KR20160107303A - 활성 작용제 전달의 강화 방법 - Google Patents

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아키바 민츠
샤오빙 슝
영규 정
요 손
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Abstract

하기에 의해, 그를 필요로 하는 대상체에서의 선택된 뇌 조직의 혈액-뇌 장벽 투과도의 증가 방법이 수행된다: (a) 뇌 조직으로 이동하는 줄기 세포를 대상체에게 비경구로 투여하는 단계로, 상기 줄기 세포는 재조합 핵산을 함유하며, 상기 재조합 핵산은 열-유도성 프로모터와 작동가능하게 연관되는 장벽-개방 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단계; 및 (b) 다음에, 상기 선택된 뇌 조직에서 혈액-뇌 장벽의 투과도를 증가시키는 데에 효과적인 양으로 상기 장벽-개방 단백질 또는 펩티드의 발현을 유도하기에 충분하도록 상기 선택된 뇌 조직을 선택적으로 가열하는 단계. 상기 방법을 수행하는 데에 유용한 핵산, 벡터, 줄기 세포 및 조성물도 기술된다.

Description

활성 작용제 전달의 강화 방법{METHODS FOR ENHANCING THE DELIVERY OF ACTIVE AGENTS}
[관련 출원]
본 출원은 2014년 1월 17일자 미국 특허 가출원 제61/928,526호의 우선권을 주장하며, 그의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
[발명의 분야]
본 발명은 뇌의 신생물 조직과 같은 관심 조직에 줄기 세포와 같은 활성 작용제 또는 치료제를 전달하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
다형성 교모세포종 (GBM)은 극히 불량한 예후를 가지는 가장 흔하고 공격성인 원발성 뇌 종양이다 (문헌 [P. Wen et al., N Engl J Med . 359(5):492-507 (2008)]). 좋지 않은 예후는 표준 치료법이 정상적인 뇌 조직에 인접하여 존재하며 그에 침윤하는 잔류성 또는 침윤성 세포를 박멸하는 데에 실패하고 있다는 사실의 직접적인 결과이다. 줄기 세포가 그의 종양-향성 이동 능력으로 인하여 원발성 및 침습성 종양 세포를 치료 표적으로 하기 위한 실현가능한 전달용 비히클로 떠오르고 있다. 사실, 본 발명자들 등은 원발성 GBM 종양은 물론 정상 뇌 조직과 뒤섞이는 침습성 종양 세포를 향한 줄기 세포의 생체 내 이동 능력을 입증한 바 있다 (문헌 [I. Germano et al., J Neurosurg. 105, 88-95 (2006)]; [J. Dorsey et al., Mol Cancer Ther . 8, 3285-3295 (2009)]; [A. Ashkenazi et al., J Clin Invest. 104, 155-162 (1999)]; [D. Lawrence et al., Nat Med . 7, 383-385 (2001)]; [H. Walczak et al., Nat Med . 5,;157-163 (1999)]; [ A. Panner et al., Mol Cell Biol 25, 8809-8823 (2005)]; [S. Kidd et al., Stem Cells. 2009;27(10):2614-2623 (2009)]).
치료용 비히클로서의 줄기 세포를 제한하는 두 가지 주요 과제로 하기가 포함된다: (1) 종양을 향한 이동 이외에, 줄기 세포는 정상적인 신체 영역을 향해서도 추가적으로 유인되는데, 그것이 고도로 독성인 치료법을 비-선택적으로 나타낼 경우 이는 유해할 수 있으며 (문헌 [S. Kidd et al., Stem Cells 27(10):2614-2623 (2009)]), (2) 종양으로 이동하는, 주사된 치료용으로 조작된 줄기 세포의 낮은 분율로 인해 임상 환경에서 치료 반응을 유도하는 데에 필요하게 될 주사되는 조작 줄기 세포의 대량의 실현불가능한 수로 인하여 그의 치료 잠재력이 제한된다. 따라서, 다형성 교모세포종과 같은 뇌 종양 및 줄기 세포 치료법에 의해 치료가능한 다른 상태 둘 다를 위하여 줄기 세포 치료제의 전달을 강화하기 위한 새로운 방법에 대한 필요성이 존재한다.
[발명의 개요]
본원에서 본 발명이 때로는 다형성 교모세포종의 치료와 연관되는 일 실시양태를 참조하여 기술되기는 하지만, 통상의 기술자라면, 암 및 비-암 조직 모두를 포함한 다양한 여러 조직 유형의 치료에 본 발명이 적용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 따라서, 본원에서의 다형성 교모세포종에 대한 구체적인 논의들은 본 발명의 다양한 측면들을 제한하는 것이기 보다는 예시적인 것으로 다루어져야 한다.
따라서, 하기에서 논의되는 바와 같이, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상체에서의 조직의 치료 준비 방법 및 치료 방법을 제공한다. 합쳐서 생각해보면, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
(a) 상기 조직으로 이동하는 예비컨디셔닝 줄기 세포를 대상체에게 비경구로 투여하는 단계로, 상기 줄기 세포는 재조합 핵산을 함유하며, 상기 재조합 핵산은 열-유도성 프로모터와 작동가능하게 연관되는 줄기-세포 유인성 케모카인을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 단계;
(b) 다음에, 차후에 상기 대상체에게 비경구로 투여되는 치료용 줄기 세포의 이동을 강화하는 데에 효과적인 양으로 조직에서 상기 줄기-세포 유인성 케모카인의 발현을 유도하기에 충분하도록 상기 조직을 선택적으로 가열하는 단계;
(c) 다음에, 상기 조직으로 이동하는 치료용 줄기 세포를 대상체에게 비경구로 투여하는 단계로써, 상기 줄기 세포는 임의적으로 (그러나 일부 실시양태에서는 바람직하게는) 재조합 핵산을 포함하며, 상기 재조합 핵산은 열-유도성 프로모터와 작동가능하게 연관되는 치료제를 코딩하는 핵산을 포함하는 단계; 및
(d) 다음에, 임의적으로 (그러나 일부 실시양태에서는 바람직하게는) 치료-유효량으로 거기에서 상기 치료제의 발현을 유도하기에 충분하도록 상기 조직을 선택적으로 가열하는 단계.
본 발명의 다른 측면은 하기를 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체에서의 선택된 뇌 조직의 혈액-뇌 장벽 투과도의 증가 방법이다:
(a) 뇌 조직으로 이동하는 줄기 세포를 대상체에게 비경구로 투여하는 단계로, 상기 줄기 세포는 재조합 핵산을 함유하며, 상기 재조합 핵산은 열-유도성 프로모터와 작동가능하게 연관되는 장벽-개방 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단계; 및
(b) 다음에, 상기 선택된 뇌 조직에서 혈액-뇌 장벽의 투과도를 증가시키는 데에 효과적인 양으로 상기 장벽-개방 단백질 또는 펩티드의 발현을 유도하기에 충분하도록 상기 선택된 뇌 조직을 선택적으로 가열하는 단계.
또한, 본원에서 기술되는 것은 본원에서 기술되는 방법을 수행하는 데에 사용하기 위한, 상기한 바와 같은 줄기 세포를 함유하며, 추가적으로 하기에서는 제약상 허용되는 담체 중에 그것을 함유하는 제약 제제이다.
역시 본원에서 기술되는 것은 본원에서 기술되는 바와 같은 제약 제제를 제조하는 데에 사용하기 위한, 그리고 본원에서 기술되는 바와 같은 방법에 사용하기 위한 줄기 세포이다.
본원의 도면 및 하기에서 제시되는 명세서에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본원에서 언급되는 모든 US 특허 참고문헌들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함될 수 있다.
도 1a. 종양 세포에 의해 분비되는 화학-유인제에 반응하는 신경 줄기 세포 (NSC)의 시험관내 이동 잠재력. 필터의 대표적인 형광 현미경법 (FM) 및 광학 현미경법 (LM) 현미경사진은 이동된 NSC를 보여주며, 이는 세포가 트랜스웰로부터 플레이트로 이동함을 나타낸다. 형광 현미경법하에서 사진을 촬영하고 트랜스웰로부터 플레이트 표면으로 이동한 세포 (화살표)를 계수함으로써 이동을 정량하였다. GBM-컨디셔닝 배지 대 대조 (CTRL, 무-혈청 배지) 존재하에서의 이동을 비교하는 히스토그램은 GBM-컨디셔닝된 배지 존재하에서의 상당히 증가된 이동을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM (n=3); *, P=0.0432, 스튜던트 t-검정으로 나타낸다.
도 1b. GFP-발현 NSC는 생체 내에서 교모세포종을 향하여 이동함. 다양한 섹션의 영상들은 GFP-발현 NSC (화살표)가 원발성 종양 (파선) 및 침윤성인 돌출부(infiltrative projection) (DsRed 발현)로 공동국재화되나, 정상 뇌에서는 그렇지 않음으로써, NSC의 생체 내 GBM-향성을 나타낸다는 것을 입증하고 있다.
도 2a. 비례적인 발현을 위하여 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 분리되어 있는 리포터 유전자, 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 반딧불이 루시페라제 (F-Luc)의 발현을 추진하는 HSP70 프로모터 (PHSP70)를 포함하는 렌티바이러스 벡터 pLenti-pHSP70:FLuc/GFP-pRSV:RFP의 개략도. HSP70 추진 발현 이외에, 상기 플라스미드는 RSV 프로모터 (PRSV)를 통하여 성공적으로 형질도입된 세포를 가시화하여 선택하기 위한 적색 형광 단백질 (RFP)도 구성적으로 발현한다.
도 2b. 다양한 온도에서의 가열 후의 HSP70-추진 리포터 유전자 발현. 저캣 세포에 pLenti-pHSP70:FLuc/GFP-pRSV:RFP를 형질도입하고, PCR 열 사이클러에서 표시된 온도로 30분 동안 가열하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 재플레이팅하고, 정상적인 배양 조건하에서 18시간 동안 배양하였다. 세포를 루시페린에 노출시키고, IVIS 100 영상화 시스템을 사용하여 영상화하였다. 웰 주변의 관심 영역(regions of interest) (ROI)을 도출하는 것에 의해 광 신호를 정량하고, 히스토그램으로 광 강도를 플로팅하였다.
도 3A. 저캣 세포에서의 HSP70-추진 F-Luc/GFP 및 구성적 RFP (Const.)의 이중 리포터 발현의 입증. 바이러스를 저캣 세포에 감염시키고, 일단 RFP 발현에 의해 형질도입이 확인되고 나면, 세포를 PCR 열 사이클러에서 표시된 시간 기간 동안 43 ℃로 가열하였다. 가열후, 세포를 재플레이팅하고, 정상 배양 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 루시페린에의 노출 후, 생물발광 및 다색 형광 (GFP 및 RFP) 영상을 기록하였다 (RFP, 상부 좌측; 상 대조, 상부 우측; GFP, 저부 좌측; 융합된 것, 저부 우측). 광 신호를 정량하고, 히스토그램에 플로팅하였다.
도 3b. B16F10 흑색종 세포에서의 HSP70-추진 F-Luc/GFP 및 구성적 RFP의 이중 리포터 발현의 입증. 바이러스를 흑색종 세포에 감염시키고, 일단 RFP 발현에 의해 형질도입이 확인되고 나면, 세포를 PCR 열 사이클러에서 표시된 시간량 동안 43 ℃로 가열하였다. 가열후, 세포를 재플레이팅하고, 정상 배양 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 루시페린에의 노출 후, 생물발광 및 다색 형광 (GFP 및 RFP) 영상을 기록하였다 (RFP, 상부 좌측; 상 대조, 상부 우측; GFP, 저부 좌측; 융합된 것, 저부 우측). 광 신호를 정량하고, 히스토그램에 플로팅하였다.
도 4. NSC에서의 HSP70-추진 리포터 유전자 발현. NSC에 pLenti-pHSP70:FLuc/GFP-pRSV:RFP 바이러스를 감염시키고, 형질도입 24시간 후, 구성적 RFP 발현을 통하여 플라스미드 발현을 확인하였다. 다음에, NSC를 PCR 열 사이클러에서 30분 동안 43 ℃로 가열하고, 재플레이팅한 후, 정상 세포 배양 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 다색 형광 영상화는 가열이 HSP70 프로모터를 유도하여 GFP 발현을 초래하였음을 나타내었다. RFP, 상부 좌측; 상 대조, 상부 우측; GFP, 저부 좌측; 융합된 것, 저부 우측.
