KR101259293B1 - 난치성 천식 진단용 바이오마커 조성물 및 바이오마커 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표 2에 기재된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 난치성 천식(Refractory Asthma: 이하 RA) 진단용 바이오마커 조성물 및 난치성 천식 진단용 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 단백질 중 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 난치성 천식 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 난치성 천식 진단용 바이오마커 검출 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면 난치성 천식의 발생 위험을 예측할 수 있으며 난치성 천식의 예방, 초기 진단 및 치료 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

난치성 천식 진단용 바이오마커 조성물 및 바이오마커 검출 방법{BIOMARKER COMPOSITION FOR DIAGNOSING REFRACTORY ASTHMA AND THE METHOD FOR DETECTING USING THE SAME}
본 발명은 난치성 천식 진단용 바이오마커에 관한 것이다.
천식은 병인학, 병리학, 중증도, 생리학적인 기준, 치료에 대한 반응에 의해 정의되는 이질적인 질병이다. 난치성 천식(Refractory asthma ; 이하RA) 은 천식의 특이적인 표현형 중의 하나이고 전체 천식의 5% 미만이다. 이 서브그룹은 지속적인 증상을 통제하기 위해 매우 많은 양의 약을 요구로 하고, 높거나 많은 약의 사용에도 불구하고 악화되거나 기도가 폐괘되어 임상적 접근과 치료에 어려움을 가진다. 경증 천식(Mild asthma)뿐만 아니라 중증 천식도 이질적이고 잠재적으로 다른 염증 병리성을 가지는 하부그룹으로 구성되어 있다. 천식은 이질적인 질병이기 때문에 특별한 하부 표현형을 동정하는 것이 병리학과 치료에 대한 반응에 대해 우리가 더 이해하게 해줄 수 있고 기존에 있었거나 새로운 항 천식 치료법 모두에 대해 더 좋은 타게팅을 가져오게 할 수 있다. RA를 치료하는 효과적인 치료법은 아직 없다. 따라서 RA의 기도 염증과 병리학적 매커니즘을 알기 위해 더 많은 연구가 필요하고, 임상적인 하부타입이 RA를 가진 사람들을 치료하기 위해 중요하다.
종래에는 천식 염증 하부타입이 증가된 호산구와 호중구의 존재에 기초하여 염증 그룹을 하위분류할 수 있다고 보고되었다. 천식의 하부타입에서 호산구성 염증은 코르티코스테로이드 치료에 대해 반응성이 좋고, 호중구성 기도 염증은 천식의 급격한 악화와 중증 천식과 관련이 있어서 천식 치료에 저항성이 있었다. 그러나 때때로 기도에서 호산구성 염증과 호중구성 염증은 천식에서 섞이므로, 두 염증 타입을 분별하기가 어렵다. 특히 RA 에서 객담 염증 세포에 관한 하부 표현형에 관한 데이터는 없었다.
RA와 경증 천식을 구별하여, RA를 진단하고 모니터하고 치료 타겟을 개발하게 할 수 있는 바이오마커의 개발 필요가 있다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 난치성 천식을 진단할 수 있는 바이오마커 조성물, 상기 바이오마커를 이용하는 난치성 천식의 진단용 키트, 난치성 천식 진단용 바이오마커 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 난치성 천식(Refractory Asthma: 이하 RA) 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다. (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 호중구 펩티드-2(Human neutrophil peptide2, Hnp-2); (2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 S100 칼슘 바인딩 단백질 A9(S100 calcium binding protein A9); (3) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 알파-아밀라제(alpha-amylase); (4) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 호중구 젤라티나제-관련 리포카린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL); (5) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 4-아미노부티레이트 전이효소(4-aminobutyrate transaminase); (6) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 시스타틴 SA(cystatin SA); (7) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 플룬크 전구체(protein Plunc precursor); (8) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 보체 성분 C3(complement component C3); (9) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 헤비 체인 변이 지역(immunoglobulin heavy chain variable region); (10) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 신경교 섬유 산성 단백질 이소폼 1(glial fibrillary acidic protein isoform 1); (11) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 Ig M 카파 IIIb SON (Ig M kappa IIIb SON); (12) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 MLL-AF4 데르(11) 융합 단백질(MLL-AF4 der(11) fusion protein); (13) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 사이토케라틴 8(cytokeratin 8); 및 (14) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 IgG4 헤비 체인(recombinant IgG4 heavy chain).
