ES2856479T3

ES2856479T3 - Método para la cuantificación de huevos de parásitos en heces

Info

Publication number: ES2856479T3
Application number: ES14889100T
Authority: ES
Inventors: Pawel Slusarewicz; Eric W Hauck
Original assignee: Mep Equine Solutions LLC
Current assignee: Mep Equine Solutions LLC
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2021-09-27
Anticipated expiration: 2034-12-05
Also published as: CN106457090B; EP3131655B1; CA3186277A1; US20190145973A1; CN106457090A; US10677796B2; NZ724790A; US20150293091A1; JP2017519220A; AU2014389998A1; NZ759799A; US9933425B2; BR112016023418A8; MX2016013261A; EP3131655A1; US10094829B2; WO2015156844A1; AU2020200599B2; CA2944596A1; EP3131655A4

Abstract

Un método para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en una muestra ambiental, comprendiendo el método: (a) obtener una solución que comprende una muestra ambiental suspendida en un tampón de muestra; (b) hacer fluir la solución a través de una primera membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre 85 micrómetros y 350 micrómetros para formar un primer filtrado; (c) hacer fluir el primer filtrado a través de una segunda membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre 5 micrómetros y 45 micrómetros; (d) tratar los huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos capturados en la segunda membrana de filtración con una solución decolorante; (e) poner en contacto los huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos tratados capturados en la segunda membrana de filtración con un dominio de unión a N-acetil-D-glucosamina conjugado con un resto detectable; y (f) detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos en la segunda membrana de filtración en la muestra ambiental basándose en el resto detectable.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la cuantificación de huevos de parásitos en heces

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para cuantificar el número de huevos de parásitos en heces.

Antecedentes

Incluso en los escenarios más optimistas, se prevé que la población mundial siga creciendo hasta bien entrado el siglo XXI (ONU, 2004) y que solo la demanda de producción de carne se duplique entre 1999 y 2050 (Steinfeld et al., 2006). Uno de los principales obstáculos para satisfacer la presente demanda es la infección de los animales por parásitos helmintos internos, que son esencialmente ubicuos en todos los animales de granja a nivel mundial.

Los parásitos helmínticos son un grupo polifilético de animales similares a gusanos que incluye los taxones cestodos, nematodos, tremátodos y monogéneos. Muchos parásitos helmínticos se propagan a través del sistema digestivo, en primer lugar, a través de la ingestión de material contaminado con parásitos o sus huevos. Durante su ciclo vital, dichos parásitos pueden migrar a otras partes del cuerpo, pero regresan al intestino para producir más huevos que después se egestan en las heces para proporcionar una fuente de nuevas infecciones.

La infección por helmintos provoca una importante morbilidad en animales, incluyendo seres humanos, y, en el caso del ganado agrícola, pérdidas económicas sustanciales debido a la reducción de la productividad por la disminución de la ganancia de peso, la producción de leche y la reproducción. Aunque las infecciones graves pueden conducir a la muerte, los rumiantes portadores de parásitos internos, incluso a niveles subclínicos, muestran una importante pérdida de productividad a través de varias modalidades, incluyendo la anemia, disminución de la aptitud reproductiva y de la lactancia, y la reducción de la utilización de alimentos, conduciendo a una reducción del crecimiento y a una mala condición corporal (Piedrafita et al., 2010; Perry y Randolph, 1999; Hoglund et al., 2001; Reinhardt et al., 2006). En los EE.UU., las pérdidas anuales de productividad ganadera se han estimado en tres mil millones de dólares anuales (Bagley et al., 2014). En los países en desarrollo, donde la atención veterinaria, los fármacos antihelmínticos y las estrategias agrícolas antihelmínticas reglamentadas están menos disponibles o se practican menos ampliamente, y donde la escasez de alimentos es más probable y más grave, se espera que las pérdidas sean sustancialmente mayores. La infección por helmintos también es un problema en no rumiantes de importancia agrícola, incluyendo aves de corral (Permin et al., 1999) y cerdos (Nansen y Roepstorff, 1999) y en otros herbívoros de importancia económica tales como caballos (Duncan, 1985). En el caso de los caballos, la infección por parásitos también da como resultado una reducción del rendimiento físico del animal. La infestación por parásitos internos, sin embargo, no se limita al ganado agrícola y también es un problema para los animales de compañía, tal como los gatos y los perros. La infestación en gatos y perros puede dar conducir a un fenómeno denominado zoonosis que da como resultado que anquilostomas y nematodos infecten a los seres humanos, con más frecuencia a los niños pequeños31.

Las infecciones parasitarias por helmintos también están muy extendidas en los seres humanos. Onchocerca volvulus, por ejemplo, provoca la oncocercosis (también conocida como ceguera de los ríos) en seres humanos. Se informa que aproximadamente de 17 a 25 millones de personas en todo el mundo están infectadas con O. volvulus, teniendo aproximadamente un millón de personas cierto grado de pérdida de visión. Brugia filariids pueden infectar a seres humanos y otros animales, provocando enfermedades incluyendo la filariasis (incluyendo la filariasis linfática), la elefantiasis y la eosinofilia tropical. La esquistosomiasis es una enfermedad parasitaria vascular en seres humanos provocada por trematodos sanguíneos de la especie Schistosoma. La esquistosomiasis es una de las muchas enfermedades helmínticas que infectan a más de mil millones de personas en todo el mundo. Estas enfermedades incluyen ascariasis, tricuriasis, enterobiasis, filariasis, triquinosis, oncocercosis, fascioliasis y cisticercosis. La esquistosomiasis ocupa el segundo lugar, después de la malaria, como causa principal de morbilidad y sufrimiento debido a parásitos.

Para agravar los problemas anteriores, la resistencia a los antiparasitarios de uso habitual (resistencia a los antihelmínticos) es un problema mundial y creciente en la producción ganadera (Kaplan, 2004). La resistencia a múltiples fármacos es un fenómeno habitual en explotaciones de ovejas y cabras (da Cruz et al., 2010), habiéndose registrado varios casos de fracaso total de los antihelmínticos (Cezar et al., 2010; Howell et al., 2008). De forma similar, se ha documentado que los parásitos equinos son resistentes a todas las clases de antiparasitarios disponibles actualmente en el mercado y la inmensa mayoría de las operaciones equinas se enfrentan a la resistencia a al menos una clase de fármacos (Peregrine et al., 2014). Más recientemente, se ha encontrados que los parásitos de las vacas son cada vez más resistentes a varias clases de productos antihelmínticos utilizados habitualmente (Gasbarre et al., 2009; Waghorn et al., 2006; Jackson et al., 2006).

Además, esta resistencia parece estar evolucionando a un ritmo significativamente más rápido con respecto al ritmo en que se desarrollan y lanzan nuevos productos antiparasitarios: desde principios de los años ochenta no se han lanzado nuevas clases de fármacos antihelmínticos para su uso en animales grandes en Norteamérica. Por estas razones, las organizaciones veterinarias de todo el mundo están promoviendo la vigilancia de la infección parasitaria y la presencia de resistencia a fármacos como un aspecto crítico del cuidado de los animales (Wood et al., 1995).

En el ámbito de la medicina veterinaria, la infección por helmintos se diagnostica en ocasiones por los síntomas clínicos manifestados. La herramienta central en la práctica de la parasitología veterinaria es el recuento de huevos en heces (FEC, por sus siglas en inglés), que ha permanecido relativamente sin cambios durante casi un siglo411 y, en general, se basa en la flotación de los huevos en un medio de azúcar y/o sal que es más denso que los propios huevos, seguida del examen microscópico y el recuento manual. Actualmente se usan dos métodos de FEC.

El primer procedimiento de recuento de huevos, y quizás el más utilizado universalmente, es el método de recuento en portaobjetos McMaster, desarrollado originalmente con heces de oveja por Gordon y Whitlock en 1939. En este método, la materia fecal se suspende en una solución de azúcar y/o sal (SS) de mayor densidad que los propios huevos de parásitos y se coloca en un portaobjetos especialmente fabricado para este fin (método de recuento en portaobjetos McMaster). Los huevos flotan en la superficie (separándolos de este modo de los residuos fecales más densos para facilitar la visualización) y se cuentan manualmente por una persona cualificada usando un microscopio con un aumento de 40-100x.

Un segundo procedimiento de recuento de huevos habitualmente utilizado es el método Wisconsin y sus derivados. Para estos métodos, los huevos se hacen flotar directamente, por lo general por la influencia de un campo centrífugo, pero también por la gravedad, en un cubreobjetos colocado sobre el menisco superficial del medio de flotación. La sensibilidad puede mejorarse tomando más muestras de la suspensión fecal colocándola en un tubo para formar un menisco. El menisco se cubre con un cubreobjetos y después se somete a centrifugación en un rotor oscilante (Rossanigo y Gruner, 1991); Egwang y Slocombe, 1981). Después, los huevos que se adhieren al cubreobjetos pueden contarse en el microscopio como antes.

Aunque los ensayos de tipo McMaster son más sencillos de realizar, las altas diluciones y los pequeños muestreos implicados dan como resultado ensayos con mayor variabilidad y menor sensibilidad que los ensayos de tipo Wisconsin. Por el contrario, los ensayos Wisconsin recuperan más huevos debido a la mayor flotación producida por los campos centrífugos y también a los grandes volúmenes de muestra que permiten, pero son ligeramente más exigentes técnicamente y requieren el acceso a una centrífuga, lo cual es poco práctico para muchas prácticas veterinarias y en el campo.

Desafortunadamente, ambas técnicas no solo consumen mucho tiempo, sino que también requieren el uso de equipos de laboratorio especializados (es decir, un microscopio, con o sin centrífuga), que rara vez está disponible para los veterinarios in situ, mucho menos para los propietarios de animales. Asimismo, la mayoría de los propietarios de animales no poseen la formación necesaria para examinar de forma fiable dichas muestras (por ejemplo, un profano podría confundir fácilmente los huevos con otras partículas fecales, tales como granos de polen). Generalmente, las muestras se recogen y se envían a la consulta del veterinario para su análisis o a un laboratorio de análisis de terceros, lo que supone un coste añadido y/o retrasos en los tiempos de diagnóstico. Como alternativa, los propietarios pueden enviar las heces directamente a laboratorios a través de varios servicios comerciales, pero generalmente tienen que esperar 48 horas para obtener los resultados. Esto, acoplado al tiempo que requieren los ensayos por su naturaleza y a la necesidad de personal cualificado para procesar e inspeccionar cada muestra, con un impacto concomitante en el coste, da como resultado que menos propietarios de animales realicen ensayos rutinarios a su ganado para detectar la presencia de parásitos y el desarrollo de resistencias.

Además de los problemas de tiempo y equipamiento, los métodos actuales de recuento de huevos adolecen de una serie de inconvenientes técnicos. Por ejemplo, la variabilidad del recuento de huevos limita la eficacia de los métodos actuales de recuento de huevos. Se ha estimado que los recuentos de huevos en caballos varían en un /- 50 % entre recuentos repetidos (parcialmente debido a la variabilidad subjetiva entre analistas y en parte por razones estadísticas debido a los pequeños volúmenes de muestreo). Por tanto, la discriminación entre un cambio verdadero y la variabilidad fortuita en la reducción del recuento de huevos en heces es un verdadero desafío (Vidyashankar et al., 2012). Aunque la variabilidad puede reducirse mediante una mejor cualificación de los analistas, realizando recuentos repetidos o usando métodos con límites de detección más bajos, todas estas soluciones tienen un coste en cualificación adicional o en tiempo de procesamiento. Otro inconveniente son las tasas de pérdida de huevos. Un determinado porcentaje de huevos en una muestra queda atrapado en los residuos fecales y no llega a la etapa de flotación. Dependiendo de la técnica y el operador, se ha comprobado que la tasa de pérdida de huevos varía entre el 30 y el 60 % (Vidyashankar et al., 2012). De forma importante, el límite de detección, el recuento de huevos más bajo detectable mediante la técnica dada, proporciona una limitación técnica a los métodos conocidos. Normalmente, está en el intervalo de 1-50 huevos por gramo (HPG). Las técnicas McMaster (véase la Figura 1) por lo general tienen límites de detección de 25 o 50 HPG, por lo que es muy difícil detectar niveles bajos de recuento de huevos, lo que es especialmente importante para los ensayos de resistencia (Vidyashankar et al., 2012).

Como resultado, el tratamiento profiláctico con fármacos antihelmínticos se ha vuelto habitual en la industria. Desafortunadamente, y de forma análoga a la prescripción excesiva de antibióticos, la frecuencia creciente de nematodos resistentes a fármacos es una preocupación mundial cada vez mayor en todas las especies, especialmente rumiantes pequeños (Kaplan, 2004; Wolstenholme et al., 2004; Sutherland y Leathwick, 2011; Jackson y Coop, 2000; Roepstorff et al., 1987; Coles et al., 2003; Cernanska et al., 2006; Kornele et al., 2014). Tanto las organizaciones veterinarias como las reguladoras han reconocido oficialmente este problema de rápido crecimiento y han emitido directrices para (1) ayudar a vigilar el crecimiento de dicha resistencia y (2) intentar frenarla reduciendo el actual uso indiscriminado de fármacos antihelmínticos, tanto de prescripción como de venta libre (Wood et al., 1995; EMEA, 2006; FDA, 2014).

Desafortunadamente, la vigilancia del desarrollo de resistencia mediante la observación de la reducción del recuento de huevos en heces (FECR, por sus siglas en inglés) implica el uso de métodos de flotación de huevos, con las desventajas descritas anteriormente8. Por tanto, es poco probable que estos métodos se utilicen ampliamente. Para poner de relieve esta suposición, una encuesta reciente realizada en granjas de purasangres de Kentucky mostró que la mayoría de los encuestados eran conscientes de ello y estaban preocupados por el fenómeno de los parásitos resistentes a fármacos; no obstante, más del 70 % seguían desparasitando profilácticamente (Robert et al., 2014). Además, la investigación del USDA ha demostrado que el 50-70 % de los ganaderos de vacas están de acuerdo en que los parásitos internos tienen un impacto económico significativo en sus operaciones (USDA, 2011b); no obstante, solo el 0,7 % usa algún tipo de ensayo de laboratorio para este problema (USDa , 2010). En resumen, la inconveniencia del recuento de huevos en heces parece representar una barrera significativa para la adopción generalizada de un enfoque más dirigido para el tratamiento y el control de la infección parasitaria.

Aunque las autoridades reguladoras en Europa han reconocido la amenaza de la aparición de cepas resistentes a fármacos y han actuado para restringir su disponibilidad, en los Estados Unidos, muchos de estos fármacos siguen estando disponibles abiertamente para el público de venta libre. Como resultado, las asociaciones profesionales veterinarias han recomendado el uso de ensayos de reducción del recuento de huevos en heces (FECR). Los FECR dependen de la evaluación sistemática de la carga parasitaria usando recuentos de huevos como marcador sustitutivo de la carga parasitaria, tanto antes como después del tratamiento con fármacos antihelmínticos. El desarrollo de resistencia puede detectarse mediante un descenso de los recuentos de huevos menor del esperado después del tratamiento, lo que provoca respuestas gestionadas adecuadas para mitigar la proliferación de cepas resistentes en la población. Como resultado, el recuento de huevos en heces ha cobrado cada vez más importancia, aunque, sorprendentemente, se ha progresado muy poco en la mejora de esta herramienta de diagnóstico clínicamente importante.

A pesar del paso de casi un siglo y del desarrollo de sofisticadas metodologías analíticas modernas en otras áreas, la práctica del recuento de huevos ha permanecido relativamente inalterada, limitándose la mayoría de las innovaciones a modificaciones de los medios de flotación o a métodos de recogida de huevos de muestras fecales más grandes. Por ejemplo, se ha agrandado el volumen de las cámaras de flotación para mejorar la sensibilidad14-15’18 o se han explorado soluciones de flotación alternativas1417.

Algunos trabajadores han hecho esfuerzos para desarrollar esfuerzos más sofisticados para detectar o cuantificar huevos en heces, usando métodos tales como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Demeler et al., 2013; Learmount et al., 2009) y citometría de flujo (Colditz et al., 2002). Sin embargo, dichas técnicas sofisticadas, junto con la experiencia y el equipo necesarios para realizarlas, las hacen incluso menos prácticas como herramientas para cualquier cosa que no sean fines de investigación.

