CN106480128B - 一种利用乳酸和盐酸胍提高纤维素酶解水稻秸秆效率的方法 - Google Patents

一种利用乳酸和盐酸胍提高纤维素酶解水稻秸秆效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于木质纤维素利用及能源化工应用领域，公开了一种利用乳酸/盐酸胍提取半纤维素以提高水稻秸秆中纤维素酶解效率的绿色方法。本发明首先以乳酸/盐酸胍为溶剂，对水稻秸秆进行预处理，经过滤分离得到残渣，干燥后即得预处理后的水稻秸秆；以水稻秸秆残渣为底物，利用纤维素酶对其进行酶解，最后得到以葡萄糖为主的糖液。本发明不仅能有效增强水稻秸秆的酶解效率，提高了可发酵的还原糖(葡萄糖)收率，而且克服了离子液体预处理工艺成本高、环境不友好等缺点。

Description

一种利用乳酸和盐酸胍提高纤维素酶解水稻秸秆效率的方法
技术领域
本发明属于木质纤维素利用及能源化工应用领域，具体涉及一种利用乳酸/盐酸胍提取半纤维素以提高水稻秸秆中纤维素酶解效率的绿色方法。
背景技术
随着全球能源危机的爆发和环境污染的加剧，以清洁、可再生的生物质燃料和基于生物质的平台化合物替代化石能源和化石产品已受到人们的广泛关注。其中，以来源广泛、廉价、可再生的木质纤维素生物质如农业废弃物为原料生产生物燃料和相关平台化合物最具应用前景。木质纤维素生物质的主要成分为纤维素(40-50wt％)、半纤维素(20-40wt％)和木质素(15-30wt％)。因物种、来源、部位的差异，这三类生物高分子的结构和比例也有所不同。纤维素是由β-D-葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而形成的链状多晶型聚合物，其线性、有序、高聚合度的特性使其不溶于水，且较难降解。半纤维素是由多种糖单元组成的化学结构非均一的多糖，分子量相对较小、多分支、链短，易水解，最具热、化学敏感性。木质素是由苯丙烷单元以C－C键和C－O－C醚键连接而成的无定型复杂网状杂聚物，它与半纤维素以醚键和酯键等共价连结而紧密覆盖着纤维素，使其成为木质纤维素生物质酶水解和微生物降解的主要障碍。目前，木质纤维素组分的利用从第二代生物燃料的生产发展到生物质组分全利用的生物炼制产业，包括由纤维素获得可发酵单糖、纤维基材料，由半纤维素获得糠醛、糖醇等化学品，由木质素得到芳香族化合物、塑料产品以及其它衍生物。由于其天然的复杂结构特性，木质纤维素生物质具有超强的化学和生物降解抗性，故在未来的生物经济中，寻找作用于木质纤维素生物质的合适溶剂已成为可再生生物燃料和生物基高附加值化学品获得过程中的关键问题。
生物质分解为纤维素、半纤维素和木质素及其相关产品的传统预处理方法常需要极端的条件和昂贵的技术手段(Curr Opin Biotechnol,2009,20:339-347)，而后人们发现某些离子液体可作为一类“绿色”溶剂成功地用于木质纤维素生物质预处理。2002年，美国阿拉巴马大学著名科学家Rogers领导的研究组开创了利用离子液体溶解纤维素的新领域，其研究表明1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([BMIm][Cl])对纤维素具有良好的溶解性。其后，离子液体用于木质纤维素生物质的溶解和组分分离的研究得到了长足发展。总体来说，离子液体用于木质纤维素原料预处理的发展趋势主要有两方面：1)离子液体的种类向绿色、合成简便、廉价的方向扩展；2)离子液体对木质纤维素生物质组分的分离作用方式由“全溶解”到“萃取分离”的转变。但目前大部分用于木质纤维素预处理的离子液体来源不可再生、毒性大、难降解，并且相对于酸碱预处理法而言，成本较高，这也是制约其工业化应用的最大障碍。即使是可再生的[胆碱][氨基酸]离子液体，虽其合成方法相对简单、成本有所降低，且预处理可获得较高的可发酵糖收率，但仍存在一些合成过程能耗教大、效率偏低、稳定性不高、碱性强等缺点。因此，开发更为绿色、廉价的新型溶剂体系，提高木质纤维素组分的利用效率迫在眉睫。
