유 완충액을 포함함)에서, IL-15 부분은 약 pH 7 내지 8의 수성 매질에 배치하고, 티올-선택적인 중합체 시약은 과량 몰로 첨가한다. PEG화 수율을 상대적으로 낮게 결정한다면 2 시간 초과의 반응 시간(예를 들어, 5 시간, 10 시간, 12 시간, 및 24 시간)은 유용할 수 있지만, 반응은 약 0.5 시간 내지 2 시간 동안 진행되게 한다. 이러한 접근법에서 사용할 수 있는 예시적인 중합체 시약은 말레이미드, 술폰(예를 들어, 비닐 술폰), 및 티올(예를 들어, 오르토 피리디닐 또는 “OPSS”와 같은 작용화된 티올)로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성기를 가지는 중합체 시약이다.
중합체 시약에 대하여, 여기 및 다른 부분에서 기술된 것들은 상업적 출처에서 구입하거나 또는 상업적으로 이용가능한 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 덧붙여, 중합체 시약을 제조하는 방법은 문헌에 기술되어 있다.
IL-15 부분과 비펩티드 수용성 중합체 사이의 부착은, 어떠한 개재 원자(intervening atom)가 IL-15 부분과 중합체 사이에 위치하지 않아 직접적일 수 있거나, 또는 IL-15 부분과 중합체 사이에 하나 이상의 원자가 위치하여 간접적일 수 있다. 간접적인 부착에 대하여 “스페이서 부분”은 IL-15 부분의 잔기와 수용성 중합체 사이에서 링커로서의 역할을 한다. 스페이서 부분을 구성하는 하나 이상의 원자는 하나 이상의 탄소 원자, 질소 원자, 황 원자, 산소 원자, 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 스페이서 부분은 아미드, 2차 아민, 카바메이트, 티오에테르, 및/또는 이황화기를 포함할 수 있다. 특이적인 스페이서 부분의 비제한적인 예로서는 -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-, 2가 사이클로알킬기, -O-, -S-, 아미노산, -N(R6)-, 및 상기한 것 중 임의의 2 개 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하고, 여기서 R6은 H 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 라디칼이고, (h)는 0 내지 6이며, (j)는 0 내지 20이다. 기타 다른 특이적인 스페이서 부분은 -C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, 및 -O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-의 구조를 가지며, 여기서 각각의 메틸렌 뒤의 아래첨자는 상기 구조 내에 포함된 메틸렌의 수를 나타내는데, 예를 들어 (CH2)1-6은 구조가 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개의 메틸렌을 포함할 수 있음을 의미한다. 추가적으로, 임의의 상기 스페이서 부분은 1 개 내지 20 개의 에틸렌 옥사이드 단량체 단위[즉, -(CH2CH2O)1- 20]를 포함하는 에틸렌 옥사이드 올리고머 사슬을 더 포함할 수 있다. 즉, 에틸렌 옥사이드 올리고머 사슬은 스페이서 부분의 앞에 또는 뒤에, 그리고 선택적으로 두 개 이상의 원자로 구성되는 스페이서 부분의 임의의 두 개의 원자 사이에서 생길 수 있다. 또한, 상기 올리고머가 중합체 분절에 인접하거나 단지 중합체 분절의 연장을 나타내는 것이라면, 상기 올리고머 사슬은 스페이서 부분의 일부인 것으로 고려되지 않는다.
조성물
상기 접합체는 통상적으로 조성물의 부분이다. 일반적으로, 바람직하게 필수적이지는 않지만, 상기 조성물은 복수의 접합체를 포함하고 각각의 접합체는 동일한 IL-15 부분으로 구성된다(즉, 전체 조성물 내에서, IL-15 부분의 오직 한 가지 유형만이 발견된다). 덧붙여, 상기 조성물은 다수의 접합체를 포함할 수 있고, 여기서 임의의 주어진 접합체는 둘 이상의 상이한 IL-15 부분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 부분으로 구성된다(즉, 전체 조성물 내에서, 둘 이상의 상이한 IL-15 부분이 발견된다). 그러나 선택적으로 조성물 내에서 실질적으로 모든 접합체(예를 들어, 조성물 내에서 85% 이상의 다수의 접합체)는 각각 동일한 IL-15 부분으로 구성된다.
조성물은 단일의 접합체 종(species)(예를 들어, 단일 중합체가 조성물 내에서 실질적으로 모든 접합체에 대하여 동일한 위치에서 부착된 모노PEG화된 접합체) 또는 접합체 종의 혼합물(예를 들어, 중합체의 부착이 상이한 부위에서 일어난 모노PEG화된 접합체의 혼합물 및/또는 모노PEG화된 접합체, 디PEG화된 접합체 및 트리PEG화된 접합체의 혼합물)을 포함할 수 있다. 또한 상기 조성물은 IL-15 활성을 가지는 임의의 주어진 부분에 부착된 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개 또는 그 이상의 중합체를 가지는 기타 다른 접합체를 포함할 수 있다. 덧붙여, 본 발명은 조성물이 다수의 접합체를 포함하는 경우를 포함하며, 각각의 접합체는 하나의 IL-15 부분에 공유적으로 부착된 하나의 수용성 중합체뿐만 아니라 하나의 IL-15 부분에 공유적으로 부착된 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 또는 그 이상의 수용성 중합체를 포함하는 조성물을 포함한다.
조성물 내의 접합체에 대하여, 조성물은 하나 이상의 다음 특징을 만족할 것이다: 조성물 내의 적어도 약 85%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개 내지 4 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 85%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개 내지 3 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 85%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개 내지 2 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 85%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 95%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개 내지 5 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 95%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개 내지 4 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 95%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개 내지 3 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 95%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개 내지 2 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 95%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 99%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개 내지 5 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 99%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개 내지 4 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 99%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개 내지 3 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 99%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개 내지 2 개의 중합체를 가질 것임; 조성물 내의 적어도 약 99%의 접합체는 IL-15 부분에 부착된 1 개의 중합체를 가질 것임. 중합체의 범위에 대한 언급, 예를 들어 “x 개 내지 y 개의 중합체”는 x부터 y까지를 포함한 중합체의 수를 고려(즉, 예를 들어 “1 개 내지 3 개의 중합체”는 1 개의 중합체, 2 개의 중합체 및 3 개의 중합체를 고려하고, “1 개 내지 2 개의 중합체”는 1 개의 중합체 및 2 개의 중합체를 고려, 등등)하는 것으로 이해된다. 덧붙여, IL-15 부분에 부착된 2 개 이상의 중합체를 가지는, 주어진 접합체는 또한 안정적이고 유리가능하도록 부착된 중합체의 혼합물(여기서, 적어도 중합체는 IL-15 부분에 안정적으로 부착되어 있고, 하나 이상의 중합체는 IL-15 부분에 유리가능하도록 부착되어 있음)을 가질 것으로도 간주되기도 한다.