Aunque se han realizado algunos esfuerzos para descubrir sondas en la superficie de los huevos que ayuden en la detección, estos esfuerzos se han limitado al cribado de diversas lectinas, con el fin de determinar las especies de huevos a las que pueden unirse estas lectinas. Una vez determinadas, estas proteínas pueden usarse como marcadores específicos de especies para la detección (pero no la cuantificación) de la presencia de determinadas especies o géneros (Palmer y McCombe, 1996; Hillrichs et al., 2012; Colditz et al., 2002). Sin embargo, debido a que el recuento total de huevos sigue siendo la referencia para la toma de decisiones clínicas y para la vigilancia de la resistencia a los antihelmínticos, todavía no se ha identificado un marcador que sea genérico para todos los huevos de helmintos. La identificación de un marcador tan ubicuo y experimentalmente manejable abriría la posibilidad de utilizarlo para desarrollar un método cuantitativo rápido para enumerar la carga total de huevos en heces y, por tanto, sustituir los métodos de flotación y sus deficiencias asociadas.

Desafortunadamente, se ha realizado poco trabajo para dilucidar la composición molecular de superficies de huevos clínicamente relevantes y lo poco que se ha hecho ha aportado poca información específica (Wharton, 1983; Quiles et al., 2006).

Las infecciones parasitarias protozoarias también son responsables de una gran diversidad de enfermedades de importancia médica y veterinaria, que varían desde la malaria y la neumonía por Pneumocystis carinii en el hombre a diversas coccidiosis en aves, peces y mamíferos. Muchas de las enfermedades son potencialmente mortales para el hospedador y provocan pérdidas económicas considerables en la ganadería. La coccidiosis es una enfermedad parasitaria protozoaria que afecta al tracto intestinal de animales incluyendo, pero sin limitación, vacas, ovejas, cabras, conejos, cerdos, pollos, pavos, gatos y perros. Los parásitos de interés incluyen, pero sin limitación, Isospora sp. (perros y gatos); Eimeria maxima, E. acervulina, E. brunetti, E. necatrix y E. tenella (pollos); E. meleagridis, E. gallopavonis, E. adenoeides y E. dispersa (pavos); E. bovis (vacas); E. ovina (ovejas); E. porci (cerdos); y E. stiedai (conejos). La coccidiosis es una de las enfermedades más económicamente importantes en muchas especies de ganado. La enfermedad se caracteriza por diarrea, aspecto no saludable, pérdida de apetito y de peso y niveles variables de mortalidad. En animales de ganadería, las pérdidas económicas son provocadas por una disminución del aumento de peso debido en parte a la mala absorción de nutrientes a través de la pared intestinal. Y, como en el caso de las infecciones por helmintos, el estado de la técnica para la detección de ooquistes de protozoos se basa en métodos que requieren mucho tiempo.

Aunque muchos parásitos pasan parte de su ciclo de vida en el tracto gastrointestinal y se egestan en heces, muchos otros parásitos infectan la vejiga y los riñones del animal hospedador. Pearsonema plica y Dioctophyme renale son dos parásitos de este tipo que se sabe que infectan la vejiga y el riñón en perros. Los huevos de ambos géneros pueden encontrarse en muestras de orina. Las especies de esquistosomiasis pueden infectar las vías urinarias o los intestinos, y sus huevos pueden encontrarse en la orina o las heces del animal.

Como puede observarse, aunque se han desarrollado métodos más modernos, estos ensayos no se han adoptado ampliamente y el recuento manual de huevos ha seguido siendo el método más ampliamente disponible y utilizado rutinariamente para vigilar la infestación por parásitos internos (es decir, la infestación parasitaria por helmintos y protozoos). Por tanto, existe la necesidad de un método simple, preciso y rentable para cuantificar el número de huevos de parásitos en heces que pueda realizarse tanto por los veterinarios en el campo como por los propios propietarios de animales.

Sumario

La presente invención se basa en el uso de dominios de unión a N-acetil-D-glucosamina (GlcNac) (por ejemplo, proteínas de unión a GlcNac) y fragmentos de los mismos para la detección de huevos de helmintos en muestras ambientales (por ejemplo, una muestra fecal). "Detectar" se refiere a identificar la presencia, ausencia o la cantidad del objeto que ha de detectarse. La cantidad detectada puede ser nula o por debajo del nivel de detección. La invención proporciona un ensayo simple in situ que permitirá tanto a los veterinarios como a los propietarios de animales diagnosticar la presencia y los niveles de infección parasitaria por helmintos y/o infecciones parasitarias por protozoos, permitiéndoles de este modo adaptar más adecuada y eficazmente las estrategias de tratamiento y preventivas a sus necesidades específicas. El ensayo también puede usarse en un entorno de laboratorio más controlado. El presente documento esboza los principios generales para alejar el recuento de huevos de parásitos del microscopio, donde han languidecido durante más de casi un siglo, y describe ensayos específicos que consiguen este objetivo usando técnicas bioquímicas modernas.

La presente invención proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en una muestra ambiental, comprendiendo el método:

(a) obtener una solución que comprende una muestra ambiental suspendida en un tampón de muestra;

(b) hacer fluir la solución a través de una primera membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre 85 micrómetros y 350 micrómetros para formar un primer filtrado;

(c) hacer fluir el primer filtrado a través de una segunda membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre 5 micrómetros y 45 micrómetros;

(d) tratar los huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos capturados en la segunda membrana de filtración con una solución decolorante;

(e) poner en contacto los huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos tratados capturados en la segunda membrana de filtración con un dominio de unión a N-acetil-D-glucosamina conjugado con un resto detectable; y (f) detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos en la segunda membrana de filtración en la muestra ambiental basándose en el resto detectable.

En una realización, el dominio de unión a N-acetil-D-glucosamina se selecciona entre el grupo que consiste en una lectina, una quitinasa y un dominio de unión a quitina (CBD).

En una realización, la lectina se selecciona entre el grupo que consiste en aglutinina de germen de trigo (WGA), lectina de Maclura pomifera (MPL), lectina de Bauhinia purpurea (BPL), lectina de Datura stramonium (DSL), lectina de Lycopersicon esculentum (LEL), lectina de Solanum tuberosum (STL) y Psophocarpus tetragonolobus-II (PTL-II).

En una realización, el resto detectable se selecciona entre el grupo que consiste en un hapteno, una enzima, un epítopo de anticuerpo, un antígeno, un fluoróforo, un radioisótopo, una nanopartícula, un miembro de un par de unión y un quelato de metal.

En una realización, el fluoróforo se selecciona entre el grupo que consiste en proteína verde fluorescente, proteína azul fluorescente, proteína roja fluorescente, fluoresceína, 5-isotiocianato de fluoresceína (FITC), colorante de cianina Cy3, colorante de cianina Cy3.5, colorante de cianina Cy5, colorante de cianina Cy5.5, colorante de cianina Cy7, dansilo, Cloruro de Dansilo (DNS-C1), 5-(yodoacetamida)fluoresceína (5-IAF), 6-acriloil-2-dimetilaminonaftaleno (acrylodan), cloruro de 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-ilo (NBD-CI), bromuro de etidio, Amarillo Lucifer, clorhidrato de 5-carboxirrodamina 6G, lisamina-rodamina B cloruro de sulfonilo, rodamina-B-isotiocianato (RITC), rodamina 800, 5-(y 6-)isotiocianato de tetrametilrrodamina (TRITC), cloruro de sulfonilo, ácido 1-anilinonaftaleno-8 -sulfónico (ANS), ácido 6-(p-toluidinil)naftaleno-e-2-sulfónico (TNS), antroil-ácido graso, 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH), Ácido parinárico, 1-(4-trimetilamoniofenil)-6-Fenil-1,3,6-hexatrieno (TMA-DPH), fluorenil-ácido graso, Fluoresceínafosfatidiletanolamina, Rojo Texas-fosfatidiletanolamina, Pirenil-fosfatidilcolina, Fluorenil-fosfatidilcolina, Merocianina 540, Naftil Estirilo, 3,3'-dipropiltiadicarbocianina (diS-C3-(5)), 4-(p-dipentil aminoestiril)-l-metilpiridinio (di-5-ASP), Cy-3 Acetamida de yodo, Cy-5-N-hidroxisuccinimida, Cy-7-Isotiocianato, IR-125, Naranja tiazol, Azure B, Azul Nilo, Ftalocianina de Al, Oxaxina 1, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Hoechst 33342, TOTO, Naranja de acridina, Homodímero de etidio, N(etoxicarbonilmetil)-6-metoxiquinolinio (MQAE), Fura-2, Verde calcio, Carboxi seminaftarrodafluoresceína-6 (SNARF-6), Ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), cumarina, fitoflúors, Coroneno y complejos metal-ligando.

En algunas realizaciones, el dominio de unión a N-acetil-D-glucosamina es aglutinina de germen de trigo y el resto detectable es isotiocianato de fluoresceína (FITC).

En una realización de los métodos que se proporcionan en el presente documento, la muestra ambiental es una muestra fecal.

En una realización de los métodos que se proporcionan en el presente documento, obtener una solución comprende suspender una muestra ambiental en un tampón de muestra para formar una primera solución ambiental; y hacer fluir la primera solución ambiental a través de una membrana de filtración en volumen que tiene un tamaño de poro de entre 400 micrómetros y 800 micrómetros, entre 425 micrómetros y 750 micrómetros, entre 450 micrómetros y aproximadamente 700 micrómetros, entre 500 micrómetros y 650 micrómetros o entre 550 micrómetros y 600 micrómetros para proporcionar la solución.

En otra realización de la invención, el método comprende adicionalmente enumerar los huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en la muestra ambiental.

Los métodos que se desvelan en el presente documento ofrecen mejoras adicionales de los métodos actuales de recuento de huevos; en concreto, el enfoque permitirá (1) aumentar el rendimiento de las muestras y eliminará la subjetividad, reduciendo o eliminando de este modo estas fuentes de variación; (2) la eliminación opcional de la etapa de flotación, lo que podría mejorar, al menos parcialmente, el problema de las tasas de pérdida de huevos; y (3) la concentración de la muestra fecal por filtración, lo que mejoraría en gran medida la sensibilidad. Además, la tecnología permitiría realizar los ensayos rápidamente in situ, eliminando de este modo el coste en tiempo e inconveniencia del transporte de heces a un laboratorio y el tiempo de procesamiento una vez allí. Por último, la tecnología encajará bien en la práctica veterinaria establecida, ya que el FEC total (independientemente de la especie del parásito) es la métrica más habitualmente utilizada para informar las decisiones de tratamiento clínico (Coles et al., 2006; Nielsen et al., 2010).

Por tanto, en el presente documento se describen métodos para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos en una muestra ambiental (por ejemplo, en una muestra fecal, una muestra de orina, una muestra de agua, una muestra de aguas residuales o aguas negras o una muestra de suelo). En el presente documento se describen métodos para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos en una muestra ambiental, comprendiendo los métodos obtener una solución que comprende una muestra ambiental suspendida en un tampón de muestra, hacer fluir la solución fecal a través de dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, veinte o cincuenta) filtros de tamaño de poro decreciente, determinándose el número y el tamaño de los poros por la especie de animal de la que se obtienen las heces y por los tipos de huevos y/o ooquistes que se detectan.

En el presente documento se describen métodos para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos en muestras fecales, comprendiendo los métodos obtener una solución fecal que comprende una muestra fecal suspendida en un tampón de muestra, hacer fluir la solución fecal a través de dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, veinte o cincuenta) filtros de tamaño de poro decreciente, determinándose el número y el tamaño de los poros por la especie de animal de la que se obtienen las heces y por los tipos de huevos y/o ooquistes que se detectan.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "uno o más" y "al menos uno" se usan indistintamente y significan uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, veinte, cincuenta, etc., del elemento al que se refiere "uno o más" o "al menos uno". La expresión "dos o más" significa al menos dos, más adecuadamente, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, veinte, cincuenta, etc., del artículo al que se refiere "dos o más".

Por tanto, en un aspecto de la divulgación, la solución que comprende una muestra ambiental (por ejemplo, una solución fecal que comprende una muestra fecal) se hace fluir a través de una primera membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 85 micrómetros y aproximadamente 350 micrómetros, entre aproximadamente 100 micrómetros y aproximadamente 300 micrómetros, entre aproximadamente 125 micrómetros y aproximadamente 250 micrómetros o entre aproximadamente 150 micrómetros y aproximadamente 200 micrómetros para formar un primer filtrado, haciendo fluir el primer filtrado a través de una segunda membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 micrómetros, 5 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 15 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 20 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 25 micrómetros y aproximadamente 40 micrómetros o entre aproximadamente 30 micrómetros y aproximadamente 35 micrómetros, poniendo en contacto los huevos de helmintos capturados en la segunda membrana de filtración con un dominio de unión a N-acetil-D-glucosamina o fragmento del mismo, tal como, por ejemplo, una lectina, una quitinasa, un dominio de unión a quitina (CBD) u otra proteína de unión a N-acetil-D-glucosamina o fragmentos de los mismos conjugados con un resto detectable, y detectando la presencia o ausencia de huevos de helmintos en la muestra fecal basándose en el resto detectable, por ejemplo, la intensidad de la señal del resto detectable.

Los términos "primero", "segundo" y "tercero" se usan en la presente divulgación solamente en su sentido relativo. Se entenderá que, a menos que se indique lo contrario, estos términos se usan simplemente por conveniencia en la descripción de una o más de las realizaciones. Los términos "primero", "segundo" y "tercero" se usan solamente para distinguir un elemento de otro y el alcance de los derechos de la tecnología desvelada no debe limitarse por estos términos. Por ejemplo, un primer elemento puede designarse como un segundo elemento y de manera similar el segundo elemento puede designarse como el primer elemento.

En el presente documento se describen métodos para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos en una muestra ambiental (por ejemplo, una muestra fecal) que comprenden obtener una solución que comprende una muestra ambiental (por ejemplo, una solución fecal que comprende una muestra fecal) suspendida en un tampón de muestra, hacer fluir la solución fecal a través de una primera membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 85 micrómetros y aproximadamente 350 micrómetros, entre aproximadamente 100 micrómetros y aproximadamente 300 micrómetros, entre aproximadamente 125 micrómetros y aproximadamente 250 micrómetros o entre aproximadamente 150 micrómetros y aproximadamente 200 micrómetros para formar un primer filtrado, haciendo fluir el primer filtrado a través de una segunda membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 micrómetros, 5 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 15 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 20 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 25 micrómetros y aproximadamente 40 micrómetros o entre aproximadamente 30 micrómetros y aproximadamente 35 micrómetros, poner en contacto una muestra capturada en la segunda membrana de filtración con un primer reactivo que comprende un colorante de unión a quitina que es fluorescente bajo luz de excitación de fluorescencia, iluminar la muestra capturada en la segunda membrana de filtración con luz de excitación de fluorescencia; y examinar la fluorescencia de la muestra para determinar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos en la muestra basándose en la intensidad fluorescente o el número de partículas fluorescentes.

En el presente documento se describen métodos para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos en una muestra ambiental (por ejemplo, una muestra fecal) que comprenden obtener una solución que comprende una muestra ambiental (por ejemplo, una solución fecal que comprende una muestra fecal) suspendida en un tampón de muestra, hacer fluir la solución a través de una primera membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 85 micrómetros y aproximadamente 350 micrómetros, entre aproximadamente 100 micrómetros y aproximadamente 300 micrómetros, entre aproximadamente 125 micrómetros y aproximadamente 250 micrómetros o entre aproximadamente 150 micrómetros y aproximadamente 200 micrómetros para formar un primer filtrado, haciendo fluir el primer filtrado a través de una segunda membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 micrómetros, 5 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 15 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 20 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 25 micrómetros y aproximadamente 40 micrómetros o entre aproximadamente 30 micrómetros y aproximadamente 35 micrómetros, poner en contacto los huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos capturados en la segunda membrana de filtración con un primer reactivo que comprende una lectina o un CBD o una proteína de unión a N-acetil-D-glucosamina o fragmentos de los mismos para formar una primera muestra de reactivo, poner en contacto la primera muestra de reactivo con un segundo reactivo que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la lectina o CBD, en donde el anticuerpo se conjuga con un resto detectable, y determinar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos en la muestra basándose en el resto detectable.

En algunas realizaciones, la muestra ambiental es una muestra fecal. La etapa de obtención de una solución fecal puede comprender suspender una muestra fecal en un tampón de muestra para formar una primera solución fecal y hacer fluir la primera solución fecal a través de una membrana de filtración en volumen que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 400 micrómetros y aproximadamente 800 micrómetros, entre aproximadamente 425 micrómetros y aproximadamente 750 micrómetros, entre aproximadamente 450 micrómetros y aproximadamente 700 micrómetros, entre aproximadamente 500 micrómetros y aproximadamente 650 o entre aproximadamente 550 micrómetros y aproximadamente 600 micrómetros para proporcionar la solución fecal. En una realización, la membrana de filtración en volumen tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 400 micrómetros y aproximadamente 450 micrómetros, la primera membrana de filtración tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 85 micrómetros y aproximadamente 120 micrómetros, y la segunda membrana de filtración tiene un tamaño de poro entre aproximadamente 20 micrómetros y aproximadamente 40 micrómetros. Hacer fluir la primera solución fecal a través de la membrana de filtración en volumen sirve para retirar partículas más grandes y residuos de la misma, permitiendo una filtración más eficiente a través de las membranas de filtración primera y segunda.

