KR102073597B1

KR102073597B1 - 배아의 양질성 판단 방법 및 배아 양질성 판단을 위한 바이오센서 시스템

Info

Publication number: KR102073597B1
Application number: KR1020180126201A
Authority: KR
Inventors: 정미경; 채영규; 정경화; 추승빈; 최윤정; 김민정; 정현정; 김명희; 이희선
Original assignee: 이희선; 김명희; 정현정; 정미경
Priority date: 2018-10-22
Filing date: 2018-10-22
Publication date: 2020-02-06

Abstract

본 발명은 배아의 배양 생성물에 의해 발현되는 유전자의 프로모터 및 형광 단백질을 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 배아의 양질성 판단 방법 및 배아 양질성 판단을 위한 비침습적 바이오 센서 시스템에 관한 것으로, 배아의 배양 생성물에 의해 변화하는 형광 발현 정도를 측정함으로써 저비용 및 짧은 시간으로 배아의 양질성을 판단할 수 있다.

Description

배아의 양질성 판단 방법 및 배아 양질성 판단을 위한 바이오센서 시스템{QUALITY EVALUATION METHOD OF EMBRYO, AND BIOSENSOR SYSTEM FOR QUALITY EVALUATION}

본 발명은 배아의 양질성 판단 방법 및 배아 양질성 판단을 위한 바이오센서 시스템에 관한 것으로, 구체적으로는 배아가 착상되는 시기에 자궁내막세포에서 배아의 발현에 의해 증가되는 유전자의 프로모터 및 형광 단백질을 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용한 배아의 양질성 판단 방법 및 배아 양질성 판단을 위한 바이오 센서 시스템에 관한 것이다.

고령의 난임 환자는 상대적으로 이수성 배아의 생성이 높고 건강한 배아의 생성이 낮은 문제를 갖고 있다. 최근 고령의 난임 환자의 증가로 인하여 배아 선별과 관련된 기술 개발에 관심이 높아지고 있다. 배아의 착상 효율을 증가시키기 위해서는 최상의 배아를 선별, 착상에 적절한 자궁내막 환경 조성, 그리고 개별 환자에게 적절한 이식 시기를 조절하는 것이 필요하다.

배아의 품질을 평가하는 기법들은 선진국을 중심으로 2008년 이후에 본격적으로 도입되었으며, 국내에는 2012년 이후 도입되었다. 그 중 배아를 비침습적인 방법으로 진단하는 time-lapse 방법은 기기의 성능에는 각각 차이가 조금 있으나 5개의 대표적인 기업들 (Vitrolife, ESCO, Astec, Genea BIOMEDX, Auxogyn)이 생산 판매하고 있어 이들 장비를 도입한 병원들은 배아의 형태 변화에 대한 평가 서비스를 활발하게 진행하고 있다.

침습적인 방법으로 진단하는 착상전 유전자 검사법 (Preimplantation genetic screening, PGS)은 2009년 24sure single cell screening technology를 이용하여 성공한 이후로 도입되었고, 2013년 Next generation sequencing (NGS) 방법을 착상전 배아 진단법에 사용하여 성공적인 결과를 나타내고 있다. 대표적인 두 회사 (iGenomix, Reprogenetics)에서 착상전 유전자 검사 및 진단 시장을 선도하고 있다. 더불어 배아 내 mitochondrial DNA (Mt DNA) 분석 서비스도 추가하여 진단에 사용하고 있다. 이 두 회사는 유럽과 미국의 대부분의 시장을 점유하고 있으나 국내에는 캔서롭 업체가 제작한 microarray를 이용하여 독점 서비스를 진행하고 있다. 하지만 이는 배아의 세포를 떼어내는 침습적 방법으로 배아의 질이 떨어질 수 있다는 단점을 가지고 있다.

배아에서 분비되는 물질을 이용한 연구는 단백질(예를들면 조직적합항원 클래서 G (histocompatibility antigen class G; HLA-G))이나 대사산물(예를들면 lacate)을 측정하여 배아의 품질을 개선하거나 평가하고자 다각도로 진행 중이다. 두 가지 방법 모두 현재 연구 단계에 있거나 기술적 한계를 일부 갖고 있으며 분석을 위해 판매되는 장비들이 고가여서 연관된 서비스도 고가로 진행되고 있어, 상대적으로 많은 환자들에게 양질의 방법을 저가로 도입하고 있지 못하는 단점이 있다.

