KR20160105002A - 미분화 치수줄기세포에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 그의 용도 - Google Patents

미분화 치수줄기세포에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미분화된 치수세포에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체, 상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 단클론 항체를 포함하는 치수줄기세포의 분화여부 확인용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 치수줄기세포의 분화여부 확인용 키트, 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 치수줄기세포의 분화여부를 확인하는 방법, 상기 단클론 항체를 포함하는 미분화된 치수줄기세포 분리용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 미분화된 치수줄기세포 분리용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 미분화된 치수줄기세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 단클론 항체를 이용하면, 치수줄기세포의 미분화 상태를 확인할 수 있을 뿐만 아니라 미분화 상태의 치수줄기세포를 분리할 수 있으므로, 치수줄기세포를 이용한 다양한 줄기세포 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

미분화 치수줄기세포에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 그의 용도{Monoclonal antibody specific binding undifferentiated dental pulp stem cells and uses thereof}
본 발명은 미분화 치수줄기세포에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 미분화된 치수세포에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체, 상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 단클론 항체를 포함하는 치수줄기세포의 분화여부 확인용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 치수줄기세포의 분화여부 확인용 키트, 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 치수줄기세포의 분화여부를 확인하는 방법, 상기 단클론 항체를 포함하는 미분화된 치수줄기세포 분리용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 미분화된 치수줄기세포 분리용 키트 및 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 미분화된 치수줄기세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.
성체줄기세포는 피부, 신경조직, 및 골수 등 다양한 성체 조직에 존재한다. 이러한 성체줄기세포는 그들의 이용에 있어서 극복해야할 윤리적 문제가 없고 암 생성 가능성이 낮아 배아줄기세포에 비하여 세포 매개 치료와 재생의약 용도로 더욱 유용하다고 알려져있다. 특히, 성체줄기세포의 일종인 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)는 오스테오블라스트(골), 콘드로사이트(연골), 아디포사이트(지방) 등 다양한 세포로 분화할 수 있는 다능성 줄기세포로서, 치수조직 등 다양한 조직으로부터 용이하게 분리될 수 있다고 알려져 있다.
치아는 다른 어떤 조직보다도 높은 자가증식 능력과 분화능력을 가진 중간엽 줄기세포 집단을 포함하는데, 최근에는 자연적으로 빠진 치아나 수술적으로 제거된 치아에서도 쉽게 중간엽 세포를 얻을 수 있다는 장점 때문에 치아의 성체줄기세포 공급원으로서의 이용에 대한 관심이 높아지고 있다. 줄기세포의 특성을 갖는 세포집단이 유치나 영구치의 치수, 치근과 뼈 사이를 연결하는 치주 인대, 성장중인 치근, 미붕출치아(unerupted tooth)를 둘러싸고 있는 치낭, 치근유두(apical papilla) 등 치아의 여러 부분에서 분리되고, 잇몸에서도 치아 줄기세포가 분리되고 있다. 상기 세포들은 생체 내외에서 특정한 유전자 마커를 발현하고 중간엽세포 계열의 조골세포, 지방세포, 연골세포 등으로 분화가 가능하며 다른 계통의 세포들로도 분화할 수 있는 유연성을 갖는다. 사람의 치수에서 분리한 치수줄기세포는 높은 증식능력을 가지며, 신경세포, 지방세포 상아질 모세포로 분화될 수 있고, 생체 내 이식 후에 뼈의 형성을 유도하고, 상아질을 생성하며 치아가 아닌 다른 세포로도 분화할 수 있는 능력이 있는 것으로 보고됨에 따라, 이러한 치아 줄기세포를 이용하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
예를 들어, 한국특허공개 제2009-0033641호에는 광화능을 갖는 인간 치아 줄기세포 및 그의 배양방법이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2009-0033643호에는 새로운 치소낭 유래의 치아 줄기세포 및 그의 배양방법이 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2012-0089547호에는 법랑모세포, 애피컬 버드세포 또는 이들의 배양액을 유효성분으로 함유하는 경조직 형성 및, 상아질 또는 치수조직 재생용 조성물이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2014-0006323호에는 치수줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는, 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물이 개시되어 있다.
