KR20160118423A

KR20160118423A - 왕침개미의 Ｐａｃｃ３ 알레르겐을 재조합적으로 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20160118423A
Application number: KR1020150046097A
Authority: KR
Inventors: 정경용; 박중원
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-01
Filing date: 2015-04-01
Publication date: 2016-10-12
Also published as: KR101686880B1; WO2016159687A1

Abstract

본 발명은 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐을 재조합적으로 제조하는 방법 및 이에 의하여 제조된 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 재조합 왕침개미 Pac c 3 알레르겐은 알레르겐 유발 활성을 보유하므로, 이를 이용하여 왕침개미 알레르기를 진단할 수 있고, 나아가 왕침개미 알레르기의 예방을 위한 면역치료제로 개발할 수 있다.

Description

왕침개미의 Ｐａｃｃ３ 알레르겐을 재조합적으로 제조하는 방법{Methods for preparing recombinant Asian needle ant allergen Pac c 3}

본 발명은 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐을 재조합적으로 제조하는 방법 및 이에 의하여 제조된 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐에 관한 것이다.

곤충에 쏘이거나(주로 벌, 개미) 물리거나(주로 모기), 곤충의 배설물 혹은 사체 부스러기를 흡입하여(주로 바퀴벌레) 우리 몸에서 나타나는 알레르기 반응을 곤충 알레르기라고 한다. 자극에 의한 증상은 대부분 국소적인 발적이나 통증 등이지만, 많은 곤충에 동시 다발적으로 쏘이게 되면 흡수되는 물질의 양이 많아지므로 혈압 저하와 같은 전신 반응이 나타날 수 있다. 이러한 경우를 제외하면, 심각한 증상은 대개 알레르기 반응에 의해 나타난다. 일반적인 면역반응이 갖는 특징이 그러하듯, 한 번만 쏘여도 전신적으로 심한 반응이 나타날 수 있으며, 다시 쏘이면 비슷한 반응이 반복적으로 나타날 수 있다.

개미의 일부 종은 침(sting)을 가지고 있고, 왕침개미(Pachycondyla chinensis, Asian needle ant)는 개미 쏘임의 가장 흔한 원인이다¹. 왕침개미에게 쏘이는 경우 나타나는 가장 흔한 증상 중 하나는 아나필락시스이다². 왕침개미가 들끓는 지역에서 약 23%의 사람이 왕침개미에 알레르기를 나타내며, 이들 중 2.1%는 전신적인 아나필락시스 반응을 경험한 것으로 보고되었다³. 아나필락시스를 비롯한 알레르기를 유발하는 왕침개미의 23 kDa 알레르겐(Pac c 3)이 독주머니가 포함된 왕침개미의 복부에 대한 단백질 분석(proteomic analysis)을 통하여 동정되었다⁴.

독을 이용하여 알레르기를 진단 및 치료할 수 있음이 곤충 독 알레르기에 대하여 규명되었다⁵. 나아가, 정제된 알레르겐을 이용한 진단(component-resolved diagnosis)의 유용성이 벌독 알레르기(Hymenoptera allergy)에 대하여 보고된바 있다⁶. 따라서, 곤충 알레르기, 특히 주변에서 흔하게 접할 수 있는 왕침개미에 의한 알레르기의 정확한 진단과 효율적 치료를 위한 재조합 알레르겐의 제조기술이 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

Kim BJ, Kim JH, Kim KG. Korean J Entomol 1998; 28: 145-54. Kim SS, Park HS, Kim HY, Lee SK, Nahm DH. J Allergy Clin Immunol. 2001;107:1095-9. Cho YS, Lee YM, Lee CK, Yoo B, Park HS, Moon HB. J Allergy Clin Immunol. 2002;110:54-7. Lee EK, Jeong KY, Lyu DP, Lee YW, Sohn JH, Lim KJ, Hong CS, Park JW. Clin Exp Allergy. 2009;39:602-7. Hunt KJ, Valentine MD, Sobotka AK, Benton AW, Amodio FJ, Lichtenstein LM. N Engl J Med 1978; 299 (4): 157-161. Monsalve RI, Vega A, Marques L, Miranda A, Fernandez J, Soriano V, Cruz S, Dominquez-Noche C, Sanchez-Morillas L, Armisen-Gil M, Guspi R, Barber D. Allergy 2012;67(4):528-536.

