KR20170004233A

KR20170004233A - 아가라제를 이용한 해조류 유래 갈락토스의 제조방법

Info

Publication number: KR20170004233A
Application number: KR1020150094302A
Authority: KR
Inventors: 홍채환; 윤나경; 전성완
Original assignee: 현대자동차주식회사
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2015-07-01
Publication date: 2017-01-11
Also published as: DE102015219343B4; CN106318994B; CN106318994A; DE102015219343A1; US20170002389A1; KR101744817B1

Abstract

본 발명은 홍조류 잔사에 효소를 처리하여 갈락토스를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 잔사 준비 단계, 효소 처리 단계, 농축 단계, 석출 단계 및 입자화 단계를 포함하는 갈락토스의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제조방법은 바이오 화학 소재 제조의 중요한 중간 물질로 활용되는 갈락토스를 산업적으로 대량 생산 가능한 공정 기술을 제공하는 효과를 가진다.

Description

아가라제를 이용한 해조류 유래 갈락토스의 제조방법 {Method for preparing galactose using agarese}

본 발명은 홍조류 잔사에 효소를 처리하여 갈락토스를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 잔사 준비 단계, 효소 처리 단계, 농축 단계, 석출 단계 및 입자화 단계를 포함하는 갈락토스의 제조방법에 관한 것에 관한 것이다.

갈락토스(galactose)는 해조류에 포함되는 홍조류 구성물질인 당류 중 하나로서, 화학반응용 원료 및 생리활성 물질 개발, 및 제약분야에 응용 시 유용한 기능성이 예상되는 매우 중요한 후보물질 중 하나이다.

이러한 갈락토스는 알도헥소스에 속하며, 천연에서는 유리 상태로 존재하는 일이 드물고, 중합체의 상태로 널리 분포한다. 분자식은 C₆H₁₂O₆이고, 녹는점은 167℃이다. 흰색 가루로 단맛이 나며, 물에 잘 녹고 결정수를 포함하는 것은 녹는점이 118℃이다. D-형, L-형의 광학 이성질체가 있으나, 천연으로는 D-형이 많이 존재한다. 일반적으로 갈락토스라고 할 때에는 D-갈락토스를 가리킨다.

현재 주로 연구되고 있는 바이오 슈가(bio sugar)로써 갈락토스 제조방법에 대한 연구는 산성 물질을 이용한 당화 기술에 집중되고 있으며, 이러한 산성 물질을 이용한 당화 기술도 아직 상업화 단계에는 이르지 못한 상황이다. 상기 산성 물질을 사용한 당화 기술은, 산성 화학물질을 사용하기 때문에 산성 화학물질을 중성 처리해야 하는 공정을 필수적으로 거쳐야 하는 단점이 있으며, 홍조류의 세포벽을 최대로 분해하기 위해 산성 물질의 농도를 높게 사용함에 따라서, 생성된 단당 바이오 슈가가 상기 산성 물질에 의해 구조가 변형되어 부산물의 생성이 증가하여 당화 수율이 오히려 낮아지는 문제점이 있다.

또한, 이러한 당화 기술을 통한 공정으로 제조된 갈락토스는 단당류로서 당화액상 상태에서 바로 입자로 얻어내는 것이 매우 어렵다는 문제가 있다. 이는 해조류에 단백질 성분 및 불순물들이 존재하기 때문이며, 동시에 산 당화 시 투입하는 산성 화학물질이 존재하기 때문이다.

그러나, 현재 해조류로부터 당화 기술을 통해 갈락토스와 같은 바이오 슈가를 제조하는 기술은, 산성 화학물질을 이용하여 해조류를 당화시키고 산성 화학물질을 중화처리 후, 발효 공정을 통하여 바이오 에탄올과 같은 연료 물질을 제조하는 연구들이 주로 이루어지고 있는 상황으로, 당화액상 상태에서 갈락토스와 같은 단당류 바이오 슈가를 바로 입자로 수득할 수 있는 입자화 제조 기술은 완성되어 있지 않다.

