KR20160140723A

KR20160140723A - 다중특이적 항체 경쇄 잘못짝짓기의 검출 방법

Info

Publication number: KR20160140723A
Application number: KR1020167028373A
Authority: KR
Inventors: 미사엘 몰호; 막시밀리아네 쾨니히; 뱅상 랄레르; 카트야 몬탄; 비앙카 그륀발더
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2015-04-01
Publication date: 2016-12-07
Also published as: JP2017509669A; US20170115304A1; KR102376287B1; US11486882B2; SG11201608054YA; US20200103413A1; SG10202107077QA; EP3126389A1; CN113092788A; WO2015150446A1; JP6666262B2; CN106164288A

Abstract

다중특이적 항체의 경쇄 짝짓기의 분석을 위한 다중특이적 항체의 단백질 가수분해 효소를 이용한 제한된 소화의 용도.

Description

다중특이적 항체 경쇄 잘못짝짓기의 검출 방법 {METHOD FOR DETECTING MULTISPECIFIC ANTIBODY LIGHT CHAIN MISPAIRING}

제한된 단백질 가수분해 소화 (digestion) 및 ESI-MS 분석을 기반으로 하는, 다중특이적 (multispecific) 항체 제조물에서 경쇄 잘못짝짓기 (mispairing) 의 측정 방법이 본원에 보고되어 있다. 이 방법은 세포주 선택 또는 품질 제어를 위해 사용될 수 있다.

1995 년에, Yamaguchi et al. (J. Immunol. Meth. 181 (1995) 259-267) 는 리실 엔도펩티다아제, 클로스트리파인, 메탈로엔도펩티다아제 및 V8 프로테아제를 이용하는 고특이성 마우스 면역글로불린 G 로의 단백질 가수분해 분쇄 방법을 보고하였으나, 여기서 반응 조건 하에 조사된 클로스트리파인, 리실 엔도펩티다아제, 메탈로엔도펩티다아제 및 V8 프로테아제는 힌지 영역 내에서 선택적으로 IgG1 및 IgG1-CM 을 절단하지 못했다.

Matsuda et al. (FEBS Lett. 473 (2000) 349-357) 은, 면역글로불린 G 의 Fc 영역에서 올리고당의 짝짓기를 측정하기 위해 MS 로써 Fc-연합된 글리코형태의 정보를 수득하도록 Lys-C 를 이용하는 Fc 단편의 제조 방법을 보고했다.

Villanueva et al. (J. Mass Spectrom. 37 (2002) 974-984) 은 양쪽 말단, 즉 N- 및 C-말단으로부터 단백질의 제 2 구조 요소를 신속하게 맵핑하기 위해 매트릭스-보조된 레이져 탈착/이온화 비행시간 질량 분석기 (MALDI-TOF MS) 와 커플링된 비특이적 엑소프로테아제를 사용하는 것을 바탕으로 하는 제한된 단백질 가수분해 방법을 보고했다.

WO　2005/073732 에서, 고분자량 단백질의 분석 방법, 구체적으로는 항체를 비롯한 고분자량 단백질의 역상 LC/MS 분석 방법이 보고되어 있다.

WO　2006/047340 는 환원/산화제 및 무질서유발제 (chaotropic agent) 로 폴리펩티드의 컬럼 단리된 제조물을 적용하고, 상기 접촉으로부터 생성된 재폴딩된 (refolded) 활성 단백질을 단리하는 것과 관련된다. 활성 단백질은 Fc 도메인 함유 폴리펩티드 또는 단편을 포함한 고분자량 단백질일 수 있다.

Kleemann et al. (Anal. Chem. 80 (2008) 2001-2009) 는 LC-MS 와 연관된 제한된 단백질 가수분해에 의한 펩티드-Fc 융합 단백질 및 IgG1 면역글로불린의 특성화를 보고했다. 엔도프로테이나아제 Lys-C 를 이용하여 제한된 단백질 가수분해를 적용해, 이 리신 잔기의 C-말단에서 우세한 절단을 도모하였다.

본 발명의 개요

완전한 다중특이적 항체 내 경쇄 잘못짝짓기의 측정은 동중 질량 간섭에 의해 방해받기 때문에, 다중특이적 항체에 있어서 경쇄 잘못짝짓기의 측정을 위해서는 (다중특이적) 항체의 제한된 단백질 가수분해를 MS 분석 이전에 행해야 한다는 점을 발견하였다.

따라서, 본원에 보고된 바와 같은 한 측면은 다중특이적 항체의 경쇄 짝짓기의 분석을 위한 다중특이적 항체의 단백질 가수분해 효소로 제한된 소화의 용도이다.

본원에 보고된 바와 같은 한 측면은 다중특이적 항체에서 경쇄 잘못짝짓기의 측정을 위한 다중특이적 항체의 단백질 가수분해 효소를 이용한 제한된 소화의 용도이다.

본원에 보고된 바와 같은 한 측면은 다중특이적 항체 생성 포유류 세포의 선택을 위한, 재조합 포유류 세포에 의해 생성된 다중특이적 항체의 단백질 가수분해 효소를 이용하는 제한된 소화의 용도이다.

모든 이전의 측면들의 한 구현예에서, 분석/측정/선택은 소화된 항체의 질량 분석법 (mass spectrometry) 의 결과를 이용하는 것에 의한 것이다.

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은, 하기의 단계를 포함하는 다중특이적 항체에서 경쇄 짝짓기의 측정 방법이다:

a) 제한된 시간 동안 단백질 가수분해 효소와 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을 인큐베이션하는 단계,

b) 단계 a) 에서 제한된 단백질 가수분해 소화에 의해 수득된 단편들의 질량을 질량 분석법으로써 동정하는 단계, 및

c) 단계 b) 에서의 결과로부터 다중특이적 항체의 경쇄 짝짓기를 측정하는 단계.

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은 하기의 단계를 포함하는 다중특이적 항체의 경쇄 잘못짝짓기의 측정 방법이다:

b) 단계 a) 에서 제한된 단백질 가수분해 소화에 의해 수득된 단편들의 질량을 질량 분석법에 의해 동정하는 단계, 및

c) 단계 b) 에서의 결과로부터 다중특이적 항체의 경쇄 짝짓기를 측정하고, 이로써 경쇄 잘못짝짓기를 측정하는 단계.

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은 하기의 단계를 포함하는 다중특이적 항체 생성 재조합 포유류 세포의 선택 방법이다:

a) 제한된 시간 동안 단백질 가수분해 효소와 다수의 재조합 포유류 세포들 중 재조합 포유류 세포의 클론 집단 (clonal population) 에 의해 생성된 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을 개별적으로 인큐베이션하는 단계 (이때, 상기 다수의 모든 세포는 동일한 다중특이적 항체를 생성함),

b) 단계 a) 에서 제한된 단백질 가수분해 소화에 의해 수득된 단편들의 질량을 질량 분석법에 의해 동정하는 단계,

c) 단계 b) 에서의 결과로부터 각 클론 세포 집단에 있어서 다중특이적 항체의 경쇄 잘못짝짓기의 존재를 측정하는 단계, 및

d) 단계 c) 에서의 결과를 바탕으로 다중특이적 항체를 생성하는 재조합 세포를 선택하는 단계.

모든 측면의 한 구현예에서, 단백질 가수분해 효소는 Lys-C, 플라스민 (plasmin), Asp-N, Arg-C, Glu-C, Ides, 펩신 (pepsin) 및 키모트립신 (chymotrypsin) 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 구현예에서, 다중특이적 항체는 2가 항체이다.

모든 측면의 하나의 바람직한 구현예에서, 단백질 가수분해 효소는 Lys-C 또는 플라스민이다.

한 구현예에서, 다중특이적 항체는 3- 또는 4-가 항체이다. 한 구현예에서, 다중특이적 항체는 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄를 포함하는 전장의 항체로서, 이때 중쇄의 C-말단에 모이어티 부재, Fv 단편, Fab 단편, scFv 단편 및 scFab 단편으로 이루어진 군으로부터 서로 독립적으로 선택된 모이어티가 직접 또는 펩티드 링커를 통해 컨쥬게이션된다.

상기 항체는 결합부가 또한 중쇄의 C-말단에 부착되어 있는 4가 항체인 경우, 2 개의 단백질 가수분해 효소로의 이중 (double) 소화가 요구될 수 있다.

한 구현예에서, 다중특이적 항체는 3가 또는 4가 다중특이적 항체이고, 방법은 2 개의 단백질 가수분해 효소의 혼합물로의 인큐베이션에 의한 이중 소화를 포함한다.

한 구현예에서, 단백질 가수분해 효소의 혼합물은 플라스민과 Ides 이다. 한 구현예에서, 단백질 가수분해 효소의 혼합물은 Lys-C 과 Ides 이다.

효과기 (effector) 침묵 항체 (L234A, L235A 돌연변이) 의 경우, Ides 는 절단하지 않고, 펩신이 선택되어야 한다.

한 구현예에서, 단백질 가수분해 효소의 혼합물은 플라스민과 펩신이다. 한 구현예에서, 단백질 가수분해 효소의 혼합물은 Lys-C 와 펩신이다.

한 바람직한 구현예에서, 다가 항체는 이중특이적 (bispecific) 항체이다.

모든 측면의 한 구현예에서, 인큐베이션은 60 분 이하 동안이다. 모든 측면의 한 구현예에서, 인큐베이션은 20 내지 60 분 동안이다. 모든 측면의 한 구현예에서, 인큐베이션은 35 내지 45 분 동안이다.

모든 측면의 한 바람직한 구현예에서, 인큐베이션은 약 40 분 동안이다.

모든 측면의 한 구현예에서, 단백질 가수분해 효소와 인큐베이션된 다중특이적 항체는 탈글리코실화 다중특이적 항체이다.

모든 측면의 한 구현예에서, 항체 대 효소의 중량비는 1:150 내지 1: 500 이다. 모든 측면의 한 구현예에서, 항체 대 효소의 중량비는 1:200 내지 1:400 이다. 모든 측면의 한 구현예에서, 항체 대 효소의 중량비는 약 1:200 이다.

모든 측면의 한 구현예에서, 단백질 가수분해 효소와 인큐베이션된 다중특이적 항체는 200 내지 600 ㎍/mL 의 농도를 가진다.

모든 측면의 한 구현예에서, 단계 b) 는 하기이다:

b) 단계 b) 의 인큐베이션 혼합물을 탈염하고, 단계 a) 에서 제한된 단백질 가수분해 소화에 의해 수득된 단편들의 질량을 질량 분석법에 의해 동정하는 단계.

모든 측면의 한 구현예에서, 다중특이적 항체는 모노클로날 다중특이적 항체이다.

모든 측면의 한 구현예에서, 다중특이적 항체는 2 개 이상의 비(非)펩티드성 연합된 경쇄를 포함한다.

모든 측면의 한 구현예에서, 다중특이적 항체는 3 개 이상의 비펩티드성 (non-peptidically) 연합 폴리펩티드를 포함한다.

모든 측면의 한 구현예에서, 질량 분석법은 온라인 측정이다.

모든 측면의 한 구현예에서, 질량 분석법은 오프라인 측정이다. 한 구현예에서, 오프라인 질량 분석법은 탈염 단계 후 행해진다.

본 발명의 상세한 설명

정의

본원 및 첨부된 청구항에서 이용되는 바와 같이, 단수형 "하나 (a)", "한 (an)" 및 "그 (the)" 는 달리 분명하게 지시되지 않는 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포 (a cell)" 에 대한 지칭은 그러한 복수의 세포 및 당업자에게 공지되어 있는 동등물 등을 포함한다. 또한, 용어 "하나" (또는 "한"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환되어 사용될 수 있다. 이에 대조적으로, "한 개의 세포 (one cell) "에 대한 지칭은 그러한 복수의 세포들을 포함하는 것이 아닌, 단일의 (단리된) 세포로 제한된다.

용어 "포함하다(comprising)", "포함한 (including)" 및 "가진다" 는 상호 교환해서 사용될 수 있다는 것도 주목된다.

