KR20160102060A - 헤파린의 형질전환적 생성 - Google Patents

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해리 엠 미드
윌리엄 쥐 가빈
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엘에프비 유에스에이, 인크.
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Abstract

한 양태에서, 본 개시내용은, 헤파린 생성을 위한 방법, 세포 및 비인간 형질전환 포유동물, 이의 세포 및 비인간 형질전환 포유동물, 및 또한 상기 세포 및 비인간 형질전환 포유동물로부터 얻어진 헤파린을 제공한다.

Description

헤파린의 형질전환적 생성{TRANSGENIC PRODUCTION OF HEPARIN}
관련 출원
본 출원은, 2013년 12월 24일 출원된, 발명의 명칭이 "헤파린의 형질전환적 생성(Transgenic Production of Heparin)"인, 미국 특허 가출원 제61/920,505호의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 이익을 향유하며, 상기 문헌은 그 전체가 본원에 참조 인용된다.
기술분야
본 개시내용은 생물학적 화합물의 형질전환 생성의 분야에 관한 것이다.
헤파린은 항응고제로서 널리 사용되는 컴플렉스 글리코스아미노글리칸이다. 헤파린은 일반적으로 동물의 장 또는 소의 폐로부터 수집된다. 하지만, 여기서는 헤파린의 오염이라는 문제점이 존재해 왔다. 따라서 헤파린의 생성을 위한 새로운 방법이 요구된다.
한 양태에서, 본 개시내용은 헤파린의 생성을 위한 방법, 세포 및 형질전환 포유동물을 제공한다. 한 실시양태에서, 젖에서 헤파린을 생성하는 비인간 형질전환 포유동물이 제공된다. 한 실시양태에서, 헤파린을 생성하는 방법으로서, 유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하도록 변형된 비인간 형질전환 포유동물을 제공하는 단계, 및 상기 형질전환 포유동물의 유선에 의해 생성된 젖으로부터 헤파린을 수집하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 헤파린을 생성하는 방법으로서, 유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하도록 변형된 비인간 형질전환 포유동물을 제공하는 단계, 및 상기 형질전환 포유동물의 유선에 의해 생성된 젖으로부터 헤파린을 수집하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 헤파린을 생성하는 방법으로서, 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하도록 변형된 유방 상피 세포를 제공하는 단계, 및 상기 유방 상피 세포로부터 헤파린을 수집하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 헤파린을 생성하는 방법으로서, 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하도록 변형된 유방 상피 세포를 제공하는 단계, 및 상기 유방 상피 세포로부터 헤파린을 수집하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 양태에서, 유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하도록 변형된 비인간 형질전환 포유동물이 제공된다. 한 실시양태에서, 유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하도록 변형된 비인간 형질전환 포유동물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하도록 변형된 유방 상피 세포가 제공된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하도록 변형된 유방 상피 세포가 제공된다.
한 실시양태에서, 형질전환 포유동물은 유제류이다. 또 다른 실시양태에서, 유제류는 염소이다. 또 다른 실시양태에서, 유제류는 소이다.
제공된 방법, 세포, 또는 포유동물 중 임의의 것의 한 실시양태에서, 헤파린 생합성 효소는 테트라사카라이드 프로듀서(producer), 반복 단위 프로듀서, 반복 단위 변형유전자(modifier), 에피머라이저(epimerizer), 황산화 효소 및 지지 효소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 테트라사카라이드 프로듀서는 XTIL, GalT-1, 또는 GlcAT-1이다. 또 다른 실시양태에서, 반복 단위 프로듀서는 EXT1 중합효소 및 EXT2 중합효소이다. 또 다른 실시양태에서, 반복 단위 변형유전자는 NDSTI 및 NDSTII이다. 또 다른 실시양태에서, 에피머라이저는 C5 에피머라아제이다. 또 다른 실시양태에서, 황산화 효소는 3-OST, 6-OST 또는 2-OST이다. 또 다른 실시양태에서, 지지 효소는 UDPGDH이다.
제공된 방법, 세포, 또는 포유동물 중 임의의 것의 또 다른 실시양태에서, 헤파린 생합성 효소 및 또한 코어 단백질 중 하나 이상은 변형되어 GPI(GlycosylPhosphatidylInositol; 글리코실포스파티딜이노시톨) 앵커가 조작되도록 한다. 한 실시양태에서, GPI 앵커는 막을 타게팅하도록 코어 단백질에 부가된다. 또 다른 실시양태에서, GPI 앵커는 젖으로의 분비를 가능하게 하도록 결실된다. 또 다른 실시양태에서, 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질은 변형되어 헤파린 및 생합성 효소가 지방구 막에서 생성되도록 한다. 또 다른 실시양태에서, 헤파린 생합성 효소 중 하나 이상은 젖 프로모터(milk promoter)의 제어 하에 있다. 또 다른 실시양태에서, 젖 프로모터는 염소 베타 카제인 프로모터이다.
한 양태에서, 제공된 방법 중 임의의 방법에 따라 생성된 헤파린이 제공된다.
본 발명의 경계치 각각은 본 발명의 다양한 실시양태들을 포괄할 수 있다. 그러므로, 임의의 한 성분 또는 성분들의 조합을 수반하는 본 발명의 경계치 각각이 본 발명의 각 양태에 포함될 수 있다는 점이 예상된다. 본 발명은 이의 적용에 있어서 구성의 세부 사항 및 하기 상세한 설명에 개시되거나 도면에 설명된 성분들의 배열에 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태나 다양한 방식으로 실시 또는 수행되는 것이 가능하다. 또한, 본원에서 사용된 어법 및 용어는 설명을 목적으로 하는 것이며 제한으로서 간주되어서는 안 된다.
하기 도면은 단지 예시를 위한 것이며 본 개시내용의 구현에 필수적인 것이 아니다.
도 1은 헤파린 생합성 경로의 개략도를 제공한다.
한 양태에서, 본 개시내용은 헤파린의 생성을 위한 방법, 세포 및 비인간 형질전환 포유동물을 제공한다. 헤파린의 투여가, 때때로 매우 심각할 수 있는, 출혈, 점상출혈, 자반 또는 반상출혈과 같은 부작용을 일으킬 수 있다는 점이 이전에 보고되었으나, 놀랍게도 본원에서는 저용량 및 중용량의 전신 및 유방 주입된 헤파린이 포유동물의 건강 및 젖 생성에 최소한의 영향을 미치면서, 형질전환 포유동물의 헤파린 생성을 가능하게 한다는 것이 입증되었다.
헤파린은 글루코스아미노글리칸(GAG) 족의 일원이며 이는 반복 디사카라이드 단위로 구성된 다음이온성, 다분산성, 선형 폴리사카라이드로 이루어진다. 헤파린 중 주요 디사카라이드는 L-이두론산(IdoA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), 또는 D-글루쿠론산(GlcA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)이다. 그러나, 헤파린 중합 사슬에 유의적인 이질성(heterogeneity)이 존재하는데, 이는 상기 디사카라이드의 추가 변형으로 인한 것이다(하기 생합성의 설명 참조). 헤파린은 통상적으로, 일반적으로 3kDa 내지 40kDa의 중량을 갖는 약 10-200개의 디사카라이드로 이루어진다(Sasisekharan et al. Curr Opin Chem Biol 4:626-631 (2000)) 헤파린과 같은 GAG는, 당 합성이 일어나는 앵커로서 사용되는 코어 단백질의 세린 잔기에 공유적으로 결합되어, 프로테오글리칸(proteoglycan)으로 지칭되는 당 결합체(glycoconjugate)를 유발할 수 있다.
헤파린은 일반적으로 세포의 외막 상에서 및 세포를 둘러싼 세포외 기질에서 발견된다. 헤파린은 다수의 헤파린 결합 분자와 상호작용하여 예를 들어 세포 생장, 세포 분화, 면역, 물질대사, 세포 신호, 염증, 혈액 응고 및 암을 비롯한 다수의 생물학적 과정(biological process)을 조절한다. 헤파린 및 헤파린 유사 분자는 무척추동물 및 척추동물 둘 모두에서 확인되었으며, 다수의 종으로부터 단리된 분자는 항응고와 같은 동일한 생물학적 과정 중 적어도 일부를 유발할 수 있는 것으로 보인다(예를 들어 문헌[Medeiros et al. Biochim Biophys Acta 1475(3): 287-294 (2000)] 및 문헌[Pejler et al. J Biol Chem 262(24): 11413-21 (1987)] 참조).