그러나, 이러한 치아줄기세포를 연구용 또는 산업용의 줄기세포로 사용하기에는 한가지 어려움이 있는데, 이는 상기 치아줄기세포에 미분화 줄기세포와 분화되거나 분화중인 줄기세포가 혼합되어 있다는 것이다. 즉, 유치, 영구체, 치수, 치주 등의 다양한 구강조직에 포함된 줄기세포는 상대적으로 우수한 분화능을 나타내기 때문에, 상기 줄기세포에는 이미 분화가 진행중이거나 또는 분화가 완료된 형태의 줄기세포가 포함되어 있어, 단일성과 균일성이 낮다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여는, 다양한 구강조직 유래 줄기세포로부터 분화된 조직세포와 미분화된 줄기세포를 구별하여야 하지만, 이러한 줄기세포를 효과적으로 구별할 수 있는 수단이 개발되지 않고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 다양한 구강조직 유래 줄기세포로부터 분화된 조직세포와 미분화된 줄기세포를 구별할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 미분화된 치수줄기세포에 특이적인 단클론 항체를 발굴하였는 바, 상기 단클론 항체를 사용할 경우, 분화된 조직세포와 미분화된 줄기세포를 효과적으로 구별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 미분화된 치수세포에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단클론 항체를 포함하는 치수줄기세포의 분화여부 확인용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 치수줄기세포의 분화여부 확인용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 치수줄기세포의 분화여부를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단클론 항체를 포함하는 미분화된 치수줄기세포 분리용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 미분화된 치수줄기세포 분리용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 미분화된 치수줄기세포를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 환자의 사랑니로부터 수득한 인간의 치수줄기세포(hDPSCs)를 배양하고, 이의 표면에서 발현되는 표면마커를 줄기세포의 마커와 비교한 결과, 미분화된 hDPSCs의 표면에서는 CD44, CD90 및 CD146이 높은 수준으로 발현되고, STRO-1의 발현수준이 다소 증가한 반면, 분화된 hDPSCs의 표면에서는 CD44, CD90, CD146 및 STRO-1의 발현수준이 급격하게 감소함을 확인하였으므로, 상기 hDPSCs가 일반적인 중간엽 줄기세포와 동일한 특성을 나타낼 것으로 예상하였다.
이에, 상기 미분화 hDPSCs를 마우스에 면역화시키고, 이로부터 림프구세포를 수득한 다음, 이로부터 미분화 hDPSCs의 표면항원과 결합할 수 있는 단클론 항체를 발굴하였다. 상기 발굴된 단클론 항체의 특성을 조사한 결과, 상기 단클론 항체는 IgG이고, IgG2b 아형을 나타내며, κ 경쇄를 포함하고, 분화된 hDPSCs의 표면보다는 미분화된 hDPSCs의 표면에 더욱 높은 수준의 결합친화도를 나타냄을 확인하였다. 또한, 상기 단클론 항체와 특이적으로 결합하는 미분화 hDPSCs의 표면항원은 약 180kDa의 크기를 갖고 N-glycosylation이 수행된 형태이며, 중간엽 줄기세포 마커의 발현과 연관됨을 확인하였다. 아울러, 상기 단클론 항체를 이용하면 미분화 hDPSCs와 분화된 hDPSCs를 명확하게 분리할 수 있음을 확인하였다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 미분화된 치수즐기세포에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체를 제공한다.
일 례로서, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.
다른 예로서, 통상적인 단클론 항체와 마찬가지로, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체 역시 2개의 전체 길이의 중쇄 및 2개의 전체 길이의 경쇄로 구성된다.
상기 중쇄는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 다른 예로서, 서열번호 7 또는 9로 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 8 또는 10으로 기재된 염기서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성될 수 있다.
상기 경쇄 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있고, 다른 예로서, 서열번호 11 또는 13으로 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 12 또는 14로 기재된 염기서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성될 수 있다.
또 다른 예로서, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체는 당해 분야에 공지된 방법에 의하여 제조될 수 있다. 일 례로서, 화학적 펩티드 합성방법으로 제조할 수도 있고, 상기 단클론 항체를 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수도 있으며, 상기 단클론 항체의 면역원을 동물에 주사하여 얻어진 림프구로부터 유래된 하이브리도마 세포주를 사용하여 제조할 수도 있고, 다른 예로서, 상기 단클론 항체가 특이적으로 결합되는 미분화된 치수줄기세포로부터 유래된 단백질을 면역원으로 동물에 접종하고, 상기 동물로부터 얻어진 림프구를 사용하여 제작된 하이브리도마 세포주를 사용하여 제조할 수 있다.
상기 단클론 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 이들을 구성하는 일부 아미노산 서열이 변이된 형태 또는 항체 분자의 기능적인 단편을 포함하는 형태가 될 수도 있다.
단백질 및 폴리펩티드에서, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이며, 이러한 교환에 의하여 본 발명에서 제공하는 단클론 항체의 아미노산 서열로부터 변이된 서열의 단클론 항체가 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 상기 단클론 항체의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 항체 활성이 증가한 변이된 단클론 항체 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 일 례로서 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다.
상기 단클론 항체는 치수줄기세포에 결합할 수 있는데, 분화된 치수줄기세포 보다는 미분화된 치수줄기세포에 더욱 높은 친화도와 특이도를 갖고 결합할 수 있다. 따라서, 상기 단클론 항체는 치수줄기세포의 분화여부를 확인하거나 치수줄기세포로부터 미분화된 치수줄기세포를 분리하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "치수줄기세포(dental pulp stem cells, DPSCs)"란, 치수조직에 존재하는 줄기세포를 의미한다. 상기 치수줄기세포는 빠른 증식능력과 세포집탁 형성능력이 높아서 밀도가 높은 석회화 결절을 형성하며, 상아질모세포, 지방세포, 연골세포, 및 조골세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DPSCs는 미분화된 DPSCs를 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 상기 미분화된 DPSCs는 분화된 DPSCs에 비하여, CD44, CD90 및 CD146이 높은 수준으로 발현되고, STRO-1의 발현수준이 다소 증가한다는 점에서 차이를 나타내는데, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체에 의하여, DPSCs의 분화여부를 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 미분화된 DPSCs를 분화된 DPSCs와 분리할 수 있다.