En algunos aspectos de la divulgación, los métodos comprenden adicionalmente, después de hacer fluir la solución a través de una segunda membrana de filtración, suspender los huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos capturados en la segunda membrana de filtración en un tampón de muestra líquido.

De acuerdo con un aspecto adicional, los métodos que se desvelan en el presente documento comprenden adicionalmente tratar la muestra (por ejemplo, la ambiental) con un agente oxidante o una solución decolorante antes de la etapa de puesta en contacto. Por tanto, en algunas realizaciones, la etapa de puesta en contacto está precedida por el tratamiento de la muestra con una solución decolorante.

En algunas realizaciones, el dominio de unión a GlcNac es una proteína de unión a GlcNac seleccionada entre el grupo que consiste en una lectina, una quitinasa o un dominio de unión a quitina (CBD) o fragmentos de los mismos. Como se describe en el presente documento, la lectina puede ser cualquier lectina capaz de unirse a N-acetil-D-glucosamina. Una lectina se selecciona entre el grupo que consiste en aglutinina de germen de trigo (WGA), aglutinina de soja (SBA), lectina de Madura pomífera (MPL), lectina de Bauhinia purpurea (BPL), lectina de Datura stramonium (DSL), lectina de Lycopersicon esculentum (LEL), lectina de Solanum tuberosum (STL) y Psophocarpus tetragonolobus-II (PTL-II). En una realización, la lectina es aglutinina de germen de trigo (WGA).

En algunas realizaciones, la proteína de unión a GlcNac se conjuga con un soporte sólido, tal como perlas magnéticas o no magnéticas, o con una membrana, tal como nitrocelulosa o difluoruro de polivinilidina, que pueden usarse para capturar y concentrar los huevos en combinación con la filtración.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a GlcNac se conjuga con un resto detectable seleccionado entre el grupo que consiste en un hapteno, una enzima, un epítopo de anticuerpo, un antígeno, un fluoróforo, un radioisótopo, una nanopartícula, un miembro de un par de unión y un quelato de metal. Por ejemplo, el marcador detectable puede ser un primer miembro de un par de unión, en donde el par de unión se selecciona entre el grupo que consiste en pares de unión biotina/estreptavidina, biotina/avidina, biotina/neutravidina, biotina/captavidina, epítopo/anticuerpo, proteína A/ inmunoglobulina, proteína G/inmunoglobulina, proteína L/inmunoglobulina, GST/glutatión, marcador de His/Metal (por ejemplo, níquel, cobalto o cobre), antígeno/anticuerpo, FLAG/anticuerpo MI, proteína de unión a maltosa/maltosa, proteína de unión a calmodulina/calmodulina, enzima-sustrato de enzima y receptor-ligando. En una realización, el resto detectable es un primer miembro de un par de unión. En algunas realizaciones, un primer miembro del par de unión se conjuga con la proteína de unión a N-acetil-D-glucosamina y el segundo miembro del par de unión se inmoviliza sobre un soporte sólido.

En algunas realizaciones, el resto detectable es un primer miembro de un par de unión; y el segundo miembro del par de unión se conjuga con una enzima, un epítopo de anticuerpo, un antígeno, un fluoróforo, un radioisótopo, una nanopartícula, un miembro de un segundo par de unión y un quelato de metal.

En otra realización más, el resto detectable es un primer miembro de un par de unión, en donde el primer miembro del par de unión es biotina y el segundo miembro del par de unión se selecciona entre el grupo que consiste en estreptavidina, avidina, neutravidina y capravidina, y el segundo miembro del par de unión se conjuga con una enzima.

En algunas realizaciones, el resto detectable es un fluoróforo que se selecciona entre el grupo que consiste en proteína verde fluorescente, proteína azul fluorescente, proteína roja fluorescente, fluoresceína, 5-isotiocianato de fluoresceína (FITC), colorantes de cianina (Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), colorantes Bodipy (Invitrogen) y/o colorantes Alexa Fluor (Invitrogen), dansilo, Cloruro de Dansilo (DNS-C1), 5-(yodoacetamida)fluoresceína (5-IAF, 6 -acriloil-2-dimetilaminonaftaleno (acrylodan), cloruro de 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-ilo (NBD-Cl), bromuro de etidio, Amarillo Lucifer, colorantes de rodamina (clorhidrato de 5-carboxirrodamina 6G, lisamina-rodamina B cloruro de sulfonilo, rodamina-B-isotiocianato (rodamina-B-isotiocianato RITC), rodamina 800); 5-(y 6-)isotiocianato de tetrametilrrodamina (TRITC), Texas Red™, cloruro de sulfonilo, ácidos naftalamina sulfónicos, incluyendo, pero sin limitación, el ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfónico (ANS) y el ácido 6-(p-toluidinil)naftaleno-2-sulfónico (TNS), antroil-ácido graso, DPH, Ácido parinárico, TMA-DPH, fluorenil-ácido graso, Fluoresceína-fosfatidiletanolamina, Rojo Texasfosfatidiletanolamina, Pirenilfosfatidilcolina, Fluorenilfosfatidilcolina, Merocianina 540, Naftil Estirilo, 3,3'-dipropiltiadicarbocianina (diS-C3-(5)), 4-(p-dipentil-aminoestiril)-1 -metilpiridinio (di-5-ASP), Cy-3 Acetamida de yodo, Cy-5-N-hidroxisuccinimida, Cy-7-Isotiocianato, IR-125, Naranja tiazol, Azure B, Azul Nilo, Ftalocianina de Al, Oxaxina 1, 4',6-diamidino-2-fenilindol. (DAPI), Hoechst 33342, TOTO, Naranja de acridina, Homodímero de etidio, N(etoxicarbonilmetil)-6-metoxiquinolinio (MQAE), Fura-2, Verde calcio, carboxi SNARF-6, BAPTA, cumarina, fitoflúors y Coroneno.

En algunas realizaciones, el resto detectable es una enzima que cataliza una reacción de cambio de color, incluyendo, una enzima seleccionada entre el grupo que consiste en fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante, ureasa y beta-lactamasa y glucosa oxidasa.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a GlcNac es aglutinina de germen de trigo y el resto detectable es fluoresceína.

La intensidad de la señal del marcador detectable puede medirse usando instrumentos y dispositivos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo, por ejemplo, un fluorímetro portátil o de mesa (por ejemplo, un fluorímetro de mano) o un colorímetro portátil o de mesa (por ejemplo, un colorímetro de mano). La intensidad de la señal del resto detectable puede determinarse mediante inspección visual. En algunas realizaciones, la intensidad de la señal del resto detectable se determina usando un dispositivo de imagen adecuado para visualizar el resto detectable seleccionado. En algunas realizaciones, el dispositivo de imagen es una cámara digital, un teléfono móvil, un teléfono inteligente, una tablet, un ordenador portátil, un ordenador o un escáner.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden adicionalmente enumerar los huevos de helmintos en la muestra fecal. En una realización, los métodos comprenden enumerar los huevos de helmintos en la muestra fecal, que se realiza usando un microscopio.

En algunos aspectos de la divulgación, poner en contacto una muestra capturada en la segunda membrana de filtración con un primer reactivo que comprende un colorante de unión a quitina que es fluorescente bajo luz de excitación de fluorescencia, en donde el colorante de unión a quitina que emite fluorescencia bajo luz de excitación de fluorescencia se selecciona entre el grupo que consiste en blanco de calcoflúor, Uvitex 3B (agente blanqueador fluorescente de diestiril bifenilo), Rylux BA, Rylux BSU (sal de ácido 1,4-bencenodisulfónico-2,2'-[etilenidilbis[(3-sulfo-4,1-fenilen)imino[6-bis(2-hidroxietil)amino]-1,3,5-trihexasodio) (Ostacolor, Pardubice, República Checa) y Blankophor (4,4'-bis{(4-anilino)-6-morfolino-1,3,5-triazin-2-il)amino}estilben-2,2'-disulfonato disódico).

En una realización, la divulgación proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en una muestra ambiental, comprendiendo el método obtener una solución que comprende una muestra ambiental suspendida en un tampón de muestra; hacer fluir la solución a través de una primera membrana de filtración que tiene un tamaño de poro entre aproximadamente 85 micrómetros y aproximadamente 350 micrómetros para formar un primer filtrado; hacer fluir el primer filtrado a través de una segunda membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 5 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros; tratar los huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos capturados en la segunda membrana de filtración con una solución decolorante; poner en contacto los huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos tratados capturados en la segunda membrana de filtración con un dominio de unión a N-acetil-D-glucosamina conjugado con un resto detectable; y detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en la segunda membrana de filtración en la muestra ambiental basándose en la intensidad de la señal del resto detectable.

En el presente documento se describen métodos para determinar la presencia o ausencia de huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en una muestra ambiental, comprendiendo el método: obtener una solución que comprende una muestra ambiental suspendida en un tampón de muestra; hacer fluir la solución a través de una primera membrana de filtración que tiene un tamaño de poro entre aproximadamente 85 micrómetros y aproximadamente 350 micrómetros para formar un primer filtrado; hacer fluir el primer filtrado a través de una segunda membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 5 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros; poner en contacto una muestra capturada en la segunda membrana de filtración con un primer reactivo que comprende un colorante de unión a quitina que es fluorescente bajo luz de excitación de fluorescencia; iluminar la muestra capturada por la segunda membrana de filtración con luz de excitación de fluorescencia; y evaluar la fluorescencia de la muestra para determinar la presencia o ausencia de huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en la muestra ambiental basándose en la intensidad de la fluorescencia o el número de partículas fluorescentes.

En el presente documento se describen métodos para determinar la presencia o ausencia de huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en una muestra ambiental, comprendiendo el método: obtener una solución que comprende una muestra ambiental suspendida en un tampón de muestra; hacer fluir la solución a través de una primera membrana de filtración que tiene un tamaño de poro entre aproximadamente 85 micrómetros y aproximadamente 350 micrómetros para formar un primer filtrado; hacer fluir el primer filtrado a través de una segunda membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 5 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros; poner en contacto los huevos de helmintos capturados en la segunda membrana de filtración con un primer reactivo que comprende una proteína de unión a N-acetil-D-glucosamina o un fragmento de la misma para formar una primera muestra de reactivo; poner en contacto la primera muestra de reactivo con un segundo reactivo que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la proteína de unión a N-acetil-D-glucosamina, en donde el anticuerpo se conjuga con un resto detectable; y determinar la presencia o ausencia de huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en la muestra fecal basándose en la intensidad del resto detectable.

En algunas realizaciones, la muestra ambiental es una muestra fecal. En consecuencia, obtener la solución comprende suspender una muestra fecal en un tampón de muestra para formar una primera solución fecal; y hacer fluir la primera solución fecal a través de una membrana de filtración en volumen que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 400 micrómetros y aproximadamente 800 micrómetros para obtener la solución que comprende la muestra fecal.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que habitualmente entiende un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. En el presente documento se describen métodos y materiales para su uso en la presente invención; también pueden usarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones, prevalecerá.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y figuras y a partir de las reivindicaciones.

Descripción de los dibujos

El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado a color. La Oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con un dibujo o dibujos a color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.

La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un método de acuerdo con la divulgación para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos en una muestra fecal usando perlas magnéticas para la captura de huevos.

La Figura 2 es un diagrama esquemático que muestra un método para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos en una muestra fecal usando un proceso de filtración de múltiples etapas.

Las Figuras 3A a 3D son fotografías que muestran las muestras antes y después de la decoloración (panel A = sin de colorar; panel B = muestra después de la decoloración durante 4 minutos; panel C = muestra después de la decoloración durante 6 minutos; y panel D = muestra después de la decoloración durante 8 minutos)

La Figura 4 muestra la tinción de huevos de helmintos específica de quitina obtenida con aglutinina de germen de trigo (WGA) marcada con FITC.

Las Figuras 5A a 5J muestran la tinción de huevos de helmintos con CBD conjugado con fluoresceína. (imágenes de muestras obtenidas en modo de contraste de fases (A-E) o de fluorescencia (F-J). Barra = 200 micrómetros. La Figura 6 muestra una diversidad de huevos de helmintos y ooquistes de protozoos de heces bovinas teñidas con CBD conjugado con fluoresceína. Barra = 200 micrómetros.

La Figura 7 muestra la detección colorimétrica de huevos en heces positivas para huevos y negativas para huevos. Las Figuras 8A y 8B muestran la formación de imágenes de huevos teñidos con CBD de heces equinas. Se generó una imagen compuesta de una rejilla McMaster con un aumento 40x tanto en el modo de contraste de fases (A) como en el de fluorescencia (B). Los recuadros muestran una ampliación de una zona representativa que incluye una espora fúngica (punta de flecha). Barra = 1,5 mm.

Las Figuras 9A-9D muestran imágenes de huevos teñidos con CBD-Fluoresceína. Se tomaron imágenes de los huevos con un iPhone 5s de 8 MP (A, B) o con una cámara Olympus PE2 Pen de 16 MP (C, D). Las imágenes se muestran tanto en bruto (A, C) como después de procesarlas para retirar el fondo (B, D). Barra (A) = 1 mm, Barra (B) = 0,5 mm.

La Figura 10 muestra la correlación de recuentos tradicionales McMaster con recuentos automatizados de los que se obtuvieron imágenes tanto con una cámara Olympus de consumo como con una cámara de teléfono móvil. Se evaluaron tres muestras fecales en cuatro ensayos independientes en cada caso y los resultados se promediaron, La Figura 11 muestra que, en general, el ensayo automatizado presenta menos variabilidad que el método tradicional McMasters. Se muestran los resultados promedio de la Figura 10 con desviaciones típicas (n=4). La Figura 12 muestra una vista isométrica superior de un aparato de ensayo para capturar imágenes para muestras preparadas de acuerdo con el método que se describe en las Figuras 1 o 2.

La Figura 13 muestra una vista inferior del aparato de la Figura 12.

La Figura 14 muestra una vista isométrica inferior del aparato de la Figura 12 con una cámara de muestras fijada. La Figura 15 muestra una sección transversal de una parte del aparato y la cámara de muestras que se muestran en la Figura 14.

Descripción detallada

La siguiente divulgación describe métodos novedosos para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos en muestras ambientales (por ejemplo, en una muestra fecal, una muestra de orina, una muestra de agua, una muestra de aguas residuales o aguas negras o una muestra de suelo). Para facilitar la revisión, se proporcionan métodos y kits de ejemplo para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos en muestras fecales con fines ilustrativos.

Aunque se ha descrito que la quitina es un componente de algunos huevos de helmintos y ooquistes de protozoos, nunca se ha reconocido de forma generalizada que sea un componente universal de dichos huevos. Al menos en parte, la presente invención se basa en el descubrimiento por parte de los inventores de que la quitina puede servir como marcador genérico para la mayoría, si no para todos, los huevos de parásitos de helmintos (véase, por ejemplo, la Figura 5) y/u ooquistes de protozoos y, por tanto, constituye una base para un ensayo para determinar la carga parasitaria total. La quitina es un polímero lineal estructuralmente similar a la celulosa, pero que consiste totalmente en unidades unidas en (31-4 de N-acetilglucosamina (GlcNAc) en lugar de glucosa (Rudall y Kenchington, 1973). Detrás de la celulosa, es el biopolímero más abundante en la naturaleza, el componente principal de los exoesqueletos de los artrópodos tanto terrestres como acuáticos y un componente fundamental de las paredes celulares de hongos y (en menor medida) levaduras. El papel universal de la quitina como componente estructural de matrices biológicas y el aspecto similar de la superficie de la mayoría de los huevos de helmintos, sugiere que puede ser un marcador ubicuo para huevos de parásitos.