또한, 본 발명은 상기 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 난치성 천식 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 난치성 천식 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 난치성 천식 진단용 바이오마커 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면 난치성 천식의 발생 위험을 예측할 수 있으며 난치성 천식의 예방, 초기 진단 및 치료 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 난치성 천식을 가진 5명의 환자와 경증 천식을 가진 10명의 환자로부터 얻은 객담 단백질을 2차원 전기영동 분리하여 나타낸 것이다.
도 2는 인간 객담에 있는 S100A9, NGAL, PLUNC, HNP 을 웨스턴 블롯한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
비 RA 와 RA 환자 모두에게 유도된 객담 호산구의 퍼센트는 상당히 높은 반면에 호중구의 퍼센트는 RA를 가진 환자들에게서 나온 객담에서만 증가하였다. 본 발명에서는 한국인 코호트 연구로부터 호중구성 객담을 가진 환자들을 선택하여 RA와 경증 천식을 구별하기 위한 바이오바커를 동정하였다.
본 발명은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질, 구체적으로는 1개 내지 14개의 단백질을 포함하는 난치성 천식(Refractory Asthma: 이하 RA) 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다. (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 호중구 펩티드-2(Human neutrophil peptide2, Hnp-2); (2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 S100 칼슘 바인딩 단백질 A9(S100 calcium binding protein A9); (3) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 알파-아밀라제(alpha-amylase); (4) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 호중구 젤라티나제-관련 리포카린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL); (5) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 4-아미노부티레이트 전이효소(4-aminobutyrate transaminase); (6) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 시스타틴 SA(cystatin SA); (7) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 플룬크 전구체(protein Plunc precursor); (8) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 보체 성분 C3(complement component C3); (9) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 헤비 체인 변이 지역(immunoglobulin heavy chain variable region); (10) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 신경교 섬유 산성 단백질 이소폼 1(glial fibrillary acidic protein isoform 1); (11) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 Ig M 카파 IIIb SON (Ig M kappa IIIb SON); (12) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 MLL-AF4 데르(11) 융합 단백질(MLL-AF4 der(11) fusion protein); (13) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 사이토케라틴 8(cytokeratin 8); 및 (14) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 IgG4 헤비 체인(recombinant IgG4 heavy chain).
본 발명의 일 실시예에서 상기 RA는 호중구성 염증 증상을 보일 수 있다.
기관지 천식에서 기도 염증은 직접적이고 외과적인 방법으로 기관지경 생검, 기관지폐포 세척액으로 측정할 수 있는 반면, 간접적이지만 비외과적으로 객담 검사와 흡입 NO로 측정할 수 있다. 객담 분석을 통한, RA의 병리학적 연구에 의하면 호중구가 경증 천식 환자 또는 정상 대조군 피검자의 기도에서보다 중증 환자의 기도에서 더 많은 양이 존재하였다. 비 RA 와 RA 환자 모두에게 유도된 객담 호산구의 퍼센트는 상당히 높은 반면에, 객담 호중구의 퍼센트는 RA를 가진 환자들에게서 나온 객담에서만 증가하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질, 구체적으로는 1개 내지 14개의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 RA 진단용 바이오마커 검출용 조성물을 제공한다. 상기 바이오마커 검출용 조성물은 상기 단백질 수준을 측정하는 제제, 구체적으로 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 완전한 형태의 항체뿐 아니라, 항체 분자의 기능적 단편도 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질, 구체적으로는 1개 내지 14개의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 RA 진단용 키트를 제공한다.
상기 진단용 키트는 상기 바이오마커 검출용 조성물에 당분야에서 널리 사용되는 다른 구성 성분 또는 장치를 추가적으로 포함하여 응용, 제작될 수 있다. 단백질에 대한 특이적인 항체 및, 추가적으로, 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소 및 그의 기질을 포함하는 ELISA용의 키트로 제작될 수 있다. 또 다른 예로서, 단백질 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 단백질 칩용 키트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질, 구체적으로는 1개 내지 14개의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 난치성 천식 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 RA 진단용 바이오마커 검출 방법을 제공한다.