한편, 본 발명의 단클론 항체는 상기 DPSCs 이외에도 인간의 치주인대 세포(hPDLCs), 치근 섬유아세포(hGFs) 및 골수성 중간엽 줄기세포(BMMSCs)에 대하여도 높은 특이도를 갖고 결합할 수 있으므로, 상기 인간의 치주인대 세포(hPDLCs) 또는 치근 섬유아세포(hGFs)에 포함된 미분화 줄기세포를 분리하는데 사용할 수도 있다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본 발명의 용어 "하이브리도마 세포주"란, 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종 세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다. 특히, 골수종 세포(myeloma cell)와 비장이나 림프절에 들어 있는 림프구 가운데 항체 생성세포의 선구세포인 B세포를 융합시킨 잡종세포는 단일 클론항체를 만들어내므로 연구와 임상에 널리 응용된다. 그 밖에 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T세포와 그 종양세포인 하이브리드마 등도 실용화되고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 하이브리도마 세포주는 본 발명에서 제공하는 미분화된 치수세포에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주인 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 환자의 사랑니로부터 수득한 인간의 치수줄기세포(hDPSCs)를 배양하고, 이의 표면에서 발현되는 표면마커를 줄기세포의 마커와 비교한 결과, 미분화된 hDPSCs의 표면에서는 CD44, CD90 및 CD146이 높은 수준으로 발현되고, STRO-1의 발현수준이 다소 증가한 반면, 분화된 hDPSCs의 표면에서는 CD44, CD90, CD146 및 STRO-1의 발현수준이 급격하게 감소함을 확인하였다. 또한, 치근단유두(dental apical papilla) 줄기세포의 표면마커인 CD24 및 CD106은 미분화 또는 분화된 hDPSCs의 표면에서 발현되지 않음을 확인하였다(도 1). 이에, 마우스에 미분화된 hDPSCs를 접종하여 면역화시키고, 이로부터 림프절을 적출하여 림프구세포를 수득한 다음, 상기 수득한 림프구세포와 골수종 세포를 융합시켜서 다양한 단클론 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 수득하였다. 상기 하이브리도마 세포로부터 발현되는 각각의 단클론 항체 중에서, 분화된 hDPSCs 보다도 미분화된 hDPSCs에 더욱 높은 친화성으로 결합하는 단클론 항체(α-1G9)를 선발하였다(실시예 2-1).
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 단클론 항체를 포함하는 치수줄기세포의 미분화 확인 또는 분리용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 단클론 항체는 미분화된 DPSCs의 표면에서 발현되는 표면항원과 특이적으로 결합하여 미분화된 DPSCs를 구별 또는 분리하는 방법에 사용될 수 있으므로, 이의 편이성을 위하여, 상기 항체에 구별가능한 표지물질이 결합된 형태로 이용될 수 있다. 상기 표지물질은 상기 단클론 항체에 결합되어 목적하는 표면항원이 발현된 미분화된 DPSCs를 구별 또는 분리하는데 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서, 리간드, 비드(bead), 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광물질(fluorescer), 화학발광물질, 자성 입자, 합텐, 염료 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 바이오틴, 아비딘, 스트렙토아비딘 등의 리간드; 루시퍼라아제, 퍼옥시다아제, 베타 갈락토시다아제 등의 효소; 플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인, 핵사크로로-6-카르복시플루오레세인, 테트라크로로-6-카르복시플루오레세인, VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노 나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린 및 이의 유도체, 시아닌-5, 루시퍼 옐로우, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 야키마 옐로우, 칼 플루오르레드 610, 쿠마린, 이들의 유도체 등의 형광물질 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "분화"란, 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 발달과정의 일부를 의미하는데, 구체적으로는, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 발달과정으로 해석될 수 있다. 일 례로서, 배아줄기세포와 같은 전능성 줄기세포가 외배엽, 중배엽 또는 내배엽성 세포로 변하는 과정이 될 수 있고, 다른 예로서, DPSCs가 골조직 또는 상아질 조직으로 변화되는 과정이 될 수도 있다.
