KR20160138699A

KR20160138699A - 액적 기반의 형광 편광 면역분석을 이용한 단백질의 검출 및 정량 방법

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Publication number: KR20160138699A
Application number: KR1020150072880A
Authority: KR
Inventors: 김학용; 최재원; 민경미; 김길중; 이지후; 김규완
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2015-05-26
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2016-12-06

Abstract

본 발명은 액적 기반 미세유체시스템(droplet-based microfluidics)을 바탕으로 형광 편광 면역분석법을 이용하여 혼합물 시료 내에 존재하는 특정 단백질을 검출 및 정량하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 검출 및 정량 방법은, 종래기술과 비교하여 최소 1,000 배 이상 시료 요구량을 줄일 수 있으며, 별도의 시료 고정, 세척 및 분리 과정이 요구되지 않기 때문에 단백질의 변성을 방지할 수 있는 동시에 단시간 안에 분석이 가능한 장점이 있다. 또한, 최소 1,000 배 이상 시료 요구량을 줄이더라도 종래 기술과 같은 수준으로 단백질의 검출 및 정량 분석이 가능하여, 훨씬 경제적으로 혈액, 소변, 눈물, 타액, 체액, 식품 등의 혼합물 시료를 분석할 수 있으므로 질병 진단, 식품 품질 분석 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

액적 기반의 형광 편광 면역분석을 이용한 단백질의 검출 및 정량 방법{Method for detection and quantitation of protein using droplet-based fluorescence polarization immunoassay}

본 발명은 액적 기반 미세유체 시스템을 바탕으로 형광 편광 면역분석법을 이용하여 적은양의 혼합물 시료 내에 존재하는 특정 단백질을 검출 및 정량하는 방법에 관한 것이다.

다양한 질병의 진단 또는 식품의 품질 분석 등에 이용하기 위하여 혈액, 소변, 눈물, 타액, 체액, 식품 등과 같은 혼합물 시료로부터 그 안에 포함되어 있는 특정 단백질(또는 단백질 바이오마커)의 존재 유무를 판단할 수 있게 하는 기술들이 개발되고 있다. 혼합물 내 특정 단백질의 존재 유무 판단 및 정량적 분석을 위한 대표적인 종래기술로는 면역크로마토그래피(immunochromatographic assay) 및 효소면역검출법(ELISA) 등의 방법이 있다. 하지만 이러한 방법의 경우 검출한계도(limit of detection)가 낮으며 정량적 분석이 어렵고, 분석을 위해 수 백 마이크로리터 이상의 많은 시료양이 요구되는 등의 단점이 있다. 또한, 질량분석기(mass spectrometry)를 이용한 특정 단백질의 검출 및 정량 방법도 널리 이용되고 있지만, 일반적으로 갖추기 힘든 값비싼 장비를 필요로 하고, 많은 시료양이 요구되며 별도의 시료 전처리 과정을 필요로 하는 등 여러 문제점이 나타나고 있다. 이러한 종래기술들의 단점을 해결하기 위해 최근 단백질 마이크로어레이(protein microarray) 및 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 등의 기술들이 특정 단백질의 검출 및 정량에 이용되고 있다. 하지만 이러한 기술들도 시료의 고정, 세척, 최종 분석을 위한 분리 단계가 요구되기 때문에, 각 단계에서 특정 단백질이 본래의 특징과는 다르게 변성될 수 있으며 검출 및 정량을 위해 시간이 많이 요구되는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 종래기술의 대표적 단점이라고 할 수 있는 검출한계도, 분석을 위해 요구되는 많은 시료양, 특정 단백질의 변성, 긴 분석 시간 소모 등의 문제를 해결하기 위하여, 액적 기반 미세유체시스템(droplet-based microfluidics)을 이용하여 미세액적 내 형광 비등방성(fluorescence anisotropy) 분석을 통해 적은 양(1 나노리터 미만)의 혼합물 시료 내에 존재하는 특정 단백질을 초고속으로 검출 및 정량할 수 있는 방법을 개발하였다.