본 발명자들은 왕침개미 알레르기의 진단 및 치료에 이용 가능한 왕침개미 알레르겐을 재조합적으로 생산하기 위한 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들이 새로이 고안한 5'쪽에 추가 염기 서열이 부가되어 변형된 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자를 효모에서 발현시키는 경우, 발현된 Pac c 3 알레르겐이 천연의 Pac c 3 알레르겐과 마찬가지로 알레르기 유발 활성을 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐을 재조합적으로 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 왕침개미의 재조합 Pac c 3 알레르겐을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐을 재조합적으로 제조하는 방법을 제공한다:

(a) 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 효모에 형질전환 하는 단계, 상기 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자는 5' 쪽에 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이 부가되어 있고;

(b) 단계 (a)의 형질전환 효모를 배양하여 Pac c 3 알레르겐을 발현시키는 단계; 및

(c) 단계 (b)에서 배양된 효모 또는 이의 배양물로부터 Pac c 3 알레르겐을 분리하는 단계.

본 발명자들은 왕침개미 알레르기의 진단 및 치료에 이용 가능한 왕침개미 알레르겐을 재조합적으로 생산하기 위한 연구를 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들이 새로이 고안한 5'쪽에 추가 염기 서열이 부가되어 변형된 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자를 효모에서 발현시키는 경우, 발현된 Pac c 3 알레르겐이 천연의 Pac c 3 알레르겐과 마찬가지로 알레르기 유발 활성을 가지고 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 제조방법을 상세히 설명한다.

(a) 효모의 형질전환

단계 (a)에서는 5' 쪽에 서열목록 제1서열의 염기 서열이 부가되어 변형된 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터로 효모를 형질전환 시킨다. 상기 서열목록 제1서열의 염기 서열은 본 발명자들이 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐을 효모를 이용하여 재조합적으로 생산하기 위하여 고안한 부가 서열이다.

본 발명의 특징 중 하나는, 5'쪽에 서열목록 제1서열의 추가 염기 서열이 부가된 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자를 이용하여 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐을 재조합적으로 생산한다는 점이다. 하기 실시 예에서 확인된 바와 같이, 서열목록 제1서열의 염기 서열을 5'쪽에 부가하여 제조한 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자를 효모에서 발현시킨 경우, 발현된 Pac c 3 알레르겐이 IgE 항체와 반응하는 등 알레르기 유발 활성을 보였으나, 다른 염기 서열을 5'쪽에 부가하여 제조한 경우에는 발현된 Pac c 3 알레르겐이 IgE 항체와 반응하지 않았다(도 2-4 참조).

본 명세서에서 사용된 용어, "Pac c 3 알레르겐"은 왕침개미 알레르기의 주요 원인 물질로서, 심한 경우 아나필락시스를 유발할 수 있는 알레르겐이다. Pac c 3 알레르겐은 Venom allergen 5 또는 23 kDa 알레르겐으로도 불린다. 상기 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐의 염기 서열과 아미노산 서열은 NCBI에 각각 GenBank accession No. EU516327(서열목록 제4서열) 및 ACA96507(서열목록 제5서열)로 공개되어 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 5' 쪽에 서열목록 제1서열의 염기 서열이 부가되어 변형된 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자는 서열목록 제2서열의 염기 서열을 포함하며, 서열목록 제3서열의 단백질(Pac c 3 알레르겐)을 코딩한다.

Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자의 5' 쪽에 부가되는 염기 서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당 업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ blast_help.html에서 확인할 수 있다.

예를 들어, 서열목록 제1서열은 Thr Asp Tyr Glu Asp Leu Lys(서열목록 제6서열)을 코딩하는 염기 서열이므로,「지방족 하이드록실 그룹을 갖는 아미노산 - 산성 아미노산 - 방향족 아미노산 - 산성 아미노산 - 산성 아미노산 - 지방족 아미노산 - 염기성 아미노산」으로 표시되는 펩타이드를 코딩하는 염기 서열로의 변형이 이루어질 수 있다. 또한, 서열목록 제1서열의 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명의 벡터는 숙주 세포(효모 세포)에서 목적 유전자(서열목록 제1서열이 부가된 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자)를 발현시키기 위한 수단으로, 플라스미드 벡터를 포함하며, 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환 된 후 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 상기 벡터 시스템은 당 업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명에서 효모 세포로의 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떠한 방법에 따라서도 실시할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이러한 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에서는 숙주 세포로서, 예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 칸디다 보이디니(Candia boidini), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica) 및 오가테아 미누타(Ogataea minuta) 등과 같은 효모 세포를 이용할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 숙주 세포는 피키아 파스토리스이다.

