KR100952367B1 - 혈관내피세포 특이적 프로모터에 리포터 유전자가 부착된발현벡터 및 이를 이용한 혈관내피세포로의 분화 모니터링방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관내피세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 혈관내피세포 분화 모니터링용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 혈관내피세포로의 분화 모니터링 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 줄기세포가 혈관내피세포계통으로 분화되었는가를 탐지할 수 있는 혈관내피세포 특이 프로모터 서열에 리포터유전자가 부착된 발현벡터들을 구축할 수 있으며, 구축된 발현벡터를 줄기세포로 도입한 후 VEGF 처리에 의해 혈관내피세포로 분화를 유도하고, 이어 리포터유전자가 혈관내피세포로 분화된 세포에서만 발현되어짐을 면역염색법에 의해 입증함으로써, 줄기세포가 혈관내피세포계통으로 분화되었는가를 탐지할 수 있음을 확인하였다.

Description

혈관내피세포 특이적 프로모터에 리포터 유전자가 부착된 발현벡터 및 이를 이용한 혈관내피세포로의 분화 모니터링 방법{Construction of the vectors expressing reporter genes driven by the endothelial cell-specific promoters and their application in monitoring of mesenchymal stem cells differentiating into the endothelial lineage}

본 발명은 혈관내피세포 특이적 프로모터에 리포터유전자가 부착된 발현벡터 및 이를 이용한 혈관내피세포로의 분화 모니터링 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 혈관내피세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 혈관내피세포 분화 모니터링용 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

심근경색을 비롯한 심장질환은 미국과 유럽을 비롯한 서구에서뿐 아니라 우리나라에서도 식습관의 변화, 운동 부족, 고령화 사회로의 진입에 따른 노년층의 증가 등으로 인해 심혈관계 질환에 의한 사망자수가 급격히 증가하는 추세에 있다. 그러나, 궁극적인 치료 방법인 약물 요법 및 심장이식은 비용 및 공여자의 한계로 제약을 받고 있는 실정이다. 최근 성인의 골수를 비롯한 성체 조직에서도 다양한 세포 계통으로 분화할 수 있는 성체 줄기세포가 존재한다는 연구 결과가 보고되면서 줄기세포를 이용한 심혈관질환의 치료 가능성에 대한 관심이 고조되고 있고, 실제 동물모델 및 임상에서 시도되어 손상된 심장조직의 재생 및 심기능이 개선되었다는 긍정적인 연구 결과가 보고되고 있다. 심혈관질환의 세포 치료는 Tomita S 등 (1999, Circulation 100:11247-11256)이 쥐의 골수에서 분리한 중간엽 줄기세포를 심근 경색모델 동물내로 이식한 후 심장 기능이 개선되었다는 첫 동물 실험 결과 이후 다양한 줄기 세포를 심혈관질환 모델동물내로 이식한 후 이식된 세포가 심근세포, 혈관내피세포 및 혈관평활근세포 등으로 분화하고, 혈관의 생성과 증식, 좌심실 기능의 개선이 이루어졌다는 희망적인 연구 결과들이 많은 동물 실험을 통해 입증되고 있다. 또한, 골수 간엽 줄기세포를 이용한 첫 임상 실험은 Strauer BE 등 (2002, Circulation 106:1913-1918)이 10명의 환자를 대상으로 자가 골수 간엽세포를 심근 경색부위의 동맥을 통하여 이식한 후 세포 이식 요법을 받은 환자들이 대조군에 비해 경색 부위가 감소하였고 경색 지역에서 혈류 속도의 증가 및 좌심실의 기능이 개선되었다고 보고한 이후 자가 골수 간엽줄기세포 및 자가 혈액 전구세포 (Assmus B 등 2002, Circulation 106:3009-3017), 자가 골격근아세포 (skelatal myoblast, Menasche 등 2001, Lancet 357:279-280) 등을 이식한 후 좌심실의 기능이 개선되었고 경색된 심장에서의 대사 작용이 증진되었다고 보고하고 있다. 최근에는 싸이토카인 (G-CSF)을 주사하여 심혈관질환자의 골수로부터 말초혈액으로 가동화된 단핵구세포를 회수한 후 이식하였을 때 좌심실의 수축력과 운동 능력 등의 개선되었다고 보고하고 있다(Kang HJ 등 2004, Lancet 363:751-756).

그러나, 자가 골격근아세포를 이식한 후 이식한 세포와 주변세포와의 전기생리적인 연결의 부재에 의한 부정맥 발생 보고와 G-CSF 투여 후 세포 이식한 환자에서 스텐트-관동맥재협착이 발견되었다는 보고 등으로 인해 줄기 세포를 이용한 심장 질환의 치료 효과와 함께 안전성에 대한 연구의 필요성이 제기되고 있는 실정이다. 최근에는 심혈관질환 모델동물내로 골수 유래 조혈모줄기세포를 이식하였을 때 초기 연구보고와는 달리 심근세포로 분화하지 않고 혈액세포계통으로만 분화하여 혈관신생성에 의한 심장 기능의 개선은 이루어지나 심근세포로의 교차분화(transdifferentiation)는 이루어지지 않는다는 주장이 제기되고 있다(Balsam LB 등 2004, Nature 428:668-673). 또한, 일부 연구진에서는 줄기세포가 심근세포로 분화하는 비율은 극히 미미하고 심장내에 존재하는 심근세포와 이식된 줄기세포와의 세포융합(cell fusion)에 의해 심근세포로 분화된 것처럼 보인다고 주장하고 있다(Nygren JM 등 2004, Nat Med 10:494-501). 한편, 동물모델에서 줄기세포 이식후 이식한 세포가 혈관이나 심근세포로 분화하는 비율은 극히 미미하고, 이식된 세포에서 분비된 인자들에 의해 손상 받은 심장 내의 세포들의 생존성, 증식 및 분화가 촉진되어 심장 기능의 개선이 이루어진다는 패러크라인 효과(paracrine effect)와 관련된 연구보고들도 많은 상황이다.