대한민국 등록특허공보 제10-1356279호

본 발명의 목적은 액적 기반 미세유체 시스템(droplet-based microfluidics)을 이용하여 적은 양의 혼합물 시료 내에 존재하는 특정 단백질을 별도의 시료 전처리과정, 시료의 고정, 세척 및 분리 과정 없이 초고속으로 검출 및 정량할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, (1) 검출 대상 단백질에 형광물질을 표지하는 단계; (2) 형광물질을 표지한 단백질과 그에 대한 항체를 액적 기반 미세유체 시스템에 주입한 후 미세액적 내 형광 편광도를 측정 및 분석하는 단계; (3) 형광물질이 표지되지 않은 검출 대상 단백질을 상기 형광물질을 표지한 단백질 및 그에 대한 항체와 함께 액적 기반 미세유체 시스템에 주입한 후 미세액적 내 형광 편광도를 측정 및 분석하여 검출 대상 단백질의 정량을 위한 표준곡선을 준비하는 단계; 및 (4) 혼합물 시료를 상기 (3)단계의 형광물질을 표지한 단백질 및 그에 대한 항체와 함께 액적 기반 미세유체 시스템에 주입한 후 미세액적 내 형광 편광도를 측정한 후 상기 (3)단계의 표준곡선과 비교하는 단계를 포함하는 혼합물 시료 내 단백질의 검출 및 정량방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세액적(microdroplet)은 액적 기반 미세유체 시스템에 주입된 오일 유동(oil flow)에 상기 단백질 및 항체가 접촉하여 형성된다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광 편광도 측정단계는 상기 미세액적으로부터 방사되는 형광의 수평 밝기와 수직 밝기를 동시에 측정한 후 이들의 관계식에 대입하여 형광 편광 값을 측정하는 것이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광 편광도를 측정하는 단계는, 편광 필터를 통해 레이저에서 방사되는 편광을 상기 액적에 조사하고, 상기 액적으로부터 방사되는 빛에 대하여 형광을 필터링하는 단계; 편광 분할기를 통해 상기 형광 필터에 의해 필터링된 빛에 대하여 편광을 선별하는 단계; 및 상기 편광 분할기에 의해 선별된 편광에 기초하여 형광 편광도를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광 편광도를 측정하는 단계는, 편광 필터를 통해 상기 레이저에서 방사되는 빛을 편광 필터링하는 단계; 수직 편광 필터를 통해 상기 편광 분할기에 의해 선별된 편광에 대하여 수직 방향의 편광을 필터링하는 단계; 및 수평 편광 필터를 통해 상기 편광 분할기에 의해 선별된 편광에 대하여 수평 방향의 편광을 필터링하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 액적 기반 미세유체 시스템은 공압형(pneumatic) 마이크로펌프를 포함하는 미세유체 장치일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 액적 기반 미세유체 시스템은, 미세유체 채널(microfluidic channel) 및 플렉시블 PDMS 막(flexible PDMS membrane)을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질 및 항체를 액적-기반 미세유체 시스템에 주입하는 단계는 초기에 단백질 및 항체를 로딩(loading)시킨 후, 플렉시블 PDMS 막에 음압을 가하여 상기 막에 지속적인 양압을 가하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 액적 기반 미세유체 시스템은, 형광물질이 표지된 단백질 및 형광물질이 표지되지 않은 단백질을 흘려 주입하는 시료 주입구; 상기 단백질에 대한 항체를 흘려 주입하는 시료 주입구; 시료와 섞이지 않는 다른 상 물질인 오일을 흘려 주입하는 오일 주입구; 상기 시료 및 오일에 기초하여 액적을 형성하는 액적 형성부; 및 형성된 액적으로부터 방사되는 형광의 편광도를 측정하는 형광 편광 측정부를 포함하는 액적 기반 미세유체 장치일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 액적 형성부는, 상기 시료 주입구 및 상기 오일 주입구를 통해 주입되는 유체의 흐름 및/또는 주입속도를 조절하여 형성되는 상기 액적의 크기를 조절 및 유지할 수 있다.