하나 이상의 구현예에서, 접합체-함유 조성물에는 알부민이 없거나 또는 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 또한 상기 조성물에는 IL-15 활성을 가지지 않는 단백질이 없거나 또는 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 조성물에는 알부민이 85%, 보다 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 99% 없는 것이 바람직하다. 추가적으로, 상기 조성물에는 IL-15 활성을 가지지 않는 임의의 단백질이 85%, 보다 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 99% 없는 것이 바람직하다. 상기 조성물 내에 알부민이 존재하는 정도까지, 본 발명의 예시적인 조성물에는 IL-15 부분의 잔기를 알부민에 결합하는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 포함하는 접합체가 실질적으로 없다.
임의의 주어진 부분에 대한 중합체의 원하는 수의 제어는 적절한 중합체 시약, IL-15 부분에 대한 중합체 시약의 비율, 온도, pH 조건, 및 접합 반응의 기타 다른 양태를 선택함으로써 성취될 수 있다. 덧붙여, 원하지 않는 접합체(예를 들어, 4 개 이상의 부착된 중합체를 가지는 접합체)의 감소 또는 제거는 정제 수단을 통해 성취될 수 있다.
예를 들어, 중합체-IL-15 부분 접합체는 정제되어 상이한 접합된 종을 획득/분리할 수 있다. 구체적으로, 생성물 혼합물은 정제되어 IL-15 부분당 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 그 이상의 PEG, 통상적으로 IL-15 부분당 1 개, 2 개, 또는 3 개의 PEG로부터 임의의 부분의 평균을 획득할 수 있다. 최종 접합체 반응 혼합물의 정제를 위한 전략은 예를 들어 이용된 중합체 시약의 분자량, 특정 IL-15 부분, 원하는 투여 요법, 및 잔여 활성 및 개별적인 접합체(들)의 생체내 특성을 포함한 다수의 인자에 따라 다를 것이다.
원한다면, 상이한 분자량을 가지는 접합체는 겔 여과 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리할 수 있다. 다시 말하면, 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 상이한 분자량에 기초하여(차이는 본질적으로 수용성 중합체 부분의 평균 분자량에 해당함) 상이하게 번호가 매겨진 중합체 대 IL-15 부분의 비율(예를 들어, 1-머, 2-머, 3-머 등, 여기서 “1-머”는 IL-15 부분에 대한 1 개의 중합체를 나타내고, “2-머”는 IL-15 부분에 대한 2 개의 중합체를 나타낸다, 등등)을 분별한다. 예를 들어, 35,000 달톤 단백질이 약 20,000 달톤의 분자량을 가지는 중합체 시약에 무작위로 접합되는 예시적인 반응에서, 생성되는 반응 혼합물은 변형되지 않은 단백질(약 35,000 달톤의 분자량을 가짐), 모노PEG화된 단백질(약 55,000 달톤의 분자량을 가짐), 디PEG화된 단백질(약 75,000 달톤의 분자량을 가짐), 등을 포함할 수 있다.
이러한 접근법을 사용하여 PEG와 상이한 분자량을 가지는 기타 다른 중합체-IL-15 부분 접합체를 분리하는 반면, 이러한 접근법은 일반적으로 IL-15 부분 내에서 상이한 중합체 부착 부위를 가지는 위치상 이소형(positional isoform)을 분리하는데 효과적이지 않다. 예를 들어, 회수된 접합체 조성물의 각각은 IL-15 부분 내에서 상이한 반응성기(예를 들어, 리신 잔기)에 부착된 PEG(들)를 포함할 수 있지만, 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 PEG 1-머, 2-머, 3-머 등의 각각의 다른 혼합물을 분리할 수 있다.
이러한 유형의 분리를 수행하는데 적합한 겔 여과 컬럼은 GE Healthcare(영국 버킹엄셔 소재)로부터 이용가능한 SuperdexTM 및 SephadexTM 컬럼을 포함한다. 특정 컬럼의 선별은 원하는 분별 범위에 따라 다를 것이다. 용출은 일반적으로 포스페이트, 아세테이트 등과 같은 적합한 완충액을 사용하여 수행할 수 있다. 수집된 분획물은, 예를 들어 (i) 단백질 함량에 대하여 280 nm에서의 흡광도, (ii) 표준으로서 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 염색에 기초한 단백질 분석, (iii) PEG 함량에 대하여 요오드 시험(Sims et al. (1980) Anal. Biochem, 107:60-63), (iv) 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PAGE) 후 바륨 요오다이드로 염색, 및 (v) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 다수의 상이한 방법으로 분석할 수 있다.
위치상 이소형의 분리는 적합한 컬럼(예를 들어, C18 컬럼 또는 C3 컬럼, Amersham Biosciences Vydac과 같은 회사에서 시판 중임)을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하여 역상 크로마토그래피로, 또는 이온 교환 컬럼(예를 들어, GE Healthcare에서 시판 중인 SepharoseTM 이온 교환 컬럼)을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피로 수행한다. 이러한 접근법 중 하나를 사용하여 동일한 분자량을 가지는 중합체-활성제 이성질체(isomer)(즉, 위치상 이소형)를 분리할 수 있다.
상기 조성물에는 바람직하게 IL-15 활성을 가지지 않는 단백질이 실질적으로 없다. 덧붙여, 상기 조성물에는 바람직하게 기타 다른 비공유적으로 부착된 수용성 중합체 모두 실질적으로 없다. 그러나 몇몇 환경에서, 상기 조성물은 중합체-IL-15 부분 접합체 및 접합되지 않은 IL-15 부분의 혼합물을 포함할 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함한다. 원한다면, 약학적으로 허용가능한 부형제는 접합체에 첨가되어 조성물을 형성할 수 있다.
예시적인 부형제는 이에 한정되지 않지만, 탄수화물, 무기염, 항균제, 항산화제, 계면활성제, 완충액, 산, 염기, 아미노산, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.
당과 같은 탄수화물, 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 및/또는 당 중합체와 같은 유도체화 당은 부형제로서 존재할 수 있다. 구체적인 탄수화물 부형제로서는 예를 들어 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등과 같은 단당류; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등과 같은 이당류; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등과 같은 다당류; 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨(글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨, 사이클로덱스트린 등과 같은 알디톨을 포함한다.