중요한 생물학적 과정, 특히 혈액 응고, 염증 및 암에서의 헤파린의 관련성은, 약물로서의 헤파린의 용도로 이어졌다. 응고에서 헤파린의 역할은 널리 연구되어왔다. 헤파린은 호염구 및 비만세포에 의해 생성되는 자연 발생 항응고제이다. 헤파린은 혈병의 형성 및 혈관계 내 존재하는 혈병의 확장(extension)을 방지함으로써 항응고제로서 작용한다. 이는 헤파린의 항트롬빈 III(AT)에의 결합을 통해 달성되며, 이는 구조적 변화를 일으켜 AT 활성화를 유발한다. 이후 활성 AT는 혈액 응고에 연관되는 트롬빈 및 다른 프로테아제들을 불활성화시켜, 초기 응고 또는 추가 응고를 차단한다. 헤파린은 현재 항응고 약물로서 널리 사용되며, 연간 100 미터톤이 넘게 사용된다(예를 들어 문헌[Laremore et al. Curr Opin Chem Biol 13(5-6): 633-640 (2009)} 참조). 헤파린은 예를 들어 심부 정맥 혈전증 및 폐색전증, 급성 관상동맥 증후군, 심방세동, 심폐 바이패스, 혈액여과에 관하여, 및 내재 중심 또는 말초 정맥 카테터에 관하여 권고된다. 헤파린이 응고 이외의 다른 과정들을 조절하는 다수의 헤파린 결합 단백질과 상호작용하기 때문에, 헤파린 치료를 수반하는 임상 시험들이 많은 다른 질병들, 예를 들어, 성인호흡곤란증후군, 알레르기성 비염, 천식, 및 염증성 장 질환에 대해 진행 중이다. 추가로, 헤파린은 또한 동물 모델에서 항전이 특성을 갖는 것을 나타내었으며, 이를 또한 암 치료에 잠재적으로 유용하게 한다(Borsig et al. Proc Natl Acad Sci USA 98(6): 3352-3357 (2000)).
일반적으로, 환자에게 사용할 헤파린은, 인간 헤파린이 다른 포유동물 헤파린과 구조적 및 기능적으로 유사하기 때문에, 도축되는 동물들에서 자연 발생하는 헤파린을 단리함으로써 제조된다(예를 들어, 문헌[Linhardt et al. Biochemistry 31(49): 12441-5 (1992)] 참조). 그러나, 2008년도에, 과황산화 콘드로이틴 황산(oversulfated chondroitin sulfate)에 의한 헤파린 공급의 오염은, 수 건의 환자 사망을 야기하였다(예를 들어, 문헌[Sasisekharan et al. Thromb Haemost 102: 854-858 (2009)] 참조). 그 결과, 한정되고 제어된 공급원으로부터 헤파린을 생성하는 대안적인 접근법에 대한 요구가 발생하였다. 도축되는 동물로부터의 헤파린의 단리를 대체하기 위해 시험되고 있는 현재의 접근법들은 화학 합성, 화학효소(chemoenzyme) 합성, 및 생체 외(ex vivo) 세포 기반 합성을 포함한다. 그러나, 이러한 접근법들은, 이들이 비용이 많이 들고/들거나, 기술적으로 쉽지 않고/않거나, 생체 외에서 보이는 다양한 헤파린을 반복하지 않기 때문에 결점을 가진다(예를 들어, 문헌[Laremore et al. Curr Opin Chem Biol 13(5-6): 633-640 (2009)] 참조). 헤파린을 생성하는 대안적인 접근법의 개발이 필요하다.
따라서, 본 발명은, 젖에서 헤파린을 발현하도록 변형된 비인간 형질전환 포유동물을 제공하는 것을 포함하는, 헤파린을 생성하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 헤파린을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하도록 변형된 비인간 형질전환 포유동물을 제공하는 단계, 및 상기 형질전환 포유동물의 유선에 의해 생성된 젖으로부터 헤파린을 수집하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 헤파린을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하도록 변형된 비인간 형질전환 포유동물을 제공하는 단계, 및 상기 형질전환 포유동물의 유선에 의해 생성된 젖으로부터 헤파린을 수집하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 형질전환 포유동물에서 헤파린을 생성하는 것은 헤파린의 발현을 포유동물에 이미 존재하는 농도 초과로 증가시키는 것(예를 들어, 형질전환 염소에서 증가된 농도의 염소 헤파린을 생성하는 것)을 지칭한다. 또 다른 양태에서, 형질전환 포유동물에서 헤파린을 생성하는 것은 그 포유동물에서 자연적으로 발생하지 않는 헤파린의 오솔로그(ortholog)(예를 들어, 형질전환 염소 또는 젖소(cow)에서 생성되는 인간 헤파린)를 생성하는 것을 지칭한다. 또 다른 양태에서, 형질전환 포유동물에서 헤파린을 생성하는 것은 그 포유동물에서 자연적으로 발생하지 않는 잡종(hybrid) 헤파린(예를 들어, 형질전환 염소에서 염소 및 인간 효소의 조합을 이용하여 생성되는 헤파린)을 생성하는 것을 지칭한다. 헤파린과 헤파린 유사 분자가 유사한 생물학적 반응을 유발하는 것으로 나타났기 때문에(예를 들어, 인간 질병 치료에 사용되는 동물 헤파린 및 무척추동물 헤파린 유사 분자의 항응고 특성), 형질전환 포유동물로부터 얻어진 헤파린이 인간 또는 비인간 포유동물 헤파린에 제한되지 않으며 헤파린 변이체(variant) 및 헤파린 유사 분자를 포괄한다.
한 양태에서, 본 발명은 헤파린을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하도록 변형된 유방 상피 세포를 제공하는 단계, 및 상기 유방 상피 세포로부터 헤파린을 수집하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 헤파린을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하도록 변형된 유방 상피 세포를 제공하는 단계, 및 상기 유방 상피 세포로부터 헤파린을 수집하는 단계를 포함한다.
헤파린 생합성에 관련된 주요 효소("헤파린 생합성 효소")는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Baik et al. Metabolic engineering 14: 81-90 (2012)] 참조). 생합성 경로는 12개 이상의 효소 단계를 수반하는 것으로 생각되며 도 1에 개괄되어 있다. 여기에는 당 합성이 일어나는 앵커로서 사용되는 코어 단백질이 있다. 이 코어 단백질은 당효소(glycoenzyme)가 존재하는 골지로 이송된다. 처음에, 코어 단백질의 Ser 잔기에 테트라사카라이드 결합의 부가가 수행된다. 이는 자일로스, 그후 두 개의 gal 잔기와 이어서 글루쿠론산을 순차적으로 부가하는 4가지 상이한 효소에 의한 순차 부가에 의해 달성된다. 테트라사카라이드를 생성하는 효소는, 코어 단백질 상의 Ser에의 자일로스 부가를 위한 XTI 및 XTII, gal 잔기를 부가하는 B4GalT7(β1,4-갈락토스전달효소) 및 B3GALT6(β1,3-갈락토스전달효소) 및 글루쿠론산을 부가하는 B3GAT3(GlcA β1,3-글루쿠론산전달효소)이다. 테트라사카라이드를 생성하는 효소는 본원에서 테트라사카라이드 프로듀서로서 지칭되며 하기 표 1에 열거된 유전자를 포함한다.
다음 단계는 헤파린 또는 헤파란 황산염이 상기 단백질 상에 합성되는 것을 확립하는 GlcNAC의 부가이다. 효소 EXTI 및 EXT2는 GlcNAC 및 GlcA 반복 단위를 교대 패턴으로 부가하여 헤파린의 중합을 유발한다. 상기 사슬을 중합하는 효소는 본원에서 "반복 단위 프로듀서"로서 지칭되며 하기 표 2에 열거된 유전자를 포함한다.