본 발명의 단백질 검출 및 정량 방법은, 종래기술과 비교하여 최소 1,000 배 이상 시료 요구량을 줄일 수 있으며, 별도의 시료 전처리 과정, 고정, 세척 및 분리 과정이 요구되지 않기 때문에 단백질의 변성을 방지할 수 있는 동시에 단시간 안에 분석이 가능한 장점이 있다. 또한, 최소 1,000 배 이상 시료 요구량을 줄이더라도 종래 기술과 같은 수준으로 단백질의 검출 및 정량 분석이 가능하여, 훨씬 경제적으로 혈액, 소변, 눈물, 타액, 체액, 식품 등의 혼합물 시료를 분석할 수 있으므로 질병 진단, 식품 품질 분석 등에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 단백질을 빠르게 검출 및 정량하기 위하여 공압식 마이크로펌프를 이용한 액적 기반 형광 편광 면역분석(droplet-based fluorescence polarization immunoassay, dFPIA) 시스템을 나타낸 것이다. 우유에 존재하는 소 엔지오제닌(bANG)을 검출함으로써, dFPIA 시스템의 모델로 이용하였다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 미세액적 내 단백질 바이오마커 검출 및 정량 방법에 대한 모식도이다.
도 3a는 혼합물 내 존재하는 단백질 바이오마커 정량을 위한 표준곡선을 얻는 단계로, 형광물질이 표지되지 않은 단백질(형광물질이 표지된 단백질과 항체의 같은 부위에 결합하는 경쟁자)농도에 대한 형광 편광도의 그래프이다.
도 3b는 도 3a로부터 높은 포화도를 보이는 구간(좌측)및 낮은 포화도를 보이는 구간(우측)을 보이는 농도 범위를 제외하여 형광물질이 표지되지 않은 단백질의 농도에 따라 실제 형광 편광도가 변화되는 구간에 대한 그래프이다.
도 4a는 혼합물의 첨가 전과 후에 따라 형광 편광도를 측정하여 특정 단백질의 존재 유무를 판별하는 원리에 대한 모식도이다.
도 4b는 특정 단백질의 정량분석을 위한 과정으로, 특정 단백질이 포함되어 있는 혼합물의 농도에 따른 형광 편광도 변화에 대한 모식도이다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

실험재료 및 방법

<1-1> 실험재료

PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4)는 Amresco사(Solon, OH, USA)에서, BSA (bovine serum albumin)는 GenDEPOT사(Barker, TX, USA)에서, Fluorinert FC-40, 미네랄 오일 및 FITC (fluorescein isothiocyanate)는 Sigma-Aldrich사(St.Louis, MO, USA)에서, ABIL EM 90 계면활성제(surfactant)는 Evonik Industries AG사(Essen, Germany)에서, Alexa Fluor 488 단백질 표지(labelling) 키트는 Life Technologies사(Carlsbad, CA, USA)에서, PD-10 desalting column은 GE Healthcare사(Wauwatosa, WI, USA)에서, PDMS (Polydimethylsiloxane, Sylgard 184 silicone elastomer kit)는 Dow Corning사(Midland, MI, USA)에서, Teflon AF 1600은 DuPont사(Wilmington, DE, USA)에서 각각 구입하였다.

<1-2> 단백질 시료의 준비

pET-angiogenin 플라스미드를 보유한 Escherichia coli 균주 Rosetta (DE3)pLysS 를 사용하여 소의 엔지오제닌(bovine angiogenin, bANG)을 발현시켰다. 구체적인 발현 및 정제 방법은 공지의 방법을 이용하였다(Jang S.H., et al. 2004. Biotechnol. Lett. 26, 15011504). Alexa Fluor 488 (AF488) 단백질 표지(labelling) 키트를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 bANG에 Alexa Fluor 488 (AF488)을 표지하였다. 항-소 엔지오제닌(anti-bovine angiogenin) 항체(anti-bANG Ab)를 위한 혈청은 AbClon사(서울, 대한민국)에서 입수하였다. AbClon사의 bANG-결합 아가로스 비드(bANG-conjugated agarose beads)를 사용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 항-소 엔지오제닌 항체(anti-bANG Ab)를 정제하였다. 컬럼(column)을 PBS(pH 7.4)로 세척하고, 0.1M 글리신(glycine)(pH 2.8)을 사용하여 항체를 용출시켰다. pH를 증가시키기 위해 1M TrisHCl (pH 8.0)을 함유한 튜브에 각각의 분획물을 수집하였다. 버퍼를 교환하기 위해 수집된 분획물들을 PBS에 투석하였다. 젖소(청주, 대한민국)로부터 원유(raw cow's milk) 시료를 얻었으며, 원심분리(5000g,4 ℃, 10분)를 통해 원유로부터 지방을 제거하여 엔지오제닌 정량을 위한 표준 시료를 준비하였다.

