KR20160128714A

KR20160128714A - 피부 성체줄기세포 분화 지연용 조성물, 상기 조성물을 이용한 피부 성체줄기세포 분화 지연 방법 및 키트

Info

Publication number: KR20160128714A
Application number: KR1020150060492A
Authority: KR
Inventors: 최혜령
Original assignee: (주)에스테위즈
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2016-11-08
Also published as: KR101699354B1

Abstract

본 발명에 따른 피부 성체줄기세포의 분화 조절용 조성물은 3개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하며, 이 조성물을 세포 배양시 첨가하면 세포의 인테그린 발현 증가를 통한 피부 성체줄기세포의 분화를 조절할 수 있다. 본 발명의 피부 성체줄기세포 분화 조절 방법은 피부세포의 분화 속도를 조절하고, 줄기세포능을 유지함으로써 피부세포의 증식능을 장기간 유지시킬 수 있다.

Description

피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물, 상기 조성물을 이용한 피부 성체줄기세포 분화 조절 방법 및 키트{COMPOSITION, METHOD AND KIT FOR REGULATING DIFFERENTIATION OF SKIN ADULT STEM CELL}

본 발명은 피부 성체줄기세포의 분화 조절용 조성물 및 이를 이용한 분화 조절 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 작은 크기의 펩타이드를 유효성분으로 하는 조성물을 이용하여 세포의 인테그린 발현 증가를 통해 피부 성체줄기세포의 분화를 조절하는 방법에 관한 것이다.

성체줄기세포에 관한 연구는 배아줄기세포가 가지고 있는 세포치료제로서의 윤리적인 문제를 해결하면서 환자 본인의 세포를 이용하고자 하는 데서 출발하였다.

그러나 성체줄기세포의 분리과정, 체외배양과정, 세포주입 과정 중에 사용되는 여러 물질로 인한 안전성의 문제들이 여전히 존재한다. 또한, 이러한 문제들 외에도 반복되는 계대 배양으로 인하여 줄기세포로서의 고유한 특성 즉, 줄기 세포능을 잃고 분화된 세포로 그 특성이 변하게 된다는 문제가 있다. 그러므로 도출된 연구결과가 줄기세포로부터 나온 것이라고 확신할 수 없기 때문에, 실제 활용되었을 때 어떠한 효과가 나타날지 예상하기 어렵다.

상기 문제점들로 인하여 연구자들은 줄기세포의 분화를 조절할 수 있는 방법과 기전에 관심을 갖게 되었다. 줄기세포의 분화를 조절할 수 있다면 해당 줄기세포나 그 줄기세포를 이용한 장기를 인공적으로 배양하여 신규 물질이나 제품의 안전성과 효능 실험 등을 효과적으로 수행할 수 있다. 이는 동물들을 대상으로 실험하거나 일반인이나 환자들을 대상으로 임상실험 하는데 들어가는 시간과 비용을 줄일 수 있음을 의미한다.

한편, 피부는 표피와 진피로 이루어져 있으며, 표피는 각질형성세포가 대부분을 차지하는 중층 편평 상피로서 진피로부터 기저층, 유극층, 과립층, 각질층 순의 4개 층으로 이루어져 있으며, 피부의 각질형성세포는 사람으로부터 가장 쉽게 얻을 수 있는 성체줄기세포로서, 각질형성세포의 분열이 일어난 후 각질형성 세포는 피부의 표면으로 이동하면서 여러 단계의 분화과정을 거치게 되는데, 피부의 성체줄기세포는 이러한 과정을 통하여 피부재생에 기여한다. 따라서, 피부 성체줄기세포의 줄기세포능을 조절할 수 있다면 피부의 재생능력을 오래 유지할 수 있으며, 피부를 보다 건강하게 만들 수 있을 것이다.

피부 성체줄기세포를 포함하는 성체줄기세포의 분화 조절에 관한 기존 기술은 세포미세환경의 조절이나 약물의 사용 등에 의존하고 있고, 작은 크기의 펩타이드를 이용하는 방법에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 제4형 콜라겐에 대한 부착능에 따라 피부의 성체줄기세포와 분화세포를 분리할 수 있는 방법을 개발한 바 있으며(대한민국특허 출원공개 10-2006-0016540호) [Kim DS, Cho HJ, Choi HR, Kwon SB, Park KC: Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents. Cellular and molecular life sciences, 2004 Nov;61(21):2774-81], 상기 방법에 따라 분리한 피부 성체줄기세포와 분화세포를 이용하여 성체줄기세포의 분화를 조절하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 작은 크기의 펩타이드를 유효성분으로 하는 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물 및 이를 이용한 피부 성체줄기세포 분화 조절 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 3개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 3개의 아미노산이 알라닌-시스테인-글루타민(Ala-Cys-Glu)으로 이루어질 수 있다.