La presencia de quitina puede sondearse no solo de forma semiespecífica con diversas lectinas que reconocen GlcNAc y diversos fluoróforos de molécula pequeña, sino también de forma más estricta con versiones truncadas de diversas quitinasas que consisten en sus respectivos dominios de unión a quitina (CBD) (Hardt y Laine, 2004; Hashimoto et al., 2000; Gao et al., 2002; Arakane et al., 2003; Chu et al., 2001; Kolbe et al., 1998; Zeltins y Schrempf, 1995). Por tanto, los inventores plantearon la hipótesis de que la detección de huevos de helmintos a partir de muestras fecales podría lograrse (1) de forma colorimétrica, uniendo un indicador enzimático a la proteína de unión a GlcNAc para generar una señal tras la adición de un sustrato adecuado; o (2) de forma fluorimétrica conjugando la proteína de unión a GlcNAc con un fluoróforo adecuado.

Aunque los CBD y las lectinas presentan mayores afinidades de unión a estructuras de azúcares que contienen quitina y GlcNAc, también pueden unirse a otros polímeros de hidratos de carbono, en particular, la celulosa, que es un componente principal de las heces de herbívoros y omnívoros. Los datos disponibles en la bibliografía son variables y en ocasiones contradictorios26-30, por lo que no queda claro que dichas proteínas puedan discriminar entre los huevos y el grueso de las heces restantes. Los inventores han descubierto que dichas proteínas pueden, de hecho, usarse eficazmente para detectar huevos en este material de fondo y, por tanto, forman la base de los métodos para enumerarlos.

En el presente documento se proporcionan métodos y el equipo asociado para detectar la presencia o ausencia de huevos de parásitos helmintos u ooquistes de protozoos en una muestra ambiental. En particular, los métodos que se proporcionan en el presente documento utilizaron un proceso de filtración que comprende hacer fluir una muestra ambiental a través de una primera membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 85 micrómetros y aproximadamente 350 micrómetros, entre aproximadamente 100 micrómetros y aproximadamente 300 micrómetros, entre aproximadamente 125 micrómetros y aproximadamente 250 micrómetros o entre aproximadamente 150 micrómetros y aproximadamente 200 micrómetros para formar un primer filtrado; hacer fluir el primer filtrado a través de una segunda membrana de filtración que tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 5 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 15 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 20 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 25 micrómetros y aproximadamente 40 micrómetros o entre aproximadamente 30 micrómetros y aproximadamente 35 micrómetros; tratar los huevos de helmintos y/u ooquistes de protozoos capturados en la segunda membrana de filtración con una solución decolorante; poner en contacto los huevos de helmintos y ooquistes de protozoos tratados capturados en la segunda membrana de filtración con un dominio de unión a N-acetil-D-glucosamina conjugado con un resto detectable; y detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en la segunda membrana de filtración en la muestra ambiental observando, cuantitativa o cualitativamente, el grado en el que la N-acetil-D-glucosamina se ha unido a huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en la muestra ambiental. La muestra ambiental puede ser cualquier muestra sospechosa de contener huevos de helmintos u ooquistes de protozoos, incluyendo, por ejemplo, una muestra fecal, una muestra de agua, una muestra de aguas residuales o aguas negras o una muestra de suelo.

La divulgación también proporciona métodos y el equipo asociado para enumerar huevos de parásitos helmintos y/u ooquistes de protozoos en la muestra. Los métodos que se desvelan se alejan de los métodos de recuento de huevos de parásitos usando un microscopio, que han languidecido durante un siglo o más, y describen métodos específicos para usar técnicas bioquímicas modernas.

Pueden detectarse huevos en una suspensión de heces de animales en agua u otro líquido adecuado (incluyendo soluciones tamponadas) mediante un proceso de dos etapas; captura de huevos y detección de huevos. En una etapa, los huevos se capturan en un sustrato sólido como medio para aislarlos de los residuos fecales. El sustrato puede ser bidimensional o tridimensional y puede estar a su vez cosuspendido en el líquido en forma de, por ejemplo, perlas o partículas.

La captura de huevos se facilita recubriendo el sustrato con moléculas tales como proteínas, hidratos de carbono o grupos químicos activados que puedan interactuar con la superficie de los huevos. Si es necesario, la captura puede facilitarse pretratando la suspensión fecal con productos químicos para exponer o activar los grupos químicos de los huevos que puedan facilitar la captura. Dichos productos químicos incluyen, pero sin limitación, lejía, tensioactivos, agentes oxidantes, agentes caotrópicos y enzimas.

La captura puede ser específica, usando como ejemplos no limitantes, anticuerpos contra los componentes de los huevos (por ejemplo, GlcNac) o lectinas que reconocen solo estructuras en todos los huevos de parásitos o en huevos de parásitos de determinados grupos taxonómicos o especies particulares. Como alternativa, la captura puede ser inespecífica y proporcionar una forma de separar los huevos de las partículas de residuos fecales, pero no necesariamente todos los componentes fecales. Dicha captura podría conseguirse, como ejemplos no limitantes, mediante grupos químicamente reactivos tales como ésteres de N-etil-maleimida, ésteres de N-hidroxisuccinamida, aminas en presencia de agentes reticulantes tales como carbodiimidas, aldehidos y otros. Como alternativa, dicha captura podría conseguirse mediante macromoléculas, tales como proteínas o hidratos de carbono, que reconocen huevos de parásitos, pero también otros componentes de las heces.

La captura en un sustrato no tiene por qué depender de productos químicos específicos para unir los huevos y también puede conseguirse mediante métodos físicos, por ejemplo, filtración, donde los huevos pueden separarse de las partículas fecales grandes mediante filtración a través de, como ejemplo no limitante, un filtro de 100 micrómetros. El filtrado que contiene huevos después puede hacerse pasar a través de un filtro más pequeño (por ejemplo, de 10-40 micrómetros pm) para atrapar los huevos y retirar al mismo tiempo partículas más pequeñas, incluyendo esporas y hongos (que podrían interferir con la detección de huevos si el reactivo de detección también puede unirse a estas células). Los huevos capturados en el filtro después pueden detectarse y cuantificarse como se describe en otra parte. Como alternativa, los huevos pueden capturarse y aislarse de las heces sin usar un sustrato sólido. Por ejemplo, las partículas fecales grandes podrían retirarse mediante una centrifugación a velocidad lenta y los huevos recogidos del sobrenadante mediante un centrifugado más rápido que, sin embargo, es demasiado lento para sedimentar partículas más pequeñas y levaduras u hongos. También puede usarse otros métodos físicos tales como difusión, electroforesis, cromatografía o separación por densidad para aislar los huevos antes de la detección.

El método de detección de los huevos depende de si la captura fue específica o inespecífica. Si la etapa de captura fue específica, entonces la selección del método de detección es menos estricta, puesto que se habrían retirado los componentes fecales contaminantes (por ejemplo, la captura de huevos usando perlas magnéticas recubiertas con CBD y, después, usando un colorante fluorescente que se une tanto a la quitina como a otros polímeros de azúcar, tales como la celulosa, para su detección), por ejemplo, blanco de calcoflúor). Si la captura fue inespecífica o semiespecífica y también atrapó componentes no relacionados con los huevos, entonces la detección debe ser lo suficientemente específica para discriminar entre los huevos y los contaminantes. Los posibles métodos de detección no limitantes incluyen: inspección visual; unión y después detección óptica de moléculas específicas de los propios huevos, tales como los anticuerpos, dominios de unión a quitina, lectinas u otras proteínas, todos ellos conjugados con grupos indicadores adecuados, tales como fluoróforos, cromóforos, enzimas, micropartículas coloreadas, puntos cuánticos o metales coloidales. También pueden usarse métodos químicos para detectar componentes celulares generales, y éstos incluyen métodos para detectar proteínas, hidratos de carbono, lípidos y ácidos nucleicos usando ensayos conocidos por los expertos en la materia. Adicionalmente, también puede usarse la hibridación de ADN o ARN de huevos con sondas específicas, o la amplificación de dichos ácidos nucleicos mediante PCR) después de su liberación de los huevos. También pueden usarse métodos físicos para proporcionar especificidad en la detección (después de, si fuera necesario, la liberación de los huevos del sustrato) y los ejemplos no limitantes de dichos métodos incluyen centrifugación, filtración, flotación o recuento de partículas (por ejemplo, usando dispositivos tales como contadores coulter, clasificadores de células; o seleccionadores de partículas). En algunos casos, cuando el sustrato está en forma de partículas o perlas, la detección de huevos puede ser indirecta mediante la detección de las propias perlas/partículas. Las perlas/partículas utilizadas para este fin pueden estar marcadas opcionalmente con cromóforos o fluoróforos adecuados para facilitar la detección. Se entiende que para los fines del presente documento, la expresión "reactivo de detección" abarca todos los componentes necesarios para conseguir la detección. Por ejemplo, un agente de detección que consiste en un anticuerpo unido a una enzima también, por definición, comprende adicionalmente los sustratos enzimáticos adecuados, tampones y otros agentes necesarios para efectuar el cambio de color necesario para la detección.

La detección puede conseguirse con los huevos todavía unidos al sustrato sólido, o después de la liberación de los huevos del sustrato, y la unión de reactivos de detección puede conseguirse antes o después de la captura. En algunos casos, la detección puede facilitarse tratando los huevos con productos químicos para exponer o liberar componentes que puedan detectarse. Los ejemplos no limitantes de dichos productos químicos incluyen tensioactivos, agentes oxidantes, agentes caotrópicos y enzimas.

Mediante la selección de los reactivos de captura y detección adecuados, el recuento de huevos puede ajustarse para detectar todos los huevos de la muestra o huevos de diversos grupos taxonómicos, desde los filos enteros hasta el nivel de especie. Esto puede conseguirse mediante el uso de un único reactivo para la captura y la detección o mediante el uso de múltiples reactivos en una o ambas etapas de captura y detección. Mediante la separación de huevos de diferentes clases/especies, y en combinación con los reactivos adecuados, la abundancia de numerosas clases o especies de huevos de parásitos puede resolverse en un único ensayo.

La captura de los huevos también puede facilitarse induciendo la agregación de huevos en solución mediante la adición de moléculas multivalentes capaces de unirse a los huevos. Los huevos floculados pueden unirse directamente al sustrato a partir de la suspensión fecal o después de su aislamiento mediante técnicas físicas tales como la centrifugación o la flotación.

La captura y la detección también pueden realizarse simultáneamente, por ejemplo, detectando los cambios de tensión tras la unión de los huevos a anticuerpos específicos de los huevos que se han unido a una red de nanofibras de carbono, o mediante métodos ópticos tales como la resonancia de plasmón superficial o la refracción.

En un caso, la detección podría conseguirse sin la captura de los huevos, donde la unión de moléculas específicas de los huevos, tales como anticuerpos o lectinas, marcadas con fluoróforos se detecta por los cambios en la anisotropía o polarización del fluoróforo.

Por tanto, en algunos aspectos, la presente divulgación proporciona métodos novedosos para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos parásitos u ooquistes de protozoos que contienen quitina a partir de muestras ambientales (por ejemplo, muestras fecales). Los métodos que se desvelan en el presente documento proporcionan métodos que pueden realizarse tanto rápidamente como in situ. Más importante aún, los métodos que se desvelan en el presente documento son capaces de detectar huevos de helmintos de cada uno de los principales taxones de helmintos parásitos (por ejemplo, cestodos, nematodos, trematodos y monogéneos) de manera rápida y rentable. Los géneros comunes de parásitos helmintos que infectan a animales incluyen, por ejemplo, Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Pearsonema, Heterakis, Toxocara, Ascardia, Oxyuris, Ancyclostoma, Uncinaria, Toxascaris y Parascaris Ancylostoma, Necator, Trichinella, Capillaria, Dioctophyme, Eimeria, Coccidia, Bursaphelenchus, Ostertagia, Mecistocirrus, Trychostrongylus, Trichuris, Bunostoinuin, Oesophagostomum, Chabertia, Chabertia, Ancylostoma, Paragonimus, Baylisascaris, Aphelenchoides, Meliodogyne, Heterodera, Globodera, Nacobbus, Pratylenchus, Ditylenchus, Xiphinema, Longidorus, Trichodorus, Nematodirus y Enterobius.

Los métodos de la invención pueden usarse para su uso humano y/o veterinario, así como en el área de ensayos ambientales.

En un aspecto, el método de la invención proporciona la obtención de una muestra biológica que comprende una muestra fecal (por ejemplo, una muestra de heces) de un sujeto mamífero (por ejemplo, un sujeto animal o humano). Por ejemplo, la muestra fecal puede ser una muestra fecal de mamífero obtenida de un caballo, vaca, cerdo, cabra, ovejas, llama, ciervo, perro, gato, ave o ser humano. Por "obtención" se entiende recoger, comprar o adquirir de otro modo la muestra fecal.

En algunos aspectos, los métodos novedosos que se desvelan en el presente documento comprenden poner contacto una muestra sospechosa de contener huevos de helmintos u ooquistes de protozoos con un dominio de unión a GlcNAc o un fragmento del mismo. La expresión "dominio de unión a N-acetil-D-glucosamina (GlcNac)", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula incluyendo proteínas de unión a N-acetil-D-glucosamina (GlcNac) naturales o modificadas genéticamente, moléculas inorgánicas y moléculas orgánicas que tengan una afinidad de unión específica por N-acetil-D-glucosamina, incluyendo cualesquier fragmentos, derivados o análogos de las mismas.

La expresión "proteína de unión a N-acetil-D-glucosamina (GlcNac)", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula, incluyendo proteínas, péptidos o anticuerpos naturales o modificados genéticamente que tengan una afinidad de unión específica por N-acetil-D-glucosamina, incluyendo cualesquier fragmentos, derivados o análogos de los mismos. Las proteínas de unión a GlcNac de ejemplo incluyen, por ejemplo, lectinas, quitinasas, proteínas de unión a quitina o un dominio de unión a quitina (CBD).

En algunos aspectos, los métodos novedosos que se desvelan en el presente documento comprenden poner contacto una muestra sospechosa de contener huevos de helmintos u ooquistes de protozoos con una proteína de unión a quitina o un fragmento de la misma. La expresión "proteína de unión a quitina", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula, incluyendo proteínas, péptidos o anticuerpos que tengan una afinidad de unión específica por quitina. Las proteínas de unión a quitina incluyen, por ejemplo, proteínas de unión a N-acetil-D-glucosamina (GlcNac), quitinasas y dominios de unión a quitina (CBD).

El término "lectina", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula, incluyendo proteínas, naturales o modificados genéticamente, que interactúe específicamente con sacáridos (es decir, hidratos de carbono). Aunque los ejemplos del presente documento se refieren a una lectina vegetal natural, el término "lectina" en el presente documento se refiere a lectinas de cualquier especie, incluyendo, pero sin limitación, plantas, animales, insectos y microorganismos, que tienen una especificidad de unión a hidratos de carbono deseada. Los ejemplos de lectinas vegetales incluyen, pero sin limitación, la familia de lectinas de leguminosas, tales como ConA, aglutinina de soja y lectina de lenteja. Otros ejemplos de lectinas vegetales son las lectinas de las familias Gramineae y Solanaceae. Los ejemplos de lectinas animales incluyen, pero sin limitación, cualquier lectina conocida de los principales grupos de lectinas de tipo S, lectinas de tipo C, lectinas de tipo P y lectinas de tipo I.

En algunas realizaciones, la lectina se selecciona entre el grupo que consiste en aglutinina de germen de trigo (WGA), aglutinina de soja (SBA), lectina de Maclura pomifera (MPL), lectina de Bauhinia purpurea (BPL), lectina de Datura stramonium (DSL), lectina de Lycopersicon esculentum (LEL), lectina de Solanum tuberosum (STL) y Psophocarpus tetragonolobus-II (PTL-II).

La expresión "dominio de unión a quitina" o "DBC", como se usa en el presente documento, se refiere a cualesquier moléculas, incluyendo proteínas, naturales o modificadas genéticamente, que interactúan específicamente con la quitina. Los CBD son conocidos por el experto en la materia y pueden derivar de quitinasas o de proteínas cuticulares de artrópodos y están disponibles en el mercado de múltiples fuentes, incluyendo el kit IMPACT™ suministrado por New England Biolabs.

El término "quitinasa" describe en general una enzima específica para el sustrato quitina. Existen muchos tipos diferentes de quitinasas en la naturaleza. Por ejemplo, se encuentran quitinasas en microbios tales como Serratia, Vibrio y Streptomyces.

La divulgación proporciona un dominio de unión a N-acetil-D-glucosamina, incluyendo proteínas de unión a N-acetil-D-glucosamina, conjugados con uno o más restos detectables. Como se usan en el presente documento, las expresiones "marcador" y "resto detectable" son intercambiables y se refieren a restos que pueden unirse a (por ejemplo, conjugarse con) una proteína de unión para hacer de este modo que la proteína de unión sea detectable mediante un instrumento o método.