나아가, 용어 "포함하다" 는 한정 용어로서 용어 "이루어지다" 를 포함하는 것도 또한 주목된다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들 항체 구조가 다중특이적이고 2 개 이상의 비(非)펩티드성 결합된 경쇄인 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예, 적어도 이중특이적 항체) 를 포함하나 이들에 제한되는 것이 아닌 다양한 항체 구조를 포함한다.

용어 "비펩티드성 결합된"은 2 개의 폴리펩티드가 펩티드 결합에 의해 서로 연합되지 않는다는 점을 의미한다 (아미노산의 아미노- 와 카르복시기 사이에 형성됨). 그럼에도 불구하고, 이들 폴리펩티드는 기타 공유 결합에 의해, 예컨대 디술파이드 결합에 의해 또는 비공유적으로 연합될 수 있다.

용어 "키메라"항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 말한다.

항체의 "클래스"는 그의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5 종의 주된 항체 클래스가 존재하고: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 이들 몇몇은 하기 서브클래스 (이소타입) 로 추가 나뉠 수 있다: 예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2. 상이한 클래스의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 지칭된다.

본원에서 용어 "Fc-영역" 은 적어도 일부의 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 것으로 사용된다. 상기 용어는 선천 서열 Fc-영역 및 변이체 Fc-영역을 포함한다. 한 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226, 또는 Pro230 에서부터 중쇄의 카르복실-말단까지 이른다. 그러나 Fc-영역의 C-말단 리신 (Lys447) 은 존재 또는 부재할 수 있다. 본원에서 다르게 명시되지 않는 한, Fc-영역 또는 불변 영역에서의 아미노산 잔기의 번호지정은 Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 에 기재된 바와 같은 EU 인덱스로도 호칭되는 EU 번호지정 시스템에 따른다.

용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전 항체"는 본원에서 상호교환하여 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 나타내는데 사용된다.

용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 호환되어 사용되며, 그러한 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 내부에 도입된 세포를 언급한다. 숙주 세포는 1차 형질전환된 세포 및 계대수에 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함하여, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 를 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 내용에서 완전히 일치하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선별된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다.

"인간 항체" 는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비(非)인간 출처에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 구체적으로 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.

"인간화" 항체는 비인간 HVR 로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR 로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 언급한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 실질적으로 모든 하나 이상, 전형적으로 2 개의, 가변 도메인을 포함할 것이고, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR) 은 비-인간 항체의 그것에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 은 인간 항체의 그것에 해당한다. 인간화 항체는 인간 항체에서 유래하는 항체 불변 영역의 적어도 일부를 임의로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태" 는 인간화를 겪은 항체를 언급한다.

"단리된" 항체는 그것의 자연 환경의 한 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, 항체는, 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 에 의해 측정할 때 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 리뷰에 대해, 예를 들어, [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87] 참조.

"단리된" 핵산은 그것의 자연 환경의 한 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 언급한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.

본원에 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 언급하며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체들은 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하며, 예를 들어, 자연 발생적 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생하는 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체는 제외한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프) 로 향해지는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자로 향해진다. 따라서, "모노클로날" 이란 수식어는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체의 특질을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 모노클로날 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 기타 예시적 방법들은 본원에 기재되어 있다.

용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인" 은 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 언급한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL) 은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4 개의 보존된 골격 영역 (FR) 및 3개의 고가변 영역 (HVR) 을 포함한다 (예를 들어, Kindt, et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co. (2007) 페이지 91 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 제공하기에 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원과 결합하는 항체는, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원과 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 참조.

본원에서 사용되는 용어 "벡터" 는 연결되어 있는 또다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 언급한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라, 숙주 세포의 게놈 내로 상기가 도입된 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결되어 있는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 로 언급된다.

본 발명의 상세한 설명

제한된 단백질 가수분해 소화 및 ESI-MS 분석을 기반으로 하는, 다중특이적 항체 제조물에서 경쇄 잘못짝짓기의 측정 방법이 본원에 보고되어 있다. 이 방법은 품질 제어 또는 세포주 선택에 사용될 수 있다.

다중특이적 항체에서 경쇄 잘못짝짓기의 측정을 위해서는, 완전한 다중특이적 항체에서 경쇄 잘못짝짓기의 측정이 동중 질량 간섭에 의해 방해받기 때문에, 그 (다중특이적) 항체의 제한된 단백질 가수분해는 MS 분석 이전에 행해져야 한다는 점이 밝혀졌다.

따라서, 본원에 보고된 바와 같은 한 측면은 다중특이적 항체의 경쇄 짝짓기의 분석을 위한 다중특이적 항체의 가수분해 효소를 이용한 제한된 소화 용도이다.

2가 다중특이적 항체에서, 즉 2가 이중특이적 항체에서, 하나의 경쇄 잘못짝짓기가 가능하다 (도 1 참조).

본원에 보고된 바와 같은 방법의 한 예의 구현예에서, 2가 이중특이적 항체의 2 개의 샘플이 플라스민 (EC 3.4.21.7) 으로 소화되었다. 모든 샘플에서, 절단되지 않은 온전한 항체는 소화 후에 존재 하지 않았다. 샘플 1 에서, 약 20% 의 경쇄 잘못짝짓기된 항체가 검출가능하나 (도 3 참조), 제 2 샘플에서 경쇄 잘못짝짓기된 항체는 검출가능하지 않는다 (도 4 참조).

본원에 보고된 바와 같은 방법의 한 예의 구현예에서, 2가 이중특이적 항체의 샘플은 Lys-C 로 제한 소화하였다. 이 샘플에서는, 경쇄 잘못짝짓기된 항체가 검출가능하다 (도 5 참조).

2 개 초과의 경쇄가 존재하는 경우, 예를 들어 3가 또는 4가 다중특이적 항체에서, 1 개 초과의 경쇄 잘못짝짓기 생성물이 가능하다 (도 2 참조). 완전한 항체의 질량 분석에 있어서, 경쇄 잘못짝짓기된 생성물의 존재를 측정하는 것만이 가능하지, 잠재적 잘못짝짓기의 화학양론 및 방향은 검출할 수 없다 (도 6 참조).

상이한 단백질 가수분해 효소가 상기 과제를 위해 선택될 수 있다:

- Ides: 힌지 영역 아래 절단 (L234A, L235A 돌연변이를 갖는 항체에 사용될 수 없음)

- 플라스민: 힌지 영역 위 절단

- 펩신: 힌지 영역 아래 절단; 그 결과 분해된 Fc-영역 도모

- Lys-C: 힌지 영역 위 절단.

본원에 보고된 바와 같은 방법의 한 예의 구현예에서, 4가 이중특이적 항체의 샘플이 Lys-C 로 제한 소화되었다.

4가 다중특이적 항체에 있어서, 경쇄 1 및 중쇄 1 단편으로부터 Fab 영역 형태 내 잘못짝짓기가 0 의 ISCID 에서 더 잘 검출될 수 있는 반면, 제 2 경쇄를 포함하는 Fc-영역 단편은 90 의 ISCID 에서 더 잘 검출될 수 있다는 점이 밝혀졌다.

Fc-영역을 제거하기 위해, 단백질 A 친화도 크로마토그래피가 효소 소화 후 Fc-영역으로부터 Fab 단편을 분리하는데 사용될 수 있다. Fab 단편은 단백질 A 친화도 크로마토그래피의 통과액에 존재한다.

키메라 및 인간화 항체

특정 구현예에서, 본원에서 보고된 방법으로 분석된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 US　4,816,567; 및 문헌 [Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)] 에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 키메라 항체는 비(非)인간 가변 영역 (예, 마우스, 래트, 햄스터, 래빗, 비인간 영장류, 예컨대 원숭이에서 유래된 가변 영역) 과 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 부모 항체의 그것으로부터 변화된 "클래스 전환된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.

특정 구현예에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성은 감소되지만, 여전히 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유한다. 일반적으로, 인간화 항체는 내부의 HVR, 예를 들어, CDR (또는 그의 일부) 은 비-인간 항체에서 유래하고, FR (또는 그의 일부) 은 인간 항체 서열에서 유래하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화도를 회복 또는 개선하도록, 인간화 항체 내의 일부 FR 잔기가 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체) 로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.

인간화 항체 및 그의 제조 방법이, 예를 들어, 문헌 [Almagro, J.C. 및 Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633] 에서 리뷰되어 있고, 예를 들어 문헌 [Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329]; [Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; US　5,821,337, US　7,527,791, US　6,982,321, 및 US　7,087,409; [Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34] (특이성 결정 영역 (SDR) 그래프팅을 기재함); [Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498] ("재포장 (resurfacing)" 을 기재함); [Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60] ("FR 셔플링" 을 기재함); 및 [Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68] 및 [Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260] (FR 셔플링에 대한 "인도되는 선별 (guided selection)" 접근을 기재함) 에 추가적으로 기재되어 있다.

인간화에 사용될 수 있는 인간 골격 영역은 하기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다: "최적-적합 (best-fit)" 방법을 사용하여 선별된 골격 영역 (예를 들어, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 서브그룹의 인간 항체의 공통 서열에서 유래하는 골격 영역 (예를 들어, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 및 Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632) 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 골격 영역 또는 인간 생식선 골격 영역 (예를 들어, Almagro, J.C. 및 Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633) 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝에서 유래하는 골격 영역 (예를 들어, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 및 Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618 참조).

인간 항체

특정 구현예에서 본원에서 보고된 바와 같은 방법에서 분석된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체는 [van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 및 Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459] 에 일반적으로 기술되어 있다.

인간 항체는 항원 공격에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 온전한 인간 항체 또는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 그러한 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대신하거나 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 그러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 리뷰에 대해, Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125 참조. 또한, 예를 들어, US 6,075,181 및 6,150,584 (XENOMOUSE^TM 기술을 기재함); US 5,770,429 (HUMAB® 기술을 기재함); US 7,041,870 (K-M MOUSE ® 기술을 기재함), 및 US 2007/0061900 (VELOCIMOUSE® 기술을 기재함) 참조. 그러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과의 조합에 의해 추가로 변형될 수 있다.

인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 미엘로마 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주가 기재된 바 있다 (예를 들어, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal 항체 Production Techniques 및 Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; 및 Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95) 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술에 의해 생성된 인간 항체도 또한 문헌 [Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562] 에 기술되어 있다. 부가적 방법은, 예를 들어, US　7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재함) 및 Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (인간-인간 하이브리도마를 기재함) 에 기재된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma technology) 은 또한 문헌 [Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 and Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191] 에 기재되어 있다.

인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 그러한 가변 도메인 서열은 그 후 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술이 아래 기재되어 있다.

라이브러리-유래 항체

본원에서 보고된 바와 같은 방법에서 분석된 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 상기 라이브러리를 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 방법은, 예를 들어, [Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37] 에서 리뷰되어 있고, 예를 들어 [McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; 및 Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132] 에 추가로 기재되어 있다.

특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 별도로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이것이 그 후 [Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455] 에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터 얻은 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 높은-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, [Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734] 에 기재된 바와 같이 순 (naive) 레퍼토리를 클로닝하여 (예를 들어, 인간으로부터) 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원의 항체를 제공할 수 있다. 마지막으로, [Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388] 에 기재된 바와 같이 순 라이브러리도 또한 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 고도 가변 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내 재배열을 달성하기 위해 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공개공보는, 예를 들어: US　5,750,373, 및 US　2005/0079574, US　2005/0119455, US　2005/0266000, US　2007/0117126, US　2007/0160598, US　2007/0237764, US　2007/0292936, 및 US　2009/0002360 을 포함한다.

인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.

다중특이적 항체

조작된 단백질, 예컨대 2개 이상의 항원과 결합할 수 있는 이중- 또는 다중-특이적 항체가 당업계에 공지되어 있다. 이러한 다중특이적 결합 단백질은 세포 융합, 화학적 컨쥬게이션 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에서 보고된 바와 같은 방법에서 분석된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 적어도 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2 개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 다중특이적 항체는 전장 항체로서 제조될 수 있다.