상기 기술한 바와 같이 현재까지 심혈관질환의 세포치료 효과가 기대했던 것보다 미미하고 줄기세포 치료의 효능과 더불어 안전성을 제고해야 되는 측면임에도 불구하고, 줄기세포 연구의 중요성을 인식하고 생명공학 및 의학 분야의 선진국에서는 정부 차원에서 주도적으로 줄기세포 연구에 관한 경제적, 정치적, 법률적 측 면에서 지원을 아끼지 않고 있다. 심혈관질환의 줄기세포 치료시장 규모는 2010년 38억 달러에서 2015년 59억 달러에 이를 것으로 전망되고 있으며 (A Jain PharmaBiotech Report 2005), 미국의 심장질환 분야 줄기세포 연구 잠재적 수혜 대상 및 규모는 5,800 만 명으로 예상되고 있다(D. Perry 2000, "Patients' Voices: The powerful Sound in the Stem Cell Debate", Science 287:1423). 줄기세포 치료 분야는 바이오벤처를 중심으로 상업화임상이 활발히 진행되고 있고 최근에는 다국적 제약기업이 벤처간의 인수, 합병을 통한 세포 치료분야에 진출하고 있는 실정이다.

혈관내피 세포 특이적 발현을 유도할 수 있는 프로모터 및 인핸서 영역에 대한 분석 및 이를 이용한 발현벡터를 구축하여 혈관내피세포에서의 발현 특이성을 검증한 연구는 주로 종양 조직에서 혈관의 신생성을 차단하는 측면에서 연구되어 왔다. 혈관내피세포의 발현을 유도하는 특이적 프로모터에 민감도가 높은 효소 등을 부착하여 혈관신생성을 조절하는 분자들을 검색하거나 암세포만을 죽이기 위하여 혈관내피세포 특이적 프로모터에 표적 분자들을 부착한 후 종양 조직내의 혈관에서 발현시키는 연구들을 진행하여 왔다. 예를 들면, Tie-2 혈관내피세포 프로모터 및 인핸서 영역은 발생과정 및 성체 조직의 혈관내피세포 특이적 발현과 관련된 신호전달체계 연구에 유용하게 이용되어져 왔다(Fadel BM 등 1998, Biochem J 330:335-343; Kisanuki YY 등 2001, Dev Biol 230:230-242). De Palma M 등(2003, Hum Gene Ther 14:1193-1206)은 Tie1, Tie2, Flk-1, VE-Cad 및 ICAM-2 프로모터 영역에 GFP 표지유전자를 부착시킨 렌티바이러스 벡터를 구성한 후 혈관내피세포, 섬 유아세포, 신경, 림포사이트, 조혈모세포, 암세포주에 도입한 후 발현 특이성을 비교한 결과, Tie-2 프로모터와 인핸서를 사용한 경우에 가장 높은 특이적인 혈관내피세포 발현을 유도함을 보고하고 있다. 또한, Tie-2 프로모터 및 인핸서에 특정한 표적유전자를 부착하여 뇌혈관 장벽(blood-brain barrier)에서만 특이적으로 발현시킴으로써 표적유전자의 효과를 검증하기 위한 도구로도 이용되어져 왔다 (특허논문, JP2006141228).

Heidenreich R 등 (2000, Cancer Res 60:6142-6147)은 939bp의 Flk-1 프로모터와 2.3kbp의 인핸서 영역에 베타-갈락토시데이제 표지유전자가 부착된 발현벡터를 다양한 암 종 조직 내로 도입한 후 조사한 결과 종양에 존재하는 혈관에서 특이적인 발현을 나타낸 반면 정상 조직에 존재하는 대부분의 혈관에서는 표지유전자를 발현하지 않는 것으로 보고하고 있다(Heidenreich R 등 2000, Cancer Res 60:6142-6147). 또한, Licht AH 등(2004, Dev Dyn 229:312-318)은 Flk-1 프로모터 영역에 베타-갈락토시데이제 표지유전자를 부착시킨 형질전환 마우스 모델을 통하여 발생과정 동안의 혈관계 발달 시 특이적인 발현을 나타낸다고 보고하고 있다(Licht AH 등 2004, Dev Dyn 229:312-318).

혈관내피세포의 특이적인 발현을 유도하는 것은 프로모터 및 인핸서 부위내에 존재하는 전사활성 및 저해 부위의 존재가 가장 중요하다고 할 수 있다. 그러나, 동일한 프로모터 및 인핸서 영역을 사용할지라도 도입된 세포에 존재하는 전사인자들의 활성을 조절할 수 있는 세포 내 환경에 따라 혈관내피세포 특이적 유전자 조절 부위들의 발현 특이성은 영향을 받을 수 있다. 이러한 맥락에서 심근 및 혈관 내피세포로의 분화능을 갖고 있어 심혈관질환의 치료에 널리 이용되고 있는 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화를 특이적으로 모니터링 할 수 있는 발현벡터의 구축 및 특이적인 발현을 검증하는 연구는 심혈관질환의 유전자 치료 및 줄기세포 치료 연구 발전에 크게 기여할 수 있을 것이다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 혈관내피세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터와 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함한 벡터로 중간엽 줄기세포를 형질전환 하는 경우, 혈관내피세포로의 분화를 특이적으로 모니터링 할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 심근 및 혈관내피세포로의 분화능을 갖고 있어 심혈관질환의 치료에 널리 이용되고 있는 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화를 특이적으로 모니터링 할 수 있는 발현벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터를 이용한 혈관내피세포 분화 모니터링 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 혈관내피세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 혈관내피세포 분화 모니터링용 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서, 상기 발현벡터는 혈관내피세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 리포터 유전자가 삽입 또는 도입될 수 있는 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 리포터 유전자 서열은 상기 혈관내피세포 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 프로모터 서열은 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. “작동 가능하게 연결 (operably linked)”된다는 것은 적절한 유전자 서열이 프로모터 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된다는 것 을 의미한다. 따라서, 상기 발현벡터는 전사를 실시하기위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 코딩서열의 인프레임(in frame)을 맞추기 위한 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 혈관내피세포 특이적 발현을 유도하는 프로모터는 혈관내피세포에서 특징적으로 발현하는 마커단백질들의 프로모터를 지칭하며, 이들 프로모터에 전사인자가 결합하여 혈관내피세포 특이적 마커단백질을 발현시키는 프로모터를 의미한다. 상기 플라스미드의 예로는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드 (YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는데 적합한 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 단백질 발현 유도 및 발현된 단백질의 분리가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명의 혈관내피세포 분화 모니터링용 재조합 발현벡터에서, 상기 혈관내피세포 특이적 프로모터는 혈관내피세포에서 특이적으로 발현되는 마커단백질들의 전사를 조절하는 어떠한 프로모터도 될 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1의 Flk-1 프로모터 또는 서열번호 2의 Tie-2 프로모터인 것이 좋다.

