KR20170000760A

KR20170000760A - Sirt1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 신장전구세포로의 분화 조절 방법

Info

Publication number: KR20170000760A
Application number: KR1020160007611A
Authority: KR
Inventors: 김원; 강경표
Original assignee: 전북대학교산학협력단; 전북대학교병원
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2017-01-03
Also published as: KR101853477B1

Abstract

본 발명은 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1) 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 신장전구세포의 분화 조절 방법에 관한 것으로, 본 발명의 SIRT1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 신장전구세포의 분화유도 방법으로 제조된 신장세포 또는 신장전구세포는 조직 재생 용도로 활용될 수 있으며, SIRT1 억제제 또는 촉진제를 투여하여 신장전구세포 분화 조절용 조성물로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

SIRT1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 신장전구세포로의 분화 조절 방법 {Methods for Regulating Differentiation of kidney precursor Cells from Embryonic Stem Cells Through modulation of SIRT1 expression}

본 발명은 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1) 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 신장전구세포의 분화 조절 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 배아줄기세포의 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1) 발현을 억제시키는 단계를 포함하는 배아줄기세포로부터 신장전구세포로의 분화 억제 방법, SIRT1 발현을 촉진시키는 단계를 포함하는 배아줄기세포로부터 신장전구세포로의 분화 촉진 방법, 상기 방법으로 제작된 신장세포, 인공신장, 상기 방법으로 제작된 신장전구세포를 포함하는 신장기능 회복제 및 치료제에 관한 것이다.

SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1)은 NAD⁺ 의존적 탈아세틸효소로써 여러 단백질의 리신 잔기를 탈아세틸화하여 단백질의 기능을 조절하는 효소로 알려져 있으며(Ageing Res, Vol.1 페이지 313-326, (2002)), NAD⁺ 의존적 class Ⅲ 히스톤 탈아세틸 활성을 가진 효모의 Sir2와 가장 유사하다. 특히, Nuclear factor-kB, p53등의 전사인자에 붙어 있는 아세틸기를 잘라내어 이들의 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다 (Cancer Res, Vol.64 페이지 7513-7525, (2004); Cell, Vol.107, 페이지 149-159, (2001); Trends Endocrinol Metab, Vol.17 페이지 186-191, (2006)).

SIRT1은 유전자 발현억제와 관련 있는 크로마틴 재구성, DNA 손상 반응, 식이 제한에 동반된 수명연장 등에 관여한다(Chen et al., Science, 310:1641, 2005). 즉, SIRT1은 효모의 Sir2처럼 히스톤 탈아세틸화를 통해 크로마틴을 재구성하고 유전자의 발현을 억제하며, 히스톤 단백질 외에도 세포성장, 스트레스 반응, 내분비조절 등에 관련된 다양한 전사인자의 탈아세틸화를 유도한다. 또한, 최근 연구에 따르면 상기 SIRT1의 탈아세틸화 활성을 증가시켜 당뇨, 비만, 신경퇴행성질병 또는 노화관련질병 등에 적용하는 기술이 보고되었고, SIRT1가 PPAR-γ의 발현을 억제하여 지방세포로 분화를 억제시킨다는 연구결과가 보고되었으나(Frederic Picard et al., Nature, 429:771, 2004) , 배아줄기세포에서 SIRT1의 발현 조절에 따른 신장전구세포로의 분화조절에 대한 연구는 이루어진바 없다.

이에, 본 발명자들은 배아줄기세포에서 SIRT1의 발현 조절에 따른 신장전구세포로의 분화조절 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1)가 배아줄기세포의 신장전구세포로의 분화에 관여하며, SIRT1 발현 억제 시에 신장세포로의 분화가 억제되는 것을 확인하고, SIRT1 활성화시에 신장세포로의 분화가 촉진되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 배아줄기세포에서 지방세포로의 분화 조절방법에 대해서는 알려져 있으나, 신장전구세포로의 분화 조절 방법을 알려져있지 않다는 점에서 안출된 것으로, 본 발명은 SIRT1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 신장 전구세포로의 분화 억제 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 SIRT1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 신장 전구세포로의 분화 촉진 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제작된 신장세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제작된 신장 전구세포를 포함하는 신장기능 회복제 및 치료제를 제공하는 것이다.

상술한 본 발명의 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 배아줄기세포의 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1) 발현을 조절시키는 단계를 포함하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 조절 방법을 포함한다.

구체적으로, 바람직한 분화 조절 방법으로는 SIRT1 유전자의 발현 억제제를 처리하면 신장전구세포 분화가 억제되며, SIRT1 유전자의 발현 촉진제를 처리하면 신장전구세포 분화가 촉진된다.

