KR20160117467A - 이. 콜라이 특이성 항체 서열 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 도 1에 나열된 바와 같은 CDR1 내지 CDR3 서열 중 임의의 것를 포함하는 적어도 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 임의로 도 1에 나열된 바와 같은 CDR4 내지 CDR6 서열 중 임의의 것를 포함하는 항체 경쇄 가변 영역(VL), 또는 상기 CDR1 내지 6 서열 중 임의의 것의 기능 활성 CDR 변이체를 추가로 포함하는 이. 콜라이 균주의 O25b 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다.

Description

이. 콜라이 특이성 항체 서열{E. COLI SPECIFIC ANTIBODY SEQUENCES}
본 발명은 이. 콜라이 균주의 O25b 항원에 특이적으로 결합하고 특이적인 CDR 서열을 특징으로 하는 단리된 항체에 관한 것이다.
리포폴리사카라이드(LPS)는 장내세균 병원체의 표면상에 가장 풍부한 항원이다. 전형적으로, LPS는 3개의 구조 부분, 즉 i) 지질 A(또한 내독소로서 공지됨), ii) 코어 올리고사카라이드, 및 iii) O-항원을 갖는다. 상기 맨 나중의 항원은 3 내지 6개 당(혈청형에 따라 다르다)의 반복되는 서브유닛으로 구성된다. 지질 A 및 코어 OS는 하나의 단일 장내세균 종들에서 비교적 잘 보존되지만, 항체에 대한 그의 접근성은 제한된다. 다른 한편으로, O-항원은 고도로 접근 가능하지만, 그의 구조에 관하여 매우 다양하다(이. 콜라이에서 약 180개의 상이한 O-형이 존재한다).
O-항원에 대한 항체는 이. 콜라이의 표면에 결합할 수 있으며, 따라서 상기 항체는 진단학(예를 들어 역학적 연구를 위한 O-형 분류)에 사용될 뿐만 아니라 치료학적 수단으로서 제안된다. 그럼에도 불구하고, 막대한 구조적 변화성이 주어지는 경우, O-항원 특이성 항체에 의한 광범위한 보호는 다루기 힘들다.
이. 콜라이에 의해 유발된 장외 감염은 현저한 이환율 및 사망률의 통상적인 원인이다. 최근에 대두된 이. 콜라이의 다중-약물 내성(MDR) 균주들은 이. 콜라이 감염의 상당 부분을 유발시킨다.
이들 MDR 균주에 대한 치료 선택권은 상기 균주들이 대부분의 임상적으로 관련된 항생제 부류에 대해 내성을 나타내왔기 때문에 점점 매우 제한되고 있다. 따라서, 대안의 치료 선택권, 예를 들어 단클론 항체(mAb)에 의한 수동 면역이 장차 대단히 유망하다.
과거 수년 동안, MDR 이. 콜라이의 잘-한정된 클론 계통인 ST131-O25b:H4는 모든 장외 이. 콜라이 감염의 대략 10% 및 MDR 이. 콜라이 감염의 대략 절반을 유발하는 것으로 나타났다(Peirano et al. Int J Antimicrob Agents 2010 Apr;35(4):316-21; Rogers et al. J Antimicrob Chemother 2011 Jan;66(1):1-14; Woodford et al. FEMS Microbiol Rev 2011 Sep;35(5):736-55). 상기 계통에 속하는 균주들은 제한된 이질성을 나타내며 따라서 항원 레퍼토리에 관하여 매우 유사한 것으로 간주될 수 있었다. 상기 클러스터에 속하는 균주들의 대다수는 O25b 항원을 발현하며 따라서 상기 항원을 합성하는 효소를 암호화하는 특이성 유전자(상기 LPS 합성 유전자좌 내의)가 상기 클론의 확인에 사용된다(Clermont et al. J Antimicrob Chemother 2008 May; 61(5):1024-8). 한편으로, 상기 O25 형별 혈청에 의한 응집반응을, 상기 계통의 O 항원이 유전적 차이에 의해 암시되는 바와 같이 고전적인 O25 항원과 상이함에도 불구하고(따라서 상기를 O25b라 칭하였다)사용할 수 있다. 그러나, 상기 O25 형별 혈청은 대개는 비-MDR인 O25와 MDR O25b 클론을 식별할 수 없다.
로저스(Rogers) 등(J Antimicrob Chemother 2011 Jan;66(1):1-14)은 상기 이. 콜라이 O25b-ST131 균주를 그의 3가지 주요 특징, 즉 그의 혈청 그룹(O25b), 그의 계통발생 그룹(B2) 및 그의 ST(ST131)에 의해 검출함을 개시한다. 이들 특징은 각각 검출을 돕는 것으로 개시되어 있다. 다양한 분자 기법들, 즉 MLST, PCR-기반 고속 검출 방법, 반복적인 서열 PCR 및 PFGE가 개시되어 있다. 다양한 면역글로불린을 포함하는 다클론성 항혈청(O25a 균주에 대해 발생된)이 상기 O25 항원의 측정에 사용되었으나, 하위유형들을 식별하지 못했다.
자드하브(Jadhav) 등(PLOS ONE 2011;6(3): e18063)은 B2-O25b-ST131-CTX-M-15 독성/다중내성 유형에 관련된 O25b 하위그룹에 대해 양성인 균주들의 독성 특징 및 유전적 친화성을 개시한다. 인간 임상 단리물이 분석되었으며 혈청형들로 분류되었고 독성 마커 프로파일이 획득되었다. O25 양성 균주는 O-항원 - O1 내지 O173에 대한 다클론성 항혈청을 사용하는 혈청형분석에 의해 확인되었다. 상기 O25 양성 균주에 대해, rfbO25b 하위그룹 유전자좌를 표적화하는 대립유전자-특이성 PCR에 의해 추가로 유전자분석을 수행하였다.
모라(Mora) 등(Int. J. Antimicrobial Agents 2011;37(1): 16-21)은 CTX-M-14 생산 이. 콜라이 임상 단리물 중 일부 클론 그룹, 상기 중 O25b: H4-B2-ST131의 출현을 개시한다. O 형별분석을 특이적인 O 항혈청(다클론성)에 의해 수행하였다.
클러몬트(Clermont) 등(J Antimicrob Chemother 2008 May; 61(5):1024-8)은 O25b ST131 이. 콜라이에 특이적인 대립유전자-특이성 pabB PCR 분석을 개시한다.
시야르토(Szijarto) 등(FEMS Microbiol Lett 2012;332:131-6)은 LPS 분자의 코어 구조에 근거한 이. 콜라이 균주 단리물의 분자 형별분석을 개시한다. 상기 단리물의 코어 유형을, 상기 코어 오페론 중의 유전자들을 표적화하고 각각 R1-4 및 K-12 코어 유형에 특이적인 프라이머들을 사용하여 PCR에 의해 측정하였다.
본 발명의 목적은 LPS O25b 운반 균주에 의해 유발된 이. 콜라이 감염의 예방 또는 치료에 사용되는 개선된 특이성을 갖는, 이. 콜라이, 특히 MDR 균주에 대한 항체를 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 신속하고 신뢰성 있는 방식으로, 이. 콜라이 세균, 예를 들어 MDR 균주를 진단할 수 있는 수단 및 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적은 본 발명의 주제에 의해 해결된다.
본 발명에 따라 도 1에 나열된 바와 같은 CDR1 내지 CDR3 서열 중 임의의 것, 또는 그의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는 적어도 하나의 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 이. 콜라이 균주의 O25b 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
본 발명에 따라 표 1에 나열된 바와 같은(카밧의 넘버링 시스템에 따라 표시된다) 또는 표 2에 나열된 바와 같은(IMGT 넘버링 시스템에 따라 표시된다) CDR1 내지 CDR3 서열 중 임의의 것, 또는 그의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는 적어도 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 이. 콜라이 균주의 O25b 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
구체적으로, 상기 이. 콜라이 균주는 MDR 균주이다.
하기에서 달리 나타내지 않는 한, 카밧에 따라 넘버링된, 즉 카밧 명명법에 따라 결정된 바와 같은 CDR 서열(Kabat et al ., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, U.S. Department of Health and Human Services. (1991)), 및 특히 표 1에 나열된 바와 같은 CDR 서열들(서열번호 1 내지 97)을 참조한다. 본 발명 및 특허청구범위는 동일한 항체 및 CDR을 또한 포함하지만 상이한 넘버링 및 표시를 갖는 CDR 영역, 예를 들어 표 2에 나열된 영역(서열번호 98-183 및 서열번호 39)을 가짐은 충분히 이해되며, 이때 CDR 영역들은 IMGT 시스템(The international ImMunoGeneTics, Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212)에 따라 정의된다.
구체적으로, 상기 항체는
A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 xiv)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되거나:
i) a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
ii) a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
iii) a) 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
iv) a) 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
v) a) 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
vi) a) 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
vii) a) 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 35의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
viii) a) 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
ix) a) 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
x) a) 서열번호 50의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 52의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
xi) a) 서열번호 50의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 55의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 56의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
xii) a) 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
xiii) a) 서열번호 61의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 62의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 63의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
xiv) a) 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 67의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 68의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체; 또는
B) A의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체이다.
구체적으로, 상기 기능 활성 변이체는, 모 CDR 서열 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 상기 모 CDR 서열과 적어도 60%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어지는 기능 활성 CDR 변이체이다.
특정한 태양에 따라서, 본 발명의 항체는
a) 도 2에 나타낸 바와 같은 VH 서열, 바람직하게는 서열번호 184 내지 서열번호 231 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VH 아미노산 서열;
b) 서열번호 184 내지 서열번호 231 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열; 또는
c) 서열번호 184 내지 서열번호 231 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것이고 C-말단 아미노산의 결실 및/또는 상기 VH 서열의 첫 번째 아미노산이 Q인 경우 Q1E 점 돌연변이를 추가로 포함하는 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열
을 포함한다.
예를 들어, 모 항체의 상기와 같은 기능 활성 변이체는 오직 O25b 항원에만 특이적으로 결합하는 O25b-특이성 항체이다. 예시적인 모 항체들은 도 1에 나열된 항체, 그룹 1 항체, 예를 들어 도 2에 나열된 바와 같은 8A1, 3E9 또는 2A7 모 항체의 인간화된 변이체이다. 구체적으로, 상기와 같은 변이체의 VH 또는 HC 서열이, 특히 다른 변이체가 동일한 모 항체의 임의의 다른 변이체인 경우, 각각 또 다른 변이체의 VH 및 HC 서열에 의해 치환될 수도 있다.
특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체는 표 1에 나열된 바와 같은(카밧의 넘버링 시스템에 따라 표시된다) 또는 표 2에 나열된 바와 같은(IMGT 넘버링 시스템에 따라 표시된다) CDR4 내지 CDR6 서열 중 임의의 것, 또는 그의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 임의로 추가로 포함한다.
구체적으로, 상기 항체는
A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 xiv)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되거나:
i) a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
ii) a) 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
iii) a) 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
iv) a) 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
v) a) 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
vi) a) 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
vii) a) 서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
viii) a) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
ix) a) 서열번호 47의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 48의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 49의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
x) a) 서열번호 53의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 54의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
xi) a) 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 54의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
xii) a) 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 60의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
xiii) a) 서열번호 64의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
xiv) a) 서열번호 69의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 70의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 71의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체; 또는
B) A의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR4, CDR5 또는 CDR6 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체이다.
구체적으로, 상기 항체는 도 2에 나타낸 바와 같은 VL 서열, 바람직하게는 서열번호 248 내지 서열번호 295 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VL 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 248 내지 서열번호 295 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 태양에 따라서, 본 발명의 항체는 상기 O25a 및 O25b 항원에 의해 공유된 에피토프와의 결합에 대해, 예를 들어 동일하거나, 유사하거나 또는 상이한 친화성으로 교차-특이성이다.
구체적으로, 본 발명의 항체는 바람직하게는 O25a 균주에 대해 생성된 다클론성 형별 혈청에 비해, 면역분석에 의해 측정된 바와 같이 O25(현지 공지되어 있으며 본 발명에서 O25a로서 지칭된다) 이. 콜라이 균주에 대해 생성된 다클론 혈청에 의해 상기 O25b 항원에 결합하는 것에 비해 더 높은 친화성으로 상기 O25b 및 O25a 항원과의 결합에 교차-특이성이고/이거나 이. 콜라이의 O25a 항원에 비해 O25b 항원에 우선적으로 결합하며, 바람직하게는 상기 항체는 면역분석, 바람직하게는 면역블럿팅, ELISA 또는 다른 면역학적 방법에 의해 측정된 바와 같이, 상기 O25b 및 O25a 항원 모두에 대해 적어도 동등한 친화성을 갖는다.
본 발명의 항체는, "교차-특이성"으로서 나타내지 않는 한, 본 발명에서 상기 O25b 특이성, 즉 오직 상기 O25b 항원만을 특이적으로 인식하는 항체, 예를 들어 표 1의 그룹 1 항체들 중 임의의 것으로서, 또는 교차-특이성 항체, 즉 상기 O25b 및 O25a 항원간에 공유된 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체, 예를 들어 표 1의 그룹 2 항체 중 임의의 것으로서 이해된다. 따라서, "본 발명의 항체"란 용어는 상기 O25b 특이성 항체 및 상기 O25b/O25a 교차-특이성 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 항체는 구체적으로 임의의 다른 이. 콜라이 항원과 교차-반응하지 않고/않거나, 임의의 다른 이. 콜라이 항원에 더 낮은 친화성으로 결합함을 추가의 특징으로 하며, 예를 들어 이때 다른 이. 콜라이 항원(상기 O25b 또는 O25a 항원 외의)에 비해 상기 O25b 항원에 우선적으로 결합하는 Kd 차이는 적어도 2 로그, 바람직하게는 적어도 3 로그이다.
구체적으로, 상기 항체는
A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 vii)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되거나:
i) a) 서열번호 72의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 73의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
ii) a) 서열번호 77의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 78의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 79의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
iii) a) 서열번호 81의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 82의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 83의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
iv) a) 서열번호 84의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 85의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 86의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
v) a) 서열번호 77의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 89의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 90의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
vi) a) 서열번호 92의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 93의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 94의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
vii) a) 서열번호 95의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 96의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 97의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체; 또는
B) A의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체이다.
구체적으로, 상기 항체는
a) 도 2에 나타낸 바와 같은 VH 서열, 바람직하게는 서열번호 232 내지 서열번호 247 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VH 아미노산 서열;
b) 서열번호 232 내지 서열번호 247 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열; 또는
c) 서열번호 232 내지 서열번호 247 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것이고 C-말단 아미노산의 결실 및/또는 상기 VH 서열의 첫 번째 아미노산이 Q인 경우 Q1E 점 돌연변이를 추가로 포함하는 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열
을 포함한다.
예를 들어, 모 항체의 상기와 같은 기능 활성 변이체는 교차-특이성 항체이다. 예시적인 모 항체들은 도 1에 나열된 항체, 그룹 2 항체, 예를 들어 도 2에 나열된 바와 같은 4D5 모 항체의 인간화된 변이체이다. 구체적으로, 상기와 같은 변이체의 VH 또는 HC 서열이, 특히 다른 변이체가 동일한 모 항체의 임의의 다른 변이체인 경우, 각각 또 다른 변이체의 VH 및 HC 서열에 의해 치환될 수도 있다.
특정한 태양에 따라, 본 발명의 교차-특이성 항체는 표 1에 나열된 바와 같은(카밧의 넘버링 시스템에 따라 표시된다) 또는 표 2에 나열된 바와 같은(IMGT 넘버링 시스템에 따라 표시된다) CDR4 내지 CDR6 서열 중 임의의 것, 또는 그의 기능 활성 CDR 변이체, 구체적으로 임의의 교차-특이성 항체의 CDR 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 임의로 추가로 포함한다.
구체적으로, 상기 교차-특이성 항체는
A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 vi)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되거나:
i) a) 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 76의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
ii) a) 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 80의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
iii) a) 서열번호 69의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 70의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 71의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
iv) a) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 87의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 88의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
v) a) 서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
vi) a) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 88의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체; 또는
B) A의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR4, CDR5 또는 CDR6 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체이다.
구체적으로, 상기 기능 활성 변이체는, 모 CDR 서열 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고 상기 모 CDR 서열과 적어도 60%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어지는 기능 활성 CDR 변이체이다.
특정한 태양에 따라, 본 발명의 교차-특이성 항체는 도 2에 나타낸 바와 같은 VL 서열, 바람직하게는 서열번호 296 내지 서열번호 311 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VL 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 296 내지 서열번호 311 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 구체적으로
a) 표 1에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 CDR1-CDR6 서열; 또는
b) 도 2에 나타낸 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 VH 및 VL 서열; 또는
c) 도 2에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 HC 및 LC 서열
을 포함하거나; 또는
d) 상기 a) 내지 c)의 서열들을 특징으로 하는 모 항체의 기능 활성 변이체이고, 바람직하게는 여기에서
i. 상기 기능 활성 변이체는 상기 모 항체의 CDR1 내지 CDR6 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하고/하거나;
ii. 상기 기능 활성 변이체는 상기 모 항체의 VH 및 VL 서열 및/또는 HC 및 LC 서열 중 임의의 것의 프레임워크 영역 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고, 임의로 VH 프레임워크 영역의 첫 번째 아미노산(VH FR1)이 Q인 경우 Q1E 점 돌연변이를 포함하며; 추가로
iii. 상기 기능 활성 변이체는 상기 모 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖고/갖거나;
iv. 상기 기능 활성 변이체는 상기 모 항체의 인간, 인간화된, 키메릭 또는 쥐 및/또는 친화성 성숙된 변이체이다.
특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체는 표 1에 나열된 바와 같은 CDR 조합을 포함하나, 단 상기 항체는 여전히 기능 활성이다.
구체적으로, 본 발명의 항체는 표 1에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 CDR1-6를 포함한다. 그러나, 또 다른 실시태양에 따르면 상기 항체는 상이한 CDR 조합들을 포함할 수도 있다, 예를 들어 표 1에 나열된 바와 같은 항체는 하나의 항체의 적어도 하나의 CDR 서열, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 CDR 서열 및 표 1에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 상이한 항체의 적어도 하나의 추가의 CDR 서열을 포함한다. 구체적인 예에 따르면, 상기 항체는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 CDR 서열을 포함하며, 여기에서 상기 CDR 서열은 1 초과 항체, 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 6의 상이한 항체들의 CDR 조합이다. 예를 들어, 상기 CDR 서열들은 함께, 바람직하게는 표 1에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 CDR1-3 중 1, 2 또는 3개 전부, 및 표 1에 나열된 동일하거나 또는 임의의 다른 항체의 CDR4-6 중 1, 2 또는 3개 전부를 포함할 수 있다.
본 발명에서 구체적으로 상기 CDR1, 2 및 3으로 넘버링된 CDR들은 VH 도메인의 결합 영역을 나타내고, CDR4, 5 및 6은 VL 도메인의 결합 영역을 나타내는 것으로 이해된다.
특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체는 도 2에 나타낸 바와 같은 HC 및 LC 아미노산 서열 조합 중 임의의 것, 또는 HC 및 LC 아미노산 서열의 상기와 같은 조합에 의해 형성된 결합 부위를 포함한다. 한편으로, 2개의 상이한 항체의 면역글로불린 쇄의 조합을 사용할 수 있으나, 단 상기 항체는 여전히 기능 활성이다. 예를 들어, 하나의 항체의 HC 서열을 또 다른 항체의 LC 서열과 조합할 수 있다. 추가의 특정한 실시태양에 따라, 도 2에 제공된 바와 같은 프레임워크 영역 중 임의의 것를 본 발명에 개시된 바와 같은 CDR 서열들 중 임의의 것 및/또는 VH/VL 조합에 대한 프레임워크로서 사용할 수 있다.
본 발명의 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 도 2의 아미노산 서열을 임의로 포함하는 것으로 생각된다.
특정한 태양에 따라, 도 2의 각각의 서열을 말단 연장시키거나, 또는 불변 영역 중에서 결실시킬 수 있다, 예를 들어 C-말단 아미노산 중 하나 이상을 결실시킬 수도 있다.
구체적으로, C-말단 리신 잔기를 포함하는 도 2의 각각의 HC 서열을 바람직하게는 상기와 같은 C-말단 리신 잔기의 결실과 함께 사용한다.
도 2는 상이한 HC 서열 및 상이한 LC 서열을 나타내며, 임의의 HC/LC 조합, 따라서 상기 각각의 모 항체에 대한 일련의 상이한 HC/LC 조합을 지지한다. 따라서, 각각의 모 항체의 특정한 변이체는 동일한 모 항체로부터 유래하는 도 2에 나타낸 각각의 변형 항체들의 임의의 HC/LC 조합을 포함할 수 있다.
특히, 도 2는 상기 O25b 항원만을 특이적으로 인식하는 그룹 1 항체의 모 항체 8A1, 3E9(1G8) 또는 2A7 각각, 및 상기 O25b 및 O25a 항원과 교차-특이적으로 결합하는 그룹 2 항체의 모 항체 4D5의 변이체들인 4개의 상이한 HC 서열 및 4개의 상이한 LC 서열을 나타낸다. 16개의 상이한 HC/LC 조합을 상기 모 항체 각각에 대해서 나타낸다.
또한, 도 2는 상기 O25b 항원만을 특이적으로 인식하는 그룹 1 항체의 모 항체 3E9(1G8)의 변이체인 2개의 추가의 상이한 HC 서열 및 2개의 추가의 상이한 LC 서열을 나타낸다.
또한, 도 2는 상기 O25b 및 O25a 항원과 교차-특이적으로 결합하는 그룹 2 항체의 모 항체 4D5의 변이체인 2개의 추가의 상이한 HC 서열 및 2개의 추가의 상이한 LC 서열을 나타낸다.
상기 CDR 서열들은 도 1에 나열된 바와 같은 각각의 CDR 서열들과 동일하다: 상기 모 8A1, 1G8, 2A7 또는 4D5 항체의 CDR 서열은 각각 도 1의 8A1-1G8, 3E9-G11, 2A7-F1 및 4D5-D4 항체의 서열들과 동일하다.
구체적으로, 서열번호 184 내지 서열번호 247 및 서열번호 312 내지 서열번호 315는 도 2에 나타낸 VH 아미노산 서열을 포함하는 HC 서열들을 나타내며, 각각의 HC 서열은 가능하게는 신호 서열에 의해 N-말단 연장된다. 상기 특이성 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VH 또는 HC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.