본 발명의 혈관내피세포 분화 모니터링용 재조합 발현벡터에서, 상기 리포터 유전자는 유전자가 전사되어 번역된 단백질을 in vivo 또는 in vitro에서 확인할 수 있는 어떠한 리포터 유전자도 될 수 있으나, 바람직하게는 형광단백질을 코딩하는 리포터 유전자가 발현된 단백질의 유무를 별도의 과정을 거치지 않고 확인할 수 있어서 좋다. 상기 형광단백질의 예로서 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 또는 적색형광단백질(DsRed) 등이 있다. 녹색형광단백질은 에쿠오레아 빅토리아(Aequorea Victoria)라는 발광 해파리에서 유래하였고, 이를 유전공학적으로 돌연변이시켜 다른 여기 및 방출파장을 갖도록 조작된 청색(CFP), 황색(YFP), 적색(DsRed) 형광단백질 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예 2에서는 형광단백질로 녹색형광단백질 EGFP(enhanced GFP)를, 실시예 3에서는 적색형광단백질 DsRed를 각각 사용하였는데 EGFP 유전자의 염기서열(GeneBank Accession No. U55761)과 DsRed 유전자의 염기서열(GeneBank Accession No. AF506025)은 당업계에서 잘 알려져 있다. 적색형광단백질 DsRed는 558 ㎚에서 최고의 여기파장(excitation)과 583 ㎚에서 최고의 방출파장(emission)을 나타내고, 녹색형광단백질 GFP는 488 ㎚에서 최고의 여기파장과 507 ㎚에서 최고의 방출파장을 나타낸다. 이러한 형광단백질의 유전자를 리포터 유전자로서 이용하는 경우 면역염색 또는 공초점 현미경 등을 이용하는 방법을 사용함으로써, 줄기세포에서 혈관내피세포로의 분화를 세포를 죽이지 않고도 (또는 비침습적으로) 쉽게 모니터링 할 수 있다.

본 발명의 혈관내피세포 분화 모니터링용 재조합 발현벡터에서, 상기 발현벡터는 도 3의 개열지도를 갖는 pEGFP/Flk-1 벡터, 도 5의 개열지도를 갖는 pDsRed/Flk-1 벡터, 및 도 6의 개열지도를 갖는 pEGFP/Tie-2 벡터로 구성된 군으로 부터 선택된 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터가 형질도입되어 혈관내피세포로의 분화시 리포터 유전자가 발현되는 골수 중간엽 줄기세포를 제공한다. 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘 (CaCl₂) 및 열쇼크 (heat shock) 방법, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스터 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리 (sonication), 전기천공법 (electroporation) 및 PEG (polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다. 상기 본 발명의 재조합 발현벡터가 도입된 줄기세포는 세포치료를 필요로 하는 환자에 이식한 후, 이식된 줄기세포가 혈관내피세포로의 분화가 어느 정도 진행되었는지를 확인하는데 이용될 수 있다. 이를 위해서 상기 재조합 발현벡터가 도입된 줄기세포는 혈관 질환 환자의 심장 부위에 직접 투여 또는 이식할 수 있으며, 심장 조직의 혈관을 이용하여 이식할 수 있다. 동물의 경우 꼬리 정맥내로 줄기세포를 주입 후 손상받은 심장에서 분비되는 가동화 반응(예를 들면 가장 잘 알려진 세포 가동화인자인 SDF-1 분자가 손상 받은 심장에서 고농도로 발현되면 SDF-1의 수용체인 CXCR4를 발현하는 골수, 말초혈액 등으로부터 줄기세포가 손상 받은 심장내로 이동하여 손상된 조직의 재생에 관여하는 반응)의 확인을 위한 연구에도 이용할 수 있다. 또한 줄기세포의 생착율을 증진시키기 위하여 다양한 봉매제(embedding materials), 예컨대, sodium alginate, hyaluronic acid, 또는 collagen 등을 줄기세포와 복합체로 형성시켜 이 를 이용할 수 있다. 이후 혈액이나 극소량의 조직 샘플을 채취하여 이식된 세포의 분화 진행 여부 및 정도를 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 혈관내피세포 분화를 모니터링 하는 방법을 제공한다.

(a) 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;

(b) 제1항에 따른 혈관내피세포 분화 모니터링용 재조합 발현벡터를 상기 준비된 중간엽 줄기세포에 도입시키는 단계; 및

(c) 상기 형질도입된 중간엽 줄기세포에서 리포터 유전자의 발현 여부를 확인하는 단계.

본 발명의 혈관내피세포로의 분화를 모니터링 방법에 있어서, 상기 a)단계에서 중간엽 줄기세포를 준비하는 방법으로서, 본 발명에서는 중간엽 줄기세포의 특징적 마커 부재로 인한 줄기세포 연구의 제한점을 해결하기 위하여 중간엽 줄기세포를 고순도로 분리할 수 있는 특정한 마커인 Sca-1를 사용하였다. 종래 보고 된 쥐, 동물 및 인간 유래 골수 중간엽 줄기세포는 CD29+, CD44+, CD90+이고, 조혈모세포 마커인 CD34-, CD45-는 발현하지 않는 것으로 보고 되고 있으나, 세포 표면 단백질의 발현에 대한 상이성이 보고 되는 등 완전히 확립되지 않고 있다. 비록 CD29, CD44, CD90과 같은 세포 표면 단백질이 중간엽 줄기세포에 양성을 나타내지만, 이들 마커들은 조혈모세포를 분리하는 데 있어서 많이 이용되고 있는 CD34, CD117, CD133과 같은 특징적인 마커들과는 달리 일반세포에서도 세포 접촉, 인지 등과 관련하여 발현되는 것으로 보고 되고 있다. 따라서 본 발명에서는 골수세포를 분리한 후 세포용기에 부착된 세포들의 세포 표면 특성을 파악한 후 골수 중간엽 줄기세포를 순도 높게 분리할 수 있는 특정한 세포 표면 마커로서, Sca-1을 마커로서 사용하였다.