도 5. 이식된 세포에서의 고강도 집속 초음파(high intensity focused ultrasound) (HIFU)-조절 가열 후의 생체 내 HSP70-추진 반딧불이 루시페라제 발현. pLenti-pHSP70:FLuc/GFP-pRSV:RFP 벡터를 안정하게 발현하는 B16F10 흑색종 세포 (8×105개)를 C57BL/6 마우스의 우측 저부 대퇴에 피하로 이식하였다. 세포 이식 7일 후, 자기 공명 열측정법 (MRT)-안내 HIFU를 사용하여 주사 부위를 43 ℃로 30분 동안 가열하였다. HIFU-유도 8시간 후, 마우스를 마취하고 i.p.로 150 mg/kg의 D-루시페린 (제노겐(Xenogen))을 주사한 후 생물발광에 대하여 영상화하였다. 생물발광은 IVIS 100 생체 내 영상화 시스템 (퍼킨엘머)을 사용하여 검출하였다 (상부 패널). B16 주사 부위 상에서 관심 영역 (ROI)을 도출하고, 광자 플럭스(photon flux)를 정량한 후, 전체 ROI에 대하여 그래프화하였다 (저부 패널).
도 6a. 생체 내 MRT-안내 HIFU. 연속 초음파 노출을 수행하여 래트 사체의 선택된 초점 (화살표)에서 뇌 조직을 가열하였다. MRT를 사용하여 실시간으로 온도를 모니터링하였다; 주변 온도: 37 ℃, TE/TR: 8.7/30 ms, 5개 슬라이스, 10 cm FOV, 128×128 매트릭스, 0.78×0.78 mm2 평면 해상도, 5 mm 슬라이스 두께 및 18초 시간 해상도.
도 6b. MRT-안내 HIFU 피드백 루프. HIFU 절차를 적용하였다 (상부 패널). 실시간 MRT를 사용하여 15분의 HIFU 실험 동안의 표적 점 내에서의 정확한 온도 (파선) 및 열 선량 (짙은 선) 변화를 모니터링하였다 (저부 패널). 그래프의 열 선량은 43 ℃에서의 누적 등가 분을 나타낸다.
도 7a. 실시간 MRT. T2-가중 영상 (TE/TR: 5.7/17 ms, 88개 슬라이스, 10 cm FOV, 256×256 매트릭스 및 0.4 mm 등방성 공간 해상도)을 사용하여 종양 위치를 확인하였으며 (화살표), MRT (TE/TR: 8.7/30 ms, 5개 슬라이스, 10 cm FOV, 128×128 매트릭스, 0.78×0.78 mm2 평면 해상도, 5 mm 슬라이스 두께 및 18초 시간 해상도)를 사용하여 두개내 온도를 실시간으로 모니터링하였다. HIFU 실험 동안 종양 코어 내에서의 온도 변화 (9 복셀(voxel))를 나타내었다 (우측 패널).
도 7b. HIFU 후의 pHSP70-추진 리포터 발현. HIFU-유도 8 및 48시간 후, 래트를 마취하고 i.p.로 150 mg/kg의 D-루시페린 (제노겐)을 주사한 후 생물발광에 대하여 영상화하였다. 신호는 리포터 구축물과 동일한 수의 종양 세포를 가지나 HIFU로 가열되지 않은 대조와 달리, HIFU로 처리된 래트에서의 강력한 F-Luc 발현 (원)을 나타내었다.
도 7c. 생물발광 신호의 정량. HIFU 처리 8 및 48시간 후, 뇌 부위 상에서 관심 영역을 도출하고, 광자 플럭스를 정량한 후, 그래프화하였다.
도 8. 표적화된 HIFU-활성화 치료 약물 전달 전략의 개략도. 단계 1. 재조합 휴면 줄기 세포를 정맥내로 주사한다. 단계 2: 줄기 세포가 원발성 종양 (T), 침습성 돌출부 및 미세위성(microsatellite) 종양을 향하여 지향성으로 이동한다. 단계 3: HIFU 파동이 MRT에 의한 지속적인 모니터링하에 종양 및 둘러싸고 있는 조직을 비-침습성으로 43 ℃로 가열한다. 단계 4: HIFU-유도 가열이 열 충격 프로모터를 통하여 강력한 치료제의 줄기 세포 발현을 활성화한다. NB, 정상 뇌; TZ, 침윤성 종양 구역; HZ, HIFU-유도 치료제 구역.
도 9. 영상-안내 HIFU와 함께 사용된 치료용 구축물의 개략도. 렌티바이러스 벡터는 비례적인 발현을 위하여 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)에 의해 분리되어 있는 sTRAIL 및 F-Luc의 발현을 추진하는 HSP70 프로모터 (PHSP70)를 포함한다. 또한, 상기 벡터는 성공적으로 형질도입된 세포를 가시화하여 선택하기 위한 적색 형광 단백질도 구성적으로 발현한다.
도 10a. CMV 프로모터의 조절하에 sTRAIL 및 mCherry 트랜스진을 코딩하는 벡터로 형질감염된 GFP-발현 NSC는 형질감염 72시간 후 NSC 사멸을 동반하거나 원형화된 세포가 검출되지 않으면서 sTRAIL, GFP 및 mCherry 트랜스진의 발현을 나타냄.
도 10b. sTRAIL 형질감염된 NSC 배양액으로부터의 배지는 GBM 세포를 사멸시킴. CMV 프로모터의 조절하에 sTRAIL 및 mCherry 트랜스진을 코딩하는 벡터로 형질감염된 NSC를 배양 배지에서 성장시키고, 그 배지를 GBM 세포를 포함하는 별도의 웰로 옮긴 후, 세포 사멸을 모니터링하였다. 이와 같은 분석은 농축되지 않은 배지 중에 존재하는 매우 적은 양의 sTRAIL도 GBM 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 반면, mCherry 만을 발현하는 바탕 벡터로 형질감염된 NSC 모방체로부터의 대조 배지 (CTRL)는 GBM 세포에 대하여 어떠한 효과도 가지지 않았다. 데이터는 평균 ± SEM (n=16). ***, P = 0.0008, 스튜던트 t-검정으로 나타낸다.
도 10c. sTRAIL을 안정하게 발현하는 NSC는 GBM 세포를 사멸시킴. F-Luc을 구성적으로 발현하는 U251MG GBM 세포 (1×103개)를 sTRAIL을 안정하게 발현하는 NSC (1×103개)와 공동-인큐베이팅하였다. 48시간 후, 생물발광을 사용하여 GBM 세포 생존율을 측정하였다. 결과는 sTRAIL을 발현하지 않는 대조 세포와 공동-인큐베이팅된 GBM 세포와 비교하였을 때의 sTRAIL-분비 세포에 노출된 GBM 세포의 완전한 제거를 나타내었다.
도 11. 래트 뇌 중 두개내 인간 GBM 종양의 자기 공명 영상.
도 12a. 비례적인 발현을 위하여 내부 리보솜 진입 부위에 의해 분리되어 있는 반딧불이 루시페라제 및 시토카인, 종양 괴사 인자 α (TNFα), 전환 성장 인자 β1 (TGFβ1) 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 발현을 추진하는 HSP70 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 벡터 pLenti-HSP70(F-Luc-2A-시토카인)의 개략도. HSP70 추진 발현 이외에, 상기 플라스미드는 성공적으로 형질도입된 세포를 가시화하여 선택하기 위한 적색 형광 단백질 (RFP) 및 블라스티시딘 S 데아미나제 (BSD)도 구성적으로 발현한다. 5' LTR, 5' 장 말단 반복체; Ψ, 패키지화 신호; RRE, Rev 반응 요소; cPPT, 중심 폴리우린 구역; WPRE, 우드척(Woodchuck) 간염 바이러스 전사-후 조절 요소; 3' LTR (SIN), SIN 돌연변이를 보유하는 3' 장 말단 반복체.
도 12b. GFP, 시토카인 및 RFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입된 인간 중간엽 줄기 세포 (상부 패널) 및 NSC 세포 (저부 패널).
도 13. 줄기 세포 이동 분석. pLenti-HSP70(F-Luc-2A-시토카인)이 형질도입된 후 무-혈청 DMEM에 현탁된 줄기 세포를 열 블록, 초음파 또는 적외선 광에 의해 20분 동안 43 ℃로 약하게 가열하고, 트랜스웰 플레이트의 저부 구획의 웰에 접종하였다. 무-혈청 DMEM 중 GFP를 발현하는 줄기 세포를 상부 구획에 접종하였다. CO2 인큐베이터에서 트랜스웰 시스템을 인큐베이팅한 후, 형광 현미경하에서 저부 구획으로 이동한 세포의 수를 계수하였다. 열 유도가 없는 줄기 세포는 대조로서 저부 구획에 접종하였다.
도 14. 열 블록 (HB), 초음파 (US) 및 적외선 광 (IR)에 의해 약하게 가열하는 것에 의해 유도된 hMSC에 의해 분비되는 시토카인에 반응한 hMSC의 시험관 내 이동. mm2 당 총 세포수를 나타내었다.
도 15. 열 블록 (HB), 초음파 (US) 및 적외선 광 (IR)에 의해 약하게 가열하는 것에 의해 유도된 NSC에 의해 분비되는 시토카인에 반응한 NSC의 시험관 내 이동. mm2 당 총 세포수를 나타내었다.
도 16a. HSP70 프로모터의 조절하에 TNFα를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입된 SF767 인간 아교 종양 세포로부터의 배지 중 TNFα의 존재. 처음으로 (1st) 가열된 세포는 높은 TNFα 농도를 나타내었다. 최초 가열 24시간 후인 추가적인 가열 기간 (2nd)에 의해 부양된 세포는 한층 더 높은 TNFα 발현 농도를 나타내었다. 배지 중 TNFα는 각 가열 16시간 후에 ELISA 검정에 의해 측정하였다. 비-유도 세포를 대조 (CTRL)로 사용하였다.
도 16b. HSP70 프로모터의 조절하에 TNFα를 발현하도록 형질전환된 SF767 세포로부터의 컨디셔닝된 배지에 반응하는 NSC의 이동. RFP-발현 NSC를 트랜스웰 플레이트 (8 ㎛ 세공)에서 SF767 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이팅함으로써, TNFα로의 NSC의 이동 반응을 평가하였다. 이동은 형광 현미경법하에 사진을 촬영하고 트랜스웰로부터 플레이트 표면으로 이동한 세포를 계수하는 것에 의해 정량하였다. 검정은 삼중으로 수행하였다. 필터의 대표적인 현미경사진 (상부 패널)은 NSC (화살표로 표시)가 트랜스웰로부터 SF767 세포를 포함하는 플레이트로 이동한다는 것을 나타내었다. 데이터는 열-유도된 SF767 세포로부터의 컨디셔닝된 배지가 대조 (CTRL) 미가열 세포 (저부 패널)로부터의 배지와 비교하였을 때 NSC 이동을 유도한다는 것을 나타내었다.
도 17a. 리포터 유전자 (루시페라제), 시토카인 (TNFα)의 발현을 추진하는 HSP70 프로모터, 그리고 RFP 및 선택가능 마커인 블라스티시딘 유전자의 발현을 추진하는 RSV 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 플라스미드의 개략도.
도 17b. pLenti-HSP70(TNFα-Luc)-RSV(RFP-BSD)를 사용하여 형질도입된 MSC (적색).
도 17c. 열-활성화된 루시페라제 및 TNFα 발현.
도 18a. 래트 뇌에 이식된 MSC와의 조합으로써 MRI-안내 HIFU에 의해 활성화되는 F-Luc 발현. HIFU 유도 18시간 후, 래트를 마취하고 i.p.로 150 mg/kg의 d-루시페린을 주사한 후 생물발광에 대하여 영상화하였다.
도 18b. 래트 뇌에 이식된 MSC와의 조합으로써 MRI-안내 HIFU에 의해 활성화되는 BBB 개방. HIFU 유도 2일 후 대조 가중 T1 영상을 수득하였다. 조영제는 i.v. 주사에 의해 투여하였다.