또한, 상기 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물은 세포에서 인테그린의 발현을 증가시킬 수 있다.

또한, 상기 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물은 인테그린 β1 과 인테그린 α6의 발현을 증가시킬 수 있다.

또한, 상기 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물은 세포에서 p63의 발현을 증가시킬 수 있다.

또한, 상기 펩타이드의 농도는 0.01 μg/ml 내지 1 mg/ml일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 피부 성체줄기세포 배양시 첨가하여 피부 성체줄기세포의 분화를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 피부 성체줄기세포 분화 조절 방법에 있어서, 피부 성체줄기세포의 분화는 조성물의 농도에 의존적으로 인테그린의 발현이 증가하는 특성을 가질 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물을 포함하는 피부 성체줄기세포 분화 조절용 키트를 제공한다.

3개의 아미노산으로 구성된 작은 크기의 펩타이드, 바람직하게는 알라닌-시스테인-글루타민(Ala-Cys-Glu, 이하 'ACQ'로 약칭할 수 있음)을 유효성분으로 하는 본 발명의 조성물은 피부세포의 분화시 분화 속도를 조절하고, 줄기세포능을 유지시켜서 피부세포의 증식능을 오래 지속시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물을 이용한 피부 성체줄기세포 분화 조절 방법은 피부성체줄기세포의 증식 분화와 관련된 다양한 연구에 활용될 수 있다.

도 1은 웨스턴 블랏 방법을 이용하여 ACQ 처리에 의한 각질형성세포에서의 인테그린 발현 증가를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 2는 헤마톡실린 및 에오신 염색을 이용하여 ACQ 처리에 따른 삼차원 인공피부모델에서의 표피 두께의 변화를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 3은 면역조직화학 염색을 이용하여 ACQ 처리에 따른 삼차원 인공피부모델에서의 p63과 α6 인테그린의 발현 증가를 관찰한 결과를 나타낸다.

이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물 및 이를 이용한 분화조절 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물은 3개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 실시예에 따르면, 상기 3개의 아미노산이 알라닌-시스테인-글루타민(Ala-Cys-Glu)일 수 있다(이하 'ACQ'로 약칭할 수 있음).

본 발명에서, 피부 성체줄기세포는 동물의 피부, 바람직하게는 사람의 피부, 더욱 바람직하게는 사람의 표피 또는 모발 등을 형성할 수 있는 세포를 의미한다. 피부 줄기세포는 각질형성세포, 피지선 또는 모발 등으로 분화될 수 있다.

피부 각질형성세포는 사람으로부터 가장 쉽게 얻을 수 있는 성체줄기세포로서, 줄기세포능을 잘 유지하기 위해서는 줄기세포가 위치하는 공간, 즉 니치(stem cell niche)가 적절하게 유지되어야 한다.

피부 성체줄기세포는 기저막 바로 위에 존재하므로 피부 성체줄기세포와 관련하여 중요한 기저막 구성 단백질 중 하나인 제4형 콜라겐이 잘 발현되어야 한다.

제4형 콜라겐은, 동물, 바람직하게는 사람에게서 유래한 제4형 콜라겐으로서, 화학적 또는 생물학적으로 합성하거나 직접 인체로부터 분리된 것일 수 있다. 제4형 콜라겐은 라미닌과 함께, 피부와 점막의 기저막을 이루는 주요한 구성성분으로 알려져 있다.

본 발명자들의 연구에 따르면 배양한 각질형성세포에 상기 펩타이드를 처리한 결과 인테그린의 발현이 크게 증가하는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명에 따른 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물은 세포 배양시 인테그린의 발현을 증가시킬 수 있으며, 특히 β1 인테그린과 α6 인테그린의 발현을 증가시킬 수 있다.

인테그린(intergrin)은 세포 표면에 존재하는 피브로넥틴, 콜라겐 등의 세포외 기질에 세포가 접착할 때 작용하는 세포외 기질 수용체 분자로서, 세포의 상호작용, 면역, 지혈 등에 관여하기도 한다.

β1 인테그린(integrin β1)과 α6 인테그린(integrin α6)은 피부 성체줄기세포가 니치 구조에 잘 붙어 있을 수 있도록 기저막 단백질과 결합할 수 있는 기질 수용체이다. β1 인테그린(integrin β1)과 α6 인테그린(integrin α6)의 발현 증가는 기저막 상태의 개선을 의미하며, 피부 성체줄기세포로서의 줄기세포능을 잘 유지하고 있음을 의미한다.

또한, 상기 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물은 세포에서 p63의 발현을 증가시킬 수 있다. p63은 피부 성체줄기세포의 표식자를 나타내며, p63의 발현 증가는 피부 성체줄기세포의 줄기세포능을 잘 유지하고 있음을 의미한다.