상기 SIRT1 유전자의 발현 억제제는 기존에 알려진 억제제일 수 있으며, 구체적으로 서티놀 (Sirtinol; 2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide), Nicotinamide (pyridine-3-carboxamide) 및 EX527 (6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-Carbazole-1-carboxamide)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것 일 수 있다.

본 발명은 또한, SIRT1 발현 억제제가 포함된 배지에서 배아줄기세포를 배양하여 신장전구세포로 분화를 억제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 억제 방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 SIRT1 발현 억제제는 분화유도 1 내지 7일 동안 처리하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT1 발현 억제제는 서티놀 (Sirtinol; 2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide), Nicotinamide (pyridine-3-carboxamide) 또는 EX527 (6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-Carbazole-1-carboxamide)일 수 있으며, SIRT1 발현 억제제 배지에 4 내지 25 μM 농도로 첨가할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, SIRT1 발현억제로 인해 배아줄기세포의 SIX2(sine oculis homeobox homolog 2) 및 WT1(wilms tumor 1)의 mRNA 발현량이 감소하며, 이를 통해 신장전구세포로의 분화가 억제된다는 것을 알 수 있다(도 3 참조).

본 발명은 또한, SIRT1 활성 물질이 포함된 배지에서 배아줄기세포를 배양하여 신장전구세포로 분화를 촉진하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 촉진 방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 SIRT1 발현 촉진제는 분화유도 1 내지 21일 동안 처리하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 7일 동안 처리하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 SIRT1 발현 촉진제는 SRT1270(ChemCruz Biochemicals), 아데노바이러스, 렌티바이러스, BML-278(ChemCruz Biochemicals), 및 레스베라트롤(resveratrol)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 레스베라트롤(resveratrol)일 수 있다. SIRT1 발현 촉진제는 배지에 10 내지 50 μM 농도로 첨가할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, SIRT1 발현 촉진제로 인해 배아줄기세포의 SIX2(sine oculis homeobox homolog 2) 및 WT1(wilms tumor 1)의 mRNA 발현량이 증가하며, 이를 통해 신장전구세포로의 분화가 촉진된다는 것을 알 수 있다(도 3 및 도 4 참조).

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 배지는 신장전구세포 분화 유도용 배지이며, 레티노산((2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenoic acid ) 및 액티빈 A 로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 과제를 해결하기 위해 본 발명은 신장세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 과제를 해결하기 위해 본 발명은 신장 전구세포를 포함하는 신장기능 회복제 및 치료제를 제공한다.

본 발명의 SIRT1 발현 조절을 통한 배아줄기세포로부터 신장전구세포의 분화 조절 방법은 SIRT1 발현 억제제 또는 활성화 물질 처리에 따라 신장전구세포의 분화를 조절할 수 있으므로, 배아에서 SIRT1 발현 증가 또는 활성화에 따른 신장손상시 신장세포 재생과정에 관여하는 신장손상질환 연구모델로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, SIRT1 억제제를 선별하여 신장 손상시에 신장세포의 손상을 줄이거나 신장 손상후에 신장의 기능을 호전시키는 신장기능 회복제 및 치료제 등으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 배아줄기세포에서 신장전구세포로 분화하기 위한 배양 프로토콜을 나타낸 모식도이다(RA: 레티노산).
도 2는 SIRT1 단백질을 발현하는 세포(SIRT1+/+; WT)와 SIRT1 단백질을 발현하지 않는 세포(SIRT1-/-; KO)를 분화시킨 후 신장전구세포 표시자인 Six2(A)와 WT1(B)의 mRNA 발현량을 측정한 데이터이다.
도 3은 배아줄기세포에서 SIRT1 억제제인 EX527 (5-10 uM)과 SIRT1 촉진제인 레스베라트롤(10-20 uM)을 투여하였을 때 신장전구세포 표시자인 WT1(A)와 Six2(B)의 mRNA 발현량을 측정한 데이터이다.
도 4는 신장 집합관 세포에서만 특이하게 SIRT1을 억제시킨 마우스 (conditional knockout mouse: Sirt1 co/co; Hoxb7-Cre (+))와 wild-type 마우스 (Sirt1 co/co; Hoxb7-Cre (-))에서 생후 1일때에 Six2 (도4A)와 WT1 (도4 B)의 발현 위치를 측정한 면역형광염색 데이터이다.
도5는 신장 집합관 세포에서만 특이하게 Sirt1을 억제시킨 마우스 (conditional knockout mouse: Sirt1 co/co; Hoxb7-Cre (+))와 wild-type 마우스 (Sirt1 co/co; Hoxb7-Cre(-))에서 생후 1일때에 Six2 (도4A)와 WT1 (도4B)의 mRNA 발현 정도를 측정한 quantitative RT-PCR 데이터이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, SIRT1 유전자의 기능에 대해 다양한 연구가 이루어지고 있으며, SIRT1 발현이 증가하면 PPAR-γ의 발현이 억제되어 지방세포로 분화를 억제시킨다는 연구결과가 보고되었으나, 배아줄기세포에서 SIRT1의 발현 조절에 따른 신장전구세포로의 분화조절에 대한 연구는 이루어진바 없다.

