KR20160144442A - 배설물에서 기생충 충란을 정량화하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 환경 샘플에서, 특별히 배설물 샘플에서 기생 연충류 충란의 존재 또는 부재를 결정하는 방법 및 키트에 관한 것이다. 이러한 방법은 충란 포획 방법 및 충란 검출을 위한 N-아세틸-D-글루코사민 특이적 리간드의 사용을 포함한다.

Description

배설물에서 기생충 충란을 정량화하는 방법{METHOD FOR THE QUANTIFICATION OF PARASITE EGGS IN FECES}
본 발명은 동물 기생충 축적량에 대한 진단, 및 더욱 특별히 배설물에서 기생충 충란의 수를 정량화하는 방법에 관한 것이다.
우선권 주장
본원은 2014년 10월 3일자로 출원된 미국 가출원 제62/059,262호 및 2014년 4월 10일자로 출원된 미국 가출원 제61/977,754호를 우선권 주장한다.
가장 낙관적인 시나리오 하에서 조차도, 1999년 내지 2050년 사이에 육류 생산만해도 2배가 요구되어, 전세계적 오염은 21세기에 계속 커질 것으로 예상된다(UN, 2004)[스타인펠트(Steinfeld) 등, 2006]. 이러한 요구를 충족시키는데 있어서의 한가지 주된 장애물은 내부 연충류 기생충에 의한 동물의 감염이고, 이는 근본적으로 전세계 모든 농장 동물에서 아주 흔한 일이다.
연충류 기생충은 촌충(taxa cestode), 선충(nematode), 흡충(trematode) 및 단생목 흡충(monogenean)을 비롯한 벌레-모양 동물의 다계통성 그룹이다. 많은 연충류 기생충은 소화계를 통해, 우선적으로 기생충 또는 그의 충란으로 오염된 물질의 섭취를 통해 확산된다. 이들의 생활 주기 동안 이러한 기생충은 신체의 다른 부분으로 이동할 수 있지만, 다시 위장으로 되돌아가 더 많은 충란을 생산하고, 이어서 이는 배설물중에 존재하여 배설되어 새로운 감염원을 제공한다.
연충류 감염은 인간을 비롯한 동물에서 상당한 이환률을 초래하고, 농축산물의 경우, 증체량, 우유 생산 및 번식의 감소로부터의 감소된 생산성에 기인하여 실질적인 경제적 손실을 일으킨다. 심각한 감염은 사망을 초래할 수 있지만, 내부 기생충을 갖는 반추동물은, 무증상 수준(subclinical level)에서 조차도, 감소된 성장 및 불량한 건강 상태를 유도하는 빈혈, 감소된 번식 적합성 및 유즙 분비, 및 식품 이용의 감소를 비롯한 다수의 양상을 통해 생산성의 상당한 손실을 나타낸다[피에드라피타(Piedrafita) 등, 2010; 페리(Perry) 및 란돌프(Randolph), 1999; 호그룬드(Hoglund) 등, 2001; 라인하르트(Reinhardt) 등, 2006]. 미국에서, 축산물 생산성의 연간 손실은 매년 30억 달러로 추정되고 있다[바글레이(Bagley) 등, 2014]. 수의학적 케어(care), 구충성 약물, 및 엄격한 구충성 영농 전략이 덜 이용가능하고 덜 광범위하게 실행되며, 식품 부족이 더욱 쉽고 더욱 심각한 장소인 개발도상국에서, 손실은 실질적으로 더 클 것으로 예상된다. 연충류 감염은 또한 가금류[페르민(Permin) 등, 1999] 및 돼지[난센(Nansen) 및 로에프스토르프(Roepstorff), 1999], 및 다른 경제적으로 중요한 초식동물, 예컨대 말[던칸(Duncan), 1985]을 비롯하여 농업적으로 중요한 비-반추동물에 있어서 쟁점이다. 말의 경우, 기생충 감염은 또한 동물의 신체적 성능을 감소시킨다. 그러나, 내부 기생충 체내침입(infestation)은 농축산물로 제한되지 않고, 또한 고양이 및 개와 같은 반려동물의 경우에도 문제가 된다. 고양이 및 개에서의 체내침입은 인수공통 전염병으로 지칭되는 현상을 유도할 수 있고, 이는 인간, 가장 종종 어린 아이들의 갈고리충 및 회충 감염을 초래한다31.
기생 연충류 감염은 또한 인간에서 만연하다. 회선사상충(Onchocerca volvulus)은, 예를 들어, 인간에서 회선사상충증(또한 하천 실명(river blindness)으로도 공지됨)을 일으킨다. 전 세계를 통해 약 1700만 내지 2500만명의 사람들이 회선사상충에 감염되고, 약 100만명의 사람들이 일정 정도의 시각 손실을 갖는 것으로 보고되어 있다. 브루기아 필라리드(Brugia filariid)는 인간 및 다른 동물을 감염시켜, 필라리아증(filariasis)(림프 필라리아증 포함), 상피병 및 국소적 호산구 증가증을 비롯한 질병을 초래할 수 있다. 주혈흡충증은 주혈흡충 종의 주혈흡충에 의해 초래된 인간에서의 혈관 기생충 질병이다. 주혈흡충증은 전세계적으로 10억명 이상을 감염시키는 많은 연충류에 의한 질병중 하나이다. 이들 질병으로는 회충증, 편충증, 요충증, 필라리아증, 선모충증, 회선사상충증, 간흡충에 의한 간질병, 및 낭미충증이 포함된다. 주혈흡충증은 기생충에 기인한 이환율 및 고통의 주요 원인으로서 말라리아에 이어 2위를 차지한다.
상기 문제점들을 조합하여, 흔히 사용되는 기생충 구제제(dewormer)에 대한 내성(구충제 내성)은 가축 생산에 있어서 세계적으로 증가하는 문제이다[카플란(Kaplan), 2004]. 다중약물 내성은 양 및 염소 사업장에서 흔한 현상이고[다 크루츠(da Cruz) 등, 2010], 전체적인 구충 실패의 몇몇 경우가 보고되어 있다[세자르(Cezar) 등, 2010; 호웰(Howell) 등, 2008]. 유사하게, 말 기생충은 현재 시판되는 기생충 구제제의 모든 부류에 대해 내성인 것으로 기록되어 있고, 압도적인 대부분의 말 사업장은 적어도 1종의 약물 부류에 대한 내성에 직면하고 있다[페레그리네(Peregrine) 등, 2014]. 가장 최근에는, 소 기생충이 흔히 사용되는 몇몇 부류의 구충성 제품에 대해 내성이 증가되는 것으로 밝혀졌다[가스바레(Gasbarre) 등, 2009; 와그혼(Waghorn) 등, 2006; 잭슨(Jackson) 등, 2006].
게다가, 이러한 내성은, 신규 기생충 구제제 제품이 개발되고 출시되는 것에 비해 상당히 더 빠르게 진화하는 것으로 보이고: 1980년대 초반 이래로 북미에서는 대형 동물에 사용하기 위한 어떠한 신규한 구충성 약물도 출시되지 않고 있다. 이러한 이유로, 전세계 수의학 조직은 기생충 감염의 모니터링 및 약물 내성의 존재를 동물 케어의 중요한 양태로서 홍보하고 있다[우드(Wood) 등, 1995].
수의학적 약물의 영역에서, 연충류 감염은 때때로 분명한 임상적 증후에 의해 진단된다. 수의 기생충학의 실행시 중심 도구는 배설물 충란-계수(FEC: fecal egg-count)이고, 이는 거의 한 세기 동안 비교적 바뀌지 않고 유지되고 있고4,11, 일반적으로, 충란 자체 보다는 더 농후한 당 및/또는 염 매질에 충란을 부유시키고, 이어서 현미경 검사 및 수동적 계수를 수행함에 기초한다. 2가지 FEC 방법이 현재 사용되고 있다.
첫 번째로, 아마도 가장 보편적으로 사용되는 충란-계수 절차는 1939년에 고돈(Gordon) 및 휘트락(Whitlock)에 의해 양 배설물로 고유적으로 개발된 맥마스터(McMaster) 슬라이드 계수 방법이다. 이러한 방법에서, 배설 물질은 기생충 충란 그 자체에 비해 밀도가 더 큰 당 및/또는 염(SS) 용액에 현탁되고, 해당 목적을 위해 특수 제작된 현미경 슬라이드에 위치된다(맥마스터 슬라이드 계수 방법). 충란은 표면에 부유되고(이로써 이들을 더 농후한 배설물 찌꺼기로부터 분리하여 시각화를 돕는다), 40 내지 100배 배율로 현미경을 사용하여 훈련된 개개인에 의해 수동으로 계수된다.
두 번째로 흔히 사용되는 충란-계수 절차는 위스콘신(Wisconsin) 방법 및 이로부터 파생된 방법이다. 이들 방법의 경우, 충란은, 원심력장의 영향하에 있지만 중력에 의해, 부유 매질의 표면 메니스커스(meniscus) 상에 위치된 커버슬립(coverslip) 상으로 직접 부유된다. 튜브에 배설물 현탁액을 위치시켜 메니스커스를 형성함으로써 더 많은 배설물 현탁액의 샘플링에 의해 감도가 개선된다. 메니스커스는 커버슬립에 의해 덧씌워진 다음, 수평 로터(swing-out rotor)에서 원심분리된다[로사니고(Rossanigo) 및 그루너(Gruner), 1991; 에그왕(Egwang) 및 슬로콤베(Slocombe), 1981]. 커버슬립에 접착된 충란은 이전과 마찬가지로 현미경에 의해 계수될 수 있다.
맥마스터-유형 검정이 더 간단히 수행되지만, 관련된 높은 희석률 및 적은 샘플링에 의해 위스콘신-유형 시험에 비해 더 높은 변동성 및 더 낮은 감도를 갖게 된다. 역으로, 위스콘신 시험은 원심력장에 의해 생성되는 증가된 부유 및 이들이 허용하는 샘플의 큰 부피로 인해 더 많은 충란을 회수하지만, 기계적으로 약간 더 부담이 되고 원심분리기를 이용할 필요가 있는데, 이는 많은 수의학적 관행 및 현장에서 비현실적이다.
불행하게도, 이들 기법 둘 다는 시간-소모적일 뿐만 아니라 특수화된 실험실 장비(즉, 현미경, 및 원심분리(이는 사용되거나 사용되지 않음))가 필요하고, 이는 현장에서 수의학자에게 좀처럼 이용될 수 없고, 동물 소유주에게는 훨씬 더 이용되기 힘들다. 더욱이, 대다수의 동물 소유주는 이러한 샘플을 신뢰할만하게 검사하도록 필요한 훈련을 받지 않는다(예를 들어, 비전문가는 충란을 다른 배설물 입자, 예컨대 화분립과 쉽게 혼동할 수 있다). 일반적으로 샘플은 수집되어 분석을 위해 수의사에게 보내지거나 제3의 분석 실험실로 보내져서, 비용이 증가되고/되거나 진단 시간이 지연된다. 다르게는, 소유주는 다수의 상업적 서비스를 통해 배설물을 실험실로 직접 보내지만, 일반적으로 결과를 위해 48 시간을 기다려야 한다. 이는, 비용에 대한 수반되는 부담과 함께 시험의 시간-소비 성질 및 각 샘플을 가공하고 조사하는 훈련된 전문가의 필요성과 결부되어, 더 적은 동물 소유주만이 기생충의 존재 및 내성의 발전에 대해 그들의 가축을 일상적으로 시험할 수 있도록 만든다.
시간 및 장비 쟁점에 더하여, 현행의 충란-계수 방법은 다수의 기술적 단점을 겪는다. 예를 들어, 충란-계수 변동성은 현행의 충란-계수 방법의 효능을 제한한다. 말 충란 계수는 반복된 계수 사이에 +/- 50% 변동되는 것으로 추정되었다(부분적으로는 주관적인 분석가들 사이에서의 변동성에 기인하고, 일부는 작은 샘플링 부피에 기인한 통계적인 이유이다). 이에 따라, 배설물 충란-계수 감소에 있어서의 기회 변동성 및 실제 변화 사이의 설명은 현실적 도전과제이다[비디아샹카(Vidyashankar) 등, 2012]. 변동성은 더 나은 분석가 훈련, 반복된 계수의 수행, 또는 더 낮은 검출 한계를 갖는 방법의 사용에 의해 감소될 수 있지만, 이들 해결책 모두는 추가의 훈련 또는 가공 시간에 비용을 수반한다. 다른 단점은 충란 손실률이다. 샘플중 특정 비율의 충란은 배설물 찌꺼기에 갇힌 채로 남아 있고 이를 부유시키지 않는다. 기법 및 조작자에 따라, 충란 손실률은 30 내지 60%로 변동되는 것으로 밝혀졌다(비디아샹카 등, 2012). 중요하게는 검출 한계, 즉 제공된 기법에 의해 검출가능한 가장 낮은 충란 계수는 공지된 방법에 기술적 제한을 부여한다. 이는 전형적으로 1 g 당 1 내지 50개 충란(EPG)의 범위에 속한다. 맥마스터 기법(도 1 참조)은 대체적으로 25 또는 50 EPG의 검출 한계를 가져서 낮은 충란 계수 수준을 검출하는 것을 어렵게 만드는데, 이는 특별히 내성 시험에 중요하다(비디아샹카 등, 2012).
결과로서, 구충성 약물에 의한 예방학적 치료는 산업 전반에 걸쳐 표준이 된다. 불행하게도, 항생제의 과잉-처방과 유사하게, 약물 내성 선충 빈도의 증가는 모든 종, 특별히 소형 반추동물에 대한 세계적으로 증진되는 관심이다[카플란(Kaplan), 2004; 울스텐홀름(Wolstenholme) 등, 2004; 수테르랜드(Sutherland) 및 레아쓰위크(Leathwick), 2011; 잭슨(Jackson) 및 쿠프(Coop), 2000; 로에프스토르프(Roepstorff) 등, 1987; 콜스(Coles) 등, 2003; 세르난스카(Cernanska) 등, 2006; 코르넬레(Kornele) 등, 2014]. 현재 수의학 및 규제 조직 둘 다 공식적으로 이러한 신속히 증진되는 문제점을 인식하고, (1) 이러한 내성의 성장의 모니터링을 돕고, (2) 처방 및 비처방(over-the-counter) 구충성 약물의 현행되는 무차별적 사용을 감소시킴으로써 문제점을 축소시키고자 하는 가이드라인을 공표하였다[우드(Wood) 등, 1995; EMEA, 2006; FDA, 2014].
불행하게도, 배설물 충란 계수 감소(FECR)를 관찰함으로써 내성의 발전을 모니터링하는 것은 상기 기재된 단점을 갖는 충란 부유 방법의 사용을 포함한다8. 이에 따라, 이들 방법은 널리 사용되기 어렵다. 이러한 추정을 강조하기 위해, 켄터키(Kentucky) 서러브레드(thoroughbred) 농장에 대한 최근 연구는, 대부분의 응답자가 약물-내성 기생충의 현상을 알고 염려하였고; 역시 70% 이상이 여전히 예방학적으로 기생충을 구제하고 있음을 보여주었다[로버트(Robert) 등, 2014]. 또한, USDA로부터의 조사에 따르면, 50 내지 70%의 소 농장주들은 내부 기생충이 그들의 사업장에 상당한 경제적 충격을 주는 것에 동의하였지만(USDA, 201lb); 단지 0.7%만이 이러한 문제점에 대해 임의의 유형의 실험실 시험을 사용하였다(USDA, 2010). 요약하면, 배설물 충란 계수의 불편함은 기생충 감염의 치료 및 처치에 대한 더욱 표적화된 접근법의 광범위한 채택에 상당한 장벽을 제공하는 것으로 보인다.
유럽에서 규제 당국은 약물 내성 균주의 출현에 대한 위협을 인식하고 이들의 이용성을 제한하기 위해 달라지고 있지만, 미국에서는 이들 약물중 많은 부분이 여전히 대중에게 비처방으로 개방적으로 이용될 수 있다. 결과로서, 배설물 충란 계수 감소 시험(FECR)의 사용은 수의학 전문 협회에 의해 권고되고 있다. FECR은 구충성 약물에 의한 치료 전 후 둘 다에서 기생충 적재량의 대리 마커로서 충란 계수를 사용하는 기생충 축적량의 계통적 평가에 의존한다. 내성의 발전은 치료 후 충란 계수에서의 예상보다 더 낮은 감소에 의해 검출될 수 있는데, 이는 적절히 처리된 반응을 촉진시켜 모집단을 통해 내성 균주의 증식을 완화시킨다. 결과로서 배설물 충란 계수는 점점 더 중요해지지만, 놀랍게도 이러한 임상적으로 중요한 진단 도구의 개발에는 거의 진전이 이루어지지 않고 있다.
거의 한 세기가 지나고 다른 분야에서는 정교한 현대적 분석 방법론이 개발되었지만, 충란 계수의 관행은 비교적 바뀌지 않은 채로 있고, 대부분의 혁신은 부유 매질에서의 변형 또는 더 많은 배설물 샘플로부터 충란을 수집하는 방법으로 제한되었다. 예를 들어, 부유 챔버(chamber)의 부피가 감도를 개선시키기 위해 확대되었거나14 ,15,18, 대체 부유 용액이 연구되었다14,17.
몇몇 연구자들은, 예컨대 폴리머라아제 쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)[데멜러(Demeler) 등, 2013; 리어마운트(Learmount) 등, 2009] 및 유세포분석[콜디츠(Colditz) 등, 2002]과 같은 방법을 사용하여 배설물중의 충란을 검출하거나 정량화하기 위한 더욱 정교한 활동을 개발하기 위해 노력을 하였다. 그러나, 이러한 정교한 기법은, 이들을 수행하기 위해 필요한 전문성 및 장비와 함께, 이들을 조사 목적 이외의 것에 대한 도구로서 더욱 더 실행될수 없게 만든다.
검출을 돕기 위한 충란-표면 탐침자의 발견을 위해 일부 노력이 이루어 졌지만, 이들 노력은, 렉틴이 결합될 수 있는 충란의 종류를 결정하기 위해, 다양한 렉틴의 선별로 제한되었다. 일단 결정되면, 이들 단백질은 특정 종 또는 속의 존재의 검출(정량화는 아님)을 위한 종-특이적 마커로서 사용될 수 있다[팔머(Palmer) 및 맥콤베(McCombe), 1996; 힐리치스(Hillrichs) 등, 2012; 콜디츠(Colditz) 등, 2002]. 그러나, 전체 충란 계수가 구충제 내성을 임상적으로 결정하고 모니터링하기 위한 표준으로 남아있으므로, 모든 연충류 충란에 대해 포괄적인 마커를 식별해야 하는 일이 남는다. 이러한 아주 흔하고 실험적으로 다루기 쉬운 마커의 식별은, 전체 배설물 충란 적재량을 낱개로 세는 신속한 정량적 방법을 개발하고, 이에 따라 부유 방법 및 이들의 연관된 결점을 대체하기 위해 이를 사용할 수 있는 가능성을 열어둔다.
불행하게도, 임상적으로 적절한 충란 표면의 분자 조성을 설명하기 위한 작업은 거의 실행되어 있지 않고, 실행된 어느 것도 거의 구체적인 정보를 산출해내지 않았다[화르톤(Wharton), 1983; 퀼레스(Quiles) 등, 2006].