<1-3> 미세유체 장치( microfluidic device )의 제작

시린지 펌프-기반 액적 미세유체시스템(syringe pump-based droplet microfluidics)과 관련된 불필요하게 발생하는 데드 볼륨(dead volume)을 줄이기 위하여 공압형(pneumatic) 마이크로펌프가 장착된 새로운 미세유체 장치를 제작하였다. 이 미세유체 장치는 3개의 층(PDMS channel, glass, 및 flexible PDMS membrane)으로 구성되어 있다(도 1). 최상층은 PDMS 내에 구성되어 있으며 액적(droplet) 생성을 위한 미세유체 채널(microfluidic channel)을 갖고 있다. 이것은 PDMS 프리폴리머(pre-polymer)와 양생제(curing agent) (Dow Corning사, Midland, MI, USA)의 10:1중량비 혼합물을 패턴화된 실리콘 웨이퍼(patterned Si-wafer) (LG Siltron사, 구미, 대한민국)에 부어서 만들었다. 열판에서 70℃로 2시간 동안 양생시킨 후, PDMS 지지층(substrate)을 마스터에서 벗기고, 1.5mm 직경의 펀치로 주입구/방출구(inlet/outlet holes)를 뚫었다. 액체 챔버(liquid chamber)를 나타내는 중간층은 유리 슬라이드(Matsunani, Tokyo,Japan)를 사용하여 제작하였다. MAXNC milling machine(Gilbert사, AZ, USA)을 사용하여 유리층에 8mm 직경의 구멍을 뚫었다. 바닥층은 유체의 구동(actuation)을 위한 플렉시블 PDMS 막(flexible PDMS membrane)을 나타낸다. 이것은 PDMS 프리폴리머와 양생제의 10:1(w/w) 혼합물을 테플론(teflon)이 코팅된 층에 스핀코팅(750rpm, 50s)하여 제작하였다. 그 후 전체 제작물을 열판에서 90℃로 15분간 가열하였다. 상기 세 개의 층은 산소 플라즈마를 처리하여 결합시켰다. 결합 후, 2mm 직경의 폴리우레탄 튜브(SMC사, Nobles-ville, IN, USA)를 미세유체 장치의 주입구에 삽입하고, 200 μL 피펫 팁을 방출구에 삽입하였다.

<1-4> 미세유체 장치의 작동원리

상기 미세유체 장치는 수성(aqueous) 샘플과 오일을 미세액적이 생성되는 지점으로 전달하는 두 개의 액체 챔버와 하나의 방출구로 구성된다. 각각의 액체 챔버에 30 μL의 수성 샘플을 넣고, 내부 압력 조정기(in-house pressure controller)를 사용하여 얇은 PDMS 막에 음압(negative pressure) (-70 kPa)을 가한 후, 각각의 액체 챔버 아래에서 얇은 PDMS 막에 양압(positive pressure) (5kPa)을 가하였다. 상기 PDMS 막은 미세유체 채널 내에서 액체를 이동시키는 동시에 각각의 주입구를 막는다. 그 과정에서 방출구에 가해진 음압에 의해 오일은 미세유체 채널 내로 흐르며 액적이 형성된다.