포유류 배아의 대사 작용은 배아 발달 단계별로 다른데, 수정 직후의 분열 단계 배아와 착상 이후 배아로 나눌 수 있다. 수정 후에는 새롭게 형성된 embryonic genome이 활성화 되는데, 배아의 전사 (transcription)가 일어나고 이에 해당하는 단백질들이 증가하게 되면서 모계 전사/단백질(maternal transcripts/proteins)에 의해 조절을 받던 genetic program이 배아의 유전정보를 받아 발현하게 된다. 이후 8세포로 분열하며 “compaction” 과정을 통해 morula 단계로 진행되게 된다 (비특허문헌 1 및 2). 특징적으로는 배반포 (blastocyst)에서 소비 된 포도당의 50 % 이상은 산화되지 않고 젖산(lactate)으로 전환 된다(비특허문헌 3). 이때 형성된 젖산(lactate)은 배아 주변의 pH를 낮춰 자궁조직을 disaggregation하게 되어 영양포(trophoblast)가 착상하게 되는 환경을 만든다. 또한 젖산(lactate)은 세포신호 물질(signaling molecule)로 작동하여 자궁내막 세포에 혈관내피성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF) recruitment를 증가시켜 혈관생성(angiogenesis)을 촉진시킨다(비특허문헌 4)

한편, 임신은 착상(implantation), 탈락막화(decidualization) 및 태반형성 (placentation) 과정으로 구성되어 있는 아주 복잡하고 비가역적인 과정이다. 이런 과정 동안 자궁내막은 임신과 착상과정에 대한 반응으로 역동적인 변화를 겪게 된다. 자궁 내막은 생리 주기에 따라 생리, 증식 및 착상기 자궁내막으로 분화하게 된다. 특히 자궁내막 기질세포는 생리주기 중 분비기(late secretory phase)에서 프로게스테론(progesterone)의 영향을 받아 형태적 기능적으로 탈락막화가 일어나게 되고, 배아 착상에 중요한 역할을 하게 된다(비특허문헌 5). 배아 착상 시 배아와 자궁내 세포들의 cross-talk이 착상과 유산에 많은 영향을 미치게 된다. 자궁내막세포의 이동에 관한 연구결과에서 양질의 배아에서는 이동이 증가하고 염색체 이상 원인으로 배아의 질이 낮은 경우에는 이동이 억제된다고 보고된 바 있다(비특허문헌 6 및 7). 이러한 결과에서 보듯이 자궁내막세포를 이용하여 배아의 품질을 검사하는 것이 가능하다.

배아가 자궁내로 도달하면 성장인자나 부착분자 같은 인자들이 자궁내막 또는 배아에 의해 생산되고 분비되어 수용성을 갖는 내막을 형성한다. 스테로이드 호르몬(Steroid hormone)에 발현이 조절되는 백혈병 저해인자(Leukaemia inhibitory factor, LIF), 콜로니 자극인자 (colony stimulating factor, CSF)-1, 인터루킨(interleukin, IL)-1 같은 사이토카인(cytokine)들이 순차적으로 발현되고, 인테그린(integrin), 뮤신(mucin)-1, L-셀렉틴 리간드(selectin ligands), 헤파린결합성 상피세포 성장인자(heparin binding epidermal growth factor, HB-EGF), 글리코델린(glycodelin), 혈관내피성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 등의 발현이 증가하고, 이들 물질들이 착상에 관여한다고 알려져 있다(비특허문헌 8).

우수한 배아를 선별하기 위해 초기 배아 발생에 사용된 배지를 분석하는 기술이 개발된다면 배아의 형태학적 변화를 관찰하는 기술보다 더 효과적일 것으로 기대한다. 따라서 본 발명에서는 배아 발생시 대사작용으로 생성되는 젖산(lactate)등의 대사 산물을 센싱(sensing) 할 수 있는 바이오 센싱 시스템을 발명하고자 하였다. 즉, Lactate sensing 벡터를 자궁내막세포에 형질전환 한 후 배아 배양 배지를 처리하여 형광량을 측정하거나(비특허문헌 9), 혹은 자궁내막세포에서 젖산(lactate) 또는 배아가 배양된 배지 내 대사 생성물 등에 의해 변화하는 유전자들의 프로모터 및 형광 단백질이 삽입된 재조합 벡터를 이용하여 자궁내막 세포를 형질전환 한 후, 배아 배양 배지에 의해 변화하는 형광의 발현 정도를 측정하여 짧은 시간에 정확하게 우수한 배아를 선별하고자 하였다.