또한 기생 원충류 감염은 인간에서의 말라리아 및 폐포자충형 폐렴, 및 조류, 어류 및 포유동물에서의 다양한 콕시듐증(coccidiose) 범위의, 의학적으로 및 수의학적으로 중요한 다양한 질병에 책임이 있다. 이중 많은 질병이 숙주의 생명을 위협하고 동물 사육에 있어서 고려할만한 경제적 손실을 초래한다. 콕시듐증은, 비제한적으로 소, 양, 염소, 토끼, 돼지, 닭, 칠면조, 고양이 및 개를 비롯한 동물의 장관에 영향을 주는 원충류 기생충성 질병이다. 흥미로운 기생충으로는, 비제한적으로 이소스포라(Isospora) 종(개 및 고양이); 아이메리아 막시마(Eimeria maxima), 아이메리아 아세르불리나(Eimeria acervulina), 아이메리아 브루네티(Eimeria brunetti), 아이메리아 네카트릭스(Eimeria necatrix), 및 아이메리아 테넬라(Eimeria tenella)(닭); 아이메리아 멜레아그리디스(Eimeria meleagridis), 아이메리아 갈로파보니스(Eimeria gallopavonis), 아이메리아 아데노에이데스(Eimeria adenoeides), 및 아이메리아 디스페르사(Eimeria dispersa)(칠면조); 아이메리아 보비스(Eimeria bovis)(소); 아이메리아 오비나(Eimeria ovina)(양); 아이메리아 포르시(Eimeria porci)(돼지); 및 아이메리아 스티에다이(토끼)가 포함된다. 콕시듐증은 많은 가축 종에서 가장 경제적으로 중요한 질병중 하나이다. 이러한 질병은 설사, 수척(unthriftiness), 식욕 및 체중 감소, 및 다양한 수준의 사망률을 특징으로 한다. 가축 동물에서, 경제적 손실은, 부분적으로는 소화관 벽을 통한 영양소의 흡수불량에 기인한 감소된 체중 증가에 의해 초래된다. 그리고, 연충류 감염에서와 같이, 원충류 접합자낭을 검출하기 위한 당분야의 상태는 시간-소모 방법에 근거한다.
많은 기생충이 그들의 생활주기의 일부를 위장관에서 보내고 배설물에 포함되어 배설되지만, 많은 다른 기생충은 숙주 동물의 방광 및 신장을 감염시킨다. 페아르소네마 플리카(Pearsonema plica) 및 디옥토파이메 레날레(Dioctophyme renale)는 개에서 방광 및 신장을 감염시키는 것으로 공지된 2종의 이러한 기생충이다. 두 속의 기생충의 충란은 뇨 샘플에서 발견될 수 있다. 주혈흡충증 종은 뇨관 또는 장을 감염시키고, 이의 충란은 동물의 뇨 또는 변에서 발견될 수 있다.
볼수 있듯이, 더 현대적인 방법이 개발되었지만, 이들 시험은 광범위하게 채택되지 않고 있고, 수동 충란 계수가 내부 기생충 체내침입(즉, 연충류 및 원충류 기생충 체내침입)을 모니터링하기 위해 가장 광범위하게 이용가능하고 일상적으로 사용되는 방법으로 남아있다. 이에 따라, 현장에서 수의사에 의해 또는 동물 소유주 스스로에 의해 수행될 수 있는, 배설물에서 기생충 충란의 수를 정량화하기 위한 간단하고, 정확하며, 비용-효과적인 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 환경 샘플(예를 들어, 배설물 샘플)에서 연충류 충란을 검출하기 위한 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNac) 결합 도메인(예를 들어, GlcNac 결합 단백질) 및 이의 단편의 용도에 기초한다. "검출하다"는 검출되는 대상의 존재, 부재 또는 양을 식별함을 지칭한다. 검출되는 양은 존재하지 않거나 검출 수준 미만일 수 있다. 본 발명은 수의사 및 동물 소유주 둘 다가 연충류 기생충 감염 및/또는 원충류 기생충 감염의 존재 및 수준을 진단할 수 있도록 허용함으로써, 이들이 이들의 구체적인 요구사항에 대해 치료 및 예방적 전략을 더욱 적절하고 효율적으로 조정할 수 있도록 하는 단순한 현장 시험을 제공한다. 이 시험은 또한 더욱 제어된 실험실 설정에서 사용될 수 있다. 본 문서는 기생충 충란 계수(이들은 거의 한 세기 이상 동안 정체됨)를 현미경으로부터 벗어나게 하기 위한 일반적 원리를 개괄하고, 현대적인 생화학 기법을 사용하여 이러한 목적을 달성하는 구체적인 검정을 기술한다.
본원에 개시된 방법은 종종 현행의 충란 계수 방법에 대한 추가의 개선점을 제안하고; 다시 말해, 이러한 접근법은 (1) 샘플 처리량의 증가 및 주관성의 제거(이로써 이들 변동의 원천을 감소 또는 제거함); (2) 충란 손실률의 문제점을 적어도 부분적으로 향상시킬 수 있는, 부유 단계의 임의적 제거; 및 (3) 감도를 크게 개선시킬 수 있는 여과에 의한 배설물 샘플의 농축을 가능하게 한다. 또한, 이러한 기술은 시험이 현장에서 신속하게 수행될 수 있도록 하여, 배설물을 실험실로 수송하는 시간- 및 불편성-비용, 및 거기서의 가공 시간을 제거한다. 최종적으로, 이러한 기술은 확립된 수의학적 관행에 잘 정합될 것인데, 이는 전체 FEC(기생충 종과 무관함)가 임상적 치료 결정을 통지하기 위한 가장 흔히 사용되는 계량법이기 때문이다[콜스(Coles) 등, 2006; 닐슨(Nielsen) 등, 2010].
이에 따라, 하나의 양태에서, 본 발명은 환경 샘플(예를 들어, 배설물 샘플, 뇨 샘플, 물 샘플, 폐수 또는 하수 샘플, 또는 토양 샘플)에서 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계, 기공 크기가 감소되는 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개 또는 15개)의 필터를 통해 배설물 용액을 유동시키는 단계(이때, 필터 수 및 기공 크기는 배설물이 수득되는 동물의 종에 의해서, 및 검출되는 충란 및/또는 접합자낭의 유형에 의해 결정됨)를 포함하는, 환경 샘플에서 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 샘플 완충액에 현탁된 배설물 샘플을 포함하는 배설물 용액을 수득하는 단계, 기공 크기가 감소되는 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개 또는 15개)의 필터를 통해 배설물 용액을 유동시키는 단계(이때, 필터 수 및 기공 크기는 배설물이 수득되는 동물의 종에 의해서, 및 검출되는 충란 및/또는 접합자낭의 유형에 의해 결정됨)를 포함하는, 배설물 샘플에서 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용될 경우, 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 상호교환적으로 사용되고, "하나 이상" 및 "적어도 하나"가 지칭하는 항목의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 15개 등을 의미한다. 용어 "둘 이상"은 "둘 이상"이 지칭하는 항목의 적어도 2개, 더욱 적합하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 12개, 15개 등을 의미한다.
따라서 하나의 양태에서, 환경 샘플을 포함하는 용액(예를 들어, 배설물 샘플을 포함하는 배설물 용액)은 약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 125 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 또는 약 150 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 유동되어 제1 여액을 형성하고, 제1 여액은 약 1 내지 약 10 ㎛, 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 15 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 20 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 또는 약 30 ㎛ 내지 약 35 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 유동되며, 제2 여과 막 상에 포획된 연충류 충란은 검출가능한 잔기(moiety)에 접합된 N-아세틸-D-글루코사민 결합 도메인 또는 이의 단편, 예컨대, 예를 들어 렉틴, 키티나아제(chitinase), 키틴 결합 도메인(CBD) 또는 다른 N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질 또는 이의 단편과 접촉되고, 배설물 샘플에서 연충류 충란의 존재 또는 부재는 검출가능한 잔기, 예를 들어, 검출가능한 잔기의 신호 강도에 기초하여 검출된다.
용어 "제1", "제2" 및 "제3"은 단지 이들끼리 상대적으로 본원에서 사용된다. 달리 주지되지 않는 한, 이러한 용어는 하나 이상의 실시태양에 대한 설명에 있어서 단지 편의상 사용되는 것으로 이해될 것이다. 용어 "제1", "제2" 및 "제3"은 단지 하나의 요소를 다른 요소로부터 구별하기 위해 사용되고, 개시된 기술의 권리의 범주는 이들 용어에 의해 제한되지 않아야 한다. 예를 들어, 제1 요소는 제2 요소로 지정될 수 있고, 유사하게 제2 요소는 제1 요소로 지정될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액(예를 들어, 배설물 샘플을 포함하는 배설물 용액)을 수득하는 단계; 약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 125 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 또는 약 150 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 배설물 용액을 유동시키는 단계; 약 1 내지 약 10 ㎛, 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 15 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 20 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 또는 약 30 ㎛ 내지 약 35 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계; 제2 여과 막 상에 포획된 샘플을, 형광-여기 광(fluorescence-exciting light)하에 형광을 발산하는 키틴-결합 염료를 포함하는 제1 시약과 접촉시키는 단계; 제2 여과 막 상에 포획된 샘플을 형광-여기 광으로 조명하는 단계; 및 샘플의 형광을 검사하여 배설물 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 형광 강도 또는 형광 입자의 수에 기초하여 결정하는 단계를 포함하는, 환경 샘플(예를 들어, 배설물 샘플)에서 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액(예를 들어, 배설물 샘플을 포함하는 배설물 용액)을 수득하는 단계; 약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 125 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 또는 약 150 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 용액을 유동시키는 단계; 약 1 내지 약 10 ㎛, 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 15 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 20 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 또는 약 30 ㎛ 내지 약 35 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계; 제2 여과 막 상에 포획된 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭을, 렉틴 또는 CBD 또는 N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 제1 시약과 접촉시켜 제1 시약 샘플을 형성하는 단계; 제1 시약 샘플을, 렉틴 또는 CBD에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제2 시약과 접촉시키는 단계(이때, 항체는 검출가능한 잔기에 접합됨); 및 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출가능한 잔기에 기초하여 결정하는 단계를 포함하는, 환경 샘플(예를 들어, 배설물 샘플)에서 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 환경 샘플은 배설물 샘플이다. 배설물 용액을 수득하는 단계는, 샘플 완충액에서 배설물 샘플을 현탁시켜 제1 배설물 용액을 형성하는 단계, 및 약 400 ㎛ 내지 약 800 ㎛, 약 425 ㎛ 내지 약 750 ㎛, 약 450 ㎛ 내지 약 700 ㎛, 약 500 ㎛ 내지 약 650 ㎛, 또는 약 550 ㎛ 내지 약 600 ㎛의 기공 크기를 갖는 벌크(bulk) 여과 막을 통해 제1 배설물 용액을 유동시켜 배설물 용액을 제공하는 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 벌크 여과 막은 약 400 ㎛ 내지 약 450 ㎛의 기공 크기를 갖고, 제1 여과 막은 약 85 ㎛ 내지 약 120 ㎛의 기공 크기를 갖고, 제2 여과 막은 약 20 ㎛ 내지 약 40 ㎛의 기공 크기를 갖는다. 벌크 여과 막을 통해 제1 배설물 용액을 유동시키는 단계는 더 큰 입자 및 찌꺼기를 제거하는 작용을 하여, 제1 및 제2 여과 막을 통한 더욱 효율적인 여과를 허용한다.
몇몇 실시태양에서, 이러한 방법은 용액을 제2 여과 막을 통해 유동시키는 단계 이후, 제2 여과 막에 포획된 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭을 액체 샘플 완충액에 현탁시키는 단계를 추가로 포함한다.
추가의 양태에 따라서, 본원에 개시된 방법은 접촉 단계 이전에 산화제 또는 표백 용액으로 샘플(예를 들어, 환경 샘플)을 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 이에 따라, 몇몇 실시태양에서, 샘플을 표백 용액으로 처리함은 접촉 단계에 선행된다.
몇몇 실시태양에서, GlcNac 결합 도메인은 렉틴, 키티나아제 또는 키틴 결합 도메인(CBD), 또는 이의 단편으로 구성된 군에서 선택된 GlcNac 결합 단백질이다. 더욱 특별히, 렉틴은 N-아세틸-D-글루코사민과 결합할 수 있는 임의의 렉틴일 수 있고, 밀 배아 응집소(WGA: wheat germ agglutinin), 대두 응집소(SBA: soybean agglutinin), 마클루라 포미페라 렉틴(MPL: Maclura pomifera lectin), 바우히니아 푸르푸레아 렉틴(BPL: Bauhinia purpurea lectin), 다투라 스트라모늄 렉틴(DSL: Datura stramonium lectin), 라이코페르시콘 에스쿨렌텀 렉틴(LEL: Lycopersicon esculentum lectin), 솔라눔 투베로숨 렉틴(STL: Solanum tuberosum lectin) 및 프소포카르푸스 테트라고놀로부스-II(PTL-II: Psophocarpus tetragonolobus-II)로 구성된 군에서 선택된 렉틴이 포함된다. 하나의 실시태양에서, 렉틴은 밀 배아 응집소(WGA)이다.
몇몇 실시태양에서, GlcNac 결합 단백질은 고체 지지체, 예컨대 자성 또는 비-자성 비드(bead) 또는 막, 예컨대 니트로셀룰로스 또는 폴리비닐리딘 다이플루오라이드에 접합되는데, 이는 여과와 조합하여 또는 여과 대신에 충란을 포획하고 농축시키기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, GlcNac 결합 단백질은 합텐(hapten), 효소, 항체 에피토프, 항원, 형광단, 방사성동위원소, 나노입자, 결합 쌍의 구성원, 및 금속 킬레이트로 구성된 군에서 선택된 검출가능한 잔기에 접합된다. 예를 들어, 검출가능한 표지는 결합 쌍의 제1 구성원일 수 있고, 이때, 결합 쌍은 비오틴(biotin)/스트렙타비딘(streptavidin), 비오틴/아비딘(avidin), 비오틴/뉴트라비딘(neutravidin), 비오틴/캡타비딘(captavidin), 에피토프/항체, 단백질 A/면역글로불린, 단백질 G/면역글로불린, 단백질 L/면역글로불린, GST/글루타티온(glutathione), His-태그/금속(예를 들어, 니켈, 코발트 또는 구리), 항원/항체, FLAG/M1 항체, 말토오스 결합 단백질/말토오스, 칼모듈린(calmodulin) 결합 단백질/칼모듈린, 효소-효소 기질, 및 수용체-리간드 결합 쌍으로 구성된 군에서 선택된다. 하나의 실시태양에서, 검출가능한 잔기는 결합 쌍의 제1 구성원이다. 몇몇 실시태양에서, 결합 쌍의 제1 구성원은 N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질에 접합되고, 결합 쌍의 제2 구성원은 고체 지지체 상에 고정화된다.
몇몇 실시태양에서, 검출가능한 잔기는 결합 쌍의 제1 구성원이고; 결합 쌍의 제2 구성원은 효소, 항체 에피토프, 항원, 형광단, 방사성동위원소, 나노입자, 제2 결합 쌍의 구성원, 및 금속 킬레이트에 접합된다.
또 다른 실시태양에서, 검출가능한 잔기는 결합 쌍의 제1 구성원이고, 이때, 결합 쌍의 제1 구성원은 비오틴이고 결합 쌍의 제2 구성원은 스트렙타비딘, 아비딘, 뉴트라비딘 및 캡타비딘으로 구성된 군에서 선택되고, 결합 쌍의 제2 구성원은 효소에 접합된다.
몇몇 실시태양에서, 검출가능한 잔기는 형광단이고, 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 5-이소티오시아네이트(FITC), 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), 보디피(Bodipy) 염료[인비트로겐(Invitrogen)] 및/또는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료(인비트로겐), 단실(dansyl), 단실 클로라이드(DNS-Cl), 5-(요오도아세트아미다)플루오레세인(5-IAF), 6-아크릴로일-2-다이메틸아미노나프탈렌(아크릴로단: acrylodan), 7-니트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일 클로라이드(NBD-Cl), 브롬화 에티듐, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 로다민(rhodamine) 염료(5-카복시로다민 6G 하이드로클로라이드, 리싸민(Lissamine) 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), 로다민 800), 테트라메틸로다민 5-(및 6-)이소티오시아네이트(TRITC), 텍사스 레드(Texas Red: 등록상표), 설포닐 클로라이드, 나프탈아민 설폰산, 예컨대 비제한적으로, 1-아닐리노나프탈렌-8-설폰산(ANS) 및 6-(p-톨루이디닐)나프탈렌-2-설폰산(TNS), 안트로일(Anthroyl) 지방산, DPH, 파리나르산, TMA-DPH, 플루오레닐 지방산, 플루오레세인-포스파티딜에탄올아민, 텍사스 레드-포스파티딜에탄올아민, 피레닐-포스파티딜콜린, 플루오레닐-포스파티딜콜린, 메로시아닌(Merocyanine) 540, 나프틸 스티릴(Naphtyl Styryl), 3,3'-다이프로필티아다이카보시아닌(다이S-C3-(5)), 4-(p-다이펜틸 아미노스티릴)-1-메틸피리디늄(다이-5-ASP), Cy-3 요오도 아세트아미드, Cy-5-N-하이드록시석신이미드, Cy-7-이소티오시아네이트, IR-125, 티아졸 오렌지(Thiazole Orange), 아주레(Azure) B, 나일 블루(Nile Blue), Al 프탈로시아닌, 옥삭신(Oxaxine) 1,4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI), 획스트(Hoechst) 33342, TOTO, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 에티듐 호모다이머(Ethidium Homodimer), N(에톡시카보닐메틸)-6-메톡시퀴놀리늄(MQAE), 푸라(Fura)-2, 칼슘 그린(Calcium Green), 카복시 SNARF-6, BAPTA, 쿠마린(coumarin), 파이토플루오르(phytofluor) 및 코로넨(Coronene)으로 구성된 군에서 선택된다.
몇몇 실시태양에서, 검출가능한 잔기는 색 변화 반응을 촉매화하는 효소이고, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 호스 래디시(horse radish) 퍼옥시다아제, 우레아제 및 베타-락타마아제 및 글루코오스 옥시다아제로 구성된 군에서 선택된 효소가 포함된다.
몇몇 실시태양에서, GlcNac 결합 단백질은 밀 배아 응집소이고, 검출가능한 잔기는 플루오레세인이다.
검출가능한 표지의 신호 강도는 당분야의 숙련가에게 공지된 기기 및 장치를 사용하여 측정될 수 있고, 예를 들어 휴대용 또는 벤치탑(benchtop) 형광광도계[예를 들어, 핸드헬드(handheld) 형광광도계] 또는 휴대용 또는 벤치탑 색도계(예를 들어, 핸드헬드 색도계)가 포함된다. 검출가능한 잔기의 신호 강도는 육안 검사에 의해 결정될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 검출가능한 잔기의 신호 강도는 선택된 검출가능한 잔기를 시각화하기에 적절한 촬상 디바이스(imaging device)를 사용하여 결정된다. 몇몇 실시태양에서 촬상 디바이스는 디지털 카메라, 모바일 폰, 스마트폰, 태블릿(tablet), 휴대용 컴퓨터, 컴퓨터 또는 스캐너이다.
몇몇 실시태양에서, 이러한 방법은 배설물 샘플중의 연충류 충란을 낱개로 세는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 배설물 샘플중의 연충류 충란을 낱개로 세는 단계는 현미경을 사용하여 수행된다.
몇몇 실시태양에서, 제2 여과 막에 포획된 샘플은 형광-여기 광하에 형광을 발산하는 키틴-결합 염료를 포함하는 제1 시약과 접촉되고, 이때, 형광-여기 광하에 형광을 발산하는 키틴-결합 염료는 칼코플루오르 화이트(calcofluor white), 우비텍스(Uvitex) 3B(다이스티릴 다이페닐 형광 증백제), 라이룩스(Rylux) BA, 라이룩스 BSU(1,4-벤젠다이설폰산-2,2'-[에틸렌다이일비스[(3-설포-4,1-페닐렌)이미노[6-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-1,3,5-트라이헥사나트륨 염)[오스타컬러(Ostacolor), 체코 공화국 파르두비체] 및 블랑코포르(Blankophor)(다이나트륨 4,4'-비스{(4-아닐리노)-6-모폴리노-1,3,5-트라이아진-2-일)아미노}스틸벤-2,2'-다이설포네이트)로 구성된 군에서 선택된다.
몇몇 양태에서, 본 개시내용은 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계; 약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 용액을 유동시켜 제1 여액을 형성하는 단계; 약 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계; 제2 여과 막 상에 포획된 연충류 충란을, 검출가능한 잔기에 접합된 N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계; 및 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출가능한 잔기의 신호 강도에 기초하여 검출하는 단계를 포함하는, 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다.