또한 부형제로서는 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 제1인산나트륨, 제2인산나트륨, 및 이의 조합과 같은 무기염 또는 완충액을 포함할 수 있다.
또한 조성물은 미생물 성장을 방지 또는 막기 위한 항균제를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 구현예에 적합한 항균제의 제한적이지 않는 예는 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질 알코올, 염화세틸피리디늄, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 질산 페닐수은, 타이메로솔(thimersol), 및 이의 조합을 포함한다.
항산화제도 또한 상기 조성물 내에 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 방지하는 데 사용되어, 접합체 또는 제조물의 기타 다른 성분의 악화를 방지한다. 본 발명의 하나 이상의 구현예에서의 사용에 적합한 항산화제로서는 예를 들어 팔미트산아스코빌, 부틸 하이드록시아니솔, 부틸 하이드록시톨루엔, 차아인산(hypophosphorous acid), 모노티오글리세롤, 갈산프로필(propyl gallate), 아황산수소나트륨(sodium bisulfite), 소듐 포름알데히드 설폭실레이트(sodium formaldehyde sulfoxylate), 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfite), 및 이의 조합을 포함한다.
계면활성제는 부형제로서 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제는 “트윈 20” 및 “트윈 80”과 같은 폴리소르베이트, F68 및 F88(둘 다 BASF(미국 뉴저지주 플로햄 파크 소재)에서 시판 중임)과 같은 플루로닉(pluronic); 소르비탄 에스테르; 레시틴 및 기타 다른 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민(바람직하게는 리포좀 형태로 있지 않음)과 같은 인지질, 지방산 및 지방 에스테르와 같은 지질; 콜레스테롤과 같은 스테로이드; 및 EDTA, 아연 및 기타 다른 적합한 양이온과 같은 IL-15화제를 포함한다.
산 또는 염기는 상기 조성물 내에 부형제로서 존재할 수 있다. 사용할 수 있는 산의 제한적이지 않는 예로서는 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산(perchloric acid), 인산, 황산, 푸마르산, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산들을 포함한다. 적합한 염기의 예로서는 이에 한정되지 않지만, 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸마르산칼륨(potassium fumerate), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기들을 포함한다.
하나 이상의 아미노산은 본원에 기술된 조성물 중 부형제로서 존재할 수 있다. 이와 관련하여, 예시적인 아미노산으로서는 아르기닌, 리신 및 글리신을 포함한다.
상기 조성물 내에서 접합체(즉, 활성제와 중합체 시약 사이에 형성된 접합체)의 양은 다수의 인자에 따라 다양할 것이지만, 최적으로는 조성물이 단위 투약 용기(unit dose container)(예를 들어, 바이알) 내에 저장될 때 치료상으로 효과적인 용량일 것이다. 덧붙여, 약학적 제조물은 주사기 내에 수용될 수 있다. 치료상으로 효과적인 용량은 임상적으로 원하는 종점을 제공하는 양을 결정하기 위하여 접합체의 양을 증가시키면서 반복된 투여에 의해 실험적으로 결정할 수 있다.
상기 조성물 내에서 임의의 개별적인 부형제의 양은 부형제의 활성 및 조성물의 특정 수요에 따라 다를 것이다. 통상적으로, 임의의 개별적인 부형제의 최적양은 통상적인 실험을 통해, 즉 (낮은 양에서 높은 양의 범위로) 부형제의 양을 달리하면서 포함하는 조성물을 제조, 안정성 및 기타 다른 파라미터를 시험, 및 그 다음 유의한 부작용이 없는 최적의 성능을 이루는 범위를 결정함으로써 결정된다.
그러나 일반적으로 부형제는 조성물 내에 부형제의 중량으로 약 1% 내지 약 99%, 바람직하게는 중량으로 약 5% 내지 약 98%, 보다 바람직하게는 중량으로 약 15% 내지 약 95%의 양으로, 가장 바람직하게는 중량으로 30% 미만의 농도로 존재할 것이다.
기타 다른 부형제와 마찬가지로 이들 상기한 약학적 부형제는 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995)], ["Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998)], 및 [Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000]에 기술되어 있다.
상기 조성물은 모든 유형의 제형, 특히 주사에 적합한 유형, 예를 들어 재구성될 수 있는 분말 또는 동결건조물(lyophilate)뿐만 아니라 액체를 포함한다. 주사하기 전에 고체 조성물을 재구성하기에 적합한 희석제의 예로서는 정균성 주사용수(bacteriostatic water for injection), 물 내의 5% 덱스트로스, 인산완충식염수, 링거용액, 식염수, 멸균수, 탈이온수, 및 이의 조합을 포함한다. 액체 약학 조성물에 대하여, 용액 및 현탁액이 고려된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 조성물은 통상적으로 필수적이지는 않지만 주사를 통해 투여되고, 따라서 일반적으로 투여 직전에 액체 용액 또는 현탁액이다. 또한 약학적 제조물은 시럽, 크림, 연고, 정제(tablet), 파우더 등과 같은 기타 다른 형태를 취할 수 있다. 기타 다른 투여 방식, 예를 들어 폐내, 직장, 경피, 경점막, 경구, 척추 강내, 종양 내, 종양 주위, 복막 내, 피하 및 동맥 내 등을 또한 포함한다.
또한 본 발명은 본원에서 제공되는 바와 같은 접합체를 이용한 치료에 반응하는 병태를 겪는 환자에게 상기 접합체를 투여하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 환자에게 일반적으로 주사를 통해 치료적으로 유효한 양의 접합체(바람직하게는 약학 조성물의 부분으로서 제공됨)를 투여하는 단계를 포함한다. 앞서 기술한 바와 같이, 상기 접합체는 (예를 들어, 근육내로, 피하로 및 비경구로) 주사될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형 유형으로서는 특히 주사용 용액으로 준비된 것, 사용 전에 용매와 같이 사용하는 건조 분말, 주사용으로 준비된 현탁액, 사용 전에 비히클과 같이 사용하는 건조 불용성 조성물, 및 투여 전에 희석하는 에멀젼 및 액체 농축물을 포함한다.
접합체(바람직하게는 약학 조성물의 부분으로서 제공됨)를 투여하는 방법은 상기 접합체가 특정 부위에 국소화되도록 선택적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 접합체를 포함하는 액체, 겔 및 고체 제형은 발병 부위(예를 들어, 종양 내부, 종양 근처, 염증이 생긴 내부 및 염증이 생긴 부위 근처)에 수술에 의해 이식될 수 있다. 편리하게, 장기와 조직은 또한 원하는 위치가 접합체에 더 잘 노출되도록 보장하기 위해 조영될 수도 있다.