<1-5> 광학기구

형광 편광 측정에 사용되는 광학기구들은 이미 공지되어 있는 것을 사용하였다(Choi, J.W. et al., 2012a. Anal. Chem.84, 38493854 및 Choi, K. et al., 2012b. Annu. Rev. Anal. Chem.5, 413440). 간략하게, 형광 편광 시스템은 488nm 다이오드 레이져(diode laser) (10mW, World Star Tech사, Canada), 도립형광현미경(inverted fluorescence microscope) (IX71, Olympus사, Japan), Alexa Fluor 488용 필터 규브 세트(filter cube set) (FITC-3540B, Semrock사, USA), 이중 편광 시스템(dual polarization system), 및 EM- CCD (electron multiplying-charge coupled device, Princeton Instruments사, USA)로 이루어져 있다. 상기 시스템을 이용하여 분할된 유동(segmented flow) 또는 미세액적(microdroplet) 내에 포함된 시료로부터 나온 편광된 형광 방출을 측정할 수 있다. 모든 EM-CCD 이미지들은 WinSpec/32 (PrincetonInstruments, Trenton사, NJ, USA)을 이용하여 얻었다.

< 실시예 2>

공압식 마이크로펌프를 장착한 액적 -기반 미세유체 장치의 작동

본 발명의 액적 기반 형광 편광 면역분석법(droplet-based fluorescence polarization immunoassay, dFPIA)을 이용하여 우유에 있는 소 엔지오제닌(bANG)의 검출 및 정량을 초기 1nL 액적 내에서 수행하였다. 구체적으로, 형광물질이 표지되지 않은 소 엔지오제닌과 Alexa Fluor 488 형광물질이 표지된(labelled) 소 엔지오제닌(AF488-bANG) 사이의 항-엔지오제닌 항체(anti-bANGAb)에 대한 경쟁적 억제(competitive inhibition)를 분석하였다. 경쟁적 억제 표준곡선(competitive inhibition standard curve)을 이용하여 우유 내 존재하는 소 엔지오제닌에 대한 검출 및 정량을 수행하였다. dFPIA 측정에 사용된 미세유체 시스템은 도 1과 같다. 마이크로펌프는 두 개의 다른 수성 및 오일 상(phase)을 액적이 형성되는 마이크로채널 T-교차점(microchannel T-junction)으로 보내는데 사용된다. 상기 장치의 효과를 실험하기 위하여, 2% ABIL EM 90을 포함하는 미네랄 오일을 연속상으로 사용하고, FITC (80 μM) 및 PBS(pH 7.4) 내 소 혈청 알부민(0.1mg/mL)을 분산상(discrete phase)으로 사용하여 미세액적을 만들었다. 플렉시블 PDMS 막에 -70kPa의 음압을 가하여 초기에는 각각의 상 30 μL을 좌측 및 우측 챔버에 로딩하였다. 이어서, 5kPa의 지속적인 양압을 상기 막에 가하여 유체를 마이크로채널로 이동시키고, 동시에 각각의 주입구를 닫았다. 도 2는 FITC 및 PBS 용액의 1:1 부피비를 이용한 T-교차점(junction)에서의 단순분산(monodisperse) 액적의 형성을 보여준다.

< 실시예 3>

액적 -기반 형광 편광 면역분석

이어서 형광물질이 표지되지 않은 bANG에 의한 AF488-bANG과 anti-bANG Ab 사이의 상호작용의 경쟁적 억제를 조사하였다. 표지되지 않은 bANG을 AF488-bANG/anti-bANGAb에 대한 경쟁적 억제자(competitive inhibitor)로 사용하였다. 형광물질이 표지되지 않은 bANG은 AF488-bANG의 경쟁자로 작용하므로 그 농도가 증가함에 따라 형광 편광이 감소하였다. 이러한 원리에 따라, 우유 내 존재하는 bANG이 형광물질이 표지되지 않은 bANG과 같은 역할을 하기 때문에, 우유의 농도가 증가할수록 우유 내 bANG의 농도는 증가하여 형광 편광은 감소한다. 이러한 경향을 정량화하기 위해, 30 μL의 오프-칩 혼합된(off-chip mixed) AF488-bANG과 표지되지 않은 bANG을 좌측 샘플 주입구를 통해 로딩하고, 30 μL의 anti-bANG Ab을 우측 주입구를 통해 로딩하였다(도 1 참조). 이 실험에서 표지되지 않은 bANG의 최종농도는 15nM AF488-bANG 및 70nM anti-bANG Ab의 고정된 최종농도에 대해 0.49 ~ 2000nM의 범위로 다양하게 하였다. 모든 실험에서, 5kPa의 양압에 대해 -70 kPa의 음압을 사용한 결과 5Hz에서 1 nL의 미세액적이 생성되었다.

