WO2023157899A1 - 組換えヘパリン様物質、及びその製造方法 - Google Patents

組換えヘパリン様物質、及びその製造方法 Download PDF

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WO2023157899A1
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heparin
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seq
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正道 上平
佳典 河邉
京佑 秋山
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国立大学法人九州大学
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a heparin-like substance by genetic engineering, and a heparin-like substance produced thereby.
  • heparin is an essential drug used in medical settings such as artificial dialysis and extracorporeal circulation. Heparin used in pharmaceuticals and the like is mainly extracted and purified from porcine small intestine or bovine lung.
  • Patent Document 1 discloses the transgenic production of heparin and describes the use of non-human transgenic mammals that have been modified to express heparin biosynthetic enzymes and core proteins. Patent Document 1 lists sulfation pathway-related genes including NDST1, NDST2 (Table 3) and Hs6st (Table 5-1) as heparin biosynthetic enzyme genes. In this document, there is no experimental result of actually producing a heparin-like substance by gene transfer, and its degree of sulfation and biological activity as heparin are unknown.
  • Patent Documents 2 to 4 describe porcine mast cells that produce heparin-type molecules and methods for producing heparin-type molecules using the same.
  • Patent Document 2 describes the use of 3-O-sulfatase (3-OST)
  • Patent Document 3 describes the use of 3-OST and 6-OST genes.
  • Patent Documents 2 to 4 describe analysis results of the types and proportions of disaccharides in the obtained heparin-type molecules and the biological activity of the obtained heparin-type molecules.
  • the present inventors have attempted to produce heparin-like substances using CHO cells that produce heparin-like substances.
  • a gene encoding bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase hereinafter abbreviated as NDST2
  • NDST2 bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase
  • Hs3st1 glucosamine 3 sulfotransferase 1
  • Hs3st1 glucosamine 3 sulfotransferase 1
  • Patent Document 5 The heparin-like substance produced by the method of the present inventors (Patent Document 5) has a lower degree of sulfation than currently commercially available heparin, and the biological activity (anticoagulant activity) as heparin is higher than that of the commercially available product. Since it is considerably low, the solution of this point is desired.
  • the present inventors secreted heparin-like sugar chains with bioactivity equivalent to that of commercially available heparin by further introducing sulfation pathway-related genes such as the Hs6st3 gene into the above CHO cells (CHO/NH-SDC). I considered whether it could be produced. As a result, the inventors found that the purpose can be achieved by introducing a specific sulfation pathway-related gene, and completed the present invention.
  • a method for producing a heparin-like substance comprising the step of culturing animal cells introduced with the following to obtain a culture supernatant containing a heparin-like substance: - a polynucleotide encoding a bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase (NDST2); - a polynucleotide encoding heparan sulfate glucosamine 3 sulfotransferase 1 (Hs3st1); - a polynucleotide encoding the extracellular domain of a syndecan (SDC); and - a polynucleotide encoding a 6-O-sulfase.
  • NDST2 bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase
  • Hs3st1 a polynucleo
  • 6-O-sulfonase is heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 1 (Hs6st1), heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 2 ( Heparan Sulfate 6-O-Sulfotransferase 2, Hs6st2), and Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 3 (Heparan Sulfate 6-O-Sulfotransferase 3, Hs6st3), 1 The manufacturing method described in . [3] The production method according to 1 or 2, wherein the 6-O-sulfonase is Hs6st3.
  • A a polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 29 or 43;
  • B Anticoagulant Xa of a heparin-like substance hybridized under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a sequence complementary to the sequence set forth in SEQ ID NO: 29 or 43 and produced by a heparin-like substance-producing animal cell a polynucleotide encoding a protein that has the function of enhancing factor activity;
  • C A function of improving the anticoagulant factor Xa activity of a heparin-like substance produced by a heparin-like substance-producing animal cell comprising a sequence having 90% or more identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 29 or 43 a polynucleotide encoding a protein having
  • D a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30 or 44;
  • E A heparin-like substance
  • a polynucleotide encoding a protein having the function of enhancing anticoagulant factor Xa activity; (F) comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30 or 44, and improving the anticoagulant factor Xa activity of a heparin-like substance produced by a heparin-like substance-producing animal cell
  • Hs6st3-expressing cell clones 28 clones of Hs6st3-expressing cells were obtained. A 1.5- to 9-fold improvement was confirmed from bulk cells.
  • the method for producing a heparin-like substance of the present invention is characterized by including the step of culturing animal cells introduced with the following to obtain a culture supernatant containing a heparin-like substance: - a polynucleotide encoding a bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase (NDST2); - a polynucleotide encoding heparan sulfate glucosamine 3 sulfotransferase 1 (Hs3st1); • A polynucleotide encoding the extracellular domain of a syndecan (SDC); and • A polynucleotide encoding a protein (transporter, enzyme, etc.) involved in each step of the sulfation pathway.
  • SDC syndecan
  • Heparin-like substance In the context of the present invention, references to heparinoids refer to heparin, heparan sulfate, and mixtures thereof. Heparin can be said to be highly sulfated among heparan sulfates. Heparin and heparan sulfate are composed of disaccharide units of uronic acid ( ⁇ -D-glucuronic acid and ⁇ -L-iduronic acid and glucosamine (DN-acetylglucosamine and DN-glucosamine sulfate) as one unit.
  • uronic acid ⁇ -D-glucuronic acid and ⁇ -L-iduronic acid
  • glucosamine DN-acetylglucosamine and DN-glucosamine sulfate
  • glucosamine at positions 3 and 6 are O-sulfated
  • glucosamine at position 2 is O-sulfated.
  • the amino group of is N-sulfated.
  • Heparin-like substances can be quantified by methods well known to those skilled in the art as sulfated glycosaminoglycans, sGAG). Also, the activity of the heparin-like substance can be measured as anticoagulant factor Xa (FXa) activity by a method well known to those skilled in the art. Activity can also be expressed as specific activity (activity per amount of protein).
  • FXa anticoagulant factor Xa
  • the heparin-like substances produced according to the invention have a highly elevated level of sulfation and therefore an enhanced anticoagulant activity. In general, low-molecular-weight heparins and synthetic heparins have only anti-FXa activity and no anticoagulant factor IIa (FIIa) activity.
  • the heparin-like substance produced by the present invention can have both anti-FXa activity and anti-FIIa activity. This indicates the possibility that the heparin-like substance produced by the present invention has the same structure as commercially available heparin.
  • NDST2 Both functional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase (NDST2)] A polynucleotide encoding NDST2 is introduced into animal cells used in the production method of the present invention.
  • NDST2 is a member of the N-deacetylase/N-sulfotransferase subfamily of sulfotransferase 1 proteins, and is an enzyme with dual functions of N-deacetylation and N-sulfation.
  • polynucleotides encoding NDST2 are any of the following.
  • A2 a polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 21 or 39;
  • B2 a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a sequence complementary to the sequence set forth in SEQ ID NO: 21 or 39 and that encodes a protein having NDST2 activity;
  • C2 a polynucleotide consisting of a sequence having 90% or more identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 21 or 39 and encoding a protein having NDST2 activity;
  • D2) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22 or 40;
  • E2 a polynucleotide consisting of an amino acid sequence in which multiple amino acids are substituted, deleted, inserted, and/or added to the amino acid sequence set forth in SEQ
  • Hs3st1 Heparan sulfate glucosamine 3 sulfotransferase 1 (Hs3st1)] A polynucleotide encoding Hs3st1 is introduced into animal cells used in the production method of the present invention.
  • Hs3st1 a member of the heparan sulfate biosynthetic enzyme family, possesses both heparan glucosaminyl sulfate 3-O-sulfotransferase activity and anticoagulant heparan sulfate conversion activity, and is the rate-limiting enzyme for anticoagulant heparan synthesis. .
  • polynucleotides encoding Hs3st1 are any of the following.
  • A3 a polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 31, 41, or 45;
  • B3 a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a sequence complementary to the sequence set forth in SEQ ID NOs: 31, 41, or 45 and that encodes a protein having Hs3st1 activity;
  • C3 a polynucleotide consisting of a sequence having 90% or more identity with the sequence set forth in SEQ ID NOs: 31, 41, or 45 and encoding a protein having Hs3st1 activity;
  • D3) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32, 42, or 46;
  • E3 A polynucleotide consisting of an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are substituted
  • Syndecan [Extracellular domain of syndecan (SDC)] A polynucleotide encoding the extracellular domain of syndecan is introduced into animal cells used in the production method of the present invention.
  • Syndecans are members of a family of four cell surface proteoglycans with retained plasma membrane and cytoplasmic domains.
  • the syndecan structure consists of extracellular, transmembrane and cytoplasmic domains. Among these, the extracellular domain contains the glycosaminoglycan binding site.
  • polynucleotides encoding extracellular domains of syndecans are any of the following.
  • A4 a polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 37;
  • B4 A heparin-like substance in the culture supernatant hybridized under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a sequence complementary to the sequence set forth in SEQ ID NO: 37 and introduced into heparin-like substance-producing animal cells a polynucleotide encoding a protein that has the function of increasing the amount of
  • C4 A function of increasing the amount of a heparin-like substance in the culture supernatant, when it consists of a sequence having 90% or more identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 37 and is introduced into a heparin-like substance-producing animal cell.
  • having a function of increasing the amount of a heparin-like substance in a culture supernatant refers to heparin-like substance productivity in which a polynucleotide encoding an extracellular domain of syndecan has not been introduced. It refers to an increase in the amount of heparin-like substances in the culture supernatant when a polynucleotide of interest is introduced into animal cells, compared to before introduction.
  • heparin-like substance-producing animal cells are CHO cells introduced with a polynucleotide encoding NDST2 and a polynucleotide encoding Hs3st1.
  • a more specific example is CHO-S/NH cells (see Patent Document 5).
  • Polynucleotides encoding proteins (transporters, enzymes, etc.) involved in each step of the sulfation pathway are introduced into the animal cells used in the production method of the present invention.