(b) Pac c 3 알레르겐의 발현

단계 (b)에서는 형질전환 효모를 배양하여 Pac c 3 알레르겐을 발현시킨다.

형질전환 효모의 배양은 당 업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions, 138-176)에 개시되어 있다.

형질전환 효모를 배양하기 위한 배지는 숙주세포의 생육에 필요한 탄소원 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로는 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 수크로오스, 및 메탄올 등이 예시된다. 무기질소원 또는 유기질소원으로는 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘스팁 리쿼(corn steep liquer), 펩톤, 카제인, 소 추출물, 대두백 및 감자추출물 등이 예시된다. 필요에 따라 다른 영양소, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 같은 무기염, 비타민류, 및 항생물질(테트라사이클린, 네오마신, 암피실린, 및 카나마이신) 등을 포함할 수 있다. 배양 시는 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명에서는 효모 균주의 발효를 통하여 Pac c 3 알레르겐을 대량으로 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포로서 피키아 파스토리스를 이용하는 경우에는 탄소원을 공급하여 균체를 고농도로 배양한 후, 메탄올을 주입하여 Pac c 3 알레르겐의 대량 생산을 유도한다.

(c) Pac c 3 알레르겐의 분리정제

단계 (c)에서는 배양된 효모 또는 이의 배양물로부터 Pac c 3 알레르겐을 분리정제하여 재조합 Pac c 3 알레르겐을 최종적으로 수득한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 최종적으로 수득한 재조합 Pac c 3 알레르겐은 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에서, 상기 배양된 형질전환 효모 또는 이의 배양물(예컨대, 배양 상청액)로부터 발현된 Pac c 3 알레르겐의 분리정제는 당 업계에서 통상적으로 이용되는 단백질 분리 및 정제 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리, 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등의 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법을 조합하여 분리 및 정제하게 된다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 분리정제는 배양 상청액을 암모늄 설페이트 침전을 통하여 농축시킨 후, 침전물을 버퍼로 투석한 다음 크로마토그래피로 정제한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 암모늄 설페이트의 농도는 50-75%(w/v)이다. 하나의 특정 예에서, 상기 암모늄 설페이트의 농도는 65-75%(w/v)이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 크로마토그래피는 친화 크로마토그래피이다. 하나의 특정 예에서, 상기 친화 크로마토그래피는 Ni-친화 크로마토그래피이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐을 재조합적으로 제조하는 방법 및 이에 의하여 제조된 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 방법에 따라 제조된 재조합 왕침개미 Pac c 3 알레르겐은 알레르겐 유발 활성을 보유하므로, 이를 이용하여 왕침개미 알레르기를 진단할 수 있고, 나아가 왕침개미 알레르기의 예방을 위한 면역치료제로 개발할 수 있다.

도 1은 재조합 23 kDa 알레르겐의 정제 결과를 보여준다. 단백질(5 ㎍)을 12% 아크릴아미드 겔에서 환원 조건 하에서 분리하고, 쿠마시브릴리언트블루로 염색하였다.
도 2는 재조합 23 kDa 알레르겐의 IgE 반응성을 보여준다. 점선은 컷오프 값을 나타낸다.
도 3은 IgE 면역블랏 분석 결과를 보여준다. 왕침개미 독주머니 추출물을 12% SDS-PAGE 상에서 분리하고, PVDF 막으로 옮겼다. M: 분자량 기준, E: 쿠마시블루로 염색된 독주머니 추출물, P: 재조합 Pac c 3 알레르겐으로 미리 인큐베이션 처리하지 않은 환자로부터 분리한 혈청으로 탐지한 IgE 반응성 성분, I: 재조합 Pac c 3 알레르겐으로 미리 인큐베이션 처리한 환자로부터 분리한 혈청으로 탐지한 IgE 반응성 성분, N: 대조군 버퍼.
도 4는 N-말단 서열이 다른 Pac c 3의 정제사진으로서, 서열목록 제1서열이 아닌 다른 서열이 5'쪽에 부가된 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자를 효모에서 발현시킨 경우, 발현된 Pac c 3 알레르겐이 IgE 항체와 반응하지 않았음을 보여준다. M: 크기 마커, P: 배지에 분비된 단백질을 모아서 Ni-컬럼에 로딩하였을 때 결합하지 않고 흘러나온 단백질, W: 20 mM 이미다졸을 포함하는 버퍼로 Ni-레진에 약하게 결합한 단백질을 세척(wash)한 단백질, E1-E5: 각각 1 mL 250 mM 이미다졸을 포함하는 용출 버퍼(elution buffer)로 정제한 단백질. 왼쪽 숫자는 분자량(kDa)을 나타낸다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

