KR20160123085A - Drp1 발현 정도의 측정을 이용한 당뇨병의 진단용 키트 및 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 디나민 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도를 측정하여 당뇨병을 진단하는 데 사용되는 키트와, 당뇨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 디나민 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도를 측정하여 당뇨병을 특이적이고 신속하게 진단할 수 있고, 나아가서는 향후 적절한 치료를 계획할 수 있어 국민 건강 수준을 보다 드높일 수 있다.

Description

Drp1 발현 정도의 측정을 이용한 통한 당뇨병의 진단용 키트 및 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법{Kit for diagnosis of diabetic disease by using Drp1 expression analysis and the method for providing information for diagnosis of diabetic disease}

본 발명은 디나민 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도를 측정하여 당뇨병을 진단하는 데 사용될 수 있는 키트와, 당뇨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

인플라마좀(inflammasomes)은 카스파제-1-활성화 복합 단백질 복합체로, 1) 감각 단백질(sensor protein)인 NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3), 2) 연결 단백질(adaptor protein)인 ASC(adaptor protein apoptosis-associated spec-like protein containing a caspase-recruitment domain) 및 3) 이펙터 단백질인 프로카스파제-1으로 구성된다. 상기한 인플라마좀 구성 성분들은 미생물의 감염이나 조직의 상해가 발생한 경우에 조립되는데, 시토졸에서 조립에 의해 활성화된 인플라마좀은 카스파제-1을 활성화시켜 인터루킨(IL)-1β 또는 인터루킨-18을 분비하여 숙주의 선천면역 방어기능을 수행한다(Schroder K, Tschopp J, Cell 140:821-832(2010); Franchi L, Munoz-Planillo R, Nunex, Nat Immunol 13:325-332(2012)).

반면 과도한 NLRP3 인플라마좀 신호가 제2형 당뇨병 및 동맥경화 등과 같은 대사성 질환이나 알츠하이머 등의 퇴행성 신경질환의 발병을 촉진할 수 있다고 알려졌다(Henao-Mejia J, Elinav Em Thaiss CA, Flavell RA(2014) Inflammasomes and metabolic disease. Annu Rev Physiol 76:57-78; Wen H, Ting JP, O’Neil LA(2012) A role for the NLRP3 inflammasome in metabolic diseases-did Warburg miss inflammation? Nat Immunol 13:352-357.). 그러나 불활성화된 NLRP3 형태가 어떻게 활성화된 형태로 전환되는지, 혹은 상기 불활성화된 NLRP3가 어떻게 다양한 자극에 의하여 인플라마좀 복합체로 조립되는 지는 아직 명확히 규명되지 않고 있다.

최근 들어 NLRP3 인플라마좀의 활성을 조절함에 있어서 미토콘드리아의 역할에 대한 연구의 중요성이 커지고 있다. 손상된 미토콘드리아의 축적은 미토콘드리아 활성 산소종(mitochondrial reactive oxygen species, mROS)을 생성하거나 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)를 시토졸로 방출함으로써 NLRP3 인플라마좀을 활성화시킨다고 보고되었다. 또한, 미토콘드리아는 특정한 세포 환경에서, NLRP3 인플라마좀을 위한 분자적 플랫폼으로 기능할 수 있다; 예를 들어, MAVS(mitochondrial anti-viral signaling protein) 또는 Mfn2(mitofusin 2)와 같은 미토콘드리아 외막 단백질은 바이러스 감염 시 인플라마좀 복합체 조립을 위하여 NLRP3를 소집할 수 있다.

미토콘드리아는 그 사이즈, 형상, mtDNA 자체 및 세포 환원 상태를 조절하기 위하여 계속해서 융합 및 분열을 반복하는 역동적인 소기관이다. 미토콘드리아 역학(mitochondrial dymamics)은 미토콘드리아 분열과 관련된 단백질인 디나민-관련 단백질 1(Drp1) 및 분열 단백질 1(Fis1)과, 융합과 관련된 단백질인 Mfn1, Mfn2 및 시신경 위축 유전자 1(optic atrophy gene 1, Opa1)에 의해 조절된다. 상기한 단백질들의 기능 상실 돌연변이로 인해 유발되는 미토콘드리아 역학 불균형은 에너지 생산, 세포 증식과 같은 미토콘드리아 또는 세포 기능에 장애를 초래할 뿐만 아니라, 파키슨병 또는 알츠하이머와 같은 복합적인 질병을 초래할 수 있다.

최근 들어, 미토콘드리아 역학이 선천면역 반응을 조절하는 가능성이 보고되었다: 바이러스 감염 시, Mfn2는 MAVS와의 결합을 통해 MAVS-중재 항바이러스 신호를 방해한다(Yasukawa K, et al. (2009) Mitofusin 2 inhibits mitochondrial antiviral signaling. Sci Signal 2:ra47.). 그러나, 또 다른 연구에서는, Mfn1-의존 방법에서 MAVS 신호를 위하여 미토콘드리아의 길이 신장이 요구된다고 밝혀졌다(Castanier C, Garcin D, Vazquez A, Arnoult D (2010) Mitochondrial dynamics regulate the RIG-I-like receptor antiviral pathway. EMBO Rep 11:133-138; Onoguchi K, et al. (2010) Virus-infection or 5'ppp-RNA activates antiviral signal through redistribution of IPS-1 mediated by MFN1. PLoS Pathog 6:e1001012). 이러한 연구들을 통하여 바이러스 감염 시 미토콘드리아의 융합에 의해 Ⅰ형 인터페론(IFN)이 생성이 증가됨을 알 수 있다. 그러나 인플라마좀 신호에 있어서 미토콘드리아 역학의 역할에 대하여는 아직까지 알려진 바가 없다.