  • Polynucleotides encoding proteins involved in each step of the sulfation pathway include:
  • - a gene encoding a transporter of sulfate ions into cells e.g., SLC26A1, SLC26A2, SLC13A1, SLC13A4
  • - A gene encoding an enzyme that synthesizes PAPS from sulfate ions e.g., SLC26A1, SLC26A2, SLC13A1, SLC13A4
  • transporters of PAPS to the Golgi apparatus e.g., PAPSS1, PAPSS2
  • ⁇ Genes encoding sugar chain converting enzymes e.g., Glce
  • - genes encoding de-N-acetylating/N-sulfating enzymes e.g., NDST1, NDST2
  • - a gene encoding a 2-O-sulfase e.g., Hs2st
  • 6-O-sulfases e.g., Hs6st1, Hs
  • the 6-O-sulfase gene it is preferable to introduce the Hs6st3 gene. more preferred. This is because the introduction increases the sulfation level of the heparin-like substance produced by the heparin-like substance-producing animal cells and improves the anticoagulant factor Xa activity.
  • Hs6st3 gene ie, a polynucleotide encoding Hs6st3, is any of the following.
  • A a polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 29 or 43;
  • B Anticoagulant Xa of a heparin-like substance hybridized under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a sequence complementary to the sequence set forth in SEQ ID NO: 29 or 43 and produced by a heparin-like substance-producing animal cell a polynucleotide encoding a protein that has the function of enhancing factor activity;
  • C A function of improving the anticoagulant factor Xa activity of a heparin-like substance produced by a heparin-like substance-producing animal cell comprising a sequence having 90% or more identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 29 or 43 a polynucleotide encoding a protein having (D) a polyn
  • a polynucleotide encoding a protein having the function of enhancing anticoagulant factor Xa activity; (F) comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30 or 44, and improving the anticoagulant factor Xa activity of a heparin-like substance produced by a heparin-like substance-producing animal cell
  • Hs6st1 gene ie, a polynucleotide encoding Hs6st1
  • A5 a polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 25
  • B5 anticoagulant factor Xa activity of a heparin-like substance hybridized under stringent conditions with a polynucleotide comprising a sequence complementary to the sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and produced by a heparin-like substance-producing animal cell
  • C5 consists of a sequence having 90% or more identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 25, and has the function of improving the anticoagulant factor Xa activity of a heparin-like substance produced by a heparin-like substance-producing animal cell a polynucleotide encoding a protein
  • D5 a polynucleotide consisting of the sequence set forth in
  • Hs6st2 gene ie, a polynucleotide encoding Hs6st2
  • A6 a polynucleotide consisting of the sequence set forth in SEQ ID NO: 27
  • B6 anticoagulant factor Xa activity of a heparin-like substance hybridized under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a sequence complementary to the sequence set forth in SEQ ID NO: 27 and produced by a heparin-like substance-producing animal cell a polynucleotide encoding a protein that has the function of enhancing
  • C6 consists of a sequence having 90% or more identity with the sequence set forth in SEQ ID NO: 27, and has the function of improving the anticoagulant factor Xa activity of a heparin-like substance produced by a heparin-like substance-producing animal cell a polynucleotide encoding a protein
  • D6 a polynucleot
  • a polynucleotide encoding 6-O-sulfase having a function of improving the anticoagulant factor Xa activity of a heparin-like substance produced by heparin-like substance-producing animal cells means 6-O-sulfase.
  • a polynucleotide of interest is introduced into heparin-like substance-producing animal cells into which no polynucleotide encoding It means that the anticoagulant factor Xa activity of mimetic substances is improved.
  • Examples of the heparin-like substance-producing animal cells referred to herein are CHO cells introduced with a polynucleotide encoding NDST2, a polynucleotide encoding Hs3st1, and a polynucleotide encoding the extracellular domain of SDC.
  • a more specific example is CHO-S/NH-SDC cells (see Patent Document 5).
  • a heparin-like substance having an anticoagulant factor Xa activity (specific activity) per 1 mg of 8 IU/mg or more can be obtained.
  • the specific activity can be 10 IU/mg or more, 12 IU/mg or more, 30 IU/mg or more, 60 IU/mg or more, 90 IU/mg or more.
  • the term IU (International Unit) for a heparin-like substance means IU (IU anti-Xa activity) of anticoagulant factor Xa activity, unless otherwise specified.
  • the IU can be defined using the International Standard (IS) recommended by WHO/BS/2012.2207, and the IS can be used to determine the IU value of the substance of interest.
  • the anticoagulant factor Xa activity (specific activity) is expressed numerically
  • the value measured as heparin concentration by the method according to the following measurement principle is expressed as glucosamine according to the following measurement principle, unless otherwise specified. It is a value calculated by dividing the value measured as the total concentration of noglycan.
  • Heparin concentration measurement principle Antithrombin III is added to the sample to form a heparin/antithrombin III complex, which is then reacted with a certain excess amount of anticoagulant factor Xa. It binds to coagulation factor Xa to form an inactive heparin-antithrombin III-anticoagulant factor Xa complex.
  • the substrate N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl ( ⁇ -OR)-glycyl-L-arginyl-p-nitroanilide, hydrochloride
  • p - nitroaniline is liberated. Since the residual activity of anticoagulant factor Xa reflects the heparin concentration in the sample, the heparin concentration of the sample can be determined by colorimetric determination of the liberated p-nitroaniline at 405 nm.
  • Measurements based on this principle can be performed using a commercially available heparin measurement kit, such as Test Team Heparin S#30564000 (Sekisui Medical).
  • heparin measurement kit such as Test Team Heparin S#30564000 (Sekisui Medical).
  • standard reagents such as heparin sodium (product code: 081-00131, 085-00134, 081-00136, 087-00133, Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) can be used.
  • Glucosaminoglycan measurement principle Blyscan Dye (1,9-dimethyl-methylene blue), which specifically binds to sulfated sugar chains, is added to the sample to pellet the soluble sulfated proteoglycans and sulfated glycosaminoglycans in the sample.
  • the dye can be eluted from the pellet with a reagent and colorimetrically determined at 656 nm to determine the concentration of total glucosaminoglycans in the sample.
  • Measurement based on this principle can be performed using a commercially available glycosaminoglycan measurement kit, such as the Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit (product code B1000, Biocolor).
  • a commercially available glycosaminoglycan measurement kit such as the Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit (product code B1000, Biocolor).
  • the present invention also provides a recombinant heparin-like substance having a specific activity of 200 IU/mg or more, preferably 230-270 IU/mg, more preferably 240-260 IU/mg.
  • Heparin-like substance-producing animal cells In the context of the present invention, a heparin-like substance-producing animal cell refers to an animal cell that has proteins necessary for heparin biosynthesis and is capable of producing a heparin-like substance, unless otherwise specified.
  • Heparin-like substance-producing animal cells are obtained by introducing polynucleotides required for heparin biosynthesis into animal cells.
  • the animal cells are CHO cells, at least one, preferably both, of a polynucleotide encoding NDST2 and a polynucleotide encoding Hs3st1, which are necessary for heparin biosynthesis and whose expression is not observed in CHO cells.
  • CHO cells that produce heparin-like substances can be obtained by the introduction (Bail JY et al., Metab Eng14:81-90, 2012).
  • Animal cells used in the present invention include, for example, Chinese hamster ovary CHO cells [Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp.
  • CHO cells lacking the enzyme gene [Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77, 4216 (1980)], CHO-K1 (ATCC CCL-61), DUkXB11 (ATCC CCL-9096) Pro-5 (ATCC CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, Cat#11619), Pro-3, human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), human umbilical artery endothelial cells (HUAEC), human pulmonary microvascular endothelial cells (HLMVEC), human aortic endothelial cells (HAoEC), human coronary artery endothelial cells (HCAEC), human pulmonary artery endothelial cells (HPAEC), human embryonic kidney (HEK), rat myeloma cells YB2/3HL.
  • HEVEC human umbilical vein endothelial cells
  • HUAEC human umbilical artery endothelial cells
  • HLMVEC human pulmonary microvascular end
  • G11.16Ag. 20 also referred to as YB2/0
  • monkey cell COS cells mouse myeloma cell NSO, mouse myeloma cell SP2/0-Ag14, Syrian hamster cell BHK or HBT5637 (Japanese Patent Laid-Open No. 63-000299), etc. be done.
  • CHO cells, CHO/DG44 cells or CHO-K1 ATCC CCL-61) are preferable, and CHO cells are more preferable.
  • polynucleotides, proteins may be human-derived or non-human mammalian-derived, unless otherwise specified.
  • Non-human mammals include pigs, mice, rats and hamsters.
  • the hybridization conditions for any polynucleotide are Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 4th ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press) and Hybridization of Nucleic Acid Immobilization on Solid Supports (ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138, 267-284 (1984)). .
  • a 6-fold concentration of SSC solution (1-fold concentration of SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) and 5% formamide
  • a condition of performing hybridization at 40°C in the presence and then washing the filter at 49°C with a 4-fold concentration of SSC solution may be used.
  • obtaining DNA with 85% or more identity hybridize at 40°C in the presence of 2-fold concentration SSC solution and 50% formamide, then use 0.1-fold concentration SSC solution at 57°C.
  • the conditions for washing the filter may be used.
  • When obtaining DNA with 90% or more identity hybridize at 45°C in the presence of 2x SSC solution and 50% formamide, then 0.1x SSC solution at 62°C.
  • the conditions for washing the filter may be used.
  • identity (number of matched positions/total number of positions) x 100, and can be calculated using a commercially available algorithm.
  • Such algorithms are also incorporated into the NBLAST and XBLAST programs described in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410.
  • sequence identity can be performed by algorithms or programs well known to those skilled in the art (eg, BLASTN, BLASTP, BLASTX, ClustalW). Parameters when using programs can be appropriately set by those skilled in the art, and default parameters of each program may be used. Specific techniques of these analysis methods are also well known to those skilled in the art. Gene information processing software GENETIX (registered trademark) (Genetics Inc.) may be used for identity calculation. If the target sequence for which percent identity is to be determined has an additional sequence such as a tag sequence at the end that does not exist in the sequence to be compared, the additional sequence portion is not included in the calculation of percent identity.
  • GENETIX registered trademark
  • the identity when referring to a nucleotide sequence or amino acid sequence, the identity is at least 50%, for example 60% or more, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 80% or more, in any case, unless otherwise specified. refers to a sequence identity of 85% or higher, more preferably 90% or higher, more preferably 95% or higher, even more preferably 97.5% or higher, further preferably 99% or higher.