본 발명의 용어 "골 분화(osteogenic differentiation)"란, 동물의 발달과정에서 나타나는, 골아세포 또는 골전구세포가 분화되어 골기질을 형성하고, 상기 형성된 골기질이 석회화되어 골을 형성하는 일련의 생리적 반응인 골형성(osteogenesis) 과정 중에서 골기질을 형성하는 발달과정을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 골 분화는 인위적으로 분화를 유도하여 DPSCs가 골 조직으로 변화되는 발달과정인 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "상아질 분화(dentinogenic differentiation)"란, 동물의 발달 과정에서 나타나는, 중외배엽 세포가 상아질 모세포를 형성하는 발달과정을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 상아질 분화는 인위적으로 분화를 유도하여 DPSCs가 상아질 조직으로 변화되는 발달과정인 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 선발된 단클론 항체의 특성을 분석한 결과, 상기 단클론 항체(α-1G9)는 IgG이고, IgG2b 아형을 나타내며, κ 경쇄를 포함하고(표 2), 분화된 hDPSCs의 표면보다는 미분화된 hDPSCs의 표면에 더욱 높은 수준의 결합친화도를 나타내며(도 3), 종래의 중간엽 줄기세포 마커(CD44 또는 CD106)에 비하여 분화된 hDPSCs에 대한 친화도와 미분화된 hDPSCs에 대한 친화도의 차이가 크고(표 3), 인간의 치주인대 세포(hPDLCs), 치근 섬유아세포(hGFs) 및 골수성 중간엽 줄기세포(BMMSCs)에 대하여는 CD44와 유사한 수준의 결합친화도를 나타내며(표 4), 상기 단클론 항체와 특이적으로 결합되는 표면항원은 약 180kDa의 크기를 갖고 N-glycosylation이 수행된 형태이며(도 5), 상기 단클론 항체(α-1G9)와 결합된 표면항원은 중간엽 줄기세포 마커의 발현과 연관됨을 확인하였다(도 6). 또한, 상기 단클론 항체를 미분화 hDPSCs를 선별하는데 사용할 수 있는지를 확인하고자, hDPSCs를 대상으로 상기 단클론 항체와 강하게 결합하는 미분화 hDPSCs 및 상기 단클론 항체와 약하게 결합하는 분화된 hDPSCs를 구별한 다음, 이들 구별된 각 hDPSCs의 골세포분화능을 비교한 결과, 상기 단클론 항체와 강하게 결합하는 미분화 hDPSCs는 상대적으로 높은 수준의 골분화능을 나타냄을 확인하였다(도 7).
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 조성물을 포함하는 치수줄기세포의 미분화 확인 또는 분리용 키트를 제공한다.
상술한 치수줄기세포의 미분화 확인 또는 분리용 조성물은 미분화 DPSCs를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이를 포함하는 DPSCs의 미분화 확인 또는 분리용 키트는 상기 조성물 이외에 상기 미분화 DPSCs를 확인 또는 분리하는 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함하는 방사선면역측정법(RIA) 키트, 효소 면역측정법(ELISA) 키트, 면역형광법 키트, 화학발광물질결합법 키트, 단백질칩 키트, 크로마토그래피 키트, 자기활성세포분리(Magnetic activated cell sorting, MACS) 키트 등이 될 수 있다.
일 례로서, 상기 키트는 상기 조성물의 제제가 고정된 기판 및 상기 DPSCs에 특이적이고 형광물질이 결합된 2차 항체를 포함하는 면역형광법 키트가 될 수 있다.
다른 예로서, 상기 키트는 상기 조성물의 제제가 결합된 비드, 상기 비드가 충진될 수 있는 컬럼 및 전개용 완충액을 포함하는 미분화 DPSCs 분리용 크로마토그래피 키트가 될 수 있다.
또 다른 예로서, 상기 키트는 상기 조성물의 제제가 결합된 바이오틴, 자성비드가 결합된 스트렙타비딘 및 자성발생장치를 포함하는 MACS 키트가 될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 치수줄기세포의 분화여부를 확인하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 치수줄기세포의 분화여부 확인방법은 (a) 상기 단클론 항체를 분리된 DPSCs에 가하여 반응물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 단클론 항체에 결합된 DPSCs의 함량을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 있어서, 대조군으로서 분화된 DPSCs에 상기 단클론 항체가 결합된 것을 사용하고, 상기 (b) 단계에서 측정된 함량이, 대조군에서 측정된 함량보다 상대적으로 높은 수준을 나타내는 경우, 상기 분리된 DPSCs가 미분화된 DPSCs인 것으로 판정할 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 미분화 치수줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 미분화 치수줄기세포를 분리하는 방법은 (a) 상기 단클론 항체 또는 조성물을 분리된 DPSCs에 가하여 반응물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 단클론 항체에 결합된 DPSCs를 회수하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 있어서, 상기 DPSCs의 회수는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 이용하여 수행될 수 있는데, 일 례로서, 유세포분석법, 면역침전법, 자기활성세포분리법, 크로마토그래피법 등을 사용할 수 있고, 다른 예로서, 형광물질로 표지된 조성물을 사용한 유세포분석법, 금 입자와 결합된 제제를 포함하는 조성물을 사용한 면역침전법, 자성 비드와 결합된 조성물을 사용한 자성분리법, 상기 제제와 결합된 비드가 충진된 컬럼을 이용한 크로마토그래피법 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서는 바이오틴이 결합된 단클론 항체와 DPSCs를 1차 반응시키고, 상기 반응물에 자성비드(MicroBeads)가 결합된 스트렙타비딘을 가하여, 상기 DPSCs에 자성비드를 표지한 다음, 자기활성세포분리법(MACS)을 이용하여 미분화 DPSCs를 분리하였다.
본 발명에서 제공하는 단클론 항체를 이용하면, 치수줄기세포의 미분화 상태를 확인할 수 있을 뿐만 아니라 미분화 상태의 치수줄기세포를 분리할 수 있으므로, 치수줄기세포를 이용한 다양한 줄기세포 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1의 A는 미분화 또는 분화된 hDPSCs(human dental pulp stem cells)를 대상으로 다양한 중간엽 줄기세포 마커의 발현수준을 유세포분석을 통하여 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 1의 B는 상기 얻어진 유세포분석결과를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 미분화된 hDPSCs에 결합할 수 있는 단클론항체를 제조하는 하이브리도마 세포를 제작하는 방법의 흐름을 나타내는 개략도이다.