상기 반복 단위는 GlcNAC N-탈아세틸화효소 및 N-술포전달효소(예를 들어 NDST I 및 NDST II)에 의해 변형된다. NDST는 선택된 GlcNAC 잔기를 탈아세틸화 및 황산화시켜 GlcNS를 생성한다(NDST II는 때때로 PAPS 황산염 도너를 이용하여 작용한다). 이 단계에서 사용된 효소는 본원에서 반복 단위 변형유전자로서 지칭되며 하기 표 3에 열거된 유전자를 포함한다.
반복 단위 변형유전자에 의한 변형 전, 중 또는 후에 일어날 수 있는 다음 단계에서, C5 에피머라아제("에피머라이저")의 작용은 글루쿠론산(GlcA)의 서브셋을 이두론산(IdoA)으로 전환한다. 에피머라이저는 하기 표 4에 열거된 유전자를 포함한다.
이에 이어서, 일련의 술포전달효소가 반복 단위 상에 작용하고 이를 변형하여, 황산염을 반복 단위의 서브셋에 부가한다. 이 단계에서 사용된 이 효소는 "황산화 효소"로서 지칭되며 3-O-술포전달효소, 6-O-술포전달효소, 및 2-O-술포전달효소(각각 3-OST, 6-OST 및 2-OST)를 포함하고 관련된 유전자는 하기 표 5에 열거되어 있다.
상기 변형에 이어서, 헤파린 내에서 발견되는 주요 변형 및 비변형된 디사카라이드는, GlcA-GlcNAc, GlcA-GlcNS, IdoA-GlcNS, IdoA(2S)-GlcNS, IdoA-GlcNS(6S), 및 IdoA(2S)-GlcNS(6S)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
적합한 테트라사카라이드 프로듀서의 예에는 하기 표 1의 유전자가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
유전자 종 GenBank 번호(들)
XTII(XYLT2라고도 함) 호모 사피엔스 NM_022167.2
무스 무스쿨루스 NM_145828.3
보스 타우루스(소) NM_001008667.1
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터)
GalT-1(B4GalT7라고도 함) 호모 사피엔스 NM_001497.3
AY358578.1
무스 무스쿨루스 NM_022305.3
보스 타우루스(소) NM_177512.2
카프라 히르쿠스(염소) HQ700335.1
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터)
GlcAT-1(B3GAT3라고도 함) 호모 사피엔스 NM_012200.3
무스 무스쿨루스 NM_024256.2
보스 타우루스(소) NM_205805.2
카프라 히르쿠스(염소) JI861818.1
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터) NM_001246684.1
적합한 반복 단위 프로듀서의 예에는 하기 표 2의 유전자가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
유전자 종 GenBank 번호(들)
EXT1 호모 사피엔스 NM_000127.2
무스 무스쿨루스 NM_010162.2
보스 타우루스(소) NM_001098095.1
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터) NM_001246767.1
EXT2 호모 사피엔스 NM_000401.3 NM_001178083.1
NM_207122.1
무스 무스쿨루스 NM_010163.3
보스 타우루스(소) NM_177496.3
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터) XM_003507774.1
적합한 반복 단위 변형유전자의 예에는 하기 표 3의 유전자가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
유전자 종 GenBank 번호(들)
NDST1 호모 사피엔스 NM_001543.4
무스 무스쿨루스 NM_008306.4
보스 타우루스(소) NM_001192361.1
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터)
NDST2 호모 사피엔스 NM_003635.3
무스 무스쿨루스 NM_010811.2
보스 타우루스(소) NM_174777.3
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터) XM_003496725.1
XM_003496726.1
NDST3 호모 사피엔스 NM_004784.2
무스 무스쿨루스 NM_031186.2
보스 타우루스(소) NM_001077961.1
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터) XM_003512401.1
NDST4 호모 사피엔스 NM_022569.1
무스 무스쿨루스 NM_022565.2
보스 타우루스(소) NM_001192673.1
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터) XM_003515214.1
적합한 에피머라이저의 예에는 하기 표 4의 유전자가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
유전자 종 GenBank 번호(들)
C5 에피머라아제(GLCE라고도 함) 호모 사피엔스 NM_015554.1
무스 무스쿨루스 NM_033320.4
보스 타우루스(소) NM_174070.2
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터) XM_003498933.1
XM_003498932.1
적합한 황산화 효소의 예에는 하기 표 5의 유전자가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
유전자 종 GenBank 번호(들)
3-OST-1(HS3ST1라고도 함) 호모 사피엔스 NM_005114.2
무스 무스쿨루스 NM_010474.2
보스 타우루스(소) NM_001076122.1
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터)
3-OST-2(HS3ST2라고도 함) 호모 사피엔스 NM_006043.1
무스 무스쿨루스 NM_001081327.1
보스 타우루스(소) NM_001205994.1
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터) XM_003512052.1
6-OST-1(HS6ST1라고도 함) 호모 사피엔스 NM_004807.2
무스 무스쿨루스 NM_015818.2
보스 타우루스(소) NM_001192491.1
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터) XM_003498310.1
6-OST-2(HS6ST2라고도 함) 호모 사피엔스 NM_001077188.1
무스 무스쿨루스 NM_001077202.1
NM_015819.3
보스 타우루스(소) NM_001206635.1
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터) XM_003506105.1
6-OST-3(HS6ST3라고도 함) 호모 사피엔스 NM_153456.3
무스 무스쿨루스 NM_015820.3
보스 타우루스(소) NM_001205484.1
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터)
2-OST(HS2ST1라고도 함) 호모 사피엔스 NM_001134492.1
NM_012262.3
무스 무스쿨루스 NM_011828.3
보스 타우루스(소) XM_002686305.1
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터)
헤파린 합성에 사용되는 코어 단백질의 예에는 하기 표 6에 열거된 단백질이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
유전자 종 GenBank 번호(들)
세르글리신(SRGN)
 호모 사피엔스 NM_002727.2
NR_036430.1
무스 무스쿨루스 NM_011157.2
보스 타우루스(소) NM_001025326.2
카프라 히르쿠스(염소)
크리세툴루스 그리세우스(중국 햄스터) XM_003499896.1
XR_135864.1
효소가 종에 따라 서열이 상이할 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어, 소 NDST I은 인간 NDST I과 상이한 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 종 특이적 효소가 본원에 기술된 방법에 사용된다. 따라서, 예를 들어, 염소 헤파린 생합성 효소가 형질전환 염소에서 사용된다. 그러나, 일부 실시양태에서, 한 종의 헤파린 생합성 효소가 상이한 종에서 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 인간 헤파린 생합성 효소가 형질전환 포유동물(예를 들어 형질전환 염소)에서 사용(즉, 발현)된다. 상이한 종으로부터의 효소들이 "믹스 매칭(mixed and matched)"될 수 있다는 점이 또한 이해되어야 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 형질전환 포유동물, 예컨대 형질전환 염소가, 전이유전자로서 인간 헤파린 생합성 효소 및 기타 포유동물 헤파린 생합성 효소를 둘 다 가질 수 있다.
형질전환 동물로부터의 헤파린 정제
일부 실시양태에서, 헤파린은 헤파린을 생성하는 형질전환 동물의 젖으로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, 헤파린은, 헤파린이 실질적으로 순수하도록, 형질전환 동물의 젖으로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, '실질적으로 순수한'은 실질적으로 오염물질을 함유하지 않는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오염물질은 과황산화 콘드로이틴 황산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 헤파린은 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제된다. 컬럼 프로마토그래피는 당해 분야에 주지되어 있다(일반 크로마토그래피에 대해 문헌[Current Protocols in Essential Laboratory Techniques Unit 6.2 (2008)] 및 헤파린 정제에 대해 US 4,119,774 참조). 일부 실시양태에서, 헤파린은 면역 침강법에 의해 정제된다(문헌[Current Protocols in Cell Biology Unit 7.2 (2001)] 참조). 일부 실시양태에서, 헤파린은 헤파린 결합 항체 또는 이의 단편을 이용하여 정제된다.