본 발명은 SIRT1의 발현을 조절하여 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 조절 방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 이를 통해, SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1)가 배아줄기세포의 신장전구세포로의 분화에 관여하며, SIRT1 발현 억제에 따라 신장전구세포로의 분화가 촉진되는 것을 확인하였다. 상기 배아줄기세포의 신장전구세포 분화조절 방법을 통해 배아에서 SIRT1 발현 조절에 따른 신장질환 연구모델로 사용할 수 있는 효과가 있다.

따라서, 본 발명은 배아줄기세포에서 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1) 발현을 조절시키는 단계를 포함하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 조절방법을 포함하며, 구체적으로, 배아줄기세포를 배양하여 SIRT1 발현 억제제를 처리하여 신장전구세포로의 분화를 억제하는 방법과 SIRT1 발현 촉진제를 처리하여 신장전구세포로의 분화를 촉진하는 방법을 포함한다.

본 발명의 SIRT1는 silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1의 약자로, SIRT1 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 표시될 수 있다.

본 발명의 "줄기세포"는 각종 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖추고 있으며 자가증식 능력을 갖추고 있는 세포를 말하며, 초기 배아에서 분리한 배아 줄기세포(embryonic stem cell, ES 세포), 배아기의 원시생식세포에서 분리한 배아 생식세포(embryonic germ cell. EG 세포), 및 성체의 골수에서 분리한 다능성 성체줄기세포(multipotent adult progenitor cell, MAPC 세포)의 3종이 가장 잘 알려져 있다.

본 발명에서는 배아줄기세포로 마우스 유래 배아줄기세포를 사용하였으나, 이에 한정되지 않으며, 마우스 유래 배아 줄기세포의 구체적인 예로는, EB3 세포, E14 세포, D3 세포, CCE 세포, R1 세포, 129SV 세포 및 J1 세포 등을 들 수 있다. 또한, 배아 줄기세포, 배아 생식세포 및 다능성 성체줄기세포의 제조, 계대 및 보존에 대해서는 이미 확립되어 있는 표준적인 프로토콜(Matsui et al., Cell, 70: 841, 1992; Shamblott et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 95: 13726, 1998; 미국특허 제 6,090,622호; Jiang et al., Nature, 418: 41, 2002; 국제공개특허 01/11011)을 참조하여 이들 줄기세포를 용이하게 사용할 수 있으며, 이미 공지되어 있는 다양한 피더세포 및 배아줄기세포 배지를 사용하여 배양할 수 있다.

본 발명에서 이용가능한 세포는 배아줄기세포로 한정되지 않으며, 포유동물의 배아나 배아 줄기세포와 유사한 형질을 가지는 줄기세포를 포함한다. 이 경우 용어, "배아 줄기세포와 유사한 형질"이란, 배아줄기세포에 특이적인 표면(항원) 마커가 존재하거나, 배아 줄기세포 특이적인 유전자를 발현하거나, 또는 테라토마(teratoma) 형성 기능을 가지거나, 또는 키메라 마우스 형성능이 있는 등의 배아 줄기세포에 특이적인 세포생물학적 성질로 정의할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, EX527(6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-Carbazole-1-carboxamide)을 배아줄기세포에 처리하였을 때, Six2 및 WT1의 발현이 대조군에 비해 월등히 억제되었다(도 3 참조). 본 발명에서는 바람직하게 EX527 를 사용하였으나, SIRT1 발현을 억제할 수 있는 공지된 SIRT1 발현 억제제를 제한 없이 사용할 수 있으며, SIRT1의 단백질 합성을 저해시키는 siRNA 등 SIRT1에 대한 특이적인 서열을 합성하여 사용할 수도 있다.

SIRT1 발현 억제제는 배지에 4 ~ 25 μM 농도로, 바람직하게는 5 ~ 10 μM 농도로 첨가될 수 있으며, 5 μM 이하의 농도로 첨가될 경우 신장전구세포로의 분화 억제 효과가 없을 수 있으며, 500 μM 이상의 농도로 첨가될 경우 세포 독성이 나타나거나 농도 증가로 인한 효능의 향상이 적어 효율이 떨어지는 문제점이 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 마우스 배아줄기세포인 R1 세포를 사용하였으며, SIRT1 단백질의 발현 유무에 따라 배아줄기세포의 신장전구세포로 분화가 영향을 미치는지 확인하기 위해, SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포(SIRT1 +/+; WT)인 대조군과 SIRT1 유전자가 결여된 마우스 배아줄기세포(SIRT1 -/-; KO)를 준비하였으며, SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포에 SIRT1 억제제인 EX527을 처리하여 SIRT1 억제에 따른 신장전구세포 분화 정도를 확인하였다.