재조합 알레르겐의 발현 및 정제

23 kDa 알레르겐의 오픈 리딩 프레임을 pCR^ⓡ II-TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클로닝 된 cDNA를 주형으로 사용한 PCR 증폭을 통하여 얻었다. 사용한 프라이머 서열은 다음과 같았다: 정방향 프라이머(서열목록 제7서열; 5'-CTCGAG AAAAGAGAGGCTGAAGCT ACTGATTACGAAGATTTAAAA ACTGAAGGCGGCGCGGTG-3'), 역방향 프라이머(서열목록 제8서열, 5'-GCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGTTGGTATATTGGTG CGCC-3'). 밑줄 친 aaaagagaggctgaagct 서열은 신호 서열의 절단(signal cleavage)을 위하여 도입하였으며, 밑줄과 이탤릭채로 표시된 actgattacgaagatttaaaa 서열은 천연(native) 알레르겐의 N-말단 아미노산 서열에 부가되도록 정방향 프라이머에 도입하였다. 재조합 단백질의 정제를 위한 6개의 히스티딘 서열(밑줄로 표시)을 역방향 프라이머에 도입시켰다. pPIC9 효모 발현 벡터(Invitrogen)로 클로닝하기 위하여, Xho I 및 NotI 제한효소 인식부위를 프라이머 서열에 추가하였다. PCR 증폭된 DNA 단편들을 pCR4 TOPO 벡터(Invitrogen)에 라이게이션 한 후, Xho I 및 Not I 제한효소로 절단하였다. 절단된 DNA 단편을 pPIC9 벡터로 서브클로닝 하였다. Pichia EasyComp 키트(Invitrogen)를 사용하여 효모 GS115 세포를 Stu I-linearized 플라스미드로 형질전환 하였다. 히스티딘 결핍 배지에서 자라는 His+ 형질전환체를 RDB 플레이트(1 M 솔비톨, 1% 덱스트로즈, 4 x 10^-5% 비오틴, 1.34% yeast nitrogen base without amino acids, 및 각 0.005%의 L-글루탐산, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌)에서 선별하였다. 5'AOX 및 3'AOX 프라이머를 사용하여 각 콜로니로부터 분리된 게놈 DNA(주형)를 사용한 PCR을 통하여 cDNA의 효모 게놈으로의 삽입(integration)을 확인하였다. 제대로 삽입된 cDNA를 갖는 클론을 30℃의 온도에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 상청액을 암모늄 설페이트 침전(70%)으로 농축하였다. 침전물을 용해하고 결합 버퍼(10 mM 이미다졸, 300 mM NaCl 및 50 mM 인산나트륨, pH 8.0)로 투석하였다. Ni-니트릴로트리아세트산 레신(Qiagen, Valencia, CA, USA)과 용출 버퍼(250 mM 이미다졸, 300 mM NaCl 및 50 mM 인산나트륨, pH 8.0)를 사용하여 재조합 단백질을 정제하였다. 브래드포드 분석(Biorad, Hercules, CA, USA)으로 단백질의 농도를 정량하고, 정제된 단백질을 황산 도데실 나트륨(sodium dodecyl sulfate)을 포함하는 12% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 환원 조건 하에서 분석하였다.

또한, 위의 재조합 23 kDa 알레르겐과 달리, N-말단에 다른 아미노산 서열이 부가된 23 kDa 알레르겐을 제조하였다. 이를 위하여, 정방향 프라이머로서 prPac c 3F2 프라이머(5'-CTCGAGAAAAGA ACTGATTACGAAGATTTAAAA ACTGAAGGCGGCGCGGTG-3'; 서열목록 제9서열)를 사용하였고, 역방향 프라이머는 위의 방법과 같았다. 배지로 분리된 단백질을 Ni-NTA 레진을 이용하여 정제하였다.