상기 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계의 구체적 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등의 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 생물학적 시료는 COPD 급성 악화 진단용 마커를 검출할 수 있는 세포, 조직 또는 체액 샘플을 의미하고, 구체적으로, 혈액, 뇨, 림프, 여성 체액, 생검, 땀, 대변, 눈물 또는 객담을 들 수 있고, 더욱 구체적으로 객담을 들 수 있다. 비강 세척액, BAL 액, 침, 객담을 포함한 기도에서의 체액 샘플로부터 하는 단백질 분석에서 객담 단백질 분석은 특히 어렵다. 왜냐하면 고분자량과 고전하량의 점액질이 풍부하여 객담 단백질의 분리를 막기 때문이다. 우리는 GeLC-MS/MS을 사용하여 2차원 젤 단백질학적 접근을 하였고 MALDI-TOF/TOF를 사용하여 단백질을 동정하였다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 대조군은 경증 천식(Mild Asthma) 환자 또는 정상인의 시료일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 바이오마커는 (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 호중구 펩티드-2(Human neutrophil peptide2, Hnp-2); (2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 S100 칼슘 바인딩 단백질 A9(S100 calcium binding protein A9); (3) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 알파-아밀라제(alpha-amylase); (4) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 호중구 젤라티나제-관련 리포카린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL); (5) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 4-아미노부티레이트 전이효소(4-aminobutyrate transaminase); (6) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 시스타틴 SA(cystatin SA); 및 (7) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 플룬크 전구체(protein Plunc precursor);로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질이며, 검출 대상의 생물학적 시료 내의 상기 단백질 발현량이 대조군에 비해 증가한 경우 난치성 천식으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 바이오마커는 (8) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 보체 성분 C3(complement component C3); (9) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 헤비 체인 변이 지역(immunoglobulin heavy chain variable region); (10) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 신경교 섬유 산성 단백질 이소폼 1(glial fibrillary acidic protein isoform 1); (11) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 Ig M 카파 IIIb SON (Ig M kappa IIIb SON); (12) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 MLL-AF4 데르(11) 융합 단백질(MLL-AF4 der(11) fusion protein); (13) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 사이토케라틴 8(cytokeratin 8); 및 (14) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 IgG4 헤비 체인(recombinant IgG4 heavy chain)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질이며, 검출 대상의 생물학적 시료 내의 상기 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소한 경우 난치성 천식으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 검출 대상의 생물학적 시료와 대조군 간의 발현량의 차이는 절대적 또는 상대적 차이로 비교될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 환자의 객담 수집과 분리
난치성 천식에 있어서 ATSWorkshop에 의해 정의된 중증(severe)의 천식 환자들과 중증의 기준을 충족하지 못하는 비중증(nonsevere) 천식 환자들을 한국인 천식 코호트(알러지 및 호흡기 질환에 대한 한국인 게놈 연구 센터)로부터 모집하였다. 비흡연자(5년 미만)가 천식 진단의 GINA 가이드라인을 충족하였고, 임상시험심사위원회(institutional review board)에 의해 승인된 동의서를 얻었다. 환자들에게 폐기능검사, 기관지확장제 가역성 및 기관지 반응제 검사, 아토피 평가, 흉부 X선 전후 사진, 객담 유도검사를 수행하였고, 천식 증상, 삶의 질, 복용약에 관한 질문지를 작성하게 하였다. 연구 프로토콜은 지방 연구 윤리 위원회에 의해 승인받은 것이었고, 모든 연구 환자들로부터 동의서를 얻었다.