액적 기반의 미세유체 시스템에서 경쟁적 억제자 측정(competitive inhibition assay)을 위한 형광 편광(P) 값은 다음 수학식 1을 이용하여 수직형광강도(

) 및 수평형광강도(

)로부터 계산되었다:

<수학식 1>

상기 식에서

는 수직형광강도(vertical fluorescence intensity)를,

는 수평형광강도(horizontal fluorescence intensity)를 의미한다.

AF488-bANG와 anti-bANG Ab 사이의 상호작용에 따른 편광의 변화는 다음 수학식 2의 함수에 의해 구하였다:

<수학식 2>

상기 식에서

는 표지되지 않은 bANG을 포함하지 않는 경쟁적 억제 곡선으로부터 얻은 최대 형광 편광 값을,

은 표지되지 않은 bANG을 최대 농도로 포함하는 경쟁적 억제 곡선으로부터 얻은 최소 형광 편광 값을,

은 표지되지 않은 bANG의 최대 억제 농도값의 절반을 의미한다.

도 3은 표지되지 않은 bANG을 사용한 경쟁적 억제 커브를 보여준다. 실험 데이터의 비선형 least-sqaures fit을 통해 도출된

값은 51.37 ± 2.85 nM,

는 0.96 ± 0.01 mP,

은 0.04 ± 0.01 mP 이다(

= 0.99 및 power(p) = 1.3).

< 실시예 4>

본 발명의 dFPIA 시스템을 이용한 우유 내 소 엔지오제닌의 정량

고처리량(high-throughput)의 바이오마커 측정을 위하여 본 발명의 실험방법을 확장시키기 위해, 표지되지 않은 bANG 대신 우유에 의한 AF488-bANG 및 anti-bANG Ab 사이의 상호작용의 저해를 측정하였다. 30 μL 의 오프-칩(off-chip) 혼합된 AF488-bANG 및 우유를 좌측 샘플 주입구를 통해 로딩하고, 30 μL 의 anti-bANG Ab를 우측 샘플 주입구를 통해 로딩하였다(도 1 참조). 상기 우유 샘플은 15nM AF488-bANG 및 70nM anti-bANG Ab의 고정된 최종 농도에 적합한 정량점(quantitation point)을 찾기 위해 연속적으로 희석하였다. 표 1은 각각의 희석된 우유 샘플에 대한 경쟁적 억제의 표준화된 FP 값을 나타낸다.

이러한 분석으로부터, 본 발명자들은 bANG의 정량을 위해 우유의 4배부터 16배까지의 희석점(dilution points)의 형광 편광 값을 선택하고 평균을 내었다. 이는 위 구간이 도 3b에 나타낸 경쟁적 억제 곡선의 선형 영역에 위치하기 때문이다. dFPIA에 의해 우유로부터 bANG을 정량하기 위해, 본 발명자들은 이전에 공지된 분석 모델을 사용하였다(Jung, J.W., et al. 2009. Biosens. Bioelectron. 24, 14691473). 상기 공지된 이종(heterogeneous) 단백질 마이크로어레이 방법을 사용하여 사람 혈장 내 CRP (C-reactive protein)를 정량하였다. 표준화된 형광 편광 값(y)을 수학식 3으로 나타내었다:

<수학식 3>

상기 식에서 Px는

의 표지되지 않은 bANG을 포함하는 경쟁적 저해 곡선으로부터 얻은 형광 편광 값이다. 우유 내 bANG의 농도는 다음 수학식 4에 의해 결정될 수 있다:

<수학식 4>

상기 식에서 X는 우유 내 bANG 농도,

는 최대 표준화된 형광 편광 값의 절반에서의 bANG 농도,

은 최소 표준화된 형광 편광 값,

는 최대 표준화된 형광 편광 값, y는 우유의 표준화된 형광 편광 값, p는 파워(power) 값이다. 기 설정된 방정식에서,

및

값은 각각 0.04 및 0.96이었으며, p 값은 1.3이었다.