또한, 산성 화학물질을 이용하여 당화 기술을 통해 얻어지는 액상 물질인 댕화액에는 바이오 슈가가 함유되어 있으므로, 이를 활용하는 방법의 연구들이 진행되고 있으나, 산성 화학물질을 이용한 당화 후 잔존물인 고체상에 대한 효소 당화 연구는 매우 미흡한 편이다. 육상 식물 자원를 활용하여 당을 제조하는 공정에 필요한 셀룰라제(cellulase)에 대한 연구개발은 약 20여 년 전부터 진행이 되어, 현재 덴마크의 노보자임(novozymes)과 같은 거대 기업으로부터 상업화된 제품이 출시되어 있는 상황이나, 해조류의 갈락탄(galactna)을 분해하는 효소인 아가라제(agarase)는 상업적으로 생산이 이루어 지지 않은 상황이며, 아가라제를 화학적으로 제조하는 기술 및 방법이 개발되지 않았기 때문에 효소 당화 분야의 연구는 매우 초기 단계이다.

이러한 산성 화학물질로 당화 후 잔존하는 고체상 물질에 대한 효소 당화 기술은 산업적 가치가 매우 뛰어나며, 경제적으로 효소 제조, 이를 활용한 당화, 및 분리 정제 기술은 산업적으로 매우 중요한 실정이다.

그러나, 현재 전 세계적으로 해조류 당화 후 효소를 활용한 갈락토스 생산공정은 확립된 것이 없으며, 실험실 수준에서도 완전한 공정 개발에 대한 보고는 전무한 상태이며, 당화 처리 후 액상 상태의 물질을 분석을 통하여 액상 내 당(sugar) 성분이 어느 정도 존재하는지 분석 후 보고 하는 수준에 머물러 있다.

이에 상기 문제점을 해결하고자, 본 발명자들은 특정 단위 공정들의 연결을 통하여 홍조류 잔사로부터 효소를 사용하여 고체상태의 갈락토스 입자를 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이에, 본 발명의 목적은 홍조류를 당화공정을 수행하고 여과하여 홍조류 잔사를 얻는 제1단계; 상기 홍조류 잔사를 아가라제(agarase) 함유 용액과 반응시켜 당혼합물을 수득하는 제2단계; 상기 당혼합물을 여과하여 여과된 당혼합물을 얻는 제3단계; 상기 여과된 당혼합물을 농축하여 농축된 당혼합물을 수득하는 제4단계; 및 상기 농축된 당혼합물에 알코올을 첨가하여 갈락토스를 석출시키는 제5단계;를 포함하는, 갈락토스의 제조방법을 제공하는 것이다.

홍조류를 구성하는 세포벽 다당류는 셀룰로오즈(cellulose), 자일란(xylan), 만난(mannan), 아가(agar) 및 카라기난(carrageenan) 등이 대표적이며 셀룰로오즈는 그다지 많지 않다. 홍조류 세포벽의 외층 및 세포간격을 구성하는 점성 다당류의 주성분은 아가이다.

이러한 아가는 갈락토오스(galactose)와 3,6-안하이드로 L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, AHG)를 단위체로 하여 알파 1,3 결합(α 1,3-linkage)과 베타 1,4 결합(β 1,4-linkage)로 번갈아 가면서 연결된 중합체이다 (Kazlowski B, Pan CL, Ko YT. (2008). Separation and quantification of neoagaro and agaro-oligosaccharide products generated from agarose digestion by beta agarase and HCl in liquid chromatography systems. Carbohydrate Research, 343, 2443-2450). 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 갈락토오스가 알파 1,3-결합을 이루고 있는 단위체를 네오아가로바이오스라고 명명하며, 이 물질을 NMR 분석을 통해 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 갈락토오스로 확인한 논문이 보고된 바 있다 (Kim HT, Lee S, Lee D et al.(2009). Overexpression and molecular characterization of Aga 50D from saccharophagus degradans 2-40. Applied microbiology and biotechnology, 1432-0614 (Online)).

아가를 분해하는 능력을 가진 미생물은 1902년 그랜에 의해 해양 미생물인 바실러스 젤라티쿠스가 처음으로 보고 된 후로, 아가리보란스, 알테로모나스, 사이토파가, 마이크로뷸비퍼 등과 같은 속들이 알려져 있다 (Swartz MN, Nancy G. (1958). Agarase from an agar-digesting bacterium. Journal of bacteriology, 77, 403-409.).