모든 환자들은 하기 기준의 하나 이상에 의해 지지되는 천식의 임상 진단을 받았다: 1) 알부테롤(albuterol)의 200 ㎍ 흡입 후 15% 이상의 FEV1에서의 증가 2) 밀리리터당 10mg 이하의 메타콜린(PC20) 흡입시 반응에서 FEV1의 20% 감소 3) 시스템적이거나 흡입 스테로이드로 14일간 치료 후 20% 이상의 FEV1 증가이다. 모든 환자들에게 유도된 객담 시료의 분석, 감별 계산을 동반한 전혈구 검사, IgE, 흉부 전후부 방사선 검사, 알러지 스킨 테스트, 폐기능검사를 포함하는 표준화된 평가를 수행하였다. 고공명 단층활영(HRCT)를 휴부 전후부 방사선 검사에서 실질 폐질환 환자로 의심되는 환자에게 수행하였다. ATS 기준(2)에 따른 RA 진단은 하나나 두 개의 주요 기준과 두 개의 보조 기준으로 정의되었다. 예를 들어, 장기 작용하는 β-길항제, 티오필린(theophylline), 또는 루코트리엔 길항제와 같은, 흡입 코르티코이드를 추가한 조절제 약으로 매일 치료를 요한다. RA 환자의 적어도 두 개의 부가적인 보조 기준은 지속적인 기도 장애(예측치로 80% 미만의 FEV1)와 매년 천식으로 한번 이상의 갑작스러운 치료를 받은 환자이거나 매년 3번 이상의 구강 스테로이드 버스트(busrt)를 경험한 것이다. 천식발작(Near-fatal asthma)은 급성 호흡 실패를 가진 ICU 에서 인정되는 천식 환자로 정의되고, 다음 기준을 충족한다. 과탄소증의 존재(PaCO2 ≥ 45 mm Hg, 5.9 kPa; 정상 범위, 38 ~ 42 mm Hg), 저산소증의 징후(cyanosis or PaO2 ≥ 60 mm Hg, 7.9 kPa; 정상 범위, 80 ~ 100 mm Hg), 및 7일 이상의 악화기간이 그것이다. 배제 기준은 COPD, 성대 기능 이상, 폐쇄성 수면 무호흡증, Churg-Strauss 증후군, 심장 기능 이상, ABPA 및 치료에 대한 열악한 고착이었다. 치료 중에 악화되면 표준 임상 가이드라인에 따라 치료하였다. 다음 기간 동안 환자들은 그들의 증상 점수와 약제를 기록할 것을 요청받았다. 환자들은 악화될 경우, 즉 FEV1이 15-20% 이상의 감소될 경우 시스템적인 스테로이드로 바꾸었다. 경구 프레드니솔론(prednisolone)을 하루에 킬로그램당 1mg 의 복용으로, 하루에 최대 40mg 의 복용으로 처방하였다. 항생제와 같은 부가적인 치료를 사용할지 여부와 입원의 필요 여부는 본 실험을 행한 의사에 의해 결정되었다. 입원을 요할 정도의 악화시에는 임상팀에 의해 치료되었다. 본 실험의 프로토콜은 지방 연구 윤리 위원회에 의해 승인받았고, 모든 환자들에게 동의서를 얻었다.
실시예 2: 폐 기능 검사와 알러지 피부 테스트
베이스라인 FVC 와 FEV1 측정은 최근(8시간 이내)의 기관지확장제를 사용하지 않았을 때 행해졌다. 기준선과 기관지확장제 사용후의 FEV1, FVC및 25%-75% 상이의 강요되는 호흡률(FEF25-75%), DLCO 를 측정하였다. 환자가 안정 상태일 때와 예상 FEV1이 65% 초과일 때 메타콜린 유도 테스트를 사용하여 AHR을 측정하였고, 비-누적 단위로 FEV1 이 20% 떨어지는(PC20) 원인이 되는 유도농도로 표현되었다.
24가지 일반 흡입 알러젠(예를 들면, 먼지, 고양이털, 개털, 바퀴벌레, 풀, 나무, 두드러기 쑥 꽃가루와 같은)(Bencard Co. Ltd., Brentford, UK)에 대해 피부 테스트를 수행하였다. 아토피는 히스타민(1mg/ml)에 의한 반응과 동일하거나 그 이상의 알러젠에 의한 휠(wheal) 반응을 가지는 것 또는 하나 이상의 양성 반응 (>3mm 직경)을 가지는 것으로 정의하였다.
실시예 3: 객담 검사
객담 유도 방법은 천식 클리닉 연구 네트워크로부터 채택되었다. 객담을 즉각적으로 유도하였다. 세포 사이토스핀은 백혈구와 기관지 상피 및 편평 세포의 감별계산을 위해 염색하였고 객담 상등액의 부분표본을 -70℃에 저장하였다. 우리는 3명의 난치성 천식환자와 20명의 경증 천식환자와 7명의 정상 대조군으로부터 객담을 선택하였다.
단기 작용하는 기관지확장제를 포함하는 등장액을 사용하여 객담을 유도하였고, 샘플을 수집 후 2시간 내에 처리하였다. 객담의 더 고체성의 눈에 보이는 부분을 주의 깊게 선택하였고, 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)를 미리 무게를 달아서 준비하였다. 샘플을 Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) 내에 0.05% 디티오트레이톨(dithiothreitol)(Sputolysin, Calbiochem Corp., San Diego, Calif., USA)을 8배 부피를 추가하였다. 프로테아제 저해제(protease inhibitors)(0.1 M EDTA 와 2 mg/ml 페닐메틸설포틸플루오라이드)를 균질화한 객담의 100배 부피로 추가하였고, 총 세포 수를 혈구계산기(hemocytometer)로 결정하였다. 균질화된 객담을 세포원심분리기로 돌렸고, 500 세포를 디프-퀵 솔루션(Diff-Quik solution (American Scientific Products, Chicago, Ill., USA)으로 염색한 각 객담 슬라이드에 놓았다. 편평 상피 세포가 10%를 넘는 객담 샘플은 분석하지 않았다. 균질화한 객담을 5분 동안 1000g 으로 원심분리 하고나서 상등액을 수집하여 다음 분석을 위해 -70℃에서 저장하였다. 편평 상피 세포를 10% 이상 포함하는 객담 샘플은 분석하지 않았다. 객담의 호산구와 호중구 부분에 기초하여, 환자들을 4개 염증 하부 타입으로 분류하였다. 예를 들어, 객담 호산구가 3.0% 가 넘는 호산구성 천식(Eosinophilic asthma), 예를 들어 객담 호중구가 70%가 넘는 호중구성 천식(Neutrophilic asthma), 예를 들어 호산구와 호중구가 모두 증가한 혼합 과립구성 천식(Mixed granulocytic asthma), 예를 들어 호산구와 호중구 모두 정상 수준인 파우치과립구성 천식(Paucigranulocytic asthma)이다. 우리는 안정 상태에서 단백질 분석을 위해 호중구성 하부 타입의 객담의 난치성 천식과 경증 천식을 가진 환자들을 랜덤하게 선택하였다.
