KR20160117212A - 광감각제를 함유하는 세포, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 빛에 의해 일항산소를 생성할 수 있는 광감작제를 함유하는 세포, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대식세포 또는 간엽줄기세포에 광감각제들을 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화와 같은 방법에 의해 접합시키거나 또는 세포 내부에 봉입시킨 광감각제를 함유하는 세포를 제공하며, 상기 광감각제를 함유하는 세포는 정맥 주사 시 암 부위에 축적되며 특정 파장의 광원을 조사 시 대식세포 또는 간엽줄기세포가 사멸하면서 국소적인 면역반응을 촉진시켜 암세포를 사멸시킬 수 있어 암 면역치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 빛에 의해 일항산소를 생성할 수 있는 광감작제를 함유하는 세포, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대식세포 또는 간엽줄기세포에 광감각제들을 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화와 같은 방법에 의해 접합시키거나 또는 세포 내부에 봉입시킨 광감각제를 함유하는 대식세포 또는 간엽줄기세포를 제공하며, 상기 광감각제를 함유하는 세포는 정맥 주사 시 암 부위에 축적되며 특정 파장의 광원을 조사 시 대식세포 또는 간엽줄기세포가 사멸하면서 국소적인 면역반응을 촉진시켜 암세포를 사멸시킬 수 있어 암 면역치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
현재 임상학적으로 사용되고 있는 암의 3대 치료 방법은 수술, 방사선 요법, 및 화학요법 등으로 암의 성질에 따라 단독 또는 복합적으로 사용되고 있으나 아직 이러한 치료방법에 의해 암을 완치하지 못하고 환자에게 심한 부작용과 고통을 수반하고 있는 실정이다. 최근 면역학적 방법에 의하여 암을 치료하려는 새로운 시도가 주로 동물 실험을 통해 활발히 진행되고 있는데 이를 총칭하여 암백신 또는 면역학적 치료법(cancer immunotherapy)이라 한다. 암의 면역학적 치료법은 기존의 바이러스 및 박테리아 백신과 유사하게 특정 암 항원에 대한 면역반응 특히 암특이 killer T 세포를 유도하여 암세포를 제거하는 것으로 최근 암 치료의 4대 요법으로 자리 잡아 가고 있다.
면역학적 암 치료 방법은 암 특이 killer T 세포를 유도시켜 이들로 하여금 암세포를 공격하여 제거하는 기술로 수술 등에 의해 제거할 수 없는 micro-metastasis된 암세포들도 찾아가서 제거하는 것과 암세포 선택적인 치료를 통해 다른 조직에 대한 부작용을 주지 않는다는 장점이 있다. 또한, 기억 CD8+ T 세포는 수년에서 수십 년까지 생체 내에서 살 수 있어 기억 세포를 유도해 놓으면 완치의 가능성 뿐 아니라 재발 억제의 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.
하지만, 지금까지 암의 면역 치료법은 종양 세포 자체가 면역 억제 사이토카인을 분비하거나 종양세포를 공격하는 림프구를 죽이는 방법 또는 종양세포를 인지할 때 사용되는 분자들의 발현을 종양세포 자신이 낮추거나 세포 내로 감추어 면역반응을 회피한다는 단점이 있어 현재 임상적용시 뛰어난 효과를 나타내지 못하고 있다.
본 발명의 목적은 정맥내 투여 시 종양 부위를 스스로 찾아가는 능력을 가지는 대식세포나 간엽줄기세포에 광감각제를 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화와 같은 방법에 의해 접합시키거나 또는 세포 내부에 봉입시킨 광감각제를 함유하는 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 광감각제를 함유하는 세포가 암 부위에 축적되고 종양 부위에 광원 조사시 대식세포 또는 간엽줄기세포가 사멸하면서 사이토카인을 생성하여 killer T세포를 종양 부위로 불러들여 암 치료를 할 수 있는 암 면역치료제를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 광감각제를 함유하는 세포를 제공한다.
보다 상세하게는, 본 발명은 광감각제가 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화 중 어느 하나의 방법으로 세포와 결합하거나 세포 내 봉입된, 광감각제를 함유하는 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 광감각제가 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화 중 어느 하나의 방법으로 세포와 결합하거나 세포 내 봉입된, 광감각제를 함유하는 세포 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 광감각제를 함유하는 세포를 유효성분으로 포함하는 암 면역치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 광감각제를 함유하는 세포는 정맥 주사 시 종양 부위를 스스로 찾아가는 능력을 가지는 대식세포 또는 간엽줄기세포에 의해 암 부위에 축적되며 특정 파장의 광원을 조사 시 광감각제가 생성하는 일항산소에 의해 간엽줄기세포를 사멸시키며 일항산소에 의해 사멸되는 세포가 IL-6, IL-8, 열충격단백질 70(hsp 70)과 같은 사이토카인을 생성함으로써 국소적인 면역반응을 촉진시켜 암세포를 사멸시킬 수 있어 암 면역치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-PheoA의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 2은 본 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-PPIX의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 4은 본 발명의 일실시예에 따른 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포 표면에 아자이드(azide) 부여 여부를 공초점 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 5은 본 발명의 일실시예에 따른 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포와 DBCO-PEG-PheoA의 접합 여부를 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포와 DBCO-PEG-PheoA의 접합 효율에 대한 유세포분석 결과를 나타내는 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 사전 활성화된 PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 9은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포와 사전 활성화된 PEG-Ce6의 접합 여부를 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 PEG-Hpp의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포와 CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp, CD105-PEG-Hpp의 접합 여부를 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포에 내재화된 Hpp의 양을 형광분광광도계로 측정하여 나타내는 것이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포에 내재화된 광감각제의 시간에 따른 양 변화를 유세포분석기로 측정하여 나타내는 것이다.
도 14는 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-PheoA를 함유하는 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 15는 발명의 일실시예에 따른 사전 활성화된 PEG-Ce6를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 16은 발명의 일실시예에 따른 CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp, CD105-PEG-Hpp를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 17은 발명의 일실시예에 따른 Hpp를 내재화하는 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 18은 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-PheoA를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 사멸과정 중 생성하는 cytokine을 나타내는 것이다.