Los ejemplos no limitantes de restos detectables adecuados para su uso en la práctica de la invención que se desvela incluyen, por ejemplo, un hapteno, una enzima, un cromóforo, un epítopo de anticuerpo, un antígeno, un fluoróforo, un radioisótopo, una nanopartícula, un miembro de un par de unión, un compuesto luminiscente y un quelato de metal.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "marcador de fluorescencia" y "fluoróforo" se usan indistintamente y se refieren a cualquier sustancia que emita energía electromagnética a una determinada longitud de onda (longitud de onda de emisión) cuando la sustancia es iluminada por una radiación de una longitud de onda diferente (longitud de onda de excitación) y tienen por objeto abarcar una molécula química o bioquímica o fragmentos de la misma que sea capaz de interactuar o reaccionar específicamente con un analito de interés en una muestra para proporcionar una o más señales ópticas.

Los fluoróforos representativos para su uso en los métodos que se proporcionan en el presente documento incluyen, por ejemplo, proteína fluorescente verde, proteína azul fluorescente, proteína roja fluorescente, fluoresceína, 5-isotiocianato de fluoresceína (FITC), colorantes de cianina (Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), colorantes Bodipy (Invitrogen) y/o colorantes Alexa Fluor (Invitrogen), dansilo, Cloruro de Dansilo (DNS-C1), 5-(yodoacetamida)fluoresceína (5-IAF, 6 -acriloil-2-dimetilaminonaftaleno (acrylodan), cloruro de 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3,-diazol-4-ilo (NBD-Cl), bromuro de etidio, Amarillo Lucifer, colorantes de rodamina (clorhidrato de 5-carboxirrodamina 6G, lisamina-rodamina B cloruro de sulfonilo, rodamina-B-isotiocianato (rodamina-B-isotiocianato RITC), rodamina 800); 5-(y 6-)isotiocianato de tetrametilrrodamina (TRITC), Texas Red™, cloruro de sulfonilo, ácidos naftalamina sulfónicos, incluyendo, pero sin limitación, el ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfónico (ANS) y el ácido 6-(ptoluidinil)naftaleno-2-sulfónico (TNS), antroil-ácido graso, DPH, Ácido parinárico, TMA-DPH, fluorenil-ácido graso, Fluoresceína-fosfatidiletanolamina, Rojo Texas-fosfatidiletanolamina, Pirenilfosfatidilcolina, Fluorenil-fosfatidilcolina, Merocianina 540, Naftil Estirilo, 3,3'-dipropiltiadicarbocianina (diS-C3-(5)), 4-(p-dipentil-aminoestiril)-1 -metilpiridinio (di-5-ASP), Cy-3 Acetamida de yodo, Cy-5-N-hidroxisuccinimida, Cy-7-Isotiocianato, IR-125, Naranja tiazol, Azure B, Azul Nilo, Ftalocianina de Al, Oxaxina 1, 4',6-diamidino-2-fenilindol. (DAPI), Hoechst 33342, TOTO, Naranja de acridina, Homodímero de etidio, N(etoxicarbonilmetil)-6-metoxiquinolinio (MQAE), Fura-2, Verde calcio, carboxi SNARF-6, BAPTA, cumarina, fitoflúors, Coroneno y complejos metal-ligando.

Los haptenos para su uso en los métodos que se proporcionan en el presente documento incluyen, por ejemplo, digoxigenina, glutatión y biotina.

Las enzimas para su uso en los métodos que se proporcionan en el presente documento incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante (HRP), peroxidasa de soja (SBP), ureasa, beta-lactamasa y glucosa oxidasa.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a GlcNac es un anticuerpo. Se han desvelados anticuerpos antiquitina (por ejemplo, anti-GlcNac) en el documento US5004699, estos anticuerpos pueden usarse para la detección de hongos y levaduras (documento US5004699).

El resto detectable puede ser un miembro específico (un primer miembro o un segundo miembro) de un par de unión. Los pares de unión para su uso en los métodos que se proporcionan en el presente documento incluyen, por ejemplo, biotina/estreptavidina, biotina/avidina, biotina/neutravidina, biotina/captavidina, epítopo/anticuerpo, proteína A/ inmunoglobulina, proteína G/inmunoglobulina, proteína L/inmunoglobulina, GST/glutatión, marcador de His/Metal (por ejemplo, níquel, cobalto o cobre), antígeno/anticuerpo, FLAG/anticuerpo MI, proteína de unión a maltosa/maltosa, proteína de unión a calmodulina/calmodulina, enzima-sustrato de enzima y receptor-ligando. En algunas realizaciones, la proteína de unión a GlcNac se conjuga con un primer miembro de par de unión (por ejemplo, biotina, avidina, neutravidina, captavid, anticuerpo, antígeno, proteína A, proteína G, proteína L, GST, marcador de His, FLAG, MBP, proteína de unión a calmodulina, una enzima, un receptor o ligando).

En una realización, la proteína de unión a GlcNac es aglutinina de germen de trigo y el resto detectable es fluoresceína. En otra realización, la proteína de unión a GlcNAc es una proteína que contiene un dominio de unión a quitina y el resto detectable es fluoresceína.

En algunos aspectos de la divulgación, los métodos que se proporcionan en el presente documento emplean un colorante que se une directamente a la quitina y es fluorescente cuando se expone a una luz de excitación de fluorescencia, tales como los colorantes desvelados en el documento U.S. 6.440.388. Los ejemplos no limitantes de colorantes que se unen o se conjugan con quitina y que son fluorescentes en la luz ultravioleta o visible incluyen blanco de calcoflúor, Uvitex 3B (agente blanqueador fluorescente de diestiril bifenilo), Rylux BA, Rylux BSU (sal de ácido 1,4-bencenodisulfónico-2,2'-[etilenidil-bis[(3-sulfo-4,1-fenilen)imino[6-bis(2-hidroxietil)amino]-1,3,5-trihexasodio) (Ostacolor, Pardubice, República Checa) y Blankophor (4,4'-bis{(4-anilino)-6-morfolino-1,3,5-triazin-2-il)amino}estilben-2,2'-disulfonato disódico).

En algunas realizaciones, un primer miembro de un par de unión se conjuga con una proteína de unión a GlcNac y el segundo miembro del par de unión se inmoviliza en un soporte sólido. En otras realizaciones, un primer miembro de un par de unión se conjuga con una proteína de unión a GlcNac y el segundo miembro del par de unión se conjuga con una enzima, un epítopo de anticuerpo, un antígeno, un fluoróforo, un radioisótopo, una nanopartícula, un miembro de un segundo par de unión y un quelato de metal. Por ejemplo, el primer miembro del par de unión puede ser biotina y el segundo miembro del par de unión puede ser estreptavidina, avidina, neutravidina o capravidina, y el segundo miembro del par de unión conjugado con una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante (HRP), ureasa, peroxidasa de soja (SBP), beta-lactamasa o glucosa oxidasa).

En algunos casos, la quitina (por ejemplo, GlcNac) puede estar parcial o totalmente bloqueada por una cápsula polisacarídica u otro tipo de recubrimiento macromolecular que se encuentra en los huevos de helmintos. Sin embargo, la quitina es extremadamente robusta, por tanto, pueden usarse digestiones enzimáticas usando proteasas o polisacáridos, tales como una glucanasa o una mananasa, para permeabilizar o retirar la capa de bloqueo antes de la detección de quitina. Como alternativa, puede usarse un tratamiento extremo, tal como la decoloración en una solución decolorante (NaOCl al 1 %, NaOH 0,5 M o una composición similar con mayores o menores concentraciones de producto químico individual), como se describe en el documento US2007/0099234) para retirar la capa de enmascaramiento. Por tanto, en algunas realizaciones, los métodos que se proporcionan en el presente documento comprenden adicionalmente, antes de poner en contacto los huevos de helmintos con una proteína de unión a GlcNac, una etapa de tratamiento de la muestra con un decolorante u otra solución que exponga la cubierta.

De acuerdo con los métodos que se describen en el presente documento, pueden detectarse huevos de parásito en una suspensión de heces de animales en agua u otro líquido adecuado (incluyendo soluciones tamponadas) mediante un proceso de dos etapas; captura de huevos y detección de huevos.

En algunos aspectos, los métodos que se describen en el presente documento comprenden capturar huevos por filtración, comprendiendo los métodos proporcionar una solución fecal que comprende una muestra fecal suspendida en un tampón de muestra, hacer fluir la solución fecal a través de una primera membrana de filtración para formar un primer filtrado y hacer fluir el primer filtrado a través de una segunda membrana de filtración para capturar los huevos de helmintos en la segunda membrana de filtración.

En un aspecto, los métodos comprenden obtener una solución fecal que comprende una muestra fecal suspendida en un tampón de muestra, hacer fluir la solución fecal a través de una primera membrana de filtración para formar un primer filtrado y hacer fluir el primer filtrado a través de una segunda membrana de filtración, en donde los huevos de helmintos se capturan en la segunda membrana de filtración. Los métodos comprenden adicionalmente poner en contacto los huevos de helmintos capturados en la segunda membrana de filtración con una proteína de unión a GlcNac conjugada con un resto detectable y detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos en la muestra fecal basándose en la intensidad de la señal del resto detectable.

En un aspecto, los métodos que se proporcionan en el presente documento comprenden hacer fluir la solución fecal a través de una primera membrana de filtración (por ejemplo, un filtro). Hacer fluir la solución fecal a través de una primera membrana de filtración permite separar los huevos de las partículas fecales. Por tanto, la primera membrana de filtración comprende un tamaño de poro que permite que los huevos pasen libremente a través del filtro (por ejemplo, teniendo un tamaño de poro de al menos 80 micrómetros) y también captura partículas fecales.

Por tanto, los métodos que se proporcionan en el presente documento comprenden el uso de un primer aparato de filtración. El tamaño de poro del primer aparato de filtración se selecciona generalmente de manera que los poros sean lo suficientemente grandes para permitir que los huevos de helmintos y los ooquistes de protozoos pasen libremente a su través, pero que sean lo suficientemente pequeños para capturar partículas finas (por ejemplo, menos de aproximadamente 450 micrómetros, menos de aproximadamente 425 micrómetros o menos de aproximadamente 400 micrómetros) de la solución fecal. En algunas realizaciones, la primera membrana de filtración del primer aparato de filtración comprende un tamaño de poro de entre aproximadamente 85 micrómetros y aproximadamente 350 micrómetros, entre aproximadamente 100 micrómetros y aproximadamente 300 micrómetros, entre aproximadamente 125 micrómetros y aproximadamente 250 micrómetros, entre aproximadamente 150 micrómetros y aproximadamente 200 micrómetros o aproximadamente 85 micrómetros, aproximadamente 90 micrómetros, aproximadamente 95 micrómetros, aproximadamente 100 micrómetros, aproximadamente 120 micrómetros, aproximadamente 125 micrómetros, aproximadamente 150 micrómetros, aproximadamente 175 micrómetros, aproximadamente 200 micrómetros, aproximadamente 250 micrómetros, aproximadamente 300 micrómetros, aproximadamente 350 micrómetros, o, como máximo, aproximadamente 400 micrómetros.

En un aspecto, los métodos que se proporcionan en el presente documento comprenden hacer fluir la solución fecal a través de una segunda membrana de filtración (por ejemplo, un filtro). Por tanto, la segunda membrana de filtración comprende un tamaño de poro que permite que el fluido pase libremente a través del filtro y también capture huevos u ooquistes (por ejemplo, teniendo un tamaño de poro de 80 micrómetros o menos).

Por tanto, los métodos que se proporcionan en el presente documento comprenden el uso de un segundo aparato de filtración. El tamaño de poro del segundo aparato de filtración se selecciona generalmente de manera que los poros sean lo suficientemente grandes para permitir que el fluido y las partículas finas pasen libremente a su través, teniendo al mismo tiempo un tamaño (es decir, sean lo suficientemente pequeños) para capturar huevos de helmintos de la solución fecal. El tamaño y el diámetro característicos de los huevos de helmintos parásitos son de entre aproximadamente 20 micrómetros y 80 micrómetros. Por tanto, para capturar huevos de helmintos de la solución fecal, la segunda membrana de filtración del segundo aparato de filtración comprende un tamaño de poro de entre 5 y aproximadamente 45 micrómetros, entre 10 y aproximadamente 45 micrómetros, entre 15 y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 20 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros, entre aproximadamente 25 micrómetros y aproximadamente 40 micrómetros, entre aproximadamente 30 micrómetros y aproximadamente 35 micrómetros o aproximadamente 5 micrómetros, aproximadamente 10 micrómetros, aproximadamente 15 micrómetros, aproximadamente 20 micrómetros, aproximadamente 25 micrómetros, aproximadamente 30 micrómetros, aproximadamente 35 micrómetros, aproximadamente 40 micrómetros o aproximadamente 45 micrómetros. Puesto que muchos ooquistes de protozoos son más pequeños que los huevos de helmintos, en el presente documento se desvela el uso de filtros de poros más pequeños, por ejemplo, de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 micrómetros o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 micrómetros.

La minimización de los residuos fecales extraños en la muestra fecal es beneficiosa para obtener recuentos de huevos en heces uniformes y, normalmente, las partículas grandes y los residuos deben retirarse por filtración de la muestra fecal antes de que la muestra fecal sea adecuada para el contacto con una proteína de unión a GlcNac. Por tanto, los métodos que se desvelan en el presente documento comprenden opcionalmente el uso de un aparato de filtración en volumen para retirar partículas más grandes y residuos. El tamaño de poro del aparato de filtración en volumen se selecciona generalmente de manera que los poros sean lo suficientemente grandes para permitir que los huevos de helmintos y los ooquistes de protozoos pasen libremente a su través, pero que sean lo suficientemente pequeños para capturar partículas grandes (por ejemplo, partículas mayores o iguales a 400 micrómetros) y residuos de la materia fecal. Por ejemplo, la membrana de filtración del aparato de filtración en volumen comprende un tamaño de poro de entre aproximadamente 400 micrómetros y aproximadamente 800 micrómetros, entre aproximadamente 425 micrómetros y aproximadamente 750 micrómetros, entre aproximadamente 450 micrómetros y aproximadamente 700 micrómetros, entre aproximadamente 500 micrómetros y aproximadamente 650 o entre aproximadamente 550 micrómetros y aproximadamente 600 micrómetros. En algunas realizaciones, el aparato de filtración en volumen puede estar conectado directamente al vaso utilizado para recoger la muestra fecal (por ejemplo, el vaso de recogida). En algunas realizaciones, la membrana de filtración en volumen tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 400 micrómetros y aproximadamente 450 micrómetros, la primera membrana de filtración tiene un tamaño de poro de entre aproximadamente 85 micrómetros y aproximadamente 120 micrómetros, y la segunda membrana de filtración tiene un tamaño de poro entre aproximadamente 20 micrómetros y aproximadamente 30 micrómetros.

Como se puede apreciar en la técnica, existen muchas formas de hacer fluir un volumen de líquido (por ejemplo, una solución) a través de una membrana de filtración, tales como el flujo por gravedad, la presión o con la ayuda de una bomba.

Los métodos de la presente invención permiten la visualización de huevos de helmintos parásitos y ooquistes de protozoos que contienen quitina, marcando la quitina con un indicador adecuado (por ejemplo, un resto detectable). Después de la unión de la quitina por un indicador adecuado (por ejemplo, un resto detectable), la cuantificación de huevos podría lograrse visualmente (1) mediante la comparación con un diagrama de colores, mediante el uso de un fluorímetro o colorímetro de longitud de onda única de bajo coste o mediante la cuantificación digital del color después de la fotografía usando una cámara, teléfono móvil, tablet u otro dispositivo de formación de imágenes digitales o (2) en el caso de un derivado de unión a quitina fluorescente, mediante la formación de imágenes de la muestra con una iluminación adecuada con un teléfono móvil u otra cámara equipada con la óptica adecuada, junto con un análisis de imagen automatizado.

El resto detectable puede iluminarse con una longitud de onda de luz que dé como resultado una respuesta óptica detectable y puede observarse con un medio para detectar la respuesta óptica. tras la iluminación, tal como mediante una longitud de onda ultravioleta o visible, los compuestos fluorescentes, incluyendo los unidas a la proteína de unión a GlcNac o a un miembro de par de unión específico, presentan una absorción intensa en el visible así como emisión de fluorescencia. El equipo seleccionado que es útil para iluminar los compuestos fluorescentes de la invención incluye, pero sin limitación, ventajosamente, equipos útiles para iluminar los compuestos fluorescentes incluyendo lámparas portátiles (por ejemplo, lámparas ultravioletas de mano). Estas fuentes de iluminación se integran opcionalmente en escáneres láser portátiles, lectores de microplacas fluorescentes, formadores de imágenes de gel fluorescente, fluorómetros convencionales o mini, colorímetros convencionales o mini o detectores cromatográficos. Antes de la detección, el exceso de luz de excitación se reduce o se retira mediante el paso a través de un filtro óptico que impide que pasen algunas o todas las longitudes de onda de excitación, permitiendo al mismo tiempo el paso de algunas o todas las longitudes de onda de emisión fluorescente. Esta emisión de fluorescencia se detecta opcionalmente mediante inspección visual o mediante el uso de cualquiera de los siguientes dispositivos de formación de imágenes: una cámara digital, un teléfono móvil, un teléfono inteligente, una tablet, un ordenador portátil, un ordenador y un escáner.