Hamatani T, et al. Global gene expression profiling of preimplantation embryos. Hum Cell, 2006. 19(3): 98-117. Houghton FD, et al. Oxygen consumption and energy metabolism of the early mouse embryo. Mol Reprod Dev, 1996. 44(4): 76-485. Gott AL, et al. Non-invasive measurement of pyruvate and glucose uptake and lactate production by single human preimplantation embryos. Hum Reprod, 1990. 5(1): 104-108. Gardner DK. Lactate production by the mammalian blastocyst: manipulating the microenvironment for uterine implantation and invasion? Bioessays. 2015.;37(4):364-71 Cha J, et al., Mechanisms of implantation: strategies for successful pregnancy. Nat Med. 2012. 18(12):1754-67 Macklon NS and Brosens JJ. The human endometrium as a sensor of embryo quality. Biol Reprod. 2014. 91(4):98 Weimar CH, et al., Endometrial stromal cells of women with recurrent miscarriage fail to discriminate between high- and low-quality human embryos. PLoS One. 2012;7(7):e41424. Hoozemans DA, et al. Human embryo implantation: current knowledge and clinical implications in assisted reproductive technology. Reprod Biomed Online. 2004. 9(6): 692-715. San M et al., A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 2013;8(2):e57712.

본 발명은 배아의 배양 생성물에 의해 변화하는 형광 발현 정도를 측정함으로써 비침습적이며, 저비용 및 짧은 시간 안에 배아의 양질성을 판단할 수 있는 배아의 양질성 판단을 위한 재조합 백터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 백터를 이용하여 형질전환된 동물세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 백터 및 재조합 백터에 의해 형질전환된 동물세포를 이용한 배아의 양질성 판단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 백터 및 재조합 백터에 의해 형질전환된 동물세포를 이용한 배아의 양질성 판단용 바이오 센서 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 배아의 배양 생성물에 의해 발현되는 유전자의 프로모터; 및 상기 배아의 발현에 의해 증가되는 유전자 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 배아의 배양 생성물에 의해 발현되는 유전자는 금속단백분해효소-9 (MMP-9), 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA), 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6), 표피증식인자(Epidermal Growth Factor, EGF) 및 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자일 수 있다.

본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터 또는 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 프로모터; 및 상기 금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터 또는 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명자들은 인공 임신의 가능성을 높이기 위한 우수한 배아를 선별하기 위하여 배아 배양 시 분비되는 물질에 의해 발현되는 다양한 유전자의 프로모터를 이용하여 우수한 배아를 선별하고자 예의 연구 노력한 결과, 상기 유전자의 프로모터 및 이에 의해 작동되도록 연결된 형광 단백질이 삽입된 재조합 벡터, 및 이에 의해 형질전환된 동물세포를 이용할 경우, 저비용 및 짧은 시간 안에 배아의 양질성을 판단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터 및 금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 프로모터 및 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 백터에 있어서, 상기 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 프로모터는 서열번호 1, 2 및 5의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 정방향 프라이머(Forward primer) 및 서열번호 3, 4 및 6의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 역방향 프라이머(Reverse primer)를 이용하여 PCR 증폭을 통해 수득된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터는 서열번호 7 내지 9의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 정방향 프라이머(Forward primer) 및 서열번호 10의 역방향 프라이머(Reverse primer)를 이용하여 PCR 증폭을 통해 수득된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 형광 단백질은 청록색 형광 단백질 (monomeric Teal Fluorescent Protein, TFP) 또는 녹색형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)인 것을 특징으로 한다.

상기 용어 '프로모터'란, 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, '작동 가능하게 연결된'은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 영향을 받는 것을 의미한다.

또한, 전사를 조절 하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사-해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서와 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함하는 벡터일 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 발현 벡터는 pLS-mp일 수 있다.

본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 동물세포를 제공한다.

본 발명의 형질전환을 위한 동물세포는 배아와 상호작용(cross-talk)할 수 있는 어떠한 동물세포도 이용할 수 있으며, 바람직하게는 자궁내막 기질세포(T-hEnSC) 또는 헬라 세포(HeLa 세포)인 것을 특징으로 한다.

동물세포 내부로 외부 DNA를 형질주입(transfection) 시키는 방법은 다양하다. 일반적으로 형질주입(transfection) 효율이나 세포에 대한 독성, 생리학적 부작용, 실험 방법의 용이성 등이 중요하게 고려되는 요소들이다. 사용하는 세포의 종류나 실험의 목적에 따라 최적의 방법을 선택해서 사용해야 한다.