도 19는 발명의 일실시예에 따른 사전 활성화된 PEG-Ce6를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 사멸과정 중 생성하는 cytokine을 나타내는 것이다.
도 20은 발명의 일실시예에 따른 CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp, CD105-PEG-Hpp를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 사멸과정 중 생성하는 cytokine을 나타내는 것이다.
도 21은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 암세포에 대한 광역학치료 효과를 나타내는 것이다.
도 22는 본 발명의 일실시예에 따른 암 동물모델(Balb/c nude mice)에서 광감각제를 함유하는 나노입자, 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포가 암부위에 축적되는 것을 형광 영상 장치 사진으로 나타내는 것이다.
도 23은 본 발명의 일실시예에 따른 암 동물모델(Balb/c nude mice)에서 광감각제를 함유하는 나노입자, 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포의 주사 후 장기별 분포를 형광 영상 장치 사진으로 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일실시예에 따른 암 동물모델(Balb/c nude mice)에서 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 주사 후 암 조직에 존재하는 인간 간엽줄기세포를 항체로 염색하여 공초점 형광현미경으로 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일실시예에 따른 다양한 개체수의 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하여 암과 비장조직에서의 면역인자변화를 ELISA 방법으로 나타내는 것이다.
도 26은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하고 레이저 조사유무에 따른 암과 비장조직에서의 면역인자변화를 ELISA 방법으로 나타내는 것이다.
도 27은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하고 광원 부여 시 나타나는 암 치료효과를 나타내는 것이다. 화살표는 레이저 조사 시기를 나타내는 것이다.
도 28은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c nude mice)에 주사하고 광원 부여 시 나타나는 암 치료효과를 나타내는 것이다. 화살표는 레이저 조사 시기를 나타내는 것이다.
도 29는 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(CB17 SCID mice)에 주사하고 광원 부여 시 나타나는 암 치료효과를 나타내는 것이다. 화살표는 레이저 조사 시기를 나타내는 것이다.
도 30은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하고 광원 부여시 나타나는 암 치료효과를 암 크기변화 사진과 암 조직염색법을 통해 나타내는 것이다.
도 31은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c nude mice)에 주사하고 광원 부여시 나타나는 암 치료효과를 암 크기변화 사진과 암 조직염색법을 통해 나타내는 것이다.
도 32는 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(CB17 SCID mice)에 주사하고 광원 부여시 나타나는 암 치료효과를 암 크기변화 사진과 암 조직염색법을 통해 나타내는 것이다.
도 2은 본 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-PPIX의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 4은 본 발명의 일실시예에 따른 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포 표면에 아자이드(azide) 부여 여부를 공초점 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 5은 본 발명의 일실시예에 따른 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포와 DBCO-PEG-PheoA의 접합 여부를 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포와 DBCO-PEG-PheoA의 접합 효율에 대한 유세포분석 결과를 나타내는 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 사전 활성화된 PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 9은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포와 사전 활성화된 PEG-Ce6의 접합 여부를 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 PEG-Hpp의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포와 CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp, CD105-PEG-Hpp의 접합 여부를 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포에 내재화된 Hpp의 양을 형광분광광도계로 측정하여 나타내는 것이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포에 내재화된 광감각제의 시간에 따른 양 변화를 유세포분석기로 측정하여 나타내는 것이다.
도 14는 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-PheoA를 함유하는 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 15는 발명의 일실시예에 따른 사전 활성화된 PEG-Ce6를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 16은 발명의 일실시예에 따른 CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp, CD105-PEG-Hpp를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 17은 발명의 일실시예에 따른 Hpp를 내재화하는 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 18은 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-PheoA를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 사멸과정 중 생성하는 cytokine을 나타내는 것이다.
도 19는 발명의 일실시예에 따른 사전 활성화된 PEG-Ce6를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 사멸과정 중 생성하는 cytokine을 나타내는 것이다.
도 20은 발명의 일실시예에 따른 CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp, CD105-PEG-Hpp를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 사멸과정 중 생성하는 cytokine을 나타내는 것이다.
도 21은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 암세포에 대한 광역학치료 효과를 나타내는 것이다.
도 22는 본 발명의 일실시예에 따른 암 동물모델(Balb/c nude mice)에서 광감각제를 함유하는 나노입자, 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포가 암부위에 축적되는 것을 형광 영상 장치 사진으로 나타내는 것이다.
도 23은 본 발명의 일실시예에 따른 암 동물모델(Balb/c nude mice)에서 광감각제를 함유하는 나노입자, 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포의 주사 후 장기별 분포를 형광 영상 장치 사진으로 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일실시예에 따른 암 동물모델(Balb/c nude mice)에서 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 주사 후 암 조직에 존재하는 인간 간엽줄기세포를 항체로 염색하여 공초점 형광현미경으로 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일실시예에 따른 다양한 개체수의 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하여 암과 비장조직에서의 면역인자변화를 ELISA 방법으로 나타내는 것이다.
도 26은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하고 레이저 조사유무에 따른 암과 비장조직에서의 면역인자변화를 ELISA 방법으로 나타내는 것이다.
도 27은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하고 광원 부여 시 나타나는 암 치료효과를 나타내는 것이다. 화살표는 레이저 조사 시기를 나타내는 것이다.
도 28은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c nude mice)에 주사하고 광원 부여 시 나타나는 암 치료효과를 나타내는 것이다. 화살표는 레이저 조사 시기를 나타내는 것이다.
도 29는 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(CB17 SCID mice)에 주사하고 광원 부여 시 나타나는 암 치료효과를 나타내는 것이다. 화살표는 레이저 조사 시기를 나타내는 것이다.
도 30은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하고 광원 부여시 나타나는 암 치료효과를 암 크기변화 사진과 암 조직염색법을 통해 나타내는 것이다.