구체적으로, 서열번호 248 내지 서열번호 311 및 서열번호 316 내지 서열번호 319는 도 2에 나타낸 VL 아미노산 서열을 포함하는 LC 서열들을 나타내며, 각각의 LC 서열은 가능하게는 신호 서열에 의해 N-말단 연장된다. 상기 특이성 항체는 각각의 신호 서열과 함께 또는 상기 서열 없이, 또는 또 다른 신호 또는 리더 서열과 함께 상기와 같은 VL 또는 LC 아미노산 서열을 포함하는 것으로 생각된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체들 중 임의의 것, 예를 들어 표 1에 나열된 바와 같은 항체이거나, 또는 도 2에 나타낸 바와 같은 HC 및 LC 아미노산 서열 조합 중 임의의 것를 포함하거나, 또는 HC 및 LC 아미노산 서열의 상기와 같은 조합에 의해 형성된 결합 부위를 포함하는 항체인 모 항체의 기능 활성 항체 변이체를 생성시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 프레임워크 영역(FR) 또는 불변 도메인, 또는 상보성 결정 영역(CDR1 내지 CDR6) 중 임의의 것에서 적어도 하나의 점 돌연변이를 조작하여(engineering) 변형 항체를 획득하고, 상기 변형 항체의 기능 활성을, 구체적으로 10-6 M 미만, 바람직하게는 10-7 M 미만, 또는 10-8 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 심지어 10-10 M 미만, 또는 10-11 M 미만의 Kd로 상기 O25b와 결합하는 친화성, 예를 들어 피코몰 범위의 친화성에 의해 측정함을 포함한다. 상기 기능 활성의 측정시, 상기 기능 활성 변이체를 추가의 용도 및 임의로 재조합 생산 방법에 의한 생성을 위해 선택한다.
바람직한 CDR 변이체는 글리코실화 또는 탈아미드화되기 쉬운 동기 (motif)의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 상기 CDR 서열 중 임의의 것 중의 N-연결된 글리코실화 동기 NXS/T(여기에서 X는 임의의 아미노산이다)에서, 상기 동기 중의 'N'을 임의의 다른 상이한 아미노산, 바람직하게는 'Q', 'S', 또는 'D'로 돌연변이시켜 글리코실화 가능성을 제거할 수도 있다. 추가의 예로 상기 CDR 서열 중 임의의 것에서, 아스파라진에서 아스파트산으로 쉽게 탈아미드화될 수 있는 아미노산 동기 NG 또는 NN이 있다. 다른 동기내에서 아스파라진은 탈아미드화가 덜 용이하다.
예를 들어, 4D5의 VL CDR1(CDR4)에서 발견된 아미노산 동기 SNG는 아스파라진에서 아스파트산으로의 탈아미드화가 용이할 수 있다. 따라서, mAb 4D5의 VL CDR1에서 SNG 동기 중의 'N'의 "폴리싱(polishing)" 돌연변이를 잠재적인 탈아미드화 부위의 제거를 위해서 임의의 다른 상이한 아미노산, 바람직하게 'Q', 'S' 또는 'D'로 돌연변이시킬 수 있다.
특정한 태양에 따라, 상기 변형 항체는 모 항체와 동일한 에피토프와 결합한다.
추가의 특정한 태양에 따라, 상기 변형 항체는 모 항체와 동일한 결합 부위를 포함한다.
기능 활성 변형 항체는 VH 또는 VL 서열 중 임의의 것가 상이하거나, 또는 공통의 VH 및 VL 서열을 공유할 수 있으며, 각각의 FR 중에 변형을 포함할 수 있다. 돌연변이유발에 의해 모 항체로부터 유래된 변형 항체를 당해 분야에 널리 공지된 방법으로 생성시킬 수 있다.
예시적인 모 항체들이 하기 실시예 섹션 및 도 1(표 1) 및 도 2에 개시되어 있다. 구체적으로, 상기 항체는 표 1에 나열된 바와 같은 모 항체의 기능 활성 유도체이다. 하나 이상의 변형된 CDR 서열, 및/또는 하나 이상의 변형된 FR 서열, 예를 들어 FR1, FR2, FR3 또는 FR4의 서열 또는 변형된 불변 도메인 서열을 갖는 변이체를 조작할 수도 있다.
예를 들어, 기능 활성 변형 항체를 본 발명에 따라 제공하고 도 2에 나열하며, 상기는 표 1에 나열된 모 항체로부터 유래되고 돌연변이유발에 의해, 구체적으로 친화성 성숙 및/또는 인간화에 의해 획득되었다. 도 2의 변형 항체가 여전히 각각의 모 항체의 공통 VH 및 VL 서열을 공유하기는 하지만, 예를 들어 각각의 FR 또는 CDR 서열 중에 변형을 갖는, 기능상 활성인 변이체 VH 및 VL 쇄를 또한 생성시키는 것도 가능하다.
모 항체의 예시적인 변형 항체는 상기 CDR1-CDR6 중 임의의 것에 적어도 하나의 점 돌연변이 및/또는 FR 영역 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하며, 바람직하게 여기에서 상기 항체는 상기 모 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖는다.
몇몇 태양에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 상기와 같은 기능 활성 변형 항체, 바람직하게는 단클론 항체, 가장 바람직하게는 인간 항체를 제공하며, 여기에서 상기 경쇄 또는 VL 가변 영역 또는 각각의 CDR 중 임의의 것는, 8D5-1G10 또는 4D5-D4로 표시된 항체, 또는 적어도 하나의 FR 또는 CDR 서열의 변형에 의한, 표 1 또는 도 2에 나열된 바와 같은 임의의 다른 항체인 모 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 4D5-D4로 표시되고 표 1에 나열된 항체는, 항체 8D10-C8(하기에 나타내는 바와 같은 기탁된 물질에 의해 특성화된다)과 동일한 CDR 서열, 및 심지어 동일한 VH/VL 서열을 포함하지만 불변 도메인 또는 영역이 상이한, 즉 상기 불변 도메인 중 임의의 것에 적어도 하나의 변형을 포함하는 것으로 밝혀졌다.
특정한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 8D5-1G10 또는 8D10-C8로 표시된 항체를 제외한 임의의 다른 항체이다. 상기와 같은 항체는 구체적으로 가변 도메인 VH/VL 중 하나 또는 둘만으로 구성되고 본 발명에서 추가로 개시되는 바와 같은 기탁된 VH/VL 물질에 의해 한정되는 것으로 이해된다. 그러나, 8D5-1G10 또는 8D10-C8로 표시된 항체의 특정한 변이체, 예를 들어 비제한적으로 CDR 변이체, FR 변이체, 쥐, 키메릭, 인간화된 또는 인간 변이체, 또는 다양한 유형의 전체-길이 항체, Fab, scFv 등을 포함한, 상기 VH/VL 조합 중 하나 또는 둘로 구성된 조합 외의 임의의 항체 도메인 조합이 구체적으로 본 발명의 특허청구범위의 주제에 포함된다.
특정한 실시태양은 도 1에 언급되고 도 2에 추가로 명시된 각 항체의 CDR 서열 및 가변 도메인을 특징으로 하는 4D5-D4(4D5) 또는 8A1-1G8(8A1) 항체에 관한 것이며, 상기 항체는 가변 및 불변 도메인을 포함하고, 예를 들어 전체-길이 항체이고, 쥐, 키메릭, 인간화된 또는 인간 항체이다.
그러나, 8D5-1G10 또는 8D10-C8로서 표시된 항체를 모 항체로서 사용하여 그의 기능 활성 변이체를 조작할 수 있다. 구체적으로, 8D5-1G10 또는 8D10-C8로 표시된 항체 또는 그의 임의의 기능 활성 변이체를, 예를 들어 IgG 항체를 생성시키기 위해서, 임의로 추가의 면역글로불린 서열과 함께 재조합 수단에 의해 본 발명에 제공된 바와 같은 서열들을 사용하여 생성시킬 수 있다. 구체적으로, 8D5-1G10 또는 8D10-C8로서 표시된 상기와 같은 항체의 기능 활성 변이체를 적어도 하나의 FR 또는 CDR 서열의 변형에 의해 생성시킬 수 있다.
특정한 태양에 따라, 본 발명은 항체 8D5-1G10의 항원-결합 부위를 포함하거나, 또는 항체 8D5-1G10 또는 상기 항체 8D5-1G10의 기능 활성 변이체로부터 유래된 다중약물 내성(MDR) 이. 콜라이 균주의 O25b 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 단클론 항체를 제공하며, 바람직하게 여기에서 상기 항체 8D5-1G10은
a) DSM 26763 하에 기탁된 숙주 세포에 의해 생산된 항체 경쇄의 가변 영역; 및/또는
b) DSM 26762 하에 기탁된 숙주 세포에 의해 생산된 항체 중쇄의 가변 영역
을 특징으로 하거나; 또는
c) (a) 및/또는 (b)의 기능 활성 변이체가 사용된다.
구체적으로, 8D5-1G10으로서 표시된 항체는 DSM 26763 하에 기탁된 이. 콜라이 숙주 세포에 포함된 플라스미드의 암호화 서열에 의해 암호화된 가변 영역을 포함하는 항체 경쇄, 및 DSM 26762 하에 기탁된 이. 콜라이 숙주 세포에 포함된 플라스미드의 암호화 서열에 의해 암호화된 가변 영역을 포함하는 항체 중쇄로 구성된다.
또 다른 특정한 태양에 따라, 본 발명은 상기 O25a 및 O25b 항원에 의해 공유된 에피토프에 결합하는 교차-특이성이고 항체 8D10-C8의 항원-결합 부위를 포함하거나 또는 상기 항체 8D10-C8 또는 상기 항체 8D10-C8의 기능 활성 변이체로부터 유래된 단리된 단클론 항체를 제공하며, 바람직하게 여기에서 상기 항체 8D10-C8은
a) DSM 28171 하에 기탁된 숙주 세포에 의해 생산된 항체 경쇄의 가변 영역; 및/또는
b) DSM 28172 하에 기탁된 숙주 세포에 의해 생산된 항체 중쇄의 가변 영역
을 특징으로 하거나; 또는
c) (a) 및/또는 (b)의 기능 활성 변이체가 사용된다.
구체적으로, 8D10-C8로서 표시된 항체는 DSM 28171 하에 기탁된 이. 콜라이 숙주 세포에 포함된 플라스미드의 암호화 서열에 의해 암호화된 가변 영역을 포함하는 항체 경쇄, 및 DSM 28172 하에 기탁된 이. 콜라이 숙주 세포에 포함된 플라스미드의 암호화 서열에 의해 암호화된 가변 영역을 포함하는 항체 중쇄로 구성된다.
구체적으로, 상기 항체는 표 1에 나열된 바와 같은 CDR 서열 중 임의의 것의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하며, 여기에서 상기 기능 활성 CDR 변이체는 하기 중 적어도 하나를 포함한다
a) 모 CDR 서열 중 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이; 및/또는
b) 상기 모 CDR 서열의 4개의 C-말단 또는 4개의 N-말단, 또는 4개의 중심 아미노산 위치 중 임의의 것에서 1 또는 2개의 점 돌연변이; 및/또는
c) 상기 모 CDR 서열과 적어도 60%의 서열 동일성.
구체적으로, 상기 기능 활성 변형 항체는 본 발명의 기능 활성 CDR 변이체 중 적어도 하나를 포함한다. 구체적으로, 상기 기능 활성 CDR 변이체 중 하나 이상을 포함하는 기능 활성 변형 항체는 상기 모 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖는다.
구체적으로, 상기 기능 활성 변이체는, 예를 들어 적어도 60%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 70%, 80% 또는 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CDR, 보다 구체적으로 CDR 고리 서열을 포함하는 CDR 변이체이다.
특정한 태양에 따라, 상기 적어도 하나의 점 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입 중 임의의 것이다.
구체적으로, 상기 기능 활성 변이체는 아미노산 서열 중의, 바람직하게는 CDR 중의 적어도 하나의 점 돌연변이가 상기 모 항체와 상이하며, 여기에서 상기 CDR 아미노산 서열들 각각의 점 돌연변이의 수는 0, 1, 2 또는 3이다.
구체적으로, 상기 항체는 상기와 같은 항체로부터 유래하며, 각각의 CDR 서열, 또는 하나의 CDR 고리내에, 예를 들어 5 내지 18 아미노산 길이의 CDR 내에, 예를 들어 5 내지 15 아미노산 또는 5 내지 10 아미노산의 CDR 영역내에, 예를 들어 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이를 갖는 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는 CDR 돌연변이체를 사용한다. 한편으로, 하나의 CDR 고리내에, 예를 들어 5 아미노산 미만의 CDR 길이 내에 1 내지 2개의 점 돌연변이가 존재하여 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는 항체를 제공할 수 있다. 특정한 CDR 서열들은 짧을 수도 있다, 예를 들어 CDR2 또는 CDR5 서열일 수도 있다. 특정한 실시태양에 따라, 상기 기능 활성 CDR 변이체는 4 또는 5 아미노산 미만으로 이루어지는 임의의 CDR 서열 중에 1 또는 2개의 점 돌연변이를 포함한다.
특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체는 CDR 및 프레임워크 서열을 포함하며, 여기에서 상기 CDR 및 프레임워크 서열 중 적어도 하나는 인간, 인간화된, 키메릭, 쥐 또는 친화성 성숙된 서열을 포함하며, 바람직하게는 상기 프레임워크 서열은 IgG 항체, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위유형, 또는 IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체의 서열이다.
예를 들어 모 항체의 제조가능성 또는 내인성을 개선시키기 위한, 예를 들어 낮은 면역원성 잠재성을 갖는 개선된 (돌연변이된) 항체, 예를 들어 모 항체에 비해 CDR 서열 및/또는 프레임워크 서열 중 임의의 것에 돌연변이를 갖는 인간화된 항체를 제공하기 위한 프레임워크 돌연변이된 항체로서 특이성 항체를 제공한다.
예를 들어 항체의 친화성을 개선시키고/시키거나 모 항체에 의해 표적화된 에피토프와 동일한 에피토프 또는 그 부근의 에피토프를 표적화하기 위한(에피토프 이동) CDR 돌연변이된 항체로서 추가의 특이성 항체를 제공한다.
따라서, 표 1 또는 도 2에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 것를 개선된 버전을 조작하기 위한 모 항체로서 사용할 수 있다.
특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체는 10-6 M 미만, 바람직하게는 10-7 M 미만, 또는 10-8 M 미만의 Kd로 상기 O25b 항원에 결합하는 친화성을 갖는다. 친화성 성숙된 변이체는 전형적으로 10-8 M 미만의 Kd로 상기 O25b 항원에 결합하는 친화성을 갖는다.
구체적으로, 본 발명의 항체는 이. 콜라이의 O25a 항원에 비해 상기 O25b 항원에 우선적으로 결합하거나, 또는 적어도 상기 두 항원 모두에 대해 동등한 친화성으로 결합한다.
특정한 실시태양에 따라, 상기 항체는 상기 O25a 항원에 비해 상기 O25b 항원에 적어도 2배 더 큰 결합 친화성을 갖는다, 구체적으로 상기 O25b 또는 상기 O25a 항원의 결합에서, 예를 들어 친화성 및/또는 결합활성의 차이에서 적어도 2배 차이, 또는 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 심지어 적어도 10배 차이를 갖는다.
특정한 태양에 따라 상기 O25b에 대한 특이적인 결합은 면역분석, 바람직하게는 면역블럿팅, ELISA 또는 다른 면역학적 방법들에 의해 측정시 O25 또는 O25a 이. 콜라이 균주에 대해 발생된 다클론 혈청에 의한 상기 O25b 항원에의 결합에 비해 상기 O25b 항원에 대해 더 큰 결합 친화성을 특징으로 한다. 상기 더 높은 결합 친화성은 구체적으로 적어도 2배 차이, 또는 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 심지어 적어도 10배 차이를 갖는다.
구체적으로, 본 발명의 항체에 의해 표적화된 바와 같은 상기 O25b 항원은 ST131 균주 중 하나 이상에 만연하며, 보다 특히 상기 균주의 대다수에 존재한다.
구체적으로, 상기 항체에 의해 인식된 에피토프는 캡슐화된 및 캡슐화되지 않은 ST131-O25b:H4 균주, 예를 들어 돌연변이 균주의 표면상에 존재한다.
추가의 특정한 태양에 따라, 상기 항체는 살아있는 야생형 MDR 이. 콜라이 균주를 포함하는 혈청 샘플에서 시험관내 살균 효능을 나타낸다.
추가의 특정한 태양에 따라, 상기 항체는 시험관내에서 식세포에 의한 살아있는 야생형 MDR 이. 콜라이 균주의 흡수를 자극한다.
추가의 특정한 태양에 따라, 상기 항체는 시험관내에서 특이적인 LPS 분자의 내독성 효과를 중화시킨다.
구체적으로, 상기 항체는 전체-길이 단클론 항체, 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 그의 항체 단편, 또는 상기 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 바람직하게, 상기 항체는 쥐, 키메릭, 인간화된 및 인간 항체, 중쇄 항체, Fab, Fd, scFv 및 VH, VHH 또는 VL 같은 단일-도메인 항체, 바람직하게는 인간 IgG1 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
추가의 특정한 태양에 따라, 상기 항체는 전체-길이 단클론 항체 또는 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 그의 항체 단편을 가지며, 상기 항체는 쥐, 라마, 토끼, 염소, 소, 키메릭, 인간화된 및 인간 항체, 중쇄 항체, Fab, Fd, scFv 및 VH, VHH 또는 VL 같은 단일-도메인 항체, 바람직하게는 인간 IgG1 항체 및 쥐 IgG 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항체이다.
본 발명에 따라, 본 발명의 항체는 특히 의학적, 진단학적 또는 분석학적 용도를 위해 제공된다.
특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체는 이. 콜라이 감염, 특히 MDR 이. 콜라이 균주에 의한 감염의 위험이 있거나 또는 상기 감염을 앓고 있는 피험자의 치료에 사용하기 위해 제공되며, 바람직하게는 신우신염, 2차 세균혈증, 패혈증, 복막염, 뇌수막염, 및 인공호흡기-관련 폐렴의 치료 또는 예방을 위해 상기 피험자에게 상기 피험자에서 상기 감염을 제한하거나 또는 상기 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 개선시키기에 유효한 양의 상기 항체를 투여함을 포함한다.
따라서, 본 발명은 특히 이. 콜라이 감염의 위험이 있거나 또는 상기 감염을 앓고 있는 피험자를, 상기 피험자에게 유효량의 상기 항체를 투여함으로써 치료하는 치료 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 항체를 MDR 이. 콜라이, 바람직하게는 ST131-O25b:H4 균주를, 상기 균주에 의해 발현되는 캡슐 폴리사카라이드에 관계없이 살균 살해하기 위해 제공한다.
특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체를 사용하는 면역요법은 예를 들어 다양한 동물 모델에서 측정시, 살아있는 세균 공격에 대해 유효하게 보호할 수 있다.
상기 항체는 치명적인 내독소혈증을 특이적으로 중화시킬 수 있다. 상기와 같은 기능 활성을 적합한 생체내 모델에서 측정할 수 있다(정제된 LPS에 의한 공격).
상기 항체는 예를 들어 시험관내 혈청 살균 분석(SBA)에 의해 측정시 보체-매개된 살해에 의해 MDR 이. 콜라이에 특히 유효하며, 예를 들어 대조용 샘플(항체가 없거나 또는 관련없는 대조용 mAb가 첨가된)보다 세균을 적어도 20% 살해한다.
상기 항체는 예를 들어 시험관내 옵소닌개시 식작용 살해 분석(OPK)에 의해 측정시 항체 매개된 식작용에 의해 MDR 이. 콜라이에 특히 유효하며, 예를 들어 대조용 샘플(항체가 없거나 또는 관련없는 대조용 mAb가 첨가된)보다 투입 세균을 적어도 20% 흡수하거나 20% 더 낮은 최종 CFU수를 갖는다.
상기 항체는 예를 들어 시험관내 LAL 분석 또는 톨형 수용체 4(LTR4) 수용체 분석에 의해 측정시 내독소 기능의 중화에 의해 MDR 이. 콜라이에 특히 유효하며, 예를 들어 대조용 샘플(항체가 없거나 또는 관련없는 대조용 mAb가 첨가된)에 비해 내독소 활성이 적어도 20% 감소된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 포함하는, 바람직하게는 비경구 또는 점막 제형을 포함하는, 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약학 제제를 제공한다.
상기와 같은 약학 조성물은 유일한 활성 물질로서, 또는 다른 활성 물질, 또는 활성 물질들의 칵테일, 예를 들어 적어도 2개 또는 3개의 상이한 항체들의 조합 또는 칵테일과 함께 상기 항체를 함유할 수 있다.
특정한 태양에 따라, 본 발명의 항체를 피험자에서 이. 콜라이 감염 또는 이. 콜라이 균주에 의해 유발된 세균혈증, 특히 LPS O25b를 발현하는 MDR 균주에 의해 유발된 감염, 예를 들어 상부 및 하부 요로 감염, 예를 들어 특히 당뇨병 환자에서 방광염 또는 요도염, 상행성 신우신염 또는 혈행성 신우신염뿐만 아니라 세균혈증, 패혈증, 복막염, 또는 장 군체형성을 측정하기 위한 진단학적 용도를 위해 제공한다.
구체적으로, 상기 항체를 피험자에서 MDR 이. 콜라이에 의한 전신 감염을, 상기 피험자의 체액 샘플을 상기 항체와 접촉시킴으로써 생체외에서 측정하는 본 발명에 따른 용도를 위해 제공하며, 여기에서 상기 항체의 특이적인 면역 반응은 상기 감염을 측정한다.
구체적으로, 상기 특이적인 면역 반응을 위해 체액 샘플을 시험하며, 상기 샘플은 뇨, 혈액, 혈액 단리물 또는 혈액 배양물, 흡출물, 객담, 삽관된 피험자의 세척액 및 대변으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
구체적으로, 본 발명에 따른 진단학적 용도는 임상 시편으로부터 회수한 순수한 이. 콜라이 배양물로부터 시험관내에서 이. 콜라이의 혈청형을 측정함을 지칭한다.
추가의 태양에 따라, 본 발명은 임의로 본 발명의 항체를 표지 및/또는 표지를 갖는 추가의 진단학적 시약, 예를 들어 상기 항체를 특이적으로 인식하는 시약과 함께, 또는 상기 항체와 각각의 표적 항원과의 면역 복합체 및/또는 상기 항체 및 상기 진단학적 시약 중 적어도 하나를 고정화시키는 고체상을 함유하는 본 발명 항체의 진단학적 제제를 제공한다.
본 발명은 또한 하기의 성분들을 포함하는, 조성물 또는 부품 키트 중에 본 발명의 항체 및 추가의 진단학적 시약을 포함하는 상기 항체를 포함하는 진단학적 제제를 제공한다:
a) 상기 항체; 및
b) 상기 추가의 진단학적 시약; 및
c) 임의로 상기 항체 및 진단학적 시약 중 적어도 하나를 고정화시키는 고체상.