  • Polynucleotides or genes and proteins or enzymes used in the present invention can be prepared by those skilled in the art using conventional techniques.
  • the default parameters are 5 for G (Cost to open gap) for base sequences, 11 for amino acid sequences, and 2 for -E (Cost to extend gap) for base sequences and 1 for amino acid sequences.
  • -q (Penalty for nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • -W (wordsize) is base sequence
  • 11 residues amino acid sequence 3 residues for
  • -y [Dropoff(X) for blast extensions in bits] is 20 for blastn, 7 for programs other than blastn
  • -X (X dropoff value for gapped alignment in bits) is 15
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the target amino acid sequence can be obtained by site-directed mutagenesis [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene , 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. It can be obtained by introducing site-directed mutation into a DNA encoding a polypeptide containing.
  • the present invention provides recombinant CHO cells introduced with at least: - a polynucleotide encoding NDST2; - a polynucleotide encoding Hs3st1; • a polynucleotide encoding the extracellular domain of SDC; and • a polynucleotide encoding 6-O-sulfase.
  • Such animal cells can be obtained by introducing a recombinant vector containing a given polynucleotide into an animal cell that serves as a host cell.
  • a recombinant vector containing a given polynucleotide into an animal cell that serves as a host cell.
  • the above description applies to each polynucleotide as it is.
  • Any recombinant vector can be used as long as it is capable of autonomous replication in the host cell used or integration into the chromosome and contains an appropriate promoter at the position where the DNA encoding the polypeptide can be transcribed. be able to.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for a recombinant vector, but it is preferable to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the recombinant vector may contain a promoter-regulating gene.
  • a recombinant vector it is preferable to use a plasmid in which a Kozak sequence, which is a ribosome binding sequence, is appropriately arranged around the initiation codon.
  • any vector can be used as long as it can exhibit its function in animal cells. 3, 133 (1990)], pAS3-3 (Japanese Patent Laid-Open No. 02-227075), pcDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNA I/Amp (Invitrogen), pcDNA3.1 (Invitrogen) ), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pME18SFL3, pKANTEX93 (International Publication No. 97/10354), N5KG1val (U.S. Patent No. 6001358), INPEP4 ( Biogen-IDEC) and transposon vectors (International Publication No. 2010/143698).
  • Any promoter can be used as long as it can exhibit its function in animal cells.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE immediate early gene promoter
  • SV40 early promoter SV40 early promoter
  • retrovirus promoter SV40 early promoter
  • metallothionein promoter the metallothionein promoter
  • the heat shock promoter the SR ⁇ promoter
  • Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • the recombinant vector may contain a selectable marker.
  • a selectable marker is a gene that allows the selection of cells containing the gene. Selection includes positive selection and negative selection. Positive selection refers to a process in which positive selection occurs to select for cells containing the selectable marker.
  • Drug resistance is an example of a positive selectable marker, in which cells containing the marker survive in drug-containing culture medium and cells without the marker die.
  • Selectable markers include drug resistance genes such as neo, which confers G418 resistance; hygr, which confers hygromycin resistance; and puro, which confers puromycin resistance.
  • Other positive selectable marker genes include genes that allow identification or screening of cells containing the marker.
  • GFP and GFP-like chromophores, luciferase genes
  • the lacZ gene the alkaline phosphatase gene
  • surface markers such as CD8.
  • Negative selection refers to the process of exposing to a suitable negative selection agent to kill cells containing the negative selectable marker.
  • cells containing the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) gene [Wigler et al, Cell 11:223 (1977)] are sensitive to the drug ganciclovir (GANC).
  • GANC herpes simplex virus thymidine kinase
  • the gpt gene renders cells sensitive to 6-thioxanthine.
  • Any method for introducing DNA into animal cells can be used as the method for introducing the recombinant vector into the host cell.
  • the electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 02-227075
  • the lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987 )] and the like.
  • Recombinant cells are preferably cultured under conditions that promote the production of heparin-like substances. Specifically, for example, it is preferable to culture the recombinant cells in a medium that enables the production of the heparin-like substance by the recombinant cells and promotes the secretion of the heparin-like substance from the recombinant cells into the culture supernatant. .
  • the medium in which the recombinant cells are cultured should contain at least sufficient carbon, nitrogen, oxygen and other nutrients, growth factors, buffers, cofactors and others to maintain cell viability and allow expression of the heparin-like substance. It is preferable to contain any substance of In embodiments in which the gene encoding the heparin-like substance is under the control of or contains an inducible promoter, the medium may further contain an inducer.
  • Media include, for example, RPMI or DMEM supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), as well as tissue culture media supplemented with factors such as antibacterial agents, growth factors, and other cytokines (e.g., Cell Biology (Third Edition) A Laboratory Handbook, vol. 1, 2006, Elsevier Inc.). Specific examples include media formulations known to those skilled in the art, such as RPMI, IMDM, DMEM, DMEM/F12, serum-free or low-serum EMEM. These media may contain additional nutritional supplements such as antibiotics, lipids, transferrin, insulin, amino acids, and optionally cofactors.
  • FCS fetal calf serum
  • the medium preferably contains at least one selected from glucose, sulfate and phosphoric acid.
  • concentration of glucose in the medium is generally preferably 5-75 mM, more preferably 10-60 mM, still more preferably 15-35 mM.
  • concentration of sulfate in the medium is generally preferably 0.5-50 mM, more preferably 10-50 mM, still more preferably 30-50 mM.
  • concentration of phosphate in the medium is generally preferably 0.5-50 mM, more preferably 1-50 mM, still more preferably 10-50 mM.
  • a heparin-like substance can be produced by producing and accumulating a heparin-like substance in the culture supernatant and collecting the heparin-like substance from the culture supernatant.
  • a method for culturing recombinant cells in a medium can be carried out according to a conventional method. Cultivation is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40°C, in the presence of 5% CO 2 .
  • the secretory production of heparin-like substances from recombinant cells can be confirmed by adding an enzyme solution containing heparin lyases I, II, and III to the culture supernatant, enzymatically treating the enzymes, and then quantifying them with HPLC for unsaturated disaccharide analysis. .
  • the secretory production of heparin-like substances from recombinant cells can also be confirmed by measuring the amount of sGAG in the culture supernatant.
  • proteoglycans which are glycoproteins containing core proteins bound to heparin-like substances that are GAGs
  • Isolation of proteins from culture supernatants is performed by methods conventionally known in the art.
  • a tag that facilitates isolation of the heparin-like substance such as an affinity tag
  • Tags include, for example, polyhistidine (His6 tag), nickel matrix, chitin binding protein (CBP), maltose binding protein (MBP), glutathione-S-transferase (GST), FLAG tag or epitope tag.
  • the heparin-like substance is isolated from the core protein by a method conventionally known in the art. Examples include enzymatic digestion using heparinase, treatment with sodium hydroxide or alkaline borohydride.
  • Heparin-like substance may contain repeating structures of disaccharide units of various lengths.
  • Heparin-like substances are UA-GlcNAc(6S), UA(2S)-GlcNAc, UA-(2S)-GlcNAc(6S), UA-GlcNS, UA-GlcNS(6S), UA(2S)-GlcNS, UA( 2S)-GlcNS(6S), which may be present in any order in the heparin-like substance.
  • UA is a uronic acid residue (i.e., glucuronic acid or iduronic acid)
  • Ac is acetyl
  • GlcNAc is N-acetylglucosamine
  • GlcNS is glucosamine-N-sulfate
  • 2S is 2-O-sulfate
  • 6S is 6 -O-sulfate.
  • compositions comprising heparin-like substances or fragments thereof produced by the methods described herein.
  • a heparin-like substance or fragment thereof included in the pharmaceutical composition may be bound to a core protein.
  • the pharmaceutical composition may also contain other therapeutic agents.
  • Pharmaceutical compositions can also be formulated, for example, by using conventional vehicles or diluents, as well as pharmaceutical additives of the type appropriate for the desired method of administration (eg, excipients, binders, preservatives).
  • compositions include, for example, sterile injectable aqueous preparations.
  • Sterile injectable aqueous solutions may be formulated according to the known art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • a sterile injectable aqueous solution may also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally-acceptable diluent or solvent, for example, a solution in 1,3-butanediol.
  • acceptable vehicles and solvents that may be employed are water, Ringer's solution and isotonic saline.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and can be in a wide variety of dosage forms.
  • Dosage forms for administering the pharmaceutical composition include, for example, tablets, capsules, sachets, troches, pills, powders, granules, elixirs, tinctures, solutions, suspensions, Administration in forms such as elixirs, syrups, ointments, creams, intravenous administration or injection, pastes, emulsions or solutions.
  • transdermal administration eg, by patch mechanism or ointment. Any of these may be modified into sustained release and/or sustained release formulations.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include vehicles, adjuvants, surfactants, suspending agents, emulsifying agents, inert fillers, diluents, excipients, wetting agents, binders, lubricants, buffers, disintegrants Including but not limited to agents and carriers.
  • a pharmaceutically acceptable carrier is chemically inert to the active compound and has no adverse side effects or toxicity under the conditions of use.
  • the nature of the pharmaceutically acceptable carrier may vary depending on the particular dosage form used and other characteristics of the composition.
  • the present invention provides a method for treating or treating blood coagulation or a condition associated with or caused by blood coagulation in a subject in need thereof, comprising administering a heparin-like substance or fragment thereof produced by the method of the present invention.
  • a preventive method In this aspect, the heparin-like substance or fragment thereof may be bound to the core protein.
  • Blood clotting or conditions associated with or caused by blood clotting include, for example, acute coronary syndrome, atrial fibrillation, deep vein thrombosis or pulmonary embolism.
  • Mammals include, for example, humans, primates, livestock animals (e.g. sheep, cows, horses, donkeys, pigs), companion animals (e.g. dogs, cats), laboratory test animals (e.g. mice, rabbits, rats). , guinea pigs, hamsters), and captive wild animals (eg, foxes, deer).
  • a mammal is typically a human or a primate, more typically a human.
  • the dosage and timing of administration are preferably those that provide therapeutic benefit in the treatment, prevention, or management of blood coagulation or blood coagulation-related conditions.
  • the specific effective dose and timing of administration may vary depending on factors such as subject's condition, medical history, size, weight and age.