도 31은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c nude mice)에 주사하고 광원 부여시 나타나는 암 치료효과를 암 크기변화 사진과 암 조직염색법을 통해 나타내는 것이다.
도 32는 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(CB17 SCID mice)에 주사하고 광원 부여시 나타나는 암 치료효과를 암 크기변화 사진과 암 조직염색법을 통해 나타내는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 종양치료를 위해 종양 부위를 스스로 찾아가는 능력을 가지는 대식세포 또는 간엽줄기세포를 기반으로 대식세포 또는 간엽줄기세포에 광감각제를 함유시키고 빛을 부여해주면 광감각제가 생성하는 일항산소에 의해 대식세포 또는 간엽줄기세포를 사멸시키며 일항산소에 의해 사멸되는 세포가 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 열충격 단백질 70(hsp 70)과 같은 사이토카인을 생성하여 암 면역치료제로서 활용할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성한 것이다.
이에, 본 발명은 광감각제를 함유하는 세포를 제공한다.
상기 세포는 대식세포 또는 간엽줄기세포일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 광감각제는 빛에 의해 일항산소를 생성하며, 일례로서 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phthalocyanines) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminolevuline esters) 화합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 상세하게는 친수성 물질과 접합을 통해 용해도를 증가시킬 수 있는 카르복실기를 갖는 페오포르바이드(pheophorbide a), 클로린(chlorin e6) 및 포르피린(protoporphyrin IX)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
[화학식 1]
본 발명에 따른 광감각제를 함유하는 세포는 광감각제가 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화 중 어느 하나의 방법으로 대식세포 또는 간엽줄기세포와 결합하거나 대식세포 또는 간엽줄기세포 내 봉입될 수 있다.
상기 화학적 결합 또는 항원-항체 결합 중 어느 하나의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함할 수 있다.
상기 폴리에틸렌글리콜은 1차 아민기(-NH2), 하이드록시기(-OH) 및 카르복실기(-COOH)로 이루어진 군에서 선택된 동종 또는 이종의 관능기를 둘 이상 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 2개의 1차 아민기(-NH2)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 2개의 하이드록실기(-OH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 1개의 1차 아민기(-NH2)와 1개의 카르복실기(-COOH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 1개의 카르복실기(-COOH)와 1개의 하이드록실기(-OH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 및 1개의 하이드록실기(-OH)와 1개의 아민기(-NH2)를 갖는 폴리에틸렌글리콜;로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 상기 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 유연하게 조절이 가능하며, 일례로서 중량평균분자량(Mw)이 2,000 내지 10,000일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화학적 결합의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 대식세포 또는 간엽줄기세포가 광감각제 및 폴리에틸렌글리콜이 결합된 접합체와 결합하며, N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화된 접합체가 대식세포 또는 간엽줄기세포 표면에 존재하는 아민기와 아마이드 결합을 통해 결합할 수 있다.
상기 화학적 결합의 방법으로 광감각제를 포함하는 세포는 디벤조사이클로옥텐을 더 포함할 수 있으며, 상기 디벤조사이클로옥텐은 1차 아민기(-NH2) 또는 카르복실기(-COOH) 중 어느 하나의 관능기를 포함할 수 있다.
상기 광감각제를 함유하는 세포는 대식세포 또는 간엽줄기세포가 광감각제, 폴리에틸렌글리콜 및 디벤조사이클로옥텐이 결합된 접합체와 결합하며, 대식세포 또는 간엽줄기세포 표면에 존재하는 글리칸을 아자이드로 개질한 후 디벤조사이클로옥텐의 관능기와 결합할 수 있다.
또한, 상기 항원-항체 결합의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 대식세포 또는 간엽줄기세포가 항체, 광감각제 및 폴리에틸렌글리콜이 결합된 접합체와 결합하며, N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화된 광감각제-폴리에틸렌글리콜 접합체가 항체에 존재하는 아민기와 결합한 항체-광감각제-폴리에틸렌글리콜 접합체가 대식세포 또는 간엽줄기세포 표면 항원과 결합할 수 있다.
상기 항체는 CD44, CD54, CD90, CD105, CD106 및 CD166로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 세포내재화의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 대식세포 또는 간엽줄기세포에 광감각제를 처리한 후 세포 배양하여 대식세포 또는 간엽줄기세포 내부에 광감각제를 봉입시킬 수 있다.
본 발명은 폴리에틸렌글리콜과 광감각제를 반응시키는 단계(제1단계); 상기 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 디벤조사이클로옥텐과 반응시키는 단계(제2단계); 세포 표면의 글리칸에 아자이드(azide)를 부여하는 단계(제3단계); 및 상기 제2단계에서 얻은 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-광각감제 접합체를 상기 아자이드가 부여된 세포와 접합시키는 단계(제4단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 간엽줄기세포의 제조방법을 제공한다.
상기 제1단계 이전에, 상기 광감각제를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제1단계 이후에, 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체 중 폴리에틸렌글리콜과 광감각제의 1 대 1 당량 반응산물만을 분리 및 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제2단계 이전에, 상기 디벤조사이클로옥텐을 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제3단계는 4개의 아세틸기를 갖는 만노스(AC4ManNAz)를 세포와 함께 배양하여 세포 표면의 글리칸에 아자이드를 부여할 수 있다.
또한, 본 발명은 폴리에틸렌글리콜과 광감각제를 반응시키는 단계(제1단계); 상기 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계(제2단계); 및 상기 활성화된 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 세포와 접합시키는 단계(제3단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 세포의 제조방법을 제공한다.
상기 제1단계 이전에, 상기 광감각제를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제1단계 이후에, 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체 중 폴리에틸렌글리콜과 광감각제의 1 대 1 당량 반응산물만을 분리 및 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 폴리에틸렌글리콜과 광감각제를 반응시키는 단계(제1단계); 상기 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계(제2단계); 상기 활성화된 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 항체와 접합시키는 단계(제3단계); 및 상기 제3단계에서 얻은 항체-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 세포와 항원-항체 결합을 통해 접합시키는 단계(제4단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 세포의 제조방법을 제공한다.