도 1은 배아줄기세포에서 신장전구세포로 분화하기 위한 배양 프로토콜을 나타낸 모식도로, 본 발명의 일실시예에서는 백혈병 억제인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF; Milipore, 미국)를 제외한 세포 배양액에 레티노산(Retinoic acid) 100 nmol/L와 액티빈 A(Activin A) 10 ng/mL를 7일 처리하여 신장전구세포로의 분화를 유도하였다.

배아줄기세포의 신장전구세포로의 분화 유도는 상기에서 설명한 것처럼, SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포(SIRT1 +/+; WT) 그룹, SIRT1 유전자가 결여된 마우스 배아줄기세포(SIRT1 -/-; KO) 그룹으로 나누어 신장전구세포로의 분화에 SIRT1가 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

본 발명에 있어서, SIRT1 발현 억제에 의해 배아줄기세포 내 SIRT1 발현억제로 인해 배아줄기세포의 SIX2(sine oculis homeobox homolog 2) 및 WT1(wilms tumor 1)의 mRNA 발현량이 억제되어 신장전구세포로의 분화가 억제되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, SIRT1의 신장전구세포 분화 억제를 조사하기 위하여, 세포 내 Six2 및 WT1의 mRNA 발현량을 PCR 방법으로 측정하였으며, 그 결과는 도2에 도시되어 있다. 도 2는 배아줄기세포의 신장전구세포로의 분화 유도시 SIRT1 발현 유무에 따른 Six2 및 WT1의 mRNA 발현 정도를 확인한 데이터로, SIRT1 +/+ 세포에서는 신장전구세포로의 분화 유도 후, Six2 및 WT1의 mRNA 발현이 증가된 반면, SIRT1 -/- 세포에서는 Six2 및 WT1의 mRNA 발현 현저히 억제되는 것을 확인하였다.

상기 SIRT1 유전자의 발현 촉진제는 기존에 알려진 촉진제일 수 있으며, 구체적으로 SRT1270(ChemCruz Biochemicals), Sirt1 과발현 바이러스(아데노바이러스 또는 렌티바이러스), BML-278 (ChemCruz Biochemicals), 또는 레스베라트롤(resveratrol)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 레스베라트롤일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 레스베라트롤을 20μM 처리하였을 때, Six2 및 WT1의 발현이 대조군에 비해 월등히 촉진되었으며, 그에 따라 신장전구세포로의 분화가 촉진됨을 확인하였다(도 3 참조). 본 발명에서는 바람직하게 레스베라트롤을 사용하였으나, SIRT1 발현을 촉진할 수 있는 공지된 SIRT1 발현 촉진제를 제한 없이 사용할 수 있으며, SIRT1의 단백질 합성을 촉진시키는 RNA 등 SIRT1에 대한 특이적인 서열을 합성하여 사용할 수도 있다.

SIRT1 발현 촉진제는 배지에 5 ~ 50 μM 농도로, 바람직하게는 10 ~ 20 μM 농도로 첨가될 수 있으며, 5 μM 이하의 농도로 첨가될 경우 신장전구세포로의 분화 억제 효과가 없을 수 있으며, 400 μM 이상의 농도로 첨가될 경우 세포 독성이 나타나거나 농도 증가로 인한 효능의 향상이 적어 효율이 떨어지는 문제점이 있을 수 있다.

상기 SIRT1 유전자 발현 촉진제 또는 억제제는 배아줄기세포 분화유도 1 내지 21일 동안 처리하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 7일 동안 처리하는 것일 수 있다. 만약 1일보다 짧은 기간동안 처리할 경우, 신장전구세포의 분화 촉진 또는 억제 효과가 유효하게 나타나지 않을 수 있으며, 21일보다 긴 기간동안 처리할 경우, 세포독성을 나타내어 세포사멸을 일으킬 수 있다.

도 3은 배아줄기세포에서 SIRT1 억제제인 EX527 (5-10 uM)과 SIRT1 촉진제인 레스베라트롤(10 내지 20 uM)을 투여하였을 때 신장전구세포 표시자인 WT1(A)와 Six2(B)의 mRNA 발현량을 측정한 데이터이다. 상기한 바와 마찬가지로 SIRT1 억제제를 투여한 경우에 Six2 및 WT1 mRNA 발현량이 현저히 감소함을 확인할 수 있었고, SIRT1 발현 촉진제인 레스베라트롤을 투여한 경우에 Six2 및 WT1 mRNA 발현량이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.