본 발명은 또한 피험자에서 이. 콜라이 감염 또는 이. 콜라이 균주에 의해 유발된 세균혈증의 진단 방법을 제공하며, 상기 방법은
a) 본 발명의 항체를 제공하고,
b) 상기 항체가 상기 O25b 항원과 면역반응하는 지를, 예를 들어 상기 시험하려는 피험자의 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액 또는 혈청 중에서 오직 O25b 항원과의 면역반응에 의해 또는 O25b 및 O25a와 반응하는 교차-반응성 면역반응에 의해, 바람직하게는 응집반응 시험에 의해 검출함으로써 MDR 이. 콜라이 감염 또는 세균혈증을 진단함
을 포함한다.
상기 피험자의 적합한 생물학적 샘플은 구체적으로 혈액, 혈청, 혈액 단리물 또는 혈액 배양물, 뇨, 흡출물, 객담, 삽관된 피험자의 세척액 및 대변으로 이루어지는 그룹 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 진단학적 분석은 예를 들어 시험하려는 샘플로부터 획득된 O25 항원 또는 O25b 무(또는 단리된) 항원을 발현하는 세균의 본 발명의 항체에 의한 응집반응을 시험하기 위한 고체상, 예를 들어 라텍스 비드, 금 입자 등에 고정화된 상기 항체를 포함한다.
일부 진단 분석은 상이한 특이성 및/또는 친화성으로 O25b 및/또는 O25a에 결합하는 2개의 상이한 항체를 수반하며, 따라서 상기 O25b와 O25a 항원간의 식별이 가능할 수 있다.
특정한 태양에 따라, 본 발명은 본 발명의 진단학 또는 본 발명의 진단 방법에 의해 이. 콜라이, 특히 MDR 이. 콜라이에 의한 피험자의 감염을 측정하여, 상기와 같은 감염에 대한 치료법, 예를 들어 본 발명의 항체에 의한 치료와 같은 면역요법을 사용하는 치료법에 의한 치료의 토대를 제공하기 위한 동반 진단학을 제공한다.
특정한 태양에 따라, 본 발명은, 예를 들어 살아있는 세균량이 제한된 임상 시편으로부터 유리 LPS를 측정함으로써 MDR 이. 콜라이, 특히 MDR 이. 콜라이에 의한 피험자의 감염을 진단하기 위한 민감한 침대곁 진단학을 제공한다. 상기와 같은 분석의 감도는 구체적으로 100 ng 미만, 바람직하게는 10 ng 미만의 LPS이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한
a) 본 발명 항체의 VH 및/또는 VL; 또는
b) 본 발명 항체의 HC 및/또는 LC
를 발현하는 암호화 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 플라스미드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
구체적으로, DSM 26763 또는 DSM 26762하에 기탁된 플라스미드 및 숙주 세포는 제외된다. 상기와 같은 기탁물은 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 숙주 세포이며, 여기에서 DSM 26763하에 기탁된 숙주 세포는 8D5-1G10-LC 표시된 항체 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환되고 DSM 26762하에 기탁된 숙주 세포는 8D5-1G10-HC 표시된 항체 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환된다.
구체적으로, DSM 28171 또는 DSM 28172하에 기탁된 플라스미드 및 숙주 세포가 또한 제외된다. 상기와 같은 기탁물은 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 숙주 세포이며, 여기에서 DSM 28171하에 기탁된 숙주 세포는 8D10-C8-LC 표시된 항체 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환되고 DSM 28172하에 기탁된 숙주 세포는 8D10-C8-HC 표시된 항체 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환된다.
본 발명은 또한 본 발명 항체의 생성 방법을 제공하며, 여기에서 본 발명의 숙주 세포를, 상기 항체를 생성시키는 조건하에서 배양하거나 유지시킨다.
추가의 태양에 따라, 본 발명은
a) 비-인간 동물을 이. 콜라이의 O25b 항원으로 면역시키고 항체를 생산하는 B-세포를 단리하고;
b) 상기 단리된 B-세포로부터 불멸화된 세포주를 형성시키고;
c) 상기 O25b 항원 및 임의로 상기 O25a 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 세포주를 확인하기 위해서 상기 세포주를 선별하고, 예를 들어 여기에서 O25a에 비해 O25b에의 우선적인 결합을 측정하고;
d) 상기 단클론 항체, 또는 상기 항체의 인간화된 또는 인간 형태, 또는 상기 단클론 항체와 동일한 에피토프 결합 특이성을 갖는 그의 유도체를 생성시킴
을 포함하는, 본 발명 항체의 생성 방법을 제공한다.
도 1: 카밧 시스템에 따라 확인된 O25b 특이성 항체(O25b에만 결합하는 그룹 1 항체) 및 O25b/O25a 교차-특이성 항체(그룹 2 항체) CDR 영역의 CDR 서열들을 포함하는 표 1; 및 IMGT 시스템에 따라 CDR 영역을 표시하는 동일한 항체들을 나열하는 표 2. 표 1 및 2에 사용된 바와 같은 명명법은 하기의 의미를 가질 것이다:
VH CDR1 = CDR1
VH CDR2 = CDR2
VH CDR3 = CDR3
VL CDR1 = CDR4
VL CDR2 = CDR5
VL CDR3 = CDR6
도 2: 그룹 1(도 1)의 O25b 특이성 항체, 즉 모 항체 8A1, 3E9 및 2A7의 인간화된 변이체들(여기에서 상기 변이체들은 모 항체 8A1의 1 내지 16번, 모 항체 3E9의 1 내지 18번 및 모 항체 2A7의 1 내지 16번이다)의 HC 및 LC 서열 정보; 및 모 항체 4D5인 그룹 2(도 1)의 O25b 및 O25a 교차-특이성 항체(모 항체 4D5이다)의 인간화된 변이체들(여기에서 상기 변이체들은 1 내지 18번이다)의 HC 및 LC 서열 정보.
도 3:
도 3i): 면역블럿 분석에서 정제된 O25a, O25b 및 O55 LPS 분자에 대한, 대조용으로서 LPS 코어-특이성(즉 모든 이. 콜라이 LPS 분자에 교차-반응성) mAb WN1뿐만 아니라 상이한 O25b-특이성(O25a 항원에 대한 교차-특이성이 있거나 없는)의 반응성.
도 3ii): O25-특이성 mAb에 대한 면역블럿. O25a, O25b 및 O55 유형의 분리된 정제된 LPS를 키메릭 또는 인간화된 O25b-특이성 mAb 및 대조용으로서 LPS-코어 특이성(즉 교차-반응성) WN-1 쥐 mAb와 반응시켰다.
도 4:
도 4i): 스트렙트아비딘 팁에 결합된 비오틴화된 O25b PS 항원을 사용하는 포르테바이오(ForteBio)에 의해 평가된 바와 같은 상이한 O25b mAb의 친화성 측정.
도 4ii): 생물층 간섭측정법(BLI) 측정. 포르테바이오에서 측정된, 친화성, 결합 및 해리 상수로서 표현된 O25b 폴리사카라이드에 대한 O25b mAb의 결합.
도 5:
도 5i): O25b-특이성(O25a 항원에 대한 교차-반응성이 있거나 없는) mAb에 의한 O25b, O25a 또는 O2 항원을 발현하는 상이한 이. 콜라이 균주의 표면 염색.
도 5ii): LB(A) 또는 인간 혈청(B) 중에서 생육된 ST131:O25b 균주 3O를 0.025 내지 40 ㎍/㎖의 농도 범위의 O25b-특이성 mAb로 염색하였다. 추가로 상이한 풀소유형(pulsotype)에 속하는 ST131 균주의 패널을 40 ㎍/㎖의 농도의 3개의 O25b 특이성 mAb에 의한 표면 염색에 대해 시험하였다(C).
도 6: 세균 공격에 대한 보호. O25b-반응성 키메릭(i) 또는 인간화된(ii) mAb뿐만 아니라 아이소타입 합치된 대조용 mAb의 예방학적 보호 효능을 세균혈증의 쥐 모델에서 시험하였다. 100 ㎍의 mAb를, 정맥내로 투여된 ST131 균주 81009에 의한 치명적인 공격 24시간 전에 i.p. 주사하였다. 치사율을 매일 모니터하였다.
도 7:
도 7i): 혈청 살균 분석. O25b 특이성 mAb에 의해 매개되는 보체 의존성 세균 살해를 초기 세균수에 비해 3시간 배양 후의 CFU의 감소로서 평가하였다.
도 7ii): 혈청 살균 분석. 2개의 상이한 ST131:O25b 균주를 LB(패널 A, B 및 D)에서 중간-대수기로 증식시켰다. 세척에 이어서 세균을 2.5 ㎍/㎖의 인간화된(A 및 B) 또는 키메릭(D) mAb와 3시간 동안 배양하였다. 한편으로, 균주 81009를 인간 혈청 중에서 생육시키고 10 ug/㎖의 mAb와 5시간 동안 배양하였다(패널 C). 생존 세균의 수를 도말에 의해 측정하였다. 살균 활성을 대조용(항체 없음) 배양에 대한 살해 퍼센트로서 나타낸다.
도 8: 내독소혈증 모델에서의 보호. 5마리 마우스의 그룹을 100 ㎍(패널 A 및 B) 또는 25 ㎍(패널 C)의 mAb로 i.p. 수동 면역시켰다. 다음 날, 마우스를 20 ㎎/마우스의 D-GalN(i.p.)으로 감작시키고 동시에 치사 용량의 정제된 O25b LPS(i.v.)로 공격하였다. 생존을 매일 모니터하였다.
도 9: 시험관내 내독소 중화 분석. 정제된 O25b LPS의 TLR-4 신호전달을 HEK-Blue 분석(패널 A)에서 평가하였다. 전형적인 O25b-특이성 mAb의 용량 의존적인 중화 잠재성을 폴리믹신 B(패널 B)와 비교하여 나타낸다. 상기 셋업에서 측정된 다수의 인간화된 및 키메릭 O25b-특이성 mAb의 IC50 농도로서 나타낸 중화 능력을 패널 C상에 요약한다.
도 10: (a): 이. 콜라이 O25b 항원의 반복 단위의 구조. (b): 이. 콜라이 O25a의 반복 단위의 구조(Kenne L, Lindberg B, Madden JK, Lindberg AA, Gemski P Jr. Structural studies of the Escherichia coli O-antigen 25. Carbohydr Res. 28;122(2):249-56, 1983).
본 발명에 사용되는 바와 같은 "항체"란 용어는 링커 서열의 존재 또는 부재하의 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로서 이해되는 항체 도메인들로 이루어지거나 또는 상기 도메인들을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭할 것이다. 폴리펩티드는, 고리 서열에 의해 연결된 항체 도메인 구조의 적어도 2개의 베타-가닥으로 이루어지는 베타-원통 구조를 포함하는 경우의 항체 도메인으로서 이해된다. 항체 도메인은 고유 구조를 갖거나, 또는 예를 들어 항원 결합 성질 또는 임의의 다른 성질, 예를 들어 안정성 또는 기능적 성질, 예를 들어 Fc 수용체 FcRn 및/또는 Fc감마 수용체에의 결합을 변형시키기 위해 돌연변이유발 또는 유도체화에 의해 변형될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 항체는 하나 이상의 항원 또는 상기와 같은 항원의 하나 이상의 에피토프에 결합하는 특이적인 결합 부위를 가지며, 구체적으로 단일 가변 항체 도메인, 예를 들어 VH, VL 또는 VHH의 CDR 결합 부위, 또는 가변 항체 도메인의 쌍, 예를 들어 VL/VH 쌍의 결합 부위, VL/VH 도메인 쌍을 포함하는 항체 및 불변 항체 도메인, 예를 들어 Fab, F(ab'), (Fab)2, scFv, Fv 또는 완전길이 항체의 결합 부위를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "항체"란 용어는 특히 단일 가변 항체 도메인, 예를 들어 VH, VL 또는 VHH, 및 연결 서열 또는 힌지 영역의 존재 또는 부재하의 가변 및/또는 불변 항체 도메인의 조합, 예를 들어 가변 항체 도메인의 쌍, 예를 들어 VL/VH 쌍을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 항체 포맷, VL/VH 도메인 쌍 및 불변 항체 도메인을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 항체, 예를 들어 중쇄 항체, Fab, F(ab'), (Fab)2, scFv, Fd, Fv 또는 완전길이 항체, 예를 들어 IgG 유형(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형)의 항체, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체를 지칭할 것이다. "완전길이 항체"란 용어는 Fc 도메인 및 천연 항체 단량체에서 통상적으로 발견되는 다른 도메인의 적어도 대부분을 포함하는 임의의 항체 분자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 상기 어구는 본 발명에서 특정 항체 분자가 항체 단편이 아님을 강조하는데 사용된다.
"항체"란 용어는 구체적으로 단리된 형태의 항체를 포함하며, 상기 항체는 상이한 표적 항원에 대한 또는 항체 도메인의 상이한 구조 배열을 포함하는 다른 항체가 실질적으로 없다. 더욱이, 단리된 항체는 상기 단리된 항체와, 예를 들어 적어도 하나의 다른 항체, 예를 들어 상이한 특이성을 갖는 단클론 항체 또는 항체 단편과의 조합을 함유하는 복합 제제 중에 포함될 수도 있다.
"항체"란 용어를 인간 종을 포함한 동물 기원, 예를 들어 인간, 쥐, 토끼, 염소, 라마, 소 및 말을 포함한 포유동물, 또는 조류, 예를 들어 닭의 항체에 적용할 것이며, 상기 용어는 특히 동물 기원의 서열, 예를 들어 인간 서열에 기반하는 재조합 항체를 포함할 것이다.
"항체"란 용어를 또한 상이한 종들의 기원의 서열, 예를 들어 쥐 및 인간 기원의 서열을 갖는 키메릭 항체에 적용한다.
항체에 관하여 사용되는 바와 같은 "키메릭"이란 용어는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열 중 한 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 강에 속하는 항체의 상응하는 서열에 상동성인 반면, 상기 쇄의 나머지 분절은 또 다른 종 또는 강의 상응하는 서열에 상동성인 항체들을 지칭한다. 전형적으로 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 하나의 포유동물 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 영역은 또 다른 종으로부터 유래된 항체의 서열에 상동성이다. 예를 들어, 상기 가변 영역은 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 함께, 비-인간 숙주 유기체로부터 쉽게 입수할 수 있는 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 소스로부터 유래될 수 있다.
"항체"란 용어를 또한 인간화된 항체에 적용할 수 있다.
항체에 관하여 사용되는 바와 같은 "인간화된"이란 용어는 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원 결합 부위를 갖는 분자를 지칭하며, 여기에서 상기 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기반한다. 상기 항원 결합 부위는 불변 도메인상에 융합된 완전한 가변 도메인을 포함하거나, 또는 가변 도메인 중의 적합한 프레임워크 영역상에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나, 또는 예를 들어 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다, 바람직하게는 인간 면역글로불린에 보다 가깝게 닮도록 변형될 수 있다. 인간화된 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열을 보존한다(예를 들어 마우스 항체로부터의 6개 CDR을 모두 함유하는 인간화된 마우스 항체). 다른 형태들은 원래 항체에 대해 변형된 하나 이상의 CDR을 갖는다.
"항체"란 용어를 또한 인간 항체에 적용한다.
항체에 관하여 사용되는 바와 같은 "인간"이란 용어는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 인간 항체는 예를 들어 CDR 중에 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 트랜스제닉인 동물로부터 단리된 항체를 포함한다.
"항체"란 용어를 구체적으로 임의의 부류 또는 하위부류의 항체에 적용한다. 항체 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 상기 항체를 항체의 주요 부류들 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 지정할 수 있으며, 이들 중 다수를 하위부류(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가 세분할 수 있다.
상기 용어를 또한 단클론 또는 다클론 항체, 구체적으로 재조합 항체에 적용하며, 상기 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리되는 모든 항체 및 항체 구조물, 예를 들어 상이한 기원으로부터의 유전자 또는 서열을 포함하는 동물, 예를 들어 인간을 포함한 포유동물로부터 기원하는 항체, 예를 들어 쥐, 키메릭, 인간화된 항체, 또는 하이브리도마 유도된 항체를 포함한다. 추가의 예는 항체를 발현하도록 형질전한된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 또는 항체 또는 항체 도메인의 재조합성, 조합적 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 항체 유전자 서열의 다른 DNA 서열에의 이어맞추기(splicing)를 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 항체를 지칭한다.
"항체"란 용어는 또한 항체의 유도체, 특히 기능 활성 유도체를 지칭하는 것으로 이해된다. 항체 유도체는 하나 이상의 항체 도메인 또는 항체 및/또는 융합 단백질의 임의의 조합(여기에서 상기 항체의 임의의 도메인은 하나 이상의 다른 단백질, 예를 들어 다른 항체의 임의의 위치에 융합될 수있다), 예를 들어 CDR 고리를 포함하는 결합 구조물, 수용체 폴리펩티드뿐만 아니라 리간드, 스캐폴드 단백질, 효소, 독소 등으로서 이해된다. 상기 항체의 유도체를 다양한 화학 기법들, 예를 들어 공유 커플링, 정전기적 상호작용, 디-설파이드 결합 등에 의한 다른 물질에의 회합 또는 결합에 의해 수득할 수 있다. 상기 항체에 결합된 다른 물질은 지질, 탄수화물, 핵산, 유기 및 무기 분자 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어 PEG, 전구약물 또는 약물)일 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 항체는 생물학적으로 허용 가능한 화합물과의 특이적인 상호작용을 허용하는 추가적인 태그를 포함하는 유도체이다. 상기 태그가 상기 항체의 그의 표적에의 결합에 대해 부정적인 영향을 미치지 않거나 허용가능한 영향을 미치는 한, 본 발명에 사용가능한 태그에 대한 특별한 제한은 없다. 적합한 태그의 예는 Hls-태그, Myc-태그, FLAG-태그, 스트렙-태그, 칼모듈린-태그, GST-태그, MBP-태그 및 S-태그를 포함한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 항체는 표지를 포함하는 유도체이다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "표지"란 용어는 "표지된" 항체를 생성시키기 위해 상기 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 상기 표지는 단독으로 검출가능하거나(예를 들어 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매화할 수 있다.
본 발명에 개시되는 바와 같은 바람직한 유도체는 항원 결합에 관하여 기능적으로 활성이며, 바람직하게는 예를 들어 SBA, OPK 또는 LAL 분석에서 측정되는 바와 같이, MDR 이. 콜라이 및 그의 내독소와 투쟁하거나, 또는 세균 공격에 대해 보호하거나 또는 치명적인 내독소혈증을 중화시키는 효능을 갖는다.
구체적으로, 본 발명의 항체로부터 유래된 항체는 상기 O25b 항원에 대한 차별적 결합에 기능 활성인, 예를 들어 상기 O25b 항원에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 CDR 영역 중 적어도 하나 이상 또는 그의 CDR 변이체를 포함할 수 있다.
모 항체 또는 항체 서열, 예를 들어 모 CDR 또는 FR 서열로부터 유도된 항체는 본 발명에서 특히, 인실리코 또는 재조합적 조작에 의해 또는 그 밖에 화학적 유도체화 또는 합성에 의해 수득되는 돌연변이체 또는 변이체로서 이해된다.
"항체"란 용어는 또한 항체의 변이체, 예를 들어 모 CDR 서열의 기능 활성 CDR 변이체를 갖는 항체 및 모 항체의 기능 활성 변형 항체를 지칭하는 것으로 이해된다.
구체적으로, 본 발명의 항체로부터 유래된 항체는 상기 CDR 영역 중 적어도 하나 이상 또는 그의 CDR 변이체, 예를 들어 중쇄 가변 영역 중 적어도 3개의 CDR 및/또는 경쇄 가변 영역 중 적어도 3개의 CDR을 포함할 수 있고, 이때 상기 CDR 또는 FR 영역 중 적어도 하나 또는 상기 HC 또는 LC의 불변 영역 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 가지며, 기능 활성이다, 예를 들어 상기 O25b 항원에 특이적으로 결합하고 상기 O25a 항원에 임의로 교차-특이적으로 결합한다.
"변이체"란 용어는 특히, 예를 들어 특이 항체 아미노산 서열 또는 영역을 결실시키거나, 교환하거나, 삽입물을 도입시키거나, 또는 예를 들어 불변 도메인에서 항체 안정성, 효과기 기능 또는 반감기를 조작하기 위해 또는 가변 도메인에서, 예를 들어 당해 분야에서 이용 가능한 친화성 성숙 기법에 의해 항원-결합 성질을 개선시키기 위해 아미노산 서열을 화학적으로 유도체화하는 돌연변이유발 방법에 의해 획득되는 항체, 예를 들어 돌연변이 항체 또는 항체의 단편을 지칭할 것이다. 상기 공지된 돌연변이유발 방법들 중 임의의 방법, 예를 들어 무작위화 기법에 의해 획득되는, 목적하는 위치에서의 점 돌연변이를 사용할 수 있다. 일부의 경우에, 예를 들어 항체 서열의 무작위화에 가능한 아미노산들 중 임의의 것 또는 바람직한 아미노산의 선택에 의해 위치들을 무작위로 선택한다. "돌연변이유발"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 변경에 대해서 당해 분야에서 인정된 임의의 기법을 지칭한다. 바람직한 유형의 돌연변이유발은 오류유발 PCR 돌연변이유발, 포화 돌연변이유발, 또는 다른 부위 지향된 돌연변이유발을 포함한다.
"변이체"란 용어는 구체적으로 기능 활성 변이체를 포함할 것이다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 CDR 서열의 "기능 활성 변이체"란 용어는 "기능 활성 CDR 변이체"로서 이해되며, 본 발명에 사용되는 바와 같은 항체의 "기능 활성 변이체"는 "기능 활성 항체 변이체"로서 이해된다. 상기 기능 활성 변이체는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환, 또는 상기 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 잔기, 또는 상기 뉴클레오티드 서열 내 뉴클레오티드, 또는 상기 서열, 예를 들어 CDR 서열의 원위 단부들 중 임의의 것 또는 둘 다에서 N-말단 및/또는 C-말단 1, 2, 3 또는 4개 아미노산, 및/또는 중심 1, 2, 3 또는 4개 아미노산(즉 상기 CDR 서열의 한 가운데)의 화학적 유도체화에 의한, 상기 서열(모 항체 또는 모 서열)의 변형으로부터 초래되는 서열을 의미하며, 상기 변형은 상기 서열의 활성에 영향, 특히 손상을 미치지 않는다. 선택된 표적 항원에 대해 특이성을 갖는 결합 부위의 경우에, 항체의 기능 활성 변이체는, 예를 들어 특정 에피토프에 적합한 특이성, 친화성, 결합활성, Kon 또는 Koff율 등이 변하도록 변화될 수 있지만, 여전히 소정의 결합 특이성을 가질 것이다. 예를 들어, 친화성 성숙 항체는 구체적으로 기능 활성 변형 항체로서 이해된다. 따라서, 친화성 성숙 항체에서 변형된 CDR 서열은 기능 활성 CDR 변이체로서 이해된다.