  • CHO cell culture (1) Composition of Medium FreeStyle CHO Expression Medium (Cat. No. 12651014, Invitrogen) was used as a medium for culturing CHO-S cells (Cat. No. R80007, Invitrogen) and CHO/NH-SDC. Penicillin (Cat. No. 021-07732, Wako) and streptomycin (Cat. No. 194-08512, Wako) were added as antibiotics. In addition, L-glutamine (Cat. No. 074-00522, Wako) was added to the medium to a final concentration of 8 mM. Cells were cultured by inoculating T-25 flasks for suspension cells (Cat. No.
  • CHO-S cells reach 100% confluence at approximately 1.5 ⁇ 10 7 cells/flask, and when passaged at 0.3 ⁇ 10 7 cells per flask (approximately 1/5), 2 After a few days, they reached confluence.
  • CHO/NH - SDC reached 100% confluence at approximately 1.2 ⁇ 10 7 cells/flask. confluence was reached later. As will be described later, in experiments such as serum-free acclimation, the proliferative state was maintained by increasing the mixing concentration.
  • antibiotics and glutamine were added by preparing a concentrated solution according to the following procedure.
  • 69.9 mg of penicillin and 100 mg of streptomycin were dissolved in 10 mL of 0.85% NaCl water, filtered and sterilized with a 0.45 ⁇ m syringe filter in a clean bench to obtain a 100 ⁇ stock solution.
  • glutamine 1.169 g of L-glutamine was dissolved in 10 mL of 0.85% NaCl water, filtered and sterilized with a 0.45 ⁇ m syringe filter in a clean bench to obtain a 200 mM stock solution.
  • the medium When culturing the cells in an adherent state, the medium was prepared by the following procedure.
  • Basic Medium F12 (10.6 g/L, Cat. No. N6760, Sigma) containing 10% (v/v) Fetal Bovine Serum (FBS) (Cat. No.FB-1280/500, Lot. ) was used.
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • As antibiotics 70 mg/L penicillin and 100 mg/L streptomycin, and sodium bicarbonate (Cat. No. 191-01305, Wako) at 1.176 g/L were used. It was cultured on a normal dish (Cat. No. 130182, Thermo) in a 37°C, 5% CO 2 incubator.
  • Anticoagulant activity is evaluated by measuring anticoagulant factor Xa activity (anti-FXa activity) of heparin-like substances contained in the cell culture supernatant. did. Seed the established cell clones or each cell line at a cell density of 0.6 ⁇ 10 6 cells/well at a density of 2 mL/well in a 6-well plate (Cat. No. 130184, Thermo) using FreeStyleCHO-S Expression Medium. and day 0. The cells were cultured without medium exchange or passage, and the culture supernatant was collected on day 3. A stock solution of the culture supernatant was used as a sample.
  • BIOPHEN HEPARIN ANTI-Xa 2 stage (Cat.No. 221005, HBM) if sample activity is low
  • Test Team Heparin S Measurement Kit (Cat.No. 30564000, Sekisui Medical Co., Ltd.) if high activity is expected was measured using The operation followed the manual of the kit.
  • the measurement principle for each kit is the same.
  • Antithrombin III is added to a sample containing heparin to form a heparin-antithrombin III complex, which is then reacted with a certain excess amount of Factor Xa (FXa). In response, it binds FXa to form an inactive heparin-antithrombin III-FXa complex.
  • An FXa-specific chromogenic substrate was added to this to release a chromogenic substrate corresponding to residual FXa activity. Since the residual activity of FXa reflects the anticoagulant activity of heparin in the sample, this released chromogenic substrate was quantified colorimetrically at 405 nm. Next, the simple operation method of each kit is shown.
  • BIOPHEN HEPARIN ANTI-Xa 2 stage BIOPHEN UFC Calibrator (Cat. No. 222301-RUO, HBM) with a known activity value was used for the calibration curve when using BIOPHEN HEPARIN ANTI-Xa 2 stage.
  • BIOPHEN UFC Calibrator kit was dissolved by adding 1 mL of sterile water.
  • Tris NaCl EDTA PEG buffer-pH 8.40 (Cat. No. AR030, HBM) was added to this and diluted 15 times to prepare 5 types of standard solutions.
  • Antithrombin III powder (R1), FXa powder (R2), and FXa-specific chromogenic substrate powder (R3) in the kit were completely dissolved by adding 1 mL of sterilized water. These reagents are usually stored in a refrigerator, and were shaken at 100 rpm and 25° C. for 30 minutes in a constant temperature shaker (Model. No. M ⁇ RB-022UP, Taitec) prior to assay. Necessary amounts were dispensed, and the R1 and R2 solutions were diluted 5-fold with Tris NaCl EDTA PEG buffer-pH 8.40, and the R3 solution was diluted 5-fold with sterilized water. Incubate at 37° C. immediately before use in the assay.
  • the culture supernatant was centrifuged at 13,200 g for 5 minutes before the assay, and 10 ⁇ L of the supernatant was used as a sample.
  • 10 ⁇ L of the standard and 10 ⁇ L of the sample were transferred to a 384-well ELISA plate (Cat. No. 3711-384, Iwaki) and incubated at 37°C for 5 minutes.
  • a 384-well ELISA plate is used here because it is easier to mix the reagents as they are added than in larger vessels.
  • 10 ⁇ L of the R1 solution was added thereto and incubated at 37°C for 2 minutes. After the reaction, 10 ⁇ L of R2 solution was added and the mixture was incubated at 37° C. for exactly 2 minutes.
  • the culture supernatant was centrifuged at 13,200 g for 5 minutes before the assay, and 5 ⁇ L of the supernatant was used as a sample.
  • 5 ⁇ l of sample was transferred to a 96-well ELISA plate, and 40 ⁇ l of the buffer included in the kit was added to make a total of 45 ⁇ l.
  • Standards and samples were then incubated at 37°C for 5 minutes.
  • 5 ⁇ L of antithrombin III solution was added thereto and the mixture was incubated at 37° C. for 6 minutes. After the reaction, 25 ⁇ L of FXa solution was added and the mixture was incubated at 37° C. for exactly 30 seconds.
  • the sGAG (sulphatedglycosaminoglycans) concentration in the obtained samples was measured by Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit (Cat. No. B1000, QBS). The assay was performed according to the kit manual. The procedure is shown below.
  • the culture supernatant was centrifuged at 13,200 g for 5 minutes before the assay, and 100 ⁇ l was used as a sample. Place 100 ⁇ L of sample or standard in a 1.5 mL microtube, add 1,000 ⁇ L of Blyscan Dye (1,9-dimethyl-methylene blue) Reagent, and mix for 30 minutes at 100 rpm at room temperature (Model. No. M BR -022UP, Maximizer, Taitec). After centrifugation (20,000 x g, 10 minutes, 4°C) was performed to obtain a pellet of the reaction material of sGAG and Blyscan Dye Reagent, the supernatant was removed and the pellet was dissolved using 500 ⁇ L of Dye Dissociation Reagent.
  • the pellet When removing the supernatant, the pellet easily came off the wall surface of the microtube, so after removing a certain amount of the supernatant by decanting, it was carefully removed with a micropipette so as not to leave as much of the supernatant as possible. Finally, after centrifugation (20,000 x g, 10 minutes, 4°C), 200 ⁇ L was transferred to a 6-well ELISA plate (Cat.No.3801-096, Iwaki), and the absorbance (656 nm) was measured using a plate reader ( Model. No, Enspire, PerkinElmer).
  • the animal cell expression vector used in the transient expression experiment was purchased from ORIGEN and Horizon Discovery.
  • the vector obtained as a frozen stock of E. coli was cultured according to the procedure described below, and plasmid DNA was extracted.
  • the obtained plasmid DNA was transformed into competent cells and cultured in the same manner to extract the plasmid DNA.
  • the gene sequences of interest were confirmed by sequence analysis (Prism 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) before use in experiments.
  • E. coli competent cells for transformation Inoculate an E. coli strain (DH5 ⁇ (Takara)) on LB agar medium (1% polypeptone, 1% NaCl, 0.5% yeast extract, 2% agar) and incubate at 37°C. cultured overnight. After that, single colonies were isolated from the agar medium and added to 30 mL of LB medium for competent cell production ( 1% polypeptone, 1% NaCl, 0.5% yeast extract, 0.02M MgSO4.7H2O , 0.02M MgCl2 . 6H 2 O (pH 7.2-7.3)) and transferred to shaking culture.
  • transformation buffer (10 mM PIPES, 15 mM CaCl 2 .2H 2 O, 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 .4H 2 O (pH 6.7-6.8)
  • the cells were cultured overnight at 37°C to obtain colonies having the desired plasmid.
  • X-gal (20 ⁇ g/mL: 50 ⁇ L) and IPTG (100 mM: 25 ⁇ L) were applied, and then E. coli was inoculated to obtain the desired plasmid. white colonies were obtained.
  • DNA ligation by DNA ligase Prepare 5 ⁇ L of DNA solution containing plasmid vector and insert DNA, and use LigaFastTM Rapid DNA Ligation System (Cat. No. M8221, Promega) to ligate DNA by reacting at 16°C for 12 hours or at room temperature for 2 hours. did The operation followed the protocol attached to the kit.
  • LigaFastTM Rapid DNA Ligation System Cat. No. M8221, Promega
  • the cell pellet was resuspended in 4 mL of Buffer P1. Next, after adding 4 mL of Buffer P2, the mixture was thoroughly mixed by vigorously inverting it 4 to 6 times, and left at room temperature for 5 minutes. The lysate was poured into the QIAfilter Cartridge and incubated for 10 minutes at room temperature. 4 mL of Buffer QBT was added to the QIAGEN-tip 100, and the column was allowed to stand until the column became empty for equilibration. The plunger was placed in the QIAfilter Midi Cartridge and the cell lysate was poured into a pre-equilibrated QIAGEN-tip 100 and filtered. The lysate was percolated into the resin by gravity flow.