도4A와 도4B에서 wild-type 마우스 (Sirt1 co/co; Hoxb7-Cre (-))에서 생후 1일때에 Six2 및 WT1의 발현이 증가하였지만, 신장 집합관 세포에서만 특이하게 Sirt1을 억제시킨 마우스 (conditional knockout mouse: Sirt1 co/co; Hoxb7-Cre (+))에서 Six2 및 WT1의 발현이 감소하였다. 이는 SIRT1 억제시에 신장전구세포의 분화를 억제할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 조절방법은 또한, SIRT1 발현조절 물질이 포함된 배지에서 신장전구세포로 분화를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포로부터 신장전구세포로의 분화 조절 방법을 포함하며, 상기 SIRT1 발현조절 물질은 SIRT1 발현 억제제 또는 발현 촉진제이며, 분화유도 1 내지 21일 동안 처리하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 7일 동안 처리하는 것일 수 있다.

본 발명의 배아줄기세포에서 유도된 신장전구세포를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 조성물은 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해 제제화할 수 있고, 구조체 자체 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 통상의 약학적 제제, 예를 들면 액제, 연고, 에멀젼, 겔, 크림제, 페이스트제 등의 다양한 제형으로 제제화할 수 있다. 본 발명 조직 재생용 치료제의 투여량에 특별한 제한은 없으나, 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병이나 상태의 정도, 약물형태 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 신장전구세포로부터 유래된 신장세포를 제공한다.

본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 신장전구세포를 함유하는 신장기능 회복제 또는 치료제를 제공한다.

본 발명의 신장기능 회복제 또는 치료제는 손상된 신장세포를 보충(재생)하거나 다시 구축(복원)한다. 상기 치료제는 바람직하게는 세포 치료제일 수 있다.

"재생(regeneration)"이란 형성된 기관 또는 개체의 일부가 상실되었을 때 그부분이 보충되는 현상이고, "복원"이란 "재구성(reconstitution)"이라고도 할 수 있는데, 이는 조직의 재구축을 의미하는 것으로 일단 해리된 세포나 조직으로부터 조직이나 기관을 다시 구축하는 것을 말한다.

이는 신장세포나 이를 함유하는 상기 조성물(세포치료제)의 형태로 병변 부위에 직접 이식함으로써 유리하게 수행될 수 있다. 신경 이식 및 세포 배양의 방법은 당업자에게 널리 알려진 공지의 방법 또는 본 발명의 실시예에 기재된 방법을 사용할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 치료학적 처치 및 예방 또는 방지 수단이다. 즉, 치료가 필요한 자들은 이미 신장기능 장애를 가진 자를 포함한다. 본 발명의 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 사람, 영장류 및 가축, 사육, 애완용 또는 스포츠 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 치료가 필요한 임의의 포유동물을 치료하는 데 사용할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 세포의 "치료학적 유효량"은 분화된 신장세포의 손실, 손상 또는 변성에 의해 유발되는 환자의 생리학적 효과를 중지 또는 경감시키기에 충분한 양이다.

사용된 세포의 치료학적 유효량은 환자의 필요성, 환자의 연령, 생리학적 상태 및 건강, 소정의 치료 효과, 치료에 표적하고자 하는 조직의 크기 및 면적, 병변의 정도 및 선택된 전달 경로에 의존할 것이다. 예를 들면, 뇌의 더 큰 영역에 영향을 주는 장애의 치료는 보다 작은 표적 영역과 비교하였을 때 치료 효과를 달성하기 위하여 보다 다수의 세포를 요할 수 있다. 또한, 세포는 저 세포 투여량의 다중 소형 이식편으로 소정의 표적 조직내 1 이상의 부위에 투여할 수 있다. 본 발명의 세포는 이식 전에 완전히 분리되어, 예컨대 단일 세포의 현탁액을 형성하거나, 또는 이식 전에 거의 완전히 분리되어, 예컨대 세포의 소형 응집물을 형성할 수 있다. 세포는 이들을 소정의 조직 부위로 이식 또는 이동시키고, 기능적으로 결핍된 영역을 재구성 또는 재생하는 방식으로 투여할 수 있다.

치료학적으로 유효하게 달성하도록 투여할 수 있는 세포의 적당한 범위는 당업자의 통상의 지식 내에서 환자에 맞추어 적절히 사용할 수 있다.