도 19. 래트 뇌에 이식된 MSC와의 조합으로써 MRI-안내 HIFU에 의해 활성화되는 BBB 개방의 정량 분석. A) MSCs-HSP70(Luc-2A-TNFα) 및 HIFU 처리를 포함하는 래트 (N=6), B) HIFU 처리 없이 MSCs-HSP70(Luc-2A-TNFα)가 이식된 래트 (N=4), 및 C) HIFU 처리를 동반하여 MSCs-HSP70(Luc-2A-GFP)가 이식된 래트 (N=4).
본 발명은 주로 인간 대상체의 치료에 관한 것이지만, 수의학적인 목적으로 동물 대상체, 특히 포유동물 대상체 예컨대 개, 고양이, 가축 및 말에서 본 발명이 수행될 수도 있다. 대상체는 모든 적합한 연령의 것일 수 있지만, 일부 실시양태에서는 대상체가 신생아, 유아, 어린이, 청소년, 성인 또는 노인 대상체이다.
본원에서 사용될 때의 "치료하다"는 환자에게 이익을 제공하는 임의 유형의 치료, 특히 진행성 질환을 지연하거나 지체시키는 것, 또는 그 질환의 증상을 경감하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용될 때의 "제약상 허용되는"은 화합물 또는 조성물이 질환의 중증도 및 치료의 필요성에 비추어 과도하게 유해한 부작용 없이 본원에서 기술되는 치료를 달성하기 위한 대상체에의 투여에 적합하다는 것을 의미한다.
본원에서 사용될 때의 "동시에"는 조합된 효과를 산출하기에 시간상 충분히 가까움을 의미한다 (즉, 동시에는 일시의 것일 수 있거나, 또는 2개 이상의 사건이 서로의 전후의 짧은 시간 기간 이내에 발생하는 것일 수 있음).
"핵산"은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 및 단일- 또는 이중-가닥 중 어느 하나의 형태인 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 자연에서 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 공지의 자연 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 핵산을 포괄한다. 달리 표시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 암묵적으로 보존성으로 변형된 그의 변이 (예컨대 축중성 코돈 치환) 및 상보성 서열은 물론, 명시적으로 표시되는 서열도 포괄한다. 핵산이라는 용어는 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 코딩되는 mRNA와 호환가능하게 사용된다.
"이종 핵산"은 일반적으로 단리되고, 클로닝되어 자연에서는 그것이 조합되지 않는 핵산에 라이게이션되고/거나, 해당 핵산 또는 단백질이 통상적으로 자연에서 발견될 수 있는 세포 또는 세포 환경이 아닌 다른 세포 또는 세포 환경으로 도입되고/거나 거기에서 발현되는 핵산을 나타낸다. 상기 용어는 원래 그것이 발현되는 세포 유형과 상이한 생물체 또는 세포 유형으로부터 수득되는 핵산, 및 또한 그것이 발현되는 세포주와 동일한 세포주로부터 수득되는 핵산 모두를 포괄한다.
"~을 코딩하는 핵산"은 구조 RNA 예컨대 rRNA, tRNA, 또는 특정 단백질 또는 펩티드의 일차 아미노산 서열, 또는 트랜스-작용 조절제를 위한 결합 부위에 대한 서열 정보를 포함하는 핵산을 지칭한다. 이와 같은 구는 특히 특정 숙주 세포의 코돈 선호도에 부합하여 도입될 수 있는 자연 서열 또는 서열들의 축중성 코돈 (즉 단일 아미노산을 코딩하는 서로 다른 코돈)을 포괄한다.
핵산에 관하여 사용될 때의 "재조합"은 일반적으로 해당 핵산 또는 단백질의 조성 또는 일차적인 서열이 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 실험적 조작을 사용하여 자연 발생 서열로부터 변경되었음을 나타낸다. 그것은 또한 핵산 또는 단백질이 단리된 후, 벡터, 또는 해당 핵산 또는 단백질이 자연에서 발견될 수 있는 세포 또는 세포 환경이 아닌 다른 세포 또는 세포 환경으로 도입되거나 거기에서 발현되는 핵산에 클로닝된다는 것을 나타낼 수도 있다.
세포에 관하여 사용될 때의 "재조합"은 세포가 기원이 그 세포에 대하여 외인성인 핵산을 복제 또는 발현하거나, 또는 그러한 핵산에 의해 코딩되는 펩티드 또는 단백질을 생성한다는 것을 나타낸다. 재조합 세포는 자연 (비재조합) 형태의 세포 내에서는 발견되지 않는 핵산을 발현할 수 있다. 인공적인 수단에 의해 핵산이 세포에 재-도입되는 경우, 재조합 세포는 또한 자연 형태의 세포에서 발견되는 핵산을 발현할 수도 있다. 그와 같은 외인성 핵산이 세포 막 내부에 도입되는 경우, 그와 같은 세포는 외인성 핵산에 의해 "형질전환되는" 것이다. 외인성 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA에 통합 (공유 연결)될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 외인성 DNA는 플라스미드와 같은 에피솜 요소상에서 유지될 수 있다. 진핵 세포에서, 안정하게 형질전환되는 세포는 일반적으로 외인성 DNA가 염색체에 통합됨으로써 그것이 염색체 복제를 통하여 딸 세포에 의해 유전되는 것, 또는 안정하게 유지되는 염색체외 플라스미드를 포함하는 것이다. 이와 같은 안정성은 외인성 DNA를 포함하는 딸 세포의 군집으로 구성되는 세포주 또는 클론을 확립하는 진핵 세포의 능력에 의해 입증된다.
열 유도성 프로모터
어떠한 적합한 열 유도성 프로모터도 본 발명을 수행하는 데에 사용될 수 있는데, 그의 예로는 HSP70 프로모터, HSP90 프로모터, HSP60 프로모터, HSP27 프로모터, HSP25 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 성장 정지 또는 DNA 손상 유전자 프로모터 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면 US 특허 제7,186,698호; 7,183,262호; 및 7,285,542호를 참조하고; 또한 문헌 [I. Bouhon et al., Cytotechnology 33:131-137 (2000)] (gad 153 프로모터)]을 참조하라.
이동-유발 시토카인
다양한 이동-유발 시토카인(pro-migratory cytokine) ("줄기 세포-유인성 케모카인"으로도 지칭될 수 있음) 및 그를 코딩하는 핵산들이 알려져 있어서, 본 발명을 수행하는 데에 사용될 수 있다. 예로는 TNF-알파, 기질 세포-유래 인자 1알파 (SDF-1알파), 종양-연관 성장 인자, 전환 성장 인자 알파, 섬유모세포 성장 인자, 내피 세포-유래 화학유인물질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 줄기 세포 인자 (SCF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF) 및 인테그린이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면 US 특허 제8,569,471호를 참조하라 (모두 포유동물, 예컨대 인간일 수 있음).
혈액-뇌 장벽 개방제
다양한 작용제들이 뇌 조직으로 가는 혈액에 투여된 치료제 또는 진단제의 전달을 강화하는 데에 유익한 방식으로 혈액-뇌 장벽을 개방하는 것으로 알려져 있다. 그와 같은 작용제의 예에는 브라디키닌, 트롬빈, 엔도텔린-1, 물질 P, 혈소판 활성화 인자, 시토카인류 (예컨대 IL-1알파, IL-1베타, IL-2, IL-6, TNF알파), 대식세포 염증 단백질 (예컨대 MIP-1, MIP-2) 및 보체-유래 폴리펩티드 C3a-desArg로 이루어진 군에서 선택되는 개방 단백질 또는 펩티드가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
치료제
본 발명을 수행하는 데에 사용될 수 있는 다양한 여러 치료제 (일반적으로 단백질 또는 펩티드 치료제) 및 그것을 코딩하는 핵산들이 알려져 있다. 일반적으로, 그와 같은 작용제들은 독소, 독소의 단편, 약물 대사 효소, 세포자멸사 유도제 등이다. 구체적인 예로는 박테리아 독소, 식물 독소, 진균 독소 및 이들의 조합; 키나제; 및 세포자멸사 유도제 예컨대 PUMA; BAX; BAK; BcI-XS; BAD; BIM; BIK; BID; HRK; Ad E1B; ICE-CED3 프로테아제; TNF-관련 세포자멸사-유도 리간드 (TRAIL); SARP-2; 및 아포틴 (이들의 활성 단편 포함)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로는 US 특허 출원 공개 제20130310446호를 참조하고; 또한 US 특허 제8,450,460호; 7,972,812호; 7,736,637호; 및 5,763,233호를 참조하라.
재조합 핵산 및 벡터
상기한 바와 같은 프로모터가 상기한 바와 같은 이동-유발 시토카인, 혈액 뇌 장벽 개방제 또는 치료제를 코딩하는 핵산과 작동가능하게 연관되는 재조합 핵산의 제조를 위한 기술에 대해서는 알려져 있다. 예로는 무넨(Moonen)의 US 특허 제7,186,698호 및 리(Li) 등의 US 특허 제7,183,262호에 기술되어 있는 것들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그와 같은 재조합 핵산이 삽입되거나, 라이게이션되거나 또는 달리 연관될 수 있으며 본 발명을 수행하는 데에 유용한 벡터들 역시 알려져 있다. 예로는 DNA 바이러스 벡터, RNA 바이러스 벡터, 플라스미드, 탄도 입자(ballistic particle) 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
줄기 세포 및 형질전환된 줄기 세포
줄기 세포는 상기한 바와 같은 벡터를 사용하여, 또는 그의 사용 없이 임의의 적합한 수단에 의해 안정하게, 또는 일시적으로 재조합 핵산으로 형질전환될 수 있다. 적합한 줄기 세포, 그리고 그의 형질전환을 위한 방법 및 벡터, 증식, 제제화 및 투여에 대해서는 알려져 있다. 예로는 US 특허 제6,368,636호; 6,387,367호; 7,022,321호; 8,034,329호; 8,057,789호; 8,216,566호; 및 8,518,390호에 제시되어 있는 것들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 줄기 세포는 임의의 적합한 조직 또는 생물학적 유체, 예컨대 태반, 양수, 혈액, 제대혈 등으로부터 수집될 수 있다. 일반적으로, 줄기 세포는 배아, 성인 또는 유도된 만능성 줄기 세포일 수 있는데, 구체적인 줄기 세포의 선택은 예정되는 구체적인 상태 및/또는 조직에 따라 달라진다.
제약 제제, 투약량 및 투여
본 발명을 수행하는 데에 사용하기 위한 줄기 세포 (비제한적으로 상기한 것들 포함)은 공지의 기술에 따라 제약상 허용되는 담체 중에서의 투여용으로 제제화될 수 있다. 예를 들면 문헌 [Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9th Ed. 1995)]을 참조하라. 비경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 활성 화합물(들)의 멸균된 수성 및 비-수성 주사 용액을 포함하는데, 상기 제제는 바람직하게는 예정된 수용자의 혈액과 등장성이다. 이러한 제제는 임의적으로 항-산화제, 완충제, 정균제, 그리고 제제가 예정된 수용체의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있다. 수성 및 비-수성인 멸균 현탁액은 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다.
줄기-세포 함유 제약 제제의 비경구 투여는 비제한적으로 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내 및 복막내 주사를 포함한 임의의 적합한 경로를 통할 수 있다. 임의의 특정 투여에서 전달되는 줄기 세포의 수는 다양한 인자들, 예컨대 투여되는 줄기 세포의 유형, 대상체의 연령, 체중 및 상태, 치료되는 조직 및 이상 등에 따라 달라지게 되지만, 일반적으로는 1백만, 5백만 또는 1000만개의 세포 내지 10억, 50억, 100억 또는 500억개의 세포 또는 그 이상이 되게 된다.
치료 조직
신행물 및 비-신생물을 포함한 매우 다양한 여러 조직들이 알려져 있는 줄기 세포 치료의 표적이다. 예를 들면, 문헌 [V. Segers and R. Lee, Stem-cell therapy for cardiac disease Nature 451, 937-942 (2008)]; [S. Kim and J. de Vellis, Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review, J. Neurosci . Res. 87, 2183 (2009)]; [A. Caplan, Review: Mesenchymal Stem Cells: Cell-Based Reconstructive Therapy, in Orthopedics, Tissue Engineering, 11, 1198-1211 (2005)] 등을 참조하라.