상기 방법을 이용하여 우유에서 dFPIA 플랫폼을 사용하여 1nL 시료 내 존재하는 bANG을 성공적으로 검출 및 정량할 수 있었다. dFPIA를 사용하여 우유 내 bANG의 농도를 4.84 ± 1.21 μg/mL으로 측정하였으며, 이는 종래기술이며 dFPIA 플랫폼보다 200,000배 많은 200 μL의 시료양을 요구하는 벌크(bulk) FPIA 측정 결과인 4.03 ± 0.51 μg/mL에 비교된다. 또한 위 결과들은 이미 공지된 우유의 bANG 농도에 비교된다(Chang, S.I., et al. 1997. Biochem. Biophys. Res. Commun.232, 323327 및 Rustam'ian, Iu. L., et al. 1999. Prikl. Biokhimiia Mikrobiol. 35, 105108). 표 2는 ELISA 및 FPIA를 각각 사용하여 우유로부터 bANG을 정량한 결과를 비교한 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 방법으로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

(1) 검출 대상 단백질에 형광물질을 표지하는 단계;
(2) 형광물질을 표지한 단백질과 그에 대한 항체를 액적-기반 미세유체 시스템에 주입한 후 미세액적 내 형광 편광도를 측정 및 분석하는 단계;
(3) 형광물질이 표지되지 않은 검출 대상 단백질을 상기 형광물질을 표지한 단백질 및 그에 대한 항체와 함께 액적 기반 미세유체 시스템에 주입한 후 미세액적 내 형광 편광도를 측정 및 분석하여 검출 대상 단백질의 정량을 위한 표준곡선을 준비하는 단계; 및
(4) 혼합물 시료를 상기 (3)단계의 형광물질을 표지한 단백질 및 그에 대한 항체와 함께 액적 기반 미세유체 시스템에 주입한 후 미세액적 내 형광 편광도를 측정한 후 상기 (3)단계의 표준곡선과 비교하는 단계를 포함하는, 혼합물 시료 내 단백질의 검출 및 정량방법.
제1항에 있어서,
상기 미세액적은 액적-기반 미세유체 시스템에 주입된 오일 유동(oil flow)에 상기 단백질 및 항체가 접촉하여 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 형광 편광도 측정단계는 상기 미세액적으로부터 방사되는 형광의 수평 강도와 수직 강도를 동시에 측정하여 형광 편광 값을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 형광 편광도를 측정하는 단계는,
편광 필터를 통해 레이저에서 방사되는 편광을 상기 액적에 조사하고, 상기 액적으로부터 방사되는 빛에 대하여 형광 필터링하는 단계;
편광 분할기를 통해 상기 형광 필터에 의해 필터링된 빛에 대하여 편광을 선별하는 단계; 및
상기 편광 분할기에 의해 선별된 편광에 기초하여 형광 편광도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서,
상기 형광 편광도를 측정하는 단계는,
편광 필터를 통해 상기 레이저에서 방사되는 빛을 편광 필터링하는 단계;
수직 편광 필터를 통해 상기 편광 분할기에 의해 선별된 편광에 대하여 수직 방향의 편광을 필터링하는 단계; 및
수평 편광 필터를 통해 상기 편광 분할기에 의해 선별된 편광에 대하여 수평 방향의 편광을 필터링하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 액적-기반 미세유체 시스템은 공압형(pneumatic) 마이크로펌프를 포함하는 미세유체 장치인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 액적 기반 미세유체 시스템은, 미세유체 채널(microfluidic channel) 및 플렉시블 PDMS 막(flexible PDMS membrane)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,
상기 단백질 및 항체를 액적 기반 미세유체 시스템에 주입하는 단계는 초기에 단백질 및 항체를 로딩(loading)시킨 후, 플렉시블 PDMS 막에 음압을 가하여 상기 막에 지속적인 양압을 가하는 것을 특징을 하는 방법.