深度共熔溶剂(DES)，是一类由季铵盐、天然碱等氢键受体和有机酸、酰胺、甘油或碳水化合物等氢键供体组成的共熔混合物。类似离子液体，DES也具有不易挥发、热稳定性高、对各种有机物和无机物溶解能力强、熔点低等优点，并且同样具有可设计性。与离子液体相比，DES的原料均为廉价、易大量获取的生物基材料，因而可完全生物降解；其合成步骤简单，仅需将两种组分在一定的温度(如80℃)下简单地搅拌混合即可获得成品，合成收率为100％，无需纯化；且无需使用溶剂、零排放，环境友好。总之，环境友好、廉价、生物相容性好的特性使DES更胜离子液体一筹。自Abbott等报道了此类新型溶剂体系以来，DES在生物催化、金属电极沉淀、天然产物萃取等方面的应用受到了越来越多的关注和研究，且DES可作为酶催化介质及其与酶分子优良的生物相容性也是其一大亮点。最值得注意的是，DES在多糖的溶解方面也表现出良好的应用前景，近来人们陆续用各种不同组分组成的DES如对纤维素、淀粉、木质素、几丁质等进行溶解研究。进而在木质纤维素生物质预处理方面，一些新的成果开始出现。如加拿大的Procentese等人，探讨了用氯化胆碱：甘油(1:2)、氯化胆碱：尿素(1:2)和氯化胆碱：咪唑(3:7)分别对玉米棒进行预处理，随后探讨其糖化效率。通过研究不同的温度(80，115，150℃)下，玉米棒回收率、结构组分变化、酶解效率和糖收率以及抑制剂的形成等因素，发现氯化胆碱/咪唑在80℃下处理玉米棒15h后，酶水解总糖收率达76％。并且，他们发现，预处理温度越高，残渣多糖降解度也越高，但总糖收率有所降低。随后，马来西亚学者Gunny等人研究了三种DES(氯化胆碱/甘油、氯化胆碱/乙二醇、氯化胆碱/苹果酸；摩尔比1:2)预处理稻壳后(115℃，3h)不经分离直接添加缓冲液稀释后，加入纤维素酶进行酶水解过程研究(DES浓度10％)，最终DNS法测定体系还原糖含量显示各种方法优劣顺序为：氯化胆碱/乙二醇>氯化胆碱/甘油>氯化胆碱/苹果酸>稀碱处理>未处理，且纤维素酶在含10％氯化胆碱/甘油或氯化胆碱/乙二醇体系中其活性可维持90％以上。最近，各种酸性DES用于木质纤维素生物质预处理开始出来，如江南大学Xu等人发现以氯化胆碱和各种有机酸如甲酸、乙酸、柠檬酸等组成的DES(两者摩尔比为1:2或1:1)进行玉米秸秆的预处理和后续的酶解及微生物丁醇发酵研究。结果发现，以氯化胆碱/甲酸(摩尔比1：2)130℃下预处理玉米秸秆3h，葡萄糖产量和得率分别为17.0g/L和99％，丁醇得率为0.17g/g总糖，生产效率达0.12g/(L·h)。关于酸性DES，最近也有印度科学家尝试新的组合，如乳酸/甜菜碱、乳酸/氯化胆碱，当以乳酸/氯化胆碱(摩尔比5:1)60℃下预处理水稻秸秆12h，60％的木质素可被提取，酶水解24h糖化率为36％。此外，作者发现若预处理过程添加5％的水，木质素提取率在以前的基础上提高22％左右。
综上可见，目前DES用于木质纤维素生物质的预处理方面报道开始展露，但并不多，从已有的报道可知它们在该方面的应用有替代离子液体的潜力，但存在以下几个缺点：(1)组成DES的有效氢键供体种类较少，主要集中在甘油、乙二醇、尿素、咪唑；(2)预处理效果好的DES主要通过去除木质素来提高纤维素酶水解得率，忽视半纤维素的作用。因此，需要在DES组分的种类和比例以及作用机理上进行选择和调整，获得更加温和、绿色的木质纤维素预处理工艺。
发明内容
为了解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种利用乳酸/盐酸胍提取半纤维素以提高水稻秸秆中纤维素酶解效率的方法，该方法可获得较高葡萄糖收率。以乳酸/盐酸胍为木质纤维素预处理溶剂，克服了传统离子液体预处理工艺环境不友好、成本较高等缺陷。同时，可通过调整氢键供体和受体的种类和比例来半纤维素去除，提高纤维素组分的糖化产率。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种利用乳酸/盐酸胍提取半纤维素以提高水稻秸秆中纤维素酶解效率的绿色方法，包括以下步骤：
(1)将水稻秸秆经干燥后，粉碎成平均粒径为150～350μm的水稻秸秆粉；
(2)以摩尔比为1:2～2:1的乳酸/盐酸胍为预处理溶剂，将质量比为1:5～1:25的水稻秸秆粉和预处理溶剂混合，于60～130℃下搅拌0.5～24小时，随后冷却至室温，加入1～3倍预处理溶剂体积的温水，过滤、洗涤滤渣，干燥后获得预处理后的水稻秸秆；