몇몇 양태에서, 본 개시내용은 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계; 약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 용액을 유동시켜 제1 여액을 형성하는 단계; 약 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계; 제2 여과 막 상에 포획된 샘플을, 형광-여기 광하에 형광을 발산하는 키틴-결합 염료를 포함하는 제1 시약과 접촉시키는 단계; 제2 여과 막에 의해 포획된 샘플을 형광-여기 광으로 조명하는 단계; 및 샘플의 형광을 평가하여 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 형광 강도 또는 형광 입자의 수에 기초하여 결정하는 단계를 포함하는, 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다.
몇몇 양태에서, 본 개시내용은 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계; 약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 용액을 유동시켜 제1 여액을 형성하는 단계; 약 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계; 제2 여과 막 상에 포획된 연충류 충란을, N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 제1 시약과 접촉시켜 제1 시약 샘플을 형성하는 단계; 제1 시약 샘플을, N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제2 시약과 접촉시키는 단계(이때, 항체는 검출가능한 잔기에 접합됨); 및 배설물 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출가능한 잔기의 강도에 기초하여 결정하는 단계를 포함하는, 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시태양에서, 환경 샘플은 배설물 샘플이다. 따라서, 용액을 수득하는 단계는 배설물 샘플을 샘플 완충액에 현탁시켜 제1 배설물 용액을 형성하는 단계; 및 약 400 ㎛ 내지 약 800 ㎛의 기공 크기를 갖는 벌크 여과 막을 통해 제1 배설물 용액을 유동시켜 배설물 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 재료는 본 발명에 사용하기 위해 본원에 기재되고; 당분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적이고, 제한하려는 것이 아니다. 본원에 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목, 및 다른 인용문헌은 참고로 그의 전체가 혼입된다. 모순되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선될 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
특허 또는 출원 파일은 색을 넣어 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다.
색 도면(들)을 갖는 이러한 특허 또는 특허출원의 복사본은 요청시 사무소에 의해 제공되고 필수 요금이 지불될 것이다.
도 1은 충란 포획을 위한 자성 비드를 사용하여 배설물 샘플에서 연충류 충란의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 본 발명에 따른 방법을 도시하는 개략적 다이어그램이다.
도 2는 다단계 여과 공정을 사용하여 배설물 샘플에서 연충류 충란의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 본 발명에 따른 방법을 도시하는 개략적 다이어그램이다.
도 3A 내지 3D는 표백 전 및 후의 샘플을 도시하는 사진이다(패널 A = 표백되지 않음; 패널 B = 4분 동안 표백된 후의 샘플; 패널 C = 6분 동안 표백된 후의 샘플; 및 패널 D = 8분 동안 표백된 후의 샘플).
도 4는 FITC 표지화된 밀 배아 응집소(WGA)에 의해 수득된 키틴 특이적 연충류 충란의 염색을 도시한다.
도 5A 내지 5J는 플루오레세인에 접합된 CBD에 의한 연충류 충란의 염색을 도시한다(위상차(A 내지 E) 또는 형광 방식(F 내지 J)으로 촬상된 샘플). 막대 = 200 ㎛.
도 6은 플루오레세인에 접합된 CBD에 의해 염색된 소 배설물로부터의 여러 가지 연충류 충란 및 원충류 접합자낭 둘 다를 보여준다. 막대 = 200 ㎛.
도 7은 충란 양성 및 충란 음성 배설물에서 충란의 색도계 검출을 보여준다.
도 8A 및 8B는 말 배설물로부터의 CBD 염색된 충란의 영상을 보여준다. 맥마스터 그리드(grid)의 합성 영상은 위상차(A) 및 형광 방식(B)으로 40배 배율로 생성되었다. 삽도는 진균류 포자(화살촉)를 포함하는 대표 영역의 확대도를 도시한다. 막대 = 1.5mm.
도 9A 내지 9D는 CBD-플루오레세인 염색된 충란의 영상을 도시한다. 충란은 8MP 아이폰(iPhone) 5s(A, B)에 의해 또는 16MP 올림푸스(Olympus) PE2 펜(Pen) 카메라(C, D)에 의해 촬상되었다. 영상은 원래 그대로(A, C), 또는 배경을 제거하기 위해 처리된 후(B, D) 도시된다. 막대(A) = 1mm, 막대(B) = 0.5mm.
도 10은 올림푸스 소비자 등급 카메라 및 셀 폰 카메라 둘 다에 의해 촬상된 자동화된 계수와 전통적인 맥마스터 계수의 상관관계를 도시한다. 3개의 배설물 샘플을 각 경우 4개의 독립적인 시험으로 평가하고 결과를 평균하였다.
도 11은 일반적으로 자동화된 시험이 전통적인 맥마스터 방법에 비해 적은 변동성을 나타냄을 보여준다. 표준 편차(n=4)를 갖는 도 10으로부터의 평균 결과가 도시된다.
도 12는 도 1 또는 2에 기재된 방법에 따라 제조된 샘플에 대한 영상을 캡쳐(capture)하기 위한 시험 장치의 등각 상면도(top isometric view)를 도시한다.
도 13은 도 12의 장치의 저면도(bottom view)를 도시한다.
도 14는 샘플 챔버가 부착된 도 12의 장치의 등각 저면도를 도시한다.
도 15는 도 14에 도시된 장치 및 샘플 챔버의 일부의 단면도를 도시한다.
하기 개시내용은 환경 샘플에서(예를 들어, 배설물 샘플, 뇨 샘플, 물 샘플, 폐수 또는 하수 샘플, 또는 토양 샘플에서) 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하는 신규 방법을 설명한다. 검토의 용이성을 위해, 배설물 샘플에서 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 예시적인 방법 및 키트는 예시적 목적을 위해 제공되는 것으로 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니고, 이는 특허청구범위의 범주에 의해 한정된다.
키틴은 몇몇 연충류 충란 및 원충류 접합자낭의 성분인 것으로 기재되지만, 이는 일반적으로 이러한 충란의 보편적 성분인 것으로는 결코 인식되지 않는다. 적어도 부분적으로, 본 발명은 키틴이 전부는 아니더라도 대부분의 연충류 기생충 충란(예를 들어, 도 5 참조) 및/또는 원충류 접합자낭에 대한 일반적 마커로서 작용할 수 있고, 이에 따라 총 기생충 적재량을 결정하기 위한 시험의 기초를 형성한다는 본 발명자들에 의한 발견에 기초한다. 키틴은 셀룰로오스와 구조적으로 유사한 선형 중합체이지만, 전적으로 글루코오스 보다는 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc)의 β 1-4 연결된 단위로 구성된다[루달(Rudall) 및 켄싱턴(Kenchington), 1973]. 셀룰로오스에 이어, 이는 자연에서 가장 풍부한 생중합체이고, 육생 및 수생 절지동물 둘 다의 외골격의 주요 구성성분이며, 진균류 및 (더 적은 정도로) 효모의 세포 벽의 중요한 성분이다. 대부분의 연충류 충란의 표면의 생물학적 기질 및 유사한 외관의 구조적 성분으로서의 키틴의 보편적인 역할은, 키틴이 기생충 충란에 대한 아주 흔한 마커일 수 있음을 제시한다.
키틴의 존재는 렉틴 및 다양한 소분자-형광단을 인식하는 다양한 GlcNAc에 의해 단지 반-특이적으로, 뿐만 아니라 이들 개개의 키틴 결합 도메인(CBD)으로 구성된 다양한 키티나아제의 절단된 형태에 의해 더욱 엄격하게 탐침될 수 있다[하르트(Hardt) 및 라이네(Laine), 2004; 하시모토(Hashimoto) 등, 2000; 가오(Gao) 등, 2002; 아라칸(Arakane) 등, 2003; 추(Chu) 등, 2001; 콜베(Kolbe) 등, 1998; 젤틴스(Zeltins) 및 슈렘프(Schrempf), 1995]. 이에 따라, 본 발명자들은 배설물 샘플로부터의 연충류 충란의 검출이 (1) 적절한 기질의 첨가시 신호를 생성하는 GlcNAc 결합 단백질에 효소 리포터(reporter)를 부착함으로써 색도계에 의해; 또는 (2) GlcNAc 결합 단백질을 적절한 형광단에 접합시킴으로써 형광광도에 의해 달성될 수 있다고 가정하였다.
CBD 및 렉틴은 키틴 및 GlcNAc 포함 당 구조물에 더 높은 결합 친화도를 나타내지만, 이들은 또한 다른 탄수화물 중합체, 특히 초식동물 및 잡식동물의 배설물의 주요 성분인 셀룰로오스에 또한 결합할 수 있다. 문헌에서 이용가능한 데이터는 가변적이고, 때때로 모순적이어서26-30, 충란과 어마어마한 양의 나머지 배설물을 구별할 수 있는지의 여부를 불확실하게 만든다. 본 발명자들은 이러한 단백질이 이러한 배경 물질에 대해 충란을 검출하기 위해 실제로 사용되어 이들을 낱개로 세는 방법의 기초를 형성할 수 있음을 발견하였다.
본원에 환경 샘플에서 연충류 기생충 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법 및 연관된 장비가 제공된다. 특히, 본원에 제공된 방법은 약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 125 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 또는 약 150 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 환경 샘플을 유동시켜 제1 여액을 형성하는 단계; 약 1 내지 약 10 ㎛, 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 15 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 20 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 또는 약 30 ㎛ 내지 약 35 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계; 제2 여과 막 상에 포획된 연충류 충란 및 원충류 접합자낭을 키틴 또는 N-아세틸-D-글루코사민에 결합하는 시약과 접촉시키는 단계; 및 키틴 또는 N-아세틸-D-글루코사민에 결합하는 시약이 환경 샘플중의 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭에 결합하는 정도를 정량적으로 또는 정성적으로 관찰함으로써 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 여과 공정을 이용하였다. 환경 샘플은 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭을 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플일 수 있고, 예를 들어 배설물 샘플, 물 샘플, 폐수 또는 하수 샘플, 또는 토양 샘플이 포함된다.
본 개시내용은 또한 샘플중의 연충류 기생충 충란 및/또는 원충류 접합자낭을 낱개로 세기 위한 방법 및 연관된 장비를 제공한다. 개시된 방법은 한 세기 이상 동안 정체된 현미경을 이용하는 기생충 충란 계수 방법에서 벗어나고, 현대적인 생화학적 기법을 사용하기 위한 구체적인 방법을 설명한다.
충란은 물 또는 기타 적합한 액체(완충 용액 포함)중의 동물 배설물의 현탁액에서 다음의 2-단계 공정으로 검출될 수 있다; 충란 포획 및 충란 검출. 1 단계에서, 충란은 배설물 찌꺼기로부터 이들을 분리하는 수단으로서의 토양 기질 상으로 포획된다. 기질은 2- 또는 3-차원적일 수 있고, 그 자체로, 예를 들어, 비드 또는 입자의 형태로 액체에 공동-현탁될 수 있다.
충란 포획은 충란의 표면과 상호작용할 수 있는 분자, 예컨대 단백질, 탄수화물 또는 활성화된 화학 기로 기질을 코팅함으로써 용이하게 된다. 필요하다면, 배설물 현탁액을 화학물질로 예비처리하여 충란 상에 포획을 용이하게 할 수 있는 화학 기를 노출시키거나 활성화시킴으로써 포획을 용이하게 할 수 있다. 이러한 화학물질로는, 비제한적으로, 표백제, 계면활성제, 산화제, 카오트로픽 시약(chaotropic agent) 및 효소가 포함된다.
포획은 특이적일 수 있고, 비제한적인 예로서, 모든 기생충 충란, 또는 특정 분류군(taxonomic group) 또는 특정 종의 기생충 충란 상의 구조물만을 인식하는 충란 성분(예를 들어, GlcNac) 또는 렉틴에 대한 항체를 사용한다. 다르게는, 포획은 비-특이적일 수 있고, 미립자형 배설물 찌꺼기로부터(모든 배설물 성분일 필요는 없음) 충란을 분리하는 방법을 제공한다. 이러한 포획은, 비제한적인 예로서, 화학 반응기, 예컨대 N-에틸-말레이미드 에스테르, N-하이드록시석신이미드 에스테르, 아민에 의해 가교결합제, 예컨대 카보다이이미드, 알데하이드 및 기타 물질의 존재하에 달성될 수 있다. 다르게는 이러한 포획은 기생충 충란 뿐만 아니라 배설물의 다른 성분을 인식하는 매크로분자, 예컨대 단백질 또는 탄수화물에 의해 달성될 수 있다.
기질 상으로의 포획은 충란에 결합하는 특이적 화학물질에 의존할 필요는 없고 또한 물리적 방법, 예를 들어 여과에 의해 달성될 수 있는데, 이때, 충란은 큰 배설물 입자로부터, 비제한적 예로서, 100 ㎛ 필터를 통한 여과에 의해 분리될 수 있다. 충란 함유 여액은 이어서 포자 및 진균류를 비롯한 더 작은 입자(검출 시약이 또한 이들 세포에 결합될 수 있다면 이는 충란 검출을 간섭할 수 있음)를 제거하면서 충란을 가두기 위해 더 작은 필터(예를 들어, 10 내지 40 ㎛)를 통해 통과될 수 있다. 필터 상에 포획된 충란은 이어서 다른 곳에 기재된 바와 같이 검출되고 정량화될 수 있다. 다르게는, 충란은 고체 기질을 사용하지 않고도 배설물로부터 포획되고 분리될 수 있다. 예를 들어, 큰 배설물 입자는 느린-속도의 원심분리에 의해 제거될 수 있고, 충란은 더 빠른(그럼에도 불구하고 더 작은 입자 및 효모 및 진균류를 침강시키기에는 너무 느린) 스핀에 의해 상청액으로부터 수득된다. 다른 물리적 방법, 예컨대 확산, 전기영동, 크로마토그래피 또는 밀도 분리가 또한 검출 전에 충란을 분리하기 위해 사용될 수 있다.
충란 검출 방법은 포획이 특이적인지 또는 비-특이적인지의 여부에 의존한다. 포획 단계가 특이적이라면, 검출 방법의 선택은 덜 염격한데, 이는 오염 배설물 성분이 제거될 것이기 때문이다(예를 들어, CBD로 코팅된 자성 비드를 사용하여 충란을 포획하고, 이어서 검출을 위해 키틴 및 다른 당 중합체, 예컨대 셀룰로오스에 결합하는 형광 염료, 예를 들어 칼코플루오르 화이트를 사용함). 포획이 비-특이적이거나 반-특이적이고, 또한 충란이 아닌 성분이 트래핑된 경우, 검출은 충란과 오염원을 구별하기에 충분히 특이적이어야 한다. 가능한 비제한적 검출 방법으로는 다음이 포함된다: 육안 검사; 충란 자체에 특이적인 분자, 예컨대 항체, 키틴 결합 도메인, 렉틴 또는 다른 단백질[이들 모두는 적합한 리포터 기, 예컨대 형광단, 발색단, 효소, 착색된 마이크로입자, 퀀텀닷(quantum dot), 또는 콜로이드성 금속에 접합됨]의 부착, 및 그 뒤의 광학 검출. 일반적 세포 성분을 검출하기 위한 화학적 방법이 또한 사용될 수 있고, 이들은 당분야의 숙련가에게 공지된 검정을 사용하여 단백질, 탄수화물, 지질 및 핵산을 검출하기 위한 방법을 포함한다. 추가적으로 특이적 탐침자로의 충란 DNA 또는 RNA의 하이브리드화, 또는 PCR에 의한 이러한 핵산의 증폭이 또한 충란으로부터의 이의 방출 이후 사용될 수 있다. 검출에 특이성을 제공하기 위해 물리적 방법이 또한 사용될 수 있고(필요할 경우 기질로부터의 충란의 방출 이후), 이러한 방법의 비제한적 예로는 원심분리, 여과, 부유 또는 입자 계수가 포함된다[예를 들어, 장치, 예컨대 쿨터(coulter) 계수기, 세포 분류기, 또는 입도분석기(particle sizer)를 사용함]. 몇몇 경우, 기질이 입자 또는 비드의 형태로 존재하는 경우, 충란의 검출은 비드/입자 그 자체의 검출에 의해 간접적일 수 있다. 이러한 목적을 위해 사용되는 비드/입자는 검출을 용이하게 하기 위한 적합한 발색단 또는 형광단으로 임의적으로 표지화될 수 있다. 본 문서의 목적을 위해, "검출 시약"이라는 어구는 검출을 달성하기 위해 요구되는 모든 구성성분들을 내포하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 정의에 의해 효소에 결합된 항체로 구성되는 검출 제제는 추가로 적절한 효소 기질, 완충액 및 검출에 필요한 색 변화를 수행하기 위해 요구되는 다른 제제를 추가로 포함한다.
검출은 고체 기질에 여전히 결합된 충란에 의해, 또는 기질로부터 충란의 방출 이후 달성될 수 있고, 검출 시약의 결합은 포획 전 또는 후에 달성될 수 있다. 몇몇 경우에, 검출은 검출될 수 있는 성분을 노출 또는 방출시키는 화학물질로 충란을 처리함으로써 용이하게 될 수 있다. 이러한 화학물질의 비제한적인 예로는 계면활성제, 산화제, 카오트로픽 제제 및 효소가 포함된다.
적절한 포획 및 검출 시약의 선택에 의해, 충란 계수는 샘플중의 모든 충란, 또는 전체 문(phyla)으로부터 특정 종 수준까지의 다양한 분류군의 충란을 검출하도록 조정될 수 있다. 이는 포획 및 검출을 위해 단일 시약을 사용하거나, 포획 및 검출 단계중 하나 또는 둘 다에서 다중 시약을 사용함으로써 달성될 수 있다. 상이한 부류/종류로부터 적절한 시약과 함께 충란을 분리시킴으로써, 기생충 충란의 다수의 부류 또는 종류의 존재비(abundance)가 단일 시험에서 해결될 수 있다.
충란의 포획은 충란에 결합할 수 있는 다가 분자의 첨가에 의해 용액중 충란의 응집을 유도함으로써 용이하게 될 수도 있다. 덩어리진 충란은 배설물 현탁액으로부터 기질에 직접 결합되거나 이후 물리적 기법, 예컨대 원심분리 또는 부유에 의해 분리될 수 있다.
포획 및 검출은 또한 동시에, 예를 들어 탄소-나노섬유 망조직에 부착된 충란-특이적 항체로의 충란 결합시의 전압 변화를 검출함으로써, 또는 광학 방법, 예컨대 표면 플라스몬(plasmon) 공명 또는 굴절에 의해 수행될 수 있다.
한 경우에, 검출은 충란의 포획없이 달성될 수 있고, 이때, 형광단에 의해 표지화된 충란-특이적 분자, 예컨대 항체 또는 렉틴의 결합은 형광단 비등방성 또는 편광에 있어서의 변화에 의해 검출된다.