다중특이적 항체의 제조를 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현 (Milstein, C. 및 Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, 및 Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659 참조), 및 "놉-인-홀 (knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, US 5,731,168 참조) 을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다중-특이적 항체는 또한 항체 Fc-헤테로다이머 분자의 제조를 위한 정전기적 스티어링 효과를 조작함으로써 (WO 2009/089004); 2 개 이상의 항체 또는 단편을 가교시킴으로써 (예를 들어, US 4,676,980, 및 Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83 참조); 이중특이적 항체를 생성하기 위해 류신 지퍼를 사용함으로써 (예를 들어, Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 를 사용함으로써 (예를 들어, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448 참조); 및 단일-사슬 Fv (sFv) 다이머를 사용함으로써 (예를 들어, Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374 참조); 그리고 예를 들어, 문헌 Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69) 에 기재된 바와 같은 삼특이적 항체를 제조함으로써 제조될 수 있다.

"문어 항체" 를 포함하여, 3 개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 가진 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576 참조).

본원의 항체 또는 단편에는 또한 [[PRO]] 뿐 아니라, 또다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "Dual Acting Fab" 또는 "DAF" 가 포함된다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).

본원의 항체 또는 단편에는 또한 WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, 및 WO 2010/145793 에 기재된 다중특이적 항체가 포함된다.

매우 다양한 재조합 다중특이적 항체 포맷, 예를 들어 IgG 항체 포맷 및 단일 사슬 도메인의 융합에 의한, 예를 들어 4가 이중특이적 항체가 최근에 개발되었다 (예를 들어 Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163; WO 2001/077342; 및 Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234 참고).

또한 항체 코어 구조 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 가 더이상 유지되지 않는 여러 다른 새로운 포맷 예컨대 둘 이상의 항원에 결합할 수 있는 다이아-, 트리아- 또는 테트라바디, 미니바디, 여러 단일 사슬 포맷 (scFv, Bis-scFv) 이 개발되었다 (Holliger, P., et. al, Nature Biotech. 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., 및 Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et. al., J. Immunol. Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297).

모든 그러한 포맷은 링커를 사용하여 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 를 추가의 결합 단백질 (예를 들어 scFv) 에 융합시키거나 또는 예를 들어 2 개의 Fab 단편 또는 scFv 를 융합시킨다 (Fischer, N., 및 Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). 링커가 다중특이적 항체의 조작에 관해 이점을 갖는다는 것이 분명하지만, 링커는 또한 치료 상황에서 문제를 야기할 수 있다. 실제로, 이들 외래 펩티드는 링커 자신 또는 단백질과 링커 사이의 연접에 대한 면역 응답을 유발할지도 모른다. 게다가, 이들 펩티드의 유연한 본질은 그것을 단백질가수분해 절단을 당하기 쉽게 만들고, 잠재적으로 불량한 항체 안정성, 응집 및 증가된 면역원성을 초래한다. 게다가 자연적으로 발생하는 항체와 고도의 유사성을 유지함으로써 Fc-부분을 통해 매개되는 효과기 기능, 예컨대 예를 들어 보체-의존적 세포독성 (CDC) 또는 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 을 보유하는 것을 원할 수 있다.

따라서, 이상적으로는, 인간 서열로부터의 편차가 최소인 자연적으로 발생하는 항체 (예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 와 일반 구조에서 매우 유사한 다중특이적 항체를 개발하는 것을 목표로 삼아야 한다.

하나의 접근법에서 쥐과 모노클로날 항체를 발현하는 2 가지 상이한 하이브리도마 세포주의 체세포 융합에 기초하는 쿼드로마 기술 (Milstein, C., 및 Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540 참고) 을 사용하여 이중특이적 항체의 요망되는 특이성을 갖는 자연 항체와 매우 유사한 이중특이적 항체가 생산되었다. 결과적인 하이브리드-하이브리도마 (또는 쿼드로마) 세포주 내에서의 2 가지 상이한 항체 중 및 경쇄의 무작위 짝짓기 때문에, 10 가지 이하의 상이한 항체 종이 생성되며, 이 중 오직 하나만 요망되는, 기능적 이중특이적 항체이다. 잘못 짝지어진 부산물의 존재, 및 유의하게 감소된 생산 수율로 인해, 정교한 정제 절차가 요구된다 (예를 들어 Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234 참고). 일반적으로 재조합 발현 기술이 사용되는 경우에 잘못 짝지어진 부산물의 동일한 문제가 여전히 있다.

'놉-인투-홀' 로서 알려져 있는, 잘못 짝지어진 부산물의 문제를 극복하기 위한 접근법은 CH3 도메인 내에 돌연변이를 도입하여 접촉 경계면을 변경함으로써 2 가지 상이한 항체 중쇄의 짝지음을 강제하는 것을 목표로 삼는다. 하나의 사슬에서 부피가 큰 아미노산이 짧은 측쇄를 갖는 아미노산으로 대체되어 '홀' 을 생성했다. 반대로, 큰 측쇄를 갖는 아미노산이 다른 CH3 도메인 내에 도입되어, '놉' 을 생성했다. 이들 2 개의 중쇄 (및 2 개의 동일한 경쇄, 이는 양쪽 중쇄에 적당해야 함) 를 공발현시킴으로써, 호모다이머 형성 ('홀-홀' 또는 '놉-놉') 에 비해 높은 수율의 헤테로다이머 형성 ('놉-홀') 이 관찰되었다 (Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; 및 WO 96/027011). 파지 표시 접근법을 사용하는 2 개의 CH3 도메인의 상호작용 표면의 개조 및 헤테로다이머를 안정화시키기 위한 디술파이드 가교의 파지 도입에 의해 헤테로다이머의 백분율이 추가로 증가될 수 있었다 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35). 놉-인투-홀 기술에 관한 새로운 접근법이 예를 들어 EP 1 870 459 A1 에 기재되어 있다. 이러한 포맷은 매우 매력적으로 보이지만, 임상을 향한 진보를 기술하는 데이타는 현재 입수가능하지 않다. 이러한 전략의 하나의 중요한 제약은 잘못짝짓기 및 불활성 분자의 형성을 방지하기 위해 2 개의 부모 항체의 경쇄가 동일해야 한다는 점이다. 따라서 이 기술은 제 1 및 제 2 항원에 대항하는 2 가지 항체에서 출발하여 3 또는 4 가지 항원에 대항하는 재조합, 삼중- 또는 사중특이적 항체를 용이하게 개발하기 위한 기초로서 적당하지 않으며, 이는 이들 항체의 중쇄 및/또는 동일한 경쇄는 첫째로 최적화되어야 하고 그 후 제 3 및 제 4 항원에 대항하는 추가의 항원 결합 펩티드가 부가되어야 하기 때문이다.

WO 2006/093794 는 헤테로다이머성 단백질 결합 조성물에 관한 것이다. WO 99/37791 은 다목적 항체 유도체를 기재한다. Morrison, S.L., et al., J. Immunol. 160 (1998) 2802-2808 은 IgG 의 기능적 특성에 대한 가변 영역 도메인 교환의 영향을 언급한다.

WO 2013/02362 는 헤테로다이머화된 폴리펩티드에 관한 것이다. WO 2013/12733 은 헤테로다이머성 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. WO 2012/131555 는 조작된 헤테로다이머화성 면역글로불린에 관한 것이다. EP 2647707 은 조작된 헤테로다이머화성 면역글로불린에 관한 것이다.

WO 2013/026835 는 도메인 크로스오버된 이중특이적, Fc 자유 항체에 관한 것이다. WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 및 Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191 은 도메인 크로스오버된 2 가, 이중특이적 IgG 항체에 관한 것이다.

WO2009/080252 에 기재되어 있는 (또한 Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191 참고), 경쇄 잘못짝짓기를 방지하기 위해 하나의 결합 팔에 VH/VL 대체/교환을 포함하는 다중특이적 항체 (CrossMabVH-VL) 는 제 1 항원에 대항하는 경쇄와 제 2 항원에 대항하는 틀린 중쇄의 미스매치에 의해 야기되는 부산물을 명백히 감소시킨다 (그러한 도메인 교환이 없는 접근법과 비교할 때). 그러나 그들의 제제에는 부산물이 완전히 없지는 않다. 주요 부산물은 벤스-존스 (Bence-Jones) 유형 상호작용에 기초한다 (또한 Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191 참조; 부록의 도 S1I 에).

이중특이적 항체

한 구현예에서 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다.

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은, 하기를 포함하는 2가의, 이중특이적 항체이다:

a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 1 경쇄 및 제 1 중쇄, 및

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄 (이때, 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 이 서로 대체되어 있음),

이때, 제 1 항원과 제 2 항원은 상이한 항원임.

a) 하의 항체는 b) 하에서 보고된 바와 같은 개질을 포함하지 않고, a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.

b) 하의 항체에서,

경쇄 내,

가변 경쇄 도메인 VL 이 그 항체의 가변 중쇄 도메인 VH 에 의해 대체되어 있고,

중쇄 내,

가변 중쇄 도메인 VH 이 그 항체의 가변 경쇄 도메인 VL 에 의해 대체되어 있음.

한 구현예에서

i) a) 하의 제 1 경쇄의 불변 도메인 CL 에서, 위치 124 에서의 아미노산 (Kabat 에 따른 번호지정) 이 양전하의 아미노산으로 치환되어 있고, a) 하의 제 1 중쇄의 불변 도메인 CH1 에서, 위치 147 에서의 아미노산 또는 위치 213 에서의 아미노산 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정) 은 음전하의 아미노산으로 치환되어 있거나,

또는

ii) b) 하의 제 2 경쇄의 불변 도메인 CL 에서, 위치 124 에서의 아미노산 (Kabat 에 따른 번호지정) 은 양전하 아미노산으로 치환되어 있고, b) 하의 제 2 중쇄의 불변 도메인 CH1 에서, 위치 147 에서의 아미노산 또는 위치 213 에서의 아미노산 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정) 은 음전하 아미노산으로 치환되어 있음.

한 바람직한 구현예에서,

i) a) 하의 제 1 경쇄의 불변 도메인 CL 에서, 위치 124 에서의 아미노산은 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) (Kabat 에 따른 번호지정) (하나의 바람직한 구현예에서 독립적으로 리신 (K) 또는 아르기닌 (R) 로) 독립적으로 치환되어 있고, a) 하의 제 1 중쇄의 불변 도메인 CH1 에서, 위치 147 에서의 아미노산 또는 위치 213 에서의 아미노산은 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D) (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정) 으로 독립적으로 치환되어 있거나,

또는

ii) b) 하의 제 2 경쇄의 불변 도메인 CL 에서, 위치 124 에서의 아미노산은 리신 (K), 아르기닌 (R) 또는 히스티딘 (H) (Kabat 에 따른 번호지정) (하나의 바람직한 구현예에서 독립적으로 리신 (K) 또는 아르기닌 (R)) 로 독립적으로 치환되어 있고, b) 하의 제 2 중쇄의 불변 도메인 CH1 에서, 위치 147 에서의 아미노산 또는 위치 213 에서의 아미노산은 독립적으로 글루탐산 (E) 또는 아스파르트산 (D) (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정) 로 치환되어 있음.

한 구현예에서, 제 2 경쇄의 불변 도메인 CH1 에서, 위치 147 및 213 에서의 아미노산은 E (Kabt 의 EU 인덱스에 따른 번호지정) 으로 치환되어 있다.

하나의 바람직한 구현예에서, 제 1 경쇄의 불변 도메인 CL 에서 위치 124 및 123 에서의 아미노산은 K 로 치환되어 있고, 제 1 중쇄의 불변 도메인 CH1 에서, 위치 147 및 213 에서의 아미노산은 E 로 치환되어 있다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

한 구현예에서, 제 2 중쇄의 불변 도메인 CL 에서, 위치 124 및 123 에서의 아미노산은 K 로 치환되어 있고, 제 2 경쇄의 불변 도메인 CH1 에서, 위치 147 및 213 에서의 아미노산은 E 로 치환되어 있고, 제 1 경쇄의 가변 도메인 VL 에서, 위치 38 에서의 아미노산은 K 로 치환되어 있고, 제 1 중쇄의 가변 도메인 VH 에서, 위치 39 에서의 아미노산은 E 로 치환되어 있고, 제 2 중쇄의 가변 도메인 VL 에서, 위치 38 에서의 아미노산은 K 로 치환되어 있고, 제 2 경쇄의 가변 도메인 VH 에서 위치 39 에서의 아미노산은 E 로 치환되어 있다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은, 하기를 포함하는 2가의 이중특이적 항체이다:

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄 (이때, 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 는 서로 대체되어 있고, 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체되어 있음),

이때, 제 1 및 제 2 항원은 상이한 항원임.

b) 하의 항체에서,

경쇄 내에서,

가변 경쇄 도메인 VL 은 그 항체의 가변 중쇄 도메인 VH 로 대체되어 있고, 불변 경쇄 도메인 CL 은 그 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1 로 대체되어 있고;

중쇄 내에서,

가변 중쇄 도메인 VH 은 그 항체의 가변 경쇄 도메인 VL 로 대체되어 있고, 불변 중쇄 도메인 CH1 은 그 항체의 불변 경쇄 도메인 CL 로 대체되어 있다.