En el presente documento se describen adicionalmente kits para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos y ooquistes de protozoos en muestras fecales. Los kits pueden adoptar una doversidad de formas. Normalmente, los kits incluirán reactivos adecuados para detectar huevos de helmintos en una muestra. Opcionalmente, los kits pueden contener una o más muestras de control.

Los kits que se describen en el presente documento comprenden opcionalmente un vaso de recogida en el que una cantidad de muestra fecal puede colocarse y diluirse con una solución tampón adecuada. Después, el vaso puede sellarse y la muestra fecal y el tampón pueden agitarse u homogeneizarse para producir una solución fecal mezclada uniformemente. La solución tampón puede ser agua corriente o un medio de flotación o tampón adecuado. El vaso de recogida puede ser un vaso desechable para la recogida de heces o un vaso reutilizable.

El vaso de recogida puede tener, por ejemplo, la forma de un tubo normal con tapa, con graduaciones, que indican el volumen de la muestra de ensayo de heces en bruto que ha de colocarse dentro del tubo, así como la cantidad de líquido diluyente que ha de añadirse.

En algunos aspectos de la divulgación, el vaso de recogida se fija a un aparato de filtración en volumen.

El kit también puede comprender una construcción para recoger la muestra fecal, tal como un vaso desechable para la recogida de heces, etc., así como un dispositivo de recogida, por ejemplo, en forma de una cuchara pequeña para coger una cantidad determinada de materia fecal. El dispositivo de recogida (pala) puede ser una parte integral de la tapa del recipiente.

En algunos aspectos de la divulgación, los kits comprenden un primer aparato de filtración, opcionalmente, un segundo aparato de filtración y, opcionalmente, un aparato de filtración en volumen como se describe en el presente documento.

Los kits que se describen en el presente documento comprenden un reactivo (por ejemplo, una solución de reactivo) que contiene una proteína de unión a GlcNAc. La proteína de unión a GlcNac puede ser una lectina o CBD como se describen en el presente documento. Opcionalmente, la proteína de unión a GlcNac se conjuga con un resto detectable. En una realización, el reactivo contiene un colorante capaz de unirse o conjugarse directamente con quitina y emitir fluorescencia tras la exposición a la luz, y una fuente de luz que emite una longitud de onda capaz de excitar la fluorescencia del colorante unido a quitina.

Los kits pueden incluir un sistema portátil para detectar el resto detectable, tal como un fluorímetro, un colorímetro, un espectrofotómetro u otro dispositivo de formación de imágenes. Los kits también pueden incluir una bandeja diseñada para sostener la muestra y el sistema portátil para detectar el resto detectable. Como se describe en el presente documento, el kit comprende una bandeja que sostiene o contiene un dispositivo de formación de imágenes.

Algunos aspectos de los kits (por ejemplo, el aparato de detección o las partes reutilizables de un sistema de filtración) pueden comercializarse por separado de otros aspectos de los kits (por ejemplo, los reactivos de detección de módulos de filtro de un solo uso).

Los kits que se describen en el presente documento pueden usarse para un uso humano y/o veterinario.

Los principios generales esbozados anteriormente pueden usarse para diseñar un gran número de sistemas para detectar la presencia y abundancia de huevos de parásitos en suspensiones fecales. Con fines ilustrativos a continuación se presenta una serie de ejemplos no limitantes de varios ensayos de recuento de huevos que pueden realizarse usando estos principios.

Cabe señalar que para la detección y la cuantificación satisfactorias de huevos del parásito se necesita tanto un método para separar (e idealmente concentrar) huevos del grueso de la muestra fecal, como un método para detectar dichos huevos. Si el método de separación también da como resultado el posible coaislamiento de otros componentes fecales y el método de detección no discrimina entre ellos, entonces el ensayo no será específico. Por ejemplo, Zhang y McReynolds23 desvelan el uso del dominio de unión a quitina (CBD) de diversas enzimas quitinasas para la detección de quitina en muestras biológicas con fines de diagnóstico. Sin embargo, puesto que muchos organismos contienen quitina, por ejemplo, levaduras, otros hongos, nematodos (y sus huevos), su mera detección no puede considerarse como un diagnóstico concluyente de ninguno de estos organismos. De forma similar, Winters24 desvela el uso de anticuerpos anti-quitina para detectar quitina en muestras biológicas como método para diagnosticar la presencia de levaduras y hongos. Winters no anticipa, sin embargo, la posibilidad de detección de quitina en helmintos o sus huevos, por lo que el ensayo desvelado no puede considerarse específico ni para las levaduras y hongos ni para helmintos o sus huevos, a menos que pueda eliminarse la posibilidad de la presencia de uno de estos grupos. En el caso de las heces de animales (y en particular para herbívoros) es posible la presencia de células tanto de levaduras como de hongos (y esporas), y de fragmentos de insectos, por lo que la presencia de quitina por sí sola no puede considerarse un diagnóstico definitivo de la presencia de huevos de parásitos, tampoco puede considerarse fiable la cuantificación de los huevos de parásitos en presencia de un fondo potencialmente variable de otros organismos que contienen quitina.

También se ha sugerido que pueden usarse diversas lectinas para distinguir entre especies diferentes de parásitos y sus huevos. Sin embargo, se sabe que la mayoría de las lectinas son semiespecíficas, puesto que reconocen estructuras de azúcar que pueden estar presentes en una serie diversa de organismos. Por tanto, aunque la unión a lectina podría distinguir entre especies reactivas y no reactivas, como principio general, la unión a lectina por sí sola no puede proporcionar un diagnóstico concluyente de infestación por parásitos a menos que se haya demostrado que todos los demás organismos contaminantes posibles son negativos para la unión.

En algunas realizaciones, una muestra fecal se suspende en agua o en un tampón adecuado tal como, pero sin limitación, solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se pone en contacto con perlas recubiertas con un reactivo capaz de unirse a huevos de parásitos (por ejemplo, una proteína de unión a GlcNac). El reactivo puede ser específico solo para dichos huevos, o para huevos de grupos taxonómicos de interés, o específico tanto para huevos como para otros componentes de las heces. Los reactivos específicos incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales generados contra un organismo particular de interés o que reconoce múltiples taxones de organismos, o un anticuerpo policlonal generado contra múltiples taxones u organismos individuales, o mezclas de múltiples anticuerpos monoclonales y/o policlonales. Los reactivos no específicos incluyen proteínas tales como CBD o lectinas o mezclas de los mismos, ya sea solos o en combinación con anticuerpos. En el caso del CBD, la unión puede potenciarse aplicando CBD en un pH elevado por encima de 7 y/o a una concentración alta de sal, por ejemplo, pero sin limitación, NaCl 0,5 M. Para los fines del presente documento, Se entiende que CDB se refiere no solo a un único dominio de unión a quitina de cualquier especie, sino también a múltiples CDB producidos por conjugación química o por expresión de repeticiones en tándem fusionadas genéticamente de dos CDB más con o sin secuencias intermedias no CDB. También se entiende que el CBD no tiene por qué ser una secuencia natural encontrada en la naturaleza, sino que también puede ser una secuencia peptídica artificial capaz de unirse a quitina, o variantes mutantes de CBD con afinidades de unión iguales o diferentes en comparación con las secuencias naturales.

En otra realización, el tampón también puede contener opcionalmente reactivos para ayudar a exponer los sitios de unión a la diana deseados en los huevos e incluyen, pero sin limitación, tensioactivos (tales como Tween-20, dodecil sulfato de sodio y Triton X-100), agentes oxidantes (tales como hipoclorito de sodio, N-clorotosilamida o peróxido de hidrógeno), caótropos (tales como urea o clorhidrato de guanidinio), enzimas (tales como proteasas, glicosidasas o lipasas) o lejía.

T ras la unión, las perlas cargadas con huevos (y posiblemente otros componentes fecales) se separan físicamente del resto de las heces mediante, por ejemplo, filtración (usando un filtro con tamaños de poro suficientes para retener las perlas y su carga, pero no otros residuos fecales) o mediante centrifugación. Como alternativa, las perlas podrían estar impregnadas de hierro y dichas perlas paramagnéticas o magnéticas (que están fácilmente disponibles en el mercado) podrían separarse del resto de la suspensión fecal mediante la aplicación de un campo magnético.

En un aspecto de la divulgación, tras el aislamiento de las perlas, las perlas se suspenden en un volumen pequeño (por ejemplo, 100 pl) de tampón y se examinan ópticamente usando un microscopio. Aunque este método no elimina la inconveniencia de la inspección visual, permite el aislamiento y el recuento de un gran número de huevos de las heces. Los métodos actuales muestrean solo de 1/25 a 1/200 de una muestra fecal de varios gramos, dando como resultado una sensibilidad baja y una variabilidad alta. El presente método elimina ambos problemas mediante la eliminación de dicho submuestreo.

En un aspecto, que se representa en la Figura 1, se aíslan huevos como se describe en el Ejemplo 1 usando perlas magnéticas. En una realización, el reactivo de captura que se une a las perlas es CBD, que se une reversiblemente a la perla magnética por medio de una secuencia de 6 restos de histidina en su extremo N o C que se unen a los átomos de níquel de la superficie de las perlas. En otra realización, el CBD se fusiona con un vehículo, tal como proteína de unión a maltosa (MBP), que se usa para unir reversiblemente el CBD a perlas recubiertas con maltosa. En estas realizaciones, CBD puede desprenderse de las perlas mediante la adición de histidina, imidazol o maltosa como ejemplos no limitantes.

Tras el aislamiento de huevos y la retirada de residuos fecales, el material unido se libera de las perlas mediante la adición del agente de elución adecuado (por ejemplo, una solución de histidina (o imidazol) o maltosa). Después, las perlas se vuelven a unir al imán y la solución que contiene los huevos liberados y la materia fecal se extrae a través de un filtro. El fin de esta etapa es separar células de hongos y levaduras, que también podrían unirse a CBD, de los huevos. El tamaño de poro del filtro se selecciona para permitir el paso a su través de células de levadura y hongos más pequeñas (5-40 pm), reteniendo al mismo tiempo las células de huevos más grandes (50-100 pm), proporcionando de este modo la especificidad que el CBD por sí solo no proporciona en un sistema de este tipo. Tras la aspiración de la solución, solo se retienen huevos (con DBC unido) y perlas (que se adhieren al lateral del tubo por el imán) en la cámara de ensayos.

Puesto que la aspiración de la solución retira la molécula de elución (por ejemplo, histidina (o imidazol) o maltosa), la adición de tampón fresco y la retirada del imán permiten que los huevos vuelvan a unirse a las perlas a través de los CDB unidos. Puesto que las perlas son de color marrón debido a su contenido en hierro, pueden usarse ellas mismas para cuantificar el número de huevos presentes después de la retirada de las perlas que no están unidas a huevos. Puesto que las propias perlas son mucho más pequeñas que los huevos (el tamaño de las perlas disponibles en el mercado varía entre 0,2 y 5 micrómetros), las perlas no unidas se retiran mediante un segundo pase a través del mismo filtro (aunque también podría usarse un tubo diferente y un filtro nuevo).

Después, las perlas retenidas unidas a huevos se resuspenden en tampón fresco y se cuantifican vertiendo la suspensión en una cámara de detección. La base de la cámara contiene un pequeño imán que atrae los complejos huevo-perlas en una pequeña área superficial. El fin de esta cámara de detección es concentrar los complejos huevo/perla para intensificar el color de la perla y permitir la determinación visual de la intensidad del color en comparación con un diagrama de colores normalizado con el fin de cuantificar el número de perlas (y por tanto, de huevos) presentes en la muestra. Como alternativa, pueden obtenerse imágenes del área mediante un sensor óptico para obtener una lectura más precisa de la intensidad del color.

El número de perlas (y por tanto, de huevos) se determina ópticamente usando un espectrofotómetro o un colorímetro de longitud de onda única para medir la turbidez de la suspensión de huevos/perlas.

En algunos aspectos de la divulgación, los huevos se cuantifican tras la liberación inicial de las perlas midiendo su capacidad para dispersar luz. Las levaduras y hongos, si están presentes, pueden diferenciarse de los huevos basándose en su menor tamaño mediante la selección de la longitud de onda de luz adecuada para su detección, o mediante el uso de un medidor de partículas.

En otras realizaciones, no es necesario que el reactivo de captura sea CBD y podría ser, a modo de ejemplo no limitante, un anticuerpo (monoclonal o policlonal) o una lectina (o mezcla de lectinas).

En otra realización, el reactivo de captura es específico solo para los huevos de parásitos, o solo para un subconjunto de huevos de interés clínico, entonces podría usarse una sola etapa de aspiración (sin reactivo de elución) para retirar las perlas no unidas y, entonces, en un aspecto de la divulgación, facilitar la cuantificación de los complejos huevo/perla como se ha descrito anteriormente.

En otra realización más, si el reactivo de captura también se une a levadura y/u hongos y si las células de levadura y/o fúngicas unidas a las perlas no forman agregados o complejos lo suficientemente grandes para quedar retenidos por el filtro (cuyo tamaño de poro es lo suficientemente pequeño para retener agregados/complejos huevo/perla), o si la carga de levadura y/o fúngica no produce un fondo clínicamente significativo en el ensayo, entonces podría usarse una sola etapa de aspiración (sin reactivo de elución) para retirar las perlas no unidas y las levaduras/hongos (si están presentes) y, entonces, en un aspecto de la divulgación, facilitar la cuantificación de los complejos huevo/perla como se ha descrito anteriormente.

En otros aspectos de la divulgación, la detección de huevos unidos se consigue mediante una reacción cromogénica utilizando, a modo de ejemplos no limitantes, ensayos de proteínas, ensayos de hidratos de carbono, o mediante la unión de otras moléculas de reconocimiento, tales como anticuerpos, lectinas o CBD a los huevos. En este último caso, las moléculas se conjugan con grupos indicadores tales como cromóforos, fluoróforos, microperlas coloreadas, puntos cuánticos, metales coloidales o enzimas cromógenas (por ejemplo, HRP o AP).

En otros aspectos de la divulgación, y en el caso de la captura específica de huevos, la detección puede producirse inmediatamente después de la captura de los huevos y el lavado de las perlas usando métodos tales como los que se detallan en otro lugar y no requiere ninguna etapa de filtración.

En otros aspectos de la divulgación, en el caso de la captura específica de huevos, la detección de huevos puede realizarse con o sin liberación de las perlas usando dispositivos de recuento de partículas, tales como un contador coulter, un clasificador de células o un seleccionador de partículas.

En otra realización más de la invención, los complejos huevo/perla se tratan con reactivos para liberar componentes para la detección química. Estos reactivos incluyen, pero sin limitación, proteasas, glicosidasas (incluyendo la quitinasa), tensioactivos, caótropos y agentes oxidantes.

Los métodos que se desvelan en el presente documento permiten la cuantificación de las cargas de huevos en heces por los veterinarios in situ, o por los propios propietarios de animales, puesto que no es necesario equipo ni cualificación caros o especializados (los imanes, las perlas y los colorímetros de longitud de onda única pueden fabricarse todos ellos de forma económica y no requieren una cualificación especializada para su funcionamiento).

En un aspecto de la divulgación, los métodos que se desvelan en el presente documento comprenden el uso de reactivos de captura (tales como un anticuerpo, lectina o CDB) unidos a una superficie sólida tal como una tira bidimensional de material, aunque la forma real puede variar según sea necesario. La tira puede consistir en cualquier material compatible, incluyendo, pero sin limitación, un plástico (tal como polietileno, polipropileno o poliestireno) u otro polímero (tal como celulosa, fosfocelulosa o difluoruro de polivinilideno). El reactivo de captura se une a la superficie mediante una de las muchas químicas reactivas disponibles para un experto en la materia y que dependen de la naturaleza de la química de la superficie. Las posibles moléculas no limitantes capaces de unir proteínas a dichas superficies incluyen suberato de disuccinimidilo, adipimidato de dimetilo, succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato o N-hidroxisuccinimida. No es necesario que el reactivo de captura se aplique a toda la superficie y puede localizarse en una área particular, tal como un punto o una tira.