상기 조성물 내 펩타이드의 농도는 0.001 μg/ml 내지 1 mg/ml일 수 있으며, 바람직하게는 0.01 μg/ml 내지 0.1 mg/ml, 보다 바람직하게는 0.01 μg/ml 내지 0.01 mg/ml일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 조성물을 피부 성체줄기세포 배양시 첨가하여 피부 성체줄기세포의 분화를 조절할 수 있다. 이때, 피부 성체줄기세포의 분화는 조성물의 농도에 따라 달라지는 농도 의존적 특성을 가질 수 있으며, 농도에 비례하여 인테그린 발현량이 증가할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물은 피부 성체줄기세포 분화 조절용 키트로도 활용될 수 있다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

< 제조예 1> 삼차원 인공피부 모델의 제조

< 제조예 1-1> 섬유아세포와 각질형성세포의 배양

각질형성세포와 섬유아세포는 어린아이의 포경수술을 통하여 얻어진 포피에서 분리하고, 피부조직에서 잔여 피하지방을 제거한 후 잘게 절개하여 서몰리신(thermolysin) 용액으로 처리하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응시킨 조직을 핀셋을 이용하여 표피와 진피로 분리하고, 각각의 조직을 트립신(trypsin) 용액에 담가 37℃에서 15분간 반응 후, 단일 세포로 분리되도록 진탕한 후에, '레인왈드 및 그린'의 방법(Rheinwald JG, Green H: Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells, Cell. 1975 Nov; 6(3):331-4)에 따라 배양하였다.

분리한 각질형성세포는 각질형성세포 성장 배지(Clonetics KGM BulletKit, Lonza, Walkersville, MD, USA)에서 배양하였고, 섬유모세포는 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Welgene, Daegu, Republic of Korea)를 사용하여 37℃ 배양기에서 7 일 내지 10일간 배양하였다.

< 제조예 1-2> 진피 대용물의 제조

쥐꼬리로부터 분리 채취한 힘줄(tendon)을 4℃의 1:1000 빙초산(glacial acetic acid) 희석액 1 리터에 48시간 동안 교반하여 녹인 제1형 콜라겐 용액, 10 x DMEM 및 완충액(0.05 N NaOH, 0.26 mM NaHCO₃ 및 200 mM HEPES)을 8:1:1의 부피비로 혼합하여, 콜라겐 기질을 제조하였다. 이와 같이 얻어진 콜라겐 기질 3.5 mL 당 섬유아세포 오십만 개를 첨가하여 혼합하였다. 이후 상기 혼합액을 30 mm의 밀리셀(millicell, Millipore, Billerica, MA, USA)에 3.5 mL씩 넣어 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 굳혀서 진피 대용물을 제조하였다.

< 제조예 1-3> 삼차원 인공피부모델의 제조

제조예 1-2에서 제조된 진피 대용물 위에 제조예 1-1에서 배양한 각질형성세포를 뿌리고, 하루 동안 배지 침지시켜 배양한 후, 12일간 공기에 노출된 상태로 배양하여 삼차원 인공피부모델을 제조하였다.

이때, 배양 온도는 37℃로 하였고, 침지 배지는 5% FBS, 0.4 mg/mL 하이드로코르티손, 1 mM 이소프로테레놀, 25 mg/mL 아스코르빈산 및 5 mg/mL 인슐린이 포함된 DMEM 배지와, 함스 영양 혼합물 F12(Ham's nutrient mixture F12)을 3:1의 비율로 혼합한 혼합 용액에 저농도 EGF(Epidermal Growth Factor, Invitrogen, 1 ng/mL)를 첨가하여 사용하였으며, 공기 노출 배양 배지는 5% FBS, 0.4 mg/mL 하이드로코르티손, 1 mM 이소프로테레놀, 25 mg/mL 아스코르빈산 및 5 mg/mL 인슐린이 포함된 DMEM 배지와, 함스 영양 혼합물 F12(Ham's nutrient mixture F12)를 3:1의 비율로 혼합한 혼합 용액에 고농도 EGF(10 ng/mL)를 첨가하였다. 배지는 일주일에 3회 교환하였다.

< 실시예 1 내지 2> ACQ 의 처리를 통한 피부 성체 줄기세포의 분화 조절

상기 제조예 1에서 제조한 삼차원 인공피부모델을 이용하여 ACQ가 하기 표 1과 같은 농도로 포함된 배양 배지를 사용하여 피부 성체줄기세포의 분화 유도하였다. 구체적으로, ACQ는 상기 제조예 1-3의 공기 노출 배양을 시작하면서 배양 배지에 첨가하기 시작하였고, 배지를 교환할 때마다 ACQ가 첨가된 배양 배지를 사용하여 12일간 배양하였으며, 이 실험은 3회 반복 실시하였다.