본 발명에서, 상기 c)단계의 리포터 유전자의 발현 여부를 확인하는 과정은 상기 리포터 유전자 예컨대, 형광단백질의 발현 여부를 면역염색 또는 공초점 현미경 등으로 확인함으로써 줄기세포에서 혈관내피세포로의 특이적 분화를 모니터할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 Flk-1 프로모터 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR)시키기 위한 서열번호 3 과 서열번호 4의 프라이머 세트와 서열번호 4 과 서열번호 5의 프라이머 세트, 그리고 서열번호 2의 Tie-2 프로모터 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR)시키기 위한 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트를 제공한다.

이하, 본 발명의 혈관내피세포 분화 모니터링용 재조합 발현벡터의 제작 및 이를 이용한 혈관내피세포 분화 모니터링을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에서는 기존에 보고된 프라이머 세트를 사용하여 알려진 서열의 프로모터 영역을 증폭하지 않고, 독창적인 프라이머 세트를 사용하여 844bp의 Flk-1, 1,061bp의 Tie 유전자 조절부위를 각각 증폭하여 혈관내피세포 특이적인 발현백터를 구축하였다. 종래기술은 발생기 또는 종양의 혈관신생성시 혈관내피세포 유전자 조절부위의 발현 특이성을 보고하고 있으나 사용된 프로모터 인핸서 영역 또는 도 입된 세포 종류에 따라 발현 특이성의 차이를 나타내고 있다. 본 발명에서는 심혈관질환의 세포 치료를 위해 이용성이 높은 중간엽 줄기세포내로 본 발명에서 구축된 혈관내피세포 특이적 발현 벡터들을 도입한 후, 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화를 특이적으로 모니터링 할 수 있음을 입증하였다. 고순도로 분리된 골수 Sca-1+ 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화를 특이적으로 모니터할 수 있어 심혈관질환의 유전자 치료 및 세포 치료 연구에 유용하게 적용될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다음 단계를 포함한다.

(a) 자석활성법을 이용한 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포의 고순도 분리 단계;

(b) 혈관내피세포 특이적 프로모터에 리포터유전자가 부착된 발현벡터의 구축 단계;

(c) 상기 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포내로 혈관내피세포 특이적 발현벡터를 도입 후 발현벡터가 혈관내피세포로의 특이적인 분화를 모니터링 하는가를 검증하는 단계.

혈관내피세포로의 분화를 특이적으로 모니터링 할 수 있는 유전자들의 프로모터에 관한 문헌 검색을 통하여 마우스 Flk-1 유전자 조절 부위는 기내(Heidenreich R 등 2000, Cancer Res 60:6142-6147) 뿐만 아니라 생체(Licht AH 등 2004, Dev Dyn 229:312-318)내에서 혈관내피세포에서의 특이적인 분화를 유도함을 확인하였다. 본 발명에서는 혈관내피세포 분화를 반영할 수 있는 마우스 Flk-1 프로모터 영역을 기존 연구보고와 마우스 유전자은행의 정보(#NT_039306.6)를 토대 로 하여 리포터유전자로의 클로닝을 고려하여 특정한 제한효소 서열을 포함하는 고유의 프라이머 세트를 제작하여 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭한 후 TA 클로닝 벡터에 동정하였다(도 1, 도2). 마우스 Flk-1 프로모터 서열 내에 BglII 제한효소 싸이트를 갖고 있기 때문에 리포터유전자로의 클로닝 시 BglII 제한효소를 제외한 다른 제한효소를 이용하는 전략을 택하였다. 염기서열 검정을 통하여 유전자은행에 보고된 서열과 동일한 프로모터 영역이 정확하게 클로닝 되었음을 확인하였다. 다음 단계로 TA 클로닝 벡터내로 동정된 844bp 크기의 마우스 Flk-1 프로모터를 pEGFP-1 및 pDsRed-Express-1 벡터내로 클로닝한 후 제한효소 처리에 의해 클로닝 방향 및 크기를 확인하였다(도 3, 도 5).

또한, 혈관내피세포로의 분화를 특이적으로 모니터링할 수 있는 유전자들의 프로모터에 관한 문헌 검색을 통하여 마우스 Tie-2 유전자 조절 영역이 기내(Fadel BM 등 1998, Biochem J 330:335-343) 뿐만 아니라 생체(De Palma M 등 2003 Hum Gene Ther 14:1193-1206; Kisanuki YY 등 2001, Dev Biol 230:230-242)내에서 혈관내피세포에서의 특이적인 분화를 유도함을 확인하였다. 본 발명에서는 혈관내피세포 분화를 반영할 수 있는 마우스 Tie-2 프로모터 영역을 기존 연구보고와 마우스 유전자은행의 정보(#NT_039280.5)를 토대로 하여 리포터유전자로의 클로닝을 고려하여 특정한 제한효소 서열을 포함하는 고유의 프라이머 세트를 제작하여 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭한 후 TA 클로닝 벡터에 동정하였다(도 1, 도 2). 마우스 Tie-2 프로모터 서열 내에 SacI, BamHI 제한효소 싸이트를 갖고 있기 때문에 리포터유전자로의 클로닝 시 상기 제한효소를 제외한 다른 제한효소를 이용 하는 전략을 택하였다. 염기서열 검정을 통하여 유전자은행에 보고된 서열과 동일한 프로모터 영역이 정확하게 클로닝 되었음을 확인하였다. 다음 단계로 TA 클로닝 벡터내로 동정된 1,061bp 크기의 마우스 Tie-2 프로모터를 pEGFP-1 벡터내로 클로닝한 후 제한효소 처리에 의해 클로닝 방향 및 크기를 확인하였다(도 6).