상기 제1단계 이전에, 상기 광감각제를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 제1단계 이후에, 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체 중 폴리에틸렌글리콜과 광감각제의 1 대 1 당량 반응산물만을 분리 및 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포를 배양하는 단계(제1단계); 및 상기 배양된 세포에 광감각제를 처리한 후 배양하여 광감각제가 봉입된 세포를 얻는 단계(제2단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 세포의 제조방법을 제공한다.
일 실시예를 근거로 본 발명을 보다 상세하게 설명하면, 다양한 관능기를 갖는 폴리에틸렌글리콜은 촉매 사용 시 1개 이상의 카르복실산을 가지는 페오포르바이드, 클로린 또는 포르피린과 같은 광감각제와 화학적 결합이 가능하여 광감각제의 난용성 문제를 해결해 줄 수 있고, 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체 제조 이후 디벤조사이클로옥텐 또는 항체를 접합시켜야 하므로 화학식 2 또는 3과 같이 2개의 반응기(하이드록실기, 1차 아민, 카르복실산)를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 사용할 수 있다.
[화학식 2]
[화학식 3]
하지만, 이러한 2개의 반응기를 가지는 폴리에틸렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜과 광감각제 간의 1 대 1 당량의 접합뿐만 아니라 1 대 2 당량의 접합이 될 수 있으므로 폴리에틸렌글리콜과 광감각제 간의 1 대 1 당량의 접합비율을 가지는 산물만을 소수성 크로마토그래피를 이용하여 소수성 차이에 의해 폴리에틸렌글리콜과 광감각제 1 대 1 당량의 접합산물을 분리 및 정제할 수 있다.
상기 제조된 1개의 1차 아민기를 가지는 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체와 1개의 카르복실기를 갖는 디벤조사이클로옥텐(Dibenzocyclootyne-acid)을 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)를 촉매로 사용하여 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(하기 화학식 4 참조)를 제조할 수 있고, 1개의 카르복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체의 카르복실기를 DCC 및 nhs를 촉매로 사용하여 사전 활성화 시키고 분말로 회수한 후, CD44, CD90, CD105과 같은 항체와 결합시킨 항체-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(하기 화학식 5 참조)를 각각 제조할 수 있다.
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 과정들을 통해 제조된 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체와 대식세포 또는 간엽줄기세포 간의 접합을 위해 대식세포 또는 간엽줄기세포에 4개의 아세틸기를 가지는 만노스(AC4ManNAz)를 처리하고 3일간 배양하여 대식세포 또는 간엽줄기세포 표면의 화학적 변형(azide)을 유도할 수 있다(하기 화학식 6 참조).
[화학식 6]
따라서, 대식세포 또는 간엽줄기세포에 상기 과정들을 통해 제조된 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체, 항체-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체, 촉매에 의해 사전 활성화된 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체, 광감각제를 각각 처리해주어 최종적으로 광감각제를 함유하는 세포를 제조할 수 있다(하기 화학식 7 참조).
[화학식 7]
본 발명에 따른 광감각제를 함유하는 세포는 암 면역치료를 위한 면역치료제로 이용될 수 있으며, 대식세포 또는 간엽줄기세포의 귀소성 특성에 따라 특정 부위의 암에 한정되지 않으며 다양한 암 치료에 광범위하게 적용할 수 있다.
이에, 본 발명은 광감각제를 함유하는 세포를 유효성분으로 포함하는 암 면역치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 광감각제를 함유하는 세포는 암 부위에 선택적으로 축적되어, 광원 조사시 상기 대식세포 또는 간엽줄기세포의 선택적 사멸을 유도함으로써, 사이토카인 생성을 증가시키고 살생 T 세포(killer T cell)를 모집(recruit)하는 면역반응에 의해 항암 효과를 나타낼 수 있다.
상기 암으로는 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 뇌종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 편평상피세포암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 광감각제를 함유하는 세포를 유효성분으로 포함하는 광역학 항암 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학조성물은 약학적으로 유효한 양의 광감각제를 함유하는 간엽줄기세포를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 광감각제를 함유하는 세포의 약학적으로 유효한 양은 0.01 ~ 100 mg/day/체중kg일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기 "약학적으로 허용되는"이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다.
상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여 하거나 비경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 목적하는 방법에 따라 치료 효과적인 질환 상태 또는 증상이 있는 사람 또는 기타 포유동물에 적합하게는 주사 또는 기타 다른 방법으로 전달(예: 이식, 체강 또는 가능한 공간에 넣는 것, 신체의 조직 표면을 코팅 또는 이식가능한 장치의 표면을 코팅함으로써)될 수 있지만, 특히, 상기 약학조성물은 비경구로 전달되는 것이 바람직하다. 이때, "비경구"란 근육내, 복막내,복부내, 피하, 정맥 및 동맥내를 의미한다. 그러므로 본 발명의 광감각제를 함유하는 간엽줄기세포를 포함하는 약학조성물은 대표적으로 주사 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 주사가능한 약학조성물은 임의의 적합한 방법, 바람직하게는 피하 바늘을 통한 주사에 의해 사람 또는 기타 포유동물의 체내에 주사 또는 삽입할 수 있다. 예를 들면, 주사 또는 기타 다른 방식으로 동맥내, 정맥내, 비뇨생식기, 피하, 근육내, 피하, 두개내, 심장막내, 흉막내, 또는 기타 신체강 또는 가능한 공간 내로 투여할 수 있다. 또는, 카테터 또는 시린지를 통해 예를 들어 관절경 시술 동안에 관절내로, 또는 비뇨생식관내로, 맥관내로, 구개내로 또는 흉막내, 또는 신체 내임의의 체강 또는 가능한 공간내로, 수술, 외과, 진단 또는 중재 시술 도중에 도입할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성 요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 구성요소의 기술적 범위를 실시예들에 예시한 것들로 한정하고자 하는 것은 아니다. 더욱이, 상기 기술의 당업자들은 본 발명의 근본적인 개념과 그 실행을 쉽게 수정하거나 변경할 수 있을 것이다.