도 3은 hDPSCs의 세포표면 분자에 대한 단클론 항체(α-1G9)의 결합친화도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)의 미분화 또는 분화된 hDPSCs에 대한 결합친화도 평균값을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)가 결합하는 미분화된 hDPSCs의 세포표면마커의 분자량을 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 6은 미분화된 hDPSCs를 대상으로 FITC가 결합된 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9) 및 중간엽 줄기세포마커(CD44, CD73 또는 CD90)에 대한 각각의 단클론 항체를 이용한 2색 유세포분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다
도 7은 단클론 항체(α-1G9)를 이용하여 선별된 미분화 또는 분화된 hDPSCs의 골분화능을 비교한 결과를 나타내는 사진(좌측) 및 그래프(우측)이다.
도 8은 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)를 이용하여 선별된 미분화 hDPSCs(Undiff) 및 분화된 hDPSCs(Diff)에서 발현되는 오스테오칼신, 오스테오넥틴, 알칼라인 포스파타제, DSPP 및 DMP-1의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 미분화된 hDPSCs ( human dental pulp stem cells )에 대한 세포표면 마커 분석
20 내지 25세의 성인환자로부터 폐기된 정상적인 사랑니를 수집하였다. 인간의 치수세포를 배양하기 위하여, 상기 사랑니를 파열시키고, 상단부와 뿌리부위에서 치수조직을 분리하였다. 치주인대 세포(periodontal ligament cell)와 치근섬유 아세포(gingival fibroblast)를 배양하기 위하여, 치추인대 조직과 치근의 돌기층을 각각 수집하였다. 조직편을 3 mg/㎖ collagenase type I과 4 mg/㎖ dispase를 포함하는 용액으로 37℃에서 1시간 동안 분해시켰다. 70-μM 스트레이너를 통하여 세포 현탁액을 수득하고, 20% FBS와 항생제를 포함하는 α-MEM 배지에 접종한 다음, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 무기질화 형질로 분화시키기 위하여, 세포를 분화배지(10% FBS, 5 mM β-glycerophosphate, 100 nM dexamethasone 및 100 μM ascorbic acid을 포함하는 α-MEM 배지)에 접종하고 7 내지 14일 동안 배양하여 hDPSCs의 분화를 유도하고, 상기 세포중에서 미분화된 상태는 일반적인 중간엽 줄기세포 마커를 사용한 면역표현형 분석을 통해 확인하였다.
이때, 면역표현형 분석은 다음과 같이 수행하였다: 무효소 분리완충액을 사용하여 세포를 분리하고, 이를 회수한 다음 5% FBS를 포함하는 PBS 에 현탁시켰다. 2 x 106 세포수/㎖의 세포에 PE(phycoerythrin)이 결합된 다양한 중간엽 줄기세포 마커(CD44, CD90, CD146, Stro-1, CD24 및 CD106)에 대한 각각의 단클론 항체를 처리하였다. 음성 대조군으로서, 항-마우스 IgG 또는 IgM을 처리한 것을 사용하였다. 얼음환경에서 30분동안 반응시킨 다음, 상기 세포를 대상으로 유세포분석을 수행하고, 얻어진 결과는 Cell Quest and WinMDI 2.9 program을 이용하여 정량분석하였다(도 1의 A 및 B).
도 1의 A는 미분화 또는 분화된 hDPSCs(human dental pulp stem cells)를 대상으로 다양한 중간엽 줄기세포 마커의 발현수준을 유세포분석을 통하여 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 1의 B는 상기 얻어진 유세포분석결과를 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 미분화된 hDPSCs의 표면에서는 CD44, CD90 및 CD146이 높은 수준으로 발현되고, STRO-1의 발현수준이 다소 증가한 반면, 분화된 hDPSCs의 표면에서는 CD44, CD90, CD146 및 STRO-1의 발현수준이 급격하게 감소함을 확인하였다. 또한, 치근단유두(dental apical papilla) 줄기세포의 표면마커인 CD24 및 CD106은 미분화 또는 분화된 hDPSCs의 표면에서 발현되지 않음을 확인하였다.
실시예 2: hDPSCs 의 세포표면 분자에 대한 단클론항체의 생산 및 특성분석
실시예 2-1: hDPSCs 의 세포표면 분자에 대한 단클론항체의 생산
10마리의 자성 Balb/c 마우스의 우측뒷다리의 발바닥과 좌측뒷다리의 발바닥에, 미분화 또는 분화된 hDPSCs를 1 x 106 세포수/30㎕의 농도로 어쥬번트를 첨가하지 않고 지정된 계획에 따라 1일 1회의 조건으로 8일동안 주사하여 면역화 반응을 유도하였다(표 1).
미분화 또는 분화된 hDPSCs의 주사계획
주사횟수 hDPSCs 1st 2nd 3rd 4th 5th 6th 7th 8th
왼발바닥
오른발바닥		 분화형
미분화형		 주사
-		 주사
주사		 주사
주사		 주사
주사		 주사
주사		 주사
주사		 주사
주사		 -
주사
면역화 반응을 유도한 다음, 미분화된 hDPSCs를 주사한 왼쪽발의 오금부위에서 림프절을 적출하고, 이로부터 림프구 현탁액을 수득하였으며, 상기 림프구를 FO 골수종 세포(myeloma cell)와 융합시켜서 하이브리도마를 제작하였고, 제작된 각각의 하이브리도마를 20% FBS/HAT가 포함된 DMEM 배지가 담겨진 96웰 플레이트에서 배양하였다(도 2).