본 발명의 일 목적은 디나민 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도의 측정을 이용한 당뇨병 진단용 키트를 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 디나민 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도를 측정하여 당뇨병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.

종래부터 과도한 NLRP3 인플라마좀의 활성이 제2형 당뇨병을 유발시킨다고 알려져 왔다(Henao-Mejia J et al., Annu Rev Physiol(2014) 76:57-78; Wen H et al., Nat Immunol(2012) 13:352-357.).

한편, 본 발명의 발명자들은 미토콘드리아의 분열과 관련된 디나민 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 억제 시 미토콘드리아의 신장(elongation)이 유도되고, 이는 세포 외 신호 조절 인산화 효소(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)의 활성을 증가시켜 NLRP3(NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3)를 미토콘드리아 내로 위치하게 하며, 최종적으로는 NLRP3 인플라마좀의 생성량을 증가시키는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

구체적으로, 본 발명의 일 구체 예에서, 디나민 단백질 1을 포함하는 당뇨병 진단용 키트를 제공한다. 상기 구체 예에서 상기 디나민 단백질은 당뇨병을 갖는 환자의 혈청 내 항체와 특이적으로 결합할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 구체 예에서, 디나민 단백질 1에 특이적인 항체를 포함하는, 당뇨병 진단용 키트를 제공한다. 상기 구체 예에서, 상기 항체는 당뇨병을 갖는 환자의 혈청 내 디나민 단백질 1과 특이적으로 결합할 수 있다.

본 발명에서, 진단의 대상이 되는 당뇨병의 유형은 특별히 한정하지 않으며, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 또는 당뇨병 전증일 수 있으나, 바람직하게는 제2형 당뇨병일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 당뇨병의 진단에 사용되는 디나민 단백질 1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

또한, 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질액 등을 포함할 수 있다.

여기서, 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광 물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체 예에서, (a) 환자로부터 분리된 시료 내 디나민 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 양을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 디나민 단백질 1의 양을 정상 대조군 시료 내 디나민 단백질 1의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명에서, 진단의 대상이 되는 당뇨병의 유형은 특별히 한정하지 않으며, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 또는 당뇨병 전증일 수 있으나, 바람직하게는 제2형 당뇨병일 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 당뇨병의 진단에 사용되는 디나민 단백질 1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 상기 비교하는 단계에 있어서, 환자로부터 분리된 시료 내 디나민 단백질 1의 양이 정상 대조군 시료의 양보다 저발현된 경우 당뇨병으로 판단하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 디나민 단백질 1의 양의 측정은 디나민 단백질 1의 단량체 또는 중합체의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다.

바람직하게 본 발명은 시료에 상기 디나민 단백질 1에 특이적인 항체를 처리하여, 그 반응 정도를 비교 분석함으로써 대상 시료를 가진 개체의 당뇨병 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 대조군 및 환자 시료군에 디나민 단백질 1에 특이적인 항체를 처리한 후 항원-항체 반응의 반응 수준을 비교할 수 있는데, 본 발명에서 항원-항체 반응 수준이란 시료 중의 상기 단백질 항원과 이를 인지하는 항체 또는 이의 항원결합부위와 결합된 양을 의미하며, 항원-항체 복합체의 양이다.

여기서, 상기 항원-항체의 반응 수준의 측정은 당업계에서 통상적으로 사용되는 측정 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들면, 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역 분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 응집법 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으며, 이 중에서 실험 환경에 따라 적절한 방법을 선택하여 수행할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 상기 단백질 발현 수준 측정은 ELISA법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 신장암의 발병 유무를 진단할 수 있다.

또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기 영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 당뇨병 발병 유무를 확인할 수 있다. 상기 정보 제공 방법은 당뇨병 발병 환자에서 디나민 단백질 1의 발현량과 정상 대조군에서의 상기 단백질의 발현량을 비교하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도)차이로 나타낼 수 있다. 또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역 조직 염색을 실시할 수 있다. 당뇨병 발병 의심 개체의 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 당뇨병의 발병 유무를 진단할 수 있다.

한편, 본 발명에서 용어 “디나민 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)”이란 미토콘드리아 분열 단백질 중 하나로, 포유류 세포(mammalian cells)에서 미토콘드리아의 형상, 크기, 분포 및 유지 등에 중요한 역할을 한다. 최근에는 Drp1이 미토콘드리아 및 퍼옥시좀 단편화, 인산화, 단백질 수모화(SUMOylation), 유비퀴틴화(ubiquitination) 및 세포 사멸 등에 관련된 것으로 보고되었다.

본 발명에서 용어 “항체”란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 디나민 단백질 1에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻한다.

본 발명에서 용어 “시료”란 개체로부터 분리한 전혈, 혈장, 혈액, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포간액과 같은 시료 등을 포함하며, 디나민 단백질 1을 검출할 수 있는 시료이면 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 디나민 단백질 1과 이에 특이적인 항체 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해 정량적으로 측정할 수 있다.

본 발명은 디나민 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 발현 정도를 측정하여 당뇨병을 특이적이고 신속하게 진단할 수 있고, 나아가서는 향후 적절한 치료를 계획할 수 있어 국민 건강 수준을 보다 드높일 수 있다.