투여 방법은 접합체 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 임의의 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 당업자들은 특이적 접합체가 효과적으로 치료할 수 있는 병태들이 무엇인지를 이해한다. 예를 들어 접합체는 어떠한 병태가 발병한 환자들을 치료하기 위해 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 기타 다른 약물요법제와 함께 사용될 수 있다. 예시적인 병태로는 골수종, 신장암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 전립선암, 유방암, 혈액암, 두경부 암, 난소암 및 결장암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유리하게, 접합체는 다른 활성제 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 환자에 투여될 수 있다.
투여될 실제 용량은 피험체의 연령, 체중 및 전체적인 상태뿐만 아니라, 치료중인 병태의 심각성, 건강 관리 전문가의 판단, 그리고 투여되는 접합체에 따라서 달라질 것이다. 치료적으로 유효한 양은 당업자들에게 공지되어 있으며/있거나 관련된 참조 문서 및 문헌에 기술되어 있다. 일반적으로 치료적으로 유효한 양은 약 0.001 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 75 mg/일의 용량으로, 보다 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 용량의 범위일 것이다. 주어진 용량은, 예를 들어 임상의가 적절한 종점에 이르렀다고(예를 들어 치료, 퇴행, 부분 퇴행 등이 이루어졌다고) 결정할 때까지 주기적으로 투여될 수 있다.
임의의 주어진 접합체(또한, 바람직하게는 약학적 제조물의 부분으로서 제공됨)의 단위 복용량은 임상의의 판단, 환자의 수요 등에 따라 다양한 투여 스케줄로 투여될 수 있다. 구체적인 투여 스케줄은 당업자에게 공지되어 있거나 또는 통상적인 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 투여 스케줄은 이에 한정되지 않지만, 하루에 1 번, 일주일에 3 번, 일주일에 2 번, 일주일에 1 번, 한달에 2 번, 한달에 1 번 투여 및 이의 임의의 조합을 포함한다. 일단 임상 종점을 성취하면, 조성물의 투여는 중단시킨다.
본 발명은 이의 바람직한 특이적 구현예와 함께 기술되어 있고, 상기한 기술뿐만 아니라 후술하는 실시예는 본 발명을 예시하는 것이고 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아닌 것으로 의도됨을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서의 다른 양태, 이점 및 변형은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련된 자들에게 명백할 것이다.
본원에서 참조한 모든 논문, 서적, 특허 및 기타 다른 간행물은 참조로서 전체가 포함된다.
실험예
본 발명의 실시는 다르게 지시되지 않는다면, 유기합성, 생화학, 단백질 정제 등의 통상적인 기법을 이용할 것이고, 이는 당업계의 기술 범위 내이다. 이와 같은 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 상기한 문헌 [J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992)]을 참조한다.
다음의 실시예에서, 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대하여 정확성을 확보하기 위하여 노력하였으나, 몇몇 실험적 오차 및 편차를 고려하여야 한다. 다르게 지시되지 않는다면, 온도는 섭씨이고 압력은 해수면에서의 대기압 또는 대기압 근처이다. 하기 실시예의 각각은 본원에 기술된 하나 이상의 구현예를 수행하는 데 당업자에게 도움이 될 것으로 고려된다.
서열 번호 1의 아미노산 서열에 상응하는 재조합체 IL-15(“rhIL-15”)를 포함하는 수용액(“스톡 용액”)이 실시예들에 사용된다.
SDS-PAGE 분석 Invitrogen 겔 전기 영동 시스템(XCell SureLock Mini-Cell)을 사용하는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 시료를 분석하였다. 시료를 시료 완충액과 혼합하였다. 그 다음, 제조된 시료들을 NuPAGE Novex 예비 주조 겔 상에 로딩한 후, 약 30 분 동안 전개시켰다.
SEC- HPLC 분석 크기별 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 분석법은 접합체 조성물을 특성 규명함과 연계하여 사용될 것으로 생각된다. SEC-HPLC 분석법이 수행될 때, 이 SEC-HPLC 분석법은 Agilent 1100 HPLC 시스템(Agilent) 상에서 수행될 수 있다. 시료들은 Shodex 단백질 KW-804 컬럼(300 × 8㎜, Phenomenex)과, 인산나트륨 및 황산나트륨으로 이루어진 이동상(pH 7)을 사용하여 분석될 수 있다. 컬럼의 유속은 0.5 ㎖/분일 수 있다. 용리된 단백질과 PEG-단백질 접합체는 280 ㎚ 및 220 ㎚에서 UV를 사용하여 검출될 수 있다.
관련된 특성규명 기법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)는 또한 Agilent 1100 HPLC 시스템(Agilent) 상에서 실행될 수 있다. 시료들은 Zorbax 300SB-C3 컬럼(입도 3.5 ㎛, 150 ㎜ × 3.0 ㎜, Agilent)과, 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산(완충액 A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산(완충액 B)으로 이루어진 이동상을 사용하여 분석될 수 있다. 컬럼의 유속은 0.3 ㎖/분일 수 있다. 단백질과 PEG-단백질 접합체는 20 분에 걸쳐 선형 구배에 따라서 용리될 수 있으며, 280 ㎚에서 UV를 사용하여 검출되었다.
일반적으로 정제는 SP-HP 컬럼 상에서 10 mM 시트르산나트륨(pH 2.7)을 사용하여 수행될 수 있다. pH는 컬럼에의 접합체 결합을 최적화하도록 낮추어진다. 접합체는 이 완충액 중에서 결합되어, 0=500 mM NaCl 구배를 사용하여 용리된다.
실시예 1
CTLL -2 세포들 내 STAT5 인산화를 기반으로 한 rIL -15의 IL-15 활성 측정
분석 하루 전에 CTLL-2 세포들을 신선한 생장 배지(RPMI 1640 + 10% FBS + 10% T-STIM + 2 mM L-glut + 1 mM Na-피루베이트)에 나누어 넣었다. 분석 당일에 세포들을 적어도 4 시간 동안 분석 배지(RPMI 1640 + 1% FBS + 2 mM L-glut + 1 mM Na-피루베이트) 중에서 예비 항온처리한 다음, 이를 96-웰 평판 내 분석 배지에 50,000 세포/웰이 되도록 넣었다.
분석 직전에 적절한 완충액 중 시험 물질 희석액들을 제조하였는데, 이 시험 물질의 각각의 희석액을 CTLL-2 세포들의 별도 웰 내에서 항온 처리하였다. 그 다음, MSD Phospho(Tyr694)/Total STATa,b Whole Cell Lysate Kit(카탈로그 #K15163D, Meso Scal Diagnostics, LLC, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)를 사용하여 STAT5의 인산화를 분석하였다.