임상적 특징을 표 1에 나타내었다. 호중구성 하부타입의 난치성 천식을 가지는 환자들은 경증 천식을 가지는 환자보다 상당히 더 높은 객담 총 세포 수를 가졌고, 더 낮은 FEV1, FVC 및 FEV1/FVC를 가졌다.
Figure 112011002183460-pat00001
실시예 4: 객담의 2차원 전기영동과 이미지 분석
각각의 샘플의 단백질 양을 BCA 방법으로 측정하였다. 호산구성 염증을 가진 8명의 RA와 10명의 비 RA, 호중구성 염증을 가진 5명의 RA와 10명의 비 RA, 7명의 NC에게서 동일한 양의 객담을 수집하였다. 고여있는 객담을 아세톤에서 50% (w/v)TCA (TCA, Sigma, T9159) 로 침전시키고 -80℃에서 오버나이트하고, 4℃에서 20분 동안 14000rpm에서 원심분리하였다. 오염을 제거하기 위해 단백질 펠렛을 얼음처럼 차가운 아세톤에 적어도 2번 세척하였다. 준비한 샘플로 2차원 전기영동을 하고 각 단백질 스팟의 상대적 강도(relative intensity)를 측정하였고, 단백질 스팟을 동정하였다.
펠렛을 몇 분간 에어 건조하고, 2DE를 위해 샘플 버퍼 (7 M urea, 2 M thiourea, 4% (w/v) CHAPS, 0.5% (v/v) ampholyte, 100 mM DTT, 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.002% Bromophenol blue)에 녹이고 나서 2D- quant 키트 단백질 에세이에 의해 단백질 농도를 정량하였다.
등전점 전기영동을 위해 Immobiline Dry Strips (Amersham Biosciences)을 사용하였고, MultiPhorⅡTM (GE Healthcare)에서 추출된 단백질 1mg 을 가지고 실험하였다. IEF 분리 후에, SDS-PAGE에 의해 2차원으로 단백질을 분리하였다. 이미지 분석을 위해 젤을 제조자 지시에 따라 Coomassie Brilliant Blue G-250 로 시각화하였다. 2-D 겔을 ImageScanner(BIO RAD) 로 transmission mode에서 스캔하였다. ImageMaster 2D 버젼 5.0(Amersham Biosciences)을 사용하여 스팟 검출과 매칭을 수행하였다. 디지탈화한 이미지를 광학 밀도를 스팟 지역(스팟 "부피")로 나눔으로써 2-D 스팟 강도를 계산하기 위해 ImageMaster 프로그램을 사용하여 분석하였다. 그 수치를 정규화한 후 통계 분석을 위해 SPSS 13.0 에 적용시켰다.