혈청 시료

개미 아나필락시스 환자로부터 채취한 7개의 혈청 중 6개를 실험에 사용하였다. 집먼지 진드기 알레르기가 있는 개체로부터 분리한 8개의 혈청과 건강한 사람으로부터 분리한 16개의 혈청 역시 본 실험에 사용하였다.

재조합 단백질에 대한 IgE의 특이적 반응성

100 ㎕의 재조합 단백질(50 mM 탄산나트륨에 용해된 2 ㎍/㎖, pH 9.6)을 마이크로타이터 플레이트를 코팅하였다. 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS(PBST)로 세척한 후, 플레이트를 PBST에 용해된 3% 탈지유로 억제(block)하였다. 이후, 1% 소 혈청 알부민이 함유된 PBST로 1:4의 비율로 희석된 혈청 50 ㎕/웰과 함께 1시간 동안 인큐베이션 하였다. IgE 항체를 비오틴화 염소 항-인간 IgE 항체(Vector, Burlingame, CA, USA)와 스트렙트아비딘-페록시다아제(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 검출하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 발색반응을 유도하였다. 0.5 M의 H₂SO₄를 첨가한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 컷오프 값을 평균 흡광도 + 2 x 음성 대조군의 표준편차로 계산하였다.

IgE 면역블랏 및 IgE 억제

이전의 방법(Clin Exp Allergy. 2009;39:602-7)으로 제조한 독주머니로부터 추출한 알레르겐 추출물을 황산 도데실 나트륨이 함유된 12% 폴리아크릴아미드 겔 상에 환원 조건 하에서 전기영동 하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 PVDF 막(polyvinylidine difluoride membrane; GE Waters & Process Technologies, Trevose, PA, USA)으로 옮겼다. PBST에 용해된 3% 탈지유로 억제시킨 후, ELISA를 통하여 재조합 단백질에 양성 반응을 보인 5명으로부터 채취한 혈청을 사용하여 알레르겐을 검출하였다(1% BSA가 함유된 PBST에 1:4의 비율로 희석). 알레르겐 특이적 IgE 항체를 1:1000으로 희석된 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 컨쥬게이트 염소 항-인간 IgE 항체(Sigma-Aldrich)를 사용하여 1시간 동안 검출하고, 니트로 블루 테트라졸륨과 5-브로모-4-클로로-3-인도릴-포스페이트(Promega, MD, WI, USA)를 사용하여 발색 반응을 유도하였다.

억제 면역블랏(inhibition immunoblotting)을 위하여, 혈청 시료를 20 ㎍/㎖의 재조합 단백질과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 하였다. 이어, 재조합 단백질로 인큐베이션 처리된 상태의 혈청을 사용하여 면역블랏을 실시하였다.

실험결과

재조합 알레르겐의 생산

재조합 단백질의 발현 수준을 4일 동안 매 24시간 마다 확인하였다. 재조합 단백질의 분비는 배양 배지에서의 발현 24시간째에만 확인되었다. 재조합 단백질은 50-70%의 암모늄 설페이트 사용 시 침전되었다. 70% 암모늄 설페이트에서 농축된 단백질을 Ni-친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질 수율은 효모 배양물 1L 당 2.78 mg 이었다. 도 1은 재조합 23 kDa 알레르겐의 정제 결과를 보여준다.

재조합 단백질의 IgE 반응성

실험에 사용한 6개의 혈청 중 다섯 개의 혈청(83.3%)에서 재조합 단백질에 대하여 양성 반응이 나타났다(도 2). IgE 억제 면역블랏 분석에서는, 23 kDa 알레르겐에 대한 IgE 반응성이 재조합 단백질과의 전-인큐베이션(pre-incubation) 처리에 의하여 완전하게 억제되었다(도 3).

또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 23 kDa 알레르겐과 N-말단 서열이 다른 Pac c 3를 효모에서 발현시킨 경우에는 발현된 Pac c 3 알레르겐이 IgE 항체와 반응하지 않았다.