그러나, 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

마우스 배아줄기세포 분비 및 배양

본 발명에서는 마우스 배아줄기세포인 R1 세포를 ATCC (American Type Culture Collection; ATCC SCRC-1011)로 부터 구입하여 사용하였으며, SIRT1 단백질의 발현 유무에 따라 배아줄기세포의 신장전구세포로 분화가 영향을 미치는지 확인하기 위해, SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포(SIRT1 +/+; WT)인 대조군과 SIRT1 유전자가 결여된 마우스 배아줄기세포(SIRT1 -/-; KO)를 준비하였다(Han MK et al., Cell Stem Cell., Mar 6:2(3):241, 2008).

마우스배아줄기세포는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에 2 mM GlutaMAX™(Gibco, 미국), 비필수 아미노산 (1X Non-essential amino acid, 1X NEAA; Gibco, 미국), 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올 (β-mercaptoethanol; Invitrogen, 미국) 및 1,000unit/㎖ 백혈병억제인자 (Leukemia Inhibitory Factor, LIF; Milipore, 미국)를 넣어 배양하였다.

마우스 배아줄기세포의 신장전구세포로의 분화 유도

본 발명에서는 SIRT1 단백질의 발현 유무에 따라 배아줄기세포의 신장전구세포로 분화가 영향을 미치는지 확인하기 위해, 실시예 1에서 준비한 SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포(SIRT1 +/+; WT) 및 SIRT1 유전자가 결여된 마우스 배아줄기세포(SIRT1 -/-; KO)의 신장전구세포로의 분화를 유도하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이 배아줄기세포에서 신장전구세포로 분화하기 위한 배양 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다. 백혈병 억제인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF; Milipore, 미국)를 제외한 세포 배양액에 레티노산(Retinoic acid) 100 nmol/L와 액티빈 A (Activin A) 10 ng/mL를 처리한 후에 신장전구세포인 Six2와 WT1의 mRNA 발현량 발현량을 측정하였다. 신장전구세포로 유도화는 과정은 6웰 플레이트 (6-well plate)를 사용하여 각 웰에 배아줄기세포를 접종하여 배양하였다.

상기 신장전구세포분화를 위한 배지는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에 2 mM Gluta MAXTM(Gibco, 미국), 비필수 아미노산(1X Non-essential aminoacid, 1X NEAA; Gibco, 미국), 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol; Invitrogen, 미국) 및 1,000 unit/ml 백혈병 억제인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF; Milipore, 미국)를 넣어 배양하였다.

mRNA 발현량을 통한 배아줄기세포의 신장전구세포로의 분화 확인

SIRT1 단백질의 발현 유무에 따라 배아줄기세포의 신장전구세포로 분화를 확인하기 위해, 실시예 1에서 준비한 SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포(SIRT1 +/+; WT) 및 SIRT1 유전자가 결여된 마우스 배아줄기세포(SIRT1 -/-; KO)의 신장전구세포로의 분화를 확인하였다. 분화는 신장전구세포 표시자인 Six2와 WT1의 mRNA 발현량을 통해 확인하였다.

신장전구세포로의 분화 단계에서 신장전구세포 표시자인 Six2와 WT1의 mRNA 발현량을 PCR 방법으로 측정하였다. PCR 수행에 사용한 각 프라이머는 하기 표 1과 같으며, 바이오니아(한국)에 의뢰하여 제조하였다. GAPDH는 PCR의 신뢰성을 위한 대조군으로 사용하였다.

프라이머 염기서열

프라이머		염기서열(5' ->3')		Tm(℃)
Six2	Forward	CAAGGAAAGGGAGAACAGCGA	서열번호 2	60
	Reverse	GCGTCTTCTCATCCTCGGAA	서열번호 3	60
WT1	Forward	ATCCCAGGCAGGAAAGTGTG	서열번호 4	60
	Reverse	GTGCTGTCTTGGAAGTCGGA	서열번호 5	60
GAPDH	Forward	AGGTCGGTGTGAACGGATTTG	서열번호 6	60
	Reverse	GGGGTCGTTGATGGCAACA	서열번호 7	60

실시예 2와 동일한 방법으로 배아줄기세포에서 신장전구세포로의 분화를 유도하였으며, 분화 유도 11일에 각 세포를 수득(harvest)한 다음, TRIzol reagent (Life Technology, 미국)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 cDNA 합성키트(Roche, 독일)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, SIRT1 -/- 세포에서는 신장전구세포로의 분화 유도 후, Six2 및 WT1의 mRNA 발현이 억제된 것을 확인한 반면, SIRT1 +/+ 세포에서는 Six2 및 WT1의 mRNA 발현 현저히 증가한 것을 확인하였다.

즉, SIRT1의 발현을 억제하면 배아줄기세포에서 신장전구세포로의 분화 시, 세포내 Six2 및 WT1의 mRNA 발현이 감소되어 신장전구세포로의 분화가 억제되는 것을 확인하였으며, 이는 SIRT1의 발현을 억제시키면, 배아줄기세포의 신장전구세포로의 분화가 억제된다는 것을 의미한다.