본 발명에 의해 구축된 혈관내피세포 프로모터에 리포터유전자가 부착된 발현벡터들(Flk-1-DsRed, Flk-1-EGFP, Tie-2-EGFP)이 혈관내피세포로의 분화를 특이적으로 모니터링 할 수 있는가를 검증하기 위하여 Sca-1+ 골수 중간엽 세포 내로의 발현벡터의 도입, 20ng/ml VEGF 처리에 의한 혈관내피세포로의 분화 유도, 발현벡터에 클로닝 된 프로모터에 의해 발현되는 Flk-1 항체와 Tie-2 단백질 항체를 사용한 면역염색을 실시하였다(실시예 5). 그 결과 리포터유전자의 발현을 조절하는 프로모터의 단백질 항체와 발현이 일치함을 증명하였다(도 7, 도 8).

본 발명에서 제작한 고유의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 혈관내피세포 프로모터 영역들이 혈관내피 세포계통으로 분화한 Sca-1+ 골수 중간엽 세포에서만 특이적으로 발현되었다는 것은 중요한 의미를 갖는다. 조직특이적인 발현을 유도하기 위해 동일한 프로모터 영역을 사용하였을지라도 도입된 세포에 따라 조직 특이적인 발현이 달라질 수 있기 때문이다. 즉 배아줄기세포를 포함한 발생기의 세포와 성체 줄기세포의 경우 줄기세포 역가와 분화능이 다르고 프로모터 영역에 결합하여 발현을 조절하는 전사인자들을 포함한 조직 특이적인 발현에 영향을 미칠 수 있는 분자들의 존재, 분포, 농도, 조절 양태 등이 다를 수 있기 때문이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포의 고순도 분리 및 세포 표면 특성 분석

1.1 골수 세포의 분리

마우스 대퇴골로부터 주사기를 사용하여 관류함으로써 내부의 골수 세포를 분리한 후 70 μm 세포 메쉬를 사용하여 조직파편 등을 제거하고 개개의 분리된 세포만을 회수하였다. 골수 세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) + 10% 우태아혈청 + 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 배지를 사용하여 0.1% 젤라틴 코팅된 10-cm 세포 용기에서 3일 동안 배양하였다. 배양 3일후에 세포 용기에 부착되지 않은 세포를 제거하기 위하여 배양액을 교환한 후 세포밀도가 배양 용기의 80% 이상 될 때 까지 (6일에서 7일) 더 배양하였다.

1.2 자석 활성법에 의한 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포의 분리

세포 배양 용기에 부착된 골수 세포에서 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포는 자석 활성법을 사용하여 분리하였다. 구체적으로 계대배양 3회 후에 골수 세포를 PE-결합된 Sca-1 항체(D7 단일클론항체, BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)와 15분동안 4℃에서 반응, 세정액(PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA)으로 세정, 항-PE 미크로비드(anti-PE microbeads, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)와 15 분동안 4℃에서 반응, 세정액으로 세정후 자석활성법 컬럼(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany, MACS Separation Column, LS Columns Cat # 130-042-401)을 통과시켜 Sca-1+ 세포만을 분리하였다. 세포 분리순도를 증진시키기 위하여 자석활성법 컬럼을 통과시키는 단계를 4회 반복하였다.

실시예 2. 마우스 혈관내피세포 Flk-1 프로모터에 EGFP 리포터유전자가 부착된 발현벡터의 제작

2.1 EGFP 리포터유전자 발현벡터로의 클로닝을 위한 마우스 Flk -1 프로모터의 증폭

본 발명자들은 마우스 C57BL/6J 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 Flk-1 프로모터 염기서열(유전자은행 #NT_039306.6) 중 혈관내피세포로 분화 시에 특이적인 발현을 유도할 수 있는 마우스 Flk-1 프로모터 부분을 증폭하기 위해 새로운 프라이머 세트를 제작한 후 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 마우스 게놈 DNA에 HindIII 제한효소 서열을 포함하는 서열번호 3로 기재된 프라이머, EcoRI 제한효소 서열을 포함하는 서열번호 4로 기재된 프라이머, dNTP, 10× PCR 버퍼 및 Taq 중합효소를 첨가하여 94℃에서 5분 동안 반응하고, 94℃에서 30초, 56℃에서 40초, 72℃에서 40초동안 반응을 35회 수행한 후, 72℃에서 7분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 반응후 얻은 반응 산물을 전기영동한 결과 서열번호 1의 Flk-1 프로모터에 상응하는 844bp 크기의 DNA 절편을 확인하였다(도 1).

마우스 Flk-1 1F-HindIII : 5'-aagcttAGGGCAAATGCACAGAGAAG-3' (서열 3)

마우스 Flk-1 1R-EcoRI : 5'-gaattcCAGGGGAACACCGATAAAAA-3' (서열 4)

PCR에 의해서 증폭된 844bp의 Flk-1 프로모터 유전자 단편을 pGEM-T Easy 벡터(Promega) 내로 클로닝 하였다. 도 2는 클로닝을 확인하기 위해 제한효소로 절단 후 844bp 크기의 Flk-1 유전자 단편이 정확하게 클로닝 되었음을 확인한 것이고, T7/SP6 프라이머 위치를 이용하여 염기서열 분석을 한 결과 Flk-1 프로모터 서열로 기재되는 염기서열을 가짐을 확인하였다.

2.2 마우스 Flk -1 프로모터를 EGFP 리포터유전자 발현벡터로의 클로닝

본 발명자들은 상기 실시예 2.1에서 증폭한 마우스 Flk-1 프로모터 유전자를 pEGFP-1 벡터(Clontech)에 클로닝하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2.1에서 증폭한 Flk-1 단편을 HindIII 및 EcoRI로 절단한 후 젤 회수 키트를 사용하여 정제한 후, 동일한 제한효소로 절단한 pEGFP-1 벡터와의 리게이션을 수행하여 Flk-1 프로모터와 리포터유전자인 EGFP을 포함하는 발현벡터를 제작하였다(도 3). Flk-1 프로모터가 벡터 내로 삽입되었는지를 확인하기 위해 제한효소 처리후 전기영동한 결과 Flk-1 프로모터의 DNA 사이즈를 확인하였고, Flk-1 프로모터를 포함하는 벡터가 구축되었음을 확인하였다(도 4 왼쪽 1 lane).