구체적으로, 본 발명 항체의 기능 활성 변이체는 O25b 항원에 결합하는 효능 및 이. 콜라이의 다른 항원들에 비해 상기 O25b 항원에 우선적으로 결합하는, 예를 들어 O25b에는 결합하지만 이. 콜라이의 O25a 항원에는 결합하지 않는, 또는 O25a 항원에 그다지 결합하지 않는, 또는 O25b 및 O25a 항원 모두에 교차-특이적으로 결합하지만 이. 콜라이의 다른 항원들에는 결합하지 않는 특이성 또는 선택성을 갖는다.
기능 활성 변이체는, 예를 들어 모 항체, 예를 들어 표 1 및 도 2에 나열된 바와 같은 항체 중 임의의 것와 동일한 결합 부위를 포함하지만 상기 결합 부위 외의 항체 영역내에 변형을 갖는 항체의 서열을 변화시킴으로써 획득되거나, 또는 상기 결합 부위내의 변형에 의해 상기와 같은 모 항체로부터 유래되지만 항원 결합을 손상시키지 않고, 바람직하게는 모 항체와 실질적으로 동일한 생물 활성 또는 심지어 개선된 활성, 예를 들어 O25b 항원에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는, 예를 들어 O25b에 결합하고 이. 콜라이의 O25a 항원에는 결합하지 않는, 또는 O25a 항원에 그다지 결합하지 않거나, 또는 O25b 및 O25a 항원 모두에 교차-특이적으로 결합하지만 이. 콜라이의 다른 항원들에는 결합하지 않는 능력을 가질 것이다. 임의로, 상기 기능 활성 변이체는, 예를 들어 (MDR) 이. 콜라이를 표적화하는 특이적 결합 분석 또는 기능 시험에 의해 측정 시 실질적으로 동일한 생물 활성과 함께, SBA 분석에서 보체 매개된 살해 효능을 추가로 포함하고/하거나 임의로 OPK 분석에서 항체 매개된 식작용의 효능을 추가로 포함하고/하거나, 임의로 LAL 분석에서 내독소 중화 기능을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 동일한 생물 활성"이란 용어는 실질적으로 동일한 활성이 필적할만한 또는 모 항체에 대해 측정된 바와 같은 활성의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 예를 들어 적어도 100%, 또는 적어도 125%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 175%, 또는 예를 들어 200% 이하임에 의해 지시되는 바와 같은 활성을 지칭한다.
본 발명에 개시된 바와 같은 바람직한 변이체 또는 유도체는 항원 결합에 관하여 기능 활성이며, 바람직하게는 O25b 항원에 특이적으로 결합하고 이. 콜라이의 다른 항원들에는 결합하지 않는, 예를 들어 O25b에 결합하고 이. 콜라이의 O25a 항원에는 결합하지 않거나, 또는 O25a 항원에 그다지 결합하지 않거나, 또는 O25b 및 O25a 항원 모두에 교차-특이적으로 결합하는, 예를 들어 O25a에 비해 O25b 항원에 우선적으로 결합하거나, 또는 O25 균주에 대해 발생한 현행 다클론 형별 혈청(O25a)에 비해 더 높은 친화성으로 O25b에 결합하는 효능을 갖는다. 바람직한 변이체는 이. 콜라이의 다른 항원들에, 적어도 2 로그, 바람직하게는 적어도 3 로그의 Kd 값 차이로 결합하지 않으며, 예를 들어 MDR 이. 콜라이를 표적화하기 위한 특이성 결합 분석 또는 기능 시험에 의해 측정된 바와 같은 실질적으로 동일한 생물 활성과 함께, 임의로 SBA 분석에서, 예를 들어 상기 항체를 함유하지 않는 대조용 샘플에 비해 세균수의 현저한 감소를 성취하기 위한 보체 매개된 살해 효능을 추가로 포함하고/하거나, 임의로 OPK 분석에서, 예를 들어 상기 항체를 함유하지 않는 대조용 샘플에 비해 세균수의 현저한 감소를 성취하기 위한 항체 매개된 식작용의 효능을 추가로 포함하고/하거나, 임의로 LAL 또는 TLR4 신호전달 분석에서, 예를 들어 상기 항체를 함유하지 않는 대조용 샘플에 비해 유리 LPS의 현저한 감소를 성취하기 위한 내독소 중화 기능을 추가로 포함한다. 상기 다양한 분석들에서 분석물의 현저한 감소는 전형적으로 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 98%의 감소 내지 약 100%(+/-1%)의 완전한 감소를 의미한다.
바람직한 실시태양에서 모 항체의 기능 활성 변이체는
a) 상기 항체의 생물 활성 단편이고, 상기 단편은 상기 분자의 서열의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%를 포함하며;
b) 적어도 하나의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 상기 항체로부터 유도되고, 여기에서 상기 기능 활성 변이체는 상기 분자 또는 그의 부분, 예를 들어 항체에 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지며; 및/또는
c) 상기 항체 또는 그의 기능 활성 변이체 및 추가로 상기 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 이종인 적어도 하나의 아미노산 또는 뉴클레오티드로 이루어진다.
본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 항체의 기능 활성 변이체는 상술한 변이체에 필수적으로 동일하지만, 상이한 종의 상동성 서열로부터 유래된다는 점에서 각각 그의 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열과 상이하다. 이들을 천연 변이체 또는 유사체라 칭한다.
"기능 활성 변이체"란 용어는 또한 천연 대립유전자 변이체뿐만 아니라 돌연변이체 또는 임의의 다른 비-천연 변이체를 포함한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 (폴리)펩티드의 생물학적 기능을 필수적으로 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 가짐을 특징으로 하는 상기 폴리펩티드의 또 다른 형태이다.
기능 활성 변이체를, 예를 들어 하나 이상의 점 돌연변이에 의한 상기 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열 중의 서열 변경에 의해 수득할 수 있으며, 여기에서 상기 서열 변경은 본 발명과 함께 사용될 때 변경되지 않은 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 기능을 유지하거나 개선시킨다. 상기와 같은 서열 변경은 비제한적으로 (보존적인) 치환, 부가, 결실, 돌연변이 및 삽입을 포함할 수 있다.
특정한 기능 활성 변이체는 CDR 변이체이다. CDR 변이체는 CDR 영역 중에 적어도 하나의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함하며, 여기에서 상기 변형은 상기 아미노산 서열의 화학적 또는 부분적 변경일 수 있고, 상기 변경은 상기 변이체가 변경되지 않은 서열의 생물학적 특징을 유지할 수 있게 한다. 상기 CDR 아미노산 서열의 부분적 변경은 하나 내지 다수의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 결실 또는 치환에 의하거나, 또는 하나 내지 다수의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 부가 또는 삽입에 의하거나, 또는 하나 내지 다수의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 화학적 유도체화에 의하거나, 또는 이들의 조합에 의할 수 있다. 아미노산 잔기에서 치환은 보존적인 치환일 수 있다, 예를 들어 하나의 소수성 아미노산의 또 다른 소수성 아미노산에 대한 치환일 수 있다.
보존적인 치환은 측쇄 및 화학적 성질에 관련된 아미노산과 내에서 발생하는 치환들이다. 상기와 같은 과의 예는 염기성 측쇄, 산성 측쇄, 비-극성 지방족 측쇄, 비-극성 방향족 측쇄, 하전되지 않은 극성 측쇄, 작은 측쇄, 큰 측쇄 등을 갖는 아미노산들이다.
점 돌연변이는 특히, 상이한 아미노산에 대한 하나 이상의 단일(비-보존적인) 또는 이중 아미노산의 치환 또는 교환, 결실 또는 삽입에서 조작되지 않은 아미노산과 상이한 아미노산 서열의 발현을 생성시키는 폴리뉴클레오티드의 조작으로서 이해된다.
바람직한 점 돌연변이는 동일한 극성 및/또는 전하의 아미노산의 교환을 지칭한다. 이에 관하여, 아미노산은 64개 삼중 코돈에 의해 암호화되는 20개의 천연 아미노산을 지칭한다. 이들 20개 아미노산을 중성 전하, 양전하 및 음전하를 갖는 것들로 분류할 수 있다:
"중성" 아미노산은 각각의 3-문자 및 단일-문자 암호 및 극성과 함께 하기에 나타낸다:
알라닌: (Ala, A) 비극성, 중성;
아스파라진: (Asn, N) 극성, 중성;
시스테인: (Cys, C) 비극성, 중성;
글루타민: (Gln, Q) 극성, 중성;
글리신: (Gly, G) 비극성, 중성;
이소류신: (Ile, I) 비극성, 중성;
류신: (Leu, L) 비극성, 중성;
메티오닌: (Met, M) 비극성, 중성;
페닐알라닌: (Phe, F) 비극성, 중성;
프롤린: (Pro, P) 비극성, 중성;
세린: (Ser, S) 극성, 중성;
쓰레오닌: (Thr, T) 극성, 중성;
트립토판: (Trp, W) 비극성, 중성;
티로신: (Tyr, Y) 극성, 중성;
발린: (Val, V) 비극성, 중성; 및
히스티딘: (His, H) 극성, 양성(10%) 중성(90%).
"양으로" 하전된 아미노산은:
아르기닌: (Arg, R) 극성, 양성; 및
리신: (Lys, K) 극성, 양성이다.
"음으로" 하전된 아미노산은:
아스파트산: (Asp, D) 극성, 음성; 및
글루탐산: (Glu, E) 극성, 음성이다.
본 발명에 개시된 항체 서열 및 그의 상동체에 관하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 서열 및 도입 틈을 최대의 서열 동일성 퍼센트를 성취하도록 정렬한 후에, 상기 서열 동일성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않으면서, 특정한 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 당해 분야의 숙련가들은 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 성취하는데 필요한 임의의 연산을 포함하여, 정렬을 측정하기에 적합한 매개변수들을 측정할 수 있다.
항체 변이체는 구체적으로, 예를 들어 당공학에 의해 생성된 특정한 글리코실화 패턴을 갖는 상동체, 유사체, 단편, 변형 또는 변이체를 포함하는 것으로 이해되며, 상기는 기능성이고 기능성 등가물, 예를 들어 특정한 표적에 결합하고 기능적 성질들을 갖는 기능성 등가물로서 작용할 수 있다.
본 발명의 항체는 Fc 효과기 기능을 나타낼 수도, 나타내지 않을 수도 있다. 작용 방식은 주로 Fc 효과기 기능이 없는 중화 항체에 의해 매개되지만, Fc는 보체를 모집하며 면역 복합체의 형성을 통해 순환으로부터 표적 항원, 예를 들어 독소의 제거를 도울 수 있다.
특이 항체는 활성 Fc 부분이 없을 수 있으며, 따라서 항체의 Fc 부분을 함유하지 않거나 Fc감마 수용체 결합 부위를 함유하지 않는 항체 도메인으로 구성되거나, 또는 예를 들어 Fc 효과기 기능을 감소시키는, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 없애거나 감소시키는 변형에 의해 Fc 효과기 기능이 없는 항체 도메인을 포함할 수 있다. 대안의 항체를, Fc 효과기 기능을 증가시키는, 특히 ADCC 및/또는 CDC 활성을 증대시키는 변형을 포함하도록 조작할 수도 있다.
상기와 같은 변형을 돌연변이유발, 예를 들어 Fc감마 수용체 결합 부위의 돌연변이에 의해 또는 항체 포맷의 ADCC 및/또는 CDC 활성을 방해하는 유도체 또는 작용제에 의해 수행하여, Fc 효과기 기능의 감소 또는 증가를 성취할 수 있다.
Fc 효과기 기능의 현저한 감소는 전형적으로 ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정시 변형되지 않은(야생형) 포맷의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만의 Fc 효과기 기능을 지칭하는 것으로 이해된다. Fc 효과기 기능의 현저한 증가는 ADCC 및/또는 CDC 활성에 의해 측정시 변형되지 않은(야생형) 포맷의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40% 또는 50%의 Fc 효과기 기능의 증가를 지칭하는 것으로 이해된다.
항체 서열에 관하여 "당공학" 변이체란 용어는 당공학의 결과로서 변형된 면역원성 또는 면역조절성(예를 들어 소염성) 성질, ADCC 및/또는 CDC를 갖는 글리코실화 변이체를 지칭할 것이다. 모든 항체는 중쇄 불변 영역 중의 보존된 위치에 탄수화물 구조를 함유하며, 이때 각각의 아이소타입은 단백질 조립, 분비 또는 기능 활성에 가변적으로 영향을 비치는 N-연결된 탄수화물 구조의 독특한 배열을 갖는다. IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인 중의 Asn297에서 보존된 N 연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 복합 2-안테나 올리고사카라이드가 상기 CH2 도메인 사이에 묻혀, 상기 폴리펩티드 주쇄와의 광범위한 접촉부를 형성하며 그의 존재는 상기 항체가 항체 의존성 세포독성(ADCC)과 같은 효과기 기능을 매개하는데 필수적이다. N297에서(예를 들어 N297의 예를 들어 A로의 돌연변이를 통해), 또는 T299에서 N-글리칸의 제거는 전형적으로, 감소된 ADCC와 함께 아글리코실화된 항체 포맷을 생성시킨다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 글리코실화된 또는 당공학에 의해 변형된 또는 아글리코실화된 항체일 수 있다.
항체 글리코실화에 있어서 큰 차이는 세포주들간에 발생하며, 심지어 작은 차이조차도 상이한 배양 조건하에서 증식된 주어진 세포주에 대해 관찰된다. 세균 세포에서 발현은 전형적으로 아글리코실화된 항체를 제공한다. 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매화하는 글리코실트랜스퍼라제, β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현을 갖는 CHO 세포는 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다(Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180). 숙주 세포의 선택 외에, 항체의 재조합 생성 중 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 생육 방식, 배지 제형, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 설계 등을 포함한다.
"항원-결합 부위" 또는 "결합 부위"란 용어는 항원 결합에 관여하는 항체의 부분을 지칭한다. 상기 항원 결합 부위는 중("H") 및/또는 경("L")쇄의 N-말단 가변("V") 영역, 또는 그의 가변 도메인의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "고가변 영역"이라 지칭되는, 상기 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내 3개의 매우 이질적인 신장부가 프레임워크 영역으로서 공지된 보다 보존된 측면 인접 신장부들 사이에 삽입된다. 상기 항원-결합 부위는 결합된 에피토프 또는 항원의 3차원 표면에 상보성인 표면을 제공하며, 고가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"이라 지칭된다. 상기 CDR에 통합된 결합 부위를 본 발명에서 또한 "CDR 결합 부위"라 칭한다.
"표적" 또는 "표적 항원"이란 용어들과 본 발명에서 호환적으로 사용되는 바와 같은 "항원"이란 용어는 항체 결합 부위에 의해 인식되는 전체 표적 분자 또는 상기와 같은 분자의 단편을 지칭할 것이다. 구체적으로, 면역학적으로 관련된 "에피토프", 예를 들어 B-세포 에피토프 또는 T-세포 에피토프로서 일반적으로 지칭되는 항원의 하위구조, 예를 들어 폴리펩티드 또는 탄수화물 구조는 상기와 같은 결합 부위에 의해 인식될 수 있다. O25b 또는 O25a 항원과 같은 특이성 항원들을 단리된 항원으로서, 또는 그 밖에 이. 콜라이 세포 또는 세포 분획의 형태로 제공한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "에피토프"란 용어는 특히 항체의 결합 부위에 대한 특정한 결합짝을 완벽하게 구성하거나 또는 특정한 결합 짝의 부분일 수 있는 분자 구조를 지칭한다. 에피토프는 탄수화물, 펩티드 구조, 지방산, 유기, 생화학적 또는 무기 물질 또는 그의 유도체 및 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 에피토프가 펩티드 구조, 예를 들어 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 중에 포함되는 경우, 상기는 대개 적어도 3개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 40개 아미노산, 및 보다 바람직하게는 약 10 내지 20개 아미노산을 포함할 것이다. 에피토프는 선형 또는 입체 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 또는 탄수화물쇄의 1차 서열의 단일 분절로 구성된다. 선형 에피토프는 연속적이거나 또는 겹칠 수 있다.
입체 에피토프는, 폴리펩티드를 폴딩시킴으로써 함께 3차 구조를 형성하는 아미노산 또는 탄수화물로 구성되며 상기 아미노산은 선형 서열에서 서로 반드시 인접할 필요는 없다. 구체적으로 및 폴리펩티드 항원에 관하여 입체 또는 불연속 에피토프는 1차 서열에서 분리되었지만 상기 폴리펩티드가 고유 단백질/항원으로 폴딩되는 경우 상기 분자의 표면상에서 일치하는 구조로 조립되는 2개 이상의 별도의 아미노산 잔기의 존재를 특징으로 한다.
본 발명에서 "에피토프"란 용어는 특히 항체에 의해 인식되는 단일 에피토프, 또는 에피토프 변이체를 포함하는, 각각이 교차-반응성 항체에 의해 인식되는 에피토프들의 혼합물을 지칭할 것이다.
"발현"이란 용어는 하기의 방식으로 이해된다. 발현 산물, 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 항체의 목적하는 암호화 서열, 및 조절 서열, 예를 들어 작동성 연결에서 프로모터를 함유하는 핵산 분자를 발현 목적에 사용할 수 있다. 이들 서열에 의해 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주는 상기 암호화된 단백질을 생산할 수 있다. 형질전환을 수행하기 위해서, 상기 발현 시스템을 벡터에 포함시킬 수 있으나; 관련 DNA를 또한 상기 숙주 염색체에 삽입할 수도 있다. 구체적으로 상기 용어는, 예를 들어 상기 벡터에 의해 운반되고 숙주 세포에 도입되는 외래 DNA에 의해 암호화된 단백질의 발현에 적합한 조건하의 숙주 세포 및 양립성 벡터를 지칭한다.
암호화 DNA는 특정한 폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어 항체에 대한 특정 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 상기 암호화 DNA의 발현을 개시하거나, 조절하거나, 또는 달리 매개하거나 제어하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA 및 암호화 DNA는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자로부터 존재할 수 있으며, 동일하거나 상이한 유기체로부터 존재할 수 있다. 재조합 클로닝 벡터는 종종 암호화 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들어 항생제 내성, 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.
본 발명에 사용되는 "벡터"는 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉 재조합 유전자의 전사 및 적합한 숙주 유기체에서 그의 mRNA의 번역에 필요한 DNA 서열로서 정의된다.
"발현 카세트"는 한정된 제한 부위에서 벡터내에 삽입될 수 있는 발현 산물을 암호화하는 DNA 암호화 서열 또는 DNA의 분절을 지칭한다. 상기 카세트 제한 부위는 적합한 판독 프레임 중의 상기 카세트의 삽입을 보장하도록 설계된다. 일반적으로, 외래 DNA는 상기 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에 삽입되고, 이어서 상기 벡터에 의해 전달 벡터 DNA와 함께 숙주 세포내로 운반된다. 삽입되거나 부가된 DNA를 갖는 DNA의 분절 또는 서열, 예를 들어 발현 벡터를 또한 "DNA 구조물"이라 칭할 수 있다.
발현 벡터는 발현 카세트를 포함하며 대개는 숙주 세포 중 자율 복제 기원 또는 게놈 삽입 부위, 하나 이상의 선택성 마커(예를 들어 아미노산 합성 유전자 또는 제오신, 가나마이신, G418 또는 하이그로마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 종결자를 추가로 포함하고, 이들 성분은 함께 작동적으로 연결된다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "벡터"란 용어는 자율 복제 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 게놈 삽입 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 통상적인 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 상기는 일반적으로, 추가적인 (외래) DNA를 쉽게 수용할 수 있고 적합한 숙주 세포내에 쉽게 도입될 수 있는 이중 가닥 DNA의 자립 분자이다. 플라스미드 벡터는 종종 암호화 DNA 및 프로모터 DNA를 함유하며 외래 DNA의 삽입에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 구체적으로, "벡터" 또는 "플라스미드"란 용어는 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어 외래 유전자)을 숙주 세포에 도입시켜, 상기 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예를 들어 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비히클을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "숙주 세포"란 용어는 특정한 재조합 단백질, 예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 항체, 및 그의 임의의 자손을 생산하도록 형질전환된 1차 피험자 세포를 지칭한다. 모든 자손이 모 세포와 정확하게 동일할 필요는 없으나(의도적인 또는 우연한 돌연변이 또는 환경상 차이로 인해), 상기와 같은 변경된 자손은 상기 자손이 최초로 형질전환된 세포와 동일한 기능성을 유지하는 한 상기 용어에 포함됨은 물론이다. "숙주 세포주"란 용어는 재조합 폴리펩티드, 예를 들어 재조합 항체를 생산하도록 재조합 유전자를 발현하는데 사용되는 바와 같은 숙주 세포의 세포주를 지칭한다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "세포주"란 용어는 연장된 기간에 걸쳐 증식하는 능력을 획득한 특정 세포 유형의 확립된 클론을 지칭한다. 상기와 같은 숙주 세포 또는 숙주 세포주를 세포 배양물 중에 유지시키고/시키거나 재조합 폴리펩티드를 생산하도록 배양할 수 있다.
핵산, 항체 또는 다른 화합물에 관하여 본 발명에 사용된 바와 같은 "단리된" 또는 "단리"란 용어는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록, 자연적으로 결합되었을 수도 있는 환경으로부터 충분히 분리된 상기와 같은 화합물을 지칭할 것이다. "단리된"은 다른 화합물 또는 물질과의 인공적인 또는 합성적인 혼합물의 배제, 또는 근본적인 활성을 방해하지 않으며 예를 들어 불완전한 정제로 인해 존재할 수도 있는 불순물의 존재를 반드시 의미하는 것은 아니다. 특히, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 또한 천연이 아닌 것들, 예를 들어 암호-최적화된 핵산 또는 cDNA, 또는 화학적으로 합성된 것들을 포함함을 의미한다.
마찬가지로, 본 발명의 단리된 항체는 구체적으로, 예를 들어 또 다른 항체 또는 활성 작용제와의 복합 제제(상기 제제는 자연에서 존재하지 않는다) 중에서 제공된 바와 같이 비-천연이거나, 또는 천연 항체의 최적화된 또는 친화성-성숙된 변이체, 또는 항체의 제조가능성을 개선시키기 위해 조작된 프레임워크-영역을 갖는 항체이다.