En otros aspectos de la divulgación, los reactivos de captura se unen a la superficie de forma reversible de la manera descrita anteriormente.

Después, la superficie se pone en contacto con la suspensión fecal para permitir que los huevos se unan y después se lava para retirar los contaminantes fecales. Después, la tira se pone en contacto con una solución que contiene reactivo de detección. El reactivo de detección puede ser, de nuevo, cualquier número de moléculas capaces de unirse a los huevos, incluyendo anticuerpos, lectinas o CBD, conjugadas con un indicador adecuado. Los indicadores deben ser capaces de generar una señal visible en la superficie e incluyen cromóforos, fluoróforos, enzimas, metales coloidales, puntos cuánticos o micropartículas coloreadas. En el caso de las enzimas, la superficie se lava y después se pone en contacto con un sustrato adecuado, cuyo producto debe ser insoluble con el fin de que se deposite sobre la superficie para su visualización. Dos ejemplos no limitantes de un sistema de este tipo son la enzima peroxidasa de rábano picante y los sustratos 4-cloro-1-naftol o 3,3'-diaminobencidina, o la enzima fosfatasa alcalina y los sustratos fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo y tetrazolio nitroazul.

T ras la deposición de color, que es proporcional al número de huevos capturados en el sustrato, El número de huevos se cuantifica por comparación visual con un diagrama de colores calibrado o mediante el uso de un dispositivo tal como un colorímetro o un densitómetro.

En otra realización de la invención, la detección enzimática de huevos inmovilizados se produce con sustratos cuyos productos coloreados solubles se liberan en la solución para producir un cambio de color que puede detectarse ópticamente.

En otros aspectos de la divulgación, y en el caso donde el reactivo de captura esta unido de forma reversible a la superficie, los huevos/reactivo de captura se liberan después de la unión y el lavado y después se detectan en la solución.

Los huevos pueden tratarse opcionalmente en cualquier etapa mediante los reactivos ya desvelados anteriormente para exponer los sitios o liberar las moléculas de detección necesarias para la captura o la detección.

En algunos aspectos de la divulgación, los métodos que se desvelan en el presente documento se adaptan a un formato de flujo lateral similar al utilizado en, por ejemplo, pruebas de embarazo caseras de consumo. Un extremo del dispositivo que contiene una cámara de muestra se coloca en la solución o se dispensan muestras de la solución en una cámara en el dispositivo. La cámara contiene un agente de detección tal como, pero sin limitación, un anticuerpo, lectina o CBD conjugado con un agente de detección tal como micropartículas coloreadas, puntos cuánticos o metales coloidales.

Tras la entrada en la cámara, la muestra (que incluye los huevos ahora unidos a reactivos de detección) se absorbe en una tira de sustrato sólido, tal como papel u otro polímero sinterizado, por medio de la acción capilar. Una porción de esta tira se recubre con un reactivo de captura similar a los descritos anteriormente, permitiendo la inmovilización de los huevos y el reactivo de detección coloreado asociado.

El desarrollo de color en la región de la tira recubierta con el reactivo de captura por la adherencia de complejos huevo/reactivo es diagnóstico del número de huevos presentes en las heces. El número puede determinarse visualmente por comparación con un diagrama de colores calibrado, o electrónicamente, mediante la obtención de imágenes del color con un dispositivo acoplado de carga o un dispositivo similar, seguido del procesamiento de señales adecuado.

Para maximizar la captura de huevos, idealmente el reactivo de captura es mucho más específico para huevos, mientras que el reactivo de detección puede ser menos discriminatorio, aunque lo contrario también puede ser cierto. Como en otras realizaciones descritas en otro lugar, el criterio principal para los reactivos de captura y detección es que la unión a ambos sea mutuamente excluyente para todos los componentes fecales excepto los huevos de parásitos o subconjuntos de huevos de parásitos.

Los huevos pueden tratarse opcionalmente en la suspensión fecal mediante reactivos ya desvelados anteriormente para exponer sitios o liberar moléculas necesarias para la captura o la detección.

En algunos aspectos de la divulgación, la tira contiene dos o más zonas recubiertas con agentes de captura que son cada uno específicos para diferentes grupos taxonómicos de especies. En este caso, se desarrollan numerosas áreas coloreadas que corresponden a la cantidad de diferentes tipos de huevos de parásitos.

En otro aspecto de la divulgación, la cámara de muestras contiene múltiples agentes de detección que reconocen cada uno huevos de diferentes especies o grupos taxonómicos. Después, se capturan huevos marcados en una única área y se determina la cantidad de cada tipo de huevo mediante la formación de imágenes del área y la reconstrucción informática de la contribución relativa de cada reactivo coloreado (y, por tanto, del tipo/número de huevos) al color final detectado.

Los reactivos de detección pueden mezclarse directamente con la suspensión fecal antes de su aplicación de o al dispositivo, y, por tanto, no se almacenan en la cámara de muestra del dispositivo.

Los huevos pueden tratarse opcionalmente en cualquier etapa mediante los reactivos ya desvelados anteriormente para exponer los sitios o liberar las moléculas necesarias para la captura o la detección.

En algunos aspectos de la divulgación, los métodos comprenden capturar huevos con un reactivo de captura adecuado que se inmoviliza a su vez sobre una superficie transparente usando los métodos descritos anteriormente. La superficie transparente puede adoptar la forma de cualquier recipiente, incluyendo, pero sin limitación, un tubo, cubeta, un plato o una placa que contenga uno o más pocillos.

Tras el lavado para retirar los residuos fecales, se añade reactivo de detección que está marcado de la manera o maneras descritas anteriormente. El color del reactivo de detección unido (o el color desarrollado por la actividad enzimática del reactivo de detección) se mide visualmente y se compara con un diagrama de colores calibrado o usando un dispositivo tal como un colorímetro, lector de microplacas, espectrofotómetro o fluorómetro.

En otro aspecto de la divulgación, no hay ningún reactivo de detección y la unión de los huevos se determina midiendo un cambio en el índice de refracción de la superficie transparente tras la unión de huevos, o mediante otros métodos ópticos tales como resonancia de plasmón superficial o refractometría.

En esta realización, cuyo ejemplo se representa en la Figura 2 con fines ilustrativos, los huevos se capturan y se separan de las levaduras y los hongos usando un método físico, en concreto, la filtración. Los huevos se homogeneizan en un vaso adecuado y después se hacen pasar a través de una primera membrana de filtración que tiene un tamaño de poro que facilita el paso de los huevos (por ejemplo, entre aproximadamente 85 micrómetros y aproximadamente 350 micrómetros). El tamaño de poro también puede seleccionarse para retirar los residuos fecales más grandes y, de este modo, ayudar a aclarar la muestra y, por tanto, reducir la posibilidad de que se obstruyan los filtros en etapas posteriores del método.

Después, el filtrado se coloca en un segundo vaso y se hace pasar a través de una segunda membrana de filtración cuyo tamaño de poro es lo suficientemente pequeño para retener huevos de helmintos (por ejemplo, entre aproximadamente 20 micrómetros y aproximadamente 45 micrómetros), pero que permite el paso y la retirada de partículas más pequeñas, incluyendo células de levadura y hongos.

En otra realización de la invención, la muestra se hace pasar a través de múltiples filtros o por una reducción secuencial del tamaño de poro con el fin de retirar gradualmente las partículas más grandes y retener los huevos antes de alcanzar el filtro final que retiene los huevos.

Los huevos capturados en la segunda membrana de filtración se tratan con una solución decolorante antes de añadir un reactivo de fijación/detección de huevos para que se una a los mismos. El reactivo de unión es una proteína de unión a GlcNac (por ejemplo, un anticuerpo, una lectina o CBD. El reactivo de detección puede comprender, pero sin limitación, una enzima, un fluoróforos, nanoesferas coloreadas o puntos cuánticos. El reactivo de unión directamente puede acoplarse químicamente al reactivo de captura para formar una entidad molecular única (por ejemplo, el acoplamiento químico de un anticuerpo específico contra huevos o CDB a una enzima tal como peroxidasa de rábano picante, usando químicas de entrecruzamiento de proteínas bien conocidas en la técnica) o puede asociarse mediante interacciones no covalentes (por ejemplo, electrostáticas o hidrófobas). En una realización de la invención, el reactivo de unión incluye un marcador His6 y el reactivo de detección contiene un metal unido tal como níquel, cobre o cobalto para facilitar la interacción. Si los reactivos de unión y detección no se unen covalentemente, entonces se premezclan para facilitar su interacción antes de la adición a la muestra de huevos, o pueden añadirse por separado para permitir que su interacción se produzca en presencia de los huevos.

En el caso de los agentes de detección enzimática, la enzima puede producirse opcionalmente como una fusión genética tanto del reactivo de unión como de la enzima para formar una entidad molecular única. Un ejemplo no limitante sería la fusión de CBD con un gen de fosfatasa alcalina para producir una proteína de fusión CBD-AP que podría unirse a huevos y podría usarse para detectarlos. En estos casos pueden prepararse construcciones que codifiquen múltiples dominios de unión (incluyendo repeticiones del mismo dominio o múltiples dominios diferentes) y múltiples dominios enzimáticos (incluyendo repeticiones del mismo dominio o múltiples dominios diferentes), con el fin de modular las afinidades de unión y las sensibilidades de detección del reactivo.

Tras la incubación con reactivo de detección, la muestra puede filtrarse de nuevo con el fin de retirar el reactivo no unido reteniendo al mismo tiempo los huevos y puede lavarse opcionalmente para garantizar la retirada completa del reactivo no unido.

El número de huevos después puede cuantificarse in situ o después de la retirada de la mezcla huevo/reactivo del recipiente. En el caso de los cromóforos, los fluoróforos y otros agentes de detección que directamente pueden cuantificarse ópticamente, en primer lugar pueden eluirse de las perlas usando, a modo de ejemplo no limitante, ácidos, álcalis, agentes caótropos, tensioactivos o sales antes de la detección. Después de dicha liberación, los reactivos pueden separarse opcionalmente de los huevos por filtración antes de la detección.

En el caso de los sistemas de detección enzimática, los productos de reacción coloreados que indican el número de huevos presentes pueden ser solubles o insolubles. En el caso de los productos solubles, su intensidad óptica también puede determinarse in situ en el recipiente o después de la retirada del contenedor, o después de la filtración para retirar huevos y cualquier partícula fecal restante. Los productos insolubles pueden detectarse de forma similar midiendo la turbidez de la suspensión o pueden filtrarse adicionalmente a través de una membrana cuyo tamaño de poro sea lo suficientemente pequeño para retener los productos, seguido de la detección óptica en la superficie del filtro.

Ejemplos

La invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Los principios generales esbozados anteriormente pueden usarse para diseñar un gran número de sistemas para detectar la presencia y abundancia de huevos de parásitos y ooquistes de protozoos en suspensiones fecales o muestras ambientales. Con fines ilustrativos a continuación se presenta una serie de ejemplos no limitantes de varios ensayos de recuento de huevos que pueden realizarse usando estos principios. Estos ejemplos se proporcionan meramente con el fin de ilustrar algunos de los muchos modos diferentes en los que la invención puede ponerse en práctica y no deben considerarse descriptivos de la totalidad de la invención.

Ejemplo 1

En el presente ejemplo se investigó si los filtros Pluriselect que tenían un tamaño de poro de 90 micrómetros y 27 micrómetros (Pluriselect PluriStrainer® Cell Strainer) eran adecuados para a) retirar por filtración los residuos fecales no deseados y b) capturar y posiblemente concentrar huevos de estróngilo.

En primer lugar se estimaron los recuentos de huevos en heces para una muestra fecal equina usando el método McMaster. Se suspendieron cinco gramos de heces en 45 ml de medio de flotación (glucosa al 37,5 %/cloruro de sodio 25 %). Las suspensiones se mezclaron en los recipientes Fill Flotac con tamices incorporados (de aproximadamente 0,5 mm de tamaño de malla). Se llenaron dos cámaras de recuento (que equivalen a 1,0 ml de suspensión examinada). Esto proporciona un factor de multiplicación de 10 huevos por gramo (HPG).

Después, se filtraron 10 ml de suspensión de medio de flotación a través de un primer filtro con un tamaño de poro de 90 micrómetros. Se llenó una cámara de recuento McMaster (0,5 ml) con filtrado y se examinó para determinar la presencia de huevos. Esto representa un factor de multiplicación de aproximadamente 20 HPG.

Después, la muestra de flujo se hizo pasar a través de un segundo filtro que tenía un tamaño de poro de 27 micrómetros. De nuevo, se examinaron 0,5 ml en la cámara McMaster (factor de multiplicación de aproximadamente 20 HPG). El material recogido en el filtro de 27 micrómetros se resuspendió en 1 ml de medio de flotación y se cargó en una cámara McMaster (0,5 ml) y se contó. El factor de multiplicación en este caso será de aproximadamente 2 HPG, si el filtrado se resuspende en exactamente 0,5 ml.

Tabla 1

Ejemplo 2

Se suspendieron cinco gramos de heces en 45 ml de medio de flotación para formar una solución fecal. Las suspensiones se mezclaron en los recipientes Fill Flotac con tamices incorporados (de aproximadamente 0,5 mm de tamaño de malla). Se filtraron 10 ml de solución fecal a través de un primer filtro con un tamaño de poro de 90 micrómetros (Pluriselect PluriStrainer® Cell Strainer). Después, la muestra de flujo se hizo pasar a través de un segundo filtro que tenía un tamaño de poro de 27 micrómetros (Pluriselect PluriStrainer® Cell Strainer) para su captura en el filtro de 27 micrómetros. El material se decoloró (solución de hipoclorito al 1 %) en la superficie del filtro de 27 p y después se recuperó. Se capturaron imágenes para muestras sin decolorar y de muestras decoloradas durante 4, 6 y 8 minutos. Las Figuras 3A a 3D son fotografías que muestran muestras antes y después de la decoloración (panel A = sin decolorar; panel B = muestra después de la decoloración durante 4 minutos; panel C = muestra después de la decoloración durante 6 minutos; y panel D = muestra después de la decoloración durante 8 minutos). En el primer panel (panel A) los huevos normales sin decolorar aparecen como objetos ovalados oscuros. En los últimos paneles (paneles B-D) los huevos decolorados aparecen translúcidos. El otro efecto drástico e inesperado es la reducción drástica de residuos, presumiblemente debido a la oxidación de celulosa, lo que facilita adicionalmente las mediciones ópticas.

Ejemplo 3

Se suspendieron cinco gramos de heces en 45 ml de medio de flotación para formar una solución fecal. Las suspensiones se mezclaron en los recipientes Fill Flotac con tamices incorporados (de aproximadamente 0,5 mm de tamaño de malla). Se filtraron 10 ml de solución fecal a través de un primer filtro con un tamaño de poro de 90 micrómetros (Pluriselect PluriStrainer® Cell Strainer). Después, la muestra de flujo se hizo pasar a través de un segundo filtro que tenía un tamaño de poro de 27 micrómetros (Pluriselect PluriStrainer® Cell Strainer) para su captura en el filtro de 27 micrómetros. El material se decoloró (solución de hipoclorito al 1 %) en la superficie del filtro de 27 p durante 5 minutos. Después, los huevos decolorados se pusieron en contacto con una solución de reactivo que contenía aglutinina de germen de trigo - FITC (5 mg/ml, Vector Labs) a diferentes diluciones en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía un agente de bloqueo (Carboblock, Vector labs) (Figura 4). El tiempo de incubación de WGA fue de 15 minutos. La suspensión de huevos se colocó bajo un cubreobjetos y se examinó mediante microscopía de fluorescencia.