이에 따라, 몇몇 양태에서, 본 개시내용은 환경 샘플(예를 들어, 배설물 샘플)로부터 키틴-함유 기생 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 신규 방법을 제공한다. 본원에 개시된 방법은 현장에서 신속하게 수행될 수 있는 방법을 제공한다. 더욱 중요하게는, 본원에 개시된 방법은 기생 연충류의 각각의 주요 분류군(예를 들어, 촌충, 선충, 흡층, 및 단생목 흡충)으로부터 연충류 충란을 빠르고 비용-효율적 방식으로 검출할 수 있다. 동물을 감염시키는 연충류 기생충의 공동의 속으로는, 예를 들어, 하에몬쿠스(Haemonchus), 트리코스트론길루스(Trichostrongylus), 오스테르타기아(Ostertagia), 네마토디루스(Nematodirus), 쿠페리아(Cooperia), 아스카리스(Ascaris), 부노스토뭄(Bunostomum), 오에소파고스토뭄(Oesophagostomum), 차베르티아(Chabertia), 트리쿠리스(Trichuris), 스트론길루스(Strongylus), 트리코네마(Trichonema), 딕티오카울루스(Dictyocaulus), 카필라리아(Capillaria), 페아르소네마(Pearsonema), 헤테라키스(Heterakis), 톡소카라(Toxocara), 아스카르디아(Ascardia), 옥시우리스(Oxyuris), 안사이클로스토마(Ancyclostoma), 운시나리아(Uncinaria), 톡사스카리스(Toxascaris) 및 파라스카리스(Parascaris), 안사일로스토마(Ancylostoma), 네카토르(Necator), 트리키넬라(Trichinella), 카필라리아(Capillaria), 디옥토파이메(Dioctophyme), 에이메리아(Eimeria), 코시디아(Coccidia), 부르사펠렌쿠스(Bursaphelenchus), 오스테르타기아(Ostertagia), 메시스토시루스(Mecistocirrus), 트라이코스트론길루스(Trychostrongylus), 트리쿠리스(Trichuris), 부노스토이누인(Bunostoinuin), 오에소파고스토뭄(Oesophagostomum), 차베르티아(Chabertia), 안사일로스토마(Ancylostoma), 파라고니무스(Paragonimus), 바일리사스카리스(Baylisascaris), 아펠렌코이데스(Aphelenchoides), 멜리오도가이네(Meliodogyne), 헤테로데라(Heterodera), 글로보데라(Globodera), 나코부스(Nacobbus), 프라틸렌쿠스(Pratylenchus), 디틸렌쿠스(Ditylenchus), 크시피네마(Xiphinema), 론기도루스(Longidorus), 트리코도루스(Trichodorus), 네마토디루스(Nematodirus) 및 엔테로비우스(Enterobius)가 포함된다.
본 발명의 방법은 인간 및/또는 수의학적 용법을 위해서, 뿐만 아니라 환경 시험 영역에서 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법은 포유동물 피험체(예를 들어, 동물 또는 인간 피험체)로부터의 배설물 샘플(예를 들어, 대변 샘플)을 포함하는 생물학적 샘플을 수득하는 단계를 제공한다. 예를 들어, 배설물 샘플은 말, 소, 돼지, 염소, 양, 라마, 사슴, 개, 고양이, 새 또는 인간으로부터 수득되는 포유동물의 배설물 샘플일 수 있다. "수득하는"은 배설물 샘플을 수집하거나, 구매하거나, 획득함을 의미한다.
몇몇 양태에서, 본원에 개시된 신규 방법은 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 GlcNAc 결합 도메인 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본원에 사용될 경우 용어 "N-아세틸-D-글루코사민(GlcNac) 결합 도메인"은 천연의 또는 유전적으로 변형된 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNac) 결합 단백질, N-아세틸-D-글루코사민에 대해 특이적 결합 친화도를 갖는 무기 분자 및 유기 분자(이의 임의의 단편, 유도체 또는 유사체 포함)를 포함하는 임의의 분자를 지칭한다.
용어 "N-아세틸-D-글루코사민(GlcNac) 결합 단백질"은 본원에 사용될 경우 N-아세틸-D-글루코사민에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 천연의 또는 유전적으로 변형된 단백질, 펩타이드, 또는 항체(이의 임의의 단편, 유도체 또는 유사체 포함)를 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 예시적인 GlcNac 결합 단백질로는, 예를 들어, 렉틴, 키티나아제, 키틴 결합 단백질, 또는 키틴 결합 도메인(CBD)이 포함된다.
몇몇 양태에서, 본원에 개시된 신규 방법은 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 키틴 결합 단백질 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다. 용어 "키틴 결합 단백질"은 본원에 사용될 경우 키틴에 대하여 특이적 결합 친화도를 갖는 천연의 또는 유전적으로 변형된 단백질, 펩타이드, 항체를 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 키틴 결합 단백질로는, 예를 들어 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNac) 결합 단백질, 키티나아제, 및 단백질 키틴 결합 도메인(CBD)이 포함된다.
용어 "렉틴"은 본원에 사용될 경우 당류(즉, 탄수화물)와 특이적으로 상호작용하는, 천연 또는 유전적으로 변형된 단백질을 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 본원에서 예로서 천연 식물 렉틴을 지칭하지만, 용어 "렉틴"은 본원에서 임의의 종으로부터의 렉틴, 예컨대 비제한적으로, 원하는 탄수화물 결합 특이성을 갖는, 식물, 동물, 곤충 및 미생물로부터의 렉틴을 지칭한다. 식물 렉틴의 예로는, 비제한적으로, 콩과(Leguminosae) 렉틴 계열, 예컨대 ConA, 대두 응집소, 및 렌틸(lentil) 렉틴이 포함된다. 식물 렉틴의 다른 예는 렉틴의 벼과(Gramineae) 및 가지과(Solanaceae) 계열이다. 동물 렉틴의 예로는, 비제한적으로, 주요 그룹인 S-유형 렉틴, C-유형 렉틴, P-유형 렉틴, 및 I-유형 렉틴의 임의의 공지된 렉틴이 포함된다.
몇몇 실시태양에서, 렉틴은 밀 배아 응집소(WGA), 대두 응집소(SBA), 마클루라 포미페라 렉틴(MPL), 바우히니아 푸르푸레아 렉틴(BPL), 다투라 스트라모늄 렉틴(DSL), 라이코페르시콘 에스쿨렌텀 렉틴(LEL), 솔라눔 투베로숨 렉틴(STL) 및 프소포카르푸스 테트라고놀로부스-II(PTL-II)로 구성된 군에서 선택된다.
용어 "키틴-결합 도메인" 또는 "CBD"는 본원에 사용될 경우 키틴과 특이적으로 상호작용하는, 천연의 또는 유전적으로 변형된 단백질을 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. CBD는 당분야의 숙련가에게 공지되어 있고, 키티나아제로부터 또는 절지동물로부터의 각피 단백질로부터 유래될 수 있으며, 다수의 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하고, 예컨대 뉴 잉글랜드 바이오랩에 의해 공급된 임팩트(IMPACT: 상품명) 키트가 포함된다.
용어 "키티나아제"는 일반적으로 기질 키틴에 대해 특이적인 효소를 기재한다. 많은 상이한 유형의 키티나아제는 천연적으로 발생된다. 예를 들어, 키티나아제는 미생물, 예컨대 세라티아(Serratia), 비브리오(Vibrio), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 발견된다.
본 개시내용은 하나 이상의 검출가능한 잔기에 접합된 N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질을 비롯한 N-아세틸-D-글루코사민 결합 도메인을 제공한다. 본원에서 사용될 경우, 용어 "표지" 및 "검출가능한 잔기"는 상호교환가능하고, 결합 단백질에 부착(예를 들어, 접합)됨으로써 결합 단백질을 기기 또는 방법에 의해 검출가능하게 만드는 잔기를 지칭할 것이다.
개시된 본 발명의 실행에서 사용하기에 적합한 검출가능한 잔기의 비제한적 예로는, 예를 들어, 합텐, 효소, 발색단, 항체 에피토프, 항원, 형광단, 방사성동위원소, 나노입자, 결합 쌍의 구성원, 발광 화합물 및 금속 킬레이트가 포함된다.
본원에서 사용될 경우, 용어 "형광 표지" 및 "형광단"은 상호교환적으로 사용되고, 상이한 파장(여기 파장)의 방사선으로 조사될 경우 특정 파장(발산 파장)에서 전자기 에너지를 발산하고, 샘플중의 흥미로운 분석물과 특이적으로 상호작용하거나 반응하여 하나 이상의 광학 신호를 제공할 수 있는 화학적 또는 생화학적 분자를 내포하고자 하는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 대표적인 형광단으로는, 예를 들어, 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 플루오레세인, 플루오레세인 5-이소티오시아네이트(FITC), 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), 보디피 염료(인비트로겐) 및/또는 알렉사 플루오르 염료(인비트로겐), 단실, 단실 클로라이드(DNS-Cl), 5-(요오도아세트아미다)플루오레세인(5-IAF), 6-아크릴로일-2-다이메틸아미노나프탈렌(아크릴로단), 7-니트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일 클로라이드(NBD-Cl), 브롬화 에티듐, 루시퍼 옐로우, 로다민 염료(5-카복시로다민 6G 하이드로클로라이드, 리싸민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), 로다민 800), 테트라메틸로다민 5-(및 6-)이소티오시아네이트(TRITC), 텍사스 레드(등록상표), 설포닐 클로라이드, 나프탈아민 설폰산, 예컨대 비제한적으로, 1-아닐리노나프탈렌-8-설폰산(ANS) 및 6-(p-톨루이디닐)나프탈렌-2-설폰산(TNS), 안트로일 지방산, DPH, 파리나르산, TMA-DPH, 플루오레닐 지방산, 플루오레세인-포스파티딜에탄올아민, 텍사스 레드-포스파티딜에탄올아민, 피레닐-포스파티딜콜린, 플루오레닐-포스파티딜콜린, 메로시아닌 540, 나프틸 스티릴, 3,3'-다이프로필티아다이카보시아닌(다이S-C3-(5)), 4-(p-다이펜틸 아미노스티릴)-1-메틸피리디늄(다이-5-ASP), Cy-3 요오도 아세트아미드, Cy-5-N-하이드록시석신이미드, Cy-7-이소티오시아네이트, IR-125, 티아졸 오렌지, 아주레 B, 나일 블루, Al 프탈로시아닌, 옥삭신 1, 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI), 획스트 33342, TOTO, 아크리딘 오렌지, 에티듐 호모다이머, N(에톡시카보닐메틸)-6-메톡시퀴놀리늄(MQAE), 푸라-2, 칼슘 그린, 카복시 SNARF-6, BAPTA, 쿠마린, 파이토플루오르, 코로넨, 및 금속-리간드 착체가 포함된다.
본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 합텐으로는, 예를 들어, 디곡시게닌(digoxigenin), 글루타티온 및 비오틴이 포함된다.
본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 효소로는, 예를 들어, 알칼리성 포스파타아제(AP), 베타-갈락토시다아제, 호스 래디시 퍼옥시다아제(HRP), 대두 퍼옥시다아제(SBP), 우레아제, 베타-락타마아제 및 글루코오스 옥시다아제가 포함된다.
몇몇 실시태양에서, GlcNac 결합 단백질는 항체이다. 항-키틴(예를 들어, 항-GlcNac) 항체는 미국특허 제5,004,699호에 개시되고, 이들 항체는 진균류 및 효모의 검출을 위해 사용될 수 있다(미국특허 제5,004,699호).
검출가능한 잔기는 결합 쌍의 특이적 구성원(제1 구성원 또는 제2 구성원)일 수 있다. 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 결합 쌍으로는, 예를 들어, 비오틴/스트렙타비딘, 비오틴/아비딘, 비오틴/뉴트라비딘, 비오틴/캡타비딘, 에피토프/항체, 단백질 A/면역글로불린, 단백질 G/면역글로불린, 단백질 L/면역글로불린, GST/글루타티온, His-태그/금속(예를 들어, 니켈, 코발트 또는 구리), 항원/항체, FLAG/M1 항체, 말토오스 결합 단백질/말토오스, 칼모듈린 결합 단백질/칼모듈린, 효소-효소 기질, 및 수용체-리간드 결합 쌍이 포함된다. 몇몇 실시태양에서, GlcNac 결합 단백질은 결합 쌍의 제1 구성원(예를 들어, 비오틴, 아비딘, 뉴트라비딘, 캡타비딘, 항체, 항원, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, GST, His-태그, FLAG, MBP, 칼모듈린 결합 단백질, 효소, 수용체 또는 리간드)에 접합된다.
하나의 실시태양에서, GlcNac 결합 단백질은 밀 배아 응집소이고 검출가능한 잔기는 플루오레세인이다. 다른 실시태양에서, GlcNAc 결합 단백질은 키틴 결합 도메인 포함 단백질이고, 검출가능한 잔기는 플루오레세인이다.
몇몇 양태에서, 본원에 제공된 방법은 키틴에 직접 결합하고 형광-여기 광에 노출될 경우 형광을 발산하는 염료, 예컨대 미국특허 제6,440,388호에 개시된 염료를 이용한다. 키틴에 결합되거나 접합되고 자외선 또는 가시광선에서 형광을 발산하는 염료의 비제한적인 예로는 칼코플루오르 화이트, 우비텍스 3B(다이스티릴 다이페닐 형광 증백제), 라이룩스 BA, 라이룩스 BSU(1,4-벤젠다이설폰산-2,2'-[에틸렌다이일비스[(3-설포-4,1-페닐렌)이미노[6-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-1,3,5-트라이헥사나트륨 염)(오스타컬러, 체코 공화국 파르두비체) 및 블랑코포르(다이나트륨 4,4'-비스{(4-아닐리노)-6-모폴리노-1,3,5-트라이아진-2-일)아미노}스틸벤-2,2'-다이설포네이트)이다.
몇몇 실시태양에서, 결합 쌍의 제1 구성원은 GlcNac 결합 단백질에 접합되고 결합 쌍의 제2 구성원은 고체 지지체에 고정화된다. 다른 실시태양에서, 결합 쌍의 제1 구성원은 GlcNac 결합 단백질에 접합되고 결합 쌍의 제2 구성원은 효소, 항체 에피토프, 항원, 형광단, 방사성동위원소, 나노입자, 제2 결합 쌍의 구성원, 및 금속 킬레이트에 접합된다. 예를 들어, 결합 쌍의 제1 구성원은 비오틴일 수 있고 결합 쌍의 제2 구성원은 스트렙타비딘, 아비딘, 뉴트라비딘 또는 캡타비딘이고, 결합 쌍의 제2 구성원은 효소(예를 들어, 알칼리성 포스파타아제(AP), 베타-갈락토시다아제, 호스 래디시 퍼옥시다아제(HRP), 우레아제, 대두 퍼옥시다아제(SBP), 베타-락타마아제 또는 글루코오스 옥시다아제)에 접합된다.
몇몇 경우에, 키틴(예를 들어, GlcNac)은 다당류 캡슐 또는 연충류 충란에서 발견되는 거대분자 코팅물의 다른 유형에 의해 부분적으로 또는 완전히 차단될 수 있다. 그러나, 키틴은 극히 단단하고, 따라서 단백질분해효소 또는 다당류, 예컨대 글루카나아제(glucanase) 또는 만나아제(mannase)를 사용하는 효소적 분해가 사용되어 키틴 검출 이전에 차단 층을 투과하거나 제거한다. 다르게는, 극한 처리, 예컨대 미국특허공개 제2007/0099234호에 기재된 바와 같은 표백 용액(1% NaOCl, 0.5 M NaOH, 또는 개별 화학물질의 더 높거나 더 낮은 농도를 갖는 유사한 조성)에서의 표백이 사용되어 차폐 층을 제거할 수 있다. 이에 따라, 몇몇 실시태양에서, 본원에 제공된 방법은 연충류 충란을 GlcNac 결합 단백질과 접촉시키기 이전에, 샘플을 표백제 또는 다른 외피-노출 용액으로 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 제공된 방법에 따라서, 기생충 충란은 물 또는 다른 적합한 액체(완충 용액 포함)중의 동물 배설물의 현탁액에서 2-단계 공정, 즉 충란 포획 및 충란 검출에 의해 검출될 수 있다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 방법은 여과에 의해 충란을 포획하는 단계를 포함하고, 이러한 방법은 샘플 완충액에 현탁된 배설물 샘플을 포함하는 배설물 용액을 제공하는 단계, 제1 여과 막을 통해 배설물 용액을 유동시켜 제1 여액을 형성하는 단계, 및 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시켜 연충류 충란을 제2 여과 막 상에서 포획하는 단계를 포함한다.
하나의 양태에서, 이러한 방법은 샘플 완충액에 현탁된 배설물 샘플을 포함하는 배설물 용액을 수득하는 단계, 제1 여과 막을 통해 배설물 용액을 유동시켜 제1 여액을 형성하는 단계, 및 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계를 포함하고, 이때, 연충류 충란은 제2 여과 막 상에 포획된다. 이 방법은 제2 여과 막 상에 포획된 연충류 충란을, 검출가능한 잔기에 접합된 GlcNac 결합 단백질과 접촉시키는 단계, 및 배설물 샘플에서 연충류 충란의 존재 또는 부재를 신호 강도 검출가능한 잔기에 기초하여 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 본원에 제공된 방법은 제1 여과 막(예를 들어, 필터)을 통해 배설물 용액을 유동시키는 단계를 포함한다. 제1 여과 막를 통해 배설물 용액을 유동시키는 단계는 배설물 입자로부터의 충란의 분리를 허용한다. 이에 따라, 제1 여과 막은 충란이 필터를 통해 자유롭게 통과하도록 허용하는 기공 크기를 포함하고(예를 들어, 적어도 80 ㎛의 기공 크기를 가짐), 또한 배설물 입자를 포획한다.
이에 따라, 본원에 제공된 방법은 제1 여과 장치의 사용을 포함한다. 제1 여과 장치의 기공 크기는 일반적으로 기공이 연충류 충란 및 원충류 접합자낭이 자유롭게 통과하기에 충분히 큰 반면 배설물 용액으로부터의 미세 입자를 포획하기에 충분히 작도록 선택된다(예를 들어, 약 450 ㎛ 미만, 약 425 ㎛ 미만, 또는 약 400 ㎛ 미만). 몇몇 실시태양에서, 제1 여과 장치의 제1 여과 막은 약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 125 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 약 150 ㎛ 내지 약 200 ㎛, 또는 약 85 ㎛, 약 90 ㎛, 약 95 ㎛, 약 100 ㎛, 약 120 ㎛, 약 125 ㎛, 약 150 ㎛, 약 175 ㎛, 약 200 ㎛, 약 250 ㎛, 약 300 ㎛, 약 350 ㎛, 또는 최대한 약 400 ㎛의 기공 크기를 포함한다.
하나의 양태에서, 본원에 제공된 방법은 제2 여과 막(예를 들어, 필터)을 통해 배설물 용액을 유동시키는 단계를 포함한다. 이에 따라, 제2 여과 막은 필터를 통해 유체를 자유롭게 통과시키면서, 충란 또는 접합자낭을 포획하는 기공 크기를 포함한다(예를 들어, 80 ㎛ 이하의 기공 크기를 가짐).
이에 따라, 본원에 제공된 방법은 제2 여과 장치의 사용을 포함한다. 제2 여과 장치의 기공 크기는, 일반적으로 기공이 유체 및 미세 입자가 자유롭게 통과하기에 충분히 큰 반면 배설물 용액으로부터의 연충류 충란을 포획하는 크기(즉, 충분히 작음)로 조정되도록 선택된다. 기생 연충류 충란의 특징적 크기 및 직경은 약 20 ㎛ 내지 80 ㎛이다. 이에 따라, 배설물 용액으로부터의 연충류 충란을 포획하기 위해, 제2 여과 장치의 제2 여과 막은 5 내지 약 45 ㎛, 10 내지 약 45 ㎛, 15 내지 약 45 ㎛, 약 20 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 약 30 ㎛ 내지 약 35 ㎛, 또는 약 5 ㎛, 약 10 ㎛, 약 15 ㎛, 약 20 ㎛, 약 25 ㎛, 약 30 ㎛, 약 35 ㎛, 약 40 ㎛, 또는 약 45 ㎛의 기공 크기를 포함한다. 많은 원충류 접합자낭이 연충류 충란에 비해 더 작으므로, 더 작은 기공의 필터가 또한 사용될 수 있고, 예를 들어 약 0.1 내지 약 10 ㎛ 또는 약 5 내지 약 20 ㎛이다.