SIRT1억제와 활성화를 통한 배아줄기세포의 신장전구세포로의 분화 조절 확인

SIRT1 단백질의 발현 억제 또는 자극에 따라 배아줄기세포의 신장전구세포로 분화를 확인하기 위해, 실시예 1에서 준비한 SIRT1 유전자 발현되는 마우스 배아줄기세포(SIRT1 +/+; WT) 에서 신장전구세포로의 분화를 확인하였다. 분화는 신장전구세포 표시자인 Six2와 WT1의 단백질 발현량을 통해 확인하였다.

신장전구세포로의 분화 단계에서 신장전구세포 표시자인 Six2와 WT1의 mRNA발현량을 quantitative PCR으로 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, WT1 mRNA 발현량(A)과 Six2의 mRNA 발현량(B)이 SIRT1 억제제 투여시에 감소 발현됨을 알 수 있으며, SIRT1발현을 자극시키는 레스베라트롤 투여시에 Six2 와 WT1 mRNA 발현이 증가되고 있음을 알 수 있다. 이는 SIRT1 단백질의 발현이 증가된 상태에서 신장전구세포로의 분화가 촉진된다는 것을 의미한다.

SIRT1 발현 억제 시, 신장전구세포로의 분화 확인

SIRT1 단백질을 신장의 집합관 세포에서만 특이하게 억제하여 출생한지 1일째된 마우스 태아신장 (conditional knockout mouse: Sirt1 co/co; Hoxb7-Cre (+))에서 Six2와 WT1의 단백질 발현 변화를 관찰하였다.

Six2와 WT1의 단백질 발현 변화는 면역형광염색법을 통해 측정하였다. 면역화학염색을 실시하기 위해서 임신한 쥐의 신장이나 태생 0일의 쥐의 신장을 획득하여 4% paraformaldehyde으로 6시간 고정한 후에 10 mm의 두께로 잘라서 염색에 이용하였다. 항체는 Anti-Six2 (Abcam; ab68908, 켐브리지, 영국), Anti- WT1 (Abcam; 켐브리지, 영국) 상은 Zeiss Z1 microscope와 a Zeiss LSM 510 confocal microscope (칼자이스, 독일)을 사용하였다.