객담 단백질 샘플을 pH 범위 3에서 10에 걸쳐 IPG 젤 스트립에 1차원 전기영동을 하고, 7.5-10% SDS-PAGE 에 2차원 전기영동을 하여 도 1에 나타내었다. 쿠마시에 블루 염색 후에 난치성 천식에서 7개의 단백질 스팟이, 경증 천식에서 7개의 단백질 스팟이 객담 단백질 1mg 에서 검출되었다. 동정된 모든 스팟을 분자량 10-150 kDa의 범위로 pI 4-10 의 범위에 위치시켰다. 스팟의 상대적 강도(%)를 표 2에 나타내었고 동정된 단백질 스팟의 위치를 매스터 이미지에서 나타내었다. 14개의 단백질이 두 그룹 상이에 상대적 강도에서 상당한 차이를 보여주었다. 이 스팟들을 젤에서 잘라서 젤내 소화를 위해 트립신과 함께 인큐베이트하고 나서 MALDI-TOF/TOF로 동정하였다. 그 동정한 단백질들을 표 2에 나타내었다. 단백질들은 염증, 항염증, 효소 활성, 면역, 신호전달, 세포골격, 시스테인 프로테아제 저해 단백질들을 포함하였다. 아래 표 2를 보면 7개 단백질 스팟이 경증 천식보다 난치성 천식의 객담에서 fold change 가 더 증가하였다. 스팟 1, 스팟 2경증 천식보다 난치성 천식에서 6배 이상 증가하였고, 스팟 3, 4, 5, 6은 경증 천식보다 난치성 천식에서 5배 이상 증가하였으며, 스팟 7은 4배 이상 증가하였다. 대조적으로 스스팟 8은 7배 이상 감소하였고, 스팟 9는 5배 이상 감소하였으며, 스팟 10, 11, 12, 13, 14는 4배 이상 감소하였다. 아래 표 2에서 등록 번호(Accession No.)는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GI 를 의미한다.
Figure 112011002183460-pat00002
실시예 5: 젤 내 소화와 질량분석
다르게 발현되는 단백질 스팟을 젤에서 얻어서 더 작은 조각으로 자르고 나서 트립신(Promega, Madison, WI, USA)으로 소화시켰다. MALDI-TOF MS 분석을 위해 트립신 펩티드를 POROS R2 칼럼 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에 농축시켰다. 40% 메탄올, 100% 아세토니트릴, 그리고 50 mM 암모늄 바이카보네이트로 칼럼을 연속 세척한 후에, 샘플을 R2칼럼에 적용시켰고, MALDI-TOF 분석 전에 2 mL of cyano-4-hydroxycinnamic acid에서 녹여서 분리하였다. 단백질 샘플에 대한 스펙트라를 Voyager DE PROMALDI-TOF spectrometer (Applied Biosystems)를 사용하여 얻었다. 단백질 데이타베이스의 서치는 모노아이소토픽 피크를 사용하여 MSFit program (http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.4/msfit.htm)으로 수행하였다. 첫 분석에서 50 ppm 내에서 질량 톨러런스를 허용하였고, 초기 분석으로부터 얻은 단백질 목록을 사용하여 20 ppm 에서 재측정하였다. 그리고 트립신 자가분해 산물을 사용하여 스펙트라를 측정하였다. Swiss-Prot 와 NCBI 데이타베이스에 대한 펩티드매칭과 단백질 서치는 Mascot search 프로그램(http://www.matrixscience.com/) and Pro Found program (http://prowl.rockefeller.edu/)을 사용하여 수행하였다.
실시예 6: 객담 내의 특이적인 단백질의 웨스턴 블롯
S100 calcium binding protein A9 (S100A9), neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), PLUNC 및 Human neutrophil peptide (HNP)에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다. RA 5명 경증 천식환자 10명에서 얻은 객담 상등액의 단백질 30㎍ 을 15% 폴리아크릴아마이드 젤로 구성된 불연속적 시스템으로 로딩하여 전기영동하였다. 단백질을 1시간동안 120V에서 니트로셀룰로오스 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 실내 온도에서 1시간 동안 TBS, 0.1% Tween-20 에서 5% skim milk로 블로킹하고, S100A9 (Abcam, Inc.)에 대한 래빗 다클론 항체의 1:300 희석, NGAL (Abcam, Inc.), PLUNC (Santa Cruz)에 대한 래빗 다클론 항체와 고우트 다클론 HNP 항체 (Santa Cruz)를 1:500 희석하여 4℃에서 오버나이트 동안 인큐베이트하였다. 멤브레인을 실내 온도에서 1시간 동안 HRP-콘쥬게이트 항-래빗 IgG (1:5,000 희석)하여 인큐베이트하였다. 타겟 단백질을 강화된 화학발광 용액(enhanced chemiluminescence solution) (Amersham pharmacia biotech, Little Chalfont Buckinghamshire, England)으로 검출하였다.
S100A9 (13kDa), NGAL (21 kDa), PLUNC (25 kDa) 및 HNP (12 kDa) 단백질을 호중구성 염증을 가지는 난치성 천식환자와 경증 천식환자로부터 얻은 객담에서 발견하였으나, 호산구성 염증을 가지는 난치성 천식환자와 경증 천식환자로부터 얻은 객담에서는 발견하지 못했다. 또한, 경증 천식환자에 비해 난치성 천식 환자에서 발현량이 증가하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
S100A9 , NGAL, PLUNC, 및 HNP 단백질은 경증 천식과 난치성 천식을 가진 환자들에서 다르게 발현하고, 호중구성 염증을 보임을 지적해주는 단백질 바이오마커가 될 가능성이 있다.