배설물 샘플에서 관련없는 배설물 찌꺼기의 최소화는 일관된 배설물 충란 계수에 유리하고, 전형적으로, 큰 입자 및 찌꺼기는, 배설물 샘플이 GlcNac 결합 단백질과 접촉하기에 적합하기 이전에, 배설물 샘플로부터 여과되어져야 한다. 이에 따라, 본원에 개시된 방법은 더 큰 입자 및 찌꺼기를 제거하기 위해 벌크 여과 장치의 사용을 임의적으로 포함한다. 벌크 여과 장치의 기공 크기는, 일반적으로 기공이 연충류 충란 및 원충류 접합자낭을 자유롭게 통과시키기에 충분히 큰 반면 배설물 물질로부터 큰 입자(예를 들어, 400 ㎛ 이상의 입자) 및 찌꺼기를 포획하기에 충분히 작도록 선택된다. 예를 들어, 벌크 여과 장치의 여과 막은 약 400 ㎛ 내지 약 800 ㎛, 약 425 ㎛ 내지 약 750 ㎛, 약 450 ㎛ 내지 약 700 ㎛, 약 500 ㎛ 내지 약 650 ㎛, 또는 약 550 ㎛ 내지 약 600 ㎛의 기공 크기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 벌크 여과 장치는 배설물 샘플을 수집하기 위해 사용되는 용기(예를 들어, 수집 용기)에 직접적으로 연결될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 벌크 여과 막은 약 400 ㎛ 내지 약 450 ㎛의 기공 크기를 갖고, 제1 여과 막은 약 85 ㎛ 내지 약 120 ㎛의 기공 크기를 갖고, 제2 여과 막은 약 20 ㎛ 내지 약 30 ㎛의 기공 크기를 갖는다.
당분야에서 인식될 수 있듯이, 여과 막을 통해 액체(예를 들어, 용액)의 부피를 유동시키는 많은 방식이 존재하고, 예컨대 중력 유동, 압력 또는 펌프의 도움에 의한 유동이다.
본 발명의 방법은 키틴을 적합한 리포터(예를 들어, 검출가능한 잔기)로 표지화함으로써 키틴-함유 기생 연충류 충란 및 원충류 접합자낭의 시각화를 허용한다. 적합한 리포터(예를 들어, 검출가능한 잔기)에 의한 키틴 결합 이후, 충란의 정량화는 (1) 색표(color chart)와 비교함으로써, 저렴한 단일-파장 색도계 또는 형광광도계를 사용함으로써, 또는 카메라, 셀 폰, 태블릿 또는 다른 디지털 촬상 디바이스를 사용하여 사진촬영한 후 색을 디지털 방식으로 정량화함으로써, 또는 (2) 형광 키틴-결합 유도체의 경우, 적절한 조명하에 자동화된 영상 분석과 함께 셀 폰 또는 적절한 광학장치가 구비된 다른 카메라에 의해 샘플을 촬상함으로써, 시각적으로 달성될 수 있다.
검출가능한 잔기는 검출가능한 광학 반응을 생성하는 광의 파장으로 조명되고, 광학 반응을 검출하기 위한 수단에 의해 관찰될 수 있다. 예컨대, 자외선 또는 가시광선 파장에 의해 조명할 경우, GlcNac 결합 단백질 또는 특이적 결합 쌍 구성원에 결합된 화합물을 비롯하여 형광 화합물은, 강한 가시성 흡수 뿐만 아니라 형광 발산을 나타낸다. 본 발명의 형광 화합물을 조명하기에 유용한 선택된 장치로는, 비제한적으로, 유리하게는, 휴대용 램프(예를 들어, 핸드헬드 자외선 램프)가 포함된다. 이들 조명 공급원은 휴대용 레이저 스캐너, 형광 마이크로플레이트(microplate) 판독기, 형광 겔 촬상장치, 표준 또는 소형 형광광도계, 표준 또는 소형 색도계 또는 크로마토그래피 검출기내로 임의적으로 통합된다. 검출 전에, 일부 또는 모든 여기 파장이 통과되는 것을 방지하면서도 일부 또는 모든 형광 발산 파장은 통과하도록 허용하는 광학 필터를 통해 통과시킴으로써 과량의 여기 광은 감소되거나 제거된다. 이러한 형광 발산은 육안 검사에 의해, 또는 촬상 디바이스: 디지털 카메라, 모바일 폰, 스마트폰, 태블릿, 휴대용 컴퓨터, 컴퓨터 및 스캐너중 임의의 장치를 사용함으로써 임의적으로 검출된다.
본 발명은 배설물 샘플에서 연충류 충란 및 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 다양한 형태를 취할 수 있다. 전형적으로, 키트는 샘플에서 연충류 충란을 검출하기에 적합한 시약을 포함할 것이다. 임의적으로 키트는 하나 이상의 대조 샘플을 함유할 수 있다.
본 발명의 키트는 임의적으로 수집 용기를 포함하고, 여기에서 일정량의 배설물 샘플이 위치되고 적합한 완충 용액에 의해 희석된다. 이어서, 이러한 용기는 밀봉되고 배설물 샘플 및 완충액은 진탕되거나 균질화되어 균일하게 혼합된 배설물 용액을 생성한다. 완충 용액은 평지 상수도이거나 적절히 완충된 매질 또는 부유 매질일 수 있다. 수집 용기는 배설물 수집용 1회용 용기이거나 재사용가능한 용기일 수 있다.
수집 용기는, 예를 들어 눈금이 그어진 일반적인 뚜껑있는 튜브의 형태이고, 이러한 눈금은 튜브 내부에 위치되는 원 상태의 대변 견본의 부피, 뿐만 아니라 첨가되는 희석 액체의 양을 지시한다.
몇몇 실시태양에서, 수집 용기는 벌크 여과 장치에 부착된다.
키트는 또한 배설물 샘플을 수집하기 위한 구조물, 예컨대 대변 수집용 1회용 용기 등, 뿐만 아니라, 예를 들어 정해진 양의 배설물 물질을 떠내기 위한 작은 숟가락 모양의 스쿠핑 디바이스(scooping device)를 포함할 수 있다. 스쿠핑 디바이스(스쿠프: scoop)는 용기의 뚜껑의 일체형 부분일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 키트는 본원에 기재된 바와 같은 제1 여과 장치, 임의적으로 제2 여과 장치, 및 임의적으로 벌크 여과 장치를 포함한다.
본 발명의 키트는 GlcNAc 결합 단백질을 함유하는 시약(예를 들어, 시약 용액)을 포함한다. GlcNac 결합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 렉틴 또는 CBD일 수 있다. 임의적으로, GlcNac 결합 단백질은 검출가능한 잔기에 접합된다. 하나의 실시태양에서, 시약은 키틴에 직접적으로 결합되거나 접합될 수 있는 염료를 함유하고, 키틴이 결합된 염료로부터 형광을 여기시킬 수 있는 파장을 발산하는 광 및 광원에 노출될 때 형광을 발산한다.
키트는 검출가능한 잔기를 검출하기 위한 휴대용 시스템, 예컨대 형광광도계, 색도계, 분광광도계, 또는 다른 촬상 디바이스를 포함할 수 있다. 키트는 또한 샘플을 유지시키도록 고안된 크래들(cradle) 및 검출가능한 잔기를 검출하기 위한 휴대용 시스템을 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 키트는 촬상 디바이스를 유지하고 함유하는 크래들을 포함한다.
키트의 몇몇 양태(예를 들어, 여과 시스템의 재사용가능한 부분 또는 검출 장치)는 키트의 다른 양태(예를 들어, 단일-사용 필터 모듈의 검출 시약)와 별도로 판매될 수 있다.
본 발명의 키트는 인간 및/또는 수의학적 용법을 위해 사용될 수 있다.
상기 개략된 일반적 원리는 배설물 현탁액에서 기생충 충란의 존재 및 존재비를 검출하기 위한 다수의 시스템을 고안하기 위해 사용될 수 있다. 예시할 목적으로, 이들 원리를 사용하여 생산될 수 있는 몇몇의 충란 계수 검정의 다수의 비제한적인 예를 수행한다. 이들 예는 단지 본 발명이 실행될 수 있는 많은 상이한 방식중 몇몇을 예시할 목적으로 제공되고, 전체 발명에 대한 설명으로서 고려되어서는 안된다.
기생충 충란의 성공적인 검출 및 정량화는 배설물 샘플 전체로부터 충란을 분리(및 이상적으로는 농축)하는 방법, 및 이어서 상기 충란을 검출하는 방법 둘 다를 필요로 함을 주지해야 한다. 분리 방법이 또한 다른 배설물 성분을 공동-분리할 수 있고 검출 방법이 이들 사이를 구별짓지 않는다면, 검정은 특이적이지 않을 것이다. 예를 들어, 장(Zhang) 및 맥레이놀즈(McReynolds)23는 진단 목적을 위해 생물학적 샘플에서 키틴을 검출하기 위한 다양한 키티나아제 효소로부터의 키틴 결합 도메인(CBD)의 용도를 개시한다. 그러나, 많은 유기체, 예를 들어, 효모, 다른 진균류, 선충(및 이들의 충란) 모두는 키틴을 함유하므로, 단지 이의 검출은 임의의 이들 유기체에 대한 결정적인 진단으로서 간주될 수 없다. 유사하게, 윈터스(Winters)24는 효모 및 진균류의 존재를 진단하기 위한 방법으로서 생물학적 샘플에서 키틴을 검출하는 항-키틴 항체의 용도를 개시한다. 그러나, 윈터스는 연충류 또는 그들의 충란에서 키틴의 검출 가능성을 고대하지 않았고, 따라서 개시된 검정은, 효모 및 진균류 뿐만 아니라 연충류 또는 그들의 충란중 하나의 존재에 대한 가능성이 제거될 수 없는 한, 이들에 대해서 특이적인 것으로 고려될 수 없다. 동물 배설물의 경우(특별히 초식동물의 경우), 효모 및 진균류 세포(및 포자), 및 곤충 부분이 존재할 수 있고, 따라서 키틴의 존재 단독으로는 기생충 충란의 존재에 대한 명확한 진단으로 고려될 수 없을 뿐만 아니라, 기생충 충란의 정량화 또한 잠재적으로 다양한 배경의 다른 키틴-함유 유기체의 존재하에 신뢰가능하게 고려될 수 없다.
또한 다양한 렉틴이 상이한 종의 기생충 및 그들의 충란 사이를 구별하기 위해 사용될 수 있는 것으로 제시되었다. 그러나, 대부분의 렉틴은, 이들이 다양한 다수의 유기체에 존재할 수 있는 당 구조물을 인식하므로 반-특이적인 것으로 공지되어 있다. 이에 따라, 렉틴 결합이 반응성 종 및 비-반응성 종 사이를 구별할 수 있지만, 일반적인 원리로서, 렉틴 결합 단독으로는, 모든 다른 가능한 오염 유기체가 결합-음성인 것으로 제시되지 않는 한, 기생충 체내침입의 결정적 진단을 제공할 수 없다.
몇몇 실시태양에서, 배설물 샘플은 물 또는 적합한 완충액, 예컨대 비제한적으로, 인산염 완충액 염수(PBS)에 현탁되고, 기생충 충란에 결합가능한 시약(예를 들어, GlcNac 결합 단백질)으로 코팅된 비드와 접촉된다. 시약은 이러한 충란에만, 또는 흥미로운 분류군의 충란에 특이적이거나, 충란 및 배설물의 다른 성분들에 특이적일 수 있다. 특이적 시약으로는, 예를 들어, 흥미로운 특정 유기체에 대해 상승하거나 유기체의 다수의 분류군을 인식하는 단일클론성 항체, 또는 다수의 분류군 또는 단일 유기체에 대해 상승하는 다중클론성 항체, 또는 다수의 단일클론성 및/또는 다중클론성 항체의 혼합물이 포함된다. 비-특이적 시약은 단백질, 예컨대 CBD 또는 렉틴 또는 이의 혼합물을 단독으로 또는 항체와 함께 포함한다. CBD의 경우, 결합은 7 이상의 상승된 pH에서 및/또는 높은 염 농도에서, 예를 들어, 비제한적으로 0.5M NaCl에서 CBD를 적용함으로써 증진될 수 있다. 본 문서의 목적을 위해, CBD는 임의의 종으로부터의 단일 키틴 결합 도메인, 뿐만 아니라 화학적 접합에 의해 또는 비-CBD 서열을 개입하거나 하지 않고 둘 이상의 CBD의 탠덤(tandem) 반복부의 유전적 융합부의 발현에 의해 생산된 다중 CBD를 지칭하는 것으로 이해된다. 또한 CBD는 자연에서 발견되는 천연 서열일 필요가 없고, 결합 키틴에 결합할 수 있는 인공적 펩티드 서열, 또는 천연 서열과 비교하여 동일하거나 상이한 결합 친화도를 갖는 CBD의 돌연변이 변형체일 수 있는 것으로 이해된다.
다른 실시태양에서, 완충액은 또한 충란에 원하는 표적 결합 자리를 노출시키는 것을 돕는 시약을 임의적으로 함유할 수 있고, 비제한적으로, 계면활성제[예컨대 트윈(Tween)-20, 나트륨 도데실 설페이트 및 트리톤(Triton) X-100], 산화제(예컨대, 차아염소산 나트륨, N-클로로토실아미드 또는 과산화 수소), 카오트로프(chaotrope)(예컨대, 우레아 또는 구아니디늄 하이드로클로라이드), 효소(예컨대, 프로테아제, 글리코시다아제 또는 리파아제) 또는 표백제가 포함된다.
결합될 경우, 충란(및 가능하게는 다른 배설물 성분)이 적재된 비드는 배설물의 나머지로부터, 예를 들어, 여과에 의해(비드 및 이들의 적하물을 보유하지만 다른 배설물 찌꺼기를 보유하지 않기에 충분한 기공 크기를 갖는 필터를 사용함), 또는 원심분리에 의해 물리적으로 분리된다. 다르게는, 비드는 철이 내장될 수 있고, 이러한 상자성 또는 자성 비드(이는 쉽게 상업적으로 입수가능함)는 자기장의 적용에 의해 배설물 현탁액의 나머지 부분으로부터 분리될 수 있다.
비드를 분리하면, 비드는 작은 부피(예를 들어, 100 ㎕)의 완충액에 현탁되고 현미경을 사용하여 광학적으로 검사된다. 이러한 방법은 육안 검사의 불편을 제거하면서도, 이는 다수의 충란을 배설물로부터 분리하고 계수할 수 있도록 허용한다. 현행의 방법은 수 g의 배설물 샘플의 단지 1/25 내지 1/200을 샘플링하여, 낮은 감도 및 높은 변동성을 초래한다. 상기 방법은 이와 같은 서브샘플링을 제거함으로써 이들 문제 둘 다를 제거한다.
도 1에 도시된 하나의 양태에서, 충란은 자성 비드를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 분리된다. 하나의 실시태양에서 비드에 부착된 포획 시약은, 비드의 표면 상의 니켈 원자에 결합하는 N- 또는 C-말단에서의 6개의 히스티딘 잔기의 서열에 의해 자성 비드에 가역적으로 부착되는 CBD이다. 다른 실시태양에서, CBD는, CBD를 말토오스로 코팅된 비드에 가역적으로 부착시키기 위해 사용되는 말토오스 결합 단백질(MBP)과 같은 담체에 융합된다. 이들 실시태양에서, CBD는 비제한적인 예로서 히스티딘, 이미다졸 또는 말토오스의 첨가에 의해 비드로부터 탈착될 수 있다.
충란의 분리 및 배설물 찌꺼기의 제거시, 결합된 물질은 적절한 용리제(예를 들어, 히스티딘(또는 이미다졸) 또는 말토오스의 용액)의 첨가에 의해 비드로부터 방출된다. 이어서, 비드는 자석에 재부착되고, 자유로운 충란 및 배설물 물질을 함유한 용액은 필터로부터 배수된다. 이 단계의 목적은 CBD에 또한 결합할 수 있는 진균류 및 효모 세포를 충란으로부터 분리하는 것이다. 필터 기공 크기는 더 작은(5 내지 40㎛) 효모 및 진균류 세포가 통과하도록 허용하지만 더 큰 충란 세포(50 내지 100㎛)를 보유하여, CBD 단독으로는 이러한 시스템에 제공하지 않는 특이성을 제공하도록 선택된다. 용액을 흡입시킬 때, 단지 충란(CBD 부착됨) 및 비드(이는 자석에 의해 튜브의 측부에 접착됨)가 시험 챔버에 보유된다.
용액의 흡입은 용출 분자(예를 들어, 히스티딘(또는 이미다졸) 또는 말토오스)를 제거하므로, 신선한 완충액의 첨가 및 자석의 제거는 충란이 부착된 CBD를 경유해 비드에 재결합하도록 허용한다. 비드는 그들의 철 함량에 의해 갈색을 띄므로, 이들은 충란에 결합되지 않은 비드의 제거 후에 존재하는 충란의 수를 정량화하기 위해 그 자체로 사용될 수 있다. 비드는 그 자체로 충란에 비해 훨씬 작으므로(상업적으로 입수가능한 비드는 0.2 내지 5 ㎛의 크기 범위임), 결합되지 않은 비드는 동일한 필터를 통한 제2 통과에 의해 제거된다(상이한 튜브를 통해 신선한 필터가 또한 사용될 수 있음).
이어서, 보유된 충란-결합 비드는 신선한 완충액에 재현탁되고, 현탁액을 검출 챔버내로 부음으로서 정량화된다. 챔버의 바닥은 충란-비드 착체를 작은 표면적으로 유인하는 소형 자석을 갖는다. 이러한 검출 챔버의 목적은, 샘플에 존재하는 비드(및 이에 따라 충란)의 수를 정량화하기 위해, 비드 색을 강화시키도록 충란/비드 착체를 농축시키고 표준화된 색표와 비교하여 색 강도를 시각적으로 결정할 수 있도록 하는 것이다. 다르게는, 이러한 면적은 색 강도의 더욱 정확한 판독을 수득하기 위해 광학 센서에 의해 촬상될 수 있다.
비드(및 이에 따라 충란)의 수는 분광광도계 또는 단일-파장 색도계를 사용하여 광학적으로 결정되어 충란/비드 현탁액의 혼탁도를 측정한다.
몇몇 실시태양에서, 충란은 빛을 산란시키는 이들의 능력을 측정함으로써 비드로부터의 초기 방출시 정량화된다. 효모 및 진균류는, 존재한다면, 검출을 위한 빛의 적절한 파장을 선택함으로써, 또는 입도분석기를 사용함으로써 이들의 더 작은 크기에 기초하여 충란으로부터 차별화될 수 있다.
다른 실시태양에서, 포획 시약은 반드시 CBD일 필요가 없고, 비제한적인 예로서, 항체(단일- 또는 다중클론성) 또는 렉틴(또는 렉틴의 혼합물)일 수 있다.
다른 실시태양에서, 포획 시약은 기생충 충란에만, 또는 임상적으로 흥미로운 충란의 하위집합에만 특이적이고, 따라서 단지 하나의 흡입 단계(용출 시약을 사용하지 않음)가 결합되지 않은 비드를 제거하기 위해 사용될 수 있어서, 상기 기재된 바와 같이 충란/비드 착체의 정량화를 용이하게 한다.
또 다른 실시태양에서, 포획 시약이 또한 효모 및/또는 진균류에 결합되고, 비드에 결합된 효모 및/또는 진균류 세포가 필터(이의 기공 크기는 충란/비드 응집체/착체를 보유하도록 충분히 작음)에 의해 보유되도록 충분히 큰 응집물 또는 착체를 형성하지 않는다면, 또는 효모 및/또는 진균류 축적량이 검정에서 임상적으로 유의미한 배경을 생성하지 않는다면, 단지 하나의 흡입 단계(용출 시약을 사용하지 않음)가 결합되지 않은 비드 및 효모/진균류(존재할 경우)를 제거하기 위해 사용될 수 있고, 이어서 상기 기재된 바와 같이 충란/비드 착체의 정량화를 용이하게 한다.
다른 실시태양에서, 결합되지 않은 충란의 검출은, 비제한적 예로서, 단백질 검정, 탄수화물 검정을 이용하는 색소생산 반응에 의해, 또는 다른 인식 분자, 예컨대 항체, 렉틴 또는 CBD의 충란으로의 부착에 의해 달성된다. 후자의 경우, 분자는 리포터 기, 예컨대 발색단, 형광단, 착색된 마이크로비드, 퀀텀닷, 콜로이드성 금속 또는 색소생산 효소(예를 들어, HRP 또는 AP)에 접합된다.
다른 실시태양에서, 및 충란-특이적 포획의 경우에, 검출은 충란 포획 및 비드의 세척 직후, 방법, 예컨대 다른 곳에서 설명된 방법에 의해 수행될 수 있고, 여과 단계는 필요하지 않다.