사카로파거스 데그러단스 2-40은 호기성, 간균이며 감마서브그룹 프로테오 박테리움으로 아가로스를 비롯한 복잡한 다당류를 분해하는 능력이 뛰어난 균으로 알려져있다(Ekborg NA, Gonzalez JM, et al. (2005). Saccharophagus degradans gen. nov., sp. Nov.,a versatile marine degrader of complex polysaccharides. International journal of systematics and evolutionary microbiology, 55, 1545-1549.). 이 전에는 마이크로 뷸비퍼 속으로 분류되었으나 2005년 사카로파거스 데그러단스 2-40으로 정식 명명되었으며, 2008년 이 균주에 대한 유전체 서열(U.S. Department of Energy Joint Genome Institute)이 밝혀졌다 (Weiner RM, Talyor LE, Henrissat B, et al. (2008). Complete genome sequence of the complex carbohydrate -degrading marine bacterium, Saccharophagus degradans strain 2-40, PLOS Genetics, 4, e1000087).

이에, 본 발명은 홍조류를 당화공정을 수행하고 여과하여 홍조류 잔사를 얻는 제1단계; 상기 홍조류 잔사를 아가라제(agarase) 함유 용액과 반응시켜 당혼합물을 수득하는 제2단계; 상기 당혼합물을 여과하여 여과된 당혼합물을 얻는 제3단계; 상기 여과된 당혼합물을 농축하여 농축된 당혼합물을 수득하는 제4단계; 및 상기 농축된 당혼합물에 알코올을 첨가하여 갈락토스를 석출시키는 제5단계;를 포함하는 갈락토스의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명에 제1단계의 당화공정은 80 내지 150℃, 100 내지 150℃, 또는 120 내지 150℃에서 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 제1단계의 당화공정은 홍조류를 가수 분해하여 수행하는 것일 수 있으며, 또한, 상기 가수분해는 산을 0.05 내지 15 %(w/v), 0.05 내지 10 %(w/v), 0.05 내지 5 %(w/v), 0.1 내지 15 %(w/v), 0.1 내지 10 %(w/v), 0.1 내지 5 %(w/v), 0.5 내지 15 %(w/v), 0.5 내지 10 %(w/v), 0.5 내지 5 %(w/v), 1 내지 15 %(w/v), 1 내지 10 %(w/v), 또는 1 내지 5%(w/v)의 농도로 첨가하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 산은 황산(H₂SO₄), 염산(HCl), 브롬산(HBr), 질산(HNO₃), 아세트산(CH₃COOH), 포름산(HCOOH), 과염소산(HClO₄), 인산(H₃PO₄), 및 파라 톨루엔 술폰산(PTSA; para toluenesulfonic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 홍조류는 갈락토스 또는 그 중합체가 함유되어 있는 홍조류, 즉, 진두말속 (Chondrus), 유케마속 (Eucheuma), 돌가사리속(Gigartina), 개우뭇속 (Pterocladia), 히프니아속 (Hypnea), 둥근비단속 (Iridaea), 카파피쿠스속 (Kappaphycus), 우뭇가사리속 (Gellidium), 또는 꼬시래기속 (Gracilaria) 등일 수 있으며, 예를 들어, 꼬시래기, 우뭇가사리(agar) 등의 홍조류가 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 홍조류는 원초의 건조물, 원초의 수세 후 건조물, 또는 이들의 파쇄물을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 제1단계의 여과는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 또는 필터 여과에 의하여 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 실리카겔 입자는 평균직경 0.1 내지 0.5 mm, 0.1 내지 0.4 mm, 0.1 내지 0.3 mm, 또는 0.1 내지 0.2 mm 일 수 있고, 중성 성분의 다양한 물질을 사용할 수 있으며, 특정 실리카 물질에 제한되는 것은 아니다.