S100A8와 S100A9 는 Ca2 +-바인딩 S100 단백질 패밀리에 속하고 호중구와 매크로파지에 있는 대부분의 풍부한 단백질 중의 일부이고 낭포성 섬유종과 관련있는 단백질의 발현을 바꾸고 카세인 키나제를 저해하는 기능을 할 수 있다. S100A8/A9 는 손상 관련 분자 패턴(damage-associated molecular pattern , DAMP) 단백질 복합체로 류마티즘 관절염, 암에서 방출되는 단백질이지만 염증과 폐쇄성 기도 질환에서의 역할은 아직 밝혀진 바 없다. S100A8/A9에 대한 두 개 리셉터인 multiligand receptor for advanced glycation end products (RAGE) 과 Toll-like receptor 4 (TLR4) 는 폐에서 발현된다. TLR4는 국부 기도 염증을 프로그램하는 선천성 면역과 연결되어 있고 RAGE 는 특발성 폐섬유 증에서 섬유증식성리모델링을 중재하는데 참여한다. S100A8/A9는 세포 증식, 아폽토시스, 염증, 콜라겐 합성, 세포 이동을 유도할 수 있다. 미에로이드 관련 단백질(myeloid-related proteins, MRPs)는 칼슘 바인딩 단백질의 S100 패밀리에 속하고 만성 염증 동안 호중구, 대식구, 상피 세포에 의해 매우 발현된다. MRP14 는 in vitro에서 섬유아세포 증식을 자극하고 유육종증(sarcoidosis) 환자로부터 육아종으로 발현된다. BALF MRP14 수준은 IPF 와 유육종증에서 증가된다. 본 발명에서 S100A9 단백질 발현이 경증 천식환자보다 난치성 천식 환자의 객담에서 더 많이 발현되는 것은 S100A9 이 중증 호중구성 기도 염증과 난치성 천식의 스테로이드 저항성 하부타입과 관련이 있다는 것을 의미한다.
PLUNC 패밀리는 입, 코, 폐에서 선천성 면역 반응에서 기능을 할 수 있고, 중요한 박테리아 노출 지점이며, IL13 발현이 증가된 천식에서 SPLUNC1 발현이 감소된다.
NGAL로 알려진 Lipocalin-2 는 호중구 젤라티나제와 관련된 단백질이다. 25-kD LCN2 단백질은 박테리아-파생된 지질다당류와 포르밀펩티드와 같은 작은 리포필릭 물질에 바인드하는 것으로 알려져 있고, 염증의 모듈레이터로 기능할 수 있다. lipocalin-2 가 박테리아 사이드로포어에 바인딩하는 것은 박테리아 감염에 대한 선천성 면역반응에서 중요하다. 디펜신(Defensins)은 살균 및 세포독성 펩티드 그룹이고 호중구에 의해 만들어진다. 인간 기도에서 루멘을 따라 있는 상피세포와 인트라루미날 세포(예를 들어, polymorphonucleus 세포)가 선천성 면역에 참여한다. 천식 환자의 기도에 있는 증가한 호중구 수는 천식의 병리학에서 호중구가 관련 있음을 제시해 준다. 본 발명에서 호중구 객담에서 증가한 S100A9 , NGAL, PLUNC, 및 HNP 단백질은 RA에서 병리학과 스테로이드 치료에 대한 저항성에서 선천성 면역이 역할을 할 수 있음을 제안해 준다.