다른 실시태양에서, 충란-특이적 포획의 경우에, 충란의 검출은 입자 계수 장치, 예컨대 쿨터 계수기, 세포 분류기 또는 입도분석기를 사용하여 비드로부터 방출되거나 방출되지 않고 실행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 충란/비드 착체는 화학적 검출을 위한 성분을 방출하기 위해 시약으로 처리된다. 이러한 시약으로는, 비제한적으로, 프로테아제, 글리코시다아제(키티나아제 포함), 계면활성제, 카오트로프 및 산화제가 포함된다.
본원에 개시된 방법은, 고가의 특수화된 장비 또는 훈련이 필요하지 않으므로, 현장에서 수의사에 의해, 또는 동물 소유주 스스로 배설물 충란 축적량을 정량화할 수 있도록 한다(자석, 비드, 단일-파장 색도계는 모두 저렴하게 제작될 수 있고, 조작을 위한 특수화된 훈련이 필요없다).
하나의 양태에서, 본원에 개시된 방법은, 필요하다면 실제 형태가 달라질 수 있지만, 고체 표면, 예컨대 물질의 2차원 스트립(strip)에 결합된 포획 시약(예컨대, 항체, 렉틴 또는 CBD)의 사용을 포함한다. 스트립은, 비제한적으로, 플라스틱(예컨대, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌) 또는 다른 중합체(예컨대, 셀룰로오스, 포스포셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴 다이플루오라이드)를 비롯한 임의의 화합성 물질로 구성된다. 포획 시약은 당분야의 숙련가에게 이용가능한 많은 반응성 화학물질중 하나에 의해 표면 화학의 성질에 따라서 표면에 결합된다. 이러한 표면으로 단백질을 결합시킬 수 있는 가능한 비제한적 분자로는 다이석신이미딜 수베레이트, 다이메틸 아디피미데이트, 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 또는 N-하이드록시석신이미드가 포함된다. 포획 시약은 표면 전체에 적용될 필요가 없고, 특정 영역, 예컨대 스팟(spot) 또는 스트립으로 국소화될 수 있다.
다른 실시태양에서, 포획 시약은 상기 기재된 방식으로 가역적으로 표면에 부착된다.
표면은 충란이 결합할 수 있도록 배설물 현탁액과 접촉되고, 이어서 배설물 오염물을 제거하기 위해 세척된다. 이어서, 스트립은 검출 시약이 함유된 용액과 접촉된다. 검출 시약은 다시 충란과 결합할 수 있는 다수의 분자일 수 있고, 적합한 리포터에 접합된 항체, 렉틴 또는 CBD가 포함된다. 리포터는 표면 상에 시각적 신호를 발생할 수 있어야 하고, 발색단, 형광단, 효소, 콜로이드성 금속, 퀀텀닷, 또는 착색된 마이크로입자가 포함된다. 효소의 경우, 표면은 세척되고, 이어서 적합한 기질과 접촉되는데, 이의 생성물은 시각화를 위해 표면 상에 침착되도록 불용성이어야 한다. 이러한 시스템의 두 가지 비제한적인 예는 효소 호스 래디시 퍼옥시다아제 및 기질 4-클로로-1-나프톨 또는 3,3'-다이아미노벤지딘, 또는 효소 알칼리성 포스파타아제 및 기질 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 및 니트로블루 테트라졸륨이다.
기질 상에 포획된 충란의 수에 비례적인 색의 침착시, 충란의 수는 보정된 색표와 시각적으로 비교함으로써, 또는 예컨대 색도계 또는 농도계와 같은 장치를 사용함으로써 정량화된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 고정화된 충란의 효소적 검출은, 가용성의 착색된 생성물이 용액으로 방출되어 광학적으로 검출될 수 있는 색 변화를 생성하는 기질에 의해 수행된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 및 포획 시약이 표면에 가역적으로 결합되는 경우에, 충란/포획 시약은 결합 및 세척 후 방출된 다음 용액에서 검출된다.
다른 실시태양에서와 같이, 충란은 임의의 단계에서 상기 이미 개시된 시약에 의해 임의적으로 처리되어 포획 또는 검출에 필수적인 자리를 노출시키거나 검출 분자를 방출한다.
몇몇 양태에서, 본원에 개시된 방법은, 예를 들어, 소비자 가정용 임신 테스트에서 사용되는 것과 유사한 측방향 유동 형식으로 적용된다. 샘플 챔버가 포함된 장치의 한쪽 말단이 용액내로 위치되거나, 용액의 샘플이 장치중의 챔버내로 분사된다. 챔버는 검출 제제, 예컨대, 비제한적으로, 착색된 마이크로입자, 퀀텀닷 또는 콜로이드성 금속에 접합된 항체, 렉틴 또는 CBD를 포함한다.
챔버에 진입시, 샘플(현재 검출 시약에 결합된 충란 포함)은 모세관 작용에 의해 고체 기질, 예컨대 페이퍼 또는 다른 소결된 중합체의 스트립으로 흡수된다. 이러한 스트립의 일부는 상기 기재된 것과 유사한 포획 시약으로 코팅되어, 충란 및 연관된 착색된 검출 시약을 고정화시킬 수 있다.
충란/시약 착체의 접착에 의해 포획 시약으로 코팅된 스트립의 영역 상에서의 색의 발색은 배설물에 존재하는 충란의 수를 진단한다. 숫자는 보정된 색표와 비교함으로써 시각적으로, 또는 적절한 신호 처리가 수반되는 전하 커플링된 장치 또는 유사한 장치에 의한 색의 촬상에 의해 전기적으로 결정될 수 있다.
충란의 포획을 최대화하기 위해, 이상적으로 포획 시약은 충란에 대해 가장 특이적인 반면 검출 시약은 덜 구별적일 수 있지만, 그 반대일 수도 있다. 다른 곳에서 기재된 다른 실시태양에서와 마찬가지로, 포획 및 검출 시약을 위한 주요 기준은, 이들 둘다에 대한 결합이 기생충 충란 또는 기생충 충란의 하위집합을 제외한 모든 배설물 구성성분에 대해 상호 배타적이라는 것이다.
다른 실시태양에서와 마찬가지로, 충란은 상기 이미 개시된 시약에 의해 배설물 현탁액에서 임의적으로 처리되어 포획 또는 검출에 필수적인 자리를 노출시키거나 검출 분자를 방출한다.
몇몇 실시태양에서, 스트립은 상이한 종의 분류군에 각각 특이적인 포획 제제로 코팅된 둘 이상의 영역을 포함한다. 이러한 경우 다수의 착색된 영역은 상이한 종류의 기생충 충란의 양에 상응하여 발색된다.
다른 실시태양에서, 샘플 챔버는 상이한 종 또는 분류군으로부터의 충란을 각각 인식하는 다수의 검출 제제를 함유한다. 이어서, 표지화된 충란은 단일 영역에 포획되고, 각각의 유형의 충란의 양은 그 영역을 촬상하고, 이어서 검출된 최종 색에 대한 각각의 착색된 시약의 상대적 기여(및 따라서 충란 유형/수)를 컴퓨터에 의해 재구성함으로써 결정된다.
검출 시약은 장치의 적용 이전에 배설물 현탁액과 직접적으로 혼합될 수 있고, 이에 따라 장치의 샘플 챔버에 저장되지 않는다.
다른 실시태양에서와 마찬가지로, 충란은 임의의 단계에서 상기 이미 개시된 시약에 의해 임의적으로 처리되어 포획 또는 검출에 필수적인 자리를 노출시키거나 분자를 방출한다.
몇몇 양태에서, 이러한 방법은 상기 기재된 방법을 사용하여 투명한 표면 상에 그 자체로 고정화되는 적합한 포획 시약에 의해 충란을 포획하는 단계를 포함한다. 투명한 표면은 임의의 용기의 형태를 취할 수 있고, 비제한적으로, 튜브, 크벳(cuvette), 접시 또는 하나 이상의 웰(well)을 포함하는 플레이트(plate)가 포함된다.
배설물 찌꺼기를 제거하기 위해 세척할 경우, 상기 기재된 방식으로 표지화된 검출 시약이 첨가된다. 결합된 검출 시약의 색(또는 검출 시약의 효소적 활성에 의해 발색된 색)은 보정된 색표와 비교하여 시각적으로, 또는 장치, 예컨대 색도계, 마이크로플레이트 판독기, 분광광도계 또는 형광광도계를 사용하여 측정된다.
본 발명의 다른 양태에서, 검출 시약은 존재하지 않고, 충란의 결합은 충란 결합시 투명한 표면의 굴절 지수에서의 차이를 측정함으로써, 또는 다른 광학 방법, 예컨대 표면 플라스몬 공명 또는 굴절률 측정에 의해 결정된다.
다른 실시태양에서와 마찬가지로, 충란은 임의의 단계에서 상기 이미 개시된 시약에 의해 임의적으로 처리되어 포획 또는 검출에 필수적인 자리를 노출시키거나 분자를 방출한다.
이러한 실시태양, 및 예시할 목적의 도 2에 도시된 예에서, 충란은 물리적 방법(즉, 여과)에 의해 포획되고 효모 및 진균류로부터 분리된다. 충란은 적합한 용기에서 균질화되고, 이어서 충란의 통과를 용이하게 하는 기공 크기(예를 들어, 약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛)를 갖는 제1 여과 막을 통해 여과된다. 기공 크기는 또한 더 큰 배설물 찌꺼기를 제거하기 위해 선택될 수 있고, 이에 따라 샘플을 투명하게 만드는 것을 돕고, 이에 따라 본 방법의 후속적인 단계에서 필터가 막힐 가능성을 감소시킨다.
이어서, 여액은 제2 용기로 위치되고, 연충류 충란을 보유하도록 충분히 작지만(예를 들어, 약 20 ㎛ 내지 약 45 ㎛), 효모 및 진균류 세포를 비롯한 더 작은 입자의 통과 및 제거를 허용하는 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 통과된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 샘플은 더 큰 입자를 점진적으로 제거하기 위해 다수의 필터를 통해 또는 연속적으로 감소되는 기공 크기를 통해 통과되고, 이 동안 충란을 보유하는 최종 필터에 도달하기 전에 충란을 보유한다.
필터에 의한 충란의 포획시, 충란 결합/검출 시약이 첨가되어 충란에 결합된다. 결합 시약은, 비제한적으로, GlcNac 결합 단백질, 예를 들어 항체, 렉틴, 또는 CBD를 포함할 수 있다. 검출 시약은, 비제한적으로 효소, 발색단, 형광단, 착색된 미소구체 또는 나노구체(nano-sphere), 퀀텀닷 또는 콜로이드성 금속을 포함할 수 있다. 결합 시약은 포획 시약에 직접 화학적으로 커플링되어 단일 분자 실체(entity)를 형성하거나(예를 들어, 당분야에 공지된 단백질 가교결합 화학물질을 사용하는 충란 특이적 항체 또는 CBD의 효소, 예컨대 호스 래디시 퍼옥시다아제로의 화학적 커플링), 비-공유적(예를 들어, 정전기적 또는 소수성) 상호작용에 의해 회합될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 결합 시약은 His6 태그를 포함하고, 검출 시약은 상호작용을 용이하게 하기 위해 부착된 금속, 예컨대 니켈, 구리 또는 코발트를 함유한다. 결합 및 검출 시약이 공유적으로 결합되지 않는다면, 이들은 예비혼합되어 충란 샘플에 첨가되기 전에 이들의 상호작용을 용이하게 하거나, 별도로 첨가되어 이들의 상호작용이 충란의 존재하에 발생되도록 허용한다.
효소적 검출 제제의 경우, 효소는 임의적으로 결합 시약 및 효소 둘 다의 유전적 융합물로서 생산되어 단일 분자 실체를 형성한다. 비제한적인 예는 CBD와 알칼리성 포스파타아제 유전자가 융합되어, 충란에 결합되어 이를 검출하기 위해 사용될 수 있는 CBD-AP 융합 단백질을 생성하는 것이다. 이러한 경우, 시약의 결합 친화도 및 검출 감도를 조정하기 위해, 작성물은 다수의 결합 도메인(동일한 도메인의 반복부 또는 다수의 상이한 도메인 포함) 및 다수의 효소 도메인(동일한 도메인의 반복부 또는 다수의 상이한 도메인 포함)을 인코딩하여 제조될 수 있다.
검출 시약과 함께 항온처리할 경우, 결합되지 않은 시약을 제거하면서도 충란을 보유하기 위해 샘플은 다시 여과되고, 임의적으로 세척되어 결합되지 않은 시약의 완전한 제거를 확보한다.
이어서, 충란의 수는 제자리에서, 또는 충란/시약 혼합물을 용기로부터 제거한 후 정량화될 수 있다. 발색단, 형광단 및 광학적으로 직접 정량화될 수 있는 다른 검출 제제의 경우, 이들은 우선 비제한적인 예로서 산, 알칼리, 카오트로픽제, 계면활성제 또는 염을 사용하여 검출 전에 비드로부터 용출될 수 있다. 이러한 방출 이후, 시약은 임의적으로 검출 이전에 여과에 의해 충란으로부터 분리될 수 있다.
효소적 검출 시스템의 경우, 존재하는 충란의 수를 지시하는 착색된 반응 생성물은 가용성이거나 불용성일 수 있다. 가용성 생성물의 경우, 이들의 광학 강도는 또한 용기내에서 제자리에서, 또는 용기로부터 제거된 후, 또는 여과되어 충란 및 임의의 잔여 배설물 입자를 제거한 후 결정될 수 있다. 불용성 생성물은 현탁액의 혼탁도를 측정함으로써 유사하게 검출될 수 있거나, 기공 크기가 생성물을 보유하기에 충분히 작은 막을 통해 추가적으로 여과된 후, 필터의 표면 상에서 광학 검출이 수행된다.
실시예
본 발명은 하기 실시예서 추가로 설명되며, 이는 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
상기 개략화된 일반적인 원리는 배설물 현탁액 또는 환경 샘플에서 기생충 충란 및 원충류 접합자낭의 존재 및 존재비를 검출하기 위한 다수의 시스템을 고안하기 위해 사용될 수 있다. 예시할 목적으로, 이들 원리를 사용하여 생산될 수 있는 몇몇의 충란 계수 검정에 대한 다수의 비제한적인 실시예를 수행한다. 이들 실시예는 단지 본 발명이 실행될 수 있는 많은 상이한 방식중 일부를 예시할 목적으로 제공되고, 전체 발명에 대한 설명으로서 고려되지 않아야 한다.
실시예 1
본 실시예는, 90 ㎛ 및 27 ㎛의 기공 크기를 갖는 플루리셀렉트(Pluriselect) 필터[플루리셀렉트 플루리스트레이너(Pluriselect PluriStrainer: 등록상표) 셀 스트레이너(Cell Strainer)]가 a) 원치않는 배설물 찌꺼기를 여과하고, b) 원충(strongyle) 충란을 포획하고 가능하게는 이를 농축시키기에 적합한지의 여부를 조사하였다.
배설물 충란 계수를 말 배설물 샘플에 대해 맥마스터 방법을 사용하여 우선 추정하였다. 5 g의 배설물을 45 ㎖의 부유 매질(37.5% 글루코오스/25% 염화 나트륨)에 현탁시켰다. 현탁액을 빌트-인(built-in) 체(약 0.5 mm 메쉬 크기)가 구비된 필 플로택(Fill Flotac) 용기에서 혼합하였다. 2개의 계수 챔버를 충전시켰다(동일하게 1.0 ㎖의 현탁액 검사). 이는 1 g 당 10개 충란의 증배율을 산출한다.
이어서, 10 ㎖의 부유 매질 현탁액을 90 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 필터를 통해 여과하였다. 맥마스터의 하나의 계수 챔버(0.5 ㎖)에 여액을 충전시키고 충란의 존재를 검사하였다. 이는 약 20 EPG의 증배율을 나타낸다.
이어서, 통과된 샘플을 27 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 필터를 통해 통과시켰다. 다시, 0.5 ㎖를 맥마스터 챔버에서 검사하였다(약 20 EPG의 증배율). 27 ㎛ 필터 상에 수집된 물질을 1 ㎖의 부유 매질에 재현탁시키고 하나의 맥마스터 챔버(0.5 ㎖)내로 적재하고, 계수하였다. 이때, 여액이 정확히 0.5 ㎖에 재현탁된다면 증배율은 약 2 EPG일 것이다.
맥마스터 90 ㎛ 여액 27 ㎛ 여액 27 ㎛
재현탁액
말 배설물
샘플 1		 59개 충란이
계수됨(590 EPG)		 27개 충란이
회수됨(540 EPG)		 충란은
회수되지 않음		 223개 충란이 챔버에서 계수됨, 약 446 EPG를
나타냄*
* 약 200 ㎕의 현탁액은 여전히 피펫에 존재하고 챔버내로 적재되지 않아서, 실제 충란 수율은 의심할 바 없이 더 높았다 - 가능하게는 600 EPG 초과
실시예 2
5 g의 배설물을 45 ㎖의 부유 매질에 현탁시켜 배설물 용액을 형성하였다. 현탁액을 빌트-인 체(약 0.5 mm 메쉬 크기)가 구비된 필 플로택 용기에서 혼합하였다. 10 ㎖의 배설물 용액을 90 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 필터(플루리셀렉트 플루리스트레이너(등록상표) 셀 스트레이너)를 통해 여과하였다. 이어서, 통과된 샘플을 27 ㎛ 필터 상에서의 포획을 위해 27 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 필터(플루리셀렉트 플루리스트레이너(등록상표) 셀 스트레이너)를 통해 통과시켰다. 물질을 27μ 필터의 표면 상에서 표백시키고(1% 차아염소산염 용액), 이어서 회수하였다. 표백되지 않은 샘플 및 4, 6 및 8 분 동안 표백된 샘플에 대해 영상을 캡쳐하였다. 도 3A 내지 3D는 표백 전 및 후의 샘플을 보여주는 사진이다(패널 A = 표백되지 않음; 패널 B = 4 분 동안 표백시킨 후의 샘플; 패널 C = 6 분 동안 표백시킨 후의 샘플; 및 패널 D = 8 분 동안 표백시킨 후의 샘플). 제1 패널(패널 A)에서 정상적인 표백되지 않은 충란은 어두운 난형 물체로 보인다. 후자의 패널(패널 B 내지 D)에서 표백된 충란은 반투명하게 보인다. 나머지 극적이고 예상치 못한 효과는, 아마도 셀룰로오스 산화에 기인한 찌꺼기의 극적인 감소이고, 이는 광학 측정을 더욱 용이하게 한다.
실시예 3
5 g의 배설물을 45 ㎖의 부유 매질에 현탁시켜 배설물 용액을 형성하였다. 현탁액을 빌트-인 체(약 0.5 mm 메쉬 크기)가 구비된 필 플로택 용기에서 혼합하였다. 10 ㎖의 배설물 용액을 90 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 필터(플루리셀렉트 플루리스트레이너(등록상표) 셀 스트레이너)를 통해 여과하였다. 이어서, 통과된 샘플을 27 ㎛ 필터 상에서의 포획을 위해 27 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 필터(플루리셀렉트 플루리스트레이너(등록상표) 셀 스트레이너)를 통해 통과시켰다. 물질을 27 μ 필터의 표면 상에서 5 분 동안 표백시켰다(1% 차아염소산염 용액). 이어서, 표백된 충란을 차단제[카보블럭(Carboblock), 벡터 랩스(Vector labs)]가 함유된 인산염 완충된 염수(PBS)중 상이한 희석률로 밀 배아 응집소 - FITC(5 mg/㎖, 벡터 랩스)가 포함된 시약 용액과 접촉시켰다(도 4). WGA 항온처리 시간은 15 분이었다. 충란 현탁액을 커버 슬립 아래에 놓고 형광 현미경으로 검사하였다.