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은 하기를 포함하는 2가의 이중특이적 항체이다:

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄 ( 이때, 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체되어 있음),

이때, 제 1 및 제 2 항원은 상이한 항원임.

b) 하의 항체에서,

경쇄 내에서,

불변 경쇄 도메인 CL 은 그 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1 로 대체되어 있고;

중쇄 내에서,

불변 중쇄 도메인 CH1 은 그 항체의 불변 경쇄 도메인 CL 로 대체되어 있다.

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은 하기를 포함하는 다중특이적 항체이다:

a) 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어진 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체, 및

b) 1 내지 4 개의 추가 항원 (즉, 제 2 및/또는 제 3 및/또는 제 4 및/또는 제 5 항원) 에 특이적으로 결합하는 (바람직하게는 1 개의 추가 항원, 즉 제 2 항원에 특이적으로 결합함) 1, 2, 3 또는 4 개의 단일 쇄 Fab 단편,

이때, 상기 b) 하의 단일 쇄 Fab 단편은 상기 a) 하 전장 항체와, 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에서 펩티드성 링커를 통해 융합하고,

제 1 및 제 2 항원은 상이한 항원임.

한 구현예에서, 제 2 항원에 결합하는 1 또는 2 개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체와 융합된다.

한 구현예에서 제 2 항원에 결합하는 1 또는 2 개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 중쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체와 융합된다.

한 구현예에서 제 2 항원에 결합하는 1 또는 2 개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 경쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체와 융합된다.

한 구현예에서 제 2 항원에 결합하는 2 개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 각 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체와 융합된다.

한 구현예에서 제 2 항원과 결합하는 2 개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 각 중쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체와 융합된다.

한 구현예에서 제 2 항원과 결합하는 2 개의 동일한 단일 쇄 Fab 단편은 상기 전장 항체의 각 경쇄의 C-말단에서 펩티드성 링커를 통해 상기 전장 항체와 융합된다.

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은, 하기를 포함하는 3가의 이중특이적 항체이다:

a) 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어지고, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체,

b) 하기로 이루어진 제 1 폴리펩티드:

ba) 항체 중쇄 가변 도메인 (VH),

또는

bb) 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 항체 불변 도메인 1 (CH1),

(이때, 상기 제 1 폴리펩티드는 상기 전장 항체의 2 개의 중쇄들 중 하나의 C-말단에 펩티드성 링커를 통해 그의 VH 도메인의 N-말단과 융합됨),

c) 하기로 이루어진 제 2 폴리펩티드:

ca) 항체 경쇄 가변 도메인 (VL),

또는

cb) 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 항체 경쇄 불변 도메인 (CL)

(이때, 상기 제 2 폴리펩티드는 상기 전장 항체의 2 개의 중쇄들 중 나머지 하나의 C-말단에 펩티드성 링커를 통히 VL 도메인의 N-말단과 융합됨),

이때, 제 1 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 제 2 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 은 함께 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 형성하고,

제 1 및 제 2 항원은 상이한 항원임.

한 구현예에서, b) 하의 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 c) 하의 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 은 하기 위치들 사이에서 디술파이드 결합의 도입으로써 쇄간 디술파이드 브릿지를 통해 연결 및 안정화된다:

i) 중쇄 가변 도메인 위치 44 내지 경쇄 가변 도메인 위치 100, 또는

ii) 중쇄 가변 도메인 위치 105 내지 경쇄 가변 도메인 위치 43, 또는

iii) 중쇄 가변 도메인 위치 101 내지 경쇄 가변 도메인 위치 100 (항상 Kabat EU Index 에 따른 번호지정).

안정화를 위한 비(非)천연적 디술파이드 브릿지를 도입하는 기술은 예를 들어 [WO　94/029350, Rajagopal, V., et al., Prot. Eng. (1997) 1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, (1998) 387-393; 또는 Schmidt, M., et al., Oncogene (1999) 18 1711-1721] 에 기재되어 있다. 한 구현예에서, b) 및 c) 하의 폴리펩티드의 가변 도메인 사이 임의적 디술파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 위치 44 와 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이다. 한 구현예에서, b) 및 c) 하의 폴리펩티드의 가변 도메인 사이의 임의적 디술파이드 결합은 중쇄 가변 도메인 위치 105 와 경쇄 가변 도메인 위치 43 사이이다 (항상 Kabat 의 EU 인덱스에 따른 번호지정). 한 구현예에서, 단일 쇄 Fab 단편의 가변 도메인 VH 및 VL 사이의 상기 임의적 디술파이드 안정화가 없는 3가, 이중특이적 항체가 바람직하다.

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은 하기를 포함하는 삼중특이적 또는 사중특이적 항체이다:

a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 제 1 경쇄 및 제 1 중쇄, 및

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 제 2 (개질된) 경쇄 및 제 2 (개질된) 중쇄 (이때, 가변 도메인 VL 및 VH 는 서로 대체되어 있고/있거나 불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체되어 있음), 및

c) 1 또는 2 개의 추가 항원 (즉, 제 3 및/또는 제 4 항원) 에 특이적으로 결합하는 1 내지 4 개의 항원 결합 펩티드는 a) 및/또는 b) 의 경쇄 또는 중쇄의 C- 또는 N-말단에 펩티드성 링커를 통해 융합되고,

이때, 제 1 및 제 2 항원은 상이한 항원임.

a) 하의 항체가 b) 하에서 보고된 바와 같은 개질을 포함하지 않고, a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄임.

한 구현예에서, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 c) 하 1 또는 2 개의 추가 항원에 특이적으로 결합하는 1 또는 2 개의 항원 결합 펩티드를 포함한다.

한 구현예에서, 항원 결합 펩티드는 scFv 단편 및 scFab 단편의 군으로부터 선택된다.

한 구현예에서, 항원 결합 펩티드는 scFv 단편이다.

한 구현예에서, 항원 결합 펩티드는 scFab 단편이다.

한 구현예에서, 항원 결합 펩티드는 a) 및/또는 b) 의 중쇄의 C-말단과 융합된다.

한 구현예에서, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 c) 하 하나의 추가 항원에 특이적으로 결합하는 1 또는 2 개의 항원 결합 펩티드를 포함한다.

한 구현예에서, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 c) 하 제 3 의 항원에 특이적으로 결합하는 2 개의 동일한 항원 결합 펩티드를 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 상기 2 개의 동일한 항원 결합 펩티드는 a) 및 b) 의 중쇄의 C-말단에 동일 펩티드성 링커를 통해 모두 융합된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 2 개의 동일한 항원 결합 펩티드는 scFv 단편 또는 scFab 단편이다.

한 구현예에서, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체는 c) 하 제 3 및 제 4 항원에 특이적으로 결합하는 2 개의 항원 결합 펩티드를 포함한다. 한 구현예에서 상기 2 개의 항원 결합 펩티드는 a) 및 b) 의 중쇄의 c-말단에 동일 펩티드 커넥터를 통해 모두 융합된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 상기 2 개의 항원 결합 펩티드는 scFv 단편이거나 scFab 단편이다.

본원에 보고된 바와 같은 하나의 측면은 하기를 포함하는 이중특이적, 4가의 항체이다:

a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 (그리고 2 개의 Fab 단편을 포함하는), 항체의 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄,

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 2 개의 추가적인 Fab 단편 (이때 상기 추가적인 Fab 단편은 a) 의 중쇄의 C- 또는 N-말단에 펩티드성 링커를 통해 모두 융합됨),

및

이때, Fab 단편에서, 하기의 개질이 수행됨:

i) a) 의 Fab 단편 양자 모두, 또는 b) 의 Fab 단편 양자 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH 은 서로 대체되고/거나, 불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨,

또는

ii) a) 의 양 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH 은 서로 대체되고, 불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체되고,

b) 의 양 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH 은 서로 대체되거나, 불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체됨,

또는

iii) a) 의 Fab 단편 양자 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH 이 서로 대체되거나, 또는 불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체되고,

b) 의 Fab 단편 양자 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH 이 서로 대체되고, 불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체됨,

또는

iv) a) 의 Fab 단편 양자 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH 이 서로 대체되고, b) 의 Fab 단편 양자 모두에서, 불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨,

또는

v) a) 의 Fab 단편 양자 모두에서, 불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체되고, b) 의 Fab 단편 양자 모두에서, 가변 도메인 VL 및 VH 은 서로 대체됨,

이때, 제 1 및 제 2 항원은 상이한 항원임.

한 구현예에서, 상기 추가적인 Fab 단편은 a) 의 중쇄의 N-말단에, 또는 a) 의 중쇄의 C-말단에 펩티드성 링커를 통해 양자 모두 융합된다.

한 구현예에서, 상기 추가적인 Fab 단편은 a) 의 중쇄의 C-말단에 펩티드성 링커를 통해 양자 모두 융합된다.

한 구현예에서, 상기 추가적인 Fab 단편은 a) 의 중쇄의 N-말단에 펩티드 커넥터를 통해 양자 모두 융합된다.

한 구현예에서, Fab 단편에서, 하기의 개질이 수행된다:

i) a) 의 양 Fab 단편에서, 또는 b) 의 양 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH 이 서로 대체되고,

및/또는

불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체됨.

한 구현예에서, Fab 단편에서, 하기의 개질이 수행된다:

i) a) 의 양 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH 이 서로 대체되고

및/또는

불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨.

한 구현예에서, Fab 단편에서, 하기의 개질이 수행된다:

i) a) 의 양 Fab 단편에서, 불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체된다.

한 구현예에서, Fab 단편에서, 하기의 개질이 수행된다:

i) b) 의 양 Fab 단편에서, 가변 도메인 VL 및 VH 이 서로 대체되고,

및/또는

불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체됨.

한 구현예에서, Fab 단편에서, 하기의 개질이 수행된다:

i) b) 의 양 Fab 단편에서, 불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체된다.

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은 하기를 포함하는 이중특이적, 4가 항체이다:

a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고, 제 1 의 VH-CH1 도메인 쌍을 포함하는 제 1 항체의 (개질된) 중쇄 (이때, 상기 중쇄의 C-말단에, 상기 제 1 항체의 제 2 VH-CH1 도메인의 N-말단이 펩티드성 링커를 통해 융합됨),

b) a) 의 상기 제 1 항체의 2 개의 경쇄,

c) 제 2 항원에 특이적으로 결합하고, 제 1 의 VH-CL 도메인 쌍을 포함하는 제 2 항체의 (개질된) 중쇄 (이때, 상기 중쇄의 C-말단에, 상기 제 2 항체의 제 2 의 VH-CL 도메인 쌍의 N-말단이 펩티드성 링커를 통해 융합됨), 및

d) c) 의 상기 제 2 의 항체의 2 개의 (개질된) 경쇄 (각각 CL-CH1 도메인 쌍을 포함함),

이때, 제 1 및 제 2 의 항원은 상이한 항원임.

본원에서 보고된 바와 같은 한 측면은 하기를 포함하는 이중특이적 항체이다:

a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 의 전장 항체의 중쇄 및 경쇄, 및

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 의 전장 항체의 중쇄 및 경쇄 (이때, 중쇄의 N-말단은 경쇄의 C-말단에 펩티드성 링커를 통해 연결됨),

이때, 제 1 및 제 2 의 항원은 상이함.

a) 하의 항체는 b) 하에서 보고된 바와 같은 개질을 포함하지 않고, 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.

a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고, 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체, 및

b) VH² 도메인 및 VL² 도메인을 포함하는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편 (이때, 양 도메인은 디술파이드 브릿지를 통해 서로 연결됨),

이때, 오직 VH² 도메인 또는 VL² 도메인중 하나만이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 펩티드성 링커를 통해 융합되고,

제 1 및 제 2 의 항원은 상이한 항원임.