본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 재조합 벡터를 동물세포에 형질전환 시키는 제 1단계; 배아를 배지에 배양시킨 후, 배지만을 분리하는 제 2단계; 상기 제1 단계에서 형질전환된 동물세포에 제 2단계에서 분리한 배지를 처리하는 제 3단계; 및 상기 제 3단계의 배지에서 형광 단백질의 발현을 측정하는 단계;를 포함하는, 배아의 양질성 판단 방법을 제공한다.

본 발명의 배아의 양질성 판단 방법에 있어서, 상기 형광 단백질의 발현량이 대조군 대비 1.5배 이상 증가한 경우, 배아의 양질성이 우수하다고 판단하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 배아의 배양 생성물인 젖산 등에 의해 발현이 증가되는 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 또는 금속단백분해효소-9 (MMP-9) 유전자 프로모터가 삽입된 플라스미드에 의해 형질전환된 헬라(HeLa) 세포 및 자궁내막 기질세포(T-hEnSCs)에 배아 배양 배지를 처리하여 형광 발현 정도를 측정한 결과, 배아를 배양하지 않은 배지보다 좋은 품질 배아를 배양한 배지에서 형광 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 배아의 배양 생성물에 의해 변화하는 형광 발현 정도를 측정함으로써 배아의 양질성을 판단할 수 있음을 보여준다.

본 발명의 따른 한 양태에 따르면, 본 발명은, 본 발명의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 동물세포를 포함하는 배아의 양질성 판단용 바이오 센서를 제공한다.

본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은, 금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터 또는 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 프로모터, 및 상기 금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터 또는 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형관 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 제조하는 제 1단계; 및 상기 제 1단계에서 제조된 재조합 벡터를 동물세포에 형질전환 시키는 제 2단계;를 포함하는, 배아의 양질성 판단용 바이오 센서의 제조방법을 제공한다.

전술한 바와 같이, 배아의 배양 생성물에 의해 발현되는 유전자의 프로모터가 삽입된 재조합 벡터에 의해 형질전환된 동물세포를 이용하여 배아 배지에 따라 변화하는 형광 발현 정도를 측정함으로써 비침습적이며, 저비용 및 짧은 시간 안에 배아의 양질성을 판단할 수 있다.

도 1은 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 유전자의 프로모터를 분석한 결과이다.
도 2는 금속단백분해효소-9 (MMP-9) 유전자의 프로모터를 분석한 결과이다.
도 3은 pLS-mP 벡터의 map을 나타낸다.
도 4는 젖산 센싱 벡터(Lactate sensing vector)의 map을 나타낸다.
도 5는 금속단백분해효소-9(MMP-9) 재조합 플라스미드의 염기서열을 나타낸다.
도 6은 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 재조합 플라스미드의 염기서열을 나타낸다.
도 7은 배아 배양배지 내 배아의 질에 따른 젖산의 농도를 측정한 실험예 1에 대한 결과이다.
도 8은 젖산의 농도에 따른 형광 발현을 측정한 실험예 2에 따른 결과이다.
도 9는 배아를 배양하지 않은 배지 또는 배아를 배양한 배지에 따른 형광 발현을 측정한 실험예 2에 따른 결과이다.
도 10은 본원발명 실험예 3에 따른 결과이다.
도 11은 본원발명 실험예 4에 따른 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

준비예 1: HeLa세포 및 자궁내막 기질세포의 배양

사람의 자궁경부암 조직에서 얻은 헬라(HeLa) 세포주는 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 U/ml 페니실린(penicillin) 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 MEM(minimum essential medium) 배지에서 37℃와 5% 이산화탄소 농도 조건에서 배양하였다.

사람 자궁내막 기질세포 (T-hEnSCs)는 10% 차콜-여과된 소태아혈청(charcoal-stripped FBS), 1% ITS + Premix, 100 U/ml 페니실린 (penicillin) 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM/F12 배지에서 37℃와 5% 이산화탄소 농도 조건에서 배양하였다.

실시예 1: 바이오마커 유전자의 프로모터 클로닝

자궁내막 기질세포 T-hEnSCs에서 Promega 사의 Wizard genomic DNA purification kit를 이용하여 분리한 genomic DNA를 이용하여 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 유전자 프로모터(promoter) 및 금속단백분해효소-9 (MMP-9) 유전자의 프로모터(promoter) 부분을 UCSC genome browser (http://genome.ucsc.edu/)의 Human (GRCh37/hg19)에서 H3K27ac의 패턴을 이용하여 분석하고, PCR로 확보하였다.