도 1은 대조군 생쥐 BMDMs(WT BMDM)과 Drp1-넌타겟팅 shRNA(이하, 'shSCR'로 기재한다.)가 감염된 BMDMs 및 Drp1-타겟팅 shRNA(이하, 'shDrp1'으로 기재한다.)가 감염된 BMDMs에서 Drp1의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 2는 MitoTracker Red로 염색된 shSCR 및 shDrp1 BMDMs의 공초점 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 shSCR 및 shDrp1 BMDMs의 투과형 전자 현미경 사진을 나타낸 것이다(Scale Bars, 5 ㎛, 20,000x 확대.).
도 4는 shSCR 및 shDrp1 BMDMs을 미처리한 경우(Unt), TNF-α 및 CHX로 자극을 가한 경우(TC)와 zVAD-fmk의 존재 하에서 상기 TNF-α 및 CHX로 자극을 가한 경우(TCZ)에 있어서의 LDH(lactated dehydrogenase) 방출 정도(%)와 프로카스파제-3, p17 및 Drp1의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 shSCR 및 shDrp1 BMDMs을 미처리한 경우(Unt)와 LPS(lipopolysaccharide)로 활성화시킨 뒤 니제리신으로 처리한 경우(L+N)에서 LDH 방출 정도(%)를 나타낸 것이다.
도 6은 LPS로 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 활성화한 뒤, ATP(1 또는 2 mM, A; 2.5 mM, B)를 처리한 후 얻어진 배양 상청액(Sup)과 세포 용해물(Lys)을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 LPS로 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 활성화한 뒤, ATP(1 또는 2 mM, A; 2.5 mM, B)를 처리한 후 얻어진 배양 상청액에 대하여 세포 외 IL-1β를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8 및 도 9는 야생형 BMDMs에 mdivi-1(25 μM) 또는 CCCP(1-10 Μm) 전처리의 수행 또는 비수행 후 LPS로 처리 또는 비처리한 뒤 ATP(2.5 mM, 40분간)를 처리한 후 얻어진 배양 상층액 또는 세포 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 LPS로 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 활성화한 뒤 ATP(2.5 mM, 30 분 간)로 처리 후 얻어진 용해물을 안티-ASC 항체를 이용하여 면역 침전시키고, 이 후 면역 침전물 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 LPS로 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 처리 또는 미처리한 뒤 니제리신(5 mM, 45 분 또는 120분 간)으로 처리 후 얻어진 용해물을 안티-ASC 항체를 이용하여 면역 침전시키고, 이 후 면역 침전물 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다. 단, ASC 올리고머 구조는 DSS-중재 가교 결합에 의해 분석하였다.
도 12 및 도 13은 야생형 BMDMs에 CCCP(5 μΜ)의 존재 또는 부재 하에서 LPS로 3시간 동안 처리 또는 미처리한 뒤, ATP(2.5 mM, 30분간) 또는 니제리신(5 μΜ, 30분간)으로 처리한 후 얻어진 용해물을 안티-ASC 항체를 이용하여 면역 침전시키고, 이 후 면역 침전물 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다. 단, NLRP3-ASC 상호작용과 ASC 올리고머화는 상기 도 3A 및 도 3B에서와 동일한 방법으로 분석하였다.
도 14는 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 LPS로 처리 또는 미처리(Unt)한 뒤 ATP(2.5 mM, 30분간)로 처리하고, 세포를 MitoSOX로 염색한 뒤 플로 사이토메트리를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 LPS로 shScr BMDMs, shDrp1 BMDM와 야생형 및 Nlrp3^-/- BMDMs를 활성화한 뒤, ATP(15 또는 30분간, 왼쪽; 30분간, 오른쪽)로 처리한 후 시토졸 mtDNA의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16 및 도 17은 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 LPS로 처리 또는 미처리(Unt)한 뒤 ATP(2.5 mM, 30분간)로 처리하고, MitoTracker Green 및 MitoTracker Red로 공동 염색한 후 플로 사이메트리를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 LPS로 처리 또는 미처리(Unt)한 뒤 ATP(2.5 mM, 10분 또는 30분간)로 처리하고, 세포 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 U0126(10 mM, LPS 처리 전 30분 또는 120분간 전처리)의 존재 또는 부재 하에서 LPS로 처리 또는 미처리한 뒤 ATP(2.5 mM, 10분 또는 30분간)로 처리하고, 배양 상청액 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 야생형 BMDMs에 CCCP(5 μΜ)의 존재 또는 부재 하에서 LPS로 2시간 또는 4시간 동안 처리 또는 미처리한 뒤, ATP로 처리하고, 배양 상청액 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 shScr BMDMs와 shDrp1 BMDMs를 U0126(10 μM, 2시간 전처리)의 존재 또는 부재 하에서 LPS로 처리 또는 미처리한 뒤, 세포 용해물을 미토콘드리아-풍부(Mito) 또는 시토졸(Cyt) 분획으로 분류하고, 각각의 분획 샘플을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 야생형 BMDMs를 U0126(10 μM, 30분간 전처리)의 존재 또는 부재 하에서 LPS로 처리 또는 미처리한 뒤, ATP로 처리하고, 세포 용해물을 안티-ASC 항체를 이용하여 면역 침전시킨 뒤, 면역 침전물 또는 용해물을 면역 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 항체 및 시약

LPS, ATP, 니제리신(nigericin), 사이클로헥시미드(cycloheximide, CHX), CCCP, mdivi-1, U0126 및 Drp1-타켓팅 또는 넌타겟팅 shRNA 렌티바이러스 플라스미드는 Sigma에서 구입하였다. z-VAD-플루오로메틸케톤(zVAD-fmk)는 Bachem으로부터 얻었다. 생쥐 IL-1β 효소 면역 분석(ELISA) 키트는 R&D로부터 얻었다. MitoSOX, MitoTracker Green, MitoTracker Deep Red 및 생쥐 재조합 TNF-α는 Invitrogen에서 구입하였다. 안티-ASC, 안티-포스포-ERK 및 안티-β-액틴 항체는 Santa Cruz(미국, CA, 산타크루즈)로부터 구입하였다. 안티-생쥐 IL-1β 항체는 R&D로부터 얻었다. 안티-생쥐 카스파제-1(p20) 및 안티-NLRP3 항체는 Adipogen으로부터 얻었다. 안티-Drp1 및 안티-JNK1/2 항체는 BD Biosciences(미국, CA, 산디에고)에서, 안티-포스포-JNK1/2 항체는 Invitrogen에서 구입하였으며, 안티-VDAC1 항체는 Abcam에서 얻었다. 인간 IL-1β, 카스파제-3, ERK 및 IκB를 감지하는 모든 항체들은 Cell Signaling(미국, MA, Berverly)에서 얻었다.