이중특이적 항체에서, a) 하의 중쇄 및 경쇄는 단리된 쇄이다.

한 구현예에서, VH² 도메인 또는 VL² 도메인의 나머지 하나는 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 펩티드성 링커를 통해 융합되지 않는다.

본원에서 보고된 바와 같은 모든 측면에서, 제 1 경쇄는 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 제 1 중쇄는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.

모든 측면의 한 구현예에서, 본원에서 보고된 바와 같은 항체는 2 개 이상의 중쇄 폴리펩티드의 헤테로다이머화를 요구하는 다중특이적 항체이다.

헤테로다이머화를 지지하기 위해 CH3-개질에 대한 몇 가지 접근법이 예를 들어 본원에 참고로 포함되어 있는 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO　2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO　2013/096291 에 기재되어 있다. 전형적으로, 당업계에 공지된 접근법에서, 제 2 중쇄의 CH3 도메인 및 제 1 중쇄의 CH3 도메인 양자 모두는 상보적인 방식으로 조작되어 하나의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄가 동일 구조의 또 다른 중쇄로 더 이상 호모다이머화할 수 없다 (예, CH3-조작된 제 1 중쇄는 또 다른 CH3-조작된 제 1 중쇄로 더 이상 호모다이머화할 수 없고; CH-3 조작된 제 2 중쇄는 더이상 또 다른 CH3-조작된 제 2 중쇄와 호모다이머화할 수 없음). 그로인해, 하나의 조작된 CH3 도메인을 포함하는 중쇄는 상보적인 방식으로 조작된 CH3 도메인을 포함하는 또 다른 중쇄와 헤테로다이머화되도록 강제된다. 본 발명의 이러한 구현예를 위해, 제 1 중쇄의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄의 CH3 도메인은 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄가 헤테로다이머화되게 강제되는 것과 같이 아미노산 치환에 의해 상보적인 방식으로 조작되는 반면에, 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄는 더 이상 호모다이머화될 수 없다 (예, 입체적 이유로 인함).

상기 인용되고 포함된, 당업계에 공지된 중쇄 헤테로다이머화를 지지하기 위한 상이한 접근법은, 본 발명에 상기 기재된 특정 아미노산 치환과 병용하여, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 항체로부터 유래된 "비가교된 (non-crossed) 영역" 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 항체로부터 유래된 "가교된 Fab 영역" 을 포함하는 본 발명에 따른 다중특이적 항체에 사용된 상이한 대안으로서 고려된다.

본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체의 CH3 도메인은, 예를 들어 문헌 [WO　96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681] 에서 몇몇의 예로 상세히 기재된 "놉-인투-홀" 로써 변경될 수 있다. 이 방법에서, 2 개의 CH3 도메인들의 상호작용 표면이 이들 두 개의 CH3 도메인을 함유하는 양 중쇄의 헤테로다이머화를 증가하도록 변경된다. (두 중쇄의) 두 CH3 도메인 각각은 "놉"일 수 있고, 다른 하나는 "홀"일 수 있다. 디술파이드 브릿지의 도입은 추가로 헤테로다이머를 안정화시키고 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35), 수율을 증가시킨다.

하나의 바람직한 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 다중특이적 항체는 본원에서 "놉 쇄"의 CH3 도메인 내 T366W 돌연변이 및 "홀-쇄"의 CH3 도메인 내 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). CH3 도메인들 사이에서 추가적인 쇄간 디술파이드 결합이 또한 예를 들어 "놉 쇄" 의 CH3 도메인에 Y349C 돌연변이를 도입하고, "홀 쇄"의 CH3 도메인에 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 도입함으로써 이용될 수 있다 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681). 따라서, 또 다른 바람직한 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 다중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 E356C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 본원에 보고된 바와 같은 다중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다 (한 CH3 도메인 내 추가적인 Y349C 돌연변이 및 또 다른 CH3 도메인 내 추가적인 E356C 또는 S354C 돌연변이는 쇄간 디술파이드 브릿지를 형성함) (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

그러나, 또한 EP　1　870　459A1 에 기재된 바와 같은 기타 놉-인-홀 기술이 대안적으로 또는 추가적으로 이용될 수 있다. 한 구현예에서, 본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인 내 R409D 및 K370E 돌연변이 및 "홀-쇄"의 CH3 도메인 내 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

한 구현예에서, 본원에 보고된 바와 같은 다중특이적 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인 내 T366W 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하고, 추가적으로 "놉 쇄"의 CH3 도메인 내 R409D 및 K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

한 구현예에서, 본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C 및 T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함하고, 추가적으로 "놉 쇄"의 CH3 도메인 내 R409D 및 K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 내 D399K 및 E357K 돌연변이를 포함한다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호 지정).

"놉-인투-홀 기술" 외에, 헤테로다이머화를 강제 실시하는 다중특이적 항체의 중쇄의 CH3 도메인을 개질하기 위한 다른 기술이 당업계에 공지되어 있다. 이들 기술, 특히 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO　2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO　2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 및 WO 2013/096291 에 기재된 것이 본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체와 조합되어 "놉-인투-홀 기술" 에 대한 대안으로서 본원에서 고려된다.

본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체의 한 구현예에서, EP 1870459 에 기재된 접근법이 다중특이적 항체의 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄의 헤테로다이머화를 지지하는데 이용된다. 이 접근법은 양쪽 제 1 및 제 2 중쇄 사이의 CH3/CH3-도메인-경계면에서의 특정한 아미노산 위치에서 반대 전하를 가진 대전된 아미노산의 도입을 기반으로 한다.

따라서, 이 구현예는 본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체에 관한 것이고, 이 항체의 3 차 구조에서 제 1 중쇄의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄의 CH3 도메인은 각 항체 CH3 도메인들 사이에 위치된 경계면을 형성하고, 제 1 중쇄의 CH3 도메인 및 제 2 중쇄의 CH3 도메인의 각 아미노산 서열 각각은 항체의 3차 구조에서 상기 경계면 내 위치된 아미노산 세트를 포함하고, 이때 한 중쇄의 CH3 도메인 내 경계면에 위치된 아미노산 세트에서, 제 1 아미노산은 양전하 아미노산으로 대체되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인 내 경계면에 위치된 아미노산 세트로부터 제 2 아미노산이 음전하 아미노산으로 대체된다. 본 구현예에 따른 다중특이적 항체는 본원에서 또한 "CH3(+/-)-조작된 다중특이적 항체" (이때 약어 "+/-" 는 각 CH3 도메인에서 도입된 반대 대전된 아미노산을 지칭함) 을 지칭한다.

본원에서 보고된 바와 같은 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이적 항체의 한 구현예에서, 양전하 아미노산은 K, R 및 H 로부터 선택되고, 음전하 아미노산은 E 또는 D 로부터 선택된다.

본원에서 보고된 바와 같은 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이적 항체의 한 구현예에서, 양전하 아미노산은 K 및 R 로부터 선택되고, 음전하 아미노산은 E 또는 D 로부터 선택된다.

본원에서 보고된 바와 같은 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이적 항체의 한 구현예에서, 양전하 아미노산은 K 이고, 음전하 아미노산은 E 이다.

본원에서 보고된 바와 같은 상기 CH3(+/-)-조작된 다중특이적 항체의 한 구현예에서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 409 에서의 아미노산 R 은 D 로 치환되고, 위치에서 아미노산 K 는 E 로 치환되고, 다른 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 399 에서의 아미노산 D 는 K 로 치환되고, 위치 357 에서 아미노산 E 는 K 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체의 한 구현예에서, WO2013/157953 에서 기재된 접근법이 다중특이적 항체의 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄의 헤테로다이머화를 지지하는데 사용된다. 본원에서 보고된 바와 같은 상기 다중특이적 항체의 한 구현예에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 366 에서의 아미노산 T 는 K 로 치환되고, 다른 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351 에서의 아미노산 L 은 D 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 본원에서 보고된 바와 같은 상기 다중특이적 항체의 또 다른 구현예에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 366 에서의 아미노산 T 는 K 로 치환되고 위치 351 에서의 아미노산 L 은 K 로 치환되고, 다른 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 351 에서의 아미노산 L 은 D 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

본원에서 보고된 바와 같은 상기 다중특이적 항체의 또 다른 구현예에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 366 에서의 아미노산 T 는 K 로 치환되고, 위치 351 에서의 아미노산 L 은 K 로 치환되고, 다른 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 351 에서의 아미노산 L 은 D 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 추가적으로, 하기의 치환들 중 적어도 하나가 다른 하나의 중쇄의 CH3 도메인에 포함된다: 위치 349 에서의 아미노산 Y 는 E 로 치환되고, 위치 349 에서의 아미노산 Y 는 D 로 치환되고, 위치 368 에서의 아미노산 L 은 E 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 한 구현예에서, 위치 368 에서의 아미노산 L 은 E 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체의 한 구현예에서, WO2012/058768 에 기재된 접근법이 이용되어 다중특이적 항체의 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄의 헤테로다이머화를 지지한다. 본원에서 보고된 바와 같은 상기 다중특이적 항체의 한 구현예에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 351 에서의 아미노산 L 이 Y 로 치환되고, 위치 407 에서의 아미노산 Y 는 A 로 치환되고, 기타 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 366 에서의 아미노산 T 는 A 로 치환되고, 위치 409 에서의 아미노산 K 는 F 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 또 다른 구현예에서, 상술된 치환에 덧붙여, 기타 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 411 에서의 아미노산 (원래 T), 위치 399 에서의 아미노산 (원래 D), 위치 400 에서의 아미노산 (원래 S), 위치 405 에서의 아미노산 (원래 F), 위치 390 에서의 아미노산 (원래 N) 및 위치 392 에서의 아미노산 (원래 K) 중 하나 이상에서 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 바람직한 치환은 하기이다:

- 위치 411 에서의 아미노산 T 를 N, R, Q, K, D, E 및 W 로부터 선택된 아미노산으로 치환 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정),

- 위치 399 에서의 아미노산 D 를 R, W, Y, 및 K 로부터 선택된 아미노산으로 치환 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정),

- 위치 400 에서의 아미노산 S 를 E, D, R 및 K 로부터 선택된 아미노산으로 치환 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정),

- 위치 405 에서의 아미노산 F 를 I, M, T, S, V 및 W 로부터 선택된 아미노산으로 치환 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정);

- 위치 390 에서의 아미노산 N 을 R, K 및 D 로부터 선택된 아미노산으로 치환 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정); 및

- 위치 392 에서의 아미노산 K 를 V, M, R, L, F 및 E 로부터 선택된 아미노산으로 치환 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

본원에서 보고된 바와 같은 상기 다중특이적 항체의 또 다른 구현예에서 (WO2012/058768 에 따라 조작됨), 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 351 에서의 아미노산 L 은 Y 로 치환되고, 위치 407 에서의 아미노산 Y 는 A 로 치환되고, 다른 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 366 에서의 아미노산 T 는 V 로 치환되고, 위치 409 에서의 아미노산 K 는 F 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 본원에서 보고된 바와 같은 상기 다중특이적 항체의 또 다른 구현예에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 407 에서의 아미노산 Y 는 A 로 치환되고, 또 다른 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 366 에서의 아미노산 T 가 A 로 치환되고, 위치 409 에서의 아미노산 K 는 F 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 상기 마지막 상술된 구현예에서, 상기 기타 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 392 에서의 아미노산 K 는 E 로 치환되고, 위치 411 에서의 아미노산 T 는 E 로 치환되고, 위치 399 에서의 아미노산 D 는 R 로 치환되고, 위치 400 에서의 아미노산 S 는 R 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체의 한 구현예에서, WO 2011/143545 에 기재된 접근법은 다중특이적 항체의 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄의 헤테로다이머화를 지지하는데 이용된다. 본원에서 보고된 바와 같은 상기 다중특이적 항체의 한 구현예에서, 양 중쇄의 CH3 도메인에서 아미노산 개질은 위치 368 및/또는 409 에서 도입된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체의 한 구현예에서, WO 2011/090762 에 기재된 접근법이 다중특이적 항체의 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄의 헤테로다이머화 지지에 이용된다. WO　2011/090762 는 "놉-인투-홀" 기술에 따른 아미노산 개질에 관한 것이다. 본원에서 보고된 바와 같은 상기 CH3 (KiH)-조작된 다중특이적 항체의 한 구현예에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 366 에서의 아미노산 T 는 W 로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 407 에서의 아미노산 Y 는 A 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 본원에서 보고된 바와 같은 상기 CH3(KiH)-조작된 다중특이적 항체의 또 다른 구현예에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 366 에서의 아미노산 T 는 Y 로 대체되고, 다른 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 407 에서의 아미노산 Y 는 T 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

IgG2 이소타입의 본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체의 한 구현예에서, WO 2011/090762 에 기재된 접근법이 다중특이적 항체의 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄의 헤테로다이머화 지지에 이용된다.