  • the QIAGEN-tip was washed twice with 10 mL of Buffer QC. DNA was eluted with 5 mL of Buffer QF, and 3.5 mL of isopropanol (room temperature) was added to precipitate the DNA. After mixing, the mixture was immediately centrifuged at 4°C and 15,000 xg for 30 minutes. The supernatant was carefully decanted and incubated for 5 minutes at room temperature. The DNA pellet was washed with 2 mL of 70% ethanol and centrifuged at 15,000 xg for 10 minutes at 4°C. The supernatant was similarly carefully decanted, the pellet was dried for 5-10 minutes, and then redissolved in approximately 50 ⁇ L of TE buffer to form a plasmid solution.
  • Hs6st3 gene expression vector
  • Hs6st3 Mouse-derived heparan sulfate glucosamine 6-sulfotransferase 3 (Hs6st3: Accesion No. NM_015820) that most enhanced the anti-FXa activity of the heparin-like substance-producing cell culture supernatant under transient expression was used as the target gene.
  • Fig. 1 shows the procedure for constructing the Hs6st3 expression transposon vector. The procedure for constructing the vector is briefly described below.
  • the Hs6st3 gene was amplified by PCR using the Hs6st3 expression plasmid vector (ORIGEN, Catalog ID: MR217272) used in the experiment under transient expression as a template. PCR was performed using KOD-Plus-Neo (Cat. No. KOD-401, Toyobo) according to the kit manual. The primers and PCR conditions used are shown in the table below.
  • the PCR product was electrophoresed on an agarose gel, and after confirming band amplification, was recovered using a DNA purification kit (Mag Extractor-PCR & Gel clean up-).
  • the PCR product was ligated with pBluescript II KS (-) treated with EcoRV, transformed into competent cells, and cloned into Escherichia coli having the target gene sequence. After mass extraction of plasmid DNA, only the target gene region was cleaved with XbaI and NruI.
  • PB-chEF1a-Hs6st3 was obtained by ligation with transposon vector PB/chEF1aEBNA1-TKHyg similarly treated with restriction enzymes. Then, the target gene sequence was confirmed by sequence analysis (Prism 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). The sequence analysis was entrusted to Hokkaido System Science.
  • Opti-MEM Invitrogen
  • Opti-MEM Invitrogen
  • the two liquids were mixed and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • the medium was changed to 2 ml of serum-free F12 medium for the cells cultured in the 6-well plate.
  • a DNA/LF2000 mixed solution was added in an amount of 500 ⁇ L/well and cultured at 37°C. After 6 hours, the medium was changed to serum-free medium.
  • the culture supernatant was collected after 48 hours after transfection.
  • the cells were allowed to stand for 48 hours after transfection as described above, and the cells were replated on normal TC dishes or plates using F12 + 10% FBS, and cultured and selected in an adherent state. .
  • the cell suspension was diluted stepwise, prepared to 1 cell/well, and plated on a collagen-coated 96-well plate (Cat. No. 4860-010, Iwaki).
  • the medium used was F12+10% FBS medium. Appropriately, the presence and growth of cells were confirmed, culture was performed, and single clones were obtained from cells in a bulk state.
  • the Hs6st3 gene is a gene encoding bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase (NDST2) introduced so far and heparan sulfate glucosamine 3 sulfotransferase 1 (Hs3st1) (Patent Document 5). ), expression in CHO cells has not been confirmed.
  • Hs6st3-Expressing Cells After introducing the Hs6st3 gene, which was highly effective in the previous experiment, into CHO-S/NH-SDC cells by lipofection, the cells were selected with hygromycin to obtain stable expression strains. The obtained cells were plated at a density of 0.6 ⁇ 10 6 cells/well in a volume of 2 mL/well in a 6-well plate, and the FreeStyleCHO-S Expression Medium was used for 3 cycles without medium change or passage. After culturing for days, the culture supernatant was recovered. The anti-FXa activity of the recovered culture supernatant was determined.
  • the specific activity of commercial heparin is 248 IU/mg.
  • a heparin-like substance produced by CHO/NH-SDC/Hs6st3 has about 38% of its activity.
  • Hs6st3-Expressing Cell Clones The Hs6st3 gene-introduced cells obtained above were serially diluted and seeded on a collagen-coated plate at 1 cell/well. FBS medium containing 10% serum was used for culture. Appropriately, the existence and growth of cells were confirmed and cultured, and 28 single clones were obtained from cells in bulk.
  • Fig. 6 shows the specific activity of the obtained clones. A 1.5- to 9-fold increase in specific activity from bulk cells was confirmed. It can be said that genetically modified CHO cells yielded an anticoagulant with an activity equivalent to that of commercial heparin.
  • Tris EDTA NaCl BSA buffer-pH 8.40 (Cat. No. AR031K) was added to this and diluted 15 times to prepare 5 types of standard solutions. 1 mL of sterilized water was added to the antithrombin III powder (R1), FIIa powder (R2), and FIIa-specific chromogenic substrate powder (R3) in the kit to dissolve them completely. These reagents are usually stored in a refrigerator, and were shaken for 30 minutes at 100 rpm and 25°C in a constant temperature shaking incubator (Model. No. M?RB-022UP, Taitec) prior to assay.
  • a constant temperature shaking incubator Model. No. M?RB-022UP, Taitec
  • the culture supernatant was centrifuged at 13,200 g for 5 minutes before the assay, and 10 ⁇ L of the supernatant was used as a sample.
  • 10 ⁇ L of the standard and 10 ⁇ L of the sample were transferred to a 96-well Assay plate (Cat. No. 3882-096, Iwaki) and incubated at 37°C for 5 minutes. Note that the 96-well Assay plate is used here because it is easier to mix the reagents as they are added than in larger vessels.
  • 10 ⁇ L of R1 solution was added to this and kept at 37°C for 2 minutes. After the reaction, 10 ⁇ L of R2 solution was added and incubated at 37°C for exactly 2 minutes.

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Abstract

ヘパリンとしての生物活性（抗血液凝固活性）が高いヘパリン様物質を得る。以下が導入された動物細胞を培養し、ヘパリン様物質を含む培養上清を得る工程を含む、ヘパリン様物質を製造する方法を提供する。両機能性ヘパラン硫酸エステルN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素（NDST2）をコードするポリヌクレオチド；へパラン硫酸エステルグルコサミン3　硫酸転移酵素１（Hs3st1）をコードするポリヌクレオチド；シンデカン（SDC）の細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド；及び6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチド。

Description

組換えヘパリン様物質、及びその製造方法
　本発明は、ヘパリン様物質の遺伝子工学的な製造方法、及びそれにより製造されたヘパリン様物質に関する。
　ヘパリンは抗血液凝固薬として、人工透析や体外循環などの医療現場で使用されている必要不可欠な薬剤である。医薬品等に用いられるヘパリンは、主にブタの小腸又はウシの肺から抽出、精製されている。
　一方で、遺伝子工学的な手法を用いてヘパリン様物質を生産することが検討されてきている。特許文献１には、ヘパリンの遺伝子導入による製造が開示されており、へパリン生合成酵素とコアタンパク質とを発現するように改変された非ヒトトランスジェニック哺乳動物を用いることが記載されている。また特許文献１には、ヘパリン生合成酵素遺伝子としてNDST1、NDST2（表３）や、Hs6st（表５－１）を含む硫酸化経路関連遺伝子が列記されている。この文献では、実際に遺伝子導入によりヘパリン様物質を製造した実験結果はなく、その硫酸化度やヘパリンとしての生物活性は不明である。特許文献２～４には、ヘパリン型分子を産生するブタ肥満細胞、それを用いたヘパリンタイプの分子を製造する方法が記載されている。特に特許文献２では、3-O-スルファターゼ (3-OST)、特許文献３では3-OSTと6-OSTの遺伝子の利用が記載されている。さらに特許文献２～４には、得られたヘパリン型分子における、二糖の種類・割合、得られたヘパリン型分子の生物学的活性についての分析結果が記載されている。