따라서, 상기에서 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서 치료를 위한 조직은 신생물 또는 암 조직으로써, 그의 예로는 뇌암 조직 또는 종양 (예컨대 신경아교종 예컨대 다형성 교모세포종, 수막종, 뇌하수체 선종, 신경초 종양 등), 유방암 조직 또는 종양, 피부암 조직 또는 종양 (예컨대 흑색종, 기저 세포 피부암, 편평 세포 피부암 등), 전립선암 조직 또는 종양, 폐암 조직 또는 종양, 난소암 조직 또는 종양, 결장암 및 결장직장암 조직 또는 종양, 췌장암 조직 또는 종양 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 실시양태에서, 치료를 위한 조직은 비-신생물 또는 비-암 조직이나, 줄기 세포 치료에 적합한 손상되거나 질환에 걸린 조직이다. 그와 같은 조직의 예에는 중추 신경, 말초 신경, 망막, 골격근, 심근, 표피, 간, 췌장, 골격, 내분비 및 외분비 조직 (예를 들면 상기언급된 조직이 급성 손상, 무산소성 손상, 대사 질환 또는 자가면역 질환에 걸린 경우)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 예에는 급성 또는 만성 뇌 손상, 급성 척수 손상, 심장 손상, 조혈, 대머리, 치아 결손, 난청, 실명 및 시각 손상, 운동 뉴런 질환, 이식편 대 숙주 질환, 크론병, 신경 및 선천성 행동 결함, 당뇨병 등을 치료하는 것이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
선택된 조직의 가열
선택된 조직을 (열-유도성 프로모터와 작동가능하게 연관되는 유전자의 발현을 유도하기에 충분하게) 가열하는 구체적인 방식은 치료되는 구체적인 조직 또는 표적 조직에 따라 달라지게 된다. 일반적으로, 선택적으로 가열하는 단계는 초음파, 레이저, 고주파, 마이크로파 또는 수조에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 무넨의 US 특허 제7,186,698호 및 리 등의 US 특허 제7,183,262호를 참조하라. 따라서, 깊은 조직 (예컨대 뇌 또는 다른 내부 기관에 위치되는 것)의 경우, 국재화되거나 선택되는 가열이 침습성 또는 비-침습성으로 수행될 수 있다. 적합한 대안에는 히트 팁(heat tip)이 구비된 카테터, 광선 또는 레이저 광선이 안내될 수 있는 광학 가이드가 구비된 카테터 (예컨대 적외선 광) 및 집중식 초음파 (다양한 여러 유형의 장치들 중 어느 것에 의해 전달될 수 있음; 예를 들면 US 특허 제5,928,169호; 5,938,608호; 6,315,741호; 6,685,639호; 7,377,900호; 7,510,536호; 7,520,856호; 8,343,050호 참조)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 선택된 조직이 가열되는 정도는 구체적인 프로모터의 선택, 가열 기간, 및 가열에 선택된 조직과 같은 인자들에 따라 달라지게 되지만, 일반적으로는 1, 5, 10 또는 15분 또는 그 이상 동안 약 1 또는 2 ℃ 내지 5 또는 6 ℃까지일 수 있다.
혈액-뇌 장벽 투과도의 강화
혈액-뇌 장벽 투과도를 강화하는 것은 계속되는 목표로써 (예컨대 US 특허 제8,349,822호 참조), 본원에서 기술되는 물질 및 방법이 혈액-뇌 장벽 투과도를 강화하는 방법에 사용 또는 적용될 수 있다. 그를 필요로 하는 대상체에서 선택된 뇌 조직의 혈액-뇌 장벽 투과도를 증가시키는 이와 같은 방법은 일반적으로 하기를 포함한다: (a) 뇌 조직으로 이동하는 줄기 세포를 대상체에게 비경구로 투여하는 단계로, 상기 줄기 세포는 재조합 핵산을 함유하며, 상기 재조합 핵산은 열-유도성 프로모터와 작동가능하게 연관되는 장벽-개방 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단계; 및 (b) 다음에, 상기 선택된 뇌 조직에서 혈액-뇌 장벽의 투과도를 증가시키는 데에 효과적인 양으로 상기 장벽-개방 단백질 또는 펩티드의 발현을 유도하기에 충분하도록 상기 선택된 뇌 조직을 선택적으로 가열하는 단계 (예컨대 이렇게 함으로써, 비제한적으로 본원에서 기술되는 바와 같은 예비컨디셔닝 또는 치료용 줄기 세포, 또는 치료용 항체 및 화학치료제와 같은 다른 활성 작용제를 포함한 활성 치료제 또는 진단제의 선택된 조직으로의 동시 또는 차후의 전달이 강화됨).
예를 들면, 줄기 세포 (및 선택적 가열)는 상기 대상체에서의 치료제 약물의 세포독성 효과를 증가시키는 데에 효과적인 양으로 투여될 수 있으며, 상기 방법은 추가적으로 대상체에게 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 강화된 BBB 투과도가 유리하게 되는 임의의 적합한 치료제가 사용될 수 있는데, 그의 예로는 치료용 줄기 세포 (비제한적으로 상기한 것들 포함), 단백질 및 펩티드 치료제 또는 진단제 (예컨대 진단 및 치료용 단일클론 항체 (그의 활성 결합 단편 포함)), 또는 화학치료용 약물이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 예로는 테모졸로미드 ("Tmz"), VP-16, 파클리탁셀, 카르보플라틴, 종양 괴사 인자-관련 세포자멸사-유도 리간드 ("TRAIL"), 트로글리타존 ("TGZ"), 피오글리타존 ("PGZ"), 로시글리타존 ("RGZ"), 그리고 시글리타존 ("CGZ"), 프로카르바진, 빈크리스틴, BCNU, CCNU, 탈리도미드, 이리노테칸, 이소트레티노인, 이마티닙, 에토포시드, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨린, 플루오로우라실, 히드록시우레아, 빈블라스틴 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 줄기 세포의 조성, 투약량 및 투여, 그리고 가열은 상기한 바와 같을 수 있으며, 다른 치료 또는 진단 활성 작용제의 조성, 투약량 및 투여는 통상의 기술자가 알고 있을 구체적인 작용제 또는 그의 변이를 위한 공지의 기술에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면 US 특허 제8,450,460호를 참조하고; 또한 US 특허 제8,628,778호; 8,580,258호; 8,449,882호; 8,445,216호; 8,409,573호; 5,624,659호; 및 5,558,852호를 참조하라.
하기의 비-제한적인 실시예에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 재료 및 방법
저캣 ( Jurkat ) 및 B16F10 흑색종 세포의 형질도입. 젠타겟(Gentarget), Inc 사 (캘리포니아 샌디에고 소재)에서 바이러스 입자를 맞춤 생성시켰다. 20 마이크로리터의 입자 (1×107 IFU/ml) (1:1 비로 폴리브렌과 혼합)를 24-웰 플레이트에서 세포와 접촉시키고, 60분 동안 원심분리하였다 (32 ℃에서 1200 RPM). 이후, 세포를 정상 세포 배양 조건 (37 ℃/5 % CO2)하에서 밤새 인큐베이팅하였다. 성공적인 바이러스 형질도입은 구성적 RSV 프로모터에 의해 추진되는 RFP의 발현에 의해 확인하였다. 바이러스 감염 확인 후, PCR 열 사이클러 (T-그래디언트(T-gradient), 바이오메트라(Biometra))를 사용하여 적절한 시간 길이 (예컨대 5-50분) 동안 적절한 온도 (37 ℃-45 ℃)로 세포를 정밀하게 가열하였다. 표준 방법에 의해 pHSP70 추진 F-Luc/GFP로부터 생성되는 생물발광 및 GFP 신호를 측정하였다. 예를 들면 문헌 [J. Dorsey et at., Mol Cancer Ther . 8(12):3285-3295 (2009)]; [S. Wang et al., Cancer Biol. Ther. 6(10):1649-53 (2007)]을 참조하라.
재조합 줄기 세포. (a) 반딧불이 루시페라제 (F-Luc), 및 줄기 세포 이동을 유인할 수 있는 여러 시토카인들의 발현을 추진하는 열-유도성 HSP70 프로모터, 및 (b) 적색 형광 단백질 (RFP) 및 임의적으로 블라스티시딘 선택 마커 (BSD)의 발현을 추진하는 RSV 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 발현 플라스미드 pLenti-Hsp70(F-Luc-2A-시토카인)-RSV(RFP-BSD)를 구축하였다. 이와 같은 연구에서 사용된 유인성 시토카인에는 종양 괴사 인자 알파 (TNFα), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 전환 성장 인자 베타 1 (TGFβ1)이 포함되었다. 일반적인 RSV 프로모터 조절하의 RFP 리포터 및 BSD를 사용하여 유동 세포측정법 또는 블라스티시딘 (BSD) 항생제를 통해 장기간 발현에 대하여 형질도입된 세포를 분류 및/또는 선택하였다. 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC) 또는 래트 자연 줄기 세포 (rNSC)에, 렌티바이러스 벡터 (젠타겟 사, 캘리포니아 샌디에고 소재)를 사용하여 이와 같은 구축물을 형질도입하였다. 간단하게 말하자면, 줄기 세포를 웰 당 1×104개의 세포로 24-웰 플레이트에 접종하고, 밤새 성장시켰다. 배지를 새로운 가온된 완전 배지 (0.5 ml)로 교체한 후, 이어서 적절한 양의 렌티바이러스 용액을 첨가함으로써, 원하는 감염 다중도 (MOI)를 수득하였다. 다음에, 34 ℃에서 1시간 동안 800×g로 세포를 원심분리한 다음, 또 다른 72시간 동안 5 % CO2를 함유하는 가습 분위기에서 37 ℃로 유지하였다. 형광 현미경하에서 세포 형광을 조사하였다. 또한, 적절한 양의 블라스티시딘의 첨가에 의해, 형질도입된 세포를 스크리닝하였다. 녹색 형광 단백질을 발현하는 pLenti(GFP)도 NSC 또는 hMSC에 형질도입하였다.
줄기 세포 이동. 줄기 세포의 이동에 대한 여러 시토카인들의 효과를 비교하기 위하여, BD 팔콘 플루오로블록 트랜스웰(FALCON FLUOROBLOK TRANSWELL) 챔버 시스템을 사용하여 시험관내 세포 이동 분석을 수행하였다. pLenti-Hsp70(F-Luc-2A-시토카인)-RSV(RFP-BSD)로 형질도입된 hMSC를 T-75 플라스크에서 60-80 % 융합도까지 성장시켰다. 세포를 트립신처리하고, 무-혈청 DMEM에 현탁한 후, 2개 분취량으로 분할하였다. 또 다른 분취량을 대조로서 37 ℃에서 인큐베이팅하면서, 1개 분취량의 줄기 세포를 열 블록 (HB), 초음파 (US) 또는 적외성 광 램프 (IR)에 의해 20분 동안 43 ℃까지 약하게 가열하였다. 700 μl의 무-혈청 DMEM에 희석된 총 20,000개의 열-유도 hMSC를 24-웰 챔버의 저부 구획의 웰에 접종하고, GFP를 발현하는 hMSC (~5×103개)를 상부 구획에 삼중으로 접종하였다. 열 유도가 없으며 무-혈청 DMEM에 현탁된 줄기 세포를 음성 대조로서 저부 구획의 웰에 접종하였다. 상기 트랜스웰 시스템을 CO2 인큐베이터에서 인큐베이팅하고, 인큐베이션 48시간 후, 형광 현미경하에서 저부 구획으로 이동된 세포를 계수하였다.