상기 필터는 1 내지 20 um, 1 내지 15 um, 1 내지 10 um, 3 내지 20 um, 3 내지 15 um, 3 내지 10 um, 5 내지 20 um, 5 내지 15 um, 또는 5 내지 10 um 의 기공 크기를 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제2단계는 상기 제1단계에서 얻어진 홍조류 잔사 (제1단계의 여과 후 잔존하는 고형물)를 아가라제 함유 용액과 반응시켜 홍조류 세포벽으로부터 생성되는 갈락토스(galactose)를 함유하는 당혼합물을 수득하는 단계일 수 있으며, 상기 당혼합물은 액상, 예컨대 수용액 상태일 수 있다.

이러한 아가라제와 같은 효소를 처리하여 갈락토스를 함유하는 당혼합물을 수득하는 방법은, 산성 물질 및 기타 화학물질을 사용하여 처리하여 수행하는 당화 기술에 비하여, 산성 물질을 사용하여 당화 시 투입한 산성 성분을 중화시키는 공정이 필요 없게 되어 제조비용이 대폭 저감될 수 있으며, 농축공정에서의 조업 안정성 향상되고, 농축공정의 효율성 향상을 가져오는 효과가 있다.

상기 반응은 반응 온도 30 내지 70℃, 30 내지 60℃, 40 내지 70℃, 40 내지 60℃, 또는 50℃에서 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 반응은 반응 시간 48시간 이상, 예를 들어, 48 내지 96시간, 48 내지 96시간, 48 내지 96시간, 48 내지 96시간, 또는 48 내지 96시간 동안 반응시키는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 아가라제는 아가라제 생산능을 가진 균주를 배양하는 배양 단계 및 상기 배양 단계 후 균체를 제거하는 단계를 통해 수득할 수 있다.

상기 아가라제(agarase)는 바실러스속 (Bacillus), 아가리보란스속 (Agarivorans), 알테로모나스속 (Alteromonas), 사이토파가속 (Cytophaga), 마이크로뷸비퍼속 (Microbulbifer), 사카로파거스속(Saccharophagus) 등의 아가라제 생산능을 가진 균주로부터 유래된 것일 수 있으며, 예를 들어, 해양에서 수득 가능한 균주인 사카로파거스 데그러단스 2-40(Saccharophagus degradans 2-40)로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 배양은 30 내지 40℃, 33 내지 40℃, 35 내지 40℃, 또는 37℃에서 수행할 수 있으며, 36 내지 72시간, 36 내지 66시간, 36 내지 60시간, 36 내지 52시간, 42 내지 72시간, 42 내지 66시간, 42 내지 60시간, 42 내지 52시간, 또는 48시간 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 배양은 물 1L에 인공해수 2.3%, 0.5% 암모늄 클로라이드, 50mM Tris-HCl, 및 아가(agar) 1.5%를 첨가하여 조성된 배지에서 배양되는 것일 수 있다.

상기 인공해수는, 해수의 염분을 35‰로 하고 이와 동일한 화학조성을 갖도록 제조한 용액이다. 구체적으로 제조방법은, 증류수 500ml에 23.9g NaCl, 4.0g Na₂SO₄, 0.7g NaHCO₃, 0.1g KBr, 30mg H₃BO₃ 및 3mg NaF을 녹여 용액 1을 제조하고, 455ml의 증류수에 10.8g MgCl₂ㆍ6H2O, 1.5g CaClㆍ2H₂O, 및 25mg SrCl₂ㆍ6H₂O을 녹인 용액 2를 제조한 다음, 상기 용액 1과 용액 2를 혼합하여 제조할 수 있다.

상기 제3단계는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 여과하는 제1여과 단계 및 상기 제1여과 단계 이후에 마이크로 필터를 사용하여 여과를 수행하는 제2여과 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 제1여과 단계는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 1회 이상의 반복 사이클, 예를 들어, 1 내지 10회, 1 내지 5회, 또는 1 내지 3회의 반복 사이클을 수행하여, 당혼합물 중에 포함된 입자상 불순물과 단백질 성분을 제거하는 것일 수 있다.

또한, 상기 실리카겔 입자는 평균직경 0.1 내지 0.5 mm, 0.1 내지 0.4 mm, 0.1 내지 0.3 mm, 또는 0.1 내지 0.2 mm 일 수 있고, 중성 성분의 다양한 물질을 사용할 수 있으며, 특정 실리카 물질에 제한되는 것은 아니다. 또한, 실리카겔 컬럼에 충진되는 실리카겔의 부피는 투입되는 당혼합물의 부피 대비 1/2 내지 1/5 부피비가 적절하다. 상기 용량 비율을 벗어나는 경우 분리 효율이 떨어지거나 불순물 입자의 함유량이 증대되어 최종 입자화 공정에서의 갈락토스 입자와의 혼재되는 현상이 발생하게 되는 문제점이 있다.