젖에서 헤파린을 발현하는 형질전환 동물의 생성을 위한 구조체(construct)
일부 실시양태에서, 핵 이식에 의해 형질전환 동물(예를 들어 염소)를 생성하는 데 사용하기 위한 (예를 들어, 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 코딩하거나 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 코딩하는) 구조체를 포함하는 원발성(primary) 세포주를 생성하기 위해, 구조체는 원발성 동물 피부 상피 세포, 예를 들어 염소 피부 상피 세포 내로 형질주입(transfect)될 수 있으며, 이는 클론 확대되고 완전 특성화되어 전이유전자 복제수, 전이유전자 구조 온전성(integrity) 및 염색체 통합 부위(chromosomal integration site)를 평가한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "핵 이식"은 도너 세포로부터의 핵을 제핵된 난모세포 내로 이식하는 클로닝 방법을 지칭한다.
원하는 단백질(예를 들어, 헤파린 생합성 효소 또는 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질)을 코딩하는 서열은, 서열 데이터베이스, 예컨대 NCBI, Genbank로부터 얻어진 선택된 동물(예컨대 유제류)로부터 유래한 유전 물질의 스크리닝 라이브러리 또는 역번역 전령 RNA에 의해 또는 헤파린 생합성 효소 등의 서열을 얻음으로써 얻어질 수 있다. 상기 서열은 적절한 플라스미드 벡터 내로 클로닝되어 E. coli와 같은 적합한 호스트 유기체에서 증폭될 수 있다.
벡터의 증폭 후, 유전자를 코딩하는 DNA는 삭제(excise)되고, 벡터의 나머지 부분으로부터 정제되어 형질전환 동물을 생성하는 데 사용될 수 있는 발현 벡터 내로 도입될 수 있다. 벡터의 증폭 후, DNA 구조체는 또한 적절한 5' 및 3' 제어 서열을 이용하여 삭제되고, 벡터의 나머지 부분으로부터 정제되어 원하는 발현 구조체를 그 유전자에 통합시킨 형질전한 동물을 생성하는데 사용될 수 있다. 반대로, 일부 벡터, 예컨대 YAC(yeast artificial chromosome)에 있어서, 회합된(assembled) 구조체를 벡터로부터 제거할 필요는 없으며; 이러한 경우 증폭된 벡터는 형질전환 동물을 만드는 데 직접적으로 사용될 수 있다. 상기 코딩 서열은 제어 시퀀스에 작동적으로 연결될(operatively linked) 수 있으며, 이는 코딩 서열이 비인간 형질전환 포유동물의 유선에서 발현될 수 있게 한다.
형질전환 동물의 젖에 헤파린 생합성 효소의 생성을 지시하기에 적합한 DNA 서열은 자연 유래 젖 단백질로부터 유래된 5'-프로모터 영역을 운반할 수 있다. 이에 따라 상기 프로모터는 호르몬성 및 조직 특이적 인자의 제어 하에 있고 젖을 분비하는 유선 조직에서 가장 활성적이다. 일부 실시양태에서, 상기 프로모터는 염소 베타 카제인 프로모터이다. 상기 프로모터는 단백질 선도 서열의 생성을 지시하는 DNA 서열에 작동적으로 연결될 수 있으며, 이는 유선 상피를 가로질러 젖으로의 형질전환 단백질의 분비를 지시한다. 일부 실시양태에서, 자연 분비된 젖 단백질로부터 유래될 수 있는, 3'-서열이, 부가되어 mRNA의 안정성을 향상시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "선도 서열" 또는 "신호 서열"은 단백질 분비 신호를 코딩하는 핵산 서열이며, 형질전환 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 분자에 작동적으로 연결되는 경우 분비를 지시한다. 선도 서열은 천연 선도 서열일 수 있거나, 인공 유래 선도이거나, 또는 전이유전자 코딩 서열의 전사를 지시하는 데 사용되는 프로모터와 동일한 유전자로부터 또는 포유동물 유방 상피 세포와 같은 세포로부터 보통 분비된 또 다른 단백질로부터 얻어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 프로모터는 젖 특이적 프로모터이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "젖 특이적 프로모터"는 젖에 단백질을 분비하는 세포(예를 들어, 유방 상피 세포)에서 유전자의 발현을 자연적으로 지시하는 프로모터이고, 예를 들어, 카제인 프로모터, 예를 들어, α-카제인 프로모터(예를 들어, 알파 S-1 카제인 프로모터 및 알파 S2-카제인 프로모터), β-카제인 프로모터(예를 들어, 염소 베타 카제인 유전자 프로모터(DiTullio et al. BioTechnology 10:74-77 (1992)), γ-카제인 프로모터, κ-카제인 프로모터, WAP(whey acidic protein) 프로모터(Gordon et al. BioTechnology 5: 1183-1187(1987)), β-락토글로불린 프로모터(Clark et al. BioTechnology 7: 487-492(1989)) 및 α-락트알부민 프로모터(Soulier et al. FEBS Letts. 297:13 (1992))를 포함한다. 또한 이 정의에 포함되는 것으로, 유선 조직에서 특이적으로 활성화되는 프로모터, 예를 들어 생쥐 유방 종양 바이러스(mouse mammary tumor virus, MMTV)의 긴 말단 반복순서(long terminal repeat, LTR) 프로모터 등이 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 코딩 서열 및 조절 서열은 상기 코딩 서열 및 조절 서열이 조절 서열의 영향 또는 제어 하에서 코딩 서열의 발현 또는 전사를 수행하는 방식으로 공유적으로 연결된 경우 "작동적으로 연결된"이라고 한다. 코딩 서열이 기능 단백질로 번역되기 위해서, 코딩 서열은 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 5' 조절 서열에서 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 유발하는 경우 및 두 DNA 서열 사이의 연결의 특성이 (1) 프레임 시프트 돌연변이의 도입을 야기하지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 간섭하지 않거나, 상응하는 RNA 전사체가 단백질로 번역되는 능력을 간섭하지 않는 경우, 두 DNA 서열이 작동적으로 연결되었다고 한다. 따라서, 프로모터 영역이 그 DNA 서열의 전사를 수행하여 그 결과 얻어지는 전사체가 원하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 할 수 있는 경우 상기 프로모터 영역은 코딩 서열에 작동적으로 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 상이한 유전적 환경들 사이의 이송을 위해 또는 호스트 세포에서의 발현을 위해 원하는 서열이 제한(restriction) 및 연결(ligation)에 의해 삽입될 수 있는 임의 수의 핵산일 수 있다. RNA 벡터도 이용 가능하지만, 벡터는 통상적으로 DNA로 구성된다. 벡터는 플라스미드 및 파지미드(phagemid)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 클로닝 벡터는 호스트 세포에서 복제가 가능한 벡터이며, 이는 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 추가 특징으로 하며, 여기서, 새로운 재조합 벡터가 호스트 세포에서 복제하는 이의 능력을 유지하도록, 벡터는 확인 가능한 방식으로 절단될 수 있고 원하는 DNA 서열이 연결될 수 있다. 플라스미드의 경우, 원하는 서열의 복제는 호스트 박테리아 내에서 플라스미드가 복제수를 증가시키는 것과 같이 여러 번 발생하거나, 호스트가 유사분열에 의해 번식하는 것과 같이 호스트당 1회만 발생할 수 있다. 파지의 경우, 복제는 용균성 단계(lytic phase) 중에 능동적으로 또는 용원성 단계(lysogenic phase) 중에 수동적으로 일어날 수 있다. 발현 벡터는 원하는 DNA 서열이 조절 서열에 작동적으로 연결되고 RNA 전사체로서 발현될 수 있도록 제한 및 연결에 의해 상기 DNA 서열이 삽입될 수 있는 벡터이다. 벡터는 세포의 식별에 사용하기에 적합한 하나 이상의 마커 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 벡터로 형질전환 또는 형질주입되거나 또는 형질전환 또는 형질주입되지 않은 서열이다. 마커는 예를 들어, 항생제 또는 기타 화합물에 내성이나 감수성을 증가 또는 감소시키는 단백질을 코딩하는 유전자, 당해 분야에 공지된 표준 분석에 의해 검출 가능한 활성을 갖는 효소(예를 들어, β-갈락토시다아제 또는 알칼리성 포스피타아제)를 코딩하는 유전자, 및 형질전환 또는 형질주입된 세포, 호스트, 콜로니 또는 플라크의 표현형에 시각적으로 영향을 주는 유전자를 포함한다. 바람직한 벡터는 이것이 작동적으로 연결된 DNA 분절에 존재하는 구조 유전자 산물의 자율적인 복제 및 발현이 가능한 벡터이다.