실시예 2: 신경 줄기 세포의 종양 향성
트랜스웰 플레이트 (8 ㎛ 세공)를 사용하여 GBM 세포주로부터 컨디셔닝된 배지 (24시간 동안)에 반응하는 GFP-발현 신경 줄기 세포 (NSC, 캐나다 밴쿠버 소재 스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies) Inc)의 이동 능력을 측정하였다. 이와 같은 분석은 NSC가 시험관 내에서 GBM 향성을 나타낸다는 것을 표시하였다 (도 1a). 이와 같은 반응이 생체 내에서도 발생하는지를 확인하기 위하여, 무흉선 누드 마우스에 DsRed를 발현하는 인간 GBM 종양 세포를 주사하였다. 종양 이식 7일 후, 5×105개의 GFP-발현 NSC를 종양으로부터 2 mm에 이식하였다. 종양 주사-후 15일차에 동물들을 희생시키고, PFA (4 %)에 뇌를 고정한 후, 분석하였다. 이와 같은 분석은 NSC가 생체 내에서도 GBM 향성을 나타낸다는 것을 표시하였다 (도 1b). 이러한 분석의 결과는 중간엽 줄기 세포 (MSC) 및 NSC를 포함한 줄기 세포가 생체 내에서 GBM 향성을 나타낸다는 것을 입증하고 있는 이전의 결과들과 일치한다 (문헌 [I. Germano et al., J. Neurosurg . 105(1);88-95 (2006)]; [J. Dorsey et al., Mol . Cancer Ther . 8(12):3285-3295 (2009)]; [A. Ashkenazi et al., J. Clin . Invest. 104(2):155-162 (1999)]; [D. Lawrence et al., Nat, Med . 7(4):383-385 (2001)]; [H. Walczak, et al., Nat. Med . 5(2):157-163 (1999)]; [A. Panner et al., Mol . Cell Biol . 25(20):8809-8823 (2005)]; [K. Aboody et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97(23):12846-12851 (2000)]; [S. Benedetti et al., Nat. Med . 6(4):447-450 (2000)]; [F. Davis et al., J. Neurosurg . 88(1):1-10 (1998)]; [L. Sasportas et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 106(12):4822-4827 (2009)]; [M. Ehtesham et al., Expert Rev. Neurother. 3(6):883-895 (2003)]; [P. Kabos et al., Expert Opin . Biol . Ther . 3(5):759-770 (2003)]; [M. Ehtesham et al., Cancer Res. 62(24);7170-7174 (2002)]; [A. Birbrair et al., PLoS One. 6(2):e16816 (2011)]; [A. Birbrair et al., Stem Cell Res. 10(1):67-84 (2013)]; [A. Birbrair et al., Exp. Cell Res. 319(l):45-63]).
실시예 3: 시험관 내에서의 pHSP70의 조절 발현
HSP70 발현은 고도로 조절되며, 비-독성인 약한 가열을 통하여 유도될 수 있다 (문헌 [G. Li & J. Mak, Cancer Res. 45(8):3816-3824 (1985)]; [J. Landry et al., Cancer Res. 42(6):2457-2461 (1982)]; [J. Landry et al., Int . J. Radiat . Oncol. Biol . Phys. 8(1):59-62 (1982)]; [J. Subjeck & T. Shyy, Am. J. Physiol . 250(1 Pt 1):C1-17 (1986)]; [S. Flanagan et al., Am. J. Physiol . 268(1 Pt 2):R28-32 (1995)]; [K. Kregel et al., J. Appl . Physiol . 79(5):1673-1678 (1995)]; [K. Diller, Annu . Rev. Biomed . Eng . 8:403-424 (2006)]). 따라서, HSP70은 공간 및 시간적으로 조절되는 방식으로 생체 내에서 치료제 발현을 비침습성이고도 인공적으로 조절하는 데에 사용될 수 있는 것으로 인정된다. 이에 따라, 구축물 통합의 확인을 위한 구성적으로 발현되는 적색 형광 단백질 (RFP) 리포터와의 조합으로써 pHSP70-조절 반딧불이 루시페라제 (F-Luc) 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 리포터 유전자를 동시에 발현하도록 설계된 바이러스 구축물을 제조하였다 (도 2a). pLenti-pHSP70:FLuc/GFP-pRSV:RFP로 지칭되는 이와 같은 벡터를 사용하여, 젠타겟, Inc 사 (캘리포니아 샌디에고 소재)에서 바이러스 입자를 맞춤 생성시킨 후, 저캣 세포에 감염시켰다. PCR 열 사이클러 (T 그래디언트, 바이오메트라)에서 다양한 온도로 30분 동안 세포를 가열한 후, 정상 세포 배양 조건하에서 96-웰 플레이트에 18시간 동안 재플레이팅하였다. 이후, 세포를 루시페린에 노출시키고, 리포터 단백질 발현을 분석하였다. 결과는 HSP70-추진 루시페라제 발현이 확실하게 온도에 대하여 의존성이며, 저캣 세포에서는 43-44 ℃에 최대라는 것을 나타내었다 (도 2b). HSP70-추진 유전자 발현의 시점을 확인하기 위하여, pLenti-pHSP70:FLuc/GFP-pRSV:RFP를 저캣 (도 3a) 및 B16F10 흑색종 (도 3b) 세포에 형질도입한 후, 가변적인 시간 길이 동안 43 ℃로 가열하였다. 이와 같은 분석의 결과는 열 노출 시간이 증가하면서 생물발광 신호의 증가가 수득된다는 것을 표시하였다. 신호는 30-40분에 최고였으며, 이후 감소하였는데, 가열 시간 길이가 50분을 초과함에 따른 생존력 감소에 기인하는 것일 가능성이 있다.
줄기 세포에서의 pLenti-pHSP70;FLuc/GFP-pRSV:RFP의 사용을 입증하기 위하여, NSC에 바이러스 벡터를 형질도입하고, 약한 가열 (30분 동안 43 ℃)에 반응하는 pHSP70-추진 루시페라제 발현을 측정하였다 (도 4). 이와 같은 분석은 줄기 세포에서 이중 프로모터 설계가 사용될 수 있으며, 그에 따라 종양-향성 치료용 비히클로 사용될 수 있음을 확인해 주었다.
실시예 4: 이식된 세포에서의 생체 내 HSP70 -추진 반딧불이 루시페라제 발현
고강도 집속 초음파 (HIFU)는 비-독성인 온도 (~43 ℃)로 종양 및/또는 둘러싸고 있는 정상 조직을 약하게 가열하는 비-침습성인 전환 방식이다. 수많은 모델 시스템을 사용하여 비-독성인 온도로 정밀하게 정상 뇌 조직을 포함한 조직을 가열하는 HIFU의 능력이 입증되어 있다 (문헌 [B. O'Neill et al., J. Magn . Reson . Imaging 35(5):1169-1178 (2012)]; [B. O'Neill et al., Ultrasound Med . Biol . 35(3):416-424 (2009)]; [K. Hynynen et al., J. Acoust . Soc . Am. 132(3):1927 (2012)]; [K. Hynynen & J, Sun, IEEE Trans. Ultrason . Ferroelectr . Freq . Control. 46(3):752-755 (1999)]). 따라서, 자기 공명 열측정법 (MRT)-안내 HIFU가 안정하게 생체 내에서 재조합 줄기 세포를 비-침습성으로 가열함으로써 pHSP70-추진 형질도입 유전자 발현을 유도하는 데에 사용될 수 있음이 확인되었다. 본 분석에서는, pLenti-pHSP70:FLuc/GFP-pRSV:RFP를 사용하여 B16 흑색종 세포를 안정하게 감염시킨 후, 이어서 마우스에 이식하였다. HIFU를 사용하여 종양 조직을 약하게 가열한 후, 생물발광 신호를 측정하였다. 이와 같은 분석은 HIFU 유도 8시간 후 매우 특이적이고 강한 생물발광 신호 유도가 관찰되었음을 표시하였다 (도 5). 반면, 가열되지 않은 종양은 유의성 있는 루시페라제 신호를 나타내지 않음으로써, 이와 같은 접근법의 특이성을 표시하였다.
피하 실험에 더하여, 형질도입된 B16 세포를 래트 뇌에 두개내 이식하고, 이식 7일 후, MR 열측정법의 안내를 동반한 HIFU를 사용하여 이식된 세포를 가열하였다. 래트 사체의 분석은 MR 열측정법-안내 HIFU 처리 프로토콜이 두개내 세포를 성공적으로 가열함으로써, 생물발광 신호로 나타나는 바와 같이 F-Luc 리포터의 발현을 유도한다는 것을 표시하였다 (도 6a 및 6b). 이러한 데이터는 MRT가 HIFU의 조정을 위한 피드백으로 작용함으로써 거의 일정한 목표 온도를 유지할 수 있다는 것을 입증하고 있다.
MRT-안내 HIFU가 생체 내에서 사용될 수 있다는 것이 확립되었으므로, 안정하게 리포터 구축물 pLenti-pHSP70:FLuc/GFP-pRSV:RFP를 발현하는 이식된 B16F10 흑색종 세포에서 HIFU-유도 HSP70 추진 루시페라제 유전자 발현을 분석하였다. 형질도입된 B16F10 세포 (5×105개 세포)를 무흉선 누드 래트의 우측 전두엽에 정위 이식하고, 이식 7일 후, MRI-안내 HIFU를 사용하여 43 ℃로 30분 동안 종양을 가열하였다. HIFU-유도 8 및 48시간 후, 래트를 생물발광에 대하여 영상화하였다 (도 7a 및 7b). 생물발광의 정량 (도 7c)은 두개내 환경에서 영상-안내 HIFU를 사용하여 리포터 유전자를 유도하는 것의 실현가능성 및 특이성을 표시해주었다.
실시예 5: HSP70 -추진 sTRAIL 발현 및 생체 내 효능
GBM은 그의 공격적인 특성은 물론, 그것이 잠재적인 치료제에 제공하는 저조한 접근성으로 인하여, 침습성인 치명적 암이다. 전신성으로 투여된 치료제는 통상적으로 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 유의성 있게 침투함에 있어서 제한된 능력을 가짐으로써, 중추 신경계 (CNS)에서 치료 수준에 도달하기 전에 높은 전신성 독성의 가능성을 초래한다. 국소적 전달과 같은 다른 접근법은 종종 종양에 인접한 정상 뇌 조직에서 균일하게 도달되는 높은 농도로 인하여, 일관성 없는 전달 및 높은 국소적 독성을 겪게 된다 (문헌 [S. Kunwar et al., Neuro . Oncol . 12(8);871-881 (2010)]; [J. Sampson et al., J. Neurosurg . 113(2):301-309 (2010)]). 반면, 종양-향성 세포-기반 치료법은 원발성 종양에서, 또는 침윤성 종양 세포에 인접하여 응집하는 그의 경향으로 인하여, 고농도의 치료제를 종양 미세환경으로 전달할 수 있다 (문헌 [S. Kidd et al., Stem Cells 27(10):2614-2623 (2009)]; [A. Nakamizo et al., Cancer Res. 65(8):3307-3318 (2005)]). 그러나, 치료제의 구성적 발현에 의존하는 세포-기반의 전략은 비-종양 조직을 잠재적으로 독성인 치료제에 노출시킬 가능성을 가지고 있다. 이는 치료제가 전신성으로 전달되는 경우에 특히 그러한데, 많은 수의 세포가 정상 조직을 통하여 이동하는 것으로 입증되어 있기 때문이다 (문헌 [S. Kidd et al., Stem Cells 27(10):2614-2623 (2009)]). 비교하자면, 본 발명은 영상 안내를 통하여 일시적으로 표적화되는 종양 및 종양주위 영역에서만 강력한 항-암 치료제를 발현하도록 재조합 줄기 세포를 활성화하는 (예컨대 HSP70 프로모터를 통함) 영상-안내 HIFU의 사용을 포괄한다. 도 8을 참조하라. 유리하게도, 인간 두개골을 통하여 시술자가 선택하는 깊이까지 HIFU를 전달하는 기술은 다른 적용분야의 임상에서 사용되어 왔다 (문헌 [R. Medel et al., Neurosurgery 71(4):755-763 (2012)]).