실시예 2: 세포 배양(Cell Culture)

C57BL/6 또는 Nlrp3 ^-/- 생쥐로부터 생쥐 골수 유래 대식세포(mouse bone marrow-derived macrophages, BMDMs)를 얻었다(Fernandes-Alnemri T, et al.(2010) The AIMS inflammasome is critical for innate immunity to Francisella turlarensis. Nat Immunol 11:385-393.). 모든 생쥐들을 특정한 무병 조건 하에서 생육하였으며, 동물 실험을 위한 프로토콜은 연세대학교 윤리 위원회로부터 승인을 받았다. Drp1 발현의 넉다운을 위하여, shRNA 넌타겟팅(scrambled) 또는 타겟팅 Drp1을 포함하는 렌티바이러스 입자를 사용하여 생쥐 BMDMs를 감염시켰다. 그 후 shRNA를 안정적으로 발현시키는 세포들을 퓨로마이신 선별에 의해 복제하였고, 모든 BMDMs를 10% FBS와 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 L929-조정 DMEM에서 배양하였다.

실시예 3: 세포 사멸 분석(Cell death Assay)

세포 자기 사멸(apoptotic cell death), 계획성 세포 괴사(necroptotic cell death), 세포 사멸(pyroptotic cell death)을 유도하기 위하여, 세포에 TNF-α(30 ng/ml) 및 사이클로헥시미드(CHX, 0.4 ㎍/ml)와 선택적으로 zVAD-fmk(20 μM)를 20시간 동안 처리하거나, 혹은 세포를 LPS(0.25 ㎍/ml)로 활성화시킨 뒤, 세포에 니제리신(5 μM)을 45분간 처리하였다. 그 후 CytoTox96 비방사성 세포 독성 분석 키트(Promega)를 이용하여 락테이트 디하이드로제네이즈(lactate dehydrogenase, LDH)의 세포 외 방출을 통해 세포 사멸을 확인하였다. LDH 방출률(%)은 [세포 외 LDH/(세포 내 LDH + 세포 외 LDH) X 100]으로 계산하였다.

실시예 4: 면역 블롯 분석( Immunoblot Analysis)

세포를 0.5% Nonidet P-40(NP-40), 50 mM KCl, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA 및 프로테아제 억제제를 포함하는 20 mM HEPES(pH 7.5) 버퍼에 용해시켰다. 수용성 용해물을 SDS-PAGE에 로딩한 뒤, 적절한 항체를 이용하여 면역 분석을 수행하였다. 공동-면역 침전(co-immunoprecipitation) 실험을 위하여, 세포를 0.2% NP-40, 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 0.5 mM EGTA, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제를 포함하는 20 mM HEPES(pH 7.5) 버퍼에 용해시켰다. 이 후 용해물을 단백질 G 세파로즈 4 비즈를 이용하여 정제한 뒤, 안티-ASC 항체를 이용하여 면역 침전시켰다. 비즈에 결합한 단백질들은 적절한 항체를 사용하여 면역 블롯 분석하였다. 모든 블롯들은 최소 3개의 독립된 실험의 대표적 이미지를 나타낸 것이다.

실시예 5: 세포 이하의 분류(Subcellular Fractionation)

세포를 10 mM HEPES(pH 7.), 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.1% NP-40 및 프로테아제 억제제를 포함하는 버퍼에 용해시켰다. 용해물은 700 g의 조건 하에서 10분 동안 원심 분리하였고, 상청액을 12,500 g의 조건 하에서 10분 동안 원심 분리하였다. 최종 얻어진 상청액을 시토졸 분획으로 사용하였다. 펠렛은 0.5% NP-40, 50 mM KCl, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA 및 프로테아제 억제제를 포함하는 10 mM HEPES(pH 7.4) 버퍼에 재현탁시킨 뒤, 12,500 g 조건 하에서 10분 동안 원심 분리하고, 얻어진 상청액을 미토콘드리아-풍부 분획으로 사용하였다.

실시예 6: 미토콘드리아 형상의 관찰

MitoTracker Red(Invitrogen)과 Hoechst 33258(Sigma)을 이용하여 세포를 염색한 뒤, 공초점 현미경(LSM700, Carl Zeiss)을 이용해 분석하였다. 세포를 0.1 M 인산 완충액(pH 7.4)에서 2% 글루타르알데히드-파라포름알데히드를 이용하여 2시간 동안 고정한 뒤, 투과형 전자 현미경(transmission electron microscope, TEM)으로 분석하였다. 세척 후, 세포를 0.1 M 인산 완충액에서 1% OsO₄를 이용하여 2시간 동안 고정(post-fixed)하고, 에탄올(ascending gradual series, 50~100%)을 이용하여 수화하였다. 시료를 Poly/Bed 812 키트(Polysciences, Inc.)에 삽입한 뒤, 70-나노미터-두께의 시료를 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트로 염색하였다. 염색된 시료를 JEM-1011(JEOL) 투과형 전자 현미경을 이용하여 관찰하였다.