형질전환 동물 및 유방 상피 세포
한 양태에서, 본 개시내용은 젖에서 헤파린을 생성하는 비인간 형질전환 포유동물을 제공한다. 구체적으로, 본 개시내용은 유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하는 비인간 형질전환 포유동물을 제공한다. 유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하는 비인간 형질전환 포유동물이 또한 제공된다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하는 유방 상피 세포가 제공된다. 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하는 유방 상피 세포가 또한 제공된다.
형질전환 동물은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 발생시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 동물은 원발성 세포에 별도의 구조체를 동시 형질주입함으로써 발생된다. 이후 상기 세포는 핵 이식에 사용될 수 있다. 대안적으로, 마이크로 주사(micro-injection)가 이용되어 형질전환 동물을 발생시킬 수 있으며, 그 구조체가 주사될 수 있다.
형질전환 발현에 적합한 동물은 염소, 양, 바이슨, 낙타, 젖소, 토끼, 버팔로, 말 및 라마를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 동물은 또한 소, 염소, 및 양을 포함하며, 이는 각각 젖소, 염소, 및 양의 다양한 종과 관련된다. 적합한 동물은 또한 유제류를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "유제류"는 발굽이 있는 통상적으로 초식성인 네발짐승인 포유동물이거나 이에 관련되며, 양, 염소, 젖소(cattle) 및 말을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
클로닝은 형질전환 동물의 다양성을 유도한다 - 각각 헤파린 생합성 효소 또는 원하는 다른 유전자 구조체를 생성할 수 있다. 생성 방법은 클로닝된 동물 및 이 동물의 새끼를 이용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 클로닝된 동물은 염소 또는 소이다. 클로닝은 또한 태아의 핵 이식, 핵 이식, 조직 및 장기 이식 및 키메라 새끼의 생성을 포괄한다.
클로닝 과정의 한 단계는, 하나 이상의 헤파린 생합성 효소, 또는 하나 이상의 생합성 헤파린 효소 및 코어 단백질을 코딩하는 전이유전자를 함유하는 세포의 유전체를 제핵된 난모세포로 이송하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "전이유전자"는 계획에 의해 세포 또는 이의 선조(ancestor) 내에 삽입되고, 그 세포로부터 성장한 동물의 유전체의 일부가 된 핵산 분자의 임의 조각을 지칭한다. 이러한 전이유전자는 형질전환 동물에 대해 부분적으로 또는 전부 외인성(즉 외부 유전자)인 유전자를 포함할 수 있거나, 그 동물의 내생성 유전자에 대한 식별자를 갖는 유전자를 나타낼 수 있다.
난모세포에 있어서 적합한 포유동물 공급원은 염소, 양, 젖소, 토끼, 비인간 영장류 등을 포함한다. 바람직하게는, 난모세포는 유제류로부터 얻어지며, 가장 바람직하게는 염소 또는 젖소로부터 얻어진다. 난모세포를 단리하는 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. 본질적으로, 상기 방법은 포유동물, 예를 들어 염소의 난소 또는 생식수관(reproductive tract)으로부터 난모세포를 단리하는 단계를 포함한다. 유제류 난모세포의 용이하게 이용 가능한 공급원은 호르몬 유도된 암컷 동물이다. 유전공학, 핵 이식 및 클로닝과 같은 기법의 성공적인 이용을 위해서, 난모세포는 바람직하게는, 상기 세포가 핵 이식의 수용 세포로서 이용될 수 있기 전에, 그리고 상기 세포가 정자에 의해 수정되어 배아로 성장하기 전에 생체 내(in vivo)에서 성숙될 수 있다. 생체 내에서 성숙한 중기 II 단계 난모세포는, 핵이식 기법에서 성공적으로 사용되어왔다. 본질적으로 성숙한 중기 II 난모세포는 발정기 시작 후 또는 인간 융모성 고나도트로핀(hCG) 또는 유사한 호르몬의 주사 후 몇 시간 뒤 비과배란 또는 과배란 동물로부터 수술적으로 수집된다.
유선에서 발현되는 재조합 분자의 양과 질을 예측하기 위해 사용되는 공구 중 하나는 젖의 분비의 유도를 통한 것이다(Cammuso,Gavin et al., Animal Biotechnology 11(1): 1-17 (1999)). 유도된 젖 분비는, 1년은 걸릴 수 있는, 임신으로 인한 자연적인 첫 젖 분비로부터 유래한 것보다 이른 단계의 형질전환 생성물로부터의 단백질의 발현 및 분석이 가능하게 한다. 젖 분비의 유도는 호르몬으로 또는 수공으로 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 헤파린의 조성물은 추가로 젖 또는 부분 정제된 젖을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 본원에 제공된 방법은 형질전환 동물의 젖으로부터 헤파린을 단리하는 단계를 포함한다(예를 들어, 문헌[Pollock et al., Journal of Immunological Methods, 231(1-2): 147-157 (1999)] 참조).
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가 설명되며, 이는 어떠한 방식으로도 추가의 제한으로 이해되어서는 안 된다. 본 명세서 전체에서 언급된 모든 참조문헌의 전체 내용(문헌 참조물, 발행된 특허, 공개된 특허 출원 및 동시 계류중인 특허 출원 포함)은 이로써 명백하게, 특히 상기 참조된 교시에 대해서, 참조로 인용된다. 그러나, 임의 참조문헌의 인용이 그 참조문헌이 종래 기술이라는 시인으로 의도된 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1 안전성 연구
1.1 유선에 대한 헤파린 효과의 시험
젖을 분비하는 유선에 대한 헤파린의 효과를 평가하였다. 유선에서의 염소 항트롬빈 농도는 약 2 mg/ml였고, 이는 혈류에서 발견되는 것의 1%였다. 헤파린은 1 mg/ml, 200 mg/ml 및 50 mg/ml의 생성 수준에 상응하는 수준으로 젖을 분비하는 염소의 유선에 주입될 수 있었다. 염소의 유선이 1 리터의 젖을 보유할 수 있으므로, 헤파린은 착유에 이어 주입될 수 있으며 다음날 젖을 빼내었다(고분자량 헤파린 1 g, 200 mg 및 50 mg의 주입). 상기 주입은 1주일 동안 매일 또는 유선 또는 혈액에서 독성이 관찰되기까지 수행할 수 있었다.
헤파린 농도는 시험하는 동물의 젖 및 혈류에서 측정할 수 있었다. 초기 연구는 유선에서 생성된 일부 단백질이 젖에서 발견되는 것의 1% 수준으로 순환계로 유출될 수 있다는 것을 나타내었다. 젖의 부피를 또한 시험 기간 전체에 걸쳐 모니터링하여 헤파린이 젖 분비에 영향을 미치는지를 측정하였다. 동물은 다시 1주간 계속 착유하여 젖 부피에 대한 장기적인 영향을 시험하였다. 혈액 샘플을 매일 수득할 수 있었고 헤파린의 농도와 응고 특성을 aPTT(activated partial thromboplastin time, 활성부분 트롬보플라스틴 시간)동안 시험함으로써 모니터링하였다. aPTT는 다양한 농도의 헤파린을 갖는 염소 혈액으로 시험할 수 있었다.
염소에 헤파린 IV 주사로 투약한 대조군 실험을 수행할 수 있었다. 출혈 문제를 일으킨 혈중 헤파린의 농도를 또한 측정할 수 있었다.