결론

이상과 같이, 항원 5(antigen 5)에 상응하는(homologous) 재조합 23 kDa 알레르겐을 왕침개미로부터 효모(Pichia)에서 성공적으로 생산하였다. 이와 같이 생산된 재조합 단백질은 좋은 알레르기 유발 활성을 보였다. 본 실험에서 사용한 모든 혈청 시료는 아나필락시스 병력이 있는 환자로부터 얻었고, 혈청 내 IgE 항체가 재조합 단백질과 반응하였으므로, 본 발명의 방법에 따라 생산된 재조합 23 kDa 알레르겐은 왕침개미에 의한 알레르기의 진단 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, Yonsei University <120> Methods for preparing recombinant Asian needle ant allergen Pac c 3 <130> PN150064 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence added to 5' of Pac c 3 sequence <400> 1 actgattacg aagatttaaa a 21 <210> 2 <211> 782 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pac c 3-coding nucleotide sequence having SEQ ID No. 1 at 5' <400> 2 actgattacg aagatttaaa aactgaaggc ggcgcggtgc atacgatgtg ccagtacact 60 tcacctcagc cgtcgccaaa ttgtggaact tatagcaatg cgcatataac tgccgctgat 120 aaggagacca tactgaaagt acacaatgac gagcggcaaa aagtcaaggc aggtcaagaa 180 accagaggaa atcctggtcc gcaaccagca gcaagtaata tgccggactt gacttgggat 240 aatgaattag cagcaattgc acaaaggtgg gttaatcagt gcaaaatcgg gcacgatggc 300 tgccgtaatg tagagagata tcaggttggt cagaacatag ccatgtcagg cagtacagct 360 aaaggtccat gcaacatgaa taacttagtc caaatgtgga taaatgaagt gaacgctttg 420 aacgcagcag atgtttctag tatgccgtcg gatggtaact attttatgaa gataggccat 480 tatactcaac tggtgtgggg taaaacaacg aaggtcgggt gtggaataat acaattccta 540 gacggtaaat tctacaaatg ttacttggct tgcaactatg gtccagctgg aaatatgttt 600 ggcgcaccaa tataccaata aactaattaa atttcatcaa atttactgtg caaatgtagc 660 ataagtaatc tgaaaacagt atcgaagtgt aatacgaagg aaagcatatt tctattttct 720 tctctctttg tcaagaattt attcttcaat aaaataaata cagcaataaa aaaaaaaaaa 780 aa 782 <210> 3 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pac c 3 amino acid sequence having SEQ ID No. 6 at N-terminal <400> 3 Thr Asp Tyr Glu Asp Leu Lys Thr Glu Gly Gly Ala Val His Thr Met 1 5 10 15 Cys Gln Tyr Thr Ser Pro Gln Pro Ser Pro Asn Cys Gly Thr Tyr Ser 20 25 30 Asn Ala His Ile Thr Ala Ala Asp Lys Glu Thr Ile Leu Lys Val His 35 40 45 Asn Asp Glu Arg Gln Lys Val Lys Ala Gly Gln Glu Thr Arg Gly Asn 50 55 60 Pro Gly Pro Gln Pro Ala Ala Ser Asn Met Pro Asp Leu Thr Trp Asp 65 70 75 80 Asn Glu Leu Ala Ala Ile Ala Gln Arg Trp Val Asn Gln Cys Lys Ile 85 90 95 Gly His Asp Gly Cys Arg Asn Val Glu Arg Tyr Gln Val Gly Gln Asn 100 105 110 Ile Ala Met Ser Gly Ser Thr Ala Lys Gly Pro Cys Asn Met Asn Asn 115 120 125 Leu Val Gln Met Trp Ile Asn Glu Val Asn Ala Leu Asn Ala Ala Asp 130 135 140 Val Ser Ser Met Pro Ser Asp Gly Asn Tyr Phe Met Lys Ile Gly His 145 150 155 160 Tyr Thr Gln Leu Val Trp Gly Lys Thr Thr Lys Val Gly Cys Gly Ile 165 170 175 Ile Gln Phe Leu Asp Gly Lys Phe Tyr Lys Cys Tyr Leu Ala Cys Asn 180 185 190 Tyr Gly Pro Ala Gly Asn Met Phe Gly Ala Pro Ile Tyr Gln 195 200 205 <210> 4 <211> 761 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GenBank accession No. EU516327 <400> 4 actgaaggcg gcgcggtgca tacgatgtgc cagtacactt cacctcagcc gtcgccaaat 60 tgtggaactt atagcaatgc gcatataact gccgctgata aggagaccat actgaaagta 120 cacaatgacg agcggcaaaa agtcaaggca ggtcaagaaa ccagaggaaa tcctggtccg 180 caaccagcag caagtaatat gccggacttg acttgggata atgaattagc agcaattgca 