실시예 7: NLRP3 인플라마좀 활성 분석(Assay of NLRP3 Inflammasome Activation)

세포를 LPS(0.25 ㎍/ml)를 이용하여 2시간 동안 활성화한 뒤, ATP(1~2.5 Mm, 30~40 분간) 또는 니제리신(2.5 μM, 40 분간)으로 처리하였다. 이 후, 배양 상청액을 침전시키고(Fernandes-Alnemri T, Yu JW, Datta P, Wu Jm Alnemri ES(2009) AIM2 activates the inflammasome and cell death in response to cytoplasmic DNA. Nature 458:509-513.), 안티-카스파제-1 또는 IL-1β 항체를 이용하여 면역 분석을 수행하거나 ELISA를 이용하여 세포 외 1L-1β를 분석하였다. ASC(adaptor protein apoptosis-associated spec-like protein containing a caspase-recruitment domain)의 올리고머화를 확인하기 위하여 디숙시니미딜 수베르산염(DSS)를 이용해 화학적 가교-결합을 형성하였다(Yu JW, et al.(2007) Pyrin activates the ASC pyroptosome in response to engagement by autoinflammatory PSTPIPI mutants. Mol Cell 28: 214-227.).

실시예 8: 미토콘드리아 유래 물질 및 미토콘드리아 손상의 확인(Determination of Mitochondria-Derived Products and Mitochondrial Damage)

mROS 생성 여부를 확인하기 위하여, 세포를 MitoSOX(Invitrogen)을 이용하여 염색하였다. 그 후 플로 사이토미터(FACSVerse, BD)를 이용하여 세포의 형광성을 관찰하였다. 시토졸 mtDNA를 측정하기 위하여, NP-40-프리 버퍼 A에서 21G 시린지를 이용하여 세포를 용해하고, 실시예 5에서 얻어진 시토졸 분획을 준비하여 10,000g 조건 하에서 마지막 원심 분리를 수행하였다. 그 후, DNeasy Blood & Tissue 키트(Qiagen)을 이용하여 시토졸 분획으로부터 DNA를 분리하였다. 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)을 통하여 사이토크롬 c 옥시데이즈 Ⅰ을 코딩하는 유전자의 복제수를 확인하였다(프라이머; 5'-GCCCCAGATATAGCATTCCC-3'(주형가닥) 및 5'-GTTCATCCTGTTCCTGCTCC-3'(비주형가닥)). 미토콘드리아의 손상과 전체 미토콘드리아의 무게를 측정하기 위하여, MitoTracker Deep Red(Invitrogen) 및 MitoTracker Green(Invitrogen)을 이용한 공동 염색과, MitoTracker Green을 이용한 단일 염색을 각각 수행하였고, 그 후 세포를 플로 사이토메트리를 이용하여 분석하였다. 플로 사이토메트리 데이터는 최소 3번의 독립적 실험의 대표를 나타낸 것이다.

실험 결과

단, 통계적 분석(Statistical Analysis) 시 모든 값들은 평균±각각의 샘플의 SEM으로 나타내었다. 데이터는 스튜던트의 t-검정(Student’s t-test)을 이용하여 분석하였고, P-값≤0.05는 통계적 유의성을 의미한다.

실험예 1: Drp1 넉다운에 기인한 미토콘드리아의 신장 및 세포 사멸 감수성의 증대

Drp1이 안정적으로 넉다운된 대식세포를 생산하기 위하여, 넌타겟팅(scrambled) 또는 Drp1-타켓팅 짧은 헤어핀 구조의 RNA(shRNA)를 이용하여 생쥐의 골수 유래 대식세포(BMDMs)를 감염시켰다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, Drp1-타겟팅 shRNA가 감염된 BMDMs(Drp1)에서 Drp1의 발현 수준이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, Drp1이 넉다운된 대식세포에서 미토콘드리아의 길이가 신장되거나 혹은 형태가 커진 것을 볼 수 있다.

한편, 미토콘드리아는 계획된 세포 예정사(programmed cell death)에 중요한 역할을 하는 바, 대식세포의 세포 자기 사멸, 계획성 세포 괴사 및 세포 사멸 자극에 대한 민감도를 확인하였다.

도 4에서 보는 바와 같이, TNF-α-사이클로헥시미드(TC) 자극 시 신장된 미토콘드리아를 포함하는 shDrp1 세포는 shScr BMDMs와 비교할 때, 세포 자기 사멸성이 감소되고, 카스파제-3 처리 또한 감소한 것을 확인할 수 있었다. 하지만, TCZ 자극 시에는 shScr 세포 및 shDrp1 세포 모두에서 RIP-3-의존 계획성 세포 괴사가 유사한 수준으로 발생하는 것을 볼 수 있었다.

또한, 도 5에서 보는 바와 같이, NLRP3-활성 LPS/니제리신 자극 시 shDrp1 BMDMs가 대조군에 비교하여 카스파제-1-의존 세포 사멸이 현저히 증가한 것을 볼 수 있었다.

이를 통하여 카스파제-1/인플라마좀 신호는 shScr BMDMs의 경우보다 신장된 미토콘드리아를 포함하는 shDrp1 BMDMs에서 더욱 강력히 작용하는 것을 알 수 있었다.

실험예 2: Drp1 녹다운의 NLRP3 인플라마좀 활성화 및 조립 촉진

다음으로, 미토콘드리아의 신장이 카스파제-1의 NLRP3-의존 활성화에 영향을 미치는 지 확인하였다.

도 6 및 도 7에서 보는 바와 같이, LPS 활성화 처리 없이 ATP 또는 니제리신으로 바로 처리한 경우, shScr BMDMs과는 달리 shDrp1 BMDMs에서는 카스파제-1 활성화가 수행된 것을 볼 수 있었다.

도 8에서 보는 바와 같이, 야생형 BMDMs에서 미토콘드리아 분열 억제제-1(mdivi-1)에 의한 Drp1의 억제 시 LPS/ATP- 또는 ATP-중재 카스파제-1의 활성이 지속적으로 증가하는 것을 볼 수 있었다.