1.2 젖을 분비하는 염소에서의 헤파린 독성 연구
유선에서 헤파린의 생성이 또한 생성하는 동물에게 현저한 영향을 미칠 수 있는지 측정하기 위한 연구를 수행하였다. 전이유전자에 의해 생성된 단백질은 직접적으로 유선에 잠재적인 영향을 미칠 수 있었다. 추가로, 단백질의 전신계(systemic system)로의 잠재적인 유출이 존재한다는 것이 공지되었다. 염소에 대한 전신 및 주입된 헤파린의 잠재적인 영향을 평가하기 위해, 하기 개괄된 연구를 수행하였다. 두 실험 동안 1일 1회 이상 각각의 젖 분비 동물들로부터 혈액을 채취하고 젖을 수집하여 전신 및 유방 주입 경로에 대한 헤파린 투여의 영향을 측정하였다. 헤파린의 농도, 및 aPTT 에 의해 나타난 응고 시간을 혈청으로부터 계산하였다. 젖 부피를 측정하고 젖에서의 헤파린 농도를 측정하였다. 추가로, 젖의 품질(색상, 일관성, 군집의 증거, 혈액, 또는 유방염)에 주의하였다. 직장 온도를 포함하여 각 동물의 일반적인 건강을 매일 평가하였다. 헤파린이 항응고제이기 때문에, 동물들을 또한 비정상적인 멍이나 점상출혈과 같은 임의의 전체적인 출혈 징후에 대해 매일 검사하였다.
방법
동물
6마리의 통상적인, 비형질전환된 젖을 분비하는 염소를 대략 1일당 4 파운드의 특별 제제화한 채식 염소 먹이로 공급하고, 티모시 및 알팔파 건초 조합과 또한 플레인(plain) 및 광물 함유 소금 블록에 대한 자유로운 이용을 제공하였다. 상기 염소가 젖을 분비하는 동물이기 때문에, 이 염소들이 도착한 날부터 시작하여 매일 착유하였다. 젖의 부피를 매일 측정하고 직장 온도를 기록하였다. 제1 또는 제2 실험 이전의 젖의 부피 및 직장 온도는 하기 표 7에서 찾을 수 있다.
채혈
동물들을 손으로 눌러 목 정맥을 식별할 수 있게 하였다. 21-게이지 ¾인치 나비주사침(BD Vacutainer Blood Collection Set Ref 367251, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)을 혈관 내에 삽입하고, 혈액을 2 - 1.8 ml 시트르산 나트륨 진공 채혈관(BD Vacutainer, Buffered Na Citrate, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재) 내에 수집하였다. 수집 후(또는 채혈 및 헤파린 투여 후 - 하기 참조) 바늘을 제거하고, 압력을 수집 부위에 가하여 임의 출혈을 막았다. 동물들은 각 절차 후 정적 강화(곡물 보상)를 부여받았다.
정맥주사 헤파린 투여
동물들을 상기와 같이 눌렀다. 상기 기술된 채혈에 대해 사용된 나비주사침을 고안하여 혈액이 진공채혈관을 통해 수집될 수 있도록, 또는 주사기가 부착되도록 하였다. 따라서, 채혈 이후, 채혈관과 연결된 바늘의 일부가 제거되고, 헤파린이 든 주사기를 부착하여 헤파린을 천천히 주사하였다. 추가 0.4 ml의 생리식염수를 바늘을 통해 플러싱하여 모든 헤파린이 전달되도록 보장하였다. 이러한 방식으로, 1회의 바늘 설치를 채혈 및 헤파린 주사 둘 모두에 대해 사용하였으며, 두번째 정맥 천자 부위에 대한 어떠한 추가 스트레스도 피하였다.
제1 또는 제2 실험 전 모든 동물에 대한 리터 단위의 젖 부피 및 화씨 단위의 체온

동물
동물 1 동물 2 동물 3 동물 4 동물 5 동물 6
일수 젖 온도 젖 온도 젖 온도 젖 온도 젖 온도 젖 온도
1 0.5 102.2 0.5 101.9 3 101.9 1 101.6 3 102.2 3 101.9
2 1 101.9 1.8 101.4 2.6 101.6 3.25 100.9 2.5 101.8 2.4 101
3 2 101.2 1.75 101.2 2.75 101.2 3.5 101.2 2.75 102.1 2.25 101.4
4 2.5 101.2 2.25 101.9 3 101.7 3.75 101 2.75 101.7 2.5 101.6
5 2.2 102.5 2.6 102 2.4 101.9 3.5 101.2 2.5 101.8 2.3 101.4
6 2.1 101.8 1.9 101.3 2 101.5 3.25 101 2.25 101.5 2.15 102
7 1.75 101.6 1.6 101.5 2.05 101.7 3.15 101.3 2.1 101.7 2.5 102.1
8 2 101.6 2.25 101.2 2.75 102 3.5 101.6 2.5 101.6 2.5 102
9 2 101.7 1.75 101.2 2.75 101.7 3 101.2 2 102 2.5 102.2
10 1.75 101.5 1.5 101.2 2 102 2.75 101.4 2 102.7 2.25 101.3
11 2.25 101.9 3.25 101.7 2.5 101.9 2 101.4
12 2.1 101.6 2.7 100.6 2.1 101.7 2.4 101.5
13 2.25 101.1 2.5 101.4 2.1 101.3 2.65 101.4
14 2.25 101.7 3 101.4 2.2 101.9 2.2 101.9
15 2.3 101 2.75 100.4 2.15 101.1 2.4 101.8
16 2.3 100.5 2.85 100.6 2.4 101.4 2.35 101
17 2.6 100.9 3 100.7 2.3 101.4 2.35 101.2
평균 1.78 101.7 1.79 101.5 2.43 101.5 2.98 101.1 2.36 101.7 2.39 101.6
염소들이 도착한 날로부터 시작하여 매일 1회씩, 모든 염소들을 이동식 착유기를 이용하여 착유하였다. 이 절차를 위해 동물들을 착유대에 위치시켰다. 착유의 일반적인 프로토콜은 하기와 같다. 착유를 수행하는 인물은 그의 손을 철저하게 세척하고 라텍스 비멸균 장갑(latex examination glove)을 착용하였다. 유방은 종이수건과 물을 이용하여 깨끗이 닦았다. 이후 유방을 깨끗한 종이 수건을 이용하여 건조시켰다. 유두는 다시 알코올 솜(alcohol wipes)을 이용하여 깨끗이 닦고, 프리딥(pre-dip, FS-106 Sanitizing Teat Dip, IBA Inc., 미국 매사추세츠 주 밀버리 소재)를 적용시키고 건조시켰다. 작은 샘플을 유두로부터 손으로 짜내어 젖의 품질을 평가하고, 도말 시험을 수행하고, 추가 분석을 위해 냉동하였다. 이후 착유기를 유방에 부착시켰다. 착유 후, 유두를 알코올로 깨끗이 닦고, 착유 후 살균제를 적용하였다(Ultra Shield Sanitizing Barrier Teat Dip, IBA Inc., 미국 매사추세츠 주 밀버리 소재). 젖의 부피를 측정하고, 작은 샘플을 냉동하여 후속 시험을 위해 -80℃ 냉동 박스에 보관하였다.
실험 1: 헤파린 전신투여의 영향에 대한 조사
두 마리 염소는, 6일 동안 매일 오전 8시, 정오 12시, 및 오후 4시의 3회씩 헤파린의 정맥내(IV) 주사를 받았다. 세부 계획은 다음과 같았다: 저용량의 헤파린, 2일 동안 1,500 단위(0.15 ml[10,000 단위/ml] IV, TID[1일 3회]), 이어서 중용량, 2일 동안 6,000 단위(0.6 ml [10,000 단위/ml] IV, TID), 마지막으로 고용량의 헤파린 2일 동안 31,000 단위(3.1 ml [10,000 단위/ml] IV, TID). 상기 용량들은 생성될 최초(founder) 형질전환 동물의 젖/유선에서 목적으로 한 발현 농도의 1%와 같았다. 각 헤파린 주사 전에 목 정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 추가로 염소들은 1일 1회 착유시키고 샘플을 수집하였다. 전신 헤파린을 받은 두 마리 염소는 실험 2에 포함되기 전 이 실험 후 1일 동안 착유하였다.