본 발명의 핵산에 관하여, "단리된 핵산"이란 용어가 때때로 사용된다. 상기 용어는 DNA에 적용될 때, 상기 DNA 분자가 기원하는 유기체의 천연 게놈 중에 바로 인접한 서열들로부터 분리된 상기 분자를 지칭한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 삽입되거나, 또는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA에 삽입된 DNA 분자를 포함할 수 있다. RNA에 적용될 때, 상기 "단리된 핵산"이라는 용어는 주로 상기 정의된 바와 같은 단리된 DNA 분자에 의해 암호화된 RNA 분자를 지칭한다. 한편으로, 상기 용어는 천연 상태(즉 세포 또는 조직 중에서)로 결합될 수도 있는 다른 핵산으로부터 충분히 분리된 RNA 분자를 지칭할 수 있다. "단리된 핵산"(DNA 또는 RNA)은 또한 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접 생성되고 그의 생성 중 존재하는 다른 성분들로부터 분리된 분자를 나타낼 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어 본 발명의 단리된 항체 또는 에피토프에 대하여, "단리된"이란 용어는 구체적으로 천연 환경 또는 시험관내 또는 생체내에서 실행된 재조합 DNA 기술에 의해 제조시 준비되는 환경(예를 들어 세포 배양물)에서 발견되는 다른 화합물과 같이, 자연적으로 결합된 물질이 없거나 실질적으로 없는 화합물을 지칭할 것이다. 단리된 화합물을 희석제 또는 항원보강제와 제형화할 수 있으며, 더욱이 단리를 목적으로, 예를 들어 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 진단 또는 치료법에 사용할 때, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합할 수 있다. 특히 본 발명의 단리된 항체는 O25(a) 균주에 대해 발생된 다클론 혈청 제제와 상이한데, 그 이유는 상기 항체가 단리되고 정제된 형태로 제공되기 때문이다, 바람직하게는 상기 단리된 항체를 유일한 활성 물질로서 포함하는 제제로 제공되기 때문이다. 그러나, 이는 상기 단리된 항체가 제한된 수의 추가의 잘-한정된(단리된) 항체를 포함하는 복합 제품으로 제공됨을 제외하지 않는다. 단리된 항체를 또한 고체, 반-액체 또는 액체 담체, 예를 들어 비드상에 제공할 수도 있다.
"중화하는" 또는 "중화"란 용어는 본 발명에서 가장 넓은 의미로 사용되며 중화가 성취되는 기전에 관계없이 병원체, 예를 들어 MDR 이. 콜라이가 피험자를 감염하는 것을 억제하거나, 또는 상기 병원체가 효능 있는 단백질 독소를 생산함으로써 감염을 촉진하는 것을 억제하거나, 또는 상기 독소가 피험자에서 표적 세포를 손상시키는 것을 억제하는 임의의 분자를 지칭한다. 중화를 예를 들어 상기 MDR 이. 콜라이 내독소와 표적 세포상의 그의 동족 수용체와의 결합 및/또는 상호작용(상기 TLR4 수용체에의 결합)을 억제하는 항체에 의해 성취할 수 있다. 중화는 또한 Fc 매개된 기능에 의해 순환으로부터 내독소 분자를 제거함으로써 발생할 수 있다.
상기 중화 효능을 전형적으로는 표준 분석, 예를 들이 LAL 시험에서 측정하며, 이때 내독소의 생물 활성의 억제가, 예를 들어 비색측정에 의해 측정된다.
"MDR 이. 콜라이"란 용어는 하기의 방식으로 이해된다: 상당 부분이, 단지 지난 10년간 나타나 세계적으로 확산된 우세한 내성 클론이 된 ST131-O25b:H4 클론 계통에 기인한 다중-약물 내성 이. 콜라이에 의한 감염. 다중-내성 이. 콜라이는 특히 3가지 부류 이상의 항생제, 예를 들어 하기의 작용제/그룹: 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴, 아미노글리코시드, 테트라사이클린, 푸오로퀴놀론, 니트로푸란토인, 트리메토프림(및 그의 조합), 포스포마이신, 폴리믹신, 클로람페니콜, 아즈트레오남, 티제사이클린에 대해 내성을 나타내는 균주들로서 이해된다.
산성 캡슐 폴리사카라이드(CPS)는 대부분의 병원성 이. 콜라이를 둘러싸는 두꺼운 점액성의 폴리사카라이드층이다. 따라서, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 특이성 에피토프가 특이적으로, 캡슐화된 및 캡슐화되지 않은 MDR 이. 콜라이 균주 모두상에서 접근가능함은 놀라운 것이다.
MDR 이. 콜라이와 투쟁하거나 상기를 중화시키는 항체는 병원체 및 병원성 반응을 방해하며, 따라서 감염을 제한하거나 예방하고/하거나 상기와 같은 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 개선시키거나, 또는 MDR 이. 콜라이 병인, 특히 숙주의 무균 신체 구획/부위 내로의 또는 상기 내의 전염 및 복제를 억제할 수 있다. 이와 관련하여 "보호 항체"는 본 발명에서 능동 또는 수동 면역에서 관찰되는 감염인자에 대한 면역을 맡고 있는 항체로서 이해된다. 특히, 본 발명에 개시된 바와 같은 보호 항체는 가능하게는 치료 목적으로, 예를 들어 병원체에 의해 유발된 질병 증상, 부작용 또는 질병의 진행을 예방하거나, 개선시키거나, 치료하거나 또는 적어도 부분적으로 억제시키기 위한 예방학 또는 치료법을 위해 사용된다. 구체적으로, 보호 항체는 예를 들어 혈청 살균 또는 옵소닌개시 식작용 활성을 유도함으로써 살아있는 이. 콜라이 세포를 살해하거나 또는 상기 세포의 복제를 방해하거나, 또는 치료법 적용(즉 확립된 감염상에 제공된)에 이어서 무균 신체 부위로부터 전체 세균세포 또는 그의 LPS 분자를 제거할 수 있다. 한편으로, 예방학적으로 적용된 보호 항체는 상기 언급된 또는 다른 기전들 중 하나에 의한 감염의 확립(즉 비-무균 부위로부터 무균 신체 구획으로의 확산)을 억제한다.
"O25b 항원"이란 용어는 본 발명에서 도 8(a)에 설명된 구조를 갖는 LPS O-항원으로서 이해된다. 상기 구조는 O25a 항원의 구조와 유사하지만 다르다. O25b는 본 발명에서, O25a와 유사하지만 다른 혈청형으로서 이해된다.
"O25a 항원"이란 용어는 켄(Kenne) 등에 의해 개시된 펜타사카라이드 반복 단위로 이루어진 항원으로서 이해된다. 상기 O25b 항원을 확인하기 전에, 상기 O25란 용어는 본 발명에 개시된 바와 같은 O25a를 의미한다(도 8(b)를 참조하시오).
본 발명에 사용되는 바와 같은 "재조합"이란 용어는 "유전 공학에 의해 또는 상기의 결과로서 제조되는"을 의미한다. 재조합 숙주는 구체적으로 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 포함하거나, 또는 특히 상기 숙주에 대해 외래인 뉴클레오티드 서열을 사용하는 재조합 핵산 서열을 함유하도록 유전자 조작되었다. 재조합 단백질은 숙주에서 각각의 재조합 핵산을 발현시킴으로써 생성된다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "재조합 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체, 예를 들어 (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 그로부터 제조된 하이브리도마에 트랜스제닉 또는 트랜스염색체성인 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 상기 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 형질주입종(transfectoma)으로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합성 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열에의 이어맞춤을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체를 포함한다. 상기와 같은 재조합 항체는 예를 들어 항체 성숙 중에 발생하는 재배열 및 돌연변이를 포함하도록 조작된 항체들을 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "특이성" 또는 "특이적 결합"이란 용어는 분자의 이종 집단에서 관심의 동족 리간드를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지시된 조건(예를 들어 면역분석 조건)하에서, 항체는 그의 특정한 표적에 특이적으로 결합하며 샘플 중에 존재하는 다른 분자에는 현저한 양으로 결합하지 않는다. 상기 특이적 결합은 결합이, 선택시 표적 정체, 높은, 중간 또는 낮은 결합 친화성 또는 결합활성에 대해서 선택성임을 의미한다. 선택성 결합은 대개 결합 상수 또는 결합 역학이 또 다른 항원과 비교시, 적어도 10배(적어도 1 로그 차이로서 이해됨), 바람직하게는 적어도 100배(적어도 2 로그 차이로서 이해됨), 및 보다 바람직하게 적어도 1000배(적어도 3 로그 차이로서 이해됨) 상이한 경우 성취된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "특이성" 또는 "특이적 결합"이란 용어는 분자의 이종 집단에서 관심의 동족 리간드를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지시된 조건(예를 들어 면역분석 조건)하에서, 항체는 그의 특정한 표적에 특이적으로 결합하며 샘플 중에 존재하는 다른 분자에는 현저한 양으로 결합하지 않는다. 상기 특이적 결합은 결합이, 선택시 표적 정체, 높은, 중간 또는 낮은 결합 친화성 또는 결합활성에 대해서 선택성임을 의미한다. 선택성 결합은 대개 결합 상수 또는 결합 역학이 적어도 10배(적어도 1 로그 차이로서 이해됨), 바람직하게는 적어도 100배(적어도 2 로그 차이로서 이해됨), 및 보다 바람직하게 적어도 1000배(적어도 3 로그 차이로서 이해됨) 상이한 경우 성취된다. 상기 "특이성" 또는 "특이적 결합"이란 용어는 또한 하나 이상의 분자, 예를 들어 교차-특이성 결합제에 결합하는 분자에 적용되는 것으로 이해된다.
본 발명의 항체는 구체적으로 오직 O25b 항원과의 결합에서, 또는 우세하게는 O25a 항원에 비해 상기 O25b 항원과의 결합, 또는 O25a 균주에 대해 발생한 다클론 혈청(상기 혈청은 상기 O25b 항원에 낮은 친화성으로 결합한다)에 비해 더 높은 친화성으로 상기 O25b와의 결합에서 선택적이다. 따라서, 본 발명의 항체는 상기 항원들에 차별적으로, 예를 들어 적어도 동등한 친화성, 또는 동등함보다 더 큰 친화성, 예를 들어 적어도 1 로그, 바람직하게는 적어도 2 로그, 보다 바람직하게는 적어도 3 로그의 Kd 차이의 상이한 친화성으로 결합하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 O25a 항원에 비해 상기 25b 항원에 선택적으로 결합하는 상기와 같은 항체는 바람직하게는 진단 또는 치료 목적에 사용된다. 일부 진단 목적을 위해서 구체적으로, 검출 가능한 방식으로 오직 상기 O25b 항원과 결합하는 항체가 사용된다.
다른 이. 콜라이 항원, 예를 들어 O25 항원 외의 임의의 탄수화물 항원 또는 임의의 코어 항원에 비해 O25b 항원과 바람직하게 결합하는 차별적인 결합 친화성은 바람직하게는 적어도 10-배 더 높다, 즉 적어도 10, 바람직하게는 적어도 100배 더 높은, 보다 바람직하게는 적어도 1000배 더 높은 Kd 차이를 갖는다.
상기 O25b 항원에 우선적으로 결합하는 차별적인 결합 친화성은 구체적으로, 상업적인 형별 혈청, 예를 들어 스타텐스 시럼 인스티튜트(Statens Serum Institut)로부터의 고 역가 이. 콜라이 O25 항혈청(#81369)에 비해 적어도 5배, 또는 적어도 6배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 8배, 또는 적어도 9배, 또는 적어도 10배 더 높다.
상기 O25a 항원에 비해 상기 O25b 항원에 우선적으로 결합하는 차별적인 결합 친화성은 구체적으로 적어도 동등하거나 또는 동등함보다 크다, 예를 들어 적어도 1.5배, 또는 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 4배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 6배, 또는 적어도 7배, 또는 적어도 8배, 또는 적어도 9배, 또는 적어도 10배 더 높다.
본 발명의 바람직한 항체는 상기 개별적인 항원 중 임의의 것, 특히 O25b 항원과 높은 친화성으로, 특히 높은 온율 및/또는 낮은 오프율, 또는 높은 결합활성으로 결합한다. 항체의 결합 친화성을 대개는 상기 항원 결합 부위의 절반이 점유되는 상기 항체의 농도(해리 상수 Kd 또는 KD로서 공지된다)에 의해 특성화한다. 대개 결합제는 Kd<10-7 M을 갖는 높은 친화성 결합제, 일부의 경우에 예를 들어 치료 목적을 위해서 더 높은 친화성, 예를 들어 Kd<10-8 M, 바람직하게는 Kd<10-9 M, 훨씬 더 바람직하게는 Kd<10-10 M을 갖는 높은 친화성 결합제가 고려된다.
그러나, 특히 바람직한 실시태양에서 상기 개별적인 항원 결합 친화성은 예를 들어 적어도 2개의 항원에 결합하는 경우 중간 친화성을 갖는다, 예를 들어 10-6 미만 및 10-8 M 이하의 Kd를 갖는다.
중간 친화성 결합제를 필요한 경우 본 발명에 따라, 바람직하게는 친화성 성숙 과정과 함께 제공할 수 있다.
친화성 성숙은 표적 항원에 대해 증가된 친화성을 갖는 항체가 초래되는 과정이다. 본 발명에 개시된 다양한 실시태양들에 따른 친화성 성숙된 항체를 생성시키기 위해서 당해 분야에서 입수할 수 있는 친화성 성숙 라이브러리를 제조 및/또는 사용하는 임의의 하나 이상의 방법을 사용할 수 있다. 예시적인 상기와 같은 친화성 성숙 방법 및 용도, 예를 들어 무작위 돌연변이유발, 세균 돌연변이 균주 계대배양, 부위-지향적 돌연변이유발, 돌연변이 다발점 표적화, 인색한 돌연변이유발, 항체 셔플링, 경쇄 셔플링, 중쇄 셔플링, CDR1 및/또는 CDR1 돌연변이유발, 및 본 발명에 개시된 다양한 실시태양들에 따른 실행 방법 및 용도에 따라 친화성 성숙 라이브러리를 생성시키고 사용하는 방법은 예를 들어 하기에 개시된 것들을 포함한다: Prassler et al. (2009); Immunotherapy, Vol. 1(4), pp. 571-583; Sheedy et al. (2007), Biotechnol. Adv., Vol. 25(4), pp. 333-352; WO2012/009568; WO2009/036379; WO2010/105256; US2002/0177170; WO2003/074679.
아미노산 돌연변이유발을 포함한 항체의 구조적 변화에 의해, 또는 면역글로불린 유전자 분절 중의 체세포 돌연변이의 결과로서, 항원에 대한 결합 부위의 변이체가 생성되고 더 큰 친화성을 위해 선택된다. 친화성 성숙된 항체는 모 항체보다 수 로그배 더 큰 친화성을 나타낼 수 있다. 단일 모 항체를 친화성 성숙시킬 수 있다. 한편으로 표적 항원에 대해 유사한 결합 친화성을 갖는 항체들의 풀을, 친화성 성숙된 단일 항체 또는 상기와 같은 항체의 친화성 성숙된 풀을 획득하기 위해 변화시킨 모 구조로서 간주할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 바람직한 친화성 성숙된 변이체는 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배, 바람직하게는 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 50배, 또는 바람직하게는 적어도 100배의 결합 친화성 증가를 나타낸다. 상기 친화성 성숙을 모 분자의 각 라이브러리를 사용하는 선택 캠페인의 과정에 사용할 수 있으며, 이때 본 발명의 항체를 수득하기 위해 중간 결합 친화성을 갖는 항체는 결합 친화성 Kd <10-8 M의 특이적인 표적 결합 성질을 갖는다. 한편으로, 상기 친화성을 10-9 M 미만, 바람직하게는 10-10 M 미만 또는 심지어 10-11 M 미만, 가장 바람직하게는 피코몰 범위의 Kd에 상응하는 높은 값을 획득하도록 본 발명에 따른 항체의 친화성 성숙에 의해 훨썬 더 증가시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서 결합 친화성을 친화성 ELISA 분석에 의해 측정한다. 몇몇 실시태양에서 결합 친화성을 비아코어(BIAcore), 포르테바이오 또는 MSD 분석에 의해 측정한다. 몇몇 실시태양에서 결합 친화성을 동역학적 방법에 의해 측정한다. 몇몇 실시태양에서 결합 친화성을 평형/용해 방법에 의해 측정한다.
"동일한 특이성을 갖는", "동일한 결합 부위를 갖는" 또는 "동일한 에피토프에 결합하는"이란 용어의 사용은 등가의 단클론 항체들이 동일하거나 또는 필수적으로 동일한, 즉 유사한 면역반응(결합) 특성을 나타내며 사전-선택된 표적 결합 서열에의 결합에 대해 경쟁함을 가리킨다. 특정 표적에 대한 항체 분자의 상대적인 특이성을, 예를 들어 문헌[Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988]에 개시된 바와 같은 경쟁 분석에 의해 상대적으로 측정할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "피험자"란 용어는 온혈 포유동물, 특히 인간을 지칭할 것이다. 특히 본 발명의 의학적 용도 또는 각각의 치료 방법을 MDR 이. 콜라이 감염과 관련된 질병 상태의 예방 또는 치료가 필요하거나, 또는 초기 또는 말기 질병을 포함한 질병을 앓고 있는 피험자에게 적용한다. "환자"란 용어는 예방학적 또는 치료학적 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물 피험자를 포함한다. 따라서 "치료"란 용어는 예방학적 및 치료학적 치료 모두를 포함함을 의미한다.
피험자를 예를 들어 MDR 이. 콜라이 질병 상태의 예방 또는 치료를 위해 치료한다. 특히, 감염의 위험이 있거나 또는 상기와 같은 질병 또는 질병 재발이 발생할 위험이 있는 피험자, 또는 상기와 같은 감염 및/또는 상기와 같은 감염과 관련된 질병을 앓고 있는 피험자를 치료한다.
구체적으로, 본 발명에 개시된 바와 같은 피험자에서 질병 상태를 치료하거나, 예방하거나, 또는 지연시키기 위한 방법은 상기 상태의 원인 인자로서 MDR 이. 콜라이의 병인을 방해함에 의한다.
구체적으로 "예방학"이란 용어는 발병의 개시의 방지를 포함하고자 하는 예방적 수단 또는 발병의 위험을 감소시키기 위한 예방학적 수단을 지칭한다.
예를 들어, 본 발명의 항체를 MDR 이. 콜라이 감염의 개시를 억제하기 위해 예방학적으로, 또는 MDR 이. 콜라이 감염, 특히 난치성인 것으로 알려진 또는 특별한 환자의 경우에 다른 통상적인 항생제 치료법에 의한 치료에 난치성인 것으로 나타난 MDR 이. 콜라이 감염을 치료하기 위해 치료학적으로 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 순수한" 또는 "정제된"이란 용어는 화합물, 예를 들어 핵산 분자 또는 항체의 적어도 50%(w/w), 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%를 포함하는 제제를 지칭할 것이다. 순도를 상기 화합물에 적합한 방법들(예를 들어 크로마토그래피 방법, 폴리아크릴아미드젤 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정한다.
화합물, 예를 들어 본 발명의 항체의 "유효량" 또는 "충분량"이란 용어 중 임의의 것와 호환적으로 본 발명에 사용되는 바와 같은 "치료 유효량"이란 용어는, 피험자에게 투여시, 임상 결과를 포함하여 이롭거나 목적하는 결과를 수행하기에 충분한 양 또는 활성이며, 유효량 그 자체 또는 그의 동의어는 상기 화합물이 적용되는 상황에 따라 변한다.
유효량은 상기와 같은 질병 또는 질환을 치료하거나, 예방하거나 억제하기에 충분한 화합물의 양을 의미하고자 한다. 질병과 관련하여, 본 발명에 개시된 바와 같은 항체의 치료 유효량은 구체적으로 (MDR) 이. 콜라이 병인, 예를 들어 점막 표면의 부착 및 군체형성, 무균 신체 부위내의 억제되지 않은 복제, 및 세균 생성물에 의한 숙주 세포의 독성의 억제가 유리한 질병 또는 상태를 치료하거나, 조절하거나, 감소시키거나, 역전시키거나 또는 영향을 미치는데 사용된다.
상기와 같은 유효량에 상응하는 화합물의 양은 다양한 인자들, 예를 들어 주어진 약물 또는 화합물, 약학 제형, 투여 경로, 질병 또는 질환의 유형, 치료되는 피험자 또는 숙주의 정체 등에 따라 변할 것이나, 그럼에도 불구하고 상기 량은 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 측정될 수 있다.
항체가 필요한 인간 환자에게 제공된 바와 같은, 본 발명에 개시된 바와 같은 상기 항체의 치료 유효량은 구체적으로 0.5 내지 50 ㎎/㎏, 바람직하게는 5 내지 40 ㎎/㎏, 훨씬 더 바람직하게는 20 ㎎/㎏ 이하, 10 ㎎/㎏ 이하, 5 ㎎/㎏ 이하의 범위일 수 있으나, 예를 들어 급성 질병 상태의 치료를 위해서 더 높은 용량이 지시될 수도 있다.
더욱이, 치료 유효량의 본 발명의 항체에 의한 피험자의 치료 또는 예방 섭생은 단일 투여로 이루어지거나, 또는 한편으로 일련의 적용을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 상기 항체를 적어도 1년에 1회, 적어도 반년에 1회, 또는 적어도 1개월에 1회 투여할 수 있다. 그러나, 또 다른 실시태양에서, 상기 항체를 상기 피험자에게, 제공된 치료에 대해 주당 약 1회 내지 대략 매일의 투여로 투여할 수 있다. 상기 치료 기간의 길이는 다양한 인자들, 예를 들어 질병의 중증도, 급성 또는 만성 질병, 환자의 연령, 항체 포맷의 농도 및 활성에 따라 변한다. 상기 치료 또는 예방에 사용되는 유효 투여량을 특정한 치료 또는 예방 섭생의 과정 동안 증가시키거나 감소시킬 수도 있음을 또한 알 것이다. 투여량의 변화가 생성될 수 있으며 이는 당해 분야에 공지된 표준 진단 분석에 의해 명백해진다. 일부의 경우에, 만성 투여가 요구될 수도 있다.
특정한 태양에 따라, 본 발명은 본 발명에 제공된 도면들에 상세히 나타낸 예시적인 항체, 및 추가의 항체 변이체, 특히 VH 및 VL 아미노산 서열, 또는 그 밖에 도 2의 HC 및 LC 아미노산 서열에 의해 형성된 특이적인 결합 부위, 또는 상기와 같은 VH/VL 도메인에 의해 형성된 결합 부위를 특징으로 하는 모 항체와 필수적으로 동일한 에피토프에 결합하는 변이체를 제공한다. 상기와 같은 항체는 예를 들어 상기 모 항체의 각각의 CDR 또는 항체 서열을 변형시킴으로써 획득된 기능 활성 변형 항체일 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같은 임의의 항체 서열은, 예를 들어 점 돌연변이에 의해 변화가 가해진 "모" 서열로 간주됨은 충분히 이해된다.