도 2는 본 발명의 미분화된 hDPSCs에 결합할 수 있는 단클론항체를 제조하는 하이브리도마 세포를 제작하는 방법의 흐름을 나타내는 개략도이다.
상기 방법에 따라 총 245개의 하이브리도마를 제작하고, 상기 각각의 하이브리도마에서 생산된 단클론항체 중에서 분화된 hDPSCs 보다도 미분화된 hDPSCs에 더욱 높은 친화성으로 결합하는 단클론 항체(α-1G9)를 선발하였다.
실시예 2-2: 단클론항체의 아형분석
상기 실시예 2-1에서 선발된 단클론 항체의 아형을 분석하였다.
구체적으로. 96웰 플레이트에 랫트의 항-마우스 IgG1, 항-마우스 IgG2a, 항-마우스 IgG2b, 항-마우스 IgG3, 항-마우스 IgM, 항-마우스 IgA, 항-마우스 Igκ 및 항-마우스 Igλ를 코팅하고, 이에 10% FBS를 포함하는 PBS를 가하여, 블로킹한 다음, 상기 단클론 항체(α-1G9)를 처리하여 항원-항체반응을 수행하였으며, 반응산물을 대상으로 450nm에서 광학밀도를 측정하여 상기 단클론 항체(α-1G9)의 아형신호를 분석하였다(표 2).
단클론 항체(α-1G9)의 아형신호 분석결과
단클론 항체 IgG IgM IgA κ λ
G1 G2a G2b G3
α-1G9 - - + - - - + -
상기 표 2에서 보듯이, 상기 단클론항체는 IgG이고, IgG2b 아형을 나타내며, κ 경쇄를 포함함을 알 수 있었다.
실시예 2-3: hDPSCs 의 세포표면 분자에 대한 단클론항체의 결합친화도 분석
상기 실시예 2-1에서 선발된 단클론 항체(α-1G9)에 FITC를 표지한 다음, 미분화 또는 분화된 hDPSCs를 대상으로, 상기 표지된 단클론항체를 이용하여 유세포분석을 수행하여, 상기 미분화 또는 분화된 hDPSCs에 대한 결합친화도를 분석하였다(도 3).
도 3은 hDPSCs의 세포표면 분자에 대한 단클론 항체(α-1G9)의 결합친화도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 상기 단클론항체(α-1G9)는 분화된 hDPSCs의 표면보다는 미분화된 hDPSCs의 표면에 더욱 높은 수준의 결합친화도를 나타냄을 확인하였다.
상기 미분화 또는 분화된 hDPSCs에 대한 결합친화도를 종래의 중간엽 줄기세포 마커(CD44 또는 CD106)의 것과 비교하기 위하여, 5종의 미분화 또는 분화된 hDPSCs(Case1-5)를 각각 개별적으로 준비하고, 상기 준비된 각 hDPSCs를 이용하여 각 항체의 결합친화도를 측정한 다음, 이의 평균값을 산출하고(표 3), 측정된 평균값을 비교하였다(도 4). 도 4는 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)의 미분화 또는 분화된 hDPSCs에 대한 결합친화도 평균값을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
hPDSCs의 세포표면에 대한 항체의 결합친화도
단클론항체 CD106 CD44 1G9
미분화 hDPSCs
 Case1
Case2
Case3
Case4
Case5		 12.16
27.93
22.07
0
27.94		 93.76
93.63
94.55
84.14
85.29		 89.8
67.86
53.72
80.94
81.81
평균 18.02 90.27 74.83
분화 hDPSCs
 Case1
Case2
Case3
Case4
Case5		 0
0
0
0
24.17		 31.32
35.81
46.59
78.05
78.12		 12.82
0
22.71
63.68
59.31
평균 4.83 53.98 31.70
상기 표 3 및 도 4에서 보듯이, 미분화 또는 분화된 hDPSCs를 대상으로 종래의 중간엽 줄기세포 마커인 CD44 또는 CD106에 대한 단클론항체를 처리하여 측정한 결합친화도의 차이는 각각 36.29 및 13.19이었고, 본 발명에서 제공하는 단클론항체(α-1G9)를 사용하여 측정한 결합친화도의 차이는 43.13 이므로, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)는 종래의 중간엽 줄기세포 마커에 대한 항체보다도 미분화된 hDPSCs에 대하여 향상된 결합친화도를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-4: 대상조직별 결합친화도 분석
치수세포 뿐만 아니라, 치주인대(periodontal ligament)와 치근조직(gingival tissues) 역시 다능성 성체줄기세포의 원천으로 사용될 수 있으므로, 성체 줄기세포 및 전구세포의 적절한 마커로서 이들 항체에 의하여 인식되는 항원의 잠재력을 연구하기 위하여, 인간의 치주인대 세포(hPDLCs), 치근 섬유아세포(hGFs) 및 골수성 중간엽 줄기세포(BMMSCs)를 대상으로 상기 단클론 항체(α-1G9)의 결합친화도를 분석하였다(표 4). 이때, +++는 60% 이상이고, ++는 30 내지 60% 이며, +는 30% 이하이고, -는 반응성이 없음을 나타낸다.