실시예 4
6개의 히스티딘 잔기를 pTXB1 플라스미드[뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)]내로 클로닝하여 CBD를 생산하였다. 이는 N-말단 His 태그, 이어서 인테인 엔도펩티다아제(intein endopeptidase), 및 C 말단에서의 바실러스 시르쿨란스(Bacillus ciruclans)의 CBD로 구성되는 융합 단백질을 생산하였다. 이러한 단백질을 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)에서 세포질적으로 발현시키고, 니켈 킬레이트 칼럼 상에서 정제하였다. 이어서, CBD를 NHS-플루오레세인[피어스(Pierce)]에 의해 제조업체의 지시에 따라 표지화하였다(접합 완충액으로서 PBS를 60 분 동안 실온에서 사용함). 탈염후, 이는 CBD 당 1.5 내지 2개 플루오레세인 분자를 갖는 6.7 mg/㎖의 CBD 용액을 생산하였다. 배설물 샘플을 여과에 의해 가공하고, 표백시키고, 형광 CBD의 1:100 희석물로 염색하고, 이어서 위상차(도 5A 내지 E) 또는 형광 방식(도 5F 내지 J)을 사용하여 현미경 상에서 촬상하였다. 다 자란 말로부터의 원충을 함유한 샘플(A, F), 망아지로부터의 회충을 함유한 샘플(B,G) 및 염소로부터의 모양선충(trichostronglye)을 함유한 샘플(C, H), 소로부터의 모양선충 및 편충(Trichuris) 충란을 함유한 샘플(D, I) 및 고양이로부터의 개회충(Toxocara) 충란을 함유한 샘플(E, J)이 도시된다. 이는 바실러스 시르쿨란스로부터의 CBD가 다수의 다양한 종에 걸쳐 기생충의 몇몇 중요한 부류의 충란에 결합함을 입증하다. 도 6은 도 5(D 및 I)에 제시된 소 샘플로부터의 다양한 원충, 편충 충란 및 콕시디아(Coccidia) 접합자낭의 사진을 도시한다. 이러한 서로 전혀 다른 속으로부터의 충란이 염색된다는 사실은, 키틴이 다수의 연충류 기생충 충란 및 원충류 접합자낭에 대한 일반적 마커로서 작용함을 입증한다. 더욱이, 이들 충란 및 접합자낭이 배설물로부터 다량의 관련없는 배설물 찌꺼기가 존재함에도 불구하고 선명하게 염색된다는 사실은, 그의 이전에 보고된 셀룰로오스와의 교차-반응에도 불구하고 CBD는 이들 배설물 성분들을 분명히 구별할 수 있음을 입증한다.
실시예 5
말 배설물 슬러리를 90 ㎛ 필터(플루리셀렉트 플루리스트레이너(등록상표) 셀 스트레이너)를 통해 통과시킨 다음, 27 ㎛ 필터(플루리셀렉트 플루리스트레이너(등록상표) 셀 스트레이너) 상에서 트래핑하고, 1% 차아염소산염에 의해 2 분 동안 표백시켰다. PBS로 세척한 후 필터상의 충란을 카보블럭/PBS중 5 mg/㎖의 WGA-비오틴 접합체(conjugate)(벡터 랩스)의 1:1000 희석물과 15 분 동안 접촉시켰다. 다시 충란을 PBS로 세척하고 이어서 카보블럭/PBS중 5 mg/㎖의 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타아제 접합체(벡터 랩스)의 1:500 희석물과 15 분 동안 접촉시켰다. PBS로 최종 세척한 후, 충란을 1OOmM 중탄산 나트륨(pH 10)중 5mM p-니트로페놀 포스페이트의 용액과 접촉시켰다. 실온에서 7 분 후, 샘플의 사진을 찍고 분광광도계로 측정하였다.
이러한 방식으로 본 발명자들은 충란 양성의 말 배설물(800개 충란/g) 및 충란 음성의 배설물을 구별하였다(도 7). WGA-AP의 양은 시험된 두 농도에서 포화된 것으로 보였고, 이는 그의 농도를 감소시킴으로써 신호-대-잡음 비율이 더욱 개선될 수 있음을 제시하였다.
실시예 6
도 8A 및 8B는 형광 현미경 상에서 40배 배율로 찍힌 말 배설물로부터의 부유되고 CBD-염색된 충란에 대한 맥마스터 그리드의 20개 영상의 합성물을 도시한다. 충란을 실시예 4에 기재된 바와 같이 처리하고 CBD로 염색하였다. 샘플 검사는 여과에 의해 제거되지 않은 소수의 진균류 포자의 존재를 제시한다(도 7B, 삽도 화살촉). 배경을 제거하기 위해 형광 영상에 대한 단순한 디지털 처리를 수행한 후(레벨 및 역치 필터링), 본 발명자들은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)으로부터 입수가능한 오픈 소스 프리웨어 소프트웨어(open source freeware software), 이미지 J(Image J)의 입자 분석 기능을 사용하여 충란의 수를 정량화할 수 있었다. 이러한 소프트웨어는 사용자가 크기 및 형태 둘 다에 의해 입자를 분석할 수 있도록 하여, 충란 및 포자(이는 더 작고 더 둥금)를 구별하기 위한 컴퓨터분석 방법을 제공한다. 육안에 의한 계수는 104개의 충란 및 19개의 포자라는 충란 계수를 유도한 반면, 이미지 J 소프트웨어는 107개의 충란 및 16개의 포자를 검출하였다. 소비자-등급의 카메라 또는 셀 폰에 의해 생산된 영상을 모의하기 위해, 영상을 4800 x 4800 화소에서 1350 xl350 화소로 축소시켰다[전체 맥마스터 챔버에 의한 8 메가화소 센서의 더 짧은 치수를 보완하는 것에 해당함(단지 영상에서의 그리드가 아님)]. 이러한 경우, 이미지 J 소프트웨어는 103개의 충란 및 20개의 포자를 계수한다. 따라서, 이들 데이터는, 원칙적으로, 배설물 샘플 내의 충란을 정확히 계수하기 위한 이러한 종류의 촬상 방법에 키틴-기제 표지화를 결합시킬 수 있음을 제시한다.
본 발명자들은 이러한 영상이 소비자-등급 카메라(접사 렌즈가 구비된 올림푸스 E-PM2) 및 접사 렌즈[올리클립(0lliclip)7x]가 구비된 셀 폰(애플 아이폰 5s)에 의해 캡쳐될 수 있음을 추가로 제시한다(도 9A 내지 D). 이들 영상은 조명을 위해 청색 LED를 사용하고 배출 필터로서 저렴한 오렌지색 퍼스펙스 플레이트(Perspex plate)를 사용하는 전기영동 겔 형광 촬상 시스템[프렙원 사파이어(PrepOne Sapphire), 엠비텍(EmbiTec)]에 의해 캡쳐되었다. 이들 데이터는 형광 염색된 충란의 가시화를 위한 저렴한 촬상 시스템의 구성이 가능함을 입증한다.
실시예 7
본 발명자들은 상기 촬상 시스템을 사용하여, 자동화된 충란 계수가 표준 맥마스터 방법에 의해 수득된 계수와 직접적으로 상관관계를 가짐을 입증하였다. 3개의 말 배설물 샘플을 맥마스터 방법에 의해 또는 실시예 6에 기재된 방법(n=4)에 의해 정량화하고 올림푸스 E-PM2 및 아이폰 5s 둘 다로 촬상하였다. 맥마스터 계수 대 자동화된 계수를 도표화한 결과, 두 카메라 모두 동일하게 잘 수행하였고(도 10) 자동화된 계수가 전통적인 충란 계수에 비례함을 알 수 있었다. 더욱이, 자동화된 검정으로 입력된 충란의 50%가 가공 동안 소실된다는 사실에도 불구하고(기울기 약 0.5), 10배 더 많은 배설물이 분석된다는 사실은 자동화된 검정이 맥마스터 계수에 비해 여전히 5배 더 민감함을 의미한다. 더욱이, 대부분의 경우, 표준 편차에 의해 평가될 경우 자동화된 방법의 변동성은 맥마스터에 비해 우수하였다(도 11).
몇몇 양태에서, 본원에 제공된 방법은 디지털 카메라 또는 스마트폰과 조합된 휴대용 시험 장치를 사용하여 실행될 수 있다. 시험 장치(100)의 비제한적인 예는 도 12 내지 15에 도시된다. 시험 장치(100)는 카메라 홀더(122)를 갖는 상부 표면(120)을 포함하는 스탠드(110)를 포함한다. 스탠드(110)는 광원(132)을 갖는 시험 회로 보오드(134), 통합된 발산 필터(140)를 갖는 렌즈 마운트(lens mount)를 포함하는 카메라 챔버(130), 및 샘플을 유지시키기 위한 검출 챔버를 갖는 시험 크래들(150)을 지지한다. 시험 장치(100)의 구성요소는, 상기 기재된 바와 같이, 카메라 홀더(122)에 위치된 카메라가 카메라 챔버(130)를 경유하여 시험 크래들(150)에 놓인 샘플에 광학적으로 접근하고 영상 캡쳐를 위해 광원(132)에 의해 조명되도록 배열된다.
도 12에 도시된 바와 같이, 시험 장치(100)의 다양한 구성요소는 스탠드(110)에 부착가능하다. 스탠드(110)는 일반적으로 편평한 상부 표면 및 4개의 지지 다리(112)를 갖는다. 지지 다리(112)는 테이블, 벤치, 또는 다른 작업 표면으로부터 상부 표면을 들어 올린다. 지지 다리(112)는 스탠드(110)의 중량을 감소시키고 사용자가 상부 표면(120) 아래에 위치된 시험 장치(100)의 일부(예를 들어, 도 14 및 15에 도시된 바와 같은 시험 크래들(150))를 조작할 수 있도록 허용하는 컷-아웃(114)에 의해 분리된다.
상부 표면(120)은 일반적으로 상부 표면(120)의 중앙에 위치된 큰 직사각형 압입 자국(indentation) 또는 블라인드 홀(blind hole)인, 카메라 홀더(122)를 갖는다. 카메라 홀더(122)는 카메라 성능을 갖는 휴대용 카메라, 예컨대 디지털 카메라 또는 스마트폰을 시험 장치(100)에 의해 보유하고 정렬하도록 배치된다. 카메라 홀더(122)는, 스마트폰의 카메라가 상부 표면(120)을 통해 상부 표면(120) 아래의 시험 크래들(150)로부터의 방사선을 검출할 수 있도록 허용하는 광학 접근 포트(124)를 갖는다(도 14 및 15에 제시된 바와 같음). 사용자는 상부 표면(120)의 한쪽 단부에 위치된 그립 허용부(126)를 사용하여 스마트폰을 카메라 홀더(122)에 위치시킨다.
도 13을 참고하여, 시험 장치(100)의 저면도는 스탠드(110)에 고정된 카메라 챔버(130)를 도시한다. 도 13의 저면도에서, 카메라 챔버(130)는 렌즈 마운트(140), 광원(132), 및 시험 회로(134)의 일부를 둘러싸는 것으로 보인다. 스탠드(110)의 하부 표면에 회로 커버(128)가 부착된다. 도 15에서 가장 잘 볼 수 있듯이, 회로 커버(128)는 스탠드(110)의 하부 표면에 인접하여 위치된 시험 회로 보오드(134)를 덮는다. 회로 커버(128)는 시험 회로 보오드(134)를 제자리에 유지시키고, 시험 회로 보오드(134) 위의 스마트폰 및 아래의 시험 크래들(150)과 광학적으로 정렬된다. 회로 커버는 커버를 정렬시키는 스크류 보스(screw boss)(도시되지 않음)를 통해 스탠드(110)의 하부 표면에 장착된다.
광원(132)은 시험 회로 보오드(134) 내에 또는 위에 위치된다. 상기 기재된 바와 같이, 광원(132)은 청색 LED일 수 있다. LED(132)는, LED가 카메라 챔버(130) 및 아래의 시험 크래들(150)중의 샘플을 조명하도록, 시험 회로 보오드(134)의 하부 표면 상에 정렬된다. 4개의 LED(132)가 도 12에 도시되지만; 더 많은 또는 더 적은 수의 LED가 사용될 수 있다. 예를 들어, 1개, 2개, 또는 3개의 LED가 정렬되어 렌즈 마운트 및 통합된 발산 필터(140)를 둘러싸도록 배열될 수 있거나, 5개 이상의 LED가 사용될 수 있다.
도 14에 도시된 바와 같이, 시험 크래들(150)은 하부에 부착되고 시험 크래들(150)은 나삿니(thread)가 있어 새로운 샘플을 함유한 시험 크래들(150)은 신속하고 쉽게 시험 장치(100) 상의 위치로 돌려서 고정된다. 또한, 카메라 챔버(130) 및 시험 크래들(150)은, 스냅(snap) 정합, 빠른 방출 기작, 자성 커플링, 또는 카메라 챔버(130)와 시험 크래들(150)을 커플링시킬 수 있는 당분야에 공지된 임의의 다른 적합한 수단을 통해 기계적으로 함께 커플링될 수 있는 것으로 고려된다. 시험 크래들(150)은, 상기 기재된 바와 같이, 샘플중의 충란을 분리하고 부착시키기 위한 하나 이상의 필터를 포함할 수 있다. 샘플에 존재하는 충란은, 시험 크래들(150) 내부에 있고 임의적으로 광원(134) 및 카메라 챔버(130)에 접근가능한 필터중 하나에 결합할 수 있다.
완전히 조립된 시험 장치(100)가 도 15에 도시되어 있다. 도시되지는 않았지만, 카메라 홀더(122)에 위치된 디지털 카메라는 상부 표면(120)의 광학 접근 포트(124)에 부착된 렌즈 및 렌즈 마운트(140)를 경유하여 시험 장치(100)를 통해 방해없는 광학 접근부를 가질 것이다. 시험 회로 보오드(134)의 하부 표면 상의 광원(132)(도 15에 도시되지 않음)은 시험 크래들(150)에서 아래에 위치한 샘플을 조명하고, 예컨대 상기 기재된 데이터의 획득을 허용한다.
몇몇 실행에서, 스탠드(110)는 바람직하게는 경량 재료, 예를 들어, 성형 또는 압출 플라스틱, 또는 경량 금속, 예컨대 알루미늄으로 제조된다. 도 12 내지 14에 제시된 장치는 4개의 다리(112) 및 4개의 컷-아웃(114)을 포함하지만, 더 많거나 더 적은 수의 다리 및 컷-아웃이 가능하다. 예를 들어, 스탠드(110)는 2개의 넓은 지지 다리를 상부 표면(120)의 각 측부 상에서 하나의 컷-아웃에 의해 분리된 상부 표면(120)의 단부에 포함할 수 있다. 다르게는, 스탠드(110)는 다리를 포함하지 않고, 그 대신 상부 표면(120)의 둘레 주변의 단일한 상승된 고체 지지체일 수 있고, 컷-아웃을 포함하지 않는다. 다른 실행이 또한 가능하다.
카메라 챔버(130)는 나삿니가 있어 시험 크래들(150)에 쉽게 부착될 수 있다. 몇몇 실행에서, 챔버 커버가 제공될 수 있고, 이는 카메라 챔버(130) 상으로 돌려서 고정되고, 샘플 및 시험 크래들(150)이 제자리에 존재하지 않을 경우 통합된 발산 필터(140) 및 시험 회로 보오드(134)와 함께 렌즈 및 렌즈 마운트를 보호한다.
몇몇 실행에서, 시험 회로 보오드(134)는 또한 광원(132)을 위한 전력 공급원, 예를 들어, 하나 이상의 배터리를 지지할 수 있다.
다른 실시태양
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 선행 기재내용은 예시하려는 것으로 본 발명의 범주를 제한하지 않으며, 이러한 범주는 첨부된 특허청구범위에 의해 한정됨을 알아야 한다. 다른 양태, 이점, 및 변형은 이후 특허청구범위의 범주내에 속한다.
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(84) 젤틴스(Zeltins) 및 슈렘프(Schrempf)의 문헌[(1995). 스트렙토마이세스 올리바세오비리디스로부터의 특이적 키틴-결합 단백질(CHB1)에 의한 알파-키틴의 시각화(Visualization of alpha-chitin with a specific chitin-binding protein (CHB1) from Streptomyces olivaceoviridis). Anal. Biochem. 231, 287-294].

Claims (70)

  1. 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계;
    약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 125 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 또는 약 150 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 용액을 유동시켜 제1 여액을 형성하는 단계;
    약 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 20 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 또는 약 30 ㎛ 내지 약 35 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계;
    검출가능한 잔기(moiety)에 접합된 N-아세틸-D-글루코사민 결합 도메인을 제2 여과 막에 의해 포획된 연충류 충란(helminth egg) 및/또는 원충류 접합자낭(protozoan oocyst)과 접촉시키는 단계; 및
    배설물 샘플에서 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출가능한 잔기에 기초하여 검출하는 단계
    를 포함하는, 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하는 방법.
  2. 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계;
    약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 125 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 또는 약 150 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 용액을 유동시켜 제1 여액을 형성하는 단계;
    약 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 20 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 또는 약 30 ㎛ 내지 약 35 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계;
    제2 여과 막에 의해 포획된 샘플을, 형광-여기 광(fluorescence-exciting light)하에 형광을 발산하는 키틴-결합 염료를 포함하는 제1 시약과 접촉시키는 단계;
    제2 여과 막 상에 포획된 샘플을 형광-여기 광으로 조명하는 단계; 및
    샘플의 형광을 평가하여 배설물 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 형광 강도 또는 형광 입자의 수에 기초하여 결정하는 단계
    를 포함하는, 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
  3. 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계;
    약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 125 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 또는 약 150 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 용액을 유동시켜 제1 여액을 형성하는 단계;
    약 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 20 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 또는 약 30 ㎛ 내지 약 35 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계;
    제2 여과 막에 의해 포획된 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭을, N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질을 포함하는 제1 시약과 접촉시켜 제1 시약 샘플을 형성하는 단계;
    제1 시약 샘플을, N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제2 시약과 접촉시키는 단계로서, 항체가 검출가능한 잔기에 접합된 단계; 및
    배설물 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출가능한 잔기에 기초하여 결정하는 단계
    를 포함하는, 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
  4. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    용액을 제2 여과 막을 통해 유동시킨 후, 제2 여과 막 상에 포획된 연충류 충란 및/또는 원충류 접합자낭을 액체 샘플 완충액에 현탁시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항 및 제3항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
    N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질이 렉틴, 키티나아제(chitinase) 및 키틴 결합 도메인(CBD: chitin binding domain)으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  6. 제6항에 있어서,
    렉틴이 밀 배아 응집소(WGA: wheat germ agglutinin), 대두 응집소(SBA: soybean agglutinin), 마클루라 포미페라 렉틴(MPL: Maclura pomifera lectin), 바우히니아 푸르푸레아 렉틴(BPL: Bauhinia purpurea lectin), 다투라 스트라모늄 렉틴(DSL: Datura stramonium lectin), 라이코페르시콘 에스쿨렌텀 렉틴(LEL: Lycopersicon esculentum lectin), 솔라눔 투베로숨 렉틴(STL: Solanum tuberosum lectin) 및 프소포카르푸스 테트라고놀로부스-II(PTL-II: Psophocarpus tetragonolobus-II)로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  7. 제1항 및 제3항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
    검출가능한 잔기가 합텐(hapten), 효소, 항체 에피토프, 항원, 형광단, 방사성동위원소, 나노입자, 결합 쌍의 구성원, 및 금속 킬레이트로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    결합 쌍이 비오틴(biotin)/스트렙타비딘(streptavidin), 비오틴/아비딘(avidin), 비오틴/뉴트라비딘(neutravidin), 비오틴/캡타비딘(captavidin), 에피토프/항체, 단백질 A/면역글로불린, 단백질 G/면역글로불린, 단백질 L/면역글로불린, GST/글루타티온(glutathione), His-태그/금속, 항원/항체, FLAG/M1 항체, 말토오스 결합 단백질/말토오스, 칼모듈린(calmodulin) 결합 단백질/칼모듈린, 효소-효소 기질, 및 수용체-리간드 결합 쌍으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  9. 제1항 및 제3항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서,
    검출가능한 잔기가 결합 쌍의 제1 구성원인 방법.