그 결과, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, SIRT1 단백질을 신장의 집합관 세포에서만 특이하게 억제한 그룹은 억제하지 않은 그룹에 비해 신장전구세포로의 분화가 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이는 SIRT1이 결손되어 mRNA 또는 단백질이 발현되지 않을 때에도 신장전구세포로의 분화가 억제될 수 있음을 의미한다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Methods for Regulating Differentiation of kidney precursor Cells from Embryonic Stem Cells Through modulation of SIRT1 expression <130> 1042837 <150> KR 2015/0089783 <151> 2015-06-24 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2214 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sirt1 gene <400> 1 atggcggacg aggtggcgct cgcccttcag gccgccggct ccccttccgc ggcggccgcc 60 atggaggccg cgtcgcagcc ggcggacgag ccgctccgca agaggccccg ccgagacggg 120 cctggcctcg ggcgcagccc gggcgagccg agcgcagcag tggcgccggc ggccgcgggg 180 tgtgaggcgg cgagcgccgc ggccccggcg gcgctgtggc gggaggcggc aggggcggcg 240 gcgagcgcgg agcgggaggc cccggcgacg gccgtggccg gggacggaga caatgggtcc 300 ggcctgcggc gggagccgag ggcggctgac gacttcgacg acgacgaggg cgaggaggag 360 gacgaggcgg cggcggcagc ggcggcggca gcgatcggct accgagacaa cctcctgttg 420 accgatggac tcctcactaa tggctttcat tcctgtgaaa gtgatgacga tgacagaacg 480 tcacacgcca gctctagtga ctggactccg cggccgcgga taggtccata tacttttgtt 540 cagcaacatc tcatgattgg caccgatcct cgaacaattc ttaaagattt attaccagaa 600 acaattcctc cacctgagct ggatgatatg acgctgtggc agattgttat taatatcctt 660 tcagaaccac caaagcggaa aaaaagaaaa gatatcaata caattgaaga tgctgtgaag 720 ttactgcagg agtgtaaaaa gataatagtt ctgactggag ctggggtttc tgtctcctgt 780 gggattcctg acttcagatc aagagacggt atctatgctc gccttgcggt ggacttccca 840 gacctcccag accctcaagc catgtttgat attgagtatt ttagaaaaga cccaagacca 900 ttcttcaagt ttgcaaagga aatatatccc ggacagttcc agccgtctct gtgtcacaaa 960 ttcatagctt tgtcagataa ggaaggaaaa ctacttcgaa attatactca aaatatagat 1020 accttggagc aggttgcagg aatccaaagg atccttcagt gtcatggttc ctttgcaaca 1080 gcatcttgcc tgatttgtaa atacaaagtt gattgtgaag ctgttcgtgg agacattttt 1140 aatcaggtag ttcctcggtg ccctaggtgc ccagctgatg agccacttgc catcatgaag 1200 ccagagattg tcttctttgg tgaaaactta ccagaacagt ttcatagagc catgaagtat 1260 gacaaagatg aagttgacct cctcattgtt attggatctt ctctgaaagt gagaccagta 1320 gcactaattc caagttctat accccatgaa gtgcctcaaa tattaataaa tagggaacct 1380 ttgcctcatc tacattttga tgtagagctc cttggagact gcgatgttat aattaatgag 1440 ttgtgtcata ggctaggtgg tgaatatgcc aaactttgtt gtaaccctgt aaagctttca 1500 gaaattactg aaaaacctcc acgcccacaa aaggaattgg ttcatttatc agagttgcca 1560 ccaacacctc ttcatatttc ggaagactca agttcacctg aaagaactgt accacaagac 1620 tcttctgtga ttgctacact tgtagaccaa gcaacaaaca acaatgttaa tgatttagaa 1680 gtatctgaat caagttgtgt ggaagaaaaa ccacaagaag tacagactag taggaatgtt 1740 gagaacatta atgtggaaaa tccagatttt aaggctgttg gttccagtac tgcagacaaa 1800 aatgaaagaa cttcagttgc agaaacagtg agaaaatgct ggcctaatag acttgcaaag 1860 gagcagatta gtaagcggct tgagggtaat caatacctgt ttgtaccacc aaatcgttac 1920 atattccacg gtgctgaggt atactcagac tctgaagatg acgtcttgtc ctctagttcc 1980 tgtggcagta acagtgacag tggcacatgc cagagtccaa gtttagaaga acccttggaa 2040 gatgaaagtg aaattgaaga attctacaat ggcttggaag atgatacgga gaggcccgaa 2100 tgtgctggag gatctggatt tggagctgat ggaggggatc aagaggttgt taatgaagct 2160 atagctacaa gacaggaatt gacagatgta aactatccat cagacaaatc ataa 2214 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> six2 forward primer <400> 2 caaggaaagg gagaacagcg a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> six2 reverse primer <400> 3 gcgtcttctc atcctcggaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WT1 forward primer <400> 4 atcccaggca ggaaagtgtg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WT1 reverse primer <400> 5 gtgctgtctt ggaagtcgga 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 6 aggtcggtgt gaacggattt g 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 7 ggggtcgttg atggcaaca 19

Claims

배아줄기세포의 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog; sirtuin 1) 발현을 조절하는 단계를 포함하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 조절 방법.
배아줄기세포에 SIRT1 발현 억제제를 처리하여 신장전구세포로의 분화를 억제시키는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 억제 방법.
제2항에 있어서, 상기 SIRT1 발현 억제제는 배양 초기인 1 내지 21일 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 억제 방법.
제2항에 있어서, 상기 SIRT1 발현 억제제는 서티놀 (Sirtinol; 2-[(2-Hydroxynaphthalen-1-ylmethylene)amino]-N-(1-phenethyl)benzamide), Nicotinamide (pyridine-3-carboxamide) 및 EX527 (6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-Carbazole-1-carboxamide)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 억제 방법.
제2항에 있어서, 상기 SIRT1 발현억제로 인해 배아줄기세포의 SIX2 (sine oculis homeobox homolog 2) 및 WT1 (Wilms tumor 1)의 mRNA 발현량이 감소하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 억제 방법.
배아줄기세포에 SIRT1 발현 촉진제를 처리하여 신장전구세포로의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 촉진 방법.
제6항에 있어서, 상기 SIRT1 발현 촉진제는 인터페론 베타-1a(interferon beta-1a), 인터페론 베타-1b(interferon beta-1b), cGMP(cyclic guanosine monophosphate), 아디포넥틴(adiponectin), 피루베이트(pyruvate), 2-데옥시글루코오스(2-deoxyglucose), SRT1270, 아데노바이러스, 렌티바이러스, BML-278, 및 레스베라트롤(resveratrol)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 촉진 방법.
제6항에 있어서, 상기 SIRT1 발현 촉진제는 분화유도 1 내지 21일 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 배아줄기세포의 신장전구세포 분화 촉진 방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 신장전구세포를 함유하는 신장기능 회복제 또는 치료제.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 신장전구세포로부터 유래된 신장세포.