단클론 항체(α-1G9)에 대한 대상조직별 결합친화도
단클론 항체 hGF hPDLSC hBMMSC
CD44
Stro-1
1G9		 +++
+++
+++		 +++
+
+++		 ++
++
++
상기 표 4에서 보듯이, CD44는 대부분의 세포표면과 비교적 강하게 결합하고, Stro-1은 hGFs의 세포표면과 강하게 결합하지만 hPDLSCs 및 BMMSCs의 표면에 대하여는 다소 약하게 결합함을 확인하였다. 이에 비하여, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)는 CD44와 유사한 비교적 높은 수준의 결합친화도를 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-5: 항원의 분자량 분석
미분화된 hDPSCs에 N-glycosylation의 억제제인 투니카마이신을 처리하지 않거나 또는 처리하고 세포를 배양하였다. 상기 배양된 hDPSCs의 세포표면에 바이오틴을 결합시키기 위하여, 상기 세포를 차가운 PBS(pH7.4)로 세척하고, 1 x 107 세포수/㎖의 세포를 포함하는 PBS에 1.0 mg Sulfo-NHS-LC-Biotin을 가하였다. 상기 바이오틴이 결합된 세포를 파쇄하여 세포파쇄물을 수득하고, 상기 세포파쇄물에 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)를 가하여 면역침전분석을 수행하였으며, 이로부터 침전물을 수득하였다. 상기 침전물을 대상으로 스트렙타비딘이 결합된 HRP를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 5).
도 5는 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)가 결합하는 미분화된 hDPSCs의 세포표면마커의 분자량을 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 5에서 보듯이, 투니카마이신이 처리되지 않은 조건에서는 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)가 결합하는 미분화된 hDPSCs의 세포표면마커는 약 180kDa의 분자량을 나타내었으나, 투니카마이신이 처리된 조건에서는 앞서 확인된 약 180kDa의 분자량을 나타내는 밴드가 소멸된 대신에, 약 50 내지 60kDa의 크기의 밴드가 새로이 나타남을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)가 결합하는 미분화된 hDPSCs의 세포표면마커는 약 180kDa의 크기를 갖고, N-glycosylation이 수행된 형태임을 알 수 있었다.
실시예 2-6: 중간엽 줄기세포 마커와의 연관성
본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)에 의하여 인식되는 표면분자의 발현이 다른 중간엽 줄기세포 마커와 연관되는지의 여부를 확인하기 위하여, 미분화 hDPSCs를 대상으로 FITC가 결합된 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9) 및 중간엽 줄기세포마커(CD44, CD73 또는 CD90)에 대한 각각의 단클론 항체를 이용한 2색 유세포분석을 수행하였다(도 6). 이때, 마우스 1차 및 2차 항체간의 교차반응성을 회피하기 위하여, 항-CD44 마우스 항체, 항-CD90 마우스 항체 및 항-CD73 마우스 항체를 바이오틴으로 표지하고, 스트렙타비딘이 결합된 PE(phycoerythrin)로 검출하였다.
도 6은 미분화된 hDPSCs를 대상으로 FITC가 결합된 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9) 및 중간엽 줄기세포마커(CD44, CD73 또는 CD90)에 대한 각각의 단클론 항체를 이용한 2색 유세포분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 1G9 양성 hDPSCs의 79.42%, 58.64% 및 75.94%가 세포표면에서 각각 CD44, CD90 및 CD73과 동시 발현됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)와 결합된 표면항원은 중간엽 줄기세포 마커의 발현과 연관될 것으로 분석되었다.
실시예 3: 단클론 항체(α-1 G9 )를 이용한 hDPSCs 의 골분화능의 예측
미분화된 hDPSCs는 이후의 분화과정에 따라, 골분화될 수 있으므로, 상기 단클론 항체(α-1G9)를 이용하여 선별된 hDPSCs를 대상으로 골분화능을 비교하였다.
먼저, hDPSCs(약 1 x 106세포수)에 바이오틴이 결합된 단클론 항체(α-1G9) 1 ㎍을 가하고 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 이를 세척하였으며, Streptavidin MicroBeads를 처리하고, 암소에서 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 자성비드(MicroBeads)로 표지된 미분화 hDPSCs를 MACS column system을 통해 분리함으로써, 미분화된 hDPSCs(Ab-positive) 또는 분화된 hDPSCs(Ab-negative)를 각각 수득하였다.
다음으로, 상기 수득한 미분화된 hDPSCs(Ab-positive) 또는 분화된 hDPSCs(Ab-negative)에 70% 에탄올을 실온에서 5분 동안 가하여 고정시킨 다음, 이를 건조시켰다. 상기 건조된 각 세포에 2 % alizarin red S (pH 4.5)를 가하여 염색반응을 수행한 다음, 세척하고 발색수준을 비교하였다. 또한, 상기 발색수준을 정량분석하기 위하여, 상기 염색된 세포에 10% 초산을 가하여 염료를 추출하고, 10% 수산화암모늄을 처리하여 중화시킨 다음, 405nm에서 광학밀도를 분석하였다(도 7).