	ACQ 처리 농도(μg/ml)
실시예 1	0.1
실시예 2	1
비교예	-

< 실험예 1> 웨스턴 블랏 방법을 통한 β1 인테그린과 α6 인테그린의 발현 확인

웨스턴 블랏(Western blot)은 항체-항원 반응을 이용하여 여러 단백질의 혼합물로부터 특정 단백질을 찾아내는 방법이다. 상기 실시예에 따른 삼차 인공피부모델 조직에 대한 ACQ의 효과를 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏 방법을 이용하여 β1 인테그린과 α6 인테그린의 발현을 확인하였다.

웨스턴 블랏 방법에 있어서, 1차 항체로 α6 인테그린(#sc-6597 from Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)과 β1 인테그린(#sc-9970 from Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 사용하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1의 결과에서 ACQ를 처리하지 않은 비교예보다 1 μg/ml의 ACQ를 처리한 실시예 2에서 β1 인테그린과 α6 인테그린의 발현이 현저하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 2> 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 통한 인공 피부 생성 능력 확인

헤마톡실린 및 에오신 염색은 검푸른 색을 내는 헤마톡실린(hematoxylin)과 붉은 색을 내는 에오신(eosin)의 두 염료를 이용하여 세포핵은 검푸르게 염색시키고, 대부분의 세포질 성분은 분홍색 또는 붉은색으로 염색시켜 핵과 세포질을 쉽게 구별할 수 있게 하는 실험 방법이다. 상기 실시예에서 얻어진 삼차원 인공피부 모델 조직에 대한 ACQ의 효과를 확인하기 위하여 H&E 염색을 하였다.

상기 실시예에서 얻어진 삼차원 인공피부 모델을 카르노이스 용액(Carnoy's solution, ethanol/chloroform/acetic acid 6:3:1)으로 세포 고정한 후 파라핀 블록으로 제조하고, 헤마톡실린과 에오신 염료를 사용하여 염색하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2의 결과에서 ACQ를 처리하지 않은 비교예에 비해 ACQ를 처리한 실시예에서 표피의 두께가 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 3> 면역조직화학 염색을 통한 p63 및 α6 인테그린 발현의 확인

면역조직화학적 검사란 항원과 항체 간의 반응을 이용하여 세포나 조직 내에 존재하는 물질을 확인하는 면역염색법으로 상기 실시예에서 얻어진 삼차원 인공피부 모델 조직의 p63 및 α6 인테그린의 발현을 알아보기 위하여 실시하였다.

p63는 피부에서 줄기세포 표식자로 알려져 있으며, α6 인테그린은 피부 성체 줄기세포가 기저막 구조 단백질들과 결합할 수 있게 해주는 세포외 부착 수용체이다.

면역조직화학 염색은 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합 기법(avidin-biotin-peroxidase complex techniques)를 사용하여 수행하였으며, 1차 항체로서 p63(#sc-8431 from Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), α6 인테그린(#sc-6597 from Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3의 결과에서 ACQ를 처리하지 않은 비교예 보다 ACQ를 처리한 실시예에서 p63와 α6 인테그린의 염색이 농도에 비례하여 증가한 것을 확인할 수 있었다.

전술한 실시예 및 실험예의 결과로 알 수 있듯이 ACQ를 처리한 실시예의 인공피부모델을 ACQ로 처리하지 않은 비교예의 인공피부모델과 비교하였을 때, ACQ를 첨가하면 피부 성체줄기세포의 분화가 지연되어 피부 성체줄기세포가 니치에 결합할 수 있게 해주는 인테그린의 발현이 증가함에 따라 줄기세포능이 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

3개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 3개의 아미노산이 알라닌-시스테인-글루타민(Ala-Cys-Glu)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 분화 조절용 조성물은 세포 배양시 인테그린의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 분화 조절용 조성물은 세포 배양시 β1 인테그린과 α6 인테그린의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 분화 조절용 조성물은 세포 배양시 p63의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 펩타이드의 농도는 0.01 μg/ml 내지 1 mg/ml인 것을 특징으로 하는 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 조성물을 피부 성체줄기세포 배양시 첨가하는 것을 특징으로 하는 피부 성체줄기세포의 분화를 조절하는 방법.
제 7항에 있어서,
상기 성체줄기세포 분화를 조절하는 방법은 상기 분화 조절용 조성물의 농도에 의존적으로 인테그린의 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 피부 성체줄기세포 분화를 조절하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 피부 성체줄기세포 분화 조절용 조성물을 포함하는 피부 성체줄기세포 분화 조절용 키트.