240 caaaggtggg ttaatcagtg caaaatcggg cacgatggct gccgtaatgt agagagatat 300 caggttggtc agaacatagc catgtcaggc agtacagcta aaggtccatg caacatgaat 360 aacttagtcc aaatgtggat aaatgaagtg aacgctttga acgcagcaga tgtttctagt 420 atgccgtcgg atggtaacta ttttatgaag ataggccatt atactcaact ggtgtggggt 480 aaaacaacga aggtcgggtg tggaataata caattcctag acggtaaatt ctacaaatgt 540 tacttggctt gcaactatgg tccagctgga aatatgtttg gcgcaccaat ataccaataa 600 actaattaaa tttcatcaaa tttactgtgc aaatgtagca taagtaatct gaaaacagta 660 tcgaagtgta atacgaagga aagcatattt ctattttctt ctctctttgt caagaattta 720 ttcttcaata aaataaatac agcaataaaa aaaaaaaaaa a 761 <210> 5 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GenBank accession No. ACA96507 <400> 5 Thr Glu Gly Gly Ala Val His Thr Met Cys Gln Tyr Thr Ser Pro Gln 1 5 10 15 Pro Ser Pro Asn Cys Gly Thr Tyr Ser Asn Ala His Ile Thr Ala Ala 20 25 30 Asp Lys Glu Thr Ile Leu Lys Val His Asn Asp Glu Arg Gln Lys Val 35 40 45 Lys Ala Gly Gln Glu Thr Arg Gly Asn Pro Gly Pro Gln Pro Ala Ala 50 55 60 Ser Asn Met Pro Asp Leu Thr Trp Asp Asn Glu Leu Ala Ala Ile Ala 65 70 75 80 Gln Arg Trp Val Asn Gln Cys Lys Ile Gly His Asp Gly Cys Arg Asn 85 90 95 Val Glu Arg Tyr Gln Val Gly Gln Asn Ile Ala Met Ser Gly Ser Thr 100 105 110 Ala Lys Gly Pro Cys Asn Met Asn Asn Leu Val Gln Met Trp Ile Asn 115 120 125 Glu Val Asn Ala Leu Asn Ala Ala Asp Val Ser Ser Met Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Tyr Phe Met Lys Ile Gly His Tyr Thr Gln Leu Val Trp Gly 145 150 155 160 Lys Thr Thr Lys Val Gly Cys Gly Ile Ile Gln Phe Leu Asp Gly Lys 165 170 175 Phe Tyr Lys Cys Tyr Leu Ala Cys Asn Tyr Gly Pro Ala Gly Asn Met 180 185 190 Phe Gly Ala Pro Ile Tyr Gln 195 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence coded by SEQ ID No. 1 <400> 6 Thr Asp Tyr Glu Asp Leu Lys 1 5 <210> 7 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 ctcgagaaaa gagaggctga agctactgat tacgaagatt taaaaactga aggcggcgcg 60 gtg 63 <210> 8 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 gcggccgctt aatgatgatg atgatgatgt tggtatattg gtgcgcc 47 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> prPac c 3F2 primer <400> 9 ctcgagaaaa gaactgatta cgaagattta aaaactgaag gcggcgcggt g 51

Claims

다음의 단계를 포함하는 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐을 재조합적으로 제조하는 방법:
(a) 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 효모에 형질전환 하는 단계, 상기 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자는 5' 쪽에 서열목록 제1서열의 염기 서열이 부가되어 있고;
(b) 단계 (a)에서 형질전환 된 효모를 배양하여 Pac c 3 알레르겐을 발현시키는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 배양된 효모 또는 이의 배양물로부터 Pac c 3 알레르겐을 분리하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 5' 쪽에 서열목록 제1서열의 염기 서열이 부가된 왕침개미의 Pac c 3 알레르겐-코딩 핵산 분자는 서열목록 제2서열의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 분리된 Pac c 3 알레르겐은 서열목록 제3서열의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 효모 배양물을 암모늄 설페이트 침전을 통하여 농축시킨 후, 침전물을 버퍼로 투석한 다음 크로마토그래피를 실시하여 Pac c 3 알레르겐을 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 암모늄 설페이트의 농도는 50-75%(w/v)이고, 상기 크로마토그래피는 친화 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 왕침개미의 재조합 Pac c 3 알레르겐.