프로토노포어 CCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)는 미토콘드리아 분열을 촉진하는 것으로 알려져 있는데, 도 9에서 보는 바와 같이, CCCP 처리는 LPS/ATP-자극된 BMDMs에서 카스파제-1 활성을 약화시키고, IL-1β의 분비를 감소시키는 것을 볼 수 있다.

이를 통하여 미토콘드리아의 신장은 NLRP3 인플라마좀의 활성을 강화시키고, 미토콘드리아의 분열은 활성을 억제함을 알 수 있었다.

다음으로, NLRP3-ASC 상호작용과 ASC 올리고머화를 확인하여 NLRP3 인플라마좀의 조립에 있어서 미토콘드리아 역학의 역할을 확인하였다. 양자 모두 NLRP3 인플라마좀의 활성화를 위한 필수적 전제 조건이다.

도 10에서 보는 바와 같이, LPS 처리 시 ASC와 NLRP3의 연관성이 기본적으로 높아지는 것을 볼 수 있었다. 그런데, Drp1가 넉다운된 BMDMs에서는 NLRP3-ASC 상호작용이 특히 현저히 증가하는 것을 볼 수 있었다.

도 11에서 보는 바와 같이, LPS/니제리신 자극에 의해 유도된 ASC 올리고머화는 shScr BMDMs와 비교하여 shDrp1 BMDMs에서 보다 강력한 효과를 나타내는 것을 볼 수 있었다.

또한, 도 12 및 도 13에서 보는 바와 같이, 미토콘드리아 분열을 유도하기 위한 CCCP의 처리는 NLRP3-ASC 상호작용과 ASC 올리고머화를 약화시키는 것을 볼 수 있었다.

이를 통하여, Drp1 넉다운에 의한 미토콘드리아의 신장은 NLRP3-ASC 상호작용을 높이고 ASC 올리고머화를 촉진하는 것을 알 수 있었다.

실험예 3: Drp1 넉다운 대식세포에서의 증가된 미토콘드리아 손상 및 카스파제 -1 활성화와의 관계

미토콘드리아의 길이 신장이 NLRP3 인플라마좀 활성화를 어떻게 촉진시킬 수 있는 지를 확인하기 위하여, 미토콘드리아 유래 물질로 mROS 및 mtDNA 의 생성 정도를 확인하였다.

도 14에서 보는 바와 같이, mROS-민감 MitoSOX 염색 결과에 따르면, LPS/ATP 자극 시 mROS 생성량이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 다만, shScr BMDMs의 경우보다 Drp1 넉다운 BMDMs에서 mROS 생성량이 조금 더 증가한 것을 볼 수 있었다.

도 15에서 보는 바와 같이, LPS-활성화된 BMDMs에 ATP로 자극을 가한 경우, mtDNA의 시토졸로의 방출이 촉진되는 것을 볼 수 있었다. 더욱이 상기 mtDNA 방출은 특히 ATP로 15분 처리하였을 때 shScr BMDMs보다 shDrp1 BMDM에서 더욱 증가한 것을 볼 수 있었다. 그러나, Nlrp3^-/- BMDMs에서는 mtDNA의 LPS/ATP 유도 세포질 방출이 수행되지 않는 것을 볼 수 있다. 이를 통하여 mtDNA 방출은 카스파제-1 활성화 또는 NLRP3의 존재에 의존하는 것을 알 수 있었다.

또한, 미토콘드리아의 손상 증가가 Drp1 넉다운 세포에서 NLRP3 인플라마좀 활성화와 어떠한 관련이 있는 지를 확인하기 위하여, MitoTracker Green 및 MitoTracker Red로 공동 염색된 세포에서 미토콘드리아의 손상을 확인해 미토콘드리아 막 전위의 소멸을 측정하였다.

도 16에서 보는 바와 같이, LPS/ATP 자극 시 손상된 미토콘드리아를 포함하는 세포의 수가 증가시키는 것을 볼 수 있었다.

또한 도 17에서 보는 바와 같이, shScr BMDMs에서는 미토콘드리아 중량에서 카스파제-1-의존 감소(caspase-1-dependent decrease)가 관찰되었으나, shDrp1 BMDMs에서는 카스파제-1 활성이 증가하였음에도 불구하고, 카스파제-1-의존 감소가 관찰되지 않았다.

이를 통하여 미토콘드리아 신장은 카스파제-1-의존 소모(caspase-1-dependent depletion)로부터 미토콘드리아를 보호할 수 있고, 최종적으로 미토콘드리아는 NLRP3 인플라마좀 활성화를 촉진할 수 있는 것을 알 수 있었다.

실험예 4: Drp1 녹다운에 기인한 ERK 활성화 및 NLRP3 인플라마좀 조립 촉진

최근 연구에서는 ERK 신호가 LPS-유도 NLRP3 활성화에 중요한 역할을 하고, 인플라마좀 활성화의 전제 조건이 된다고 밝혀진 바 있다(Ghonime MG, et al.(2014) Inflammasome priming by lipopolysaccharide is dependent upon ERK signaling and proteasome function. J Immunol 192: 3881-3888). 이에, Drp1 넉다운 세포에서 ERK 신호가 NLRP3 인플라마좀 활성화의 촉진에 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여 ERK 인산화를 수행하였다.

도 18에서 보는 바와 같이, shScr BMDMs에서 LPS 자극은 ERK1 및 ERK2 인산화를 일으키는 것을 볼 수 있었다. 반면 Drp1 녹다운 BMDMs는 LPS 자극 없이도 기초적인 ERK 인산화가 발생하는 것을 볼 수 있었다.