또한, 상기 마이크로 필터는 0.45 내지 0.9 um(마이크로미터)의 기공 크기를 가지는 것일 수 있으며, 0.45 um 보다 작은 기공 크기를 갖는 필터는 필터링 작업의 조업 안정성이 떨어져서 경제적인 공정이 되지 못하며, 0.9 um 보다 큰 기공 크기의 필터는 일부 미세 입자들이 걸러지지 않는 단점이 있어서, 최종 수득물의 순도를 떨어뜨리는 문제점이 있다.

상기 제3단계의 컬럼 내 당혼합물의 흐름속도는 0.1 내지 100 ml/min, 0.1 내지 약 80 ml/min, 0.1 내지 약 60 ml/min, 0.1 내지 약 40 ml/min, 0.1 내지 20 ml/min, 0.1 내지 10 ml/min, 0.1 내지 5 ml/min 또는 3.5 ml/min의 유속(flow rate)으로 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 대용량 규모의 상기 시스템에서는 그에 맞는 유속을 설정할 수 있다.

상기 제3단계 이후 농축을 위한 제4단계를 수행할 수 있으며, 농축 방법은 감압 증류방법을 사용할 수 있으며, 이때 사용하는 장비는 감압 증류장치로서 특수한 장치에 제한받지 않는다. 상기 제4단계에서는 제3단계에서 여과된 당혼합물의 부피 대비 약 1/10 내지 1/20 수준으로 농축을 하는 것이 적절하다.

또한, 상기 제4단계는 30 내지 60℃의 온도에서 수행할 수 있으며, 60℃를 초과하는 경우 농축되는 갈락토스 성분에 일부 변색이 발생하는 단점이 있으며, 30℃ 미만인 경우에는 공정시간이 길어지는 단점이 있다.

또한, 상기 제4단계는 10 내지 120 mbar의 압력 조건에서 수행될 수 있으며, 120 mbar를 초과하는 경우 공정 시간이 길어지는 단점이 있으며, 10 mbar 이하 조건에서는 공정 안정성이 저하되는 단점이 있다.

상기 제4단계 이후 갈락토스를 석출하기 위한 제5단계를 수행할 수 있으며, 구체적으로, 상기 농축된 당혼합물에 -10℃ 내지 25℃ 온도에서 알코올를 첨가하거나, -10℃ 내지 25℃ 온도의 알코올을 첨가하여 갈락토스 입자생성(입자화)을 유도하여 갈락토스를 석출시킬 수 있다. 석출된 갈락토스 고체입자는 감압 필터링 장비를 이용하여 수득할 수 있다.

상기 알코올은 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 및 프로판올(예를 들어, 이소프로필알콜)로 이루어진 군에서 선택된 1종이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 알코올은 농도가 10 내지 100%(v/v), 20 내지 100(v/v), 30 내지 100(v/v), 40 내지 100(v/v), 50 내지 100(v/v), 60 내지 100(v/v), 70 내지 100(v/v), 80 내지 100(v/v), 90 내지 100(v/v), 95 내지 100(v/v), 또는 98 내지 100(v/v), 예컨대, 99%(v/v) 일 수 있다. 구체예에서, 상기 알코올은 농도가 10 내지 100%(v/v), 20 내지 100(v/v), 30 내지 100(v/v), 40 내지 100(v/v), 50 내지 100(v/v), 60 내지 100(v/v), 70 내지 100(v/v), 80 내지 100(v/v), 90 내지 100(v/v), 95 내지 100(v/v), 또는 98 내지 100(v/v), 예컨대, 99%(v/v)인 메탄올, 에탄올, 및 프로판올(예를 들어, 이소프로필알콜)일 수 있다.