본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체의 한 구현예에서, WO 2009/089004 에 기재된 접근법이 다중특이적 항체의 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄의 헤테로다이머화 지지에 이용된다. 본원에서 보고된 바와 같은 상기 다중특이적 항체의 한 구현예에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 392 에서의 아미노산 K 또는 N 이 음전하 아미노산 (하나의 바람직한 구현예에서 E 또는 D, 하나의 바람직한 구현예에서 D) 로 치환되고, 다른 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 399 에서의 아미노산 D, 위치 356 에서의 아미노산 E 또는 D 또는 위치 357 에서의 아미노산 E 는 양전하 아미노산 (하나의 바람직한 구현예에서 K 또는 R 로, 하나의 바람직한 구현예에서 K 로, 하나의 바람직한 구현예에서, 위치 399 또는 356 에서의 아미노산은 K 로 치환됨) 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 하나의 추가 구현예에서, 상술된 치환에 덧붙여, 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 409 에서 아미노산 K 또는 R 은 음전하 아미노산 (하나의 바람직한 구현예에서 E 또는 D, 하나의 바람직한 구현예에서 D) (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정) 로 치환된다. 나아가 하나의 추가 구현에에서, 상술된 치환에 덧붙이거나 또는 대안적으로, 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 439 에서의 아미노산 K 및/또는 위치 370 에서의 아미노산 K 는 음전하 아미노산 (하나의 바람직한 구현예에서 E 또는 D, 하나의 바람직한 구현예에서 D) 으로 서로 독립적으로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체의 한 구현예에서, WO 2007/147901 에 기재된 접근법이 다중특이적 항체의 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄의 헤테로다이머화를 지지하는데 사용된다. 본원에서 보고된 바와 같은 상기 다중특이적 항체의 한 구현예에서, 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 위치 253 에서의 아미노산 K 는 E 로 치환되고, 위치 282 에서의 아미노산 D 는 K 로 치환되고, 위치 322 에서의 아미노산 K 는 D 로 치환되고, 다른 한 중쇄의 CH3 도메인에서 위치 239 에서의 아미노산 D 는 K 로 치환되고, 위치 240 에서의 아미노산 E 는 K 로 치환되고 위치 292 에서의 아미노산 K 는 D 로 치환된다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

본원에서 보고된 바와 같은 다중특이적 항체의 한 구현예에서, WO 2007/110205 에서 기재된 접근법은 다중특이적 항체의 제 1 중쇄 및 제 2 중쇄의 헤테로다이머화를 지지하는데 이용된다.

모든 측면의 한 구현예에서, 및 본원에서 보고된 바와 같은 구현예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 항체이다. 본 발명의 하나의 바람직한 구현예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체이다.

모든 측면의 한 구현예에서, 본원에서 보고된 바와 같이, 항체는 2가 또는 3 가의 항체이다. 한 구현예에서, 항체는 2 가의 항체이다.

모든 측면의 한 구현예에서, 본원에서 보고되는 바와 같이, 다중특이적 항체는 IgG 유형 항체의 불변 도메인 구조를 가진다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 측면의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 인간 서브클래스 IgG1 의 것, 또는 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 인간 서브클래스 IgG1 의 것인 점을 특징으로 한다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 측면의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 인간 서브클래스 IgG2 의 것인 점을 특징으로 한다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 측면의 하나의 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 이 다중특이적 항체가 인간 서브클래스 IgG3 의 것인 점을 특징으로 한다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 측면의 하나의 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 이 다중특이적 항체가 인간 서브클래스 IgG4 의 것 또는 추가적인 돌연변이 S228P 를 갖는 인간 서브클래스 IgG4 의 것인 점을 특징으로 한다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 측면의 한 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 이 다중특이적 항체가 인간 서브클래스 IgG1 의 것 또는 인간 서브클래스 IgG4 의 것인 점을 특징으로 한다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 측면의 한 추가의 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 인간 서브클래스 IgG1 의 것인 점을 특징으로 한다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 본원에서 보고된 바와 같은 모든 측면의 하나의 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 를 갖는 인간 서브클래스 IgG1 의 것인 점을 특징으로 한다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 본원에서 보고된 바와 같은 모든 측면의 하나의 추가 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 S228P 및 L235E 를 갖는 인간 서브클래스 IgG4 의 것인 점을 특징으로 한다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 본원에서 보고된 바와 같은 모든 측면의 한 추가의 구현예에서, 다중특이적 항체는 상기 다중특이적 항체가 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G 를 갖는 인간 서브클래스 IgG4 의 것인 점을 특징으로 한다 (Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정).

모든 측면의 한 구현예에서, 본원에서 보고된 바와 같이, 본원에서 명기된 바와 같은 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 추가적인 C-말단 글리신-리신 디펩티드를 포함한다 (G446 및 K447, Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정). 모든 측면의 한 구현예에서, 본원에서 보고된 바와 같이, 본원에 명기된 바와 같이 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 추가적인 C-말단 글리신 잔기 (G446, Kabat EU 인덱스에 따른 번호지정) 을 포함한다.

한 구현예에서, 항체는 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드 및 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하고,

이때

i) 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이고, 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이거나, 또는

ii) 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 L234A, L235A 를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이고, 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 L234A, L235A 를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이거나, 또는

iii) 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 L234A, L235A, P329G 를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이고, 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 L234A, L235A, P329G 를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이거나, 또는

iv) 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 L234A, L235A, S354C, T366W 를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이고, 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V 를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이거나, 또는

v) 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 L234A, L235A, P329G, S354C, T366W 를 갖는 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이고, 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V 를 갖는 인간 인간 IgG1 Fc-영역 폴리펩티드이거나, 또는

vi) 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이고, 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이거나, 또는

vii) 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E 를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이고, 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E 를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이거나, 또는

viii) 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E, P329G 를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이고, 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E, P329G 를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이거나, 또는

ix) 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E, S354C, T366W 를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이고, 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A, Y407V 를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이거나, 또는

x) 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E, P329G, S354C, T366W 를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이고, 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V 를 갖는 인간 IgG4 Fc-영역 폴리펩티드이다.

이때, 항체는 제 1 의 Fc-영역 폴리펩티드 내 및 제 2 의 Fc-영역 폴리펩티드 내에 하기 돌연변이들의 조합을 포함한다:

i) I253A, H310A, 및 H435A, 또는

ii) H310A, H433A, 및 Y436A, 또는

iii) L251D, L314D, 및 L432D, 또는

iv) i) 내지 iii) 의 조합.

모든 측면의 한 구현예에서, 본원에서 보고된 바와 같은 항체는 효과기 침묵 항체이다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 측면의 한 구현예에서, 항체는 효과기 침묵 항체이고 인간 FcRn 에 결합하지 않는다. 본원에서 보고한 바와 같은 모든 측면의 한 바람직한 구현예에서, 인간 서브클래스 IgG1 의 항체는 양 중쇄에 돌연변이 L234A, L235A, P329G, I253A, H310A 및 H434A 를 갖는다 (Kabat 인덱스에 따른 번호지정).

재조합 방법 및 조성물

항체는 예를 들어, US 4,816,567 에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 제조될 수 있다. 요구 핵산은 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄) 을 인코딩할 수 있다. 추가의 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 가 제공된다. 추가의 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 구현예에서, 숙주 세포는: (1) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL 을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH 를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이것으로 형질전환되었다). 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 하나의 구현예에서, 상기 제공된 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항-[[PRO]] 항체의 제조 방법이 제공된다.

항체의 재조합 제조를 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하고 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다.

항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포에는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들어, 항체는 특히, 글리코실화 및 Fc 효과기 작용이 필요하지 않은 경우에 박테리아에서 제조될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현을 위해서는, 예를 들어, US 5,648,237, US 5,789,199, 및 US 5,840,523 을 참조한다 (또한 E. coli. 에서의 항체 단편의 발현을 설명하는 문헌 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 참조). 발현 후, 항체는 가용성 분획 중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.

원핵생물외에, 사상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 그의 글리코실화 경로가 "인간화된" 진균 및 효모 균주를 포함하여 항체-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이고, 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 가진 항체의 생성을 산출한다. 문헌 Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 를 참조한다.

글리코실화 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해 사용될 수 있는 수많은 배큘로바이러스 균주가 확인되었다.

식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978, 및 US 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 제조하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 설명함) 를 참조한다.

척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 조정된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7); 인간 배아 신장 주 (예를 들어, 문헌 Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어, 문헌 Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주에는 DHFR^- CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 가 포함된다. 항체 제조에 적합한 특정의 포유류 숙주 세포주의 리뷰를 위해서는, 예를 들어, 문헌 Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268 을 참조한다.

특정 구현예

1. 다중특이적 항체의 경쇄 짝짓기의 분석을 위한 다중특이적 항체의 단백질 가수분해 효소를 이용한 제한된 소화의 용도.

2. 다중특이적 항체 내 경쇄 잘못짝짓기의 측정을 위한 다중특이적 항체의 단백질 가수분해 효소를 이용한 제한된 소화의 용도.

3. 다중특이적 항체 생성 포유류 세포의 선택을 위한 재조합 포유류 세포에 의해 생성된 다중특이적 항체의 단백질 가수분해 효소를 이용한 제한된 소화의 용도.

4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 단백질 가수분해 효소는 Lys-C, Asp-N, Arg-C, Glu-C 및 키모트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.

5. 구현예 4 에 있어서, 단백질 가수분해 효소는 Lys-C 인 용도.

6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션은 35 내지 45 분 동안인 용도.

7. 구현예 6 에 있어서, 인큐베이션은 약 40 분 동안인 용도.

8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 단백질 가수분해 효소와 인큐베이션된 다중특이적 항체는 탈글리코실화 다중특이적 항체인 용도.

9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 항체 대 효소의 중량비는 약 1:200 인 용도.

10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 단백질 가수분해 효소와 인큐베이션된 다중특이적 항체는 200 내지 600 ㎍/mL 의 농도를 갖는 용도.

11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 다중특이적 항체는 모노클로날 다중특이적 항체인 용도.

12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 다중특이적 항체는 2 개 이상의 비(非)펩티드성 결합된 경쇄를 포함하는 용도.

13. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 다중특이적 항체는 3 개 이상의 비펩티드성 결합된 폴리펩티드를 포함하는 용도.

14. 다중특이적 항체 내 경쇄 짝짓기의 측정 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법:

b) 단계 a) 에서 제한된 단백질 가수분해 소화에 의해 수득된 단편의 질량을 질량 분석법으로써 동정하는 단계, 및

15. 하기 단계를 포함하는 다중특이적 항체의 경쇄 잘못짝짓기의 측정 방법:

a) 제한된 시간 동안 단백질 가수분해 효소와 다중특이적 항체를 포함하는 샘플의 인큐베이션 단계,

16. 하기 단계를 포함하는, 다중특이적 항체를 생성하는 재조합 포유류 세포의 선택 방법:

a) 제한된 시간 동안 단백질 가수분해 효소와, 다수의 재조합 포유류 세포들 중 재조합 포유류 세포의 클론 집단에 의해 제조된 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을 개별적으로 인큐베이션하는 단계로서, 상기 다수의 세포 모두는 동일한 다중특이적 항체를 생성하는 단계,

b) 단계 a) 에서 제한된 단백질 가수분해 소화에 의해 수득된 단편의 질량을 질량 분석법으로써 동정하는 단계,

c) 단계 b) 의 결과로부터, 각 클론 세포 집단에 대한 다중특이적 항체의 경쇄 잘못짝짓기의 존재를 측정하는 단계, 및

d) 단계 c) 의 결과를 바탕으로 다중특이적 항체를 생성하는 재조합 세포를 선택하는 단계.