<
실시예
1> 세포 표면
글리칸의
아자이드
생성을 통한 화학적 결합방법에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포 제조
<1-1> 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체(DBCO-PEG-PheoA)의 제조
<1-1-1> 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체(PEG-PheoA)의 제조
폴리에틸렌글리콜과 페오포르바이드 접합에 앞서 페오포르바이드의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 페오포르바이드(pheophorbide a, PheoA, 0.146g)와 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.0695g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.0385g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 25ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이후 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-bisamine, PEG, 1g)을 디메틸설폭시드(DMSO, 25ml)에 녹인 후 앞선 페오포르바이드 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조한 후, 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.
<1-1-2>
폴리에틸렌글리콜
-
페오포르바이드
접합체(PEG-
PheoA
)의 분리정제
상기 실시예 <1-1-1>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 1 대 1 당량의 접합산물만을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체를 5mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5의 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 회수하였다.
<1-1-3> 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체(DBCO-PEG-PheoA)의 제조
상기 실시예 <1-1-2>에서 분리정제된 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체와 디벤조사이클로옥텐 접합에 앞서 디벤조사이클로옥텐(Sigma aldrich, USA)의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 디벤조사이클로옥텐(Dibenzocyclootyne aicd, DBCO, 0.002g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.002g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.001g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 2ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체(PEG-PheoA, 0.030g)를 디메틸설폭시드(DMSO, 3ml)에 녹인 후 앞선 디벤조사이클로옥텐 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석한다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조한다. 결과는 도 1과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.
<1-2> 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(DBCO-PEG-Ce6)의 제조
<1-2-1> 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6)의 제조
폴리에틸렌글리콜과 클로린 접합에 앞서 클로린의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 클로린(Chlorin e6, Ce6, 0.146g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.0695g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.0385g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 25ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-bisamine, PEG, 1g)을 디메틸설폭시드(DMSO, 25ml)에 녹인 후 앞선 클로린 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 회수하였다.
<1-2-2> 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6)의 분리정제
상기 실시예 <1-2-1>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-클로린 1 대 1 당량의 접합산물만을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체를 5mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5의 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 회수하였다.
<1-2-3> 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(DBCO-PEG-Ce6)의 제조
상기 실시예 <1-2-2>에서 분리정제된 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체와 디벤조사이클로옥텐 접합에 앞서 디벤조사이클로옥텐(Sigma aldrich, USA)의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 디벤조사이클로옥텐(Dibenzocyclootyne aicd, DBCO, 0.002g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.002g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.001g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 2ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6, 0.030g)를 디메틸설폭시드(DMSO, 3ml)에 녹인 후 앞선 디벤조사이클로옥텐 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조하여 회수하였다. 결과는 도 2과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.
<1-3> 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(DBCO-PEG-PPIX)의 제조
<1-3-1> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-PPIX)의 제조
폴리에틸렌글리콜과 포르피린 접합에 앞서 포르피린의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 포르피린(protoporphyrin IX, PPIX, 0.146g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.0695g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.0385g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 25ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-bisamine, PEG, 1g)을 디메틸설폭시드(DMSO, 25ml)에 녹인 후 앞선 포르피린 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 회수하였다.
<1-3-2> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-PPIX)의 분리정제
상기 실시예 <1-3-1>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 1대1 당량의 접합산물만을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체를 5mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5의 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 회수하였다.
<1-3-3> 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(DBCO-PEG-PPIX)의 제조
상기 실시예 <1-3-2>에서 분리정제된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체와 디벤조사이클로옥텐 접합에 앞서 디벤조사이클로옥텐(Sigma aldrich, USA)의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 디벤조사이클로옥텐(Dibenzocyclootyne aicd, DBCO, 0.002g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.002g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.001g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 2ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-PPIX, 0.030g)를 디메틸설폭시드(DMSO, 3ml)에 녹인 후 앞선 디벤조사이클로옥텐 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 회수하였다. 결과는 도 3과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.
<1-4> 다양한 세포 표면의 글리칸 변형
인간 간엽줄기세포(hMSCs, Lonza, Walkersville, MD)는 α-minimum essential medium 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서, 마우스 간엽줄기세포(mMSCs, Cyagen Biosciences, Sunnyvale, CA)는 Eagle’minimum essential medium 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서, 대식세포는(RAW264.7, ATCC, TIB-71)는 RPMI 1640 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서 배양하였으며 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 간엽줄기세포를 포함한 다양한 세포 표면의 글리칸에 아자이드(azide)를 부여하기 위하여 4개의 아세틸기를 가지는 만노스(AC4ManNAz, Thermoscientific, korea) 50μM를 대식세포, 인간 및 마우스 간엽줄기세포 배지에 추가한 후 3일간 배양하였다. 표면의 글리칸 변형 유무는 Dibenzocyclooctyne-cy5(sigma aldrich, USA)와 결합여부를 도 4와 같이 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scattering microscopy)을 통해 확인하였다.
<1-5> 광감각제를 함유하는 다양한 세포 제조
상기 <실시예 1-4>에서 세포 표면의 글리칸을 변형시킨 다양한 세포 배지에 [실시예 1-1]에서 제조한 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체를 처리하여 4℃ 환경에서 1시간 동안 배양하였으며, Cooper-free click reaction에 의해 최종적으로 인간 간엽줄기세포와 페오포르바이드 접합체를 제조하였다. 대식세포(PheoA-RAW264.7), 마우스(PheoA-mMSCs) 및 인간(PheoA-hMSCs) 간엽줄기세포-페오포르바이드 접합체의 결합여부는 1시간 후, DPBS buffer를 이용해 접합되지 않은 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체를 모두 제거한 후, 도 5과 같이 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scattering microscopy)을 통해 확인하였다. 또한, 다양한 세포들에 페오포르바이드 접합체의 접합효율을 도 6과 같이 유세포분석기(flow cytometry analysis)를 이용하여 확인하였다.