프로모터 부분은 transcription start site로부터 upstream 500 bp와 1000 bp까지 PCR 프라이머(primer)를 각각 디자인하였으며, 구체적인 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다. 제한효소로는 프라이머의 정방향 프라이머(forward primer)에는 Xba1을, 역방향 프라이머(reverse primer)에는 Age1을 첨가하여 사용하였다.

No.	Primer Name	Sequence (5'- 3')
1	vegfa_S1_F1-Xba1	AAAtctagaATAGGGGGTCCAGGAGCAAA
2	vegfa_S1_F2-Xba1	AAAtctagaGATGGCACATTGTCAGAGGGA
3	vegfa_S1_R1	GTCTGTCTGTCCGTCAGCG
4	vegfa_S1_R2-Age1	AAAaccggtTCCCCGCTACCAGCCGACTTTT
5	vegfa-Long-F-Xba1	AAAtctagaCCTCAGAGCCCCAACTTTGT
6	vegfa-Long-R-Age1	AAAaccggtAACTCTGTCCAGAGACACGC
7	MMP9-S1-F1-Xba1	AAAtctagaCTTGCCTAGCAGAGCCCATT
8	MMP9-S1-F2-Xba1	AAAtctagaGAAGCAGGGAGAGGAAGCTG
9	MMP9-Long-F-Xba1	AAAtctagaGGGAGGCTTGGCATAAGTGT
10	MMP9-S1-R2-Age1	AAAaccggtCTCCAGGGAAGAGCACAAGG

Predenaturation	95˚C 5 min
Denaturation	95 ˚C 1 min
Annealing	60 ˚C 1 min
Extension	72 ˚C 1 min
Total cycle	30 cycle
Post-extension	72 ˚C 5 min
PCR 조성물 조성	Taq 2X Master mix(BioLabs 사의 LongAmp^®), 2 pmole의 각각의 primer, 100 ng genomic DNA

상기 표 1에 기재된 각 set의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 상기 표 2와 같다. 그 다음, 얻어진 PCR 산물을 정제한 후, Xba1과 Age1을 처리하였다. 벡터인 pLS-mp를 프라이머에 적용한 제한효소인 Xba1과 Age1을 처리하여 정제하였다. 각각의 제한효소를 처리한 PCR 산물과 pLS-mp를 리게이션(ligation) 반응을 수행하였다. Ligation된 pLS-mp를 대장균 stbl3에 형질전환하여 재조합된 플라스미드를 확보하였고, 염기서열로 제대로 클로닝이 되었는지 확인하였다.

혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 유전자 프로모터 및 금속단백분해효소-9(MMP-9) 유전자의 프로모터를 분석한 결과는 도 1 및 2에 나타내었으며, pLS-mP 벡터 map은 도 3에 나타내었다.

클로닝한 후, 형질전환된 콜로니 중 금속단백분해효소-9(MMP-9)(10-8) 및 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA)(1-7)의 플라스미드를 얻어 염기서열을 결정하였다. 얻어진 염기서열을 금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터와 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 프로모터의 서열과 정렬(alignment)을 수행하여, 클로닝된 플라스미드의 염기서열을 결정하였다. 금속단백분해효소-9(MMP-9) 재조합 플라스미드의 염기서열은 서열번호 11(도 5)로 표시하였으며, 혈관내피세포성장인자 A(VEGFA) 재조합 플라스미드의 염기서열은 서열번호 12(도 6)로 표시하였다.

실시예 2: HeLa 세포의 형질전환 및 LPS처리

HeLa 세포를 24 well plate에 1 x 10⁴ cells/well으로 분주한 후, 12시간 동안 배양하였다. 그리고 젖산(Lactate)에 의해 발현이 증가되는 (VEGFA, MMP9) plasmid(실시예 1) 각각을 Lipofectamine® 3000 (L3000-001, Life technologies)을 이용하여 HeLa 세포에 transfection 하고 24시간 배양하였다. 이후에 각 well에 growth medium을 교체 후 24시간 배양하였다.

Lipopolysaccharide (LPS)는 이후 젖산(Lactate) 또는 배아 배양 배지를 농도 별로 처리 할 때, 대조군으로 LPS (none, 1 μg/ml)를 처리하였다.

실시예 3: 자궁내막 세포의 형질전환

자궁내막 기질세포(T-hEnSCs)를 24well plate에 1 x 10⁴ cells/well으로 분주한 후 12시간 동안 배양하였다. 그리고 젖산(Lactate)에 의해 발현이 증가되는 (mmp-9, VEGFA) plasmid(실시예 1) 각각을 Lipofectamine® 3000 (L3000-001, Life technologies)을 이용하여 T-hEnSCs 세포에 transfection 하고 24시간 배양하였다. 이후에 각 well에 growth medium을 교체 후 24시간 배양하였다.