17. 구현예 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 단백질 가수분해 효소는 Lys-C, Asp-N, Arg-C, Glu-C 및 키모트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.

18. 구현예 17 에 있어서, 단백질 가수분해 효소는 Lys-C 인 방법.

19. 구현예 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션은 35 내지 45 분 동안인 방법.

20. 구현예 19 에 있어서, 인큐베이션이 약 40 분 동안인 방법.

21. 구현예 14 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 단백질 가수분해 효소와 인큐베이션된 다중특이적 항체는 탈글리코실화 다중특이적 항체인 방법.

22. 구현예 14 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 항체 대 효소의 중량비는 약 1:200 인 방법.

23. 구현예 14 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 단백질 가수분해 효소와 인큐베이션된 다중특이적 항체는 200 내지 600 ㎍/mL 의 농도를 갖는 방법.

24. 구현예 14 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 단계 b) 는 하기인 방법:

b) 단계 a) 의 인큐베이션 혼합물을 탈염하고, 단계 a) 에서 제한된 단백질 가수분해 소화에 의해 수득된 단편의 질량을 질량 분석법으로써 동정하는 단계.

25. 구현예 14 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 다중특이적 항체는 모노클로날 다중특이적 항체인 방법.

26. 구현예 14 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 다중특이적 항체는 2 개 이상의 비펩티드성 결합된 경쇄를 포함하는 방법.

27. 구현예 14 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 다중특이적 항체는 3 개 이상의 비펩티드성 결합된 폴리펩티드를 포함하는 방법.

도면의 설명

도 1 올바르게 어셈블링된 (1) 및 경쇄 잘못짝지어진 (2) 형태의 2가의 이중특이적 항체.

도 2 올바르게 어셈블리된 (1) 및 일부 경쇄 잘못짝지어진 (2, 3, 4, 5) 형태의 4가 이중특이적 항체.

도 3 플라스민 소화된 2가 이중특이적 항체의 IE; 경쇄 1 및 중쇄 1 은 제 1 의 결합 부위를 형성하고, 경쇄 2 및 중쇄 2 는 제 2 의 결합 부위를 형성함; 각 쌍들이 하기의 위치에서 기대될 것이다; A: 경쇄 2 + 중쇄 단편 1, B: 경쇄 1 + 중쇄 1, C: 경쇄 2 + 중쇄 2, D: 경쇄 1 + 중쇄 2.

도 4 플라스민 소화된 2가의 이중특이적 항체의 IE; 경쇄 1 및 중쇄 1 은 제 1 의 결합 부위를 형성하고, 경쇄 2 및 중쇄 2 는 제 2 의 결합 부위를 형성함; 각 쌍들이 하기의 위치에서 기대될 것이다: A: 경쇄 2 + 중쇄 단편 1, B: 경쇄 1 + 중쇄 1, C: 경쇄 2 + 중쇄 2, D: 경쇄 1 + 중쇄 2.

도 5 제한된 Lys-C 소화된 2가의 이중특이적 항체의 IE; 경쇄 1 및 중쇄 1 은 제 1 의 결합 부위를 형성하고, 경쇄 2 및 중쇄 2 는 제 2 의 결합 부위를 형성함; 각 쌍들이 하기의 위치에서 기대될 것이다: A: 경쇄 2 + 중쇄 단편 1, B: 경쇄 1 + 중쇄 1, C: 경쇄 2 + 중쇄 2, D: 경쇄 1 + 중쇄 2.

도 6 4가 이중특이적 항체의 IE; A: 3 배 경쇄 1; B: 올바르게 어셈블링된 항체; C: 3 배 경쇄 2.

도 7 단백질 가수분해 소화된 4가 이중특이적 항체의 단백질 A 친화도 크로마토그래피 통과액에 대한 MS 분석, 0 의 ISCID; A: 올바르게 짝지어진 Fab, B: 잘못짝지어진 Fab.

도 8 단백질 가수분해 소화된 4가 이중특이적 항체의 단백질 A 친화도 크로마토그래피 통과액에 대한 MS 분석, 90 의 ISCID; A: 올바르게 짝지어진 Fab, B: 잘못짝지어진 Fab.

도 9 단백질 가수분해 소화된 4가 이중특이적 항체의 단백질 A 친화도 크로마토그래피 용출액에 대한 MS 분석, 0 의 ISCID; B: 올바르게 짝지어진 Fc-Fab, B: 잘못짝지어진 Fc-Fab.

도 10 단백질 가수분해 소화된 4가 이중특이적 항체의 단백질 A 친화도 크로마토그래피 용출액에 대한 MS 분석, 90 의 ISCID; A: 올바르게 짝지어진 Fc-Fab, B: 잘못짝지어진 Fc-Fab.

도 11 펩신 소화된 4가 이중특이적 항체의 EI.

하기의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 제시되어 있다. 본 발명의 주제에서 벗어나지 않으면서 제시된 절차에 변화를 가할 수 있다고 이해된다.

실시예

재료 & 일반 방법

인간 면역글로불린 경 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반 정보는: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 에 제공되어 있다. 항체 사슬의 아미노산은 위에 정의된 바와 같은 Kabat 에 따른 번호지정 시스템 (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) 에 따라 번호지정되고 호칭된다.

재조합 DNA 기술

Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 DNA 를 조작했다. 분자 생물학 시약을 제조사의 지침에 따라 사용했다.

유전자 합성

요망되는 유전자 분절을 화학적 합성에 의해 만들어진 올리고뉴클레오티드로부터 제조했다. 측면에 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 자리가 있는, 600 - 1800 bp 길이의 유전자 분절을 PCR 증폭을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰에 의해 조립하고, 후속적으로 명시된 제한 자리 예를 들어 KpnI/ SacI 또는 AscI/PacI 를 통해 pPCRScript (Stratagene) 기반 pGA4 클로닝 벡터 내에 클로닝했다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 유전자 합성 단편을 Geneart (Regensburg, Germany) 에서 제공된 설명서에 따라 정리했다.

DNA 서열 확인

DNA 서열을 MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany) 또는 SequiServe GmbH (Vaterstetten, Germany) 에서 수행된 이중 가닥 서열분석에 의해 확인했다.

DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이타 관리

GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) 의 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 Infomax 의 Vector NT1 Advance 묶음 버전 8.0 을 서열 생성, 지도화, 분석, 주석달기 및 설명에 사용했다.

발현 벡터

기재된 항체의 발현을 위해, CMV-Intron A 프로모터를 포함 또는 불포함하는 cDNA 조직화 또는 CMV 프로모터를 포함하는 게놈 조직화에 기초하는 일시적 발현 (예를 들어 HEK293 EBNA 또는 HEK293-F) 세포를 위한 발현 플라스미드의 변이체를 적용했다.

항체 발현 카세트 외에도 벡터는 하기를 함유했다:

- 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 복제 원점, 및

- 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 β-락타마제 유전자.

항체 유전자의 전사 단위체는 하기 요소들로 구성되었다:

- 5' 말단에서 독특한 제한 자리(들),

- 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 조기 인핸서 및 프로모터,

- cDNA 조직화의 경우에 그에 뒤이어 Intron A 서열,

- 인간 항체 유전자의 5'-미번역 영역,

- 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 면역글로불린 엑손-인트론 조직화에 의한 게놈 조직화로서 또는 cDNA 로서 인간 항체 사슬 (야생형 또는 도메인 교환을 포함함)

- 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 3' 미번역 영역, 및

- 3' 말단에서 독특한 제한 자리(들).

아래 기재된 바와 같은 항체 사슬을 포함하는 융합 유전자를 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 생성했고 알려진 재조합 방법 및 기술에 의해 해당하는 핵산 분절을 예를 들어 각각의 벡터 내의 독특한 제한 자리를 사용하여 연결하여 조립했다. 서브클로닝된 핵산 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 일시적 트랜스펙션을 위해, 형질전환된 대장균 배양물로부터의 플라스미드 제조에 의해 더 많은 양의 플라스미드를 제조했다 (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

세포 배양 기술

Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. 및 Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc 에 기재된 바와 같은 표준 세포 배양 기술을 사용했다.

아래 기재된 바와 같이 부착하여 성장하는 HEK293-EBNA 에서 또는 현탁액에서 성장하는 HEK29-F 세포에서 각각의 발현 플라스미드의 일시적 코-트랜스펙션에 의해 다중특이적 항체를 발현시켰다.

HEK293-EBNA 시스템에서의 일시적 트랜스펙션

10% 초저 IgG FCS (태아 송아지 혈청, Gibco®), 2 mM L-글루타민 (Gibco®), 및 250 ㎍/ml 게네티신 (Gibco®) 으로 보충된 DMEM (둘베코 변형 이글 배지, Gibco®) 에서 배양된 부착하여 성장하는 HEK293-EBNA 세포 (엡스타인 바 바이러스 핵 항원을 발현하는 인간 배아 신장 세포주 293; 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 기탁 번호 ATCC # CRL-10852, Lot. 959 218) 에서 각각의 발현 플라스미드 (예를 들어 중 및 수식된 중쇄, 뿐만 아니라 상응하는 경 및 수식된 경쇄를 인코딩함) 의 일시적 코-트랜스펙션에 의해 다중특이적 항체를 발현시켰다. 트랜스펙션을 위해 FuGENE™ 6 트랜스펙션 시약 (Roche Molecular Biochemicals) 을 4:1 (3:1 내지 6:1 범위) 의 FuGENE™ 시약 (㎕) 대 DNA (㎍) 의 비율로 사용했다. 각각 1:2 내지 2:1 범위의 1:1 (등몰) 의 (수식된 및 야생형) 경쇄 및 중쇄 인코딩 플라스미드의 몰비를 사용하여 각각의 플라스미드로부터 단백질을 발현시켰다. Day 3 에 세포에 L-글루타민 ~ 4 mM, 글루코스 [Sigma] 및 NAA [Gibco®] 를 공급했다. 트랜스펙션 후 day 5 로부터 11 까지 원심분리에 의해 다중특이적 항체 함유 세포 배양물 상청액을 수확하고 -20℃ 에서 저장했다. 예를 들어 HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반 정보가 Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203 에 제공되어 있다.

HEK293-F 시스템에서의 일시적 트랜스펙션

HEK293-F 시스템 (Invitrogen) 을 제조사의 지침에 따라 사용하여 각각의 플라스미드 (예를 들어 중 및 수식된 중쇄, 뿐만 아니라 상응하는 경 및 수식된 경쇄를 인코딩함) 에 의한 일시적 트랜스펙션에 의해 다중특이적 항체를 생성했다. 간략히, 셰이크 플라스크 내의 또는 교반 발효조 내의 무혈청 FreeStyle™ 293 발현 배지 (Invitrogen) 에서 현탁액 중에서 성장하는 HEK293-F 세포 (Invitrogen) 를 4 가지 발현 플라스미드 및 293펙틴™ 또는 펙틴 (Invitrogen) 의 믹스로 트랜스펙션했다. 2 L 셰이크 플라스크 (Corning) 의 경우에 HEK293-F 세포를 600 mL 중 1.0E*6 세포/mL 의 밀도로 시딩하고, 120 rpm, 8% CO₂ 에서 인큐베이션했다. 그 다음날 세포를 약 1.5E*6 세포/mL 의 세포 밀도에서 A) 20 mL Opti-MEM (Invitrogen) + 600 ㎍ 총 플라스미드 DNA (1 ㎍/mL) (각각 중 또는 수식된 중쇄, 및 상응하는 경쇄를 인코딩함, 등몰비) 및 B) 20 ml Opti-MEM + 1.2 mL 293 펙틴 또는 펙틴 (2 ㎕/mL) 의 약 42 mL 믹스로 트랜스펙션했다. 발효 과정 동안 글루코스 소모에 따라 글루코스 용액을 첨가했다. 분비된 항체를 함유하는 상청액을 5-10 days 후에 수확했고, 항체를 바로 상청액으로부터 정제하거나 또는 상청액을 동결 및 저장했다.