또한, 도 19에서 보는 바와 같이, shScr BMDMs에서 U0126, MEK1 및 MEK2의 선택적 억제제에 의한 ERK 경로의 방해가 LPS/ATP-중재 ERK 인산화 및 카스파제-1 활성화를 현저히 감소시킨 것을 볼 수 있었고, 이를 통하여 ERK 신호가 NLRP3 인플라마좀의 활성화에 요구되는 것을 알 수 있었다. 한편, shDrp1 BMDMs에서도 U0126에 의해 ERK 인산화가 감소되었고, 이러한 U0126 처리는 ATP 또는 니제리신 중재 카스파제-1 활성화를 실질적으로 억제하는 것을 알 수 있었다.

또한, 도 20에서 보는 바와 같이, CCCP가 LPS 또는 LPS/ATP-중재 ERK 인산화를 감소시키는 것을 볼 수 있었다.

이를 통하여 Drp1 넉다운 세포에서 ERK 신호가 NLRP3 인플라마좀 활성화에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

한편, 미토콘드리아는 인플라마좀 구성 성분을 조립하는데 플랫폼 역항르 수행하기 때문에, NLRP3 인플라마좀 구성 성분의 세포 이하 분포를 확인하였다.

도 21에서 보는 바와 같이, shScr BMDMs에서 LPS 활성화에 의해 NLRP3의 미토콘드리아 내 분포가 증가하는 것을 볼 수 있었으나, 이는 U0126에 의해서는 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 22에서 보는 바와 같이, U0126의 처리에 의해 NLRP3 및 ASC의 연관성이 부분적으로 감소한 것을 볼 수 있었고, 이를 통해 NLRP3의 ERK-의존성 미토콘드리아 내의 위치화가 NLRP3 조립에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

한편, 도 21에서 보는 바와 같이, ERK 인산화뿐만 아니라, 미자극된 shDrp1 BMDMs는 shScr BMDMs의 경우보다 미토콘드리아 내 NLRP3의 분포가 증가한 것을 볼 수 있었다.

즉, 미토콘드리아 내 ASC 수준이 shDrp1 세포에서 높았고, 이는 NLRP3 인플라마좀의 조립을 위한 세포 환경을 유지하기 위하여 사용되는 것임을 알 수 있었다. 또한, 미토콘드리아의 길이 신장이 ERK 경로의 활성화를 유도하고, 최종적으로는 NLRP3 인플라마좀의 조립 및 활성화를 촉진함을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 Drp1의 넉다운에 의해 미토콘드리아 분열에 결함이 생긴 경우, NLRP3를 통한 신호에 영향을 미치는 것을 알 수 있었고, 구체적으로는 Drp1-타켓팅 shRNA를 안정적으로 발현시키는 Drp1 넉다운 대식세포는 미토콘드리아의 신장이 관찰될 뿐만 아니라, LPS/ATP 자극에 의해 카스파제-1 활성 및 인터루킨-1-β 분비가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 미토콘드리아 분열의 화학적 유도자인 카보닐 시아니드 m-클로로페닐 하이드라존(CCCP)의 경우 NLRP3 인플라마좀의 조립 및 활성화를 방지하는 것을 볼 수 있었다. 또한, Drp1 넉다운 세포에서 NLRP3-활성화 자극은 미토콘드리아 활성화 산소종의 생성이나, 미토콘드리아 DNA의 방출과 같은 미토콘드리아 손상을 유도하지만, 카스파제-1 활성화를 촉진하는 것을 볼 수 있었다. 즉, Drp1-넉다운 세포에서 세포 외 신호-조절 키네이즈(ERK)의 구조적 인산화가 발생하고, ERK 신호의 증가는 NLRP3를 미토콘드리아 내부로 위치화시켜 NLRP3 인플라마좀의 조립을 촉진하며, 이를 통해 제2형 당뇨병과 같은 대사성 질환이 유도되는 것을 알 수 있었다.