(3)称取预处理后的水稻秸秆，按照固液比为1～5mg/mL加入柠檬酸盐缓冲液，再按照6～20U/mg预处理后的水稻秸秆的比例加入商品化纤维素酶，在转速为150～250r/min以及温度为40～60℃的条件下进行反应，测定水解液中葡萄糖浓度，直至水解液中葡萄糖浓度不再变化，终止反应。
步骤(3)中所述的柠檬酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，其pH值为4.8。
步骤(3)中所述的商品化纤维素酶是来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)本发明所用的深度共熔物乳酸/盐酸胍作为溶剂预处理水稻秸秆，明显增强了水稻秸秆的酶解效率，提高了可发酵的葡萄糖收率。
(2)涉及的预处理溶剂深度共熔溶剂乳酸/盐酸胍具有低毒、可再生、可生物降解、合成工艺简便绿色、成本低廉等特点，故以该深度共熔溶剂为木质纤维素的预处理溶剂，预处理工艺环境友好、符合绿色化学发展策略，克服传统预处理工艺环境不友好、离子液体预处理工艺成本高等缺陷。
(3)本发明所涉及的酸性DES酸度不高，有机酸与盐酸胍的摩尔比不超过2：1，降低了设备要求和操作难度。
(4)本技术是通过利用乳酸/盐酸胍大量去除水稻秸秆的半纤维素组分而不是木质素组分，最终提高纤维素组分的酶水解得率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
乳酸/盐酸胍(摩尔比1:1)预处理提高水稻秸秆酶解效率
a)预处理：精确称量300mg水稻秸秆粉(将水稻秸秆经干燥后，粉碎成平均粒径为150～350μm的水稻秸秆粉)和6g摩尔比1：1的乳酸/盐酸胍深度共熔溶剂，共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流搅拌6小时；随后冷却至室温，加入6g的温水稀释、过滤，再用18g去离子水洗涤滤渣4次，滤渣经干燥后即得到预处理后的水稻秸秆。
b)酶解：精确称量上述预处理后的水稻秸秆20mg，置于50mL的三角瓶中，加入7mL柠檬酸盐缓冲液(50mmol/L,pH 4.8)和160U来源于里氏木霉的商品化纤维素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒温振荡器中反应。定时取样200μL，于100℃下处理3分钟以淬灭酶反应；离心(10000g)后，利用高效液相色谱测定葡萄糖浓度，直至水解液中葡萄糖浓度不再变化，终止反应。根据预处理前水稻秸秆中葡萄糖的理论产量，即可计算得到最终的葡萄糖收率，如表1。
表1实施例1的葡萄糖收率
Figure GDA0002235283760000061
c)水稻秸秆样品的成分分析：依据美国可再生能源部方法NREL/TP-510-42618(2008)测定，半纤维素提取率＝未处理原料中木聚糖含量×1/经乳酸:盐酸胍预处理后回收水稻秸秆样品中木聚糖含量×回收率×100％，根据测定结果计算出半纤维素提取率为87.6％。
对比例1
未经预处理的水稻秸秆酶解
精确称量20mg未经预处理的水稻秸秆粉(将水稻秸秆经干燥后，粉碎成平均粒径为150～350μm的水稻秸秆粉)，置于50mL的三角瓶中，加入7mL柠檬酸盐缓冲液(50mmol/L,pH 4.8)和160U来源于里氏木霉的商品化纤维素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒温振荡器中反应。定时取样200μL，于100℃下处理3分钟以淬灭酶反应；离心(10000g)后，利用高效液相色谱测定葡萄糖浓度，直至水解液中葡萄糖浓度不再变化，终止反应。根据预处理前水稻秸秆中葡萄糖的理论产量，即可计算得到最终的葡萄糖收率，如表2。
表2对比例1的葡萄糖收率
Figure GDA0002235283760000071
对比例2
氯化胆碱/盐酸胍(摩尔比1:1)预处理提高水稻秸秆酶解效率
a)预处理：精确称量300mg水稻秸秆粉(将水稻秸秆经干燥后，粉碎成平均粒径为150～350μm的水稻秸秆粉)和6g摩尔比1：1的氯化胆碱/盐酸胍深度共熔溶剂，共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流搅拌6小时；随后冷却至室温，加入6g的温水稀释、过滤，再用18g去离子水洗涤滤渣4次，滤渣经干燥后即得到预处理后的水稻秸秆。