단백질 확인

Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423 에 따른 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 확인함으로써 정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를 확인했다.

상청액 중 항체 농도 확인

Protein A 아가로스-비드 (Roche) 를 사용하는 면역침전에 의해 세포 배양물 상청액 중 항체 및 유도체의 농도를 추정했다. 60 ㎕ Protein A 아가로스 비드를 TBS-NP40 (50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet-P40) 중에서 3 회 세정했다. 후속적으로, 1-15 mL 세포 배양물 상청액을 TBS-NP40 중에서 예비-평형시킨 Protein A 아가로스 비드에 적용했다. 1 hour 동안 실온에서 인큐베이션 후에 비드를 Ultrafree-MC-필터 칼럼 (Amicon) 상에서 0.5 mL TBS-NP40 로 1 회, 0.5 mL 2x 포스페이트 완충 식염수 (2xPBS, Roche) 로 2 회 및 간략히 0.5 mL 100 mM Na-시트레이트 pH 5,0 로 4 회 세정했다. 결합된 항체를 35 ㎕ NuPAGE® LDS 샘플 완충액 (Invitrogen) 의 첨가에 의해 용출시켰다. 샘플의 절반을 각각 NuPAGE® 샘플 환원제와 조합하거나 미환원 상태로 놔두었고, 10 min 동안 70℃ 에서 가열했다. 결과적으로, 5-30 ㎕ 를 4-12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen) (비환원 SDS-PAGE 의 경우에 MOPS 완충액 및 환원 SDS-PAGE 의 경우에 NuPAGE® 항산화제 러닝 완충액 첨가제 (Invitrogen) 함유 MES 완충액) 에 적용하고 쿠마시 블루로 염색했다.

세포 배양물 상청액 중 항체 및 유도체의 농도를 친화도 HPLC 크로마토그래피에 의해 정량적으로 측정했다. 간략히, Protein A 에 결합하는 항체 및 유도체를 함유하는 세포 배양물 상청액을 Agilent HPLC 1100 시스템 상의 200 mM KH₂PO₄, 100 mM 소듐 시트레이트, pH 7.4 중 Applied Biosystems Poros A/20 칼럼에 적용하고, 매트릭스로부터 200 mM NaCl, 100 mM 시트르산, pH 2,5 으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 면적을 적분에 의해 정량화했다. 정제된 표준 IgG1 항체가 표준으로서의 역할을 했다.

대안적으로, 세포 배양물 상청액 중 항체 및 유도체의 농도를 Sandwich-IgG-ELISA 에 의해 측정했다. 간략히, StreptaWell High Bind Streptavidin A-96 웰 마이크로티터 플레이트 (Roche) 를 1 hour 동안 실온에서 또는 대안적으로 밤새 4℃ 에서 100 ㎕/웰 비오티닐화된 항-인간 IgG 포획 분자 F(ab')2<h-Fcγ> BI (Dianova) 로 0.1 ㎍/mL 로 코팅하고 후속적으로 200 ㎕/웰 PBS, 0.05% Tween (PBST, Sigma) 로 3 회 세정했다. 100 ㎕/웰 의 각각의 항체 함유 세포 배양물 상청액의 PBS (Sigma) 중 희석 시리즈를 웰에 첨가하고 1-2 hour 동안 마이크로티터플레이트 셰이커에서 실온에서 인큐베이션했다. 웰을 200 ㎕/웰 PBST 로 3 회 세정하고, 결합된 항체를 1-2 시간 동안 마이크로티터플레이트 셰이커에서 실온에서 탐지 항체로서 0.1 ㎍/mL 의 100 ㎕ F(ab')2<hFcγ>POD (Dianova) 를 사용하여 탐지했다. 미결합 탐지 항체를 200 ㎕/웰 PBST 로 3 회 세정해내고, 결합된 탐지 항체를 100 ㎕ ABTS/웰의 첨가에 의해 탐지했다. 흡광도의 확인을 Tecan Fluor 분광계에서 405 nm 의 측정 파장 (참조 파장 492 nm) 에서 수행했다.

단백질 정제

표준 프로토콜을 참조하여 여과된 세포 배양물 상청액으로부터 단백질을 정제했다. 간략히, 항체를 Protein A Sepharose 칼럼 (GE healthcare) 에 적용하고 PBS 로 세정했다. 항체의 용출을 pH 2.8 에서 그에 뒤이어 샘플의 즉시 중화에 의해 달성했다. PBS 중 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl pH 6.0 중 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200, GE Healthcare) 에 의해 단량체성 항체로부터 응집된 단백질을 분리했다. 단량체성 항체 분획을 모으고, 예를 들어, MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO) 원심 농축기를 사용하여 농축하고 (요구되는 경우에), -20℃ 또는 -80℃ 에서 동결 및 저장했다. 샘플의 일부를 예를 들어 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 또는 질량 분석법에 의하는 후속적 단백질 분석학 및 분석적 특성분석에 제공했다.

SDS-PAGE

NuPAGE® Pre-Cast 겔 시스템 (Invitrogen) 을 제조사의 지침에 따라 사용했다. 특히, 10% 또는 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast 겔 (pH 6.4) 및 NuPAGE® MES (환원된 겔, NuPAGE® 항산화제 러닝 완충액 첨가제 함유) 또는 MOPS (환원되지 않은 겔) 러닝 완충액을 사용했다.

분석적 크기 배제 크로마토그래피

항체의 응집 및 올리고머 상태의 확인을 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행했다. 간략히, Protein A 정제된 항체를 Agilent HPLC 1100 시스템 상의 300 mM NaCl, 50 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄, pH 7.5 중 Tosoh TSKgel G3000SW 칼럼에 또는 Dionex HPLC-시스템 상의 2 x PBS 중 Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare) 에 적용했다. 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 면적의 적분에 의해 정량화했다. BioRad 겔 여과 표준 151-1901 이 표준으로서의 역할을 했다.

실시예 1

제한된 단백질 가수분해 소화 후 다중특이적 항체의 경쇄 잘못짝짓기의 측정 방법

예상된 1차 구조를, 제한된 LysC 소화되어진 CrossMabs 의 전기분무 이온화 질량 분석법 (ESI-MS) 로써 분석했다. 유리하게, 항체는 미리 탈글리코실화하였다.

VH/VL CrossMabs 를, 1 ㎎/㎖ 의 단백질 농도에서, 100: 1 의 항체:효소 비로, 포스페이트 또는 Tris 또는 히스티딘 완충액 중 N-글리코시다제 F 로 37℃ 에서 17 h 이하 동안 탈글리코실화했다. 제한된 Lys-C (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 소화를, 37℃ 에서 40 min 동안 Tris 완충액 pH 8 중 100 ㎍ 탈글리코실화된 VH/VL CrossMabs 으로 수행했다.

질량 분석법에 앞서 샘플을 Sephadex G25 컬럼 (GE Healthcare) 에서 HPLC 를 통해 탈염했다.

총 질량을 TriVersa NanoMate source (Advion) 이 장착된 maXis 4G UHR-QTOF MS 시스템 (Bruker Daltonik) 에서 ESI-MS 를 통해 확인했다.

실시예 2

4가 이중특이적 항체의 경쇄 잘못짝짓기의 측정 방법

4가 이중특이적 항체를, 1 ㎎/㎖ 의 단백질 농도에서, 100 : 1 의 항체:효소 비로, 포스페이트 또는 Tris 또는 히스티딘 완충액 중 N-글리코시다제 F 로 37℃ 에서 17 h 이하 동안 탈글리코실화했다. 제한된 Lys-C (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 소화를, 약 0.9 mg/mL 의 단백질 농도에서, 50 : 1 의 항체: 효소비로, 100 mM 시트레이트 완충액 pH 3.7 중 37℃ 에서 16 시간 동안 100 ㎍ 탈글리코실화된 4가 이중특이적 항체로 수행했다.

Claims

다중특이적 항체의 경쇄 짝짓기 분석을 위한, 다중특이적 항체의 단백질 가수분해 효소로의 제한된 소화의 용도.
다중특이적 항체 내 경쇄 잘못짝짓기의 측정을 위한, 다중특이적 항체의 단백질 가수분해 효소로의 제한된 소화의 용도.
다중특이적 항체 생성 포유류 세포의 선택을 위한, 재조합 포유류 세포에 의해 생성된 다중특이적 항체의 단백질 가수분해 효소로의 제한된 소화의 용도.
하기의 단계를 포함하는, 다중특이적 항체 내 경쇄 짝짓기의 측정 방법:
a) 제한된 시간 동안 단백질 가수분해 효소와 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을 인큐베이션하는 단계,
b) 단계 a) 에서 제한된 단백질 가수분해 소화에 의해 수득된 단편의 질량을 질량 분석법으로써 동정하는 단계, 및
c) 단계 b) 에서의 결과로부터 다중특이적 항체의 경쇄 짝짓기를 측정하는 단계.
하기의 단계를 포함하는, 다중특이적 항체의 경쇄 잘못짝짓기의 측정 방법:
a) 제한된 시간 동안 단백질 가수분해 효소와 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을 인큐베이션하는 단계,
b) 단계 a) 에서 제한된 단백질 가수분해 소화에 의해 수득된 단편의 질량을 질량 분석법으로써 동정하는 단계, 및
c) 단계 b) 에서의 결과로부터 다중특이적 항체의 경쇄 짝짓기를 측정하고, 이로써 경쇄 잘못짝짓기를 측정하는 단계.
하기의 단계를 포함하는, 다중특이적 항체 생성 재조합 포유류 세포의 선택 방법:
a) 제한된 시간 동안 단백질 가수분해 효소와 다수의 재조합 포유류 세포들 중 재조합 포유류 세포의 클론 집단에 의해 생성된 다중특이적 항체를 포함하는 샘플을 개별적으로 인큐베이션하는 단계로서, 상기 다수의 모든 세포는 동일한 다중특이적 항체를 생성하는 단계,
b) 단계 a) 에서 제한된 단백질 가수분해 소화에 의해 수득된 단편의 질량을 질량 분석법으로써 동정하는 단계,
c) 단계 b) 에서의 결과로부터 각 클론 세포 집단에 있어서의 다중특이적 항체의 경쇄 잘못짝짓기의 존재를 측정하는 단계, 및
d) 단계 c) 에서의 결과를 바탕으로, 다중특이적 항체 생성 재조합 세포를 선택하는 단계.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 가수분해 효소가 Lys-C, Asp-N, Arg-C, Glu-C 및 키모트립신으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도 또는 방법.
제 7 항에 있어서, 단백질 가수분해 효소가 Lys-C 인, 용도 또는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션이 35 내지 45 분 동안인, 용도 또는 방법.
제 9 항에 있어서, 인큐베이션이 약 40 분 동안인, 용도 또는 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 가수분해 효소와 인큐베이션된 다중특이적 항체가 탈글리코실화된 다중특이적 항체인, 용도 또는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 대 효소의 중량비가 약 1 : 200 인, 용도 또는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 가수분해 효소와 인큐베이션된 다중특이적 항체가 200 내지 600 ㎍/mL 의 농도를 갖는, 용도 또는 방법.
제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b) 가 하기인, 방법:
b) 단계 a) 의 인큐베이션 혼합물을 탈염하고, 단계 a) 에서 제한된 단백질 가수분해 소화에 의해 수득된 단편의 질량을 질량 분석법으로써 동정하는 단계.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체가 모노클로날 다중특이적 항체인, 용도 또는 방법.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체가 2 개 이상의 비펩티드성 결합된 경쇄를 포함하는, 용도 또는 방법.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체가 3 개 이상의 비펩티드성 결합된 폴리펩티드를 포함하는, 용도 또는 방법.