3. 마우스 혈관내피세포 특이 Flk -1 프로모터에 DsRed 리포터유전자가 부착된 발현 벡터의 제작

3.1 DsRed 리포터유전자 발현벡터로의 클로닝을 위한 마우스 Flk-1 프로모터의 증폭

본 발명자들은 마우스 C57BL/6J 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 Flk-1 프로모터 염기서열(유전자은행 #NT_039306.6) 중 혈관내피세포로 분화시에 특이적인 발현을 유도할 수 있는 마우스 Flk-1 프로모터를 증폭하기 위해 새로운 프라이머 세트를 제작한 후 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 마우스 게놈 DNA에 XhoI 제한효소 서열을 포함하는 서열번호 5으로 기재되는 프라이머, EcoRI 제한효소 서열을 포함하는 서열번호 4로 기재되는 프라이머, dNTP, 10× PCR 버퍼 및 Taq 중합효소를 첨가하여 94℃에서 5분 동안 반응하고, 94℃에서 30초, 56℃에서 40초, 72℃에서 40초동안 반응을 35회 수행한후, 72℃에서 7분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 반응후 얻은 반응 산물을 전기영동한 결과 서열번호 1의 Flk-1 프로모터에 상응하는 844bp 크기의 DNA 절편을 확인하였다(도 1).

마우스 Flk-1 1F-XhoI : 5'-ctcgagAGGGCAAATGCACAGAGAAG-3' (서열 5)

마우스 Flk-1 1R-EcoRI : 5'-gaattcCAGGGGAACACCGATAAAAA-3' (서열 4)

PCR에 의해서 증폭된 844bp의 Flk-1 프로모터 유전자 단편을 pGEM-T Easy 벡터내로 클로닝 하였다. 도 2는 클로닝을 확인하기 위해 제한효소로 절단 후 844bp 크기의 Flk-1 유전자 단편이 정확하게 클로닝 되었음을 확인한 것이고, T7/SP6 프 라이머 위치를 이용하여 염기서열 분석을 한 결과 Flk-1 프로모터 서열로 기재되는 염기서열을 가짐을 확인하였다.

3.2 마우스 Flk -1 프로모터를 DsRed 리포터유전자 발현벡터로의 클로닝

본 발명자들은 상기 실시예 3.1에서 증폭한 마우스 Flk-1 프로모터 유전자를 pDsRed-1 벡터(Clontech #632412)에 클로닝 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3.1에서 증폭한 Flk-1 단편을 XhoI 및 EcoRI로 절단한 후 젤 회수 키트를 사용하여 정제한 후, 동일한 제한효소로 절단한 pDsRed-Express-1 벡터와의 리게이션을 수행하여 Flk-1 프로모터와 리포터유전자인 DsRed을 포함하는 발현벡터를 제작하였다(도 5). Flk-1 프로모터가 벡터 내로 삽입되었는지를 확인하기 위해 제한효소 처리 후 전기영동한 결과 Flk-1 프로모터의 DNA 사이즈를 확인하였고, Flk-1 프로모터를 포함하는 벡터가 구축되었음을 확인하였다(도 4 오른쪽).

실시예 4 마우스 혈관내피세포 특이 Tie -2 프로모터에 EGFP 리포터유전자가 부착된 발현벡터의 제작

4.1 EGFP 리포터유전자 발현벡터로의 클로닝을 위한 마우스 Tie -2 프로모터의 증폭

본 발명자들은 마우스 C57BL/6J 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 Tie-2 프로모터 염기서열(유전자은행 #NT_039280.5) 중 혈관내피세포로 분화 시에 특이적인 발현을 유도할 수 있는 마우스 Tie-2 프로모터를 증폭하기 위해 새로운 프라이머 세트를 제작한 후 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 마우스 게놈 DNA에 HindIII제한효소 서열 을 포함하는 서열번호 6로 기재되는 프라이머, EcoRI 제한효소 서열을 포함하는 서열번호 7로 기재되는 프라이머, dNTP, 10× PCR 버퍼 및 Taq 중합효소를 첨가하여 94℃에서 5분 동안 반응하고, 94℃에서 30초, 56℃에서 40초, 72℃에서 40초 동안 반응을 35회 수행한 후, 72℃에서 7분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 반응후 얻은 반응 산물을 전기영동한 결과 서열번호 2의 Tie-2 프로모터 염기서열 정보에 상응하는 1,061bp 크기의 DNA 절편임을 확인하였다(도 1).

마우스 Tie-2 1F-HindIII : 5'-aagcttGTCTTGGTTTTACCGGCTGA-3' (서열 6)

마우스 Tie-2 1R-EcoRI : 5'-gaattcACTCACAACTTTGCGACTTCC-3' (서열 7)

PCR에 의해서 증폭된 1,061bp의 Tie-2 프로모터 유전자 단편을 pGEM-T Easy 벡터내로 클로닝하였다. 도 2는 클로닝을 확인하기 위해 제한효소로 절단 후 1,061bp 크기의 Tie-2 유전자 단편이 정확하게 클로닝 되었음을 확인한 것이고, T7/SP6 프라이머 위치를 이용하여 염기서열 분석을 한 결과 Tie-2 프로모터 서열로 기재되는 염기서열을 가짐을 확인하였다.

4.2 마우스 Tie -2 프로모터를 EGFP 리포터유전자 발현벡터로의 클로닝

본 발명자들은 상기 실시예 4.1에서 증폭한 마우스 Tie-2 프로모터 유전자를 pEGFP-1 벡터에 클로닝 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4.1에서 증폭한 Tie-2 단편을 HindIII 및 EcoRI로 절단한 후 젤 회수 키트를 사용하여 정제한 후, 동일한 제한효소로 절단한 pEGFP-1 벡터와의 리게이션을 수행하여 Tie-2 프로모터와 리포터유전자인 EGFP을 포함하는 발현벡터를 제작하였다(도 6). Tie-2 프로모터가 벡터 내로 삽입되었는지를 확인하기 위해 제한효소 처리 후 전기영동한 결과 Tie-2 프로모터의 DNA 사이즈를 확인하였고, Tie-2 프로모터를 포함하는 벡터가 구축되었음을 확인하였다(도 4 왼쪽 2 lane).