PeproTech(카탈로그 #200-15)로부터 얻은 rIL-15는, 평균 pSTAT5 EC50을 5 분에는 0.20705 ng/㎖(2 회 전개에 대한 평균값)에서 나타내고, 10 분에는 0.08187 ng/㎖에서 나타냄으로써 IL-15 활성을 나타냈다.
실시예 2
분지형 mPEG-N- 하이드록시숙신이미딜 유도체(20 kDa )를 이용한 rIL -15의 PEG화
Figure pct00037
mPEG2-ru-20K-N-하이드록실숙신이미딜 유도체, 20 kDa("mPEG2-ru-20K-NHS")
아르곤 하에 -80℃에 보관하였던 mPEG2-ru-20K-NHS를 질소로 퍼징(purging)하면서 상온까지 가온시켰다. mPEG2-ru-20K-NHS의 스톡 용액(200 ㎎/㎖)을 2 mM HCl 중에 제조한 후, mPEG2-ru-20K-NHS를 rIL-15에 첨가하였는데, 이때 mPEG2-ru-20K-NHS 대 rIL-15의 몰비는 약 5:1 내지 약 100:1 범위로 하였다. 상기 혼합물 중 rIL-15의 최종 농도는 0.5 ㎎/㎖(0.031 mM)였다. 중탄산나트륨 완충액(1 M, pH 8.0)을 상기 혼합물에 첨가하여 최종 농도 100 mM이 되도록 하였으며, 30 분 동안 접합을 진행시켜, [mPEG2-ru-20K]-[rIL-15] 접합체를 제공하였다. 30 분 후 반응 혼합물에 1 M 글리신(pH 6.0)을 첨가하여 급랭을 달성하였으며, 그 결과 최종 농도는 100 mM에 도달하게 되었다.
[mPEG2-ru-20K]-[rIL-15]의 통상 접합 생성물 프로필이 도 1에 제공되어 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이, mPEG2-ru-20K-NHS 대 rIL-15 몰비의 약 5:1(레인 3), 약 10:1(레인 4), 약 25:1(레인 5), 약 50:1(레인 6) 및 약 100:1(레인 7)로부터의 증가는, 주요 생성물로서 모노-PEG-IL-15(레인 3)로부터 디-, 트리-PEG-IL-15 및 이보다 큰 종으로의 전환을 초래한다. 별개의 모노-, 디-, 트리- 및 이보다 큰 PEG-IL-15 접합체는 정제 및 특성규명될 것이다.
일반적으로 정제는 SP-HP 컬럼 상에서 10 mM 시트르산나트륨(pH 2.7)을 사용하여 수행될 수 있다. pH는 접합체의 컬럼과의 결합을 최적화하도록 낮춘다. 접합체는 이 완충액 중에서 결합되어, 0=500 mM NaCl 구배를 사용하여 용리된다
실시예 3
mPEG2 -C2- fmoc -20K- NHS를 이용한 rIL -15의 PEG화
Figure pct00038
mPEG2-C2-fomc-20K-N-하이드록시숙신이미드 유도체, 20 kDa("mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS")
아르곤 하에 -80℃에 보관하였던 mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS를 질소로 퍼징하면서 상온까지 가온시켰다. mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS의 스톡 용액(200 ㎎/㎖)을 2 mM HCl 중에 제조한 후, mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS를 rIL-15에 첨가하였는데, 이때 mPEG2-C2-fmoc-20K-NHS 대 rIL-15의 몰비는 5:1 내지 100:1 범위로 하였다. 상기 혼합물 중 rIL-15의 최종 농도는 0.5 ㎎/㎖(0.031 mM)였다. 중탄산나트륨 완충액(1 M, pH 8.0)을 상기 혼합물에 첨가하여 최종 농도 100 mM이 되도록 하였으며, 30 분 동안 접합을 진행시켜, [mPEG2-C2-fmoc-20K]-[rIL-15] 접합체를 제공하였다. 30 분 후, 반응 혼합물에 1 M 글리신(pH 6.0)을 첨가하여 급랭을 달성하였으며, 그 결과 최종 농도는 100 mM에 도달하게 되었다. 그 다음, 빙초산을 사용하여 상기 급랭된 반응 혼합물의 pH를 4.0으로 맞추고 난 후, 컬럼 크로마토그래피 정제 및 특성규명을 수행하였다.
실시예 4
mPEG2 - CAC - fmoc -20K- NHS를 이용한 rIL -15의 PEG화
Figure pct00039
mPEG2-CAC-fmoc-20K-N-하이드록시숙신이미드 유도체, 20 kDa, ("mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS")
아르곤 하에 -80℃에 보관하였던 mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS를 질소로 퍼징하면서 상온까지 가온시켰다. mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS의 스톡 용액(200 ㎎/㎖)을 2 mM HCl 중에 제조한 후, mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS를 rIL-15에 첨가하였는데, 이때 mPEG2-CAC-fmoc-20K-NHS 대 rIL-15의 몰비는 5:1 내지 100:1 범위로 하였다. 상기 혼합물 중 rIL-15의 최종 농도는 0.5 ㎎/㎖(0.031 mM)였다. 중탄산나트륨 완충액(1 M, pH 8.0)을 상기 혼합물에 첨가하여 최종 농도 100 mM이 되도록 하였으며, 30 분 동안 접합을 진행시켜 [mPEG2-CAC-fmoc-20K]-[rIL-15] 접합체를 제공하였다. 30 분 후, 반응 혼합물에 1 M 글리신(pH 6.0)을 첨가하여 급랭을 달성하였으며, 그 결과 최종 농도는 100 mM에 도달하게 되었다. 그 다음, 빙초산을 사용하여 상기 급랭된 반응 혼합물의 pH를 4.0으로 맞추고 난 후, 컬럼 크로마토그래피 정제 및 특성규명을 수행하였다.