실험예 1: 젖산(Lactate) 농도 측정

젖산 농도는 Biovision 사의 Lactate Colorimetric assay kit를 이용하여 분석하였다.

Good 또는 bad quality의 배아를 배양한 배지와 배아 배양 배지 사이의 젖산(Lactate) 농도 차이를 분석하기 위하여, 배양 후 상층액을 얻어 원심 분리하여 세포를 완전히 제거하여 배양액만 모은 후 Biovision 사의 Lactate Colorimetric assay kit를 이용하여 분비된 Lactate 양을 측정하였다. 각 well에 0.5 μl의 시료를 첨가한 후 Lactate Assay Buffer로 volume을 50 μl/well 로 조절하였다. 그리고 colorimetric assay의 경우 Lactate standard (MW 90.08)을 희석하여 각 well에 0, 2, 4, 6, 8, 10 nmol/well이 되게 분주하였다. 그리고 각 well에 Reaction Mix (Lactate Assay Buffer 46 μl, Lactate Enzyme Mix 2 μl, Probe 2 μl)를 각 50 μl씩 첨가한 후 30분 동안 암실 상태의 상온에서 반응시킨 후 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 standard solution의 농도에 따라 배양액 내의 Lactate 농도를 계산하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

그 결과, 도 7에서 확인할 수 있듯이, 좋은 배아가 배양된 배지에서 젖산의 농도가 증가하였으나, Good, None, Bad 배양 배지에서의 젖산의 농도는 크게 차이가 없었다.

실험예 2: Lactate sensing vector를 이용한 배아 품질 검출

Lactate sensing vector를 이용해 배아 품질을 측정하기 앞서 헬라(HeLa)세포를 이용해 lactate sensing이 잘 되는 조건을 찾기 위해 plasmid 농도와 lactate 농도 및 반응 시간을 변경해 가며 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

상기 결과를 바탕으로 헬라(HeLa) 세포 및 자궁내막 세포(T-hEnSCs)에 Lactate sensing vector를 transfection하여 배아 배양 배지내의 젖산(lactate)을 sensing하였다. Lactate sensing vector map은 도 4에 나타내었다.

구체적으로, 자궁내막 세포(T-hEnSCs) 또는 헬라(HeLa) 세포를 24well plate(Black plate, clear bottom)에 1 x 10⁴ cells/well으로 분주한 후 12시간 동안 배양하였다. 그리고 젖산(Lactate)의 발현을 sensing하는 pcDNA를 Lipofectamine® 3000 (L3000-001, Life technologies)을 이용하여 각 세포에 transfection 하고 24시간 배양하였다. 이후에 각 well에 growth medium을 교환 후 24시간 배양하였다. 이후 배아 배양 배지를 group별로 처리하고 세포를 30분 배양 한 후 특정 파장대(mTFP: Excitation 430 nm, Emission 485, Venus: Excitation 430 nm, Emission 528 nm)에서 형광을 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이, 젖산(lactate)의 농도가 증가할수록 형광이 증가하였다.

또한, 도 9에서 확인할 수 있듯이, 배아를 배양하지 않은 배지(None)보다 좋은 품질의 배아를 배양한 배지(Good)에서 형광 발현이 더 증가한 것을 확인하였다.

실험예 3: 배아 품질 검출을 위한 플라스미드의 발현 양상 분석

실시예 2에 따라 형질전환된 헬라(HeLa) 세포에 젖산(Lactate)을 농도 별로(1 mM, 5 mM, 10 mM, 및 50 mM) 처리하고 positive control로 LPS (1 μg/ml)를 처리한 후, 30분 및 4시간 후에 특정 파장대 (GFP: Excitation 510 nm, Emission 530 nm)에서 형광의 발현 정도를 측정하였으며. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

구체적으로, 형광의 발현 정도는 24well plate (Black plate, clear bottom)에 HeLa 세포를 12시간 동안 배양 후, 각각의 플라스미드를 2일 동안 형질전환 하였다. 형질전환 2일 후 젖산(Lactate)을 농도 별로(1mM, 5 mM, 10mM, 50mM) 처리하고 positive control로 LPS (1 μg/ml)를 처리한 후 4시간 후 BioTek사의 Synergy H1 Hybrid Multi-mode microplate reader에 상기 24well plate를 넣고 GFP: Excitation 510 nm, Emission 530 nm 파장에서 측정하였다.