실시예 5. Sca -1+ 골수 중간엽세포내로 혈관내피세포 특이 발현벡터의 도입 후 혈관내피세포로의 분화의 특이성 검증

DNA 도입효율을 증진시키기 위해 항생제를 포함하지 않은 10% 우태아 혈청을 함유한 DMEM 배지를 사용하여 실시예 1에 의해 분리한 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포(2 x 10⁴ 세포/well)를 0.1% 젤라틴 코팅된 커버슬립이 놓인 24-well 세포 용기에 접종하였다. 배양 24 시간 후에 도 5 및 5 6에서 구축한 각각 1 ug 농도의 혈관내피세포 프로모터 발현벡터 (Flk-1-EGFP, Tie-2-EGFP)를 50 ul의 Opti-Mem 배양액(Invitrogen)에 혼합한 후 5분 동안 반응시켰다. 2 ul의 리포펙타민 (Lipofectamine 2000, Invitrogen) 용액과 50 ul의 Opti-Mem 배양액을 혼합한 후 5분 동안 반응시켰다. 발현벡터와 리포펙타민 용액을 혼합한 후 상온에서 20분 동안 반응시킨 후 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포가 접종된 배양용액내로 첨가한 후 48시간 동안 배양하였다. 혈관내피세포로의 분화 유도를 위해 20ng/ml VEGF 존재하에 DMEM + 10% 우태아혈청 배지에서 14일 동안 분화를 유도하였다. 20ng/ml VEGF를 함유한 배양액은 3일마다 교환하였다.

혈관내피세포 프로모터에 발현되는 리포터유전자가 혈관내피세포로 분화된 세포에서만 특이적인 발현을 나타내는가를 확인하기 위해 0.1% 젤라틴 코팅된 커버슬립위에 부착된 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포를 혈관내피세포 특이 항체를 사용한 면역염색법에 의해 확인하였다. 구체적으로 분화 처리된 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포를 2% 파라포름알데히드 고정액으로 15분 처리, PBS + 0.1% Tween20(PBST) 용액으로 세정, 0.25% Triton X-100 용액으로 30분 동안 처리, PBST 용액으로 세정, 5% 염소 혈청으로 1시간 배양, 1차 항체인 Flk-1 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 Tie-2 항체 (Upstate), 를 사용하여 1시간 배양, PBST 용액으로 세정, 2차 항체인 Cy3 항체(Zymed Laboratories Inc., San Francisco, USA)와 1시간 배양, PBST 용액으로 세정, 핵 염색을 위해 DAPI 용액과 1시간 배양, PBST 용액으로 세정 후 형광현미경하에서 형광신호의 강도를 유지하기 위한 마운팅 용액을 사용하여 시료를 준비한 후 형광현미경하에서 관찰하였다. 그 결과 리포터유전자의 발현을 조절하는 프로모터의 단백질 항체와 발현이 일치함을 입증하였다(도 7, 도 8).

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 혈관내피세포 계통으로 분화되었는가를 탐지할 수 있는 혈관내피세포 특이 프로모터 서열에 EGFP 또는 DsRed 리포터유전자가 부착된 발현벡터를 이용하여 골수 중간엽 줄기세포로 도입한 후 혈관내피세포로 분화를 모니터링 할 수 있다.

따라서 본 발명에서 구축한 혈관내피세포 특이적 발현벡터는 혈관내피세포 의 분화를 특이적으로 반영할 수 있음을 나타내어 혈관질환의 세포 치료 연구에 크게 기여할 것으로 생각된다. 또한, 본 발명에 의해 개발된 혈관내피세포 분화 탐지 기술과 분자영상 기술과의 접목에 의해 비침습적인 생체 내 줄기세포 분화, 운명 연구 등을 통해 줄기세포 치료의 효능 및 안전성 확보에 크게 기여할 수 있을 것이다.

도 1은 혈관내피세포 프로모터 (Flk-1, Tie-2)를 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의해 증폭한 후 예측된 크기의 DNA 절편이 생성되었음을 전기영동에 의해 확인한 사진이다.

도 2는 PCR에 의해 증폭된 혈관내피세포 프로모터 (Flk-1, Tie-2)들이 TA 클로닝벡터인 pGEM-T Easy내로 클로닝 되었음을 제한효소로 절단 후 전기영동에 의해 확인한 사진이다.

도 3은 모벡터인 pEGFP-1 벡터 내로 혈관내피세포 프로모터(Flk-1)를 삽입하여 생성된 재조합 벡터의 모식도이다.

도 4는 pEGFP-1 또는 pDsRed-Express-1 벡터 내로 클로닝 된 혈관내피세포 프로모터(Flk-1, Tie-2)를 제한효소를 사용하여 절단한 후 전기영동에 의해 확인한 사진이다.

도 5는 모벡터인 pDsRed-Express-1 벡터 내로 혈관내피세포 프로모터(Flk-1)를 삽입하여 생성된 재조합 벡터의 모식도이다.

도 6은 모벡터인 pEGFP-1 벡터 내로 혈관내피세포 프로모터(Tie-2)를 삽입하여 생성된 재조합 벡터의 모식도이다.

도 7은 혈관내피세포 프로모터(Flk-1)에 리포터유전자인 EGFP가 부착된 발현벡터를 Sca-1+ 중간엽 줄기세포내로 도입한 후 VEGF 처리에 의해 혈관내피세포로의 분화를 유도한 후 리포터유전자를 발현하는 세포가 혈관내피세포 특이항체들과 동시에 염색되어지는 것을 검증하기 위해 면역염색 후 공초점 현미경 하에서 확인한 사진이 다.