Ejemplo 4

Se produjo CBD clonando seis restos de histidina en el plásmido pTXB 1 (New England Biolabs). Esto produjo una proteína de fusión que consistía en un marcador de His N-terminal seguido de la inteína endopeptidasa y después el CBD de Bacillus ciruclans en el extremo C. La proteína se expresó citoplasmáticamente en E. co liy se purificó en una columna de quelato de níquel. Después, el CBD se marcó usando NHS-Fluoresceína (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (usando PBS como tampón de conjugación durante 60 minutos a temperatura ambiente). Después de la desalación, esto produjo una solución de CBD 6,7 mg/ml con entre 1,5 y 2 moléculas de fluoresceína por CBD. Las muestras de heces se procesaron mediante filtración, se decoloraron y se tiñeron con una dilución 1: 100 de CBD fluorescente y después se obtuvieron imágenes en un microscopio usando el modo de contraste de fases (Figuras 5A-E) o de fluorescencia (Figuras 5F-J). Se muestran muestras que contenían estróngilos de un caballo adulto (A,F), ascaridos de un potro (B,G) y tricoestróngilos de una cabra (C, H), un tricoestróngilo y un huevo de Trichuris de una vaca (D, I) y huevos de Toxocara de un gato (E, J). Esto demuestra que el CBD de B. circulans se une a huevos de varias clases importantes de parásitos a través de numerosas especies diversas. La Figura 6 muestra un montaje de diversos estróngilos, un huevo de Trichuris y ooquistes de Coccidia de la muestra bovina que se muestra en la Figura 5 (D e I). El hecho de que se tiñeran huevos de géneros tan dispares demuestra que la quitina sirve como marcador genérico de múltiples huevos de parásitos helmintos y ooquistes de protozoos. Asimismo, el hecho de que estos huevos y ooquistes estén claramente teñidos a pesar de la gran cantidad de residuos fecales extraños presentes en las heces demuestra que, a pesar de su reacción cruzada con la celulosa publicada anteriormente, el CBD es claramente capaz de discriminar entre estos componentes fecales.

Ejemplo 5

Se hizo pasar una suspensión fecal equina a través de un filtro de 90 micrómetros (Pluriselect PluriStrainer® Cell Strainer) y después se atrapó en un filtro de 27 micrómetros (Pluriselect PluriStrainer® Cell Strainer) y se decoloró con hipoclorito al 1 % durante 2 minutos. Después de lavar con PBS, los huevos en el filtro se pusieron en contacto con una dilución 1:1000 de conjugado WGA-biotina 5 mg/ml (Vector Labs) en Carboblock/PBS durante 15 minutos. Los huevos se lavaron de nuevo con PBS y después se pusieron en contacto con una dilución 1:500 de conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina 5 mg/ml (Vector Labs) en Carboblock/PBS durante 15 minutos. Después de un lavado final con PBS, los huevos se pusieron en contacto con una solución de p-nitrofenol fosfasa 5 mM en bicarbonato de sodio 100 mM pH 10. Después de 7 minutos a temperatura ambiente, las muestras se fotografiaron y se midieron con un espectrofotómetro.

En este caso, los inventores discriminaron entre heces equinas positivas para huevos (800 huevos/gramo) y heces negativas para huevos (Figura 7). La cantidad de WGA-AP parecía saturada a las dos concentraciones sometidas a ensayo, lo que sugiere que la relación señal-ruido podría mejorarse adicionalmente reduciendo su concentración.

Ejemplo 6

Las Figuras 8A y 8B muestran una composición de 20 imágenes de una rejilla McMaster de huevos flotados, teñidos con CBD de heces de caballo tomadas a 40x en un microscopio de epifluorescencia. Los huevos se trataron y se tiñeron con CBD como se describe en el Ejemplo 4. El examen de la muestra demuestra la presencia de un pequeño número de esporas fúngicas (Fig. 7B, punta de flecha en el recuadro) que no se habían retirado por filtración. Después de un sencillo procesamiento digital de la imagen de fluorescencia para retirar el fondo (niveles y filtrado umbral), los inventores fueron capaces de cuantificar el número de huevos usando la función de análisis de partículas del software gratuito de código abierto, Imagen J, disponible en los Institutos Nacionales de Salud de los EE.EE. Este software permite al usuario analizar las partículas tanto por su tamaño como por su forma, proporcionando de este modo un método informático para discriminar entre huevos y esporas (que son más pequeñas y redondas). El recuento a ojo condujo a un recuento de 104 huevos y 19 esporas, mientras que el software Image J detectó 107 huevos y 16 esporas. Para simular una imagen que sería producida por una cámara de consumo o un teléfono móvil, la imagen se redujo de 4800 x 4800 píxeles a 1350 x 1350, lo que equivale a llenar la dimensión más corta de un sensor de 8 megapíxeles con toda la cámara McMaster (no solo la rejilla de la imagen). En este caso, el software Image J contó 103 huevos y 20 esporas. Estos datos sugieren, por tanto, que, en principio, es posible acoplar el marcador a base de quitina a este tipo de metodología de formación de imágenes para contar con precisión huevos dentro de una muestra fecal.

Los inventores han demostrado adicionalmente que dichas imágenes pueden capturarse tanto con una cámara de consumo (Olympus E-PM2 equipada con un objetivo macro) como con un teléfono móvil (Apple iPhone 5s) equipado de un objetivo macro (Olliclip7x) (Figuras 9A-D). Estas imágenes se capturaron con un sencillo sistema de formación de imágenes de fluorescencia de gel electroforético (PrepOne Sapphire, EmbiTec) que usa LED azules para la iluminación y una placa Perspex de color naranja de bajo coste como filtro de emisión. Estos datos demuestran que es posible la construcción de un sistema de formación de imágenes de bajo coste para la visualización de huevos teñidos con fluorescencia.

Ejemplo 7

Los inventores han utilizado los sistemas de formación de imágenes mencionados anteriormente para demostrar que los recuentos automatizados de huevos están directamente correlacionados con los recuentos obtenidos mediante la metodología McMasters convencional. Se cuantificaron tres muestras fecales equinas mediante el método McMasters o mediante el método descrito en el Ejemplo 6 (n=4) y se tomaron imágenes tanto con la Olympus E-PM2 como con el iPhone 5s. La representación del recuento McMasters frente al recuento automatizado demostró que ambas cámaras funcionaban igualmente bien (Figura 10) y que los recuentos automatizados eran proporcionales al recuento tradicional de huevos. Asimismo, a pesar del hecho de que el 50 % de los huevos introducidos en el ensayo automatizado se perdieron durante el procesamiento (pendiente ~0,5), el hecho de que se analizaran diez veces más heces significa que el ensayo automatizado sigue siendo 5 veces más sensible que un recuento McMasters. Asimismo, en la mayoría de los casos, la variabilidad del método automatizado, evaluada mediante la desviación típica, fue superior a la de McMasters (Figura 11).

En algunos aspectos, los métodos que se proporcionan en el presente documento pueden implementarse usando un aparato de ensayos portátil combinado con una cámara digital o un teléfono inteligente. En las Figuras 12 - 15 se muestra un ejemplo no limitante de un aparato de ensayo 100. El aparato de ensayo 100 incluye un soporte 110 que incluye una superficie superior 120 con un soporte de cámara 122. El soporte 110 soporta una placa 134 de circuito de ensayos con una fuente de luz 132, una cámara de cámara 130 que incluye una montura de objetivo con filtro de emisión integrado 140 y una bandeja de ensayos 150 con una cámara de detección para sostener la muestra. Los elementos del aparato de ensayo 100 se disponen de manera que una cámara colocada en el soporte de cámara 122 puede acceder ópticamente a una muestra colocada en la bandeja de ensayos 150 a través de la cámara de cámara 130 y se ilumina por la fuente de luz 132 para la captura de imágenes, como se ha descrito anteriormente.

Como se muestra en la Figura 12, los diversos elementos del aparato de ensayo 100 son fijables al soporte 110. El soporte 110 tiene una superficie superior generalmente plana y cuatro patas de apoyo 112. Las patas de apoyo 112 elevan la superficie superior de una mesa, banco u otra superficie de trabajo. Las patas de apoyo 112 están separadas por recortes 114 que reducen el peso del soporte 110 y permiten a un usuario manipular las porciones del aparato de ensayo 100 (por ejemplo, la bandeja de ensayos 150 como se muestra en las Figuras 14 y 15) ubicado debajo de la superficie superior 120.

La superficie superior 120 tiene una gran hendidura rectangular o un orificio ciego situado generalmente en el centro de la superficie superior 120, el soporte de cámara 122. El soporte de cámara 122 se configura para retener y alinear una cámara portátil, tal como una cámara digital o un teléfono inteligente con capacidad de cámara, con el aparato de ensayo 100. El soporte de cámara 122 tiene un puerto de acceso óptico 124 que permite que la cámara del teléfono inteligente detecte la radiación a través de la superficie superior 120 y desde la bandeja de ensayos 150 debajo de la superficie superior 120 (como se muestra en las Figuras 14 y 15). Un usuario coloca el teléfono inteligente en el soporte de cámara 122 usando un acceso de agarre 126 ubicado en un extremo de la superficie superior 120.

Con referencia a la Figura 13, una vista inferior del aparato de ensayo 100 muestra la cámara de cámara 130 fijada al soporte 100. En la vista inferior de la Figura 13, la cámara de cámara 130 parece rodear la montura de objetivo 140, las fuentes de luz 132 y una porción de un circuito de ensayos 134. Fijado a la superficie inferior del soporte 100 hay una cubierta 128 de circuito. Como puede observarse mejor en la Figura 15, la cubierta 128 de circuito cubre la placa 134 de circuito de ensayos que está situada adyacente a la superficie inferior del soporte 110. La cubierta 128 de circuito mantiene la placa 134 de circuito de ensayos en su lugar y alineada ópticamente con el teléfono inteligente encima y la bandeja de ensayos 150 debajo de la placa 134 de circuito de ensayos. La cubierta del circuito está montada en la superficie inferior del soporte 110 a través de unos salientes de tornillo, que alinean la cubierta (no se muestran).

Las fuentes de luz 132 están ubicadas en la placa 134 de circuito de ensayos o sobre la misma. Como se ha descrito anteriormente, las fuentes de luz 132 pueden ser LED azules. Los LED 132 se disponen en una superficie inferior de la placa 134 de circuito de ensayos, de manera que los LED iluminan la cámara 130 y la muestra en la bandeja de ensayos 150 que se encuentra debajo. En la Figura 12 se muestran cuatro LED 132; sin embargo, pueden usarse más o menos LED. Por ejemplo, puede disponerse uno, dos o tres LED para rodear la montura de objetivo y el filtro de emisión integrado 140 o pueden usarse cinco o más LED.

Como se muestra en la Figura 14, una bandeja de ensayos 150 está fijada a la parte inferior y la bandeja de ensayos 150 está roscada de manera que una bandeja de ensayos 150 que contenga una nueva muestra pueda atornillarse rápida y fácilmente en su posición en el aparato de ensayo 100. También se contempla que la cámara de cámara 130 y la bandeja de ensayos 150 puedan acoplarse mecánicamente entre sí a través de un empalme a presión, un mecanismo de liberación rápida, acoplamiento magnético o cualquier otro medio adecuado conocido en la técnica que sea capaz de acoplar la cámara de cámara 130 con la bandeja de ensayos 150. La bandeja de ensayos 150 puede incluir uno o más filtros para separar y fijar los huevos en la muestra, como se ha descrito anteriormente. Los huevos presentes en la muestra pueden estar unidos a uno de los filtros dentro de la bandeja de ensayos 150 y ser accesibles ópticamente para las fuentes de luz 134 y a la cámara de cámara 130.

En la Figura 15 se muestra el aparato de ensayo 100 totalmente ensamblado. Aunque no se muestra, una cámara digital situada en el soporte de cámara 122 tendrá un acceso óptico sin obstáculos a través del aparato de ensayo 100 a través del objetivo y la montura de objetivo 140 fijados al puerto de acceso óptico 124 de la superficie superior 120. Las fuentes de luz 132 (que no se muestran en la Figura 15) sobre la superficie inferior de la placa 134 de circuito de ensayos iluminan la muestra que descansa debajo en la bandeja de ensayos 150 y permiten la obtención de datos tal como se ha descrito anteriormente.

En algunas implementaciones, el soporte 110 es preferentemente de material ligero, por ejemplo, plástico moldeado o extruido, o metal ligero tal como aluminio. Aunque la implementación que se muestra en las Figuras 12-14 incluye cuatro patas 112 y cuatro recortes 114, son posibles más o menos patas y recortes. Por ejemplo, el soporte 110 puede incluir dos amplias patas de apoyo en cada extremo de la superficie superior 120, separadas por un recorte en cada lado de la superficie superior 120. Como alternativa, el soporte 110 puede carecer de patas y, en su lugar, ser un único soporte sólido elevado alrededor del perímetro de la superficie superior 120 y no contener recortes. También son posibles otras implementaciones.

La cámara de cámara 130 está roscada para permitir una fijación fácil a una bandeja de ensayos 150. En algunas implementaciones, puede proporcionarse una tapa de la cámara, que se atornilla a la cámara de cámara 130 y protege el objetivo y la montura de objetivo con el filtro de emisión integrado 140 y la placa 134 de circuito de ensayos cuando una muestra y la bandeja de ensayos 150 no están en su sitio.

En algunas implementaciones, la placa 134 de circuito de ensayos también puede soportar una fuente de alimentación para las fuentes de luz 132, por ejemplo, una batería o baterías.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar la presencia o ausencia de huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en una muestra ambiental, comprendiendo el método:

2. El método de la reivindicación 1, en donde el dominio de unión a N-acetil-D-glucosamina se selecciona entre el grupo que consiste en una lectina, una quitinasa y un dominio de unión a quitina (CBD).

3. El método de la reivindicación 2, en donde la lectina se selecciona entre el grupo que consiste en aglutinina de germen de trigo (WGA), lectina de Madura pomífera (MPL), lectina de Bauhinia purpurea (BPL), lectina de Datura stramonium (DSL), lectina de Lycopersicon esculentum (LEL), lectina de Solanum tuberosum (STL) y Psophocarpus tetragonolobus-II (PTL-II).

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el resto detectable se selecciona entre el grupo que consiste en un hapteno, una enzima, un epítopo de anticuerpo, un antígeno, un fluoróforo, un radioisótopo, una nanopartícula, un miembro de un par de unión y un quelato de metal.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el fluoróforo se selecciona entre el grupo que consiste en proteína verde fluorescente, proteína azul fluorescente, proteína roja fluorescente, fluoresceína, 5-isotiocianato de fluoresceína (FITC), colorante de cianina Cy3, colorante de cianina Cy3.5, colorante de cianina Cy5, colorante de cianina Cy5.5, colorante de cianina Cy7, dansilo, Cloruro de Dansilo (DNS-C1), 5-(yodoacetamida)fluoresceína (5-IAF), 6 -acriloil-2-dimetilaminonaftaleno (acrylodan), cloruro de 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-4-ilo (NBD-CI), bromuro de etidio, Amarillo Lucifer, clorhidrato de 5-carboxirrodamina 6G, lisamina-rodamina B cloruro de sulfonilo, rodamina-B-isotiocianato (RITC), rodamina 800, 5-(y 6-)isotiocianato de tetrametilrrodamina (TRITC), cloruro de sulfonilo, ácido 1-anilinonaftaleno-8-sulfónico (ANS), ácido 6-(p-toluidinil)naftaleno-e-2-sulfónico (TNS), antroil-ácido graso, 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH), Ácido parinárico, 1 -(4-trimetilamoniofenil)-6-Fenil-1,3,6-hexatrieno (TMA-DPH), fluorenil-ácido graso, Fluoresceína-fosfatidiletanolamina, Rojo Texas-fosfatidiletanolamina, Pirenil-fosfatidilcolina, Fluorenilfosfatidilcolina, Merocianina 540, Naftil Estirilo, 3,3'-dipropiltiadicarbocianina (diS-C3-(5)), 4-(p-dipentil aminoestiril)-lmetilpiridinio (di-5-ASP), Cy-3 Acetamida de yodo, Cy-5-N-hidroxisuccinimida, Cy-7-Isotiocianato, IR-125, Naranja tiazol, Azure B, Azul Nilo, Ftalocianina de Al, Oxaxina 1,4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Hoechst 33342, TOTO, Naranja de acridina, Homodímero de etidio, N(etoxicarbonilmetil)-6-metoxiquinolinio (MQAE), Fura-2, Verde calcio, Carboxi seminaftarrodafluoresceína-6 (SNARF-6), Ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético (BAPTA), cumarina, fitoflúors, Coroneno y complejos metal-ligando.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 a 5, en donde el dominio de unión a N-acetil-D-glucosamina es aglutinina de germen de trigo y el resto detectable es isotiocianato de fluoresceína (FITC).

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde la muestra ambiental es una muestra fecal.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde obtener una solución comprende suspender una muestra ambiental en un tampón de muestra para formar una primera solución ambiental; y

hacer fluir la primera solución ambiental a través de una membrana de filtración en volumen que tiene un tamaño de poro de entre 400 micrómetros y 800 micrómetros, entre 425 micrómetros y 750 micrómetros, entre 450 micrómetros y aproximadamente 700 micrómetros, entre 500 micrómetros y 650 micrómetros o entre 550 micrómetros y 600 micrómetros para proporcionar la solución.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo además la enumeración de los huevos de helmintos u ooquistes de protozoos en la muestra ambiental.