실시예 5
분지형 mPEG-N- 하이드록시숙신이미딜 유도체, 40 kDa를 이용한 rIL -15의 PEG화
Figure pct00040
mPEG2-ru-40K-N-하이드록시숙신이미딜 유도체, 40 kDa(mPEG2-ru-40K-NHS")
아르곤 하에 -80℃에 보관하였던 mPEG2-ru-40K-NHS를 질소로 퍼징하면서 상온까지 가온시켰다. mPEG2-ru-40K-NHS의 스톡 용액(200 ㎎/㎖)을 2 mM HCl 중에 제조한 후, mPEG2-ru-40K-NHS를 rIL-15에 첨가하였는데, 이때 mPEG2-ru-40K-NHS 대 rIL-15의 몰비는 5:1 내지 100:1 범위로 하였다. 상기 혼합물 중 rIL-15의 최종 농도는 0.5 ㎎/㎖(0.031 mM)였다. 중탄산나트륨 완충액(1 M, pH 8.0)을 상기 혼합물에 첨가하여 최종 농도 100 mM이 되도록 하였으며, 30 분 동안 접합을 진행시켜 [mPEG2-ru-40K-]-[rIL-15] 접합체를 제공하였다. 30 분 후 반응 혼합물에 1 M 글리신(pH 6.0)을 첨가하여 급랭을 달성하였으며, 그 결과 최종 농도는 100 mM에 도달하게 되었다. 그 다음, 빙초산을 사용하여 상기 급랭된 반응 혼합물의 pH를 4.0으로 맞추고 난 후, 컬럼 크로마토그래피 정제 및 특성규명을 수행하였다.
[mPEG2-ru-40K-]-[rIL-15]의 접합 생성물 프로필이 도 2에 제공되어 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, mPEG2-ru-40K-NHS 대 rIL-15 몰비의 약 5:1(레인 2), 약 10:1(레인 3), 약 25:1(레인 4), 약 50:1(레인 5) 및 약 100:1(레인 6)로부터의 증가는, PEG화된 더 작은 생성물로부터 PEG화된 더 큰 생성물로의 전환을 초래한다. 별개의 접합체들은 정제 및 특성규명될 수 있다.
실시예 6
mPEG2 -C2- fmoc -40K- NHS를 이용한 rIL -15의 PEG화
Figure pct00041
mPEG2-C2-fomc-40K-N-하이드록시숙신이미드 유도체, 40 kDa("mPEG2-C2-fmoc-40K-NHS")
아르곤 하에 -80℃에 보관하였던 mPEG2-C2-fmoc-40K-NHS를 질소로 퍼징하면서 상온까지 가온시켰다. mPEG2-C2-fmoc-40K-NHS의 스톡 용액(200 ㎎/㎖)을 2 mM HCl 중에 제조한 후, mPEG2-C2-fmoc-40K-NHS를 rIL-15에 첨가하였는데, 이때 mPEG2-C2-fmoc-40K-NHS 대 rIL-15의 몰비는 5:1 내지 100:1 범위로 하였다. 상기 혼합물 중 rIL-15의 최종 농도는 0.5 ㎎/㎖(0.031 mM)였다. 중탄산나트륨 완충액(1 M, pH 8.0)을 상기 혼합물에 첨가하여 최종 농도 100 mM이 되도록 하였으며, 30 분 동안 접합을 진행시켜 [mPEG2-C2-fmoc-40K]-[rIL-15] 접합체를 제공하였다. 30 분 후 반응 혼합물에 1 M 글리신(pH 6.0)을 첨가하여 급랭을 달성하였으며, 그 결과 최종 농도는 100 mM에 도달하게 되었다. 그 다음, 빙초산을 사용하여 상기 급랭된 반응 혼합물의 pH를 4.0으로 맞추고 난 후, 컬럼 크로마토그래피 정제 및 특성규명을 수행하였다.
이와 동일한 일반적 접근법에 따라서 mPEG2-C2-fmoc-40K-N-하이드록시숙신이미드 유도체 10 kDa형 및 20 kDa형을 사용하여 접합체를 제조하였다.
실시예 7
mPEG2 - CAC - fmoc -40K- NHS를 이용한 rIL -15의 PEG화
Figure pct00042
mPEG2-CAC-fmoc-40K-N-하이드록시숙신이미드 유도체, 40 kDa("mPEG2-CAC-fmoc-40K-NHS")
아르곤 하에 -80℃에 보관하였던 mPEG2-CAC-fmoc-40K-NHS를 질소로 퍼징하면서 상온까지 가온시켰다. mPEG2-CAC-fmoc-40K-NHS의 스톡 용액(200 ㎎/㎖)을 2 mM HCl 중에 제조한 후, mPEG2-CAC-fmoc-40K-NHS를 rIL-15에 첨가하였는데, 이때 mPEG2-CAC-fmoc-40K-NHS 대 rIL-15의 몰비는 5:1 내지 100:1 범위로 하였다. 상기 혼합물 중 rIL-15의 최종 농도는 0.5 ㎎/㎖(0.031 mM)였다. 중탄산나트륨 완충액(1 M, pH 8.0)을 상기 혼합물에 첨가하여 최종 농도 100 mM이 되도록 하였으며, 30 분 동안 접합을 진행시켜 [mPEG2-CAC-fmoc-40K]-[rIL-15] 접합체를 제공하였다. 30 분 후 반응 혼합물에 1 M 글리신(pH 6.0)을 첨가하여 급랭을 달성하였으며, 그 결과 최종 농도는 100 mM에 도달하게 되었다. 그 다음, 빙초산을 사용하여 상기 급랭된 반응 혼합물의 pH를 4.0으로 맞추고 난 후, 컬럼 크로마토그래피 정제 및 특성규명을 수행하였다.
이와 동일한 일반적 접근법에 따라서 mPEG2-CAC-fmoc-40K-N-하이드록시숙신이미드 유도체 10 kDa형 및 20 kDa형을 사용하여 접합체를 제조하였다. 이러한 부가적 제조에 있어서, 시약:rIL-15 몰비는 100:1을 사용하였으며, (빙초산을 사용하여 pH를 4.0으로 맞추기 보다는) 염화수소산으로 pH를 2.7로 맞춘 다음, 정제 및 특성규명을 수행하였다.