<실시예 2> 반응기 사전 활성화를 통해 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포 제조
<2-1> 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6)의 제조
폴리에틸렌글리콜과 클로린 접합에 앞서 클로린의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 클로린(Cholorin e6, Ce6, 0.0597g)와 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.0309g), 4-Dimethylaminopyridine(DMAP, 0.0183g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 10ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 활성화하였다. 6시간 반응 이후 폴리에틸렌글리콜(Hydroxyl polyethylene glycol carboxyl, PEG, 0.3g)을 디메틸설폭시드(DMSO, 10ml)에 녹인 후 앞선 클로린 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조한 후, 결과는 도 7과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR spectroscopy)을 통하여 확인하였다.
<2-2> 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6)의 사전 활성화
폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6)를 세포에 처리하기에 앞서 사전 활성화를 실시하였다. 상기 <실시예 2-1>의 과정을 통해 제조한 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6, 0.02g)를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.00012g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.001g)을 디메틸포름아마이드(N,N-Dimethylmethanamide(DMF, 25ml)에 녹인 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물에서 생긴 비수용성의 디사이클로헥실우레아를 제거하기 위해 필터링 한 후 투석막(Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조하여 사전 활성화된 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체를 수득하였다. 결과는 도 8과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR spectroscopy)을 통하여 확인하였다.
<2-3> 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포 제조
인간 간엽줄기세포는(hMSCs, Lonza, Walkersville, MD) α-minimum essential medium 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서 배양하였으며 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 인간 간엽줄기세포 표면에 있는 아민기와 상기 <실시예 2-2>와 같이 사전 활성화시킨 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체를 아마이드 결합(Amide bond)을 통해서 결합시켜 주었다. 인간 간엽줄기세포-클로린 접합체의 결합여부는 1시간 후, DPBS buffer를 이용해 접합되지 않은 폴리에틸렌 글리콜-클로린 접합체를 모두 제거한 후, 도 9과 같이 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scattering microscopy)을 통해 확인하였다.
<실시예 3> 항체접합을 통해 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 제조
<3-1> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-protoporphyrin IX)의 제조
<3-1-1> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체 (PEG-Hpp)의 제조
폴리에틸렌글리콜과 포르피린 접합에 앞서 포르피린 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 포르피린 (hematoporphyrin, Hpp, 43.2mg)와 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 17.8mg), 4-Dimethylaminopyridine (DMAP, 10.5mg)를 디메틸포름아마이드(Dimethylformamide, DMF, 20ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이후 폴리에틸렌글리콜(hydroxyl polyethylene glycol carboxyl, PEG, 0.6g)을 디메틸포름아마이드(DMF, 6ml)에 녹인 후 앞선 포르피린 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 과량의 차가운 에테르에 침전시켜 디메틸포름아마이드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하였고, 용매를 모두 증발시키기 위해 진공건조(vacuum dry)를 실시하였다.
<3-1-2> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-Hpp)의 분리정제
상기 실시예 <3-1-1>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 1 대 1 당량의 접합산물만을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체를 5mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5의 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였다. 메탄올을 증발시킨 수득물을 메틸클로라이드(Methylene chloride, MC)에 녹여 과량의 차가운 에테르에서 침전시키고 진공건조(vacuum dry)를 통해 최종반응물을 회수하였다. 결과는 도 10과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR spectroscopy)을 통하여 확인하였다.
<3-1-3> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-Hpp)의 사전 활성화
상기 실시예 <3-1-2>에서 분리정제된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체와 CD44 항체 접합에 앞서 폴리에틸렌글리콜-포르피린의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 폴리에틸렌글리콜-포르피린(PEG-Hpp, 0.5g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 11.5mg), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 6.5mg)를 메틸클로라이드(Methylene chloride, MC, 10mL)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 과량의 차가운 에테르에 침전시켜 메틸클로라이드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하였고, 용매를 모두 증발시키기 위해 진공건조(vacuum dry)를 통해 최종반응물을 회수하였다.
<3-2> 항체-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(항체-PEG-Hpp)의 제조
<3-2-1> Anti-human CD44 항체-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(CD44-PEG-Hpp)의 제조
상기 실시예 <3-1-3>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체의 활성화된 카르복실기를 정제 anti-human CD44 항체에 다량 존재하는 1차 아민기에 접합시키기 위해 1X Phosphate-buffered saline(PBS) 1ml에 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(2mg)를 녹인 후 이 용매에 Purified anti-human CD44 항체(20 ㎍)를 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다.
<3-2-2> Anti-human CD90 항체-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(CD90-PEG-Hpp)의 제조
상기 실시예 <3-1-3>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체의 활성화된 카르복실기를 정제 anti-human CD90 항체에 다량 존재하는 1차 아민기에 접합시키기 위해 1X Phosphate-buffered saline(PBS) 1ml에 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(2mg)를 녹인 후 이 용매에 purified anti-human CD90 항체(20 ㎍)를 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다.
<3-2-3> Anti-human CD105 항체-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(CD105-PEG-Hpp)의 제조
상기 실시예 <3-1-3>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체의 활성화된 카르복실기를 정제 anti-human CD105 항체에 다량 존재하는 1차 아민기에 접합시키기 위해 1X Phosphate-buffered saline(PBS) 1ml에 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(2mg)를 녹인 후 이 용매에 정제 anti-human CD105 항체(20 ㎍)를 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다.
<3-3> 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포 제조
인간 간엽줄기세포는(hMSCs, Lonza, Walkersville, MD) α-minimum essential medium 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서 배양하였으며 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 상기 <실시예 3-2>에서 제조한 항체-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체를 다양한 농도별로 처리하여 4시간 동안 배양하였으며, 항원-항체 반응에 의해 최종적으로 인간 간엽줄기세포 표면의 항원과의 접합체를 제조하였다. 인간 간엽줄기세포-포르피린 접합체의 결합여부는 4시간 후, DPBS buffer를 이용해 접합되지 않은 항체-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체를 모두 제거한 후, 도 11과 같이 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scattering microscopy)을 통해 확인하였다.