　本発明者らは、ヘパリン様物質を産生するＣＨＯ細胞を用いたヘパリン様物質の産生を試みてきた。そして、ヘパリン様物質の生産に関わる、（１）両機能性ヘパラン硫酸エステルＮ－脱アセチラーゼ／Ｎ－硫酸転移酵素（以下、ＮＤＳＴ２と略す。）をコードする遺伝子、及び（２）へパラン硫酸エステルグルコサミン３　硫酸転移酵素１（以下、Ｈｓ３ｓｔ１と略す。）をコードする遺伝子が導入されたＣＨＯ細胞に、さらに（３）シンデカン（ＳＤＣ）の細胞外ドメインをコードする遺伝子を導入した組換えＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ）により、ヘパリン様物質が培養上清中に分泌され、効率的に生産できることを見出してきた（特許文献５）。
特表２０１７－５０３４９０号公報 特表２００８－５１５４１７号公報 特表２００６－５２２５９７号公報 特表２００５－５０６０９２号公報 国際公開ＷＯ２０２１／０６６１６７
　本発明者らの方法（前掲特許文献５）で生産したヘパリン様物質は、現在市販されているヘパリンよりも硫酸化度が低く、ヘパリンとしての生物活性（抗血液凝固活性）は市販のものよりかなり低いため、この点の解決が望まれる。
　本発明者らは、上記のＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ）にHs6st3遺伝子等の、硫酸化経路関連遺伝子をさらに導入することで、市販ヘパリンと同等の生物活性を有するヘパリン様糖鎖を分泌生産できないか検討した。その結果、特定の硫酸化経路関連遺伝子を導入することにより、目的が達成できることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は以下を提供する。
[１]　以下が導入された動物細胞を培養し、ヘパリン様物質を含む培養上清を得る工程を含む、ヘパリン様物質を製造する方法：
・両機能性ヘパラン硫酸エステルN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素（NDST2）をコードするポリヌクレオチド；
・へパラン硫酸エステルグルコサミン3　硫酸転移酵素１（Hs3st1）をコードするポリヌクレオチド；
・シンデカン（SDC）の細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド；及び
・6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチド。
[２]　6-O-硫酸化酵素が、へパラン硫酸エステル６－Ｏ－硫酸転移酵素１（Heparan Sulfate 6-O-Sulfotransferase 1、Hs6st1）、へパラン硫酸エステル６－Ｏ－硫酸転移酵素２（Heparan Sulfate 6-O-Sulfotransferase 2、Hs6st2）、及びへパラン硫酸エステル６－Ｏ－硫酸転移酵素３（Heparan Sulfate 6-O-Sulfotransferase 3、Hs6st3）からなる群より選択されるいずれかである、１に記載の製造方法。
[３]　6-O-硫酸化酵素が、Hs6st3である、１又は２に記載の製造方法。
[４]　動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
[５]　１から４のいずれか１項に記載の製造方法により製造された、1 mgあたりの抗凝固第Xa因子活性が、200 IU/mg以上である、組換えヘパリン様物質。
[６]　少なくとも以下が導入された組換えＣＨＯ細胞：
・NDST2をコードするポリヌクレオチド；
・Hs3st1をコードするポリヌクレオチド； 
・SDCの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド；及び
・6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチド。
[７]　6-O-硫酸化酵素が、Hs6st1、Hs6st2、及びHs6st3からなる群より選択されるいずれかである、６に記載の細胞。
[８]　6-O-硫酸化酵素が、Hs6st3である、６又は７に記載の細胞。
[９]　6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチドが、下記のいずれかである、６から８のいずれか１項に記載の細胞。
(A)配列番号29又は43に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B)配列番号29又は43に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C)配列番号29又は43に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D)配列番号30又は44に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E)配列番号30又は44に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F)配列番号30又は44に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
Hs6st3発現トランスポゾンベクターの作製手順 硫酸化経路 一過性発現時の抗凝固第Xa因子活性　硫酸化経路関連遺伝子を導入したCHO細胞の培養上清中の抗凝固第Xa因子活性（抗FXa活性）を測定した。硫酸化経路関連遺伝子のうち、6-O-硫酸化に関与する3つの酵素Hs6st3、Hs6st2、Hs6st1を導入した場合に、抗FXa活性が有意に向上した。 比活性の導出　硫酸化経路関連遺伝子を導入したCHO細胞の培養上清について、物質1 mgあたりの抗凝固第Xa因子活性（抗FXa活性）（比活性）を求めた。3つの酵素Hs6st3、Hs6st2、Hs6st1をコードする遺伝子のいずれかを導入した場合に有意に向上した比活性が見られた。Hs6st3遺伝子のCHO細胞での発現は、これまで確認されていない 比活性の向上　Hs6st3発現細胞（CHO/NH-SDC/Hs6st3）が産生するヘパリン様物質について、sGAG 1 mgあたりの抗凝固第Xa因子活性（抗FXa活性）（比活性）を求めた。比活性は、従来のへパリン様物質産生（CHO/NH-SDC）に比較し、9.7 倍向上し、95 IU/mgだった。市販ヘパリンの比活性は248 IU/mgであり、遺伝子組換えCHO細胞産生ヘパリン様物質は38％ 程度の活性を有していた。 Hs6st3発現細胞クローンの評価　Hs6st3発現細胞（CHO/NH-SDC/Hs6st3）のクローンを28個取得した。バルク細胞から1.5～9倍の向上が確認できた。 CHO/NH-SDC/Hs6st3（#17）の評価 　Hs6st3発現細胞（CHO/NH-SDC/Hs6st3）のクローン#17の培養上清中に含まれるヘパリン様物質の抗FXa活性（比活性）を、市販ヘパリンに対する相対値として表した。 CHO/NH-SDC/Hs6st3（#17）の評価　Hs6st3発現細胞（CHO/NH-SDC/Hs6st3）のクローン#17の培養上清中に含まれるヘパリン様物質の抗FIIa活性（比活性）を、市販ヘパリンに対する相対値として表した。
＜ヘパリン様物質の製造方法＞
　本発明のヘパリン様物質の製造方法は、以下が導入された動物細胞を培養し、ヘパリン様物質を含む培養上清を得る工程を含むことを特徴とする：
・両機能性ヘパラン硫酸エステルN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素（NDST2）をコードするポリヌクレオチド；
・へパラン硫酸エステルグルコサミン3　硫酸転移酵素１（Hs3st1）をコードするポリヌクレオチド； 
・シンデカン（SDC）の細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド；及び
・硫酸化経路の各ステップに関与するタンパク質（輸送体、酵素等）をコードするポリヌクレオチド。 
［へパリン様物質］
　本発明に関し、ヘパリン様物質というときは、ヘパリン、へパラン硫酸、及びこれらの混合物のいずれかを指す。ヘパリンはヘパラン硫酸のなかでも高度に硫酸化されたものということができる。ヘパリン及びヘパラン硫酸は、ウロン酸（β－Ｄ－グルクロン酸及びα－Ｌ－イズロン酸とグルコサミン（Ｄ－Ｎ－アセチルグルコサミン及びＤ－Ｎ－硫酸グルコサミン）の二糖が１単位となって、それらがα又はβ－１，４結合を繰り返した直鎖状の多糖である。ウロン酸の２位がＯ－硫酸化、グルコサミンの３位と６位がＯ－硫酸化されたものと、２位のアミノ基がＮ－硫酸化されたものがある。
　ヘパリン様物質は、硫酸化グリコサミノグリカン類、sulphatedglycosaminoglycans, sGAG）として当業者には周知の方法で定量できる。またヘパリン様物質の活性は、抗凝固第Xa因子（FXa）活性として、当業者には周知の方法で測定することができる。活性は、比活性（タンパク質量あたりの活性）として表すこともできる。本発明により製造されるヘパリン様物質は、高度に硫酸化レベルが高く、そのため抗凝固活性が向上している。一般に、低分子ヘパリンや合成ヘパリンでは、抗FXa活性のみが認められ、抗凝固第IIa因子（FIIa）活性は認められない。これに対し、本発明により製造されるヘパリン様物質は、抗FXa活性及び抗FIIa活性の両方の活性を有しうる。このことは、本発明により製造されるヘパリン様物質が市販ヘパリンと同様の構造を有している可能性を示している。
［両機能性ヘパラン硫酸エステルN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素（NDST2）]
　本発明の製造方法に用いられる動物細胞には、NDST2をコードするポリヌクレオチドが導入される。NDST2は、硫酸転移酵素1タンパク質のN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素サブファミリーの一員であり、N-脱アセチル化とN-硫酸化という２つの機能を有する酵素である。
　NDST2をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A2)配列番号21又は39に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B2)配列番号21又は39に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつNDST2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C2)配列番号21又は39に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつNDST2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D2)配列番号22又は40に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E2)配列番号22又は40に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつNDST2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F2)配列番号22又は40に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつNDST2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［へパラン硫酸エステルグルコサミン3　硫酸転移酵素１（Hs3st1）］
　本発明の製造方法に用いられる動物細胞には、Hs3st1をコードするポリヌクレオチドが導入される。Hs3st1は、ヘパラン硫酸生合成酵素ファミリーの一員であり、ヘパラン硫酸グルコサミニル3-O-硫酸転移酵素活性と抗凝固性ヘパラン硫酸変換活性の両方を有し、抗凝固性ヘパラン合成の速度制限酵素である。
　Hs3st1をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A3)配列番号31、41、又は45に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B3)配列番号31、41、又は45に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつHs3st1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C3)配列番号31、41、又は45に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつHs3st1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D3)配列番号32、42、又は46に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E3)配列番号32、42、又は46に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつHs3st1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F3)配列番号32、42、又は46に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつHs3st1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［シンデカン（SDC）の細胞外ドメイン］
　本発明の製造方法に用いられる動物細胞には、シンデカンの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドが導入される。シンデカンは、保持された原形質膜ドメインと細胞質ドメインを持った細胞表面の4種のプロテオグリカンファミリーの一員である。シンデカンの構造は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインからなる。このうち、細胞外ドメインはグリコサミノグリカン結合部位を含んでいる。
　シンデカンの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A4)配列番号37に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B4)配列番号37に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン様物質生産性動物細胞に導入したときに、培養上清のヘパリン様物質の量を増加する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C4)配列番号37に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞に導入したときに、培養上清のヘパリン様物質の量を増加する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D4)配列番号38に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E4)配列番号38に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞に導入したときに、培養上清のヘパリン様物質の量を増加する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F4)配列番号38に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞に導入したときに、培養上清のヘパリン様物質の量を増加する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　シンデカンの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドに関し、培養上清のヘパリン様物質の量を増加する機能を有するとは、シンデカンの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドが導入されていないヘパリン様物質生産性動物細胞に、対象となるポリヌクレオチドを導入したときに、導入前の場合と比較して、培養上清のヘパリン様物質の量が増加することをいう。ここでいうヘパリン様物質生産性動物細胞の例は、NDST2をコードするポリヌクレオチド、及びHs3st1をコードするポリヌクレオチドが導入されたCHO細胞である。より具体的な例として、CHO-S/NH細胞（特許文献５参照）が挙げられる。