예시적인 모 항체는 하기 실시예 섹션 및 도 1 및 2에 개시되어 있다. 도 2의 항체는 표 1의 모 항체, 즉 2A7, 8A1, 4D5 및 3E9로 표시된 항체 및 상이한 HC/LC 조합을 갖는 각각의 변이체로부터 유래된 변형 항체이며, 상기는 인간화 및 임의로 친화성 성숙에 의해 획득된다. 이들 변형 항체는 표적 항원에 결합하며, 따라서 기능 활성인 것으로 간주된다. 또한, 예를 들어 각각의 FR 또는 CDR 서열에 변형을 갖는 변형 VH 또는 VL 도메인 또는 변형 HC 또는 LC 쇄를 사용할 수 있으며, 이들은 기능 활성이다, 예를 들어 상기 모 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 동일한 결합 부위를 포함하거나 또는 동일한 결합 특성을 갖는다. 또한, 본 발명에 개시된 항체의 FR 또는 CDR 서열 중 일부를 다른 항체, 예를 들어 도 1 또는 2에 나열된 바와 같은 항체의 서열들에 의해 교환시킬 수 있다.
항체는, 단지 하나의 항체가 주어진 시점에서 에피토프에 결합할 수 있도록 항체들이 교차-경쟁하는 경우, 즉 하나의 항체가 다른 항체의 결합 또는 조절 효과를 방지하는 경우, "동일한 에피토프에 결합한다" 또는 "동일한 결합 부위를 포함한다" 또는 "필수적으로 동일한 결합" 특성을 갖는다고 한다.
항체에 대하여 본 발명에 사용되는 바와 같은 "경쟁한다" 또는 "교차-경쟁한다"란 용어는 1차 항체 또는 그의 항원-결합 부분이, 상기 1차 항체와 그의 동족 에피토프와의 결합 결과가 2차 항체의 부재하에서의 1차 항체의 결합에 비해 상기 2차 항체의 존재하에서 검출 가능하게 감소하기에 충분히 상기 2차 항체, 또는 그의 항원-결합 부분의 결합과 유사한 방식으로 에피토프에 결합함을 의미한다. 한편, 상기 2차 항체의 그의 에피토프에의 결합이 또한 상기 1차 항체의 존재하에서 검출 가능하게 감소하는 경우가 존재할 수 있으나, 필요한 것은 아니다. 즉, 1차 항체는 2차 항체가 상기 1차 항체의 그의 각 에피토프에의 결합을 억제하지 않으면서 상기 2차 항체의 그의 에피토프에의 결합을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 다른 항체와 그의 동족 에피토프와의 결합을 검출 가능하게 억제하는 경우, 동일한 정도든, 더 큰 정도든 또는 더 적은 정도든간에, 상기 항체는 그의 각 에피토프(들)의 결합에 대해서 서로 "교차-경쟁한다"고 한다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체는 모두 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 경쟁은 경쟁 ELISA 분석에 의해서 또는 포르테바이오(ForteBio) 분석에 의해서 측정시 약 30% 초과의 상대적인 억제를 의미한다. 특정 상황에서, 예를 들어 상기 경쟁 분석을, 상기 항원의 결합의 의도된 기능을 갖도록 설계된 새로운 항체를 선택하거나 선별하는데 사용하는 경우, 경쟁의 적합한 수준의 기준으로서 더 큰 상대적인 억제 한계를 설정하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 예를 들어 상기 경쟁 결합에 대한 기준을 설정할 수 있으며, 여기에서 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 심지어 적어도 100%의 상대적인 억제가 검출된 후에, 항체는 충분히 경쟁적인 것으로 간주된다.
본 발명에 개시되는 바와 같이, 하나의 태양에서, 본 발명은 예를 들어 상기 O25b 항원과의 결합에 대해, 도 1 또는 2에 나열된 항체들 중 임의의 것와 경쟁하는 능력을 특징으로 하는 항체 분자를 제공한다.
O25b에 고도로 특이적인 단클론 항체(mAb)는 ST131 계통에 속하는 MDR 균주의 확인에 진단 시약으로서 큰 잠재성을 갖는다. 더욱이, 특히 인간화에 이어서, 상기 mAb는 ST131-O25b:H4 균주에 의해 유발된 이. 콜라이 감염의 예방(예를 들어 고 위험군의 경우) 및 치료에 사용하기에 적합하다.
상기 O25b 및 O25a 탄수화물 항원은, O25에 대한 면역 혈청이 O25b 항원을 발현하는 이. 콜라이 균주의 진단 확인에 통상적으로 사용된다는 사실에 근거하여 동일하거나 매우 유사한 것으로 생각되었다. ST131 균주에서 O-항원 합성의 유전적 배경은 충분히 밝혀지지 않았지만, rfb 클러스터(O-항원 합성을 암호화한다) 내의 특이 유전자는 O25b 균주의 PCR 기반 확인의 토대를 형성한다. 더욱 또한, 지금까지 O25a와 O25b 항원간의 임의의 차이를 지지하는 구조 데이터는 없었다.
따라서, 본 발명의 항체가 상기 O25b 항원에 특이적으로 결합할 수 있음은 놀라웠다.
O25b와 O25a 항원 발현 이. 콜라이 균주들간의 유전적 차이를 확인하기 위해서, 상기 O-항원 합성을 암호화하는 rfb 클러스터를, 보존된 측면인접 유전자: gnd 및 galF에 특이적인 올리고뉴클레오티드로 시작하는 프라이머 워크(walk) 방법을 사용하여 ST131-O25b:H4 균주 81009(Szijarto et al., FEMS Microbiol Lett, 2012, 332:131-6)의 임상 단리물로부터 서열분석하였다. 상기 초래되는 rfb 오페론의 콘틱은 11,300 bp 길이이며 상기 O25 항원 합성 효소(NCBI 수납 번호 GU014554)를 암호화하는 것과 단지 부분적으로 상동성이다. 상기 O25b rfb 오페론의 3' 단부의 2043 bp 길이 분절은 상기 O25 rfb 오페론의 상응하는 영역에 비-상동성인 것으로 밝혀졌으며, 이때 상기 분절은 퓨코스 합성 및 수송을 암호화하는 6267 bp 길이 서열에 의해 치환된다.
이. 콜라이 ST131로부터 단리된 LPS 중에 존재하는 O-특이성 PS 생물학적 반복 단위(RU)의 구조를 하나의 반복 단위(RU)에 의한 코어 OS 치환에 의해 형성된 정제된 분획 중에서 상세히 분석하였다. 상기 LPS ST131의 RU는 도 8(a)에 묘사된 구조를 갖는 O-아세틸화된 펜타사카라이드이다.
실제로, 상기 ST131 O-PS의 RU 구조는 켄(Kenne) 등에 의해 보고된 LPS O25 RU(도 8(b))와 상이하며 우리가 아는 바로는 상기는 이. 콜라이 리포폴리사카라이드 중의 신규의 O-혈청형이다(Stenutz et al. FEMS Microbiol Rev. 2006 May; 30(3):382-403. Review). 추가로, LPS ST131로부터 단리된 코어 올리고사카라이드의 MALDI-TOF 질량 분광분석 및 조성 분석(당 및 메틸화 분석)의 예비 결과는 K-12 유형을 지지하였으며, 이는 유전자 분석을 근거로 시야르토(Szijarto V.) 등에 의해 앞서 보고되었다(Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett, 2012, 332:131-6). LPS ST131은 2개의 주요 코어 올리고사카라이드(OS) 복합당질로 이루어지는 것으로 밝혀졌다. 상기 복합당질의 유형은 상기 O-특이성 폴리사카라이드(PS)의 존재 또는 부재에 따라 다르다. 치환되지 않은 코어 OS의 우세한 복합당질은 K-12 코어 올리고사카라이드의 절두된 버전으로, 이는 →7)-α-Hepp-(1→6)-α-Glcp 디사카라이드가 없다. 상기 디사카라이드의 존재는 O-PS 치환된 코어 OS와 치환되지 않은 코어 OS간의 차이이다.
특정한 태양은 특이적인 항균 기능 활성, 예를 들어 보체 매개된 세균 살해 및 옵소닌개시된 식작용 흡수 및 살해를 특징으로 하는 본 발명의 항체에 관한 것이다.
특정한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 표준 SBA 또는 OPK 분석에서 측정된 바와 같이 면역-효과기 세포의 존재하에서 세포독성 활성을 갖는다. SBA 또는 OPK 분석에 의해 측정된 바와 같은 세포독성 활성은, 대조용에 비해 세균 살해 비율의 현저한 증가가 존재하는 경우, 본 발명의 항체에 대해 입증될 수 있다. SBA 또는 OPK와 관련된 살균 활성을 바람직하게는 절대 백분율의 증가로서 측정하며, 상기는 바람직하게는 5% 초과, 보다 바람직하게는 10% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 또는 50% 초과이다.
식작용성 효과기 세포를 보체의 활성화를 사용하는 또 다른 경로를 통해 활성화시킬 수 있다. 미생물상의 표면 항원에 결합하는 항체는 Fc 영역과의 보체 캐스케이드의 제1 성분을 유인하고 "고전적인" 보체 시스템의 활성화를 개시한다. 이는 식균작용성 효과기 세포를 자극하여, 최종적으로 보체 의존성 세포독성(CDC)에 의해 표적을 살해한다.
특정한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 표준 ADCC 또는 CDC 분석에서 측정되는 바와 같이 면역-효과기 세포의 존재하에서 세포독성을 갖는다. ADCC 또는 CDC 분석에 의해 측정되는 바와 같은 세포독성 활성을, 대조용에 비해 세포용해 백분율의 현저한 증가가 존재하는 경우, 본 발명의 항체에 대해서 입증할 수 있다. ADCC 또는 CDC와 관련된 세포독성 활성을 바람직하게는 절대 백분율 증가로서 측정하며 상기 증가는 바람직하게는 5% 초과, 보다 바람직하게는 10% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 20% 초과이다. 보체 고정이 특이적으로 관련될 수도 있으며, 상기 기전은 형성된 면역 복합체의 제거에 의해 감염 부위 또는 혈액으로부터 독소를 제거할 수 있다.
특정한 실시태양에 따라, 본 발명의 항체는 IgG의 Fc 부분에 의해 발휘되는 면역조절 기능을 갖는다. 예를 들어 말단 갈락토스 잔기상의 시알화를 증가시키는 변경된 글리코실화는 가능하게는 DC-SIGN 신호전달을 통해 소염 효과를 갖는다. Ia, IIa 및 III Fc감마 수용체에 비해 Fc감마 수용체 IIb(억제성)에의 우선적인 결합은 가능하게는 소염 효과를 제공한다.
본 발명의 항체를 하이브리도마 방법을 사용하여 확인하거나 획득할 수 있다. 상기와 같은 방법에서, 마우스 또는 다른 적합한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를 면역시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 이끌어낸다. 한편으로, 림프구를 시험관내에서 면역시킬 수도 있다. 이어서 림프구를 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다.
하이브리도마 세포가 생육하는 배양 배지를 항원에 대한 단클론 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성을 면역침전에 의해서 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성면역분석(RIA) 또는 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 의해서 측정한다.
예를 들어, 본 발명의 항체를 소스 (모)항체로부터 획득할 수 있다, 예를 들어 마우스를, kps 클러스터(캡슐 합성을 암호화한다)를 가나마이신 내성을 암호화하는 카세트로 치환시킴으로써 전형적인 ST131-O25b:H4 균주 81009의 캡슐화되지 않은 돌연변이체(예를 들어 81009Δkps :: kan)로 면역시킴으로서 획득할 수 있다. 이어서 상기 마우스로부터 수득된 혈청 샘플을 분석하고, O25b 항원에 대해 가장 높은 IgG 역가(ELISA 및 웨스턴 블럿에서)를 나타내는 마우스의 비장을 하이브리도마 생성에 사용할 수 있다. 서브클로닝에 이어서, O25b 항원을 발현하는 살아있는 야생형 이. 콜라이 균주의 표면에 결합되었을 뿐 아니라 25b 항원에 특이적인 항체를 분비한 하이브리도마 클론들을 선택할 수 있다. 이어서 이들 mAb를, O25b 항원의 특이적인 결합 및 가능하게는 O25a 항원에 비해 O25b 항원에 우선적으로 결합하는 그의 차별적인 결합 친화성, 및 예를 들어 상이한 진단학적 또는 치료학적 목적을 위한 항체의 조작에 대해서 추가로 시험하기 위해 하이브리도마 상등액으로부터 정제할 수 있다.
일부의 경우에 차별적으로 결합하는 항체(본 발명에서 또한 선택성 항체라 칭한다)는 단일 항원에 대한 선별을 통해 나타난다. 차별적으로 결합하는 클론의 단리 가능성을 증가시키기 위해서 상기 차별적인 항원들에 대한 점진적인 선별에 의해 다수의 선택압을 적용할 것이다. 특별한 mAb 선택 전략은 상기 O25b 및 O25a 성분 또는 다른 이. 콜라이 항원을 교번 방식으로 사용한다.
목적하는 선택적인 결합 성질을 갖는 항체를 확인하기 위한 선별 방법을 디스플레이 기술(파지, 세균, 효모 또는 포유동물 세포를 사용한다)에 의해 수행할 수 있다. 반응성을 ELISA, 웨스턴 블럿팅, 또는 예를 들어 표준 분석을 사용하는 유식 세포측정에 의한 표면 염색을 근거로 평가할 수 있다.
재조합 항원(들)을 예를 들어 항체 라이브러리, 예를 들어 효모-디스플레이된 항체 라이브러리로부터 항체를 선택하는데 사용할 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 구체적으로, 예를 들어 특수 발견 선택 설계에 의해 상기 O25b 항원에 결합하는 특이성을 갖는 항체를 확인하는 방법에 의해 획득되는 O25b 특이성 항체를 제공한다. 상응하게, 상기 O25b 표적과 반응성을 나타내는 항체를 포함하는 항체 라이브러리가 상기 표적과의 반응성을 위해 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 구체적으로, 예를 들어 교차-반응성 발견 선택 설계에 의해 2개의 표적, 예를 들어 O25b 및 O25a 항원에 결합하는 특이성을 갖는 항체를 확인하는 방법에 의해 획득되는 교차-반응성 항체를 제공한다. 상응하게, 2개의 표적, 표적 A 및 B와 반응성을 나타내는 항체들을 포함하는 항체 라이브러리를 먼저 상기 표적 중 하나, 예를 들어 표적 A와의 반응성에 대해 선택한 다음 다른 표적, 예를 들어 표적 B와의 반응성에 대해 선택할 수 있다. 각각의 연속적인 선택 라운드는 상기 두 표적 모두에 대해 초래되는 풀의 반응성 강도를 강화시킨다. 상응하게, 상기 방법은 2개의 상이한 표적에 대한 교차-반응성, 및 병원체를 교차-중화시키는 잠재성을 갖는 항체의 확인에 특히 유용하다. 상기 방법을, 추가적인 표적(들)에 대한 추가의 농축 라운드를 포함시킴으로써, 추가의 표적들에 대해 반응성을 보이는 항체들의 확인으로 확장할 수 있다.
어느 경우든, 선택성 결합을 당해 분야에 공지된 항체 최적화 방법에 의해 추가로 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 면역글로불린 쇄의 가변 영역 중 몇몇 영역에, 경쇄 셔플링, 용도 돌연변이유발, CDR 융합, 및 선택된 CDR 및/또는 프레임워크 영역의 지정 돌연변이유발을 포함한 하나 이상의 최적화 전략을 가할 수 있다.
일단 목적하는 성질을 갖는 차별적으로 결합하는 항체가 확인되었으면, 상기 항체에 의해 인식되는 우세한 에피토프 또는 에피토프들을 측정할 수 있다. 에피토프 지도화 방법은 당해 분야에 주지되어 있으며 예를 들어 문헌[Epitope Mapping : A Practical Approach, Westwood and Hay, eds., Oxford University Press, 2001]에 개시되어 있다.
에피토프 지도화는 항체가 결합하는 에피토프의 확인에 관한 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된, 단백질 상의 또는 탄수화물에 의해 형성된 에피토프의 위치를 측정하기 위한 다수의 방법들, 예를 들어 항체-항원 복합체의 결정학 분석, 경쟁 분석, 유전자 단편 발현 분석, 및 합성 펩티드-기반 분석이 존재한다. 기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는" 항체를 본 발명에서 하기의 방식으로 이해한다. 2개의 항체가 동일하거나 입체적으로 중복되는 에피토프인 에피토프를 인식하는 경우, 상기 항체들을 동일한 또는 필수적으로 동일한 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 것으로서 지칭한다. 2개의 항체가 동일하거나 또는 입체적으로 중복되는 에피토프에 결합하는지를 측정하기 위해 통상적으로 사용되는 방법은 경쟁 분석이며, 상기 분석은 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하는 다수의 상이한 포맷들로 구성될 수 있다. 대개, 항원을 96-웰 플레이트상에 고정화시키고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 표지되지 않은 항체의 능력을 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정한다.
일단 목적하는 결합 성질을 갖는 항체가 확인되었으면, 항체 단편을 포함한 상기와 같은 항체를 당해 분야에 주지된 방법들, 예를 들어 하이브리도마 기법 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성시킬 수 있다.
재조합 단클론 항체를, 예를 들어 필요한 항체 쇄를 암호화하는 DNA를 단리하고 재조합 숙주 세포를 주지된 재조합 발현 벡터, 예를 들어 상기 항체 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 발명의 플라스미드 또는 발현 카세트(들)를 사용하여 발현을 위한 암호화 서열로 형질감염시킴으로써 생성시킬 수 있다. 재조합 숙주 세포는 원핵생물 및 진핵생물 세포, 예를 들어 상술한 것들일 수 있다.
특정한 태양에 따라, 상기 뉴클레오티드 서열을, 항체를 인간화시키거나 또는 상기 항체의 친화성 또는 다른 특성을 개선시키기 위한 유전자 조작에 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 항체가 인간의 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우, 불변 영역을 인간 불변 영역에 보다 가깝게 닮도록 조작하여 면역 반응을 피할 수도 있다. 상기 항체 서열을, 표적 O25b에 대해 더 큰 친화성을 획득하고 MDR 이. 콜라이에 대해 보다 큰 효능을 획득하기 위해서 유전자 조작하는 것이 바람직할 수도 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 상기 항체에 대해 수행될 수 있고 표적 O25b에 대한 그의 결합 능력을 여전히 유지할 수 있음은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다.
다양한 수단에 의한 항체 분자의 생성은 일반적으로 충분히 이해되어 있다. 예를 들어 미국특허 제 6331415 호(Cabilly et al.)는 중쇄 및 경쇄가 단일 벡터 또는 단일 세포 중 2개의 별도의 벡터로부터 동시에 발현되는 항체의 재조합 생산 방법을 개시한다. 문헌[Wibbenmeyer et al., 1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202] 및 문헌[Lee and Kwak, 2003, J. Biotechnology 101 :189-198]은 에스케리키아 콜라이의 별도의 배양물에서 발현된 플라스미드를 사용하는, 별도로 생성된 중쇄 및 경쇄로부터 단클론 항체를 생성시키는 방법을 개시한다. 항체의 생성에 관련된 다양한 다른 기법들이 예를 들어 문헌[Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)]에 제공된다.
경우에 따라, 본 발명의 항체, 예를 들어 도 1 또는 도 2의 항체 중 임의의 것를 서열분석하고, 이어서 발현 또는 확대를 위해 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터내에 클로닝할 수 있다. 상기 항체를 암호화하는 서열을 숙주 세포 중의 벡터에서 유지시킬 수 있고 이어서 상기 숙주 세포를 확대시키고 추후의 용도를 위해 동결시킬 수 있다. 세포 배양물에서 재조합 단클론 항체의 생성을 당해 분야에 공지된 수단에 의해 B 세포로부터의 항체 유전자의 클로닝을 통해 수행할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 항체의 생성을 암호화하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
항체 암호화 핵산은 임의의 적합한 특성을 가질 수 있으며 임의의 적합한 특징들 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 항체 암호화 핵산은 DNA, RNA 또는 그의 하이브리드 형태로 존재할 수 있으며, 비-천연 염기, 변형된 주쇄, 예를 들어 상기 핵산의 안정성을 촉진하는 포스포로티오에이트 주쇄, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 상기 핵산을 유리하게는 표적 숙주 세포(들)에서 목적하는 발현, 복제 및/또는 선택을 촉진하는 특징들을 포함하는 본 발명의 발현 카세트, 벡터 또는 플라스미드 중에 통합시킬 수 있다. 상기와 같은 특징의 예는 복제 성분의 기원, 선택 유전자 성분, 프로모터 성분, 인헨서 요소 성분, 폴리아데닐화 서열 성분, 종결 성분 등을 포함하며, 이들의 다수의 적합한 예는 공지되어 있다.
본 명세는 본 발명에 개시된 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상을 포함하는 재조합 DNA 구조물을 추가로 제공한다. 이들 재조합 구조물은 임의의 개시된 항체를 암호화하는 DNA 분자가 삽입되는 벡터, 예를 들어 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 함께 사용된다.
단클론 항체를, 배양물 중에서 연속적인 세포주에 의해 항체 분자를 생성시키는 임의의 방법에 의해 생성시킨다. 단클론 항체의 제조에 적합한 방법들의 예는 하이브리도마 방법(Kohler et al., 1975, Nature 256:495-497) 및 인간 B-세포 하이브리도마 방법(Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; 및 Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63)을 포함한다.
본 발명은 더욱이 본 발명에 개시된 바와 같은 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이들 약학 조성물을 본 발명에 따라 일시 주사 또는 주입으로서 또는 연속 주입에 의해 투여할 수 있다. 상기와 같은 투여 수단을 촉진하는데 적합한 약학 담체는 당해 분야에 주지되어 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 관련 조성물 또는 조합과 생리적으로 상용성인 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 추가의 예는 멸균수, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.
하나의 상기와 같은 태양에서, 항체를 목적하는 투여 경로에 적합한 하나 이상의 담체와 병용할 수 있으며, 항체를 예를 들어 락토스, 슈크로스, 전분, 알칸산, 스테아르산의 셀룰로스 에스테르, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 산화 마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘염, 아라비아검, 젤라틴, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리딘, 폴리비닐 알콜 중 임의의 것와 혼합하고, 통상적인 투여를 위해 임의로 추가로 정제화하거나 캡슐화할 수 있다. 한편으로, 항체를 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 카복시메틸 셀룰로스 콜로이드 용액, 에탄올, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 참깨유, 트라가칸트검, 및/또는 다양한 완충제 중에 용해시킬 수 있다. 다른 담체, 항원보강제, 및 투여 방식들은 약학 분야에 주지되어 있다. 담체는 조절된 방출 물질 또는 시간 지연 물질, 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로, 또는 왁스 또는 당해 분야에 주지된 다른 물질들과 함께 포함할 수 있다.
추가의 약학적으로 허용 가능한 담체는 당해 분야에 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES]에 개시되어 있다. 액체 제형은 용액, 유화액 또는 현탁액일 수 있으며 부형제, 예를 들어 현탁제, 용해제, 계면활성제, 보존제 및 킬레이트제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 하나 이상의 치료 활성제가 제형화된 약학 조성물이 고려된다. 본 발명의 항체의 안정한 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 면역글로불린을 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 혼합함으로써 보관용으로 제조한다. 생체내 투여용으로 사용되는 상기 제형은 구체적으로 무균성, 바람직하게는 무균성 수용액 형태이다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과 또는 다른 방법에 의해 용이하게 수행된다. 본 발명에 개시된 상기 항체 및 다른 치료 활성제를 또한 면역리포솜으로서 제형화하고/하거나 미세캡슐 중에 포집할 수 있다.