실시예 7: 통계적 분석
데이터를 통계 소프트웨어 패키지(SPSS, version 10.0; SPSS Inc; Chicago, IL)로 이중 분석하였다. 데이터를 mean ±SD로 표현하였다. 난치성 천식과 경증 천식에 대한 연속적인 변이의 비교를 독립 샘플 t 테스팅을 사용하여 하였다. p< 0.05 를 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> BIOMARKER COMPOSITION FOR DIAGNOSING REFRACTORY ASTHMA AND THE METHOD FOR DETECTING USING THE SAME <130> 10p631ind <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Xaa Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg 1 5 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Ile Glu Thr Ile Ile Asn Thr Phe His Gln Tyr Ser Val Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asn Trp Gly Glu Gly Trp Gly Phe Met Pro Ser Asp Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Leu Ile Phe Leu Thr Ala Gly Arg Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Gln Ile Val Gly Gly Val Asn Tyr Phe Phe Asp Ile Glu Val Gly 1 5 10 15 Arg <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Val Thr Asp Pro Gln Leu Leu Glu Leu Gly Leu Val Gln Ser Pro Asp 1 5 10 15 Gly His Arg <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Val Gln Leu Ser Asn Asp Phe Asp Glu Tyr Ile Met Ala Ile Glu Gln 1 5 10 15 Thr Ile Lys <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Val Leu Arg <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 His Phe Glu Ser Ser Ser Lys Val Ala Gln Ala Pro Ser Pro Cys Ile 1 5 10 15 Ala Arg <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Leu Ser Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gln Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 1 5 10 15 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 20

Claims (8)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 S100 칼슘 바인딩 단백질 A9(S100 calcium binding protein A9)을 포함하는 난치성 천식(Refractory Asthma: 이하 RA) 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 RA는 호중구성 염증 증상을 보이는 것을 특징으로 하는 RA 진단용 바이오마커 조성물.
  3. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 S100 칼슘 바인딩 단백질 A9(S100 calcium binding protein A9)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 RA 진단용 키트.
  4. (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 S100 칼슘 바인딩 단백질 A9(S100 calcium binding protein A9)에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및
    (b) 상기 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 RA 진단용 바이오 마커 검출방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 항체는
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 호중구 펩티드-2(Human neutrophil peptide2, Hnp-2);
    서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 알파-아밀라제(alpha-amylase);
    서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 호중구 젤라티나제-관련 리포카린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL);
    서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 4-아미노부티레이트 전이효소(4-aminobutyrate transaminase);
    서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 시스타틴 SA(cystatin SA); 및
    서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 플룬크 전구체(protein Plunc precursor);으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, RA 진단용 바이오 마커 검출방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 항체는
    서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 보체 성분 C3(complement component C3);
    서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 헤비 체인 변이 지역(immunoglobulin heavy chain variable region);
    서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 신경교 섬유 산성 단백질 이소폼 1(glial fibrillary acidic protein isoform 1);
    서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 Ig M 카파 IIIb SON (Ig M kappa IIIb SON);
    서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 MLL-AF4 데르(11) 융합 단백질(MLL-AF4 der(11) fusion protein);
    서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 사이토케라틴 8(cytokeratin 8); 및
    서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 IgG4 헤비 체인(recombinant IgG4 heavy chain)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, RA 진단용 바이오마커 검출방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 호중구 펩티드-2(Human neutrophil peptide2, Hnp-2);
    서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 알파-아밀라제(alpha-amylase);
    서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 호중구 젤라티나제-관련 리포카린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL);
    서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 4-아미노부티레이트 전이효소(4-aminobutyrate transaminase);
    서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 시스타틴 SA(cystatin SA);
    서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 플룬크 전구체(protein Plunc precursor);
    서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 보체 성분 C3(complement component C3);
    서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 헤비 체인 변이 지역(immunoglobulin heavy chain variable region);
    서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 신경교 섬유 산성 단백질 이소폼 1(glial fibrillary acidic protein isoform 1);
    서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 Ig M 카파 IIIb SON (Ig M kappa IIIb SON);
    서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 MLL-AF4 데르(11) 융합 단백질(MLL-AF4 der(11) fusion protein);
    서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 사이토케라틴 8(cytokeratin 8); 및
    서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 IgG4 헤비 체인(recombinant IgG4 heavy chain)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, RA 진단용 바이오마커 조성물.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 키트는
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 호중구 펩티드-2(Human neutrophil peptide2, Hnp-2);
    서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 알파-아밀라제(alpha-amylase);
    서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 호중구 젤라티나제-관련 리포카린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL);
    서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 4-아미노부티레이트 전이효소(4-aminobutyrate transaminase);
    서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 시스타틴 SA(cystatin SA);
    서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 플룬크 전구체(protein Plunc precursor);
    서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 보체 성분 C3(complement component C3);
    서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 헤비 체인 변이 지역(immunoglobulin heavy chain variable region);
    서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 신경교 섬유 산성 단백질 이소폼 1(glial fibrillary acidic protein isoform 1);
    서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 Ig M 카파 IIIb SON (Ig M kappa IIIb SON);
    서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 MLL-AF4 데르(11) 융합 단백질(MLL-AF4 der(11) fusion protein);
    서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 사이토케라틴 8(cytokeratin 8); 및
    서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 IgG4 헤비 체인(recombinant IgG4 heavy chain)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 더 포함하는, RA 진단용 키트.
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