상기 알코올의 투입량은 상기 농축된 당혼합물의 부피의 5 내지 10배 수준이 적절하다. 5배 이하인 경우 입자석출이 원활하지 않으며, 10배 이상인 경우 과도한 사용에 따른 비용 증대가 발생하는 단점이 있다.

상기 갈락토스의 제조방법에 의하여 제조된 갈락토스는 D-갈락토스, L-갈락토스, 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 갈락토스는 흰색이고, 고형의 입자형태일 수 있다. 갈락토스를 고형의 입자형태로 수득하는 경우 이후 다른 화학 반응의 출발 물질로 갈락토스를 사용 시 계량의 용이성, 투입량의 정밀한 제어, 보관의 용이성, 부피의 감소 등의 장점이 있다. 만약 액상상태의 갈락토스를 후속 화학반응 물질의 출발물질로 사용하는 경우 상기 기술한 장점이 없어져서 제조 공정이 매우 어려워지는 문제가 있습니다.

다른 예는 상기 갈락토스 제조 방법에 의하여 제조된 갈락토스를 제공한다.

상기 갈락토스의 제조방법에 의하여 제조된 갈락토스는 D-갈락토스, L-갈락토스, 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 갈락토스는 흰색이고, 고형의 입자형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 갈락토스는 녹는점이 163 내지 170 ℃, 예컨대, 167 내지 169 ℃일 수 있다. 순수한 갈락토스의 녹는점이 167 내지 169 ℃인 것을 고려할 때, 상기 갈락토스는 순도가 80wt% 이상, 85wt% 이상, 90wt% 이상, 95wt% 이상, 96wt% 이상, 97wt% 이상, 98wt% 이상, 또는 99wt%이상인 것일 수 있다.

본 발명은 홍조류 잔사에 효소를 처리하여 갈락토스를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 잔사 준비 단계, 효소 처리 단계, 농축 단계, 석출 단계 및 입자화 단계를 포함하는 갈락토스의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제조방법은 기존의 산성 화학물질을 이용한 당화 공정에서 얻어지는 다양한 고체상 물질을 폐기처리 하지 않고, 효소 처리를 함으로서 높은 수율로 갈락토스를 수득하게 되어 산업적으로 중요한 기술을 제시하게 되며, 또한 동시에 홍조류를 재배하는 어촌 경제에도 이익이 되며, 상기 해조류가 방치됨으로써 발생하는 환경 문제도 해결할 수 있는 기술을 제공하게 된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 갈락토스 제조 공정을 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 효소 처리를 통하여 수득한 갈락토스 입자를 나타내는 사진이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

제조예 . 아가라제 함유 용액 제조 단계

해양에서 유래한 균주인 사카로퍼거스 데그라단스 2-10(Saccharophagus degradans 2-40)(입수처: ATCC(American Type Culture Collection), Manassas, VA, USA)을 배양하였다.

구체적으로, 배지 조성은 1L 물에 인공해수 (상품명: Aquarium Systems, Mentor, Ohio) 2.3%, 0.5% 암모늄 클로라이드(㈜시그마알드리치), 50mM Tris-HCl(㈜시그마알드리치), 아가(agar)(㈜시그마알드리치) 1.5% 이며, 배양 조건은 5L 발효반응기(LiFlus GM, ㈜ 바이오트론)에서 온도 35℃에서 48시간 동안 배양하였다.

배양이 완료된 후 원심분리 장치(Continent 512R, (주) 한일과학)를 이용하여 6000rpm에서 30분간 원심분리하여 사카로퍼거스 데그라단스 2-40에서 유래한 아가라제가 함유된 액상 용액 1000 ml를 수득하였다.

실시예 1. 홍조류 유래 갈락토스 제조

제1단계: 홍조류 잔사 준비 단계

전남 해안에서 채취한 홍조류 꼬시래기를 건조 후 분쇄하였다. 이후 500cc 플라스크에 증류수 350cc 및 1N HCl 용액 150cc를 투입하여 용액의 산 농도를 0.3 N HCl로 만든 후, 상기 건조 후 분쇄한 꼬시래기 25g을 투입하고, 120℃ 조건에서 4시간 동안 교반하였다. 그 다음, 교반을 중지하고 상온(25℃)에서 제류시킨 후 실리카 임자가 채워진 컬럼으로 필터링하여 홍조류 잔사 15g을 수득하였다.