그 결과, 도 10에서 확인할 수 있듯이, 젖산(lactate)의 높은 농도 및 LPS 처리군에서 plasmid의 발현이 증가해 높게 detection 되었다. 이러한 결과를 바탕으로 이후에 배아 품질 검출에 사용할 플라스미드를 결정하였다.

실험예 4: 형질전환된 자궁내막 세포 및 HeLa 세포를 이용한 배아 품질 검출

실시예 2 및 실시예 3에 따라 형질전환된 자궁내막세포(T-hEnSCs)에 배아 배양 배지를 처리 하여 형광발현을 정도를 측정하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

구체적으로, 형광발현 측정은 24well plate (Black plate, clear bottom)에 T-hEnSCs/HeLa 세포를 12시간 동안 배양 후, 각각의 플라스미드를 2일 동안 형질전환 하였다. 형질전환 2일 후 배아 배양 배지를 처리한 후 4시간 후 BioTek사의 Synergy H1 Hybrid Multi-mode microplate reader에 상기 24well plate를 넣고 GFP: Excitation 510 nm, Emission 530 nm 파장에서 측정하였다.

그 결과, 도 11에서 확인할 수 있듯이, 배아를 배양하지 않은 배지 (None)보다 좋은 품질의 배아를 배양한 배지(Good)에서 형광 발현이 1.5 배 증가하는 것을 확인하였다.

<110> LEE, Hee Sun KIM, Myung Hee JEONG, Hyeon Jeong CHUNG, Mi Kyung <120> QUALITY EVALUATION METHOD OF EMBRYO, AND BIOSENSOR SYSTEM FOR QUALITY EVALUATION <130> P18-0147 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vegfa_S1_F1-Xba1(forward primer) <400> 1 aaatctagaa tagggggtcc aggagcaaa 29 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vegfa_S1_F2-Xba1(forward primer) <400> 2 aaatctagag atggcacatt gtcagaggga 30 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vegfa_S1_R1(reverse primer) <400> 3 gtctgtctgt ccgtcagcg 19 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vegfa_S1_R2-Age1(reverse primer) <400> 4 aaaaccggtt ccccgctacc agccgacttt t 31 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vegfa-Long-F-Xba1(forward primer) <400> 5 aaatctagac ctcagagccc caactttgt 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vegfa-Long-R-Age1(reverse primer) <400> 6 aaaaccggta actctgtcca gagacacgc 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9-S1-F1-Xba1(forward primer) <400> 7 aaatctagac ttgcctagca gagcccatt 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9-S1-F2-Xba1(forward primer) <400> 8 aaatctagag aagcagggag aggaagctg 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9-Long-F-Xba1(forward primer) <400> 9 aaatctagag ggaggcttgg cataagtgt 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9-S1-R2-Age1(reverse primer) <400> 10 aaaaccggtc tccagggaag agcacaagg 29 <210> 11 <211> 1158 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP9-pLSmp sequence(Recombinant vector) <400> 11 ttcaccttgg atttaatcgt ctgcatttct gcagggcccg ctctagactt gcctagcaga 60 gcccattcct tccgccccca gatgaagcag ggagaggaag ctgagtcaaa gaaggctgtc 120 agggagggaa aaagaggaca gagcctggag tgtggggagg ggtttgggga ggatatctga 180 cctgggaggg ggtgttgcaa aaggccaagg atgggccagg gggatcatta gtttcagaaa 240 gaagtctcag ggagtcttcc atcactttcc cttggctgac cactggaggc tttcagacca 300 agggatgggg gatccctcca gcttcatccc cctccctccc tttcatacag ttcccacaag 360 ctctgcagtt tgcaaaaccc tacccctccc ctgagggcct gcggtttcct gcgggtctgg 420 ggtcttgcct gacttggcag tggagactgc gggcagtgga gagaggagga ggtggtgtaa 480 gccctttctc atgctggtgc tgccacacac acacacacac acacacacac acacacacac 540 acacaccctg acccctgagt cagcacttgc ctgtcaagga ggggtggggt cacaggagcg 600 cctccttaaa gcccccacaa cagcagctgc agtcagacac ctctgccctc accatgagcc 660 tctggcagcc cctggtcctg gtgctcctgg tgctgggctg ctgctttgct gcccccagac 720 agcgccagtc cacccttgtg ctcttccctg gagaccggtc gccaccatgg tgagcaaggg 780 cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg 840 ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct 900 gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct 960 gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt 1020 caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg 1080 caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgaa accctggtga accgcatcga 1140 gctgaagggc atcgactt 1158 <210> 12 <211> 1125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA-pLSmp sequence(Recombinant vector) <400> 12 cacttgtggt gtctaatcag cctgcatttc tgccagggcc cgctctagaa tagggggtcc 60 aggagcaaac tccccccacc ccctttccaa agcccattcc ctctttagcc agagccgggg 120 tgtgcagacg gcagtcacta gggggcgctc ggccaccaca gggaagctgg gtgaatggag 180 cgagcagcgt cttcgagagt gaggacgtgt gtgtctgtgt gggtgagtga gtgtgtgcgt 240 gtggggttga gggtgttgga gcggggagaa ggccaggggt cactccagga ttccaataga 300 tctgtgtgtc cctcgcccca cccggccctg aaaattctaa tgattcccct gcccccttca 360 atattcctag cagagaggga acggctctca ggccctgtcc gacgtaacct cacttgcctg 420 atccctcatc ggtgatgccc cgcgggcgcg aagctctgga cagagcttcg gggggcagat 480 gggtagttta gaggctgttg accttgaaag ggatttagct tccccttcat tacggcaggg 540 tttggaagag ggtaaactgg gagaaggcag aacccgggtc ttagaaaaat tatttggttt 600 tgaagctcga ttgtaatgct caaagggcca gtaggggggg gaatcaagtt cgtggggaga 660 aatgcgctgc tccttagggt ttaaaggcag ggactagtgg gagatgataa gttggtagga 720 taggcaagta cgtggagtcg gggtgcagag ggctataaat gctctcgtct gaaggaaagg 780 gtgtgtagga cgtgtcacgc tatgtgtatg ccggcgaagg agctggtaca catgtgaaag 840 cattgtagac gaaaaagaag tcaacataga caaataagag tcacccggat cccgtgagct 900 cagggcaagt acaccgacag gaagaagaac gtggcgcaca cgaacagagc gcccgtcgca 960 ccgggtgcag ggtgggcatg aaggagagat ctgactagtg tgtgagtttg tcttcaacgg 1020 ggtcatcaag cgtcatcaca cgagtgccca caacatccgg tgcatgtgag ttgagccgag 1080 tgtgccaagg atctattgga atggtcagca taggacatcg ggcgt 1125