도 7은 단클론 항체(α-1G9)를 이용하여 선별된 미분화 또는 분화된 hDPSCs의 골분화능을 비교한 결과를 나타내는 사진(좌측) 및 그래프(우측)이다. 도 7에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)를 이용하여 선별된 미분화 hDPSCs(Ab-positive)는 우수한 골분화능을 나타낸 반면, 상기 단클론 항체를 이용하여 선별된 분화된 hDPSCs(Ab-negative)는 매우 낮은 수준의 골분화능을 나타냄을 확인하였다.
한편, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)를 이용하여 선별된 미분화 hDPSCs(Undiff) 및 분화된 hDPSCs(Diff)를 대상으로 골 및 상아질 마커 단백질인 오스테오칼신(Osteocalcin), 오스테오넥틴(Osteonectin), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), DSPP(dentin sialophosphoprotein) 및 DMP-1(Dentin matrix acidic phosphoprotein 1)의 발현수준을 비교하였다(도 8).
도 8은 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)를 이용하여 선별된 미분화 hDPSCs(Undiff) 및 분화된 hDPSCs(Diff)에서 발현되는 오스테오칼신, 오스테오넥틴, 알칼라인 포스파타제, DSPP 및 DMP-1의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)를 이용하여 선별된 미분화된 hDPSCs 보다는 분화된 hDPSCs에서 골 및 상아질 마커 단백질로 알려진 오스테오칼신, 오스테오넥틴, 알칼라인 포스파타제, DSPP 및 DMP-1의 발현수준이 현저하게 증가함을 확인하였다. 따라서, 상기 단클론 항체(α-1G9)를 이용하여 선별된 미분화된 hDPSCs는 골 또는 상아질로 분화될 가능성이 높은 치수줄기세포임을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 단클론 항체(α-1G9)를 사용하면 미분화 또는 분화된 hDPSCs를 명확하게 구별할 수 있음을 알 수 있었다.
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aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccaggtatt attgtgccag agatgggggt 300 gactacccct ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgcagccaaa 360 acaacacccc catcagtcta tccactggcc cct 393 <210> 9 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain 6 <400> 9 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Ser Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 115 120 125 Leu Ala Pro 130 <210> 10 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser 115 <210> 12 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain 1 <400> 12 gacattcagc tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcactaat aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctattac acatcaagtt tacattcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagt tggagatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatcc 348 <210> 13 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain 6 <400> 13 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Thr Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser 115 <210> 14 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain 6 <400> 14 gatattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcactaat aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctattac acatcaagtt tacattcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagt tggagatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatcc 348

Claims (15)

  1. 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR1; 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR1; 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열로 구성된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 단클론 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 7 또는 9로 기재된 아미노산 서열로 구성된 중쇄 및 서열번호 11 또는 13으로 기재된 아미노산 서열로 구성된 경쇄를 포함하는 것인 단클론 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 8 또는 10으로 기재된 핵산서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 중쇄 및 서열번호 12 또는 14로 기재된 핵산서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 경쇄를 포함하는 것인 단클론 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    미분화된 치수줄기세포와 특이적으로 결합하는 것인 단클론 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단클론 항체를 포함하는 치수줄기세포의 분화여부 확인용 조성물.
  7. 제6항의 조성물을 포함하는 치수줄기세포의 분화여부 확인용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 키트는 방사선면역측정법(RIA) 키트, 효소 면역측정법(ELISA) 키트, 면역형광법 키트, 화학발광물질결합법 키트, 단백질칩 키트, 크로마토그래피 키트 또는 자기활성세포분리(Magnetic activated cell sorting, MACS) 키트인 것인 키트.
  9. (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단클론 항체를 분리된 치수줄기세포에 가하여 반응물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 단클론 항체에 결합된 치수줄기세포의 함량을 측정하는 단계를 포함하는, 치수줄기세포의 분화여부 확인방법.
  10. 제9항에 있어서,
    분화된 치수줄기세포에 상기 단클론 항체가 결합된 것을 대조군으로 사용하고, 상기 (b) 단계에서 측정된 함량이, 대조군에서 측정된 함량보다 상대적으로 높은 수준을 나타내는 경우, 상기 분리된 치수줄기세포가 미분화된 치수줄기세포인 것으로 판정하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단클론 항체를 포함하는 미분화된 치수줄기세포 분리용 조성물.
  12. 제11항의 조성물을 포함하는 미분화된 치수줄기세포 분리용 키트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 키트는 방사선면역측정법(RIA) 키트, 효소 면역측정법(ELISA) 키트, 면역형광법 키트, 화학발광물질결합법 키트, 단백질칩 키트, 크로마토그래피 키트 또는 자기활성세포분리(Magnetic activated cell sorting, MACS) 키트인 것인 키트.
  14. (a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단클론 항체를 분리된 치수줄기세포에 가하여 반응물을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 단클론 항체에 결합된 치수줄기세포를 회수하는 단계를 포함하는, 미분화된 치수줄기세포의 분리방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 회수는 유세포분석법, 면역침전법, 자기활성세포분리법 또는 크로마토그래피법에 의하여 수행되는 것인 방법.
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