［硫酸化経路の各ステップに関与するタンパク質（輸送体、酵素等）］
　本発明の製造方法に用いられる動物細胞には、硫酸化経路の各ステップに関与するタンパク質（輸送体、酵素等）をコードするポリヌクレオチドが導入される。硫酸化経路の各ステップに関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは下記を含む。
・細胞内への硫酸イオンの輸送体（例えば、SLC26A1、SLC26A2、SLC13A1、SLC13A4）をコードする遺伝子、
・硫酸イオンからPAPSを合成する酵素（例えば、SLC26A1、SLC26A2、SLC13A1、SLC13A4）をコードする遺伝子、
・PAPSのゴルジ体への輸送体（例えば、PAPSS1、PAPSS2）をコードする遺伝子、
・糖鎖の変換酵素（例えば、Glce）をコードする遺伝子、
・脱N-アセチル化/N-硫酸化酵素（例えば、NDST1、NDST2）をコードする遺伝子、
・2-O-硫酸化酵素（例えば、Hs2st）をコードする遺伝子、
・6-O-硫酸化酵素（例えば、Hs6st1、Hs6st2、Hs6st3）をコードする遺伝子、
・3-O-硫酸化酵素（例えば、Hs3st1、Hs3st5）をコードする遺伝子
　本発明者らの検討によると、これらの硫酸化経路の各ステップに関与するタンパク質をコードする遺伝子のうち、6-O-硫酸化酵素遺伝子を導入することが好ましく、Hs6st3遺伝子を導入することがより好ましい。導入により、ヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の硫酸化レベルを高め、抗凝固第Xa因子活性を向上するからである。
　Hs6st3遺伝子、すなわちHs6st3をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A)配列番号29又は43に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B)配列番号29又は43に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C)配列番号29又は43に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D)配列番号30又は44に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E)配列番号30又は44に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F)配列番号30又は44に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　Hs6st1遺伝子、すなわちHs6st1をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A5)配列番号25に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B5)配列番号25に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C5)配列番号25に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D5)配列番号26に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E5)配列番号26に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F5)配列番号26に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　Hs6st2遺伝子、すなわちHs6st2をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A6)配列番号27に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B6)配列番号27に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C6)配列番号27に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D6)配列番号28に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E6)配列番号28に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F6)配列番号28に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチドに関し、ヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するとは、6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されていないヘパリン様物質生産性動物細胞に、対象となるポリヌクレオチドを導入したときに、導入前の場合と比較して、ヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性が向上することをいう。ここでいうヘパリン様物質生産性動物細胞の例は、NDST2をコードするポリヌクレオチド、Hs3st1をコードするポリヌクレオチド、及びSDCの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドが導入されたCHO細胞である。より具体的な例として、CHO-S/NH-SDC細胞（特許文献５参照）が挙げられる。
［高比活性抗凝固物質］
　本発明の製造方法により、1 mgあたりの抗凝固第Xa因子活性（比活性）が、8 IU/mg以上であるヘパリン様物質を得ることができる。好ましい態様により比活性は10 IU/mg以上とすることができ、12 IU/mg以上、30 IU/mg以上、60 IU/mg以上、90 IU/mg以上であり得る。なお本発明に関し、ヘパリン様物質についてIU（International Unit）というときは、特に記載した場合を除き、抗凝固第Xa因子活性のIU（IU anti-Xa activity）の意味で用いている。IUは、WHO/BS/2012.2207で推奨されている国際スタンダード（International Standard, IS）を用いて定義することができ、またISを用いて対象物質のIU値を決定できる。
　本発明に関し、抗凝固第Xa因子活性（比活性）を数値で示すときは、特に記載した場合を除き、下記の測定原理による方法でヘパリン濃度として測定した値を、下記の測定原理によりグルコサミノグリカン総量の濃度として測定した値で除して算出した値である。
　ヘパリン濃度測定原理：
　サンプルにアンチトロンビンIIIを加え、ヘパリン・アンチトロンビンIII複合体とし、これに一定過剰量の抗凝固第Ｘa因子を加えて反応させると、ヘパリン・アンチトロンビンIII複合体は、その量に応じて抗凝固第Ｘa因子と結合し、活性のないヘパリン・アンチトロンビンIII・抗凝固第Ｘa因子複合体を形成する。これに基質（N－ベンゾイル－L－イソロイシル－L－グルタミル（γ－OR）－グリシル－L－アルギニル－p－ニトロアニリド・塩酸塩）を加えると、残存抗凝固第Ｘa因子活性に相当するp－ニトロアニリンが遊離する。この抗凝固第Ｘa因子の残存活性は、サンプル中のヘパリン濃度を反映するので、この遊離したp－ニトロアニリンを405nmで比色定量することによりサンプルのヘパリン濃度を求めることができる。
　この原理による測定は、市販のヘパリン測定キット、例えばテストチーム　ヘパリンＳ#30564000（積水メディカル）を用いて行うことができる。この場合、スタンダードとして試薬として販売されているもの、例えばヘパリンナトリウム（製品コード081-00131,085-00134,081-00136,087-00133、富士フィルム和光純薬）を用いることができる。
　グルコサミノグリカン測定原理：
　サンプルに、硫酸化糖鎖に特異的に結合するBlyscan Dye(1,9-dimethyl-methylene blue)を加え、サンプル中の可溶性硫酸化プロテオグリカン及び硫酸化グリコサミノグリカンをペレットとする。ペレットから試薬で色素を溶出し、656 nmで比色定量することによりサンプルのグルコサミノグリカン総量の濃度を求めることができる。
　この原理による測定は、市販のグリコサミノグリカン測定キット、例えばBlyscan Glycosaminoglycan Assay Kit（商品コードB1000,Biocolor）を用いて測定することができる。
　後述するように、本発明に基づいて得られた組換えCHO細胞群の中から選抜することにより、市販ヘパリン（比活性248 IU/mg）と同じ、又はそれ以上、例えば250 IU/mg、300 IU/mg、400 IU/mgの比活性を有する抗凝固物質を生産することができる。このような高い比活性を有する組換えヘパリン様物質は、新規なものである。したがって、本発明は、比活性が、200 IU/mg以上、好ましくは230～270 IU/mg、より好ましくは240～260 IU/mgである、組換えヘパリン様物質を提供するものでもある。   
［ヘパリン様物質生産性動物細胞］
　本発明に関し、ヘパリン様物質生産性動物細胞というときは、特に記載した場合を除き、ヘパリン生合成に必要なタンパク質を有しており、ヘパリン様物質を生産することができる動物細胞をいう。
　ヘパリン様物質生産性動物細胞は、動物細胞にヘパリン生合成に必要となるポリヌクレオチドを導入することにより得られる。例えば、動物細胞がCHO細胞である場合、ヘパリン生合成に必要であり、CHO細胞では発現がみられない、NDST2をコードするポリヌクレオチド、及びHs3st1をコードするポリヌクレオチドの少なくとも一方、好ましくは双方を導入することにより、ヘパリン様物質を産生するCHO細胞を得ることができる（Bail JY et al., Metab Eng14:81-90, 2012）。
　本発明に用いる動物細胞としては、例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞CHO細胞［Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 , 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900)］、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したCHO細胞（CHO／DG44細胞）［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)］、CHO-K1（ATCC　CCL-61）、DUkXB11（ATCC　CCL-9096）、Pro-5（ATCC　CCL-1781）、CHO-S（Life　Technologies、Cat＃11619）、Pro-3、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト臍帯動脈内皮細胞（HUAEC）、ヒト肺微小血管内皮細胞（HLMVEC）、ヒト大動脈内皮細胞（HAoEC）、ヒト冠状動脈内皮細胞（HCAEC）、ヒト肺動脈内皮細胞（HPAEC）、ヒト胎児腎臓（HEK）、ラットミエローマ細胞YB2／3HL．P2．G11．16Ag．20（又はYB2／0ともいう）、サル細胞COS細胞、マウスミエローマ細胞NSO、マウスミエローマ細胞SP2／0-Ag14、シリアンハムスター細胞BHK又はHBT5637（日本国特開昭63-000299号公報）などが挙げられる。生産効率の点から、これらの中でも、CHO細胞、CHO／DG44細胞又はCHO-K1（ATCC　CCL-61）は好ましく、CHO細胞がより好ましい。
［ポリヌクレオチド、タンパク質］
　本発明に関し、ポリヌクレオチド、又はタンパク質というときは、特に記載した場合を除き、ヒト由来であってもよく、ヒト以外の哺乳類動物由来のものであってもよい。ヒト以外の哺乳類動物には、ブタ、マウス、ラット、ハムスターが含まれる。
　本発明に関し、ポリヌクレオチドについてストリンジェントな条件下でハイブリダイズするというときは、特に記載した場合を除き、いずれのポリヌクレオチドにおいても、ハイブリダイゼーションの条件は、Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 4th ed. (Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press)及びHybridization of Nucleic Acid Immobilization on Solid Supports(ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138,267-284(1984))の記載に従い、取得しようとするポリヌクレオチドに合わせて適宜選定することができる。例えば50%以上の同一性を有するDNAを取得する場合、6倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150 mM塩化ナトリウム、15 mMクエン酸ナトリウムよりなる)及び5%ホルムアミドの存在下、40℃でハイブリダイゼーションを行った後、4倍濃度のSSC溶液を用い、49℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。また85%以上の同一性を有するDNAを取得する場合、2倍濃度のSSC溶液及び50%ホルムアミドの存在下、40℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1倍濃度のSSC溶液を用い、57℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。また90%以上の同一性を有するDNAを取得する場合、2倍濃度のSSC溶液及び50%ホルムアミドの存在下、45℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1倍濃度のSSC溶液を用い、62℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。
　また、本発明に関し、タンパク質又はアミノ酸配列について1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのタンパク質においても、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、1-250個、1-200個、1-150個、1-100個、1-50個、1-40個、1-30個、1-20個、1-15個、1-9個又は1-4個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチド又はタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。