  10. 제7항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서,
    결합 쌍의 제1 구성원이 N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질에 접합되고, 결합 쌍의 제2 구성원이 고체 지지체 상에 고정화되는 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    형광단이 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 5-이소티오시아네이트(FITC), 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), 보디피(Bodipy) 염료[인비트로겐(Invitrogen)] 및/또는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료(인비트로겐), 단실(dansyl), 단실 클로라이드(DNS-Cl), 5-(요오도아세트아미다)플루오레세인(5-IAF), 6-아크릴로일-2-다이메틸아미노나프탈렌(아크릴로단: acrylodan), 7-니트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일 클로라이드(NBD-Cl), 브롬화 에티듐, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 로다민(rhodamine) 염료(5-카복시로다민 6G 하이드로클로라이드, 리싸민(Lissamine) 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), 로다민 800), 테트라메틸로다민 5-(및 6-)이소티오시아네이트(TRITC), 텍사스 레드(Texas Red), 설포닐 클로라이드, 나프탈아민 설폰산, 예컨대, 비제한적으로, 1-아닐리노나프탈렌-8-설폰산(ANS) 및 6-(p-톨루이디닐)나프탈렌-2-설폰산(TNS), 안트로일(Anthroyl) 지방산, DPH, 파리나르산, TMA-DPH, 플루오레닐 지방산, 플루오레세인-포스파티딜에탄올아민, 텍사스 레드-포스파티딜에탄올아민, 피레닐-포스파티딜콜린, 플루오레닐-포스파티딜콜린, 메로시아닌(Merocyanine) 540, 나프틸 스티릴(Naphtyl Styryl), 3,3'-다이프로필티아다이카보시아닌(다이S-C3-(5)), 4-(p-다이펜틸 아미노스티릴)-1-메틸피리디늄(다이-5-ASP), Cy-3 요오도 아세트아미드, Cy-5-N-하이드록시석신이미드, Cy-7-이소티오시아네이트, IR-125, 티아졸 오렌지(Thiazole Orange), 아주레(Azure) B, 나일 블루(Nile Blue), Al 프탈로시아닌, 옥삭신(Oxaxine) 1,4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI), 획스트(Hoechst) 33342, TOTO, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange), 에티듐 호모다이머(Ethidium Homodimer), N(에톡시카보닐메틸)-6-메톡시퀴놀리늄(MQAE), 푸라(Fura)-2, 칼슘 그린(Calcium Green), 카복시 SNARF-6, BAPTA, 쿠마린(coumarin), 파이토플루오르(phytofluor), 코로넨(Coronene), 및 금속-리간드 착체로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    휴대용 또는 벤치탑(benchtop) 형광광도계, 예를 들어, 핸드헬드(handheld) 형광광도계를 사용하여 검출가능한 잔기의 신호 강도를 결정하는 방법.
  13. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    휴대용 또는 벤치탑 색도계를 사용하여 검출가능한 잔기의 신호 강도를 결정하는 방법.
  14. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    육안 검사에 의해 검출가능한 잔기의 신호 강도를 결정하는 방법.
  15. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    촬상 디바이스(imaging device)를 사용하여 검출가능한 잔기의 신호 강도를 결정하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    촬상 디바이스가 디지털 카메라, 모바일 폰, 스마트폰, 태블릿(tablet), 휴대용 컴퓨터, 컴퓨터 또는 스캐너인 방법.
  17. 제1항, 제3항 내지 제7항 및 제11항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서,
    N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질이 밀 배아 응집소이고, 검출가능한 잔기가 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)인 방법.
  18. 제1항 및 제3항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서,
    검출가능한 잔기가 결합 쌍의 제1 구성원이고, 결합 쌍의 제2 구성원이 효소, 항체 에피토프, 항원, 형광단, 방사성동위원소, 나노입자, 제2 결합 쌍의 구성원, 및 금속 킬레이트에 접합된 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    결합 쌍의 제1 구성원이 비오틴이고, 결합 쌍의 제2 구성원이 스트렙타비딘, 아비딘, 뉴트라비딘 및 캡타비딘으로 구성된 군에서 선택되고, 결합 쌍의 제2 구성원이 효소에 접합된 방법.
  20. 제7항 또는 제17항에 있어서,
    효소가 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 호스 래디시(horse radish) 퍼옥시다아제, 우레아제 및 베타-락타마아제 및 글루코오스 옥시다아제로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  21. 제4항 내지 제20항중 어느 한 항에 있어서,
    렉틴이 밀 배아 응집소인 방법.
  22. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    접촉 단계가, 샘플을 표백 용액으로 처리한 후 진행되는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서,
    환경 샘플이 배설물 샘플, 뇨 샘플, 물 샘플, 폐수 또는 하수 샘플, 또는 토양 샘플인 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    환경 샘플이 배설물 샘플인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서,
    배설물 용액을 수득하는 단계가, 배설물 샘플을 샘플 완충액에 현탁시켜 제1 배설물 용액을 형성하는 단계; 및 약 400 ㎛ 내지 약 800 ㎛, 약 425 ㎛ 내지 약 750 ㎛, 약 450 ㎛ 내지 약 700 ㎛, 약 500 ㎛ 내지 약 650 ㎛, 또는 약 550 ㎛ 내지 약 600 ㎛의 기공 크기를 갖는 벌크(bulk) 여과 막을 통해 제1 배설물 용액을 유동시켜 배설물 용액을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제23항 내지 제25항중 어느 한 항에 있어서,
    배설물 샘플이 포유동물의 배설물 샘플인 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    포유동물의 배설물 샘플이 말, 소, 돼지, 염소, 양, 라마, 사슴, 개, 고양이, 새 및 인간의 배설물 샘플로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항중 어느 한 항에 있어서,
    환경 샘플중의 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭을 낱개로 세는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    환경 샘플중의 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭을 낱개로 세는 단계를 현미경에 의해 수행하는 방법.
  30. 제2항에 있어서,
    형광-여기 광하에 형광을 발산하는 키틴-결합 염료가 칼코플루오르 화이트(calcofluor white), 우비텍스(Uvitex) 3B(다이스티릴 다이페닐 형광 증백제), 라이룩스(Rylux) BA, 라이룩스 BSU(1,4-벤젠다이설폰산-2,2'-[에틸렌다이일비스[(3-설포-4,1-페닐렌)이미노[6-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-1,3,5-트라이헥사나트륨 염)[오스타컬러(Ostacolor), 체코 공화국 파르두비체] 및 블랑코포르(Blankophor)(다이나트륨 4,4'-비스{(4-아닐리노)-6-모폴리노-1,3,5-트라이아진-2-일)아미노}스틸벤-2,2'-다이설포네이트)로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  31. 제25항에 있어서,
    벌크 여과 막이 약 400 ㎛ 내지 약 450 ㎛의 기공 크기를 갖고, 제1 여과 막이 약 85 ㎛ 내지 약 120 ㎛의 기공 크기를 갖고, 제2 여과 막이 약 20 ㎛ 내지 약 40 ㎛의 기공 크기를 갖는 방법.
  32. 약 20 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 또는 약 30 ㎛ 내지 약 35 ㎛의 기공 크기를 갖는 여과 막; 및
    검출가능한 잔기에 접합된 N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 시약 용액
    을 포함하는 키트.
  33. 제32항에 있어서,
    85 ㎛ 내지 약 350 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 125 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 또는 약 150 ㎛ 내지 약 200 ㎛의 기공 크기를 갖는 여과 막을 추가로 포함하는 키트.
  34. 제32항에 있어서,
    N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질이 렉틴, 키티나아제 및 키틴 결합 도메인(CBD)으로 구성된 군에서 선택되는 키트.
  35. 제32항에 있어서,
    약 400 ㎛ 내지 약 800 ㎛, 약 425 ㎛ 내지 약 750 ㎛, 약 450 ㎛ 내지 약 700 ㎛, 약 500 ㎛ 내지 약 650 ㎛, 또는 약 550 ㎛ 내지 약 600 ㎛의 기공 크기를 갖는 벌크 여과 막의 기공 크기를 갖는 여과 막을 포함하는 벌크 필터 장치를 추가로 포함하는 키트.
  36. 제32항에 있어서,
    촬상 디바이스를 유지시키거나 함유하는 크래들(cradle)을 추가로 포함하는 키트.
  37. 제32항에 있어서,
    검출가능한 잔기를 검출하기 위한 휴대용 또는 벤치탑 시스템을 추가로 포함하는 키트.
  38. 제37항에 있어서,
    검출가능한 잔기를 검출하기 위한 휴대용 시스템이 휴대용 또는 벤치탑 형광광도계 및 휴대용 또는 벤치탑 색도계로 구성된 군에서 선택되는 키트.
  39. 제32항에 있어서,
    N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질에 결합하는 항체를 추가로 포함하는 키트.
  40. 제32항에 있어서,
    시약 검출 시스템을 추가로 포함하는 키트.
  41. 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계;
    약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 용액을 유동시켜 제1 여액을 생성하는 단계;
    약 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계;
    제2 여과 막 상에 포획된 연충류 충란을, 검출가능한 잔기에 접합된 N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계; 및
    환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출가능한 잔기의 신호 강도에 기초하여 검출하는 단계
    를 포함하는, 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출하는 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질이 렉틴, 키티나아제 및 키틴 결합 도메인(CBD) 또는 이의 단편으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  43. 제42항에 있어서,
    렉틴이 밀 배아 응집소(WGA), 대두 응집소(SBA), 마클루라 포미페라 렉틴(MPL), 바우히니아 푸르푸레아 렉틴(BPL), 다투라 스트라모늄 렉틴(DSL), 라이코페르시콘 에스쿨렌텀 렉틴(LEL), 솔라눔 투베로숨 렉틴(STL) 및 프소포카르푸스 테트라고놀로부스-II(PTL-II)로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  44. 제41항에 있어서,
    검출가능한 잔기가 합텐, 효소, 항체 에피토프, 항원, 형광단, 방사성동위원소, 나노입자, 결합 쌍의 구성원, 및 금속 킬레이트로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    형광단이 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 플루오레세인, 플루오레세인 5-이소티오시아네이트(FITC), 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), 보디피 염료(인비트로겐) 및/또는 알렉사 플루오르 염료(인비트로겐), 단실, 단실 클로라이드(DNS-Cl), 5-(요오도아세트아미다)플루오레세인(5-IAF), 6-아크릴로일-2-다이메틸아미노나프탈렌(아크릴로단), 7-니트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일 클로라이드(NBD-Cl), 브롬화 에티듐, 루시퍼 옐로우, 로다민 염료(5-카복시로다민 6G 하이드로클로라이드, 리싸민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), 로다민 800), 테트라메틸로다민 5-(및 6-)이소티오시아네이트(TRITC), 텍사스 레드, 설포닐 클로라이드, 나프탈아민 설폰산, 예컨대, 비제한적으로, 1-아닐리노나프탈렌-8-설폰산(ANS) 및 6-(p-톨루이디닐)나프탈렌-2-설폰산(TNS), 안트로일 지방산, DPH, 파리나르산, TMA-DPH, 플루오레닐 지방산, 플루오레세인-포스파티딜에탄올아민, 텍사스 레드-포스파티딜에탄올아민, 피레닐-포스파티딜콜린, 플루오레닐-포스파티딜콜린, 메로시아닌 540, 나프틸 스티릴, 3,3'-다이프로필티아다이카보시아닌(다이S-C3-(5)), 4-(p-다이펜틸 아미노스티릴)-1-메틸피리디늄(다이-5-ASP), Cy-3 요오도 아세트아미드, Cy-5-N-하이드록시석신이미드, Cy-7-이소티오시아네이트, IR-125, 티아졸 오렌지, 아주레 B, 나일 블루, Al 프탈로시아닌, 옥삭신 1, 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI), 획스트 33342, TOTO, 아크리딘 오렌지, 에티듐 호모다이머, N(에톡시카보닐메틸)-6-메톡시퀴놀리늄(MQAE), 푸라-2, 칼슘 그린, 카복시 SNARF-6, BAPTA, 쿠마린, 파이토플루오르, 코로넨, 및 금속-리간드 착체로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  46. 제41항에 있어서,
    휴대용 또는 벤치탑 형광광도계, 휴대용 또는 벤치탑 색도계, 또는 촬상 디바이스를 사용하여 검출가능한 잔기의 신호 강도를 결정하는 방법.
  47. 제46항에 있어서,
    촬상 디바이스가 디지털 카메라, 모바일 폰, 스마트폰, 태블릿, 휴대용 컴퓨터, 컴퓨터 또는 스캐너인 방법.
  48. 제41항에 있어서,
    접촉 단계가, 샘플을 표백 용액으로 처리한 후 진행되는 방법.
  49. 제41항에 있어서,
    환경 샘플이 배설물 샘플인 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    용액을 수득하는 단계가, 배설물 샘플을 샘플 완충액에 현탁시켜 제1 배설물 용액을 형성하는 단계; 및 약 400 ㎛ 내지 약 800 ㎛의 기공 크기를 갖는 벌크 여과 막을 통해 제1 배설물 용액을 유동시켜 배설물 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계;
    약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 용액을 유동시켜 제1 여액을 형성하는 단계;
    약 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계;
    제2 여과 막 상에 포획된 샘플을, 형광-여기 광하에 형광을 발산하는 키틴-결합 염료를 포함하는 제1 시약과 접촉시키는 단계;
    제2 여과 막에 의해 포획된 샘플을 형광-여기 광으로 조명하는 단계; 및
    샘플의 형광을 평가하여 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 형광 강도 또는 형광 입자의 수에 기초하여 결정하는 단계
    를 포함하는, 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    환경 샘플이 배설물 샘플인 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    용액을 수득하는 단계가, 배설물 샘플을 샘플 완충액에 현탁시켜 제1 배설물 용액을 형성하는 단계; 및 약 400 ㎛ 내지 약 800 ㎛의 기공 크기를 갖는 벌크 여과 막을 통해 제1 배설물 용액을 유동시켜 배설물 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
  54. 제51항에 있어서,
    형광-여기 광하에 형광을 발산하는 키틴-결합 염료가 칼코플루오르 화이트, 우비텍스 3B(다이스티릴 다이페닐 형광 증백제), 라이룩스 BA, 라이룩스 BSU(1,4-벤젠다이설폰산-2,2'-[에틸렌다이일비스[(3-설포-4,1-페닐렌)이미노[6-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-1,3,5-트라이헥사나트륨 염) 및 블랑코포르(다이나트륨 4,4'-비스{(4-아닐리노)-6-모폴리노-1,3,5-트라이아진-2-일)아미노}스틸벤-2,2'-다이설포네이트)로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  55. 제51항에 있어서,
    휴대용 또는 벤치탑 형광광도계, 또는 촬상 디바이스를 사용하여 형광 강도를 결정하는 방법.
  56. 제51항에 있어서,
    접촉 단계가, 샘플을 표백 용액으로 처리한 후 진행되는 방법.
  57. 샘플 완충액에 현탁된 환경 샘플을 포함하는 용액을 수득하는 단계;
    약 85 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 기공 크기를 갖는 제1 여과 막을 통해 용액을 유동시켜 제1 여액을 형성하는 단계;
    약 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛의 기공 크기를 갖는 제2 여과 막을 통해 제1 여액을 유동시키는 단계;
    제2 여과 막 상에 포획된 연충류 충란을, N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 제1 시약과 접촉시켜 제1 시약 샘플을 형성하는 단계;
    제1 시약 샘플을, N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 제2 시약과 접촉시키는 단계로서, 항체가 검출가능한 잔기에 접합된 단계; 및
    샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 검출가능한 잔기의 강도에 기초하여 결정하는 단계
    를 포함하는, 환경 샘플에서 연충류 충란 또는 원충류 접합자낭의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질이 렉틴, 키티나아제 및 키틴 결합 도메인(CBD) 또는 이의 단편으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  59. 제58항에 있어서,
    렉틴이 밀 배아 응집소(WGA), 대두 응집소(SBA), 마클루라 포미페라 렉틴(MPL), 바우히니아 푸르푸레아 렉틴(BPL), 다투라 스트라모늄 렉틴(DSL), 라이코페르시콘 에스쿨렌텀 렉틴(LEL), 솔라눔 투베로숨 렉틴(STL) 및 프소포카르푸스 테트라고놀로부스-II(PTL-II)로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  60. 제57항에 있어서,
    검출가능한 잔기가 합텐, 효소, 항체 에피토프, 항원, 형광단, 방사성동위원소, 나노입자, 결합 쌍의 구성원, 및 금속 킬레이트로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    형광단이 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 플루오레세인, 플루오레세인 5-이소티오시아네이트(FITC), 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), 보디피 염료(인비트로겐) 및/또는 알렉사 플루오르 염료(인비트로겐), 단실, 단실 클로라이드(DNS-Cl), 5-(요오도아세트아미다)플루오레세인(5-IAF), 6-아크릴로일-2-다이메틸아미노나프탈렌(아크릴로단), 7-니트로벤조-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일 클로라이드(NBD-Cl), 브롬화 에티듐, 루시퍼 옐로우, 로다민 염료(5-카복시로다민 6G 하이드로클로라이드, 리싸민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), 로다민 800), 테트라메틸로다민 5-(및 6-)이소티오시아네이트(TRITC), 텍사스 레드, 설포닐 클로라이드, 나프탈아민 설폰산, 예컨대, 비제한적으로, 1-아닐리노나프탈렌-8-설폰산(ANS) 및 6-(p-톨루이디닐)나프탈렌-2-설폰산(TNS), 안트로일 지방산, DPH, 파리나르산, TMA-DPH, 플루오레닐 지방산, 플루오레세인-포스파티딜에탄올아민, 텍사스 레드-포스파티딜에탄올아민, 피레닐-포스파티딜콜린, 플루오레닐-포스파티딜콜린, 메로시아닌 540, 나프틸 스티릴, 3,3'-다이프로필티아다이카보시아닌(다이S-C3-(5)), 4-(p-다이펜틸 아미노스티릴)-1-메틸피리디늄(다이-5-ASP), Cy-3 요오도 아세트아미드, Cy-5-N-하이드록시석신이미드, Cy-7-이소티오시아네이트, IR-125, 티아졸 오렌지, 아주레 B, 나일 블루, Al 프탈로시아닌, 옥삭신 1, 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI), 획스트 33342, TOTO, 아크리딘 오렌지, 에티듐 호모다이머, N(에톡시카보닐메틸)-6-메톡시퀴놀리늄(MQAE), 푸라-2, 칼슘 그린, 카복시 SNARF-6, BAPTA, 쿠마린, 파이토플루오르, 코로넨, 및 금속-리간드 착체로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  62. 제57항에 있어서,
    휴대용 또는 벤치탑 형광광도계, 휴대용 또는 벤치탑 색도계, 또는 촬상 디바이스를 사용하여 검출가능한 잔기의 신호 강도를 결정하는 방법.
  63. 제62항에 있어서,
    촬상 디바이스가 디지털 카메라, 모바일 폰, 스마트폰, 태블릿, 휴대용 컴퓨터, 컴퓨터 또는 스캐너인 방법.
  64. 제57항에 있어서,
    접촉 단계가, 샘플을 표백 용액으로 처리한 후 진행되는 방법.
  65. 제57항에 있어서,
    환경 샘플이 배설물 샘플인 방법.
  66. 약 5 ㎛ 내지 약 45 ㎛의 기공 크기를 갖는 여과 막; 및
    검출가능한 잔기에 접합된 N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질을 포함하는 시약 용액
    을 포함하되, 각각의 N-아세틸-D-글루코사민 결합 단백질이 검출가능한 잔기에 접합된 렉틴, 키티나아제 및 CBD로 구성된 군에서 선택되는 키트.
  67. 제66항에 있어서,
    약 400 ㎛ 내지 약 800 ㎛의 기공 크기를 갖는 벌크 여과 막의 기공 크기를 갖는 여과 막을 포함하는 벌크 필터 장치를 추가로 포함하는 키트.
  68. 제66항에 있어서,
    촬상 디바이스를 유지시키거나 함유하는 크래들을 추가로 포함하는 키트.
  69. 제66항에 있어서,
    검출가능한 잔기를 검출하기 위한 휴대용 또는 벤치탑 시스템을 추가로 포함하는 키트.
  70. 제66항에 있어서,
    85 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 기공 크기를 갖는 여과 막을 추가로 포함하는 키트.
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