실시예 8
CTLL -2 세포 내 STAT5 인산화를 기반으로 한 rIL -15 접합체의 IL-15 활성 측정
분석 하루 전에 CTLL-2 세포들을 신선한 생장 배지[10% FBS, 10% T-세포 배양 보충제(카탈로그 #354115, Corning, Inc., 미국 매사추세츠주 턱스베리 소재), 2 mM L-글루타메이트, 그리고 1 mM 피루브산나트륨으로 보충된 RPMI 1640]에 나누어 넣었다. 분석 당일에 세포들을 적어도 4 시간 동안 분석 배지(1% FBS, 2 mM L-글루타메이트, 그리고 1 mM 피루브산나트륨으로 보충된 RPMI 1640) 중에서 예비 항온처리한 다음, 이를 96-웰 평판 내 분석 배지에 50,000 세포/웰이 되도록 넣었다. 분석 직전에 적절한 완충액 중 시험 물질 희석액들을 제조하였다. 25 배 시험 물질 용액을, CTLL-2 세포를 함유하는 3 개의 웰에 첨가하여 CTLL-2 세포 자극을 개시하였다. 평판들을 37℃, 5% CO2에서 10 분 동안 항온처리한 다음, 세포 용해에 의해 반응을 중지시켰다. MSD Phospo(Tyr694)/Total STATa,b Whole Cell Lysate Kit(카탈로그 #K15163D, Meso Scale Diagnostics, LLC, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)를 사용하여 세포 용해물 중 Phospo-STAT5 및 Total STAT5 단백질 수준의 검출을 실행하였다. 10 분간 처리를 수행한 후, PeproTech(카탈로그 #200-15)로부터 얻은 재조합 인간 IL-15는, CTLL-2 세포에서 STAT5 인산화를 유도함으로써 IL-15 활성(평균 EC50 0.063 +/- 0.028 ng/㎖)을 나타내었다(대조군으로 사용함). 실시예 2, 3 및 5에 따라서 제조된 접합체들을 시험하였는데, 10 분간 처리 후의 결과들을 표 4에 제공하였다.
CTLL -2 세포 내 STAT5 인산화를 기반으로 한 rIL -15 접합체들의 IL-15 활성
시험 물질 EC50(ng/㎖)
Ave ± SD n
대조군 IL-15 0.063 ± 0.028 7
안정적 결합들을 가지는 접합체들 실시예 2
(20 k, 분지형 PEG)		 모노-PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획 0.78 ± 0.004 2
모노- 및 디-PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획 0.065 1
디- 및 트리-PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획 3.62 ± 0.08 2
디-, 트리- 및 이 이상의 PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획 2.43 1
실시예 5
(40 k, 분지형 PEG)		 모노-PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획 3.25 ± 0.36 2
모노- 및 디-PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획 0.16 1
모노-, 디- 및 트리-PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획 5.84 ± 0.70 2
트리-PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획 172.3 ± 1.7 2
유리가능한 결합들을 가지는 접합체들 실시예 3
(20 k 분지형PEG)		 디-, 트리- 및 테트라-PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획 4.52 ± 2.13 2
디-, 트리- 및 테트라-PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획(유리 PEG 포함) 8.02 ± 4.81 2
*유리가능한 결합들을 가지는 접합체들은, 분획 내 임의의 유리된 중합체들의 정도에 대한 부가적인 평가를 거치지 않고 시험됨.
실시예 9
B16F10 흑색종 종양에 있어서 rIL -15 접합체의 항종양 활성 평가
생체 내 모델에서 rIL-15 접합체들의 효능을 시험 및 비교하기 위하여, 후방 배쪽 복부 영역에 마우스 전이 B16F10 흑색종 세포를 비혈청 함유 세포 배양 배지 부피 100 ㎕ 중 1 × 106 세포/㎖의 밀도로 피하 주사함으로써, 6 주령 내지 8 주령 암컷 C57BL/6 마우스에서 동계 종양들을 유도하였다. 6 일 내지 8 일의 종료시에 마우스는 종양을 약 100 ㎣까지 발달시켰다. 마우스들을 6 개의 군으로 나누었으며, 각 군은 10 마리의 동물로 이루어졌다. 표 5에 나타낸 바와 같이 각각의 군에는 상이한 시험 물질들이 할당되었다.
군 할당 및 투여 매개변수
군 시험 물질 용량
(㎎/㎏) 		투여횟수 투여경로 동물의 수
A 실시예 2에서 얻은 디- 및 트리-PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획 0.6 1 회 i.v. 10
B 실시예 5에서 얻은 모노-, 디- 및 트리-PEG-rIL-15를 포함하는 분획 0.6 1 회 i.v. 10
C 실시예 2에서 얻은 디-, 트리 및 이 이상의 PEG-rIL-15를 포함하는 분획 0.6 1 회 i.v. 10
D 실시예 3에서 얻은 모노-, 디-, 트리- 및 테트라-PEG-rIL-15 접합체들을 포함하는 분획 0.6 1 회 i.v. 10
E IL-15 0.3 하루 걸러 총 6 회 i.p. 10
F 비히클 대조군 0 1 회 i.v. 10
A군 내지 D군은 단 1 회 체중 1 ㎏ 당 0.6 ㎎만큼 rIL-15 접합체가 정맥내 주사로 투여된 마우스군에 해당하는 반면에, E군은 복막내 주사를 통해 비접합 IL-15가 하루 걸러 투여된 마우스군을 나타낸다. F군은 인산염 완충된 염수가 정맥내 주사에 의해 투여된 비히클 대조군을 나타낸다.
용량 투여 후 마우스 체중 변화와 피하 전이 흑색종 종양의 생장(1 주일에 3 회씩 디지털 캘리퍼스로 측정)에 대해 측정하였다. 매일의 임상 징후들도 모니터링하였다. 종양의 평균 부피가 1500 ㎣에 이르렀을 때(즉, 평균 종양 부피가 1500 ㎣에 이르렀을 때) 연구의 종점에 도달하였다.
평균 종양 부피 1500 ㎣에 이른 첫 번째 군은 F군(비히클 대조군 군)이었는데, 이 결과는 본 연구 13 일째 되는 날에 얻어졌다. 다른 모든 군들(즉, A군 내지 E군)은 본 연구의 종점(약 24 일)에 도달하였는데, 이때 IL-15 및 rIL-15 접합체 둘다의 종양 생장 억제 효능이 나타났다.
뿐만 아니라, 비록 비접합 IL-15 및 rIL-15 접합체에 대해 1000 ㎣에 이르렀음이 관찰되었던 종양 생장 지연은 1.5 일 내지 4.5 일의 범위였지만, 적어도 비접합 IL-15(매일 0.3 ㎎/㎏씩 총 6 회 투여)의 총 용량은 접합 rIL-15(0.6 ㎎/㎏, 1 회 투여)의 1 회 용량의 3 배에 해당하였던 것으로 보아, rIL-15 접합체는 비접합 IL-15보다 약 3 배 더 강력하였음이 확인되었다. 표 6을 참조한다.