실험 2: 헤파린의 유방 주입
여섯 마리의 젖을 분비하는 염소를 두 마리씩 세 군으로 나누었다. 모든 염소들은 착유기로 매일 착유하고, 혈액 샘플을 채취하였다. 착유 및 채혈 후, 염소들을 유두 주입 캐뉼라(Udder Infusion Cannula, IBA Inc., 미국 매사추세츠 주 밀버리 소재)를 이용하여 헤파린을 그 염소들의 유방에 주입하였다. 각 군은 저용량(25,000 단위), 중용량(100,000 단위), 또는 고용량(500,000 단위)의 주입된 헤파린을 받았고, 1리터의 젖을 기준으로 밝혀진 3가지 상이한 발현 수준에 상응하였다. 주입된 부피는 각 유방당 50 ml 미만이었다. 이 프로토콜을 총 7일 동안 수행하였다. 유방 주입 후, 염소들을 추가 8일 동안 착유하였고, 이동안 혈액 샘플을 채취하고 젖 샘플을 수집하였다.
1.3 결과
실험 1
IV 헤파린의 저용량 및 중용량 투여 중에 aPTT에서 온건한 상승이 있었다. aPTT는 고용량 헤파린의 투여 후 극적으로 증가했다. 고용량 동안, 4개의 정오 및 4 PM 샘플 중 3개가 혈액 응고 계측에 의해 계산될 수 있는 최대 aPTT를 초과하였다. 제2 고용량 AM 샘플의 aPTT 시간(AM 용량의 헤파린 이전)은 밤새 보다 보통 수준으로 하락하였다. 젖 부피와 체온은 어떠한 용량에도 영향받지 않았다. 어느 때에도 점상출혈 또는 이상 출혈의 증거는 없었다. 유일한 물리적 관찰은 고용량 투여의 제2일째 중 정오 및 4 PM 검사에서 한 동물에서 폐에서의 소리가 증가했다는 것이다. 상기 폐에서의 소리는 높은 전신 투여가 끝나자 사라졌다.
실험 2
젖 생성 부피에 대한 주입된 헤파린의 결과는 하기와 같이 분석되었다. 모든 경우에서, 유방으로의 헤파린 주입 시간 중에 젖의 부피에서 초기 급감이 있으며, 헤파린 주입 중지 후 얼마간의 회복이 나타났다. 가장 큰 급감은 대량으로 주입된 헤파린(주입된 헤파린의 양은 주입 전 생성된 젖의 부피를 기준으로 계산하였다)을 받는 한 동물에서 일어났다(하기 표 8에 나타난 바와 같다). 표 8은 또한 주입된 헤파린의 양과 aPTT와의 관례를 설명한다. aPTT는 주입된 헤파린의 양에 비례하며 최초 3일의 투여 중에 최고점을 나타내고, 이후 줄어든다. aPTT는 헤파린 유방 주입 후 "세정(washout)" 기간 중에 보다 보통 수준(20-40 초)으로 되돌아간다. 헤파린 주입 농도와 헤파린 후 aPTT 수준과의 직접적인 연관성은 나타나지 않았다.
젖 부피, 헤파린의 단위, 및 별표는(*) 10,000 단위/mL를 의미하며, 그 이외에는 20,000 단위/mL를 의미한다. 젖 부피의 단위는 리터이다. mL은 유방당 주입된 헤파린의 mL를 나타낸다. aPTT 시간은 초 단위이다.
저용량
동물 1 동물 6
일수 젖 단위 mL aPTT 젖 단위 mlL aPTT
1 2.25 56,250 2.8* 23.2 2.75 68, 750 3.4* 26.2
2 2.25 56,250 2.8* 36 2.25 56,250 2.8* 35.5
3 2.2 56,250 2.8* 37 2.0 50,000 2.5* 36.5
4 2.0 50,000 2.5* 34.9 1.75 43,750 2.2* 47
5 1.9 50,000 2.5* 34.5 1.25 31,250 1.6* 55.3
6 1.8 43,750 2.2* 34.6 1.3 31,250 1.6* 41.3
7 1.7 43,750 2.2* 33.5 1.9 50,000 2.5 32.8
8 2.0 33.1 2.25 35.9
중용량 유방 주입(1 리터당 100,000 단위)
동물 2 동물 4
일수 젖 단위 mL aPTT 젖 단위 mL aPTT
1 2 200,000 5 30.8 3.25 300,000 8.1 24.7
2 1.35 135,000 7* 30 2.75 275.000 13.75 32.7
3 1.5 150,000 7.5* 27.7 2.5 250,000 12.5* 44
4 1.6 150,000 7.5* 31.4 1.9 200,000 10* 30.2
5 1.3 125,000 6.25* 15.4 2.2 225,000 11.25* 42.4
6 1.2 125,000 6.25* 28.3 2.0 200,000 10* 42.1
7 1.25 125,000 6.25* 26.4 2.25 225,000 11.25* 22.9
8 1.75 26.9 2.5 29.8
고용량 유방 주입(1 리터당 500,000 단위)
동물 5 동물 3
일수 젖 단위 mL aPTT 젖 단위 mL aPTT
1 2.25 1,125,000 28.1 23.9 3.25 1,625,000 40.62 26.4
2 2.15 1,062,500 26.5 46.9 3.0 1,500,000 37.5 41.1
3 1.3 625,000 16 >124 3.0 1,500,000 37.5 >124
4 0.9 500,000 12.5 56 1.1 0 0 >124
5 1.25 625,000 15.6 50.3 0.2 0 0 59.5
6 1.5 750,000 18.75 42 0.75 0 0 46.2
7 1.3 625,000 15.6 32.6 1.1 0 0 21.3
8 1.9 34.2 1.0 37.6
1.4 결론
실험 1
헤파린의 전신 투여는 본원에서, 체온이나 젖 생성 부피에 대해, 존재한다해도 적은 영향을 갖는 것으로 입증되었다. 저수준과 중수준의 전신 헤파린은 aPTT를 천천히 40-50 초(통상 범위 20-40)로 증가시키는 것을 나타내었다. 고수준의 전신 헤파린은 주사후 aPTT에 큰 영향을 미쳤으며, 때때로 기계에 의해 측정될 수 있는 것 초과의 응고 시간으로 증가하였다(>124 초). 그러나, aPTT는 밤 사이에 낮은 40대로 급감하였고(두 고용량 사이), 이는 저수준 및 중수준의 전신 헤파린에 대해 관찰된 것과 유사하다. 구강 점막, 외음부 또는 유방에서의 점상 출혈과 같은 전체적인 뚜렷한 출혈 징후는 없었다. 고수준의 헤파린 투여 중인 염소 가운데 하나에서, 증가하여, "탁탁 하는 소리(crackling)"의 폐에서의 소리를 들을 수 있었다. 그러나, 이 시간 동안 코로부터의 어떠한 혈담 삼출물(blood-tinged exudate) 증거는 없었다.
상기 결과로부터, 놀랍게도, 6일 이상 투여된 전신 헤파린은 헤파린의 부작용으로 보고되었던 점상출혈, 자반 또는 반상출혈을 일으키지 않으며, 형질전환 포유동물로부터의 헤파린의 생성을 방해하지 않는다는 결론을 내릴 수 있다.
실험 2
1주일 동안 유방으로의 저용량 또는 중용량 헤파린의 일일 일회 주입은 체온에 거의 영향을 미치지 않으며, 출혈의 어떠한 징후도 야기하지 않고, 55초 초과로 aPTT를 증가시키지 않는다는 점이 밝혀졌다. 고농도의 주입된 헤파린은 극적으로 aPTT를 증가시켰으며, 가장 높은 농도의 주입은 높은 체온과 증가된 호흡음을 나타내었다. 가장 높은 농도로 주입된 염소의 유방은 염증반응, 및 젖 생성에서의 극적인 감소를 갖는 것으로 나타났다. 그러나, 이 실험에서, 염소들은 착유될 것이며 순수한 헤파린이, 희석되지 않고, 직접 유방에 주입되었다. 헤파린을 생성하는 형질전환 염소에서, 단백질은 젖과 함께 생성되며 따라서 희석된다. 추가로, 염소에 의해 생산된 헤파린 자체는 주입된 외인성 헤파린과 동일하지 않을 수 있다.