도 8은 혈관내피세포 프로모터(Tie-2)에 리포터유전자인 EGFP가 부착된 발현벡터를 Sca-1+ 중간엽 줄기세포내로 도입한 후 VEGF 처리에 의해 혈관내피세포로의 분화를 유도한 후 리포터유전자를 발현하는 세포가 혈관내피세포 특이항체들과 동시에 염색되어지는 것을 검증하기 위해 면역염색 후 공초점 현미경 하에서 확인한 사진이다.

<110> Korea University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Construction of the vectors expressing reporter genes driven by the endothelial cell-specific promoters and their application in monitoring of mesenchymal stem cells differentiating into the endothelial lineage <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 844 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 1 agggcaaatg cacagagaag agcccccggt ccttctccag tggctgctag agtgcttttg 60 tctacccagt tccatgacca cggtccccta cagtaacttt ggccaggccc cttttcagag 120 ctgacctttc agccaagata tgcttggggg gaagagaagg gagagtttct tgccagaggc 180 gccagtgtag gaacaaagag gaaaccggtc ccatgtgaac agtccccccc ccccccccag 240 ctatgtagac ttcaagtagc gactagagag gaacagcagc cttcacccct cgttttcttt 300 ccattccttt ccttccacgc ctgggaaatg acaacaaata tcttgtgaca tgttttactc 360 ctggcaaaaa ccaaatgcat ttagaatgat agtttaaagg acagtctttc agccagacaa 420 agagataaga ttattgtctc tacatcggat ctaaactaca ctgatatgca tgattaatga 480 tgtaacatgg tgcttttctt taaaaaaaat aaggggggaa acaggcatgc tcctttatca 540 cgtgcctaag cctcaagtat ggtgccagaa gcaggtggca aaccaggagg gtttgtaaaa 600 tccaggttca ctataaaaac atgtcaacac atagcgaatc tatataataa aattatactt 660 gaagatcttg ggcatgtttg gtgtgggcat cctcatttag cagaggcatg cctggtctgc 720 tcacatttag ctttgttgta tattcagctc ctcacgaatg aaaactccgt atgaaggctg 780 cttggtgtac ctatcgacag cgttctgaag gttctggctt gttcttttta tcggtgttcc 840 cctg 844 <210> 2 <211> 1061 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 gtcttggttt taccggctga gccatctcac ctgcctgatt atttaaaaat ctccggagta 60 atccaagagt gtggtttatg attgtagtat caacactcgg gaggctgagg gagcatcgtt 120 atcatgagct ccaggctagt tccaggcttg cctaagctgt agagcaagtc actctcttaa 180 aaagtgcctc tcccatattt ttgtatataa tttgcatctg aaattctgtt tgccaataac 240 tatgaaatta ttcacattac taaaatcttc ctgtgccaag ttctccaacg aattagatca 300 cactcagatg aaatgctaat aaaaattaaa gctgtagcca gtagcatgcg tatatttggg 360 ctcagggcca acaggcaggc gatctgggtg taagaaaata ggctaatggc tgtggaatct 420 ggtctctagt ggctccgctg agagctgacc tcaaccacgc tccctcaaat tgattgcctt 480 ccaggttatg atttctcatc acaggaaact ttgttgccca attcaaaccc tgtgagtgaa 540 aacaaaaaca ggagagcaag tgctgctccc cgtgccccaa agccccttct gtcagggatc 600 ccaaatgcac cccagagaac agcttagcct gcaagggctg gtcctcatcg cataccatac 660 ataggtggag ggcttgttat tcaattcctg gcctatgaga ggatacccct attgttcctg 720 aaaatgctga ccaggacctt acttgtaaca aagatccctc tgccccacaa tccagttaag 780 gcaggagcag gagccggagc aggagcagaa gataagcctt ggatgaaggg caagatggat 840 agggctcgct ctgccccaag ccctgctgat accaagtgcc tttaagatac agcctttccc 900 atcctaatct gcaaaggaaa caggaaaaag gaacttaacc ctccctgtgc tcagacagaa 960 atgagactgt taccgcctgc ttctgtggtg tttctccttg ccgccaactt gtaaacaaga 1020 gcgagtggac catgcgagcg ggaagtcgca aagttgtgag t 1061 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 prime PCR primer for Flk1 <400> 3 aagcttaggg caaatgcaca gagaag 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 prime PCR primer for Flk1 <400> 4 gaattccagg ggaacaccga taaaaa 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 prime PCR primer for Flk1 <400> 5 ctcgagaggg caaatgcaca gagaag 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 prime PCR primer for Tie2 <400> 6 aagcttgtct tggttttacc ggctga 26 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 prime PCR primer for Tie2 <400> 7 gaattcactc acaactttgc gacttcc 27

Claims (8)

1. 혈관내피세포 특이적 발현을 유도하는 서열번호 1의 Flk-1 프로모터 또는 서열번호 2의 Tie-2 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(DsRed)로 구성된 군에서 선택된 리포터 유전자를 포함하는 골수 중간엽줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 모니터링용 재조합 발현벡터.
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4. 제 1항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 3의 개열지도를 갖는 pEGFP/Flk-1 벡터, 도 5의 개열지도를 갖는 pDsRed/Flk-1 벡터, 또는 도 6의 개열지도를 갖는 pEGFP/Tie-2 벡터인 것을 특징으로 하는 혈관내피세포 분화 모니터링용 재조합 발현벡터.
5. 제 1항의 재조합 발현벡터가 형질도입되어 혈관내피세포로의 분화 시 리포터 유전자가 발현되는 골수 중간엽 줄기세포.
6. 다음의 단계를 포함하는 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포로부터 혈관내피세포로의 분화를 모니터링 하는 방법:

   (a) 자석활성법을 이용하여 Sca-1+ 골수 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;

   (b) 제1항에 따른 혈관내피세포 분화 모니터링용 재조합 발현벡터를 상기 분리된 Sca-1+ 중간엽 줄기세포에 도입시키는 단계; 및

   (c) 상기 형질도입된 Sca-1+ 중간엽 줄기세포에서 리포터 유전자의 발현 여부를 확인하는 단계.
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