이상, 본 발명을 상기 실시 예를 중심으로 하여 설명하였으나 이는 예시에 지나지 아니하며, 본 발명은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 다양한 변형 및 균등한 기타의 실시 예를 이하에 첨부한 청구범위 내에서 수행할 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Kit for diagnosis of diabetic disease by using Drp1 expression analysis and the method for providing information for diagnosis of diabetic disease <130> DPB150034 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Ala Leu Ile Pro Val Ile Asn Lys Leu Gln Asp Val Phe Asn 1 5 10 15 Thr Val Gly Ala Asp Ile Ile Gln Leu Pro Gln Ile Val Val Val Gly 20 25 30 Thr Gln Ser Ser Gly Lys Ser Ser Val Leu Glu Ser Leu Val Gly Arg 35 40 45 Asp Leu Leu Pro Arg Gly Thr Gly Ile Val Thr Arg Arg Pro Leu Ile 50 55 60 Leu Gln Leu Val His Val Ser Gln Glu Asp Lys Arg Lys Thr Thr Gly 65 70 75 80 Glu Glu Asn Gly Val Glu Ala Glu Glu Trp Gly Lys Phe Leu His Thr 85 90 95 Lys Asn Lys Leu Tyr Thr Asp Phe Asp Glu Ile Arg Gln Glu Ile Glu 100 105 110 Asn Glu Thr Glu Arg Ile Ser Gly Asn Asn Lys Gly Val Ser Pro Glu 115 120 125 Pro Ile His Leu Lys Ile Phe Ser Pro Asn Val Val Asn Leu Thr Leu 130 135 140 Val Asp Leu Pro Gly Met Thr Lys Val Pro Val Gly Asp Gln Pro Lys 145 150 155 160 Asp Ile Glu Leu Gln Ile Arg Glu Leu Ile Leu Arg Phe Ile Ser Asn 165 170 175 Pro Asn Ser Ile Ile Leu Ala Val Thr Ala Ala Asn Thr Asp Met Ala 180 185 190 Thr Ser Glu Ala Leu Lys Ile Ser Arg Glu Val Asp Pro Asp Gly Arg 195 200 205 Arg Thr Leu Ala Val Ile Thr Lys Leu Asp Leu Met Asp Ala Gly Thr 210 215 220 Asp Ala Met Asp Val Leu Met Gly Arg Val Ile Pro Val Lys Leu Gly 225 230 235 240 Ile Ile Gly Val Val Asn Arg Ser Gln Leu Asp Ile Asn Asn Lys Lys 245 250 255 Ser Val Thr Asp Ser Ile Arg Asp Glu Tyr Ala Phe Leu Gln Lys Lys 260 265 270 Tyr Pro Ser Leu Ala Asn Arg Asn Gly Thr Lys Tyr Leu Ala Arg Thr 275 280 285 Leu Asn Arg Leu Leu Met His His Ile Arg Asp Cys Leu Pro Glu Leu 290 295 300 Lys Thr Arg Ile Asn Val Leu Ala Ala Gln Tyr Gln Ser Leu Leu Asn 305 310 315 320 Ser Tyr Gly Glu Pro Val Asp Asp Lys Ser Ala Thr Leu Leu Gln Leu 325 330 335 Ile Thr Lys Phe Ala Thr Glu Tyr Cys Asn Thr Ile Glu Gly Thr Ala 340 345 350 Lys Tyr Ile Glu Thr Ser Glu Leu Cys Gly Gly Ala Arg Ile Cys Tyr 355 360 365 Ile Phe His Glu Thr Phe Gly Arg Thr Leu Glu Ser Val Asp Pro Leu 370 375 380 Gly Gly Leu Asn Thr Ile Asp Ile Leu Thr Ala Ile Arg Asn Ala Thr 385 390 395 400 Gly Pro Arg Pro Ala Leu Phe Val Pro Glu Val Ser Phe Glu Leu Leu 405 410 415 Val Lys Arg Gln Ile Lys Arg Leu Glu Glu Pro Ser Leu Arg Cys Val 420 425 430 Glu Leu Val His Glu Glu Met Gln Arg Ile Ile Gln His Cys Ser Asn 435 440 445 Tyr Ser Thr Gln Glu Leu Leu Arg Phe Pro Lys Leu His Asp Ala Ile 450 455 460 Val Glu Val Val Thr Cys Leu Leu Arg Lys Arg Leu Pro Val Thr Asn 465 470 475 480 Glu Met Val His Asn Leu Val Ala Ile Glu Leu Ala Tyr Ile Asn Thr 485 490 495 Lys His Pro Asp Phe Ala Asp Ala Cys Gly Leu Met Asn Asn Asn Ile 500 505 510 Glu Glu Gln Arg Arg Asn Arg Leu Ala Arg Glu Leu Pro Ser Ala Val 515 520 525 Ser Arg Asp Lys Ser Ser Lys Val Pro Ser Ala Leu Ala Pro Ala Ser 530 535 540 Gln Glu Pro Ser Pro Ala Ala Ser Ala Glu Ala Asp Gly Lys Leu Ile 545 550 555 560 Gln Asp Ser Arg Arg Glu Thr Lys Asn Val Ala Ser Gly Gly Gly Gly 565 570 575 Val Gly Asp Gly Val Gln Glu Pro Thr Thr Gly Asn Trp Arg Gly Met 580 585 590 Leu Lys Thr Ser Lys Ala Glu Glu Leu Leu Ala Glu Glu Lys Ser Lys 595 600 605 Pro Ile Pro Ile Met Pro Ala Ser Pro Gln Lys Gly His Ala Val Asn 610 615 620 Leu Leu Asp Val Pro Val Pro Val Ala Arg Lys Leu Ser Ala Arg Glu 625 630 635 640 Gln Arg Asp Cys Glu Val Ile Glu Arg Leu Ile Lys Ser Tyr Phe Leu 645 650 655 Ile Val Arg Lys Asn Ile Gln Asp Ser Val Pro Lys Ala Val Met His 660 665 670 Phe Leu Val Asn His Val Lys Asp Thr Leu Gln Ser Glu Leu Val Gly 675 680 685 Gln Leu Tyr Lys Ser Ser Leu Leu Asp Asp Leu Leu Thr Glu Ser Glu 690 695 700 Asp Met Ala Gln Arg Arg Lys Glu Ala Ala Asp Met Leu Lys Ala Leu 705 710 715 720 Gln Gly Ala Ser Gln Ile Ile Ala Glu Ile Arg Glu Thr His Leu Trp 725 730 735

Claims (9)

1. 디나민 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1), 또는 이에 특이적인 항체를 포함하는, 당뇨병 진단용 키트.
2. 제1항에 있어서,
   상기 디나민 단백질 1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 당뇨병 진단용 키트.
3. 제1항에 있어서,
   상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는, 당뇨병 진단용 키트.
4. (a) 환자로부터 분리된 시료 내 디나민 단백질 1(Dynamin related protein 1, Drp1)의 양을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 디나민 단백질 1의 양을 정상 대조군 시료 내 디나민 단백질 1의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 비교하는 단계 시 환자로부터 분리된 시료 내 디나민 단백질 1의 양이 정상 대조군 시료의 양보다 적은 경우 당뇨병으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법.
6. 제4항에 있어서,
   상기 디나민 단백질 1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법.
7. 제4항에 있어서,
   상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법.
8. 제4항에 있어서,
   상기 디나민 단백질 1의 양을 측정하는 단계는 디나민 단백질 1에 특이적인 항체를 이용하여 수행되는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법.
9. 제4항에 있어서,
   상기 디나민 단백질 1의 양을 측정하는 단계는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법을 이용하여 수행되는, 당뇨병 진단을 위한 정보 제공 방법.

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