본 발명의 항체를 포함하는 약학 조성물의 투여를 다양한 방식으로, 예를 들어 경구, 피하, 정맥내, 비내, 귀내, 피내, 점막, 국소, 예를 들어 젤, 연고, 로션, 크림 등, 복강내, 근육내, 폐내, 예를 들어 흡입 기술 또는 폐 전달 시스템을 사용하여, 질, 비경구, 직장 또는 안내로 수행할 수 있다.
비경구 투여용의 예시적인 제형은 예를 들어 무균 용액, 유화액 또는 현탁액으로서 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 적합한 것들을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 질병 변형 또는 예방 단독요법으로서 피험자에게 투여되는 유일한 치료 활성제이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 항체를, 칵테일이 예를 들어 질병 변형 또는 예방 복합 요법으로서 피험자에게 투여되는 하나 초과의 치료 활성제를 함유하도록 상기 칵테일 중에 이. 콜라이를 표적화하기 위한 추가의 항체와 병용한다, 예를 들어 혼합물 또는 부분들의 키트 중에서 병용한다.
더욱이, 본 발명의 항체를 하나 이상의 다른 치료제 또는 예방제, 예를 들어 비제한적으로 표준 치료, 예를 들어 항생제, 스테로이드 및 비-스테로이드성 염증 억제제, 및/또는 예를 들어 항균 또는 소염제를 사용하는 다른 항체 기반 요법과 함께 투여할 수 있다.
복합 요법은 특히, 예를 들어 MDR 이. 콜라이 감염의 치료에 사용되는 바와 같은 표준 섭생을 사용한다. 상기는 항생제, 예를 들어 티제사이클린, 리네졸리드, 메티실린 및/또는 반코마이신을 포함할 수 있다.
복합 요법에서, 상기 항체를 혼합물로서, 또는 하나 이상의 다른 치료 섭생과 동반하여, 예를 들어 동반 요법 전에, 상기 요법과 동시에, 또는 상기 요법 후에 투여할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 각 약학 제제의 생물학적 성질들을 세포, 조직 및 완전 유기체 실험으로 생체외에서 특성화할 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 약물을 종종, 질병 또는 질병 모델에 대한 약물의 치료 효능을 측정하거나 또는 약물의 약동학, 약역학, 독성 및 다른 성질들을 측정하기 위해서 동물, 예를 들어 비제한적으로 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 원숭이에서 생체내에서 시험한다. 상기 동물을 질병 모델로서 지칭할 수도 있다. 치료법을 종종 마우스, 예를 들어 비제한적으로 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식 마우스 및 트랜스제닉 마우스(녹인 및 녹아웃 포함)에서 시험한다. 상기와 같은 실험은 적합한 반감기, 효과기 기능, (교차-) 중화 활성 및/또는 능동 또는 수동 면역요법에 대한 면역 반응을 갖는 치료제 또는 예방제로서 사용되는 상기 항체의 가능성을 측정하는데 의미있는 데이터를 제공할 수 있다. 임의의 유기체, 바람직하게는 포유동물을 시험에 사용할 수 있다. 예를 들어 인간에 대한 유전적 유사성으로 인해 영장류인 원숭이가 적합한 치료 모델일 수 있으며, 따라서 주 작용제 또는 조성물의 효능, 독성, 약동학, 약역학, 반감기 또는 다른 성질을 시험하는데 사용될 수 있다. 약물로서의 승인을 위해서는 최종적으로 인간에서의 시험이 요구되며, 따라서 물론 상기 실험이 고려된다. 따라서, 본 발명의 항체 및 각 약학 조성물을 인간에서 시험하여 이들의 치료학적 또는 예방학적 효능, 독성, 면역원성, 약동학, 및/또는 다른 임상 성질을 측정할 수 있다.
본 발명은 또한 진단을 목적으로, 예를 들어 생물학적 유체 샘플에서 면역시약 또는 표적으로서 세균량 또는 항체의 농도를 검출하고 정량적으로 측정하는 방법에 사용하기 위해 본 발명의 주 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플, 예를 들어 MDR 이. 콜라이가 있는 샘플, 예를 들어 체액을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 샘플 중 패혈증 또는 MDR 이. 콜라이 감염의 정도, 예를 들어 상기 MDR 이. 콜라이가 있는 샘플의 양을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체를 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어 경쟁 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 면역침전 분석 및 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 사용할 수 있다.
바람직한 진단학적 분석을 하기와 같이 수행한다. 표적 항원 특이성 항체를 라텍스 비드상에 고정화시키고, 이를 체액 중에 존재하거나 또는 체액으로부터 단리된 세균과 함께 배양한다. 양성 반응을, 상기 세균의 표면상에서 발현된 상응하는 동족 항원의 존재하에서 상기 (가능하게는 착색된) 라텍스 비드의 응집에 기인하여 육안으로 검출할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 바와 같은 체액은 피험자의 생물학적 샘플, 예를 들어 조직 추출물, 소변, 혈액, 혈청, 대변 및 객담을 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 방법은 항체를 고체 지지체의 표면에 부착되게 하는 조건하에서 상기 고체 지지체를, 특이적으로 표적과 복합체를 형성하는 과잉의 몇몇 유형의 항체 단편과 접촉시킴을 포함한다. 이어서 상기 항체가 부착된 상기 생성된 고체 지지체를, 생물학적 유체 중의 표적이 상기 항체와 결합하여 표적-항체 복합체를 형성하도록 상기 생물학적 유체 샘플과 접촉시킨다. 상기 복합체를 검출 가능한 마커로 표지할 수 있다. 한편으로, 상기 표적이나 항체를 상기 복합체 형성 전에 표지할 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 마커(표지)를 상기 항체에 접합시킬 수 있다. 이어서 상기 복합체를 검출하고 정량적으로 측정하여, 상기 생물학적 유체 샘플 중의 상기 표적의 농도를 검출하고 정량적으로 측정할 수 있다.
특정한 용도를 위해서 본 발명의 항체를 유기 분자, 효소 표지, 방사성 표지, 착색된 표지, 형광 표지, 발색성 표지, 발광 표지, 합텐, 디곡시제닌, 비오틴, 금속 착체, 금속, 콜로이드성 금 및 이들의 혼합물로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 표지 또는 리포터 분자에 접합시킨다. 표지 또는 리포터 분자에 접합된 항체를, 예를 들어 이. 콜라이 감염 또는 이와 관련된 질병 상태의 진단을 위한 분석 시스템 또는 진단 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 항체를 예를 들어 결합 분석(예를 들어 ELISA) 및 결합 연구에서 상기 접합체의 간단한 검출을 허용하는 다른 분자에 접합시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 항체를 포함하는 키트를 제공하며, 상기 키트는 하나 이상의 항체 외에 다양한 진단제 또는 치료제를 포함할 수도 있다. 키트는 또한 진단 또는 치료 방법에 사용하기 위한 설명서를 포함할 수도 있다. 상기와 같은 설명서를 예를 들어 상기 키트 중에 포함되는 기구상에, 예를 들어 진단용 생물학적 샘플을 제조하기 위한, 예를 들어 질병 진단을 위해 상기 MDR 이. 콜라이 양을 측정하기 전에 세포 및/또는 단백질 함유 분획을 분리시키는 도구 또는 기구상에 제공할 수 있다. 유리하게는, 상기와 같은 키트는 항체 및 본 발명에 개시된 다양한 진단 방법들 중 하나 이상에 사용될 수 있는 진단제 또는 시약을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 키트는 항체를, 예를 들어 동결건조된 형태로, 임의로 설명서 및 상기 동결건조물을 재조성하기 위한 매질, 및/또는 가까운 기간의 투여를 위한 주사성 조성물을 형성시키기 위해 사용전에 혼합될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체(들)와 함께 포함한다.
8D5-1G10 및 8D10-C8 표시된 항체, 구체적으로 항체 경쇄 및/또는 중쇄 중 임의의 것는 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b / Inhoffenstraβe 7B, 38124 Braunschweig (DE))에 기탁된 생물학적 물질에 의해 추가로 특성화된다.
상기 기탁물들은 형질전환된 이. 콜라이 배양물들을 지칭하며, 상기 배양물들은 각각 관심 유전자가 삽입된 클로닝된 플라스미드를 함유한다. 상기 관심 유전자는 마우스 단클론 항체 8D5-1G10(IgG3)의 중쇄 및 경쇄, 및 마우스 단클론 항체 8D10-C8(IgG2b)의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이다.
DSM 26763은 8D5-IG10 경쇄(8D5-1G10-LC)의 가변 도메인 암호화 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 숙주 세포이다: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 8D5-1G10-VL = DSM 26763, 기탁일: 2013년 1월 15일; 기탁자: 알사니스 바이오사이언시즈(Arsanis Biosciences) GmbH(오스트리아 빈 소재).
DSM 26762는 8D5-IG10 중쇄(8D5-1G10-HC)의 가변 도메인 암호화 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 숙주 세포이다: 에스케리키아 콜라이 8D5-1G10-VH = DSM 26762, 기탁일: 2013년 1월 15일; 기탁자: 알사니스 바이오사이언시즈 GmbH(오스트리아 빈 소재).
DSM 28171은 8D10-C8 경쇄(8D10-C8-LC)의 가변 도메인 암호화 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 숙주 세포이다: 에스케리키아 콜라이 8D10-C8-VL = DSM 28171, 기탁일: 2013년 12월 11일; 기탁자: 알사니스 바이오사이언시즈 GmbH(오스트리아 빈 소재).
DSM 28172는 8D10-C8 중쇄(8D10-C8-HC)의 가변 도메인 암호화 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 숙주 세포이다: 에스케리키아 콜라이 8D10-C8-VH = DSM 28172, 기탁일: 2013년 12월 11일; 기탁자: 알사니스 바이오사이언시즈 GmbH(오스트리아 빈 소재).
하기 항들의 요지는 본 발명의 실시태양들로 간주된다:
1. 표 1에 나열된 바와 같은(카밧의 넘버링 시스템에 따라 표시된다) 또는 표 2에 나열된 바와 같은(IMGT 넘버링 시스템에 따라 표시된다) CDR1 내지 CDR3 서열 중 임의의 것, 또는 그의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 적어도 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 이. 콜라이 균주의 O25b 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
2. 1항의 항체로,
A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 xiv)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되거나:
i) a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
ii) a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
iii) a) 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
iv) a) 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
v) a) 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
vi) a) 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
vii) a) 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 35의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
viii) a) 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
ix) a) 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
x) a) 서열번호 50의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 52의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
xi) a) 서열번호 50의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 55의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 56의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
xii) a) 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
xiii) a) 서열번호 61의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 62의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 63의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
xiv) a) 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 67의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 68의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체; 또는
B) A의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체
인 항체.
3. 1항 또는 2항의 항체로,
a) 도 2에 나타낸 바와 같은 VH 서열, 바람직하게는 서열번호 184 내지 서열번호 231 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VH 아미노산 서열;
b) 서열번호 184 내지 서열번호 231 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열; 또는
c) 서열번호 184 내지 서열번호 231 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것이고 C-말단 아미노산의 결실 및/또는 상기 VH 서열의 첫 번째 아미노산이 Q인 경우 Q1E 점 돌연변이를 추가로 포함하는 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열
을 포함하는 항체.
4. 1항 내지 3항 중 어느 한 항의 항체로,
표 1에 나열된 바와 같은(카밧의 넘버링 시스템에 따라 표시된다) 또는 표 2에 나열된 바와 같은(IMGT 넘버링 시스템에 따라 표시된다) CDR4 내지 CDR6 서열 중 임의의 것, 또는 그의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함하는 항체.
5. 4항의 항체로,
A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 xiv)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되거나:
i) a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
ii) a) 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
iii) a) 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
iv) a) 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
v) a) 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
vi) a) 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
vii) a) 서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
viii) a) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
ix) a) 서열번호 47의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 48의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 49의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
x) a) 서열번호 53의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 54의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
xi) a) 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 54의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
xii) a) 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 60의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
xiii) a) 서열번호 64의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
xiv) a) 서열번호 69의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 70의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 71의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체; 또는
B) A의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR4, CDR5 또는 CDR6 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체
인 항체.
6. 4항 또는 5항의 항체로,
도 2에 나타낸 바와 같은 VL 서열, 바람직하게는 서열번호 248 내지 서열번호 295 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VL 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 248 내지 서열번호 295 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함하는 항체.
7. 1항의 항체로,
O25a 및 O25b 항원에 의해 공유된 에피토프와의 결합에 교차-특이성인 항체.
8. 7항의 항체로,
A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 vii)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되거나:
i) a) 서열번호 72의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 73의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
ii) a) 서열번호 77의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 78의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 79의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
iii) a) 서열번호 81의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 82의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 83의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
iv) a) 서열번호 84의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 85의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 86의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
v) a) 서열번호 77의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 89의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 90의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
vi) a) 서열번호 92의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 93의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 94의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체;
vii) a) 서열번호 95의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
b) 서열번호 96의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
c) 서열번호 97의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
을 포함하는 항체; 또는
B) A의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체
인 항체.
9. 7항 또는 8항의 항체로,
a) 도 2에 나타낸 바와 같은 VH 서열, 바람직하게는 서열번호 232 내지 서열번호 247 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VH 아미노산 서열;
b) 서열번호 232 내지 서열번호 247 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열; 또는
c) 서열번호 232 내지 서열번호 247 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것이고 C-말단 아미노산의 결실 및/또는 상기 VH 서열의 첫 번째 아미노산이 Q인 경우 Q1E 점 돌연변이를 추가로 포함하는 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열
을 포함하는 항체.
10. 7항 내지 9항 중 어느 한 항의 항체로,
표 1에 나열된 바와 같은(카밧의 넘버링 시스템에 따라 표시된다) 또는 표 2에 나열된 바와 같은(IMGT 넘버링 시스템에 따라 표시된다) CDR4 내지 CDR6 서열 중 임의의 것, 또는 그의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함하는 항체.
11. 10항의 항체로,
A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 vi)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되거나:
i) a) 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 76의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
ii) a) 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 80의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
iii) a) 서열번호 69의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 70의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 71의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
iv) a) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 87의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 88의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
v) a) 서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체;
vi) a) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
c) 서열번호 88의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
을 포함하는 항체; 또는
B) A의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR4, CDR5 또는 CDR6 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체
인 항체.
12. 10항 또는 11항의 항체로,
도 2에 나타낸 바와 같은 VL 서열, 바람직하게는 서열번호 296 내지 서열번호 311 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VL 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 296 내지 서열번호 311 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함하는 항체.
13. 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 항체로,
a) 표 1에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 CDR1-CDR6 서열; 또는
b) 도 2에 나타낸 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 VH 및 VL 서열; 또는
c) 도 2에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 HC 및 LC 서열
을 포함하거나; 또는
d) 상기 a) 내지 c)의 서열들을 특징으로 하는 모 항체의 기능 활성 변이체이고, 바람직하게는
i. 상기 기능 활성 변이체가 상기 모 항체의 CDR1 내지 CDR6 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하고/하거나;
ii. 상기 기능 활성 변이체가 상기 모 항체의 VH 및 VL 서열 및/또는 HC 및 LC 서열 중 임의의 것의 프레임워크 영역 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고, 임의로 VH 프레임워크 영역의 첫 번째 아미노산(VH FR1)이 Q인 경우 Q1E 점 돌연변이를 포함하며; 추가로
iii. 상기 기능 활성 변이체가 상기 모 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖고/갖거나;
iv. 상기 기능 활성 변이체가 상기 모 항체의 인간, 인간화된, 키메릭 또는 쥐 및/또는 친화성 성숙된 변이체인
항체.
14. 13항의 항체로,
CDR1-CDR6 중 임의의 것에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하는, 8D5-1G10 또는 8D10-C8 표시된 항체의 기능 활성 유도체이며, 바람직하게는 각각 8D5-1G10 및 8D10-C8로서 표시된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖는 항체.
15. 1항 내지 14항 중 어느 한 항의 항체로,
표 1에 나열된 바와 같은 CDR 서열 중 임의의 것의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하며, 상기 기능 활성 CDR 변이체가
a) 모 CDR 서열 중 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이; 및/또는
b) 상기 모 CDR 서열의 4개의 C-말단 또는 4개의 N-말단, 또는 4개의 중심 아미노산 위치 중 임의의 것에서 1 또는 2개의 점 돌연변이; 및/또는
c) 상기 모 CDR 서열과 적어도 60%의 서열 동일성
중 적어도 하나를 포함하는 항체.
16. 15항의 항체로,
기능 활성 CDR 변이체가 4 또는 5 아미노산 미만으로 이루어지는 임의의 CDR 서열 중에 1 또는 2개의 점 돌연변이를 포함하는 항체.
17. 1항 내지 16항 중 어느 한 항의 항체로,
CDR 및 프레임워크 서열을 포함하며, 상기 CDR 및 프레임워크 서열 중 적어도 하나가 인간, 인간화된, 키메릭, 쥐 또는 친화성 성숙된 서열을 포함하고, 바람직하게는 상기 프레임워크 서열이 IgG 항체의 서열인 항체.
18. 1항 내지 17항 중 어느 한 항의 항체로,
10-6 M 미만, 바람직하게는 10-7 M 미만, 또는 10-8 M 미만의 Kd로 O25b 항원에 결합하는 친화성을 갖는 항체.
19. 1항 내지 18항 중 어느 한 항의 항체로,
이. 콜라이의 O25a 항원에 비해 O25b 항원에 우선적으로 결합하거나, 또는 적어도 상기 두 항원 모두에 대해 동등한 친화성으로 결합하는 항체.
20. 1항 내지 19항 중 어느 한 항의 항체로,
전체-길이 단클론 항체, 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 그의 항체 단편, 또는 상기 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질인 항체.
21. 1항 내지 19항 중 어느 한 항의 항체로,
이. 콜라이 감염의 위험이 있거나 또는 상기 감염을 앓고 있는 피험자에게, 상기 피험자에서 상기 감염을 제한하거나 또는 상기 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 개선시키기에 유효한 양의 상기 항체를 투여함을 포함하는, 상기 피험자의 치료에 사용하기 위한, 바람직하게는 신우신염, 2차 세균혈증, 패혈증, 복막염, 뇌수막염, 및 인공호흡기-관련 폐렴의 치료 또는 예방을 위한 항체.
22. 1항 내지 20항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 바람직하게는 비경구 또는 점막 제형을 포함하는, 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약학 제제.
23. 피험자에서 이. 콜라이 감염 또는 이. 콜라이 균주에 의해 유발된 세균혈증, 예를 들어 상부 및 하부 요로 감염, 예를 들어 특히 당뇨병 환자에서 방광염 또는 요도염, 상행성 신우신염 또는 혈행성 신우신염뿐만 아니라 세균혈증, 패혈증, 복막염, 또는 장 군체형성을 측정하기 위한 진단학적 용도를 위한 1항 내지 20항 중 어느 한 항의 항체.
24. 하기의 성분들을 포함하는, 조성물 또는 부품 키트 중에 1항 내지 20항 중 어느 한 항의 항체 및 추가의 진단학적 시약을 포함하는 진단학적 제제:
a) 상기 항체; 및
b) 상기 추가의 진단학적 시약; 및
c) 임의로 상기 항체 및 진단학적 시약 중 적어도 하나를 고정화시키는 고체상.
25. 피험자에서 이. 콜라이 감염 또는 이. 콜라이 균주에 의해 유발된 세균혈증의 진단 방법으로,
a) 1항 내지 20항 중 어느 한 항에 따른 항체를 제공하고,
b) 상기 항체가 O25b 항원과 특이적으로 면역반응하는 지를, 상기 시험하려는 피험자의 생물학적 샘플 중에서, 바람직하게는 응집반응 시험에 의해 검출함으로써 MDR 이. 콜라이 감염 또는 세균혈증을 진단함
을 포함하는 방법.
26. 1항 내지 20항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
27. a) 1항 내지 20항 중 어느 한 항의 항체의 VH 및/또는 VL; 또는
b) 1항 내지 20항 중 어느 한 항의 항체의 HC 및/또는 LC
를 발현하는 암호화 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 플라스미드.
28. 27항의 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
29. 1항 내지 20항 중 어느 한 항에 따른 항체의 생성 방법으로, 28항에 따른 숙주 세포를 상기 항체를 생성시키는 조건하에서 배양하거나 유지시키는 방법.
상기 개시는 하기의 실시예들을 참조하여 보다 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이와 같은 실시예들은 단지 본 발명의 하나 이상의 실시태양의 실행 방법을 나타내며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.
실시예
실시예 1: O25b -특이성 항체의 생성
전형적인 ST131-O25b:H4 균주 81009의 캡슐화되지 않은 돌연변이체(81009Δkps::kan, [Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett, 2012])를, kps 클러스터(캡슐 합성을 암호화한다)를 가나마이신 내성을 암호화하는 카세트로 치환시킴으로써 생성시켰다. 상기 돌연변이체의 살아있는 또는 포름알데히드-불활성화된 세포의 준치사 용량뿐만 아니라 야생형 모 균주의 준치사 용량을 사용하여 마우스를 2주 간격으로 4회 면역시켰다. 후속으로, 상기 마우스로부터 수득한 혈청 샘플을 분석하고, O25b 항원에 대해 최고의 IgG 역가를 보이는(ELISA, 면역블럿팅 및 표면 염색에서) 상기 마우스의 비장을 하이브리도마 생성에 사용하였다. 서브-클로닝에 이어서, O25b 항원을 발현하는 살아있는 야생형 이. 콜라이 균주의 표면에 결합되었을 뿐만 아니라 정제된 O25b 항원에 특이성인 항체를 분비한 다수의 하이브리도마 클론을 선택하였다. 상기 생성된 마우스 항체는 모든 가능한 쥐 아이소타입, 즉 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3를 포함하였다. O25b-특이성 mAb의 중(VH) 및 경(VL)쇄의 가변 도메인들을 축퇴된 중쇄 및 경쇄 프라이머와 함께 RT-PCR을 사용하여 하이브리도마 클론으로부터 증폭시키고 서열분석하였다. 서열들을 Ig 데이터베이스에 대해 BLAST에 의해서, 및 IMGT/V-QUEST에 의해서 분석하였으며, CDR 영역들을 카밧 명명법에 따라 한정하였다(도 1, 표 1).