<실시예 4> 광감각제를 내재화하는 인간 간엽줄기세포의 제조
인간 간엽줄기세포는(hMSCs, Lonza, Walkersville, MD) α-minimum essential medium 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서 배양하였으며 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 포르피린을 다양한 농도별로 처리하여 4시간 동안 배양하였으며, 포르피린이 가지는 소수성으로 인해 인간 간엽줄기세포 내부에 포르피린이 존재하는 인간 간엽줄기세포를 제조하였다. 인간 간엽줄기세포-포르피린 접합체의 결합여부는 4시간 후, DPBS buffer를 이용해 접합되지 않은 항체-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체를 모두 제거한 후, 도 12과 같이 인간 간엽줄기세포 내부에 존재하는 광감각제를 정량하여 확인하였다.
<실험예 1> 시간변화에 따른 인간 간엽줄기세포에 함유된 광감각제 정량 평가
상기 [실시예 1-5]와 [실시예 4]와 같은 방법으로 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포가 시간 변화에 따라 함유하는 광감각제의 양의 변화 유무를 평가하기 위하여 상기 [실시예 1-5]와 [실시예 4]에서 제조한 인간 간엽줄기세포를 도 13와 같이 유세포분석기(flow cytometry analysis)를 이용하여 분석하였다.
<실험예 2> 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 자체 세포독성 확인
상기 실시예 1 내지 4에서 각각 제조한 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포가 다양한 광원세기에 따라 인간 간엽줄기세포에 나타나는 독성을 확인하기 위하여 세포독성 시험을 시행하였다. 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포(1x104 cell/well, 96well)에 670nm 파장의 광원을 0~9J/cm2로 다양한 세기의 광원을 부여하고 24시간 동안 배양 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT assay, sigma aldrich, USA)를 이용해 인간 간엽줄기세포의 독성을 도 14 내지 17과 같이 확인하였다.
<실험예 3> 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 면역인자 생성 유무 확인
상기 [실험예 2]에서 인간 간엽줄기세포에 함유된 광감각제가 광원 부여시 인간 간엽줄기세포에 독성효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 인간 간엽줄기세포 사멸 과정에서 면역반응을 촉진시키는 사이토카인(cytokine)을 발생하는지 확인하기 위해서 인터루킨-6(IL-6)와 인터루킨-8(IL-8), 열충격단백질 70(hsp70)을 Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)를 통해 도 18 내지 20과 같이 확인하였다.
<실험예 4> 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 암세포 광역학치료 효과 확인
상기 <실시예 1>에서 제조한 광각작제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암세포에 처리한 후, 광원 부여시 암세포에 광역학치료 효과를 보이는지 알아보기 위하여 세포독성 시험을 시행하였다. 다양한 암에서 효과를 확인하기 위하여 K1735 세포(murine melanoma, 한국세포주은행 구매)와 UV2237 세포(murine fibrosarcoma, adriamycin resistance, 한국세포주은행 구매), MDA-MB-231 세포(human breast carcinoma, ATCC 구매) 각각을 1x106 cell/well (6well)로 배지에 분주하고 실시예 1 내지 5]에서 제조한 광각작제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 각 well에 103~105 cell씩 처리 한 후, 670nm파장을 가지는 광원을 2J/cm2세기로 부여하였으며, MTT assay를 이용해 암세포 광역학치료 효과를 도 21와 같이 확인하였다.
<실험예 5> 광감각제를 함유하는 다양한 세포의 암 특이적 축적효과 확인
상기 <실시예 1>에서 제조한 광각작제를 함유하는 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포가 동물모델에서 암 특이적 축적효과가 있는지 여부를 확인하기 위해서 K1735세포를 Balb/c nude 마우스에 이식하여 동물 질병모델을 제작하였다. 동물모델에 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 정맥주사(5x104 cell/mice)하고 시간이 지남에 따라 다양한 세포가 암 부위에 축적되는 것을 도 22 내지 24과 같이 확인하였다.
<실험예 6> 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 체내 면역인자 생성 유무 확인
상기 <실험예 5>에서 나타난 암 특이적 축적효과를 근거로 암 부위에 670nm 파장의 레이저 조사 후, 암 부위에서의 면역인사 생성 유무를 확인하기 위하여 K1735세포를 Balb/c 마우스에 이식하여 동물 질병모델을 제작하였다. 동물 질병모델에 상기 <실시예 1>에서 제조한 페오포르바이드가 접합된 인간 간엽줄기세포를 각각 0 ~ 1x105 cell/mice로 세포 수 또는 광감각제가 없는 인간 간엽줄기세포(hMSCs), 광감각제를 함유하지만 레이저 조사 유(Light(+))ㆍ무(Light(-))차이를 비교하여 확인하였다. 정맥주사하고 24시간 뒤, 암 부위에 670nm파장을 가지는 광원을 100J/cm2세기로 부여하였으며, 광원 조사 24시간 뒤 암과 비장을 각각 적출하여 도 25 및 도 26와 같이 면역인자를 생성하는지 확인(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)하였다.