치료제를 전달하기 위한 HIFU 원격 활성화 플랫폼의 사용을 입증하기 위하여, 가용성 TRAIL (sTRAIL)을 GBM의 치료를 위한 모범 치료제로 사용한다. sTRAIL을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 렌티바이러스 구축물에 삽입하여 (a) HSP70 프로모터 조절하의 sTRAIL, 및 (b) 영상화 리포터로서의 F-Luc을 동시에 발현하는 pLenti-pHSP70:sTRAIL/FLuc-pRSV:RFP (도 9)를 생성시킨다. 또한, 구축물은 RFP를 상시적으로 발현함으로써, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용한 sTRAIL 발현 세포의 보강을 가능케 한다. 이와 같은 구축물을 사용하여, 다양한 유형의 줄기 세포들 (예컨대 MSC 및 NSC)을 치료용 바이러스 구축물로 감염시킨다. pHSP70-조절 발현 및 세포 생존력을 최대화하기 위하여, 서로 다른 온도에서 세포를 유도한다. 줄기 세포에서의 치료제 유도 (가열 8 및 24시간 후)를 평가하기 위하여, 웨스턴 블럿 분석은 물론, 유도되는 F-Luc 발현에 기인하는 생물발광 신호를 통하여 분비되는 sTRAIL의 발현을 측정한다. 또한, 표준 열량측정 MTS/PMS 검정 (프로메가(Promega))을 사용하여 pLenti-pHSP70:sTRAIL/FLuc-pRSV:RFP로 형질도입된 줄기 세포로부터 수득되는 sTRAIL-함유 배지의 시험관 내 항-종양 활성을 측정한다 (문헌 [A. Mintz et al., J Neurooncol . 64(1-2):117-123 (2003)]; [A. Mintz et al., Neoplasia 4(5):388-399 (2002)]; [V. Nguyen et al., Translational Oncology 4(6):390-400 (2011)]; [V. Nguyen et al., Neuro -Oncology 14:1239]). sTRAIL을 발현하는 가열된 줄기 세포는 GBM 세포를 사멸시키게 될 것으로 예상된다. 사실상, NSC는 sTRAIL을 발현하여 배지로 분비함으로써 GBM 세포를 사멸시키도록 형질도입될 수 있다는 것이 밝혀졌다 (도 10a-10c). sTRAIL 발현이 GBM으로의 종양-향성 이동을 변경시키지는 않는다는 것을 확인하기 위하여, 본원에서 기술되는 트랜스웰 방법을 사용하여 확립되어 있는 GBM 세포주들 (예컨대 U251, U87, G48a)에서 컨디셔닝된 배지 중 형질도입된 NSC 및 MSC의 이동을 시험하였다.
생체 내 분석에는, 침습성 동소 GBM 종양을 보유하는 래트를 사용한다 (문헌 [G. Kitange et al., J Neurooncol . 92(1):23-31 (2009)]; [J. Sarkaria et al., Mol Cancer Ther . 6(3):1167-1174 (2007)]; [J. Sarkaria et al., Clin . Cancer Res. 12(7 Pt 1):2264-2271 (2006)]). 이와 같이 임상적으로 관련된 모델은 누드 마우스 또는 래트의 옆구리에 대한 환자 종양 시편의 직접적인 이식을 포함한다. 이러한 종양은 제거된 후, 이후의 설치류 옆구리에서의 연속 계대에 의해 확장/유지된다. 예시를 하자면, 10 μL의 PBS 중 1×106개의 인간 GBM 세포를 무흉선 래트에 두개내 이식하였다. 천두공을 통하여 3.5 mm 깊이로 삽입되는 30-게이지 니들이 구비되며 디지털 정위 장치 (데이비드 코프 인스트루먼츠(David kopf Instruments) 사, 캘리포니아 투융가 소재) 상에 장착되는 10 μL 주사기 (해밀턴(Hamilton) Co. 사, 네바다 리노 소재)를 사용하여 정위 주사를 수행하였다. 외과용 드릴 (하버드 아파라투스(Harvard Apparatus) 사, 메사추세츠 홀리스톤 소재)을 사용하여 두피 절개를 통해 중앙선의 1.5-2 mm 좌측 및 관상 봉합 1-1.5 mm 후방에 5 mm 천두공을 생성시켰다. 주사 속도는 2 μL/분이었으며, 주사 완료 60초 후, 바늘을 철회하고, 절개부를 봉합하였다. 두개내 종양 이식 대략 25일 후, 7 테슬라(Tesla) 소형 동물 MRI 시스템 (브루커 바이오스핀(Bruker BioSpin) 사, 독일 에틀링거 소재)을 사용하여 각 동물을 영상화하였다 (도 11). 대조 가중를 위하여, 5-7초 기간 동안의 꼬리 정맥 주사 (0.05-2.5 mmol/kg)를 통한 Gd-DTPA 투여 후, T1-가중 영상을 수득하였다. 이와 같은 분석은 인간 GBM 종양이 래트 뇌에서 생성될 수 있음을 표시하였다.
모니터링을 용이하게 하기 위해서는, 두개내 종양 형성이 생물발광에 의해 측정하였을 때 비-침습성이 되도록, 레닐라 ( Renilla ) 루시페라제 (바이러스 입자는 캘리포니아 샌디에고 소재 젠타겟 사로부터 구매)를 발현하는 GBM 세포를 사용한다. 레닐라 루시페라제 (RLuc)는 F-Luc 리포터의 pHSP70-유도를 영상화하는 데에 사용되는 루시페린 기질과는 구별되는 코엘렌테라진을 촉매촉진한다. 서로 다른 기질의 사용으로 인하여, 이러한 구별되는 루시페라제들은 2개의 별도 과정 (F-Luc은 줄기 세포에서의 pHSP70 활성화에 대하여, 그리고 R-Luc은 종양 세포 성장에 대하여)을 사용하여 평가된다. 침습성 동소 GBM 종양을 보유하는 래트에 종양 이식 및 종양 성장의 영상화 확인 (생물발광 및/또는 MRI) ~20일 후 sTRAIL을 발현하도록 형질전환된 줄기 세포를 주사한다. sTRAIL을 분비하는 줄기 세포의 항-종양 효과는 이식된 종양 대비 다양한 위치에 다양한 양의 재조합 줄기 세포 (1-10×106개)를 주사하는 것에 의해 측정한다. 예를 들면, FACS를 통하여 sTRAIL 또는 대조를 발현하도록 (리포터 구축물로 형질도입됨) 보강된 재조합 줄기 세포를 종양 이식과 동일한 주사 부위 및 좌표를 사용하여 종양에 직접적으로 주사한다. 이는 항-종양 효능, 그리고 치료 효과를 보기 위하여 종양 부위에서 필요로 하는 세포의 최소 수를 입증한다. 또한, 별도의 래트 군의 종양 부위의 반대쪽 종양 부위로부터 3 mm에 대칭으로 재조합 줄기 세포 (또는 대조)를 주사한다. 줄기 세포 이식 48시간 후, HIFU를 사용하여 대략 43 ℃로 표적 부위를 가열한다. 엄격하게 조절되는 HIFU 가열을 수행하기 위하여, MRI/MR 열측정법-안내 HIFU 시스템 (RK100, 캐나다 토론토 소재 FUS 인스트루먼츠(Instruments) Inc.)을 사용하여 고전력 초음파 에너지를 pHSP70 유도 동안 래트 뇌로 전달한다. 상기 시스템은 두개내 치료법, 약물 전달 및 활성화와 같은 적용분야에서 고-전력 연속 초음파처리 (열 응고) 내지 펄스화 초음파처리 범위의 초음파 노출을 전달할 수 있다. 시스템 프로브는 1 MHz의 중심 주파수, 그리고 직경 1-2 mm 및 길이 5-6 mm 가량의 초점 크기를 가지는 구형의 집중식 초음파 변환기이다. 처리 동안, 지멘스 스키라(Siemens Skyra) 3T 스캐너의 베드 상에서 초점은 래트 우측 상부 두개골 (종양 부위)에 대향하여 위치된다. 초점 부근의 음향 강도 및 HIFU-유도 고열은 조절되며, MR-열측정법을 사용하여 실시간으로 모니터링된다. MR 열측정법은 5초마다의 1.88×1.882×5 mm3의 공간 해상도를 가지는 실시간 온도 매핑을 가능케 한다. MR-열측정법에 의해 비-침습성으로 수득되는 실시간 온도 매핑은 MR 상용성 섬유 광학 열측정기에 의해 추가적으로 보정된다.
pHSP70 활성화는 생물발광 영상화를 통하여 확인하며, sTRAIL 발현은 면역조직화학을 사용하여 확인한다. 생물발광 영상화의 경우, IVIS 생물발광 스캐너 (퍼킨엘머(PerkinElmer))에서의 가열 후 F-Luc 기질인 150 mg/kg의 D-루시페린의 i.v. 주사 직후에 영상화한다. 가열 및 비가열 종양에 대하여 ROI를 도출하고, 정량한다. 생물발광 이외에, HIFU 처리 후 고정된 시점 (0, 12, 24 및 48시간)에 래트의 하위군을 희생시키고, 다색 형광 현미경법을 사용하여 주사된 줄기 세포를 종양 대비 국재화하는데, 줄기 세포는 그의 pHSP70-유도 GFP 이외에도 RFP를 구성적으로 발현하기 때문이다. 유도는 비-활성화 줄기 세포에 의해서도 구성적으로 발현되는 RFP 발현 줄기 세포에 비교한 유도된 GFP 발현 세포의 비를 계산하는 것에 의해 측정한다. 래트의 정상적인 뇌 조직 및 종양에서 43 ℃의 온도는 정밀하게 조절될 수 있을 것으로 예상된다.
활성화된 줄기 세포에 의한 치료제 발현을 확인한 후에는, 종양 성장시 sTRAIL을 발현하는 줄기 세포의 효과 (리포터만으로 형질도입되거나 가열되지 않게 될 대조와 비교)를 평가한다. MRI (매주)에 의한 종양 부피, 생물발광 (매주) 및 생존 (카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석)을 측정하는 것에 의해, 주사 200일 후까지 항종양 효과를 모니터링한다. 또한, 줄기 세포 주사 또는 HIFU 처리에 의해 야기되는 예상치 못한 임상적 결과가 존재하지 않는다는 것을 보장하기 위하여, 치료법 후 3회/주로 동물들을 모니터링한다. HSP70 프로모터 대조하에 sTRAIL을 발현하는 줄기 세포만이 리포터 유전자로 감염된 줄기 세포 또는 가열되지 않은 줄기 세포와 달리 항-종양 활성을 나타내게 될 것으로 예상된다.
실시예 6: 시토카인 생성 및 재조합 줄기 세포 이동의 열적 조절
종양-향성 이동 특성으로 인하여, 줄기 세포는 고립성 종양 및 전이성 질환에 대한 효과적인 표적화 치료의 전달을 위한 비히클로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 인간 중간엽 줄기 세포는 입증가능한 생존상의 장점을 가지는 인터페론 β, S-TRAIL 및 종양용해 바이러스를 포함한 신경아교종에 대한 생물학적 항-신경아교종 작용제를 전달하도록 형질전환된 바 있다. 종양에 대한 줄기 세포 치료법의 치료 효능은 전달 부위로부터 이동하여 종양 영역에 도달하는 줄기 세포의 수에 의존한다. 또한, 줄기 세포 이동은 시토카인 분비에 의해 크게 영향을 받는다. 예를 들면, 중간엽 줄기 세포의 이동은 여러 시토카인/수용체 쌍인 SDF-1/CXCR4, SCF/c-키트, HGF/c-Met, VEGF/VEGFR, PDGF/PDGFR, MCP-1/CCR2 및 HMGB1/RAGE에 따라 달라진다. 기질 세포-유래 인자 1 (SDF-1) 및 그의 수용체 CXC 케모카인 수용체-4 (CXCR4)는 종양으로의 뉴런 줄기 세포 동원의 중요한 매개체이다. 줄기 세포 이동을 유인하기 위하여 종양 조직에서 시토카인 발현을 조절하는 데에는 조작 전략이 사용될 수 있다. 종양 조직으로의 줄기 세포 전달을 강화하는 능력은 치료 효과를 달성하는 데에 요구되는 세포의 수를 상당히 감소시키고, 아마도 환자에게 더 우수한 결과를 제공하게 될 것이다. 이와 관련하여, 본 발명의 조성물 및 방법은 표적 부위에 축적된 줄기 세포에서의 특정 시토카인 생성의 유도를 공간적 및 시간적으로 조절할 수 있다. 생성되는 시토카인은 더 많은 재조합 줄기 세포를 표적 부위로 유인함으로써 효과의 증폭으로 이어지도록 설계될 것이다.