제2단계: 갈락토스를 포함한 당혼합물 수득 단계

제1단계에서 수득한 홍조류 잔사 1g에 대하여 제조예에서 제조한 아가라제 함유 용액 10cc의 비율로 혼합하였다. 혼합 후, 50℃에서 48시간 동안 반응시켜 갈락토스가 포함된 당혼합물 200 cc 수득하였다.

제3단계: 여과 단계

상기 당혼합물을 평균직경 0.1 내지 0.5 mm의 중성 실리카겔 입자 100cc가 충진된 컬럼에 3.5 ml/min로 흘려주는 1차 여과단계를 수행하였다. 그 다음, 실리카겔 컬럼을 통과시킨 액상물질을 평균직경 0.45 um의 기공을 가지는 마이크로 필터를 사용하여 2차 여과를 수행하였다. 이러한 여과를 통해 고체상 물질이 제거된 액상의 당혼합물 150 ml를 수득하였다.

제4단계: 농축 및 입자화 단계( 석출단계 )

이 후, 로타리 이베이퍼레이터(IKA® RV 10 rotary evaporator)를 사용하여 배스(bath) 온도 55℃, 감압조건 90 mbar에서 농축 전 부피대비 약 1/20 수준으로 농축하였다. 이후 저온에 보관된 99%(v/v) 에탄올을 상기 농축 물질에 투입하여 입자를 석출하였다. 이때 투입한 에탄올의 함량은 농축된 물질의 부피대비 약 20배 수준이었다. 이후 석출된 입자는 감압 필터링 방법을 통하여 갈락토스 입자 10 g을 수득하였다. 수득한 갈락토스 입자의 사진을 도 2에 나타내었다.

비교예 1.

상기 실시예 1과 동일한 조건에서 제조하되, 제조예에서 제조한 아가라제 함유 용액 대신 상용 엔자임 셀룰라아제(Viscozyme; 노보자임)을 사용하여 제2단계를 수행하였다.

비교예 2.

상기 실시예 1과 동일한 조건에서 제조하되, 여과 단계를 수행하지 않고 농축 및 입자화 단계를 진행하였다.

비교예 3.

상기 실시예 1과 동일한 조건에서 제조하되, 여과 단계에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피만 수행하고 마이크로 필터 여과를 수행하지 않고, 농축 및 입자화 단계를 진행하였다

비교예 4.

상기 실시예 1과 동일한 조건에서 제조하되, 농축 후 입자화 처리 조건에서 에탄올 대신 99%(v/v) 헥산을 사용하여 입자화 처리 단계를 진행하였다. 이때 투입한 헥산 시약의 함량은 농축된 물질의 부피대비 약 20배 수준이었다.

비교예 5.

상기 실시예 1과 동일한 조건에서 제조하되, 농축 후 입자화 처리 조건에서 에탄올 대신 99%(v/v) 에틸아세테이트를 사용하여 입자화 처리 단계를 진행하였다. 이때 투입한 에틸아세테이트 시약의 함량은 농축된 물질의 부피대비 약 20배 수준이었다.

실험예 1. 갈락토스 입자 생성 여부 확인

실시예 1 및 비교예 1 내지 5에서 갈락토스 생성 여부를 확인하였다. 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.

	입자 생성 여부
실시예1	입자상 물질 생성됨
비교예1	끈적끈적한 물질 생성됨 입자상 물질 생성안됨
비교예2	끈적끈적한 물질 생성됨 입자상 물질 생성안됨
비교예3	끈적끈적한 물질 생성됨 입자상 물질 생성안됨
비교예4	끈적끈적한 물질 생성됨 입자상 물질 생성안됨
비교예5	끈적끈적한 물질 생성됨 입자상 물질 생성안됨

상기 표 1의 결과에서 볼 수 있듯이, 실시예 1의 경우 입자상 물질이 생성되었으나, 비교예 1 내지 5는 끈적끈적한 물질이 생성될 뿐, 입자상 물질이 생성되지 않았음을 확인하였다.