A군 내지 F군과 연관된 종양 생장 측정치들
주입일로부터 경과된 시간(일) A군 B군 C군 D군 E군 F군
250 ㎣에 이르는 시간 11 10.5 11.4 10.5 10.6 10
500 ㎣에 이르는 시간 14.2 12.8 15.1 14 13.5 12.6
1000 ㎣에 이르는 시간 18.6 16.6 19.5 22.1 19.1 15.1
종양 부피가 2 배 되는 시간(500 ㎣) 3.2 2.3 3.7 3.5 2.9 2.6
종양 부피가 2 배 되는 시간(1000 ㎣) 4.4 3.8 4.4 8.1 5.6 2.5
250 ㎣에 대한 종양 생장 지연 1 0.5 1.4 -1 0.6
500 ㎣에 대한 종양 생장 지연 1.6 0.2 2.5 -0.1 0.9
1000 ㎣에 대한 종양 생장 지연 3.5 1.5 4.4 4.5 4
rIL-15 접합체들의 증가한 효능에 더하여, 유의적 임상 징후들(예를 들어, 체중 감소 %)는 없었다. 도 3으로 제공된 플롯에 있어서, A군 내지 F군 각각의 투여 후 체중 변화 %가 나타내어져 있다.
실시예 10
IL- 15Rα에 대한 rIL -15 접합체의 수용체 친화도
표면 플라스몬 공명법(Surface Plasmon Resonance; "SPR")을 사용하여 IL-15 및 rIL-15 접합체들의 친화도를 측정하였다. 간단히 말해서, NHS:EDC의 1:1 혼합물을 사용하여 Biacore CM5 센서 칩의 표면을 활성화하여 활성 NHS 에스테르를 생성하였다. 10 mM 아세트산나트륨(pH 4) 중에서 염소 항-인간 Fc 항체를 5 분 동안 주사하여 상기 표면에 이 항체를 공유 부착시켰다. 상기 표면에 결합된 항체들은 약 8000 RU 존재하였다. 그 다음, 임의의 잔여 NHS 에스테르를 에탄올아민으로 급랭시켰다.
PBSP 중 5 분간의 주사 단계에 의해 각각의 주사 주기 개시시, IL-15-Rα-Fc를 센서 칩 채널에 포착시켰다. 통상적으로 수용체 150 RU 내지 200 RU가 표면에 결합되었다.
rIL-15 접합체들을 PBS(0.05% Tween 20 및 0.1 ㎎/㎖ BSA 포함) 중에 10 μM로 희석하였다. 일련의 3 배 희석액들을 제조하고 나서, 이를 IL-15Rα로 코팅된 센서 칩에 주사하였다. ka 속도 및 kd 속도를 별도로 측정하여 친화도를 측정하였으며, kd 및 ka 사이의 비율을 사용하여 Kd 값을 산정하였다.
표 7에 나타낸 바와 같이, IL-15의 IL-Ra에 대한 친화도는 3.8 pM이다. 이 친화도는 모노-PEG 종을 이용할 때에는 43 pM까지 감소하였고, 디- 및 트리-PEG 종을 이용할 때에는 183 pM까지 감소하였다(모든 종들은 실시예 2에 따라서 제조됨). 효과는 40 kDa PEG를 이용하였을 때가 더 컸으며; 친화도는 모노- 및 디- 및 트리-종들을 이용하였을 때 2 nM 내지 4 nM로 감소하였고, 트리-PEG 종들을 이용하였을 때에는 9.4 nM로 감소하였다(모든 종들은 실시예 5에 따라서 제조됨).
표면 플라스몬 공명법에 의해 측정된 바와 같은, IL-15 및 이의 접합체의 IL-15Rα에 대한 친화도
시험 물질 k a
(M -1 s -1 ) 		k d (s -1 ) K d (nM)
IL-15 7.5 x 106 2.8 x 10-4 0.0038
실시예 2에서 제조된 모노-PEG-rIL-15를 포함하는 분획 1.4 x 106 6.2 x 10-4 0.043
실시예 2에서 제조된 디- 및 트리-PEG-rIL-15를 포함하는 분획 2.6 x 106 4.9 x 10-4 0.183
실시예 5에서 제조된 모노-PEG-rIL-15를 포함하는 분획 1.3 x 105 4.7 x 10-4 3.56
실시예 5에서 제조된 디- 및 트리-PEG-rIL-15를 포함하는 분획 4.6 x 105 8.8 x 10-4 1.90
실시예 5에서 제조된 트리-PEG-rIL-15를 포함하는 분획 4.2 x 105 3.9 x 10-3 9.4
SEQUENCE LISTING <110> NEKTAR THERAPEUTICS <120> CONJUGATES OF AN IL-15 MOIETY AND A POLYMER <130> SHE0506.PCT <140> PCT/US2015/023871 <141> 2015-04-01 <150> 61/974,914 <151> 2014-04-03 <160> 3 <170> PatentIn version 3. 5 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <201> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 1 5 10 15 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 20 25 30 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 35 40 45 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 50 55 60 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 85 90 95 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 100 105 110 Asn Thr Ser 115 <210> 3 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Ser

Claims (18)

  1. 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 IL-15 부분의 잔기를 포함하는 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 IL-15 부분은 유리가능한 결합을 통하여 공유적으로 부착되어 있는 것인 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 IL-15 부분은 안정적인 결합을 통하여 공유적으로 부착되어 있는 것인 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 분지형 수용성 중합체인 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥사이드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리옥사졸린 및 폴리(아크릴로일모르폴린)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중합체인 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 옥사이드)인 접합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리(알킬렌 옥사이드)는 폴리(에틸렌 글리콜)인 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)은 하이드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알케녹시, 치환된 알케녹시, 알키녹시, 치환된 알키녹시, 아릴옥시 및 치환된 아릴옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 말단 캡핑 부분으로 말단이 캡핑된 것인 접합체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 중량 평균 분자량이 약 500 달톤 내지 약 100,000 달톤의 범위인 접합체.
  10. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 IL-15 부분의 잔기의 아민기에서 공유적으로 부착되는 것인 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 수용성 중합체가 IL-15 부분의 잔기에 부착되어 있는 것인 접합체.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1 개, 2 개 또는 3 개의 수용성 중합체가 IL-15 부분의 잔기에 부착되어 있는 것인 접합체.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1 개 또는 2 개의 수용성 중합체가 IL-15 부분의 잔기에 부착되어 있는 것인 접합체.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1 개의 수용성 중합체가 IL-15 부분의 잔기에 부착되어 있는 것인 접합체.
  15. 수용성 중합체에 공유적으로 부착되어 있는 IL-15 부분의 잔기를 포함하는 접합체로서, 상기 수용성 중합체는 공유적으로 부착되기 전 N-하이드록시숙신이미딜기를 보유하는 중합체 시약인 접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 접합체와 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  17. 제16항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 접합 조건 하에서 IL-15 부분과 중합체 시약을 접촉시키는 단계를 포함하는, 접합체를 제조하는 방법.
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