시토카인 생성의 조절을 입증하기 위하여, NSC 및 MSC에 pLenti-HSP70(F-Luc-2A-시토카인)-RSV(RFP-BSD) (도 12a)를 형질도입하고, 블라스티시딘 내성에 대하여 스크리닝하였다. 블사스티시딘-내성 NSC 및 MSC는 영구적으로 적색 형광을 나타내었다 (도 12b). HSP70-추진 시토카인을 코딩하는 재조합 세포를 열 블록, 초음파 또는 적외선 광에 의해 43 ℃로 20분 동안 가열함으로써, 시토카인 (TNFα, VEGF 또는 TGFβ1)의 발현을 유도하였다 (도 13). 이후, 재조합 세포를 트랜스웰 챔버 저부 구획의 웰에 접종하고, GFP를 발현하는 NSC 및 MSC를 상부 구획에 접종하였다. 형광 현미경하에서 저부 구획으로 이동하는 세포를 계수하였다. 도 14에 나타나 있는 바와 같이, 열-유도된 hMSC (즉 시토카인을 발현하는 세포)는 상부 트랜스웰 구획으로부터 플레이트로의 줄기 세포 이동을 유도가 없는 대조 hMSC에 비해 유의성 있게 유인하였다. 유사하게, 열-유도된 NSC (즉 시토카인을 발현하는 세포)는 상부 트랜스웰 구획으로부터 플레이트로의 NSC 이동을 유도가 없는 대조 NSC에 비해 유의성 있게 유인하였다 (도 15).
실시예 7: 제2의 증폭된 치료용 줄기 세포 파동을 유인하는 시토카인의 사용
줄기 세포의 종양-향성 이동은 종양-분비 가용성 인자에 의해 매개된다 (문헌 [A. Belmadani et al., J. Neurosci . 26(12):3182-3191 (2006)]). 따라서, 이러한 이동-유발 인자를 분비하는 재조합 줄기 세포는 종양으로의 제2의 재조합 줄기 세포 파동의 이동을 유도할 수 있다. 따라서, 첫 번째 줄기 세포 파동은 HIFU의 조절하에 줄기 세포 유인성 케모카인/시토카인을 선택적으로 발현하도록 생성된다. 일단 이와 같은 첫 번째 파동이 종양에 도달하고 나면, HIFU를 사용하여 종양 및 그 주변에서 일시적으로 이동-유발 가용성 인자를 발현하도록 줄기 세포를 유도한다. 이와 같이 유도되는 가용성 인자는 결과적으로 종양 단독이 하게 되는 것에 비해 상당히 더 효과적으로 종양 부근으로 제2의 치료용으로 조작된 줄기 세포의 파동을 유인하며, 그에 따라 제2 줄기 세포 파동의 치료 잠재력을 증폭한다. 예시하자면, TNFα가 줄기 세포 이동을 유인하는 시토카인으로 사용되는데, (i) TNFα는 잘 알려져 있는 염증 인자로써, 줄기 세포를 효과적으로 유인하는 것으로 나타난 바 있으며 (문헌 [G. Kitange et al., J. Neurooncol . 92(1):23-31 (2009)]; [J. Sarkaria et al., Mol . Cancer Ther . 6(3):1167-1174 (2007)];[J. Sarkaria et al., Clin . Cancer Res. 12(7 Pt 1):2264-2271 (2006)]), (ii) TNFα는 BBB를 개방하는 잠재력을 가지고 있고 (문헌 [N. Tsao et al., J. Med . Microbiol . 50(9):812-821 (2001)]; [R. Reyes et al., J. Neurosurg . 110(6):1218-1226 (2009)]; [J. Mullin et al., Cancer Res. 50(7):2172-2176 (1990)]; [M. Lopez-Ramirez et al., J. Immunol . 189(6):3130-3139 (2012)]), (iii) pHSP70-조절 구축물이 시험관 내에서 NSC를 사멸시키지 않으면서 NSC 이동을 효과적으로 증가시키기 (도 15) 때문이다. 따라서, TNFα를 코딩하는 첫번째 줄기 세포 파동은 종양으로의 증폭된 제2의 줄기 세포 이동 파장을 유인할 수 있다. TNFα 이외에, 다른 염증 인자 예컨대 SDF-1α (문헌 [K. Carbajal et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 107(24):11068-11073 (2010)]; [J. Imitola et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(52): 18117-18122 (2004)]); 종양-연관 성장 인자, 예컨대 산란 인자/간세포 성장 인자 (SF/HGF), TGFα, 및 섬유모세포 성장 인자 (FGF) (문헌 [0. Heese, et al., Neuro - Oncol . 7(4):476-484 (2005)]); 및 내피 세포-유래 화학-유인제 예컨대 PDGF-BB, 란테스(RANTES), I-TAC, NAP-2, GROα, Ang-2 및 M-CSF (문헌 [N. Schmidt et al., Brain Res. 1268:24-37 (2009)])도 생체 내에서 제2의 치료용 줄기 세포 파동을 유인하는 데에 사용될 수 있는 것으로 인정된다.
TNFα를 발현하는 바이러스로 감염된 세포로부터의 컨디셔닝된 배지를 사용하여 시험관 내에서, 제2 재조합 줄기 세포 파동의 이동 능력을 증폭하는 시토카인의 효과를 입증하였다. HSP 70 프로모터의 조절하에 TNFα를 코딩하는 렌티바이러스를 생성시켰다. pLenti-pHSP70:TNFα/FLuc-pRSV:RFP (도 12a 참조)로 지칭되는 이와 같은 벡터를 SF767 인간 아교 종양 세포에 형질도입하였다. 재조합 SF767 세포를 43 ℃에서 30분 동안 약하게 가열함으로써, TNFα 발현을 유도하였는데, TNFα를 배지로 분비하는 것으로 나타났다 (도 16a). 또한, pLenti-pHSP70:TNFα/F-Luc-pRSV:RFP 벡터로 감염된 이러한 열-활성화 세포로부터 제조되는 컨디셔닝된 배지는 열 유도가 없는 세포로부터의 조절되는 컨디셔닝 배지에 비해 직접적인 NSC 이동을 상당히 증가시키는 것으로 나타났다 (도 16b).
실시예 8: 추가적인 전신성 치료법에 대하여 BBB를 집중적으로 투과화하기 위한 HIFU-유도 시토카인 생성의 사용
GBM 치료에 있어서의 한 가지 장애는 종양-BBB를 통한 치료제의 저조한 침투이다. 시토카인 및 케모카인은 종양-연관 BBB 침투에 대하여 지대한 효과를 가질 수 있어서, 현재는 BBB에 의한 배제로 인하여 GBM을 치료하는 데에 사용되지 않는 효능이 있는 항-암 치료제들의 이용을 가능케 할 수 있는 것으로 나타난 바 있다 (문헌 [N. Tsao et al., J. Med . Microbiol . 50(9):812-821 (2001)]; [R. Reyes et al., J. Neurosurg . 110(6):1218-1226 (2009)]; [J. Mullin et al., Cancer Res. 50(7):2172-2176 (1990)]; [M. Lopez-Ramirez et al., J. Immunol . 189(6):3130-3139 (2012)]). 따라서, GBM 종양 영역에서의 재조합 줄기 세포에 의한 HIFU-활성화 염증-유발 인자 생성은 전신성으로 투여된 약물의 BBB 투과도 및 종양 농도를 상당히 증가시키는 데에 사용될 수 있다. 중요한 것은, 재조합 줄기 세포로부터의 시토카인 발현을 조절하기 위한 엄격하게 조절되는 HIFU 유도가 짧게 생존하며 조절가능한 유도로 인하여 의도하지 않은 부작용을 야기하거나 종양 성장을 촉진할 가능성이 훨씬 더 적게 되도록 함으로써, 이와 같은 접근법을 가능케 한다는 것이다.
반딧불이 루시페라제 (F-Luc) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)의 발현을 추진하는 열-유도성 HSP70 프로모터, 그리고 적색 형광 단백질 (RFP) 및 블라스티시딘 선택 마커 (BSD)의 발현을 추진하는 RSV 프로모터를 포함하는 렌티바이러스 발현 플라스미드인 pLenti-Hsp70(F-Luc-2A-TNFα)-RSV(RFP-BSD) (도 17a)를 구축하였다. 렌티바이러스 벡터 (젠타겟 사, 캘리포니아 샌디에고 소재)에 의한 이와 같은 플라스미드 구축물을 사용한 형질도입에 의해 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 조작하였다. TNFα의 열-활성화 유전자 발현을 확인한 후, 시험관 내에서 수조를 사용하여 온도 및 시간 기간 면에서 최적화하였다. 생체 내 연구를 위해서는, HSP70(F-Luc-2A-TNFα)-RSV(RFP-BSD)를 사용하여 형질도입된 MSC를 무흉선 누드 래트의 뇌에 정위로 이식하였다 (래트 당 1×106개 세포). 세포 이식 2일 후, 반시간 동안의 MRI 안내 하에서의 HIFU에 의해 주사 부위 영역을 43 ℃로 가열함으로써, TNFα 발현을 유도하였다. 루시페린 주사 후, 생물발광에 의해 루시페라제 발현을 모니터링하였다. 48시간 후, 꼬리 정맥에 의한 MRI 조영제 (마그네비스트(Magnevist), 0.125 mmol/kg)의 정맥내 주사 후에, T1-가중 영상에서 BBB의 개방을 확인하였다. HIFU 처리 없이 MSCs-HSP70(Luc-2A-TNFα)가 이식된 래트 및 HIFU 처리를 동반하여 MSCs-HSP70(Luc-2A-GFP)가 이식된 래트를 대조로 사용하였다.
MSC에 pLenti-HSP70(F-Luc-2A-TNFα)-RSV(RFP-BSD)를 성공적으로 형질도입한 후, 블라스티시딘에 의해 스크리닝하였다. 조작된 MSC 세포는 영구적으로 적색 형광을 나타내었다 (도 17b). HSP70-추진 트랜스진 발현은 확실하게 온도 및 시간 기간에 대하여 의존성이었다. 43 ℃에서의 15분 동안의 활성화는 최고의 TNFα 및 F-Luc 발현으로 이어졌다 (도 17c). 다음에는, 조작된 MSC를 래트 뇌에 정위로 이식한 후, 이어서 MRI-안내 HIFU 활성화를 수행하였다. 도 18a에 나타낸 바와 같이, 43 ℃에서의 20분 동안의 HIFU 처리를 동반하여 HSP70(Luc-2A-GFP) 또는 MSCs-HSP70(Luc-2A-TNFα)가 이식된 래트는 HIFU 처리 없이 MSCs-HSP70(Luc-2A-TNFα)가 이식된 래트에 비해 뇌에서 상당히 더 강한 생물발광 신호를 나타내었다. 해당 영역의 정량은 HIFU 활성화 후의 래트 뇌에서의 10배 더 높은 F-Luc 발현을 밝혔다. 생물발광 영상화 후에는, 꼬리 정맥을 통하여 MR 조영제를 주사함으로써, 대조-강화 T1-가중 영상에서 BBB 투과도의 변화를 모니터링하였다. HIFU 처리를 동반하여 MSCs-HSP70(Luc-2A-TNFα)가 이식된 래트 뇌의 표적 영역에서 대조에 비해 상당한 MRI 신호 강화가 관찰되었다 (도 18b). 해당 영역의 정량은 3배 더 높은 MRI 신호 강도를 나타냄으로써, HIFU 처리를 동반하여 MSCs-HSP70(Luc-2A-TNFα)가 이식된 래트 뇌에서의 대조에 비해 MRI 조영제에 대한 증가된 BBB 투과도 (P < 0.01)를 표시해 주었다 (도 19).
전기는 본 발명의 예시로써, 그것을 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 된다. 본 발명은 하기하는 청구범위에 의해 한정되며, 청구범위의 등가물들은 거기에 포함되어야 한다.

Claims (56)

  1. (a) 하기 (b)와 작동가능하게 연관되는 열-유도성 프로모터,
    (b) (i) 줄기-세포 유인성 케모카인 또는 (ii) 혈액-뇌 장벽 개방 단백질 또는 펩티드인 활성 작용제를 코딩하는 핵산
    을 포함하는 재조합 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 열 유도성 단백질 프로모터인 재조합 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 상기 열 유도성 프로모터가 HSP70 프로모터, HSP90 프로모터, HSP60 프로모터, HSP27 프로모터, HSP25 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 성장 정지 유전자 프로모터 및 DNA 손상 유전자 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것인 재조합 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 작용제가 TNF-알파, 기질 세포-유래 인자 1알파, 종양-연관 성장 인자, 전환 성장 인자 알파, 섬유모세포 성장 인자, 내피 세포-유래 화학유인물질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 줄기 세포 인자 (SCF)로 이루어진 군에서 선택되는 줄기-세포 유인성 케모카인이며, 단 상기 재조합 핵산이 그에 의해 형질전환되는 줄기 세포 내에 존재하지 않는 경우 VEGF는 배제되는 것인 재조합 핵산.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 작용제가 브라디키닌, 트롬빈, 엔도텔린-1, 물질 P, 혈소판 활성화 인자, 시토카인류, 대식세포 염증 단백질 및 보체-유래 폴리펩티드 C3a-desArg로 이루어진 군에서 선택되는 혈액-뇌 장벽 개방 단백질 또는 펩티드인 재조합 핵산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터인 벡터.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 이종 재조합 핵산 또는 제6항 또는 제7항에 따른 벡터에 의해 형질전환된 줄기 세포.