선택된 하이브리도마 클론을 키메릭 mAb로서 발현시켰다(즉 상기 마우스 가변 영역을 인간 IgG1 불변 도메인뿐만 아니라 카파 경쇄에 융합시켰다). 더욱이, 인간화된 mAb를, 고가변(CDR) 마우스 서열을 인간 프레임워크 서열(원래의 마우스 프레임워크에 가장 적합한 것으로 인실리코 예견되었다)에 그래프트화함으로써 생성시켰다. 상기 키메릭 및 인간화된 mAb를 포유동물 세포에 의해 발현시키고, 단백질 A 컬럼을 통해 정제시키고, 후속의 실시예들에 나타낸 분석에 사용하였다(하기 참조).
실시예 2: 결합 특징
키메릭 및 인간화된 mAb의 특이성을 정제된 LPS를 사용하여 면역블럿 분석에 의해 확인하였다(도 3). 모든 mAb는 상기 O25b 항원을 함유하는 ST131 균주로부터 LPS 분자를 인식하였으나, O25a LPS 항원에 대한 교차-반응성 잠재성은 상이하였다. 일부 mAb는 O25b 항원에 독점적으로 반응하였지만, 다른 것들(계통 4D5로부터 - 도 4ii; 중간 패널)은 O25a에 교차-반응성이었다. 상기 mAb 중 어느 것도, 관련되지 않은 O-항원(예를 들어 O55)을 갖는 LPS 분자에 반응하지 않았다. 항체 결합 특징을 생물층 간섭측정법(BLI)에 의해 추가 조사하였다. 비오틴화된 O25b 폴리사카라이드에 대한 상기 O25b mAb(키메릭 및 인간화된)의 결합을, 상기 비오틴화된 항원을 스트렙트아비딘 센서(포르테바이오, 폴 라이프 사이언시즈(Pall Life Sciences)상에 고정화시키고, 1% BSA를 함유하는 PBS 중에서 10분 동안 상기 프리로딩된 센서에 대한 상기 mAb(8 내지 10 ㎍/㎖)의 결합에 이어서 동일한 완충액 중의 해리(5분)를 모니터함으로써 수행하였다. Kd, kon 및 koff 값을 데이터 어낼리시스(Data Analysis) 7 소프트웨어(포르테바이오, 폴 라이프 사이언시즈)를 사용하여 측정하였다. 조사된 모든 mAb는 상기 셋업에서 9.5 내지 211 nM의 강한 결합 친화성을 나타내었다(도 4).
상기 세균 표면상의 고유 항원에 대한 mAb의 결합을 유식 세포측정에 의해 시험하였다. 다수의 상이한 임상 단리물에 결합된 모든 항체는 ST131-O25b:H4 균주인 것으로 측정되었다. 상기 O25a 항원을 발현하는 균주에의 결합에 관하여, 2가지 유형의 mAb가 확인되었다. 하나의 그룹은 O25a 균주의 표면에 결합하지 않은 반면, 다른 그룹의 mAb는 관련된 O25a 균주를 발현하는 균주에 교차-반응성이었다. 그러나, 상기 mAb 중 어느 것도, 관련되지 않은 항원 O-형을 발현하는 임의의 이. 콜라이 균주에 결합할 수 없었다(도 5i). 유식 세포측정(도 5i) 및 면역블럿팅(도 3)에 의해 나타난 교차-반응성간에 양호한 상관성이 존재하였다.
표면 결합을 보다 상세히 조사하기 위해서, ST131 균주 3O(Novais A. et al, Antimicrob Agents Chemother 2012 56(5):2763-6)를 LB(즉 통상적인 실험용 생육 배지) 또는 불활성화된 인간 혈청(생체내 같은 생육 조건을 모방하기 위해서) 중에서 중간 대수 증식기까지 배양하고 세척에 이어서 0.025 내지 40 ㎍/㎖의 희석 범위로 정제된 O25b-반응성 mAb로 염색하였다. 세척에 이어서 알렉사(Alexa) 488 표지된 항-인간 IgG를 4 ㎍/㎖의 농도로 적용하고 형광 강도를 유식 세포측정(BD 애큐리(Accuri) C6 유식 세포계)에 의해 측정하였다. 도 5ii) A에 나타낸 전형적인 실험은 시험된 모든 mAb가 용량 의존적인 방식으로 상기 조사된 균주의 표면에 결합할 수 있음을 입증하였다. 상기 결합 강도는 혈청(대 LB)에서 세균 생육시 다소 감소하였으나, 시험된 모든 mAb에 대해서 매우 뚜렷이 남아있었다(도 5ii) B). 표면 결합이 ST131-O25b 균주내의 유전적 차이와 관련 없음을 입증하기 위해서, 상이한 풀소유형을 포함하는 ST131 균주의 잘-특성화된 패널을 조사하였다(Peirano et al, Antimicrob. Agents Chemother. 2014, 58(7):3762). 도 5ii) C에 요약된 데이터는, 실제로 ST131:O16 계통에 속하는 것으로 보고된 풀소유형 'O'를 제외하고, 조사된 3개의 mAb가 모두 모든 전형적인 균주의 표면을 강하게 염색함을 입증하였다. 따라서, 유식 세포측정 실험은 상기 ST131:O25b 계통 전체를 통해 광범위한 결합 스펙트럼을 입증할 수 있었으며 상기 결합은 세균을 인간 혈청 중에서(즉 생체내-같은 조건하에서) 생육시켰을 때 유지되었다.
실시예 3: O25b 특이성 mAb의 항균 효과
선택된 O25b-특이성 키메릭 mAb 및 인간화된 mAb(O25a에 대한 교차-반응성이 있거나 없는)의 잠재적인 보호 효과를 치명적인 쥐 세균혈증 모델에서 시험하였다. 5마리 마우스의 그룹에게 PBS 중의 정제된 mAb 100 ㎍을 복강내로 제공하였다. 24시간 후에 마우스를, O25b 항원을 발현하는 이. 콜라이 균주 ST131 81009(Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett 2012;332:131-6)의 치사 용량(앞서 파일럿 실험에서 측정됨)으로 정맥내 접종하였다. 24시간 후에 마우스를, O25b 항원을 발현하는 것으로 입증된 이. 콜라이 균주 ST131 81009(Szijarto et al, FEMS Microbiol Lett 2012;332:131-6)의 치사 용량(앞서 파일럿 실험에서 측정된 바와 같이 108 CFU)으로 정맥내 접종하였다. 마우스의 치사율을 매일 모니터하였다. 도 6i)는 100 ㎍의 관련없는 특이성을 갖는 대조용 mAb로 면역시킨 마우스의 100%가 감염으로 죽은 반면, 시험된 모든 O25b 특이성 mAb는 모니터된 14일의 감염-후 기간 동안 통계학적으로(로그순위 시험) 의미있는 생존의 증가를 제공하였음을 보인다.
상기 생체내 데이터를 확인하기 위해서, 정제된 mAb의 살균 효과를 또한 시험관내에서 시험하였다. 세균을 루리아 베르타니(LB) 브로쓰 또는 열 불활성화된 통상적인 인간 혈청에서 중간 대수 증식기로 배양하였다. 2 ㎖의 세균 배양물을 PBS 중에서 2회 세척하였다. 혈청 살균 분석(SBA)을 칼슘 및 마그네슘이 보충된 DPBS로 희석된 50% 고갈된 인간 혈청 풀에서 수행하였다. 반응 혼합물은 각각 LB- 또는 혈청 중간 대수기 증식된 세균 현탁액 및 2.5 또는 10 ㎍/㎖의 mAb로부터 약 5x103 CFU를 함유하였다. 항체가 없는 및 아이소타입 합치된 관련되지 않은 mAb를 갖는 혼합물을 대조용으로서 포함하였다. 세균을 410 RPM에서 진탕하면서 37 ℃에서 3시간(LB-증식된 세균의 경우) 또는 5시간(혈청-증식된 세균의 경우) 배양 후에 적합한 희석액을 도말하여 수를 세었다. 특이성 mAb에 의해 매개된 살해를 접종물(출발 CFU)에 대한 퍼센트로서(도 7i) 또는 하기로서 나타내었다:
살해(%) = 100 - [CFU(mAb)/CFU(항체 없이) x 100](도 7ii).
도 7i)에 묘사된 바와 같이, 시험된 모든 mAb는 3시간의 연구 기간에 걸쳐 CFU를 유의수준으로 감소시킬 수 있었다. 대조적으로, 관련없는 mAb와 함께 또는 항체 없이 혼합된 세균은 상기 배지에서 생육을 나타내었다. 보체가 혈청 샘플 중에서 불활성화된 경우에(56 ℃에서 30분까지 배양), 어떠한 mAb에 의해서도 세균 살해가 관찰되지 않았다(데이터 도시 안 됨). 이러한 결과는 O25b-특이성 mAb(O25a에 대한 교차-반응성이 있거나 없는)가 보체 매개된 살균 효과를 촉발할 수 있음을 입증한다.
추가의 실험이 상기 활성을 입증하였다(도 7ii). 아이소타입-합치된 관련없는 mAb는 살균 활성을 이끌어낼 수 없었지만, 항-O25b mAb는 모두 시험된 ST131-O25b 균주 모두에 대해 3시간의 연구 기간에 걸쳐 CFU를 의미있게 감소시킬 수 있었다(도 7iiA, B 및 D). 보체가 혈청 샘플 중에서 불활성화된 경우에(56 ℃에서 30분까지 배양), 어떠한 mAb에 의해서도 세균 살해가 관찰되지 않았다(데이터 도시 안 됨). 이러한 결과는 O25b-특이성 mAb(O25a에 대한 교차-반응성이 있거나 없는)가 보체 매개된 살균 효과를 촉발할 수 있음을 입증한다. 이러한 작용 방식이 상기 관찰된 생체내 보호(상기 참조)에 관련될 수 있음을 입증하기 위해서, 우리는 동일한 분석을 인간 혈청(세균 배양 배지, 즉 LB와 대조적으로)에서 생육된 세균을 사용하여 수행하였다. "생체내-같은" 조건하에서 세균을 생육시키는 중요성은 세균의 표면 및 따라서 항원의 접근성이 표면 세균 성분의 발현적 재정렬로 인해 상이한 조건에서 생육시 매우 상이할 수 있다는 것이다(Miajlovic H et al., Infect. Immun. 82:298-305, 2014). 도 7iiC상에 묘사된 바와 같이, O25b-특이성 인간화된 mAb는 인간 혈청에서 세균의 사전-컨디셔닝(즉 생육) 후에조차 현저한 세균 살해를 이끌어낼 수 있었다. 그러나, 최대의 살균 효과를 위해서는 보다 높은 mAb 용량(10 ㎍/㎖)뿐만 아니라 보다 긴 배양 시간(5시간)이 필요하였다.
실시예 4. O25b 특이성 mAb의 내독소 중화 잠재성
LPS는 내독성 잠재성을 갖기 때문에, 우리는 상기 LPS 분자내 O25b 항원에 결합하는 mAb의 잠재적인 중화 능력을 시험하는 것이 중요하다고 생각하였다.
마우스는 유전적으로 인간보다 내독소에 더 내성이나, 간독성 탄수화물 D-GalN의 투여에 의해 소량의 정제된 LPS에 대해서 민감성으로 될 수 있다(Galanos C et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 76:5939-5943, 1979). 마우스를, 20 ㎎/마우스 D-GalN에 의한 i.p. 감작화 및 치사 용량(1 ng)의 정제된 O25b LPS에 의한 i.v. 접종을 동시 적용하기 24시간 전에 100 또는 25 ㎍의 mAb로 예방학적으로 면역시켰다. 도 8은 치명적인 내독소혈증에 대해 현저하고 용량 의존적인 보호를 나타내는 인간화된 mAb에 대한 전형적인 실험을 도시한다.
상기 작용 방식을 보다 더 설명하기 위해서, 인간화된 O25b 특이성 mAb를 시험관내 중화 분석에서 조사하였다. LPS는 생체내에서 패혈성 쇼크를 이끌어내는 원인이 되는 톨형 수용체-4(TLR-4)/MD2 수용체 복합체를 통해 신호를 전달한다. 상기 TLR-4 복합체를 통한 LPS 신호전달의 중화를 평가하기 위해서, 우리는 상업적인 HEK-블루 시스템(인비보젠(InvivoGen))을 사용하였다. 상기 분석은 상기 인간 TLR-4 복합체를 발현하도록 형질전환된 HEK 세포를 사용한다. 상기 수용체를 통한 신호전달은 효소의 분비를 유도하며, 이를 색소생산성 기질을 통해 정량분석한다. 도 9A는 정제된 O25b LPS가 상기 분석에서 용량 의존적인 활성을 가짐을 도시한다. 중화 mAb는 표준 농도의 내독소에 의해 유도된 신호를 용량 의존적인 방식으로 억제할 수 있다(도 9B). IC50 값(최대 효과의 50%를 중화시키는 mAb의 농도)은 다양한 mAb의 중화 잠재성을 비교할 수 있게 한다. 도 9C는 전형적인 인간화된 O25b-반응성 mAb의 중화 효능을 요약한다.
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Claims (25)

  1. 표 1(카밧의 넘버링 시스템에 따라 표시된다) 또는 표 2(IMGT 넘버링 시스템에 따라 표시된다)에 나열된 바와 같은 CDR1 내지 CDR3 서열 중 임의의 것, 또는 그의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 적어도 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 이. 콜라이 균주의 O25b 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 하기의 A) 또는 B)인 항체:
    A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 xiv)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 항체:
    i) a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    ii) a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    iii) a) 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    iv) a) 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    v) a) 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    vi) a) 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    vii) a) 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 35의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    viii) a) 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    ix) a) 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    x) a) 서열번호 50의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 52의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    xi) a) 서열번호 50의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 55의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 56의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    xii) a) 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 58의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 59의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    xiii) a) 서열번호 61의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 62의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 63의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    xiv) a) 서열번호 66의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 67의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 68의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체; 또는
    B) A)의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 도 2에 나타낸 바와 같은 VH 서열, 바람직하게는 서열번호 184 내지 서열번호 231 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VH 아미노산 서열;
    b) 서열번호 184 내지 서열번호 231 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열; 또는
    c) 서열번호 184 내지 서열번호 231 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것이고 C-말단 아미노산의 결실 및/또는 상기 VH 서열의 첫 번째 아미노산이 Q인 경우 Q1E 점 돌연변이를 추가로 포함하는 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열
    을 포함하는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    표 1(카밧의 넘버링 시스템에 따라 표시된다) 또는 표 2(IMGT 넘버링 시스템에 따라 표시된다)에 나열된 바와 같은 CDR4 내지 CDR6 서열 중 임의의 것, 또는 그의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함하는 항체.
  5. 제4항에 있어서, 하기의 A) 또는 B)인 항체:
    A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 xiv)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 항체:
    i) a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    ii) a) 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    iii) a) 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    iv) a) 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 22의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    v) a) 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    vi) a) 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    vii) a) 서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    viii) a) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    ix) a) 서열번호 47의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 48의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 49의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    x) a) 서열번호 53의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 54의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    xi) a) 서열번호 57의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 54의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    xii) a) 서열번호 26의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 60의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    xiii) a) 서열번호 64의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 65의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 38의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    xiv) a) 서열번호 69의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 70의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 71의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체; 또는
    B) A)의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR4, CDR5 또는 CDR6 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    도 2에 나타낸 바와 같은 VL 서열, 바람직하게는 서열번호 248 내지 서열번호 295 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VL 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 248 내지 서열번호 295 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  7. 제1항에 있어서,
    O25a 및 O25b 항원에 의해 공유된 에피토프와의 결합에 교차-특이성인, 특히 이. 콜라이의 O25a 항원에 비해 O25b 항원에 우선적으로 결합하거나, 상기 두 항원 모두에 대해 적어도 동등한 친화성으로 결합하는 항체.
  8. 제7항에 있어서, 하기의 A) 또는 B)인 항체:
    A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 vii)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 항체:
    i) a) 서열번호 72의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 73의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 74의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    ii) a) 서열번호 77의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 78의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 79의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    iii) a) 서열번호 81의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 82의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 83의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    iv) a) 서열번호 84의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 85의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 86의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    v) a) 서열번호 77의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 89의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 90의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    vi) a) 서열번호 92의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 93의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 94의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체;
    vii) a) 서열번호 95의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1; 및
    b) 서열번호 96의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2; 및
    c) 서열번호 97의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3
    을 포함하는 항체; 또는
    B) A)의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    a) 도 2에 나타낸 바와 같은 VH 서열, 바람직하게는 서열번호 232 내지 서열번호 247 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VH 아미노산 서열;
    b) 서열번호 232 내지 서열번호 247 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것인 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열; 또는
    c) 서열번호 232 내지 서열번호 247 중 임의의 것 또는 서열번호 312 내지 서열번호 315 중 임의의 것이고 C-말단 아미노산의 결실 및/또는 상기 VH 서열의 첫 번째 아미노산이 Q인 경우 Q1E 점 돌연변이를 추가로 포함하는 항체 중쇄(HC) 아미노산 서열
    을 포함하는 항체.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    표 1(카밧의 넘버링 시스템에 따라 표시된다) 또는 표 2(IMGT 넘버링 시스템에 따라 표시된다)에 나열된 바와 같은 CDR4 내지 CDR6 서열 중 임의의 것, 또는 그의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함하는 항체.
  11. 제10항에 있어서, 하기의 A) 또는 B)인 항체:
    A) 하기의 그룹 구성원 i) 내지 vi)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 항체:
    i) a) 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 76의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    ii) a) 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 80의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    iii) a) 서열번호 69의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 70의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 71의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    iv) a) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 87의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 88의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    v) a) 서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체;
    vi) a) 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR4; 및
    b) 서열번호 32의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR5; 및
    c) 서열번호 88의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR6
    을 포함하는 항체; 또는
    B) A)의 그룹 구성원들 중 임의의 것인 모 항체의 CDR4, CDR5 또는 CDR6 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하는, 상기 모 항체의 기능 활성 변이체인 항체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    도 2에 나타낸 바와 같은 VL 서열, 바람직하게는 서열번호 296 내지 서열번호 311 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VL 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 296 내지 서열번호 311 중 임의의 것 또는 서열번호 316 내지 서열번호 319 중 임의의 것인 항체 경쇄(LC) 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 표 1에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 CDR1-CDR6 서열; 또는
    b) 도 2에 나타낸 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 VH 및 VL 서열; 또는
    c) 도 2에 나열된 바와 같은 항체들 중 임의의 것의 HC 및 LC 서열
    을 포함하거나; 또는
    d) 상기 a) 내지 c)의 서열들을 특징으로 하는 모 항체의 기능 활성 변이체이고, 바람직하게는
    i. 상기 기능 활성 변이체가 상기 모 항체의 CDR1 내지 CDR6 중 임의의 것의 적어도 하나의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하고/하거나;
    ii. 상기 기능 활성 변이체가 상기 모 항체의 VH 및 VL 서열 및/또는 HC 및 LC 서열 중 임의의 것의 프레임워크 영역 중에 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고, 임의로 VH 프레임워크 영역의 첫 번째 아미노산(VH FR1)이 Q인 경우 Q1E 점 돌연변이를 포함하며; 추가로
    iii. 상기 기능 활성 변이체가 상기 모 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖고/갖거나;
    iv. 상기 기능 활성 변이체가 상기 모 항체의 인간, 인간화된, 키메릭 또는 쥐 및/또는 친화성 성숙된 변이체인
    항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    표 1에 나열된 바와 같은 CDR 서열 중 임의의 것의 기능 활성 CDR 변이체를 포함하며, 상기 기능 활성 CDR 변이체가
    a) 모 CDR 서열 중 1, 2 또는 3개의 점 돌연변이; 및/또는
    b) 상기 모 CDR 서열의 4개의 C-말단 또는 4개의 N-말단, 또는 4개의 중심 아미노산 위치 중 임의의 것에서 1 또는 2개의 점 돌연변이; 및/또는
    c) 상기 모 CDR 서열과 적어도 60%의 서열 동일성
    중 적어도 하나를 포함하고;
    바람직하게는 상기 기능적 활성 CDR 변이체가 4 또는 5개 미만의 아미노산으로 이루어지는 임의의 CDR 서열 중에 1 또는 2개의 점 돌연변이를 포함하는 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    CDR 및 프레임워크 서열을 포함하며, 상기 CDR 및 프레임워크 서열 중 적어도 하나가 인간, 인간화된, 키메릭, 쥐 또는 친화성 성숙된 서열을 포함하고, 바람직하게는 전체-길이 단클론 항체, 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 그의 항체 단편, 또는 항원 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 항체 도메인을 포함하는 융합 단백질인 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    10-6 M 미만, 바람직하게는 10-7 M 미만, 또는 10-8 M 미만의 Kd로 O25b 항원에 결합하는 친화성을 갖는 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    이. 콜라이 감염의 위험이 있거나 또는 상기 감염을 앓고 있는 피험자에게, 상기 피험자에서 상기 감염을 제한하거나 또는 상기 감염으로부터 초래되는 질병 상태를 개선시키기에 유효한 양의 항체를 투여함을 포함하는, 상기 피험자의 치료에 사용하기 위한, 바람직하게는 신우신염, 2차 세균혈증, 패혈증, 복막염, 뇌수막염, 및 인공호흡기-관련 폐렴의 치료 또는 예방을 위한 항체.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 바람직하게는 비경구 또는 점막 제형을 포함하는, 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약학 제제.
  19. 피험자에서 이. 콜라이 감염 또는 이. 콜라이 균주에 의해 유발된 세균혈증, 예를 들어 상부 및 하부 요로 감염, 예를 들어, 특히 당뇨병 환자에서, 방광염 또는 요도염, 상행성 신우신염 또는 혈행성 신우신염뿐만 아니라 세균혈증, 패혈증, 복막염, 또는 장 군체형성을 진단학적으로 측정하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체의 용도.
  20. 하기의 성분들을 포함하는, 조성물 또는 부품 키트 중에 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 및 추가의 진단학적 시약을 포함하는 진단학적 제제:
    a) 상기 항체; 및
    b) 상기 추가의 진단학적 시약; 및
    c) 임의로 상기 항체 및 진단학적 시약 중 적어도 하나를 고정화시키는 고체상.
  21. 피험자에서 이. 콜라이 감염 또는 이. 콜라이 균주에 의해 유발된 세균혈증의 진단 방법으로,
    a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체를 제공하고,
    b) 상기 항체가 시험하려는 피험자의 생물학적 샘플 중의 O25b 항원과 특이적으로 면역반응하는 지를, 바람직하게는 응집반응 시험에 의해 검출함으로써 MDR 이. 콜라이 감염 또는 세균혈증을 진단함을 포함하는 방법.
  22. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
  23. a) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체의 VH 및/또는 VL; 또는
    b) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체의 HC 및/또는 LC
    를 발현하는 암호화 서열을 포함하는 발현 카세트 또는 플라스미드.
  24. 제23항의 발현 카세트 또는 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
  25. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 항체의 생성 방법으로, 제24항에 따른 숙주 세포를 상기 항체를 생성시키는 조건하에서 배양하거나 유지시키는 방법.
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