<실험예 7> 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 암성장 억제효과 확인
상기 실시예 1에서 제조한 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포가 동물모델에서 암성장 억제효과가 있는지 여부를 확인하기 위해서 K1735 세포를 Balb/c, Balb/c nude, CB17SCID 마우스에 이식하여 동물 질병모델을 각각 제작하였다. 실시예 1에서 제조한 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 정확한 암성장 억제효과 확인을 위해서 PBS와 광감각제를 함유하지 않는 인간 간엽줄기세포 각각을 대조군으로 사용하였으며 빛에 민감하게 반응하는 여부를 확인하기 위하여 빛을 조사한 군(light(+))과 빛을 조사하지 않은 군(light(-))으로 구분하여 실험을 진행하였다. 동물모델에 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 정맥주사(1x105 cell/mice)하고 24시간 뒤 암 부위에 670nm파장을 가지는 광원을 100J/cm2세기로 부여하였으며, 도 27 내지 도 29과 같이 총 14일간 암 크기를 측정하여 암성장 억제효과를 확인하였다. 페오포르바이드가 접합된 인간 간엽줄기세포를 정맥주사하고 14일 뒤, 암 조직을 적출하여 Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling(TUNEL)방법과 Hematoxylin and eosin stain(H&E)방법을 이용하여 암세포 사멸여부를 도 30 내지 도 32과 같이 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (29)
- 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 대식세포 또는 간엽줄기세포 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 광감각제는 빛에 의해 일항산소를 생성하는 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 광감각제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phthalocyanines) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminolevuline esters) 화합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 광감각제는 페오포르바이드(pheophorbide a), 클로린(chlorin e6) 및 포르피린(protoporphyrin IX)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 1에 있어서, 상기 광감각제는 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화 중 어느 하나의 방법으로 세포와 결합하거나 세포 내 봉입된 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 6에 있어서, 상기 화학적 결합 또는 항원-항체 결합 중 어느 하나의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 7에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 1차 아민기(-NH2), 하이드록시기(-OH) 및 카르복실기(-COOH)로 이루어진 군에서 선택된 동종 또는 이종의 관능기를 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 7에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 2개의 1차 아민기(-NH2)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 2개의 하이드록실기(-OH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 1개의 1차 아민기(-NH2)와 1개의 카르복실기(-COOH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 1개의 카르복실기(-COOH)와 1개의 하이드록실기(-OH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 및 1개의 하이드록실기(-OH)와 1개의 아민기(-NH2)를 갖는 폴리에틸렌글리콜;로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 7에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 중량평균분자량이 2,000 내지 10,000인 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 7에 있어서, 상기 화학적 결합의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 세포가 광감각제 및 폴리에틸렌글리콜이 결합된 접합체와 결합하며, N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화된 접합체가 세포 표면에 존재하는 아민기와 아마이드 결합을 통해 결합하는 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 7에 있어서, 상기 화학적 결합의 방법으로 광감각제를 포함하는 세포는 디벤조사이클로옥텐을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 12에 있어서, 상기 디벤조사이클로옥텐은 1차 아민기(-NH2) 또는 카르복실기(-COOH) 중 어느 하나의 관능기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 13에 있어서, 상기 광감각제를 함유하는 세포는 세포가 광감각제, 폴리에틸렌글리콜 및 디벤조사이클로옥텐이 결합된 접합체와 결합하며, 세포 표면에 존재하는 글리칸을 아자이드로 개질한 후 디벤조사이클로옥텐의 관능기와 결합하는 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 7에 있어서, 상기 항원-항체 결합의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 세포가 항체, 광감각제 및 폴리에틸렌글리콜이 결합된 접합체와 결합하며, N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화된 광감각제-폴리에틸렌글리콜 접합체가 항체에 존재하는 아민기와 결합한 항체-광감각제-폴리에틸렌글리콜 접합체가 세포 표면 항원과 결합하는 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 15에 있어서, 상기 항체는 CD44, CD54, CD90, CD105, CD106 및 CD166 로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 청구항 6에 있어서, 상기 세포내재화의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 세포에 광감각제를 처리한 후 세포 배양하여 세포 내부에 광감각제를 봉입시킨 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.
- 폴리에틸렌글리콜과 광감각제를 반응시키는 단계(제1단계);
상기 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 디벤조사이클로옥텐과 반응시키는 단계(제2단계);
세포 표면의 글리칸에 아자이드(azide)를 부여하는 단계(제3단계); 및
상기 제2단계에서 얻은 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-광각감제 접합체를 상기 아자이드가 부여된 세포와 접합시키는 단계(제4단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 세포의 제조방법. - 청구항 18에 있어서, 상기 제1단계 이전에, 상기 광감각제를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 광감각제를 함유하는 세포를 제조하는 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 제1단계 이후에, 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체 중 폴리에틸렌글리콜과 광감각제의 1 대 1 당량 반응산물만을 분리 및 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 광감각제를 함유하는 세포를 제조하는 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 제2단계 이전에, 상기 디벤조사이클로옥텐을 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 광감각제를 함유하는 세포를 제조하는 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 제3단계는 4개의 아세틸기를 갖는 만노스(AC4ManNAz)를 세포와 함께 배양하여 세포 표면의 글리칸에 아자이드를 부여하는 것을 특징으로 하는 광감각제를 함유하는 세포를 제조하는 방법.
- 폴리에틸렌글리콜과 광감각제를 반응시키는 단계(제1단계);
상기 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계(제2단계); 및
상기 활성화된 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 세포와 접합시키는 단계(제3단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 세포의 제조방법. - 폴리에틸렌글리콜과 광감각제를 반응시키는 단계(제1단계);
상기 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계(제2단계);
상기 활성화된 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 항체와 접합시키는 단계(제3단계); 및
상기 제3단계에서 얻은 항체-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 세포와 항원-항체 결합을 통해 접합시키는 단계(제4단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 세포의 제조방법. - 세포를 배양하는 단계(제1단계); 및
상기 배양된 세포에 광감각제를 처리한 후 배양하여 광감각제가 봉입된 세포를 얻는 단계(제2단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 세포의 제조방법. - 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 광감각제를 함유하는 세포를 유효성분으로 포함하는 암 면역치료용 약학조성물.
- 청구항 26에 있어서, 상기 광감각제를 함유하는 세포는 암 부위에 선택적으로 축적되어, 광원 조사시 상기 세포의 선택적 사멸을 유도함으로써, 사이토카인 생성을 증가시키고 살생 T 세포(killer T cell)를 모집(recruit)하는 면역반응에 의해 항암 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 암 면역치료용 약학조성물.
- 청구항 26에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 뇌종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 편평상피세포암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 면역치료용 약학조성물.
- 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 따른 광감각제를 함유하는 세포를 유효성분으로 포함하는 광역학 항암 치료용 약학조성물.
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