이들 연구로부터, 저용량 및 중용량의 전신 및 주입된 헤파린은 염소의 건강 및 젖 생성에 최소한의 영향을 미치며 형질전환 포유동물로부터의 헤파린의 생성을 방해하지 않는다는 결론을 내릴 수 있다.
2. 헤파린 생성 형질전환 동물의 생성
다양한 변형 효소를 운반하는 구조체는 이미 코어 단백질을 생성하는 동물로부터 유전체 라인으로 도입될 수 있다. 구조체는, 테트라사카라이드 합성으로부터 시작하여 술포전달효소로 끝나는, 경로에서 발생하는 것으로 추정되기 때문에 도입될 수 있다. 각 지점에서(예를 들어, 신규한 효소의 부가 후에), 헤파린은 형질전환된 암컷의 젖으로부터 단리될 수 있다.
2.1 테트라사카라이드 합성, EXT I 및 EXT II, NDST I 및 NDST II, 술포전달효소
테트라사카라이드 합성에 수반되는 효소에 대해 효소를 코딩하는 DNA, EXT I 및 EXT II, NDST I 및 NDST II, 및 술포전달효소는 이미 코어 단백질을 운반하는 동물의 배아 내로 미세주사된 구조체 및 베타 카제인 벡터 내로 연결될 수 있다. 신규한 구조체를 운반하는 자손은 성숙하여 코어 단백질에 테트라사카라이드를 부가하는 능력에 대해 시험될 수 있다. EXTI 및 EXTII를 코딩하는 유전자는 또한 이미 코어 단백질을 운반하는 동물의 배아 내로 미세주사된 구조체 및 베타 카제인 벡터 내로 연결될 수 있다. 마찬가지로, 이 접근법은 NDST I 및 NDST II, 및 술포전달효소를 코딩하는 유전자를 이용하여 수행될 수 있다.
2.2 다수의 헤파린 합성 경로 유전자를 갖는 형질전환 동물의 발생
한 군의 효소(예를 들어, NDSTI, NDSTII, 및 C5 에피머라아제)를 운반하는 형질전환 라인은 두번째 군(예를 들어, 코어 단백질 및 테트라사카라이드 합성 및 EXT I 및 EXT II)을 운반하는 형질전환 동물의 별도의 라인으로 크로싱될 수 있다. 이후 유선의 기존 헤파린 합성 활성을 보완하기 위해 필요한 효소의 군이 육종계획(breeding program)으로부터 식별될 수 있다.
별도의 평행적인 프로그램에서, 경로에 요구되는 유전자 전체를 운반하는 큰 구조체(BAC 또는 YAC 사용)는 회합될 수 있다. 이 큰 구조체는 이후 동물 유전체 내에 도입될 수 있다. 이 방법은 큰 다중 유전자 어레이(예를 들어 면역글로불린 좌(locus))를 운반하는 형질전환 동물을 구축하는 데 성공적으로 사용되어 왔다.
2.3 분비 과정
대부분의 글리코스아미노글리칸 단백질은 막에 결합한 것이거나 세포 내에 있다.
분비를 돕기 위해 가용 형태가 또한 제작될 수 있다. 예를 들어, 일부 GAG 단백질(글리피칸)이 GPI 앵커를 이용하여 세포 표면에 연결된다. 상기 앵커 부위는 결실되어 가용 버전이 생성되게 할 수 있다.
지방구 분비: 막 단백질이 지방구 막에서 생성될 수 있다.
2.4 헤파린을 생성하는 큰 형질전환 동물의 발생
구조체는 체세포 핵 이식(클로닝)에 의해 염소 또는 젖소 유전체 내에 도입될 수 있다. 형질전환 염소는 젖소에 비해 보다 짧은 세대 기간이라는 장점을 가진다. 그러나, 형질전환 젖소는 동물당 대략 10배 더 많은 젖을 생산하고 향상된 확장성을 제공한다. 더 나아가. 젖소가 염소보다 더 긴 세대 기간을 갖지만, 상당한 양의 젖이 청소년기의 소의 호르몬 유도를 통해 얻어질 수 있으며, 개발 타임라인 상의 세대 기간의 영향을 얼마간 상쇄한다.
큰 발현 구조체는 세포, 예컨대 섬유아세포에 형질주입될 수 있고, 성공적인 클론에 대한 선택이 수행될 수 있다. 이러한 클로닝된 세포는 이후 모든 관련된 헤파린 생합성 유전자의 성공적인 도입에 관하여 스크리닝될 수 있다. 상기 클로닝 절차는 헤파린 경로를 운반하는 몇 마리의 최초의 소를 결과로 할 수 있었따. 염소에 대해 2개월(또는 소에 대해 6개월)째의 유도는 코어 단백질이 성공적으로 변형되어 큰 동물의 유선에서 헤파린을 형성하는지 측정하도록 수행될 수 있다.
균등론
상기의 기술된 명서서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있는 데 충분한 것으로 여겨진다. 본 발명은 제공된 실시예에 의해 범위가 제한되지 않는데, 이는 실시예가 본 발명의 특정 양태 및 실시양태의 설명으로서 의도된 것이기 때문이다. 다른 기능적으로 균등한 실시양태는 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에 나타나고 기술된 것들 외의 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이며 첨부된 특허청구범위 내에 포함될 것이다. 본 발명의 이점 및 목적은 본 발명의 각 실시양태에 의해 포괄될 필요는 없다.

Claims (19)

  1. 헤파린을 생성하는 방법으로서,
    젖에서 헤파린을 생성하는 비인간 형질전환 포유동물을 제공하는 단계, 및
    상기 형질전환 포유동물의 유선에 의해 생성된 젖으로부터 헤파린을 수집하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 헤파린을 생성하는 방법으로서,
    유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하도록 변형된 비인간 형질전환 포유동물을 제공하는 단계, 및
    상기 형질전환 포유동물의 유선에 의해 생성된 젖으로부터 헤파린을 수집하는 단계
    를 포함하는 방법.
  3. 헤파린을 생성하는 방법으로서,
    유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하도록 변형된 비인간 형질전환 포유동물을 제공하는 단계, 및
    상기 형질전환 포유동물의 유선에 의해 생성된 젖으로부터 헤파린을 수집하는 단계
    를 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 형질전환 포유동물은 유제류인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 유제류는 염소인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 유제류는 소인 방법.
  7. 헤파린을 생성하는 방법으로서,
    하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하도록 변형된 유방 상피 세포를 제공하는 단계, 및
    상기 유방 상피 세포로부터 헤파린을 수집하는 단계
    를 포함하는 방법.
  8. 헤파린을 생성하는 방법으로서,
    하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하도록 변형된 유방 상피 세포를 제공하는 단계, 및
    상기 유방 상피 세포로부터 헤파린을 수집하는 단계
    를 포함하는 방법.
  9. 젖에서 헤파린을 생성하는 비인간 형질전환 포유동물.
  10. 유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하도록 변형된 비인간 형질전환 포유동물.
  11. 유선에서 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하도록 변형된 비인간 형질전환 포유동물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 정의된 비인간 형질전환 포유동물.
  13. 하나 이상의 헤파린 생합성 효소를 발현하도록 변형된 유방 상피 세포.
  14. 하나 이상의 헤파린 생합성 효소 및 코어 단백질을 발현하도록 변형된 유방 상피 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 헤파린 생합성 효소 중 하나 이상은 젖 프로모터의 제어 하에 있는 것인 방법, 포유동물 또는 세포.
  16. 제15항에 있어서, 젖 프로모터는 염소 베타 카제인 프로모터인 방법, 포유동물 또는 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 생성된 헤파린.
  18. 제17항의 헤파린을 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 젖을 추가로 포함하는 조성물.
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