b)酶解：精确称量上述预处理后的水稻秸秆20mg，置于50mL的三角瓶中，加入7mL柠檬酸盐缓冲液(50mmol/L,pH 4.8)和160U来源于里氏木霉的商品化纤维素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒温振荡器中反应。定时取样200μL，于100℃下处理3分钟以淬灭酶反应；离心(10000g)后，利用高效液相色谱测定葡萄糖浓度，直至水解液中葡萄糖浓度不再变化，终止反应。根据预处理前水稻秸秆中葡萄糖的理论产量，即可计算得到最终的葡萄糖收率，如表3。
表3对比例2的葡萄糖收率
Figure GDA0002235283760000072
c)水稻秸秆样品的成分分析：依据美国可再生能源部方法NREL/TP-510-42618(2008)测定，半纤维素提取率＝未处理原料中木聚糖含量×1/经乳酸:盐酸胍预处理后回收水稻秸秆样品中木聚糖含量×回收率×100％，根据测定结果计算出半纤维素提取率为14.4％。
对比例3
乳酸/尿素(摩尔比1:1)预处理提高水稻秸秆酶解效率
a)预处理：精确称量300mg水稻秸秆粉(将水稻秸秆经干燥后，粉碎成平均粒径为150～350μm的水稻秸秆粉)和6g摩尔比1：1的乳酸/尿素深度共熔溶剂，共同置于25mL三角瓶中，于120℃下回流搅拌6小时；随后冷却至室温，加入6g的温水稀释、过滤，再用18g去离子水洗涤滤渣4次，滤渣经干燥后即得到预处理后的水稻秸秆。
b)酶解：精确称量上述预处理后的水稻秸秆20mg，置于50mL的三角瓶中，加入7mL柠檬酸盐缓冲液(50mmol/L,pH 4.8)和160U来源于里氏木霉的商品化纤维素酶，密封后置于200r/min、50℃的恒温振荡器中反应。定时取样200μL，于100℃下处理3分钟以淬灭酶反应；离心(10000g)后，利用高效液相色谱测定葡萄糖浓度，直至水解液中葡萄糖浓度不再变化，终止反应。根据预处理前水稻秸秆中葡萄糖的理论产量，即可计算得到最终的葡萄糖收率，如表4。
表4对比例3的葡萄糖收率
Figure GDA0002235283760000081
c)水稻秸秆样品的成分分析：依据美国可再生能源部方法NREL/TP-510-42618(2008)测定，半纤维素提取率＝未处理原料中木聚糖含量×1/经乳酸:盐酸胍预处理后回收水稻秸秆样品中木聚糖含量×回收率×100％，根据测定结果计算出半纤维素提取率为15.8％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种利用乳酸和盐酸胍提高纤维素酶解水稻秸秆效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将水稻秸秆经干燥后，粉碎成平均粒径为150～350μm的水稻秸秆粉；
(2)以摩尔比1:2～2:1的乳酸/盐酸胍为预处理溶剂，将质量比为1:5～1:25的水稻秸秆粉和预处理溶剂混合，于60～130℃下搅拌0.5～24小时，随后冷却至室温，加入1～3倍预处理溶剂体积的温水，过滤、洗涤滤渣，干燥后获得预处理后的水稻秸秆；
(3)称取预处理后的水稻秸秆，按照固液比为1～5mg/mL加入柠檬酸盐缓冲液，再按照6～20U/mg预处理后的水稻秸秆的比例加入商品化纤维素酶，在转速为150～250r/min以及温度为40～60℃的条件下进行反应，测定水解液中葡萄糖浓度，直至水解液中葡萄糖浓度不再变化，终止反应。
2.根据权利要求1所述的一种利用乳酸和盐酸胍提高纤维素酶解水稻秸秆效率的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的柠檬酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，其pH值为4.8。
3.根据权利要求1所述的一种利用乳酸和盐酸胍提高纤维素酶解水稻秸秆效率的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的商品化纤维素酶是来源于里氏木霉(Trichodermareesei)的纤维素酶。
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