Claims

삭제
금속단백분해효소-9 (MMP-9) 프로모터; 및 상기 금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 배아 양질성 판단용 동물세포.
제2항에 있어서,
금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터 및 금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 것인, 배아 양질성 판단용 동물세포.
제2항에 있어서,
상기 동물세포는 젖산을 센싱함으로써 배아의 양질성을 판단하는 것을 특징으로 하는, 배아 양질성 판단용 동물세포.
삭제
제2항에 있어서,
금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터는 서열번호 7 내지 9의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 정방향 프라이머(Forward primer) 및 서열번호 10의 역방향 프라이머(Reverse primer)를 이용하여 PCR 증폭을 통해 수득된 것인, 배아 양질성 판단용 동물세포.
제2항에 있어서,
상기 형광 단백질은 청록색 형광 단백질(TFP) 또는 녹색형광 단백질(GFP)인 것인, 배아 양질성 판단용 동물세포.
삭제
제2항에 있어서,
상기 동물세포는 자궁내막 기질세포(T-hEnSC) 또는 헬라 세포(HeLa cell)인 것인, 배아 양질성 판단용 동물세포.
제2항의 형질전환 동물세포를 제작하는 제 1단계;
배아를 배지에 배양시킨 후, 배지만을 분리하는 제 2단계;
상기 제1 단계에서 형질전환된 동물세포에 제 2단계에서 분리한 배지를 처리하는 제 3단계; 및
상기 제 3단계의 배지에서 형광 단백질의 발현을 측정하는 단계;를 포함하는, 배아의 양질성 판단 방법.
제10항에 있어서,
상기 형광 단백질의 발현량이 대조군 대비 1.5배 이상 증가한 경우, 배아의 양질성이 우수하다고 판단하는 것인, 배아의 양질성 판단 방법.
제2항의 동물세포를 포함하는 배아의 양질성 판단용 바이오 센서.
금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터 및 상기 금속단백분해효소-9(MMP-9) 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 형광 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 제조하는 제 1단계; 및
상기 제 1단계에서 제조된 재조합 벡터를 동물세포에 형질전환 시키는 제 2단계;를 포함하는,
배아의 양질성을 판단하기 위한 배아 양질성 판단용 바이오 센서의 제조방법.