  9. 제8항에 있어서, 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 유도된 만능성 줄기 세포인 줄기 세포.
  10. 제약상 허용되는 담체 중에 제8항 또는 제9항에 따른 줄기 세포를 포함하는 조성물.
  11. 치료 처리를 필요로 하는 대상체에서의 치료 처리를 위한 조직의 준비 방법이며,
    (a) 상기 조직으로 이동하는 예비컨디셔닝 줄기 세포를 대상체에게 비경구로 투여하는 단계로, 상기 줄기 세포는 재조합 핵산을 함유하며, 상기 재조합 핵산은 열-유도성 프로모터와 작동가능하게 연관되는 줄기-세포 유인성 케모카인을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 다음에, 차후에 상기 대상체에게 비경구로 투여되는 치료용 줄기 세포의 이동을 강화하는 데에 효과적인 양으로 조직에서 상기 줄기-세포 유인성 케모카인의 발현을 유도하기에 충분하도록 상기 조직을 선택적으로 가열하는 단계
    를 포함하는, 치료 처리를 위한 조직의 준비 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 조직이 뇌, 유방, 피부, 전립선, 폐, 망막, 근육, 간, 췌장, 골격 또는 연골 조직인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 조직이 신생물 조직인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 신생물 조직이 뇌 종양, 유방암, 피부암, 전립선암 또는 폐암 조직인 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 유도된 만능성 줄기 세포인 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 열 유도성 단백질 프로모터인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 열 유도성 프로모터가 HSP70 프로모터, HSP90 프로모터, HSP60 프로모터, HSP27 프로모터, HSP25 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 성장 정지 유전자 프로모터 및 DNA 손상 유전자 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기-세포 유인성 케모카인이 TNF-알파, 기질 세포-유래 인자 1알파, 종양-연관 성장 인자, 전환 성장 인자 알파, 섬유모세포 성장 인자, 내피 세포-유래 화학유인물질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 줄기 세포 인자 (SCF)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택적으로 가열하는 단계가 초음파, 레이저, 고주파, 마이크로파 또는 수조에 의해 수행되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 선택적으로 가열하는 단계가 고강도 집속 초음파에 의해 수행되는 것인 방법.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비경구로 투여하는 단계가 전신성 투여 단계인 방법.
  22. 치료를 필요로 하는 대상체에서의 조직의 치료 방법이며,
    (a) 상기 조직으로 이동하는 치료용 줄기 세포를 대상체에게 비경구로 투여하는 단계로, 상기 줄기 세포는 재조합 핵산을 함유하며, 상기 재조합 핵산은 열-유도성 프로모터와 작동가능하게 연관되는 치료제를 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 다음에, 치료-유효량으로 조직에서 상기 치료제의 발현을 유도하기에 충분하도록 상기 조직을 선택적으로 가열하는 단계
    를 포함하는, 조직의 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 치료제가 독소, 독소의 단편, 약물 대사 효소 및 세포자멸사 유도제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 치료제가 (a) 박테리아 독소, 식물 독소, 진균 독소 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 독소; (b) 키나제를 포함하는 약물-대사 효소; 또는 (c) PUMA; BAX; BAK; BcI-XS; BAD; BIM; BIK; BID; HRK; Ad E1B; ICE-CED3 프로테아제; TRAIL; SARP-2; 및 아포틴으로 이루어진 군에서 선택되는 세포자멸사 유도제인 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직이 뇌, 유방, 피부, 전립선, 폐, 망막, 근육, 간, 췌장, 골격 또는 연골 조직인 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직이 신생물 조직인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 신생물 조직이 뇌 종양, 유방암, 피부암, 전립선암 또는 폐암 조직인 방법.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 유도된 만능성 줄기 세포인 방법.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 열 유도성 단백질 프로모터인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 열 유도성 프로모터가 HSP70 프로모터, HSP90 프로모터, HSP60 프로모터, HSP27 프로모터, HSP25 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 성장 정지 유전자 프로모터 및 DNA 손상 유전자 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택적으로 가열하는 단계가 초음파, 레이저, 고주파, 마이크로파 또는 수조에 의해 수행되는 것인 방법.
  32. 제19항에 있어서, 상기 선택적으로 가열하는 단계가 고강도 집속 초음파에 의해 수행되는 것인 방법.
  33. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비경구로 투여하는 단계가 전신성 투여 단계인 방법.
  34. 조직의 치료 준비 및 치료를 필요로 하는 대상체에서의 조직의 치료 준비 및 치료 방법이며,
    (a) 상기 조직으로 이동하는 예비컨디셔닝 줄기 세포를 대상체에게 비경구로 투여하는 단계로, 상기 줄기 세포는 재조합 핵산을 함유하며, 상기 재조합 핵산은 열-유도성 프로모터와 작동가능하게 연관되는 줄기-세포 유인성 케모카인을 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 단계;
    (b) 다음에, 차후에 상기 대상체에게 비경구로 투여되는 치료용 줄기 세포의 이동을 강화하는 데에 효과적인 양으로 조직에서 상기 줄기-세포 유인성 케모카인의 발현을 유도하기에 충분하도록 상기 조직을 선택적으로 가열하는 단계;
    (c) 다음에, 상기 조직으로 이동하는 치료용 줄기 세포를 대상체에게 비경구로 투여하는 단계로, 상기 줄기 세포는 임의적으로 재조합 핵산을 포함하며, 상기 재조합 핵산은 열-유도성 프로모터와 작동가능하게 연관되는 치료제를 코딩하는 핵산을 포함하는 단계; 및
    (d) 다음에, 임의적으로 치료-유효량으로 거기에서 상기 치료제의 발현을 유도하기에 충분하도록 상기 조직을 선택적으로 가열하는 단계
    를 포함하는, 조직의 치료 준비 및 치료 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 줄기-세포 유인성 케모카인이 TNF-알파, 기질 세포-유래 인자 1알파, 종양-연관 성장 인자, 전환 성장 인자 알파, 섬유모세포 성장 인자, 내피 세포-유래 화학유인물질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 줄기 세포 인자 (SCF)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 치료제가 독소, 독소의 단편, 약물 대사 효소 및 세포자멸사 유도제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 (a) 박테리아 독소, 식물 독소, 진균 독소 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 독소; (b) 키나제를 포함하는 약물-대사 효소; 또는 (c) PUMA; BAX; BAK; BcI-XS; BAD; BIM; BIK; BID; HRK; Ad E1B; ICE-CED3 프로테아제; TRAIL; SARP-2; 및 아포틴으로 이루어진 군에서 선택되는 세포자멸사 유도제인 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직이 뇌, 유방, 피부, 전립선, 폐, 망막, 근육, 간, 췌장, 골격 또는 연골 조직인 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직이 신생물 조직인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 신생물 조직이 뇌 종양, 유방암, 피부암, 전립선암 또는 폐암 조직인 방법.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포들 중 어느 하나 또는 모두가 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 유도된 만능성 줄기 세포인 방법.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 열 유도성 단백질 프로모터인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 열 유도성 프로모터 중 어느 하나 또는 모두가 HSP70 프로모터, HSP90 프로모터, HSP60 프로모터, HSP27 프로모터, HSP25 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 성장 정지 유전자 프로모터 및 DNA 손상 유전자 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택적으로 가열하는 단계 중 어느 하나 또는 모두가 초음파, 레이저, 고주파, 마이크로파 또는 수조에 의해 수행되는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 선택적으로 가열하는 단계 중 어느 하나 또는 모두가 고강도 집속 초음파에 의해 수행되는 것인 방법.
  46. 제34항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비경구로 투여하는 단계 중 어느 하나 또는 모두가 전신성 투여 단계인 방법.
  47. 증가를 필요로 하는 대상체에서의 선택된 뇌 조직의 혈액-뇌 장벽 투과도의 증가 방법이며,
    (a) 뇌 조직으로 이동하는 줄기 세포를 대상체에게 비경구로 투여하는 단계로, 상기 줄기 세포는 재조합 핵산을 함유하며, 상기 재조합 핵산은 열-유도성 프로모터와 작동가능하게 연관되는 장벽-개방 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 다음에, 해당 선택 뇌 조직에서 혈액-뇌 장벽의 투과도를 증가시키는 데에 효과적인 양으로 상기 장벽-개방 단백질 또는 펩티드의 발현을 유도하기에 충분하도록 상기 선택 뇌 조직을 선택적으로 가열하는 단계
    를 포함하는, 선택된 뇌 조직의 혈액-뇌 장벽 투과도의 증가 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 선택된 조직이 신생물 조직인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 줄기-세포 유인성 케모카인이 TNF-알파, 기질 세포-유래 인자 1알파, 종양-연관 성장 인자, 전환 성장 인자 알파, 섬유모세포 성장 인자, 내피 세포-유래 화학유인물질, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 줄기 세포 인자 (SCF)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액-뇌 장벽 개방 단백질 또는 펩티드가 브라디키닌, 트롬빈, 엔도텔린-1, 물질 P, 혈소판 활성화 인자, 시토카인류, 대식세포 염증 단백질 및 보체-유래 폴리펩티드 C3a-desArg로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 유도된 만능성 줄기 세포인 방법.
  52. 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 열 유도성 단백질 프로모터인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 열 유도성 프로모터가 HSP70 프로모터, HSP90 프로모터, HSP60 프로모터, HSP27 프로모터, HSP25 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 성장 정지 유전자 프로모터 및 DNA 손상 유전자 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 상기 대상체에서 치료제의 세포독성 효과를 증가시키는 데에 효과적인 양으로 투여되며, 대상체에게 치료제를 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 치료제가 테모졸로미드 ("Tmz"), VP-16, 파클리탁셀, 카르보플라틴, 종양 괴사 인자-관련 세포자멸사-유도 리간드 ("TRAIL"), 트로글리타존 ("TGZ"), 피오글리타존 ("PGZ"), 로시글리타존 ("RGZ"), 및 시글리타존 ("CGZ"), 프로카르바진, 빈크리스틴, BCNU, CCNU, 탈리도미드, 이리노테칸, 이소트레티노인, 이마티닙, 에토포시드, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 메르캅토퓨린, 플루오로우라실, 히드록시우레아, 빈블라스틴 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 사용하기 위한 것이거나, 또는 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 데에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 벡터 또는 줄기 세포 자체.
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US20220241337A1 (en) * 2019-02-22 2022-08-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of Newyork Preparing tissues for delivery of therapeutic and diagnostic agents and delivering the agents
WO2022212005A2 (en) * 2021-03-12 2022-10-06 California Institute Of Technology Acoustic remote control of microbial immunotherapy

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5112596A (en) * 1990-04-23 1992-05-12 Alkermes, Inc. Method for increasing blood-brain barrier permeability by administering a bradykinin agonist of blood-brain barrier permeability
JP2001501458A (ja) * 1996-08-15 2001-02-06 アメリカ合衆国 ヒートショックタンパク質プロモーターと局部加熱との組合せを利用した遺伝子発現の場所的及び時期的制御
WO1999042137A2 (en) * 1998-02-19 1999-08-26 Peter Bromley Stress promoter control of therapeutic genes in gene therapy: compositions and methods
CA2349506C (en) * 2001-06-14 2009-12-08 Duke University A method for selective expression of therapeutic genes by hyperthermia
WO2005017164A1 (en) * 2003-08-11 2005-02-24 University Of South Florida Vigilant cells
AU2006269879A1 (en) * 2005-07-19 2007-01-25 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Transport agents for crossing the blood-brain barrier and into brain cancer cells, and methods of use thereof
WO2010119039A1 (en) * 2009-04-13 2010-10-21 Apceth Gmbh & Co. Kg Engineered mesenchymal stem cells and method of using same to treat tumors

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