실험예 2. 녹는점 측정을 통한 갈락토스 생성여부 확인

실시예 1 및 비교예 1 내지 5에서 갈락토스 생성 여부를 판단하기 위해, 시차주사열량계(DSC)(미국, TA instruments)를 이용하여 녹는점(melting point)을 측정하였다.

구체적으로, 갈락토스 시약의 녹는점을 측정한 결과 167 내지 169 ℃로 측정되었으며, 실시예 1 및 비교예 1 내지 5의 녹는점을 측정하여 하기의 표 1에 나타내었다.

	녹는점 (℃)
실시예1	167
비교예1	65
비교예2	66
비교예3	50
비교예4	45
비교예5	45

상기 표 2의 결과에서 볼 수 있듯이, 실시예 1의 경우 녹는점이 167℃로 측정되어 갈락토스 시약의 녹는점인 167 내지 169℃ 범위에 포함되는바, 갈락토스가 생성된 것을 확인할 수 있었으나, 비교예 1 내지 5는 녹는점이 45 내지 65℃로 측정되어 갈락토스 시약의 녹는점 범위에 포함되지 않는바, 갈락토스가 생성되지 않은 것을 확인하였다.

Claims

홍조류를 당화공정을 수행하고 여과하여 홍조류 잔사를 얻는 제1단계;
상기 홍조류 잔사을 아가라제(agarase) 함유 용액과 반응시켜 당혼합물을 수득하는 제2단계;
상기 당혼합물을 여과하여 여과된 당혼합물을 얻는 제3단계;
상기 여과된 당혼합물을 농축하여 농축된 당혼합물을 수득하는 제4단계; 및
상기 농축된 당혼합물에 알코올을 첨가하여 갈락토스를 석출시키는 제5단계;를 포함하는, 갈락토스의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제1단계의 홍조류는 진두말속 (Chondrus), 유케마속 (Eucheuma), 돌가사리속(Gigartina), 개우뭇속 (Pterocladia), 히프니아속 (Hypnea), 둥근비단속 (Iridaea), 카파피쿠스속 (Kappaphycus), 우뭇가사리속 (Gellidium), 및 꼬시래기속 (Gracilaria)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제1단계의 당화공정은 80 내지 150℃에서 수행하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제1단계의 당화공정은 홍조류를 가수 분해하여 수행하는 것인, 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 가수 분해는 산을 0.1%(w/v) 내지 15%(w/v)의 농도로 첨가하여 수행하는 것인, 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 산은 황산(H₂SO₄), 염산(HCl), 브롬산(HBr), 질산(HNO₃), 아세트산(CH₃COOH), 포름산(HCOOH), 과염소산(HClO₄), 인산(H₃PO₄), 및 파라 톨루엔 술폰산(PTSA; para toluene sulfonic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제1단계의 여과는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 또는 필터 여과를 수행하여 여과하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 아가라제는 사카로파거스 데그러단스 2-40(Saccharophagus degradans 2-40)으로부터 유래된 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 아가라제 함유 용액은,
사카로파거스 데그러단스 2-40을 배양하는 배양 단계; 및
상기 배양 단계 후 사카로파거스 데그러단스 2-40의 균체를 제거하는 단계;를 통해 수득한 것인, 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 배양은 30 내지 40℃에서 36 내지 72시간 수행하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제3단계는,
실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 여과하는 제1여과 단계; 및
상기 제1여과 단계 이후에 마이크로 필터를 사용하여 여과를 수행하는 제2여과 단계;
를 포함하는 것인, 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 실리카겔 컬럼 크로마토그래피는 0.1 내지 0.5 mm의 평균직경을 가지는 실리카겔로 충진된 것인, 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 마이크로 필터는 0.45 내지 0.9 um의 기공 크기를 가지는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제3단계는 0.1 내지 100 ml/min의 유속(flow rate)으로 수행되는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 농축 단계는 여과된 당혼합물을 감압 증류하여 농축시키는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 농축 단계는 30 내지 60℃에서 수행하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 농축 단계는 10 내지 120 mbar의 압력 조건에서 수행하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 석출 단계는 -10℃ 내지 25℃에서 수행하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 석출 단계의 알코올은 메탄올, 에탄올, 및 프로판올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 석출 단계 후에 여과를 수행하여 갈락토스 입자를 수득하는 수득 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조방법.