　本発明に関し、ヌクレオチド配列（塩基配列ということもある。）又はアミノ酸配列に関し、同一性というときは、特に記載した場合を除き、2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で共有する一致したヌクレオチド又はアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝(一致した位置の数/位置の全数)×100で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(1990)403-410に記載されるNBLAST及びXBLASTプログラム中に組込まれている。より詳細には、配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム(例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW)により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。同一性の計算には遺伝子情報処理ソフトウェア　GENETIX(登録商標)(株式会社ゼネティックス)を用いてもよい。なお、同一性%を求める対象配列が、末端にタグ配列等の、比較する配列には存在しない付加配列を有する場合には、その付加配列部分は同一性%の計算には含めない。
　本発明に関し、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列について、同一性というときは、特に記載した場合を除き、いずれの場合も、少なくとも50%、例えば60%以上、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは97.5%以上、さらに好ましくは99%以上の配列の同一性を指す。
　本発明で用いるポリヌクレオチド又は遺伝子、及びタンパク質又は酵素は、当業者であれば、従来技術を利用して調製することができる。
　デフォルトのパラメータとしては、G（Cost to open gap）が塩基配列の場合は5、アミノ酸配列の場合は11、-E(Cost to extend gap）が塩基配列の場合は2、アミノ酸配列の場合は1、-q（Penalty for nucleotide mismatch）が-3、-r（reward for nucleotide match）が1、-e（expect value）が10、-W（wordsize）が塩基配列の場合は11残基、アミノ酸配列の場合は3残基、-y［Dropoff（X）for blast extensions in bits］がblastnの場合は20、blastn以外のプログラムでは7、-X（X dropoff value for gapped alignment in bits）が15及び-Z（final X dropoff value for gapped alignment in bits）がblastnの場合は50、blastn以外のプログラムでは25である（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch）。
　目的とするアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)］などを用いて、例えば配列番号1～3のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
＜組換え細胞＞
　本発明は、少なくとも以下が導入された組換えＣＨＯ細胞を提供する：
・NDST2をコードするポリヌクレオチド；
・Hs3st1をコードするポリヌクレオチド； 
・SDCの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド；及び
・6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチド。
　このような動物細胞は、所定のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、宿主細胞となる動物細胞に導入することにより、得ることができる。各々のポリヌクレオチドについては上述した説明がそのまま当てはまる。
　組換えベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするDNAを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
　組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるコザック配列を開始コドン周辺に適当に配置したプラスミドを用いることが好ましい。
　DNAの塩基配列において、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするNDST2及びHs3st1の生産率を向上させることができる。
　組換えベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、pcDNA I、pcDM8（フナコシ社）、pAGE107［日本国特開平03-22979号公報； Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、pAS3-3（日本国特開平02-227075号公報）、pcDM8［Nature, 329, 840 (1987)］、pcDNA I／Amp（インビトロジェン社）、pcDNA3．1（インビトロジェン社）、pREP4（インビトロジェン社）、pAGE103［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93（国際公開第97／10354号）、N5KG1val（米国特許第6001358号明細書）、INPEP4（Biogen-IDEC社）及びトランスポゾンベクター（国際公開第2010／143698号）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のimmediate early（IE）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　組換えベクターは選択マーカーを含む場合がある。選択マーカーは、遺伝子を含有する細胞の選択を可能にする遺伝子である。選択には正の選択と負の選択がある。正の選択とは、正の選択が起こって、選択マーカーを含有する細胞を選択するプロセスを指す。薬剤耐性が正の選択マーカーの一例であり、マーカーを含有する細胞は薬剤含有培養培地中で生存し、マーカーのない細胞は死滅する。選択マーカーとしては、G418耐性を与えるneo；ハイグロマイシン耐性を与えるhygr；及びピューロマイシン耐性を与えるpuroなどの薬剤耐性遺伝子が挙げられる。他の正の選択マーカー遺伝子には、マーカーを含有する細胞の同定又はスクリーニングを可能にする遺伝子が含まれる。これらの遺伝子としては、とりわけ、蛍光タンパク質（GFP及びGFP様発色団、ルシフェラーゼ）遺伝子、lacZ遺伝子、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子、及びCD8などの表面マーカーが挙げられる。負の選択とは、適切な負の選択薬剤に曝露して、負の選択マーカーを含有する細胞を死滅させるプロセスを指す。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子を含有する細胞［Wigler et al, Cell 11:223 (1977)］は薬剤ガンシクロビル（GANC）に対して感受性である。同様に、gpt遺伝子は細胞を6-チオキサンチン感受性にする。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology、3、133(1990)］、リン酸カルシウム法（日本国特開平02-227075号公報）、又はリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などが挙げられる。
　組換え細胞は、ヘパリン様物質の産生を促進する条件下で培養することが好ましい。具体的には例えば、組換え細胞のへパリン様物質の産生を可能にし、かつ組換え細胞から培養上清へのヘパリン様物質の分泌を促進する培地中で組換え細胞を培養することが好ましい。
　組み換え細胞を培養する培地は、少なくとも細胞の生存率を維持し、ヘパリン様物質の発現を可能にするために十分な炭素、窒素、酸素及び他の栄養素、成長因子、緩衝剤、補因子及び他の任意の物質を含有することが好ましい。ヘパリン様物質をコードする遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にあるか、又は誘導性プロモーターを含む実施形態では、培地はさらにインデューサーを含んでもよい。
　培地としては、例えば、10％ウシ胎児血清（FCS）を添加したRPMI又はDMEM、並びに抗菌剤、増殖因子、他のサイトカインなどの因子を添加した組織培養培地が挙げられる（例えば、Cell Biology (Third Edition) A Laboratory Handbook, vol. 1, 2006, Elsevier Inc.）。具体的には例えば、当業者に公知の培地製剤、例えば、RPMI、IMDM、DMEM、DMEM／F12、無血清又は低血清のEMEMが挙げられる。これらの培地は、抗生物質、脂質、トランスフェリン、インスリン、アミノ酸などの追加の栄養補助食品、及び必要に応じて補因子を含んでもよい。
　ヘパリン様物質の産生を促進する観点から、培地は、グルコース、硫酸塩及びリン酸から選ばれる少なくとも1を含有することが好ましい。培地におけるグルコースの濃度は、通常5～75mMであることが好ましく、より好ましくは10～60mM、さらに好ましくは15～35mMである。培地における硫酸塩の濃度は、通常0．5～50mMであることが好ましく、より好ましくは10～50mM、さらに好ましくは30～50mMである。培地におけるリン酸塩の濃度は、通常0．5～50mMであることが好ましく、より好ましくは1～50mM、さらに好ましくは10～50mMである。
　培養上清中にヘパリン様物質を生成蓄積させ、培養上清から採取することにより、ヘパリン様物質を製造することができる。組換え細胞を培地中で培養する方法は、通常の方法に従って行うことができる。培養は、通常pH6～8、30～40℃、5％CO2存在下などの条件下で1～7日間行う。
　組換え細胞からのヘパリン様物質の分泌生産は、培養上清にヘパリンリアーゼI、II、IIIを含む酵素溶液を添加して酵素処理後、不飽和二糖分析用HPLCで定量することにより確認できる。組換え細胞からのヘパリン様物質の分泌生産は、培養上清中におけるsGAG量を測定することによっても確認できる。
　本発明の組換え細胞からは、培養上清中にGAGであるヘパリン様物質に結合したコアタンパク質を含む糖タンパク質であるプロテオグリカンが分泌される。培養上清からのタンパク質の単離は、当該分野で従来公知の方法により行う。例えば、アフィニティータグのようなヘパリン様物質の単離を容易にするタグを用いてもよい。タグとしては、例えば、ポリヒスチジン（His6タグ）、ニッケルマトリックス、キチン結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質（MBP）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、FLAGタグ又はエピトープタグが挙げられる。
　コアタンパク質からのヘパリン様物質の単離は、当該技術分野において従来公知の方法により行う。例えば、ヘパリナーゼを用いた酵素消化法、水酸化ナトリウム又はアルカリ水素化ホウ素による処理が挙げられる。
　得られるヘパリン様物質は、様々な長さの二糖単位の繰り返し構造を含み得る。ヘパリン様物質は、UA-GlcNAc（6S）、UA（2S）-GlcNAc、UA-（2S）-GlcNAc（6S）、UA-GlcNS、UA-GlcNS（6S）、UA（2S）-GlcNS、UA（2S）-GlcNS（6S）のいずれかを含むことが好ましく、これらはヘパリン様物質中に任意の順序で存在してもよい。
　上記において、UAはウロン酸残基（すなわち、グルクロン酸又はイズロン酸）、Acはアセチル、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン、GlcNSはグルコサミン-N-硫酸、2Sは2-O-硫酸塩、6Sは6-O-硫酸塩である。
＜医薬組成物＞
　本発明は、本明細書に記載の方法により製造されたヘパリン様物質又はその断片を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物に含まれるヘパリン様物質又はその断片は、コアタンパク質に結合していてもよい。医薬組成物は他の治療薬を含有してもよい。また、医薬組成物は、例えば、慣用のビヒクル又は希釈剤、ならびに所望の投与方法に適したタイプの医薬添加剤（例えば賦形剤、結合剤、保存剤）を使用することにより処方され得る。
　医薬組成物の形態としては、例えば、滅菌注射用水性剤が挙げられる。滅菌注射用水性剤は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、既知の技術に従って処方することができる。滅菌注射用水性剤は、例えば1，3-ブタンジオール中の溶液のような、無毒の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液及び等張食塩水である。
　医薬組成物の剤型は特に限定されず、多種多様な剤型とすることができる。医薬組成物を投与するための剤型としては、例えば、組成物は、錠剤、カプセル剤、サシェ剤、トローチ剤、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、シロップ剤、軟膏剤、クリーム剤などの形態での投与、静脈内投与若しくは注射、ペースト、エマルジョン又は溶液が挙げられる。また、例えば、パッチメカニズム又は軟膏による経皮投与が挙げられる。これらのいずれも、徐放及び／又は持続放出製剤に改変してもよい。
　薬学的に許容される担体には、ビヒクル、アジュバント、界面活性剤、懸濁剤、乳化剤、不活性充填剤、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、結合剤、滑沢剤、緩衝剤、崩壊剤及び担体が含まれるがこれらに限定されない。典型的には、薬学的に許容される担体は活性化合物に対して化学的に不活性であり、そして使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さない。薬学的に許容される担体の性質は、使用される特定の剤型及び組成物の他の特徴に応じて異なり得る。
＜治療方法及び予防方法＞
　本発明は、本発明の方法により製造されたヘパリン様物質又はその断片を投与することを含む、それを必要とする被験体における血液凝固又は血液凝固に関連する又はそれによって引き起こされる状態を治療又は予防する方法を提供する。本態様において、ヘパリン様物質又はその断片は、コアタンパク質に結合していてもよい。血液凝固又は血液凝固に関連する又はそれによって引き起こされる状態としては、例えば、急性冠症候群、心房細動、深部静脈血栓症又は肺塞栓症が挙げられる。
　前記被験体は哺乳動物をいう。哺乳動物としては、例えば、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）が挙げられる。哺乳動物は、典型的にはヒト又は霊長類であり、より典型的にはヒトである。
　投与量及び投与時期は、血液凝固又は血液凝固に関連する状態の治療、予防又は管理において治療上の利益を提供する投与量及び時期であることが好ましい。有効である具体的な投与量及び投与時期は、被験体の状態、病歴、体格、体重、年齢などの要因に応じて変動し得る。
　以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実験材料及び実験方法］
１．CHO細胞培養
(1)　培地の組成
　CHO-S細胞（Cat. No. R80007, Invitrogen）及びCHO/NH-SDCを培養するための培地として、FreeStyle CHO Expression Medium（Cat. No. 12651014, Invitrogen）を用いた。抗生物質としてペニシリン（Cat. No. 021-07732, Wako）及びストレプトマイシン（Cat. No. 194-08512, Wako）を添加した。また、培地中に最終濃度8 mMとなるようにL-グルタミン（Cat. No. 074-00522, Wako）を添加した。細胞の培養は、浮遊細胞用T-25フラスコ（Cat. No. 690195, Griener）に5 mLの培地にて細胞を播種し、湿潤に保った37℃、5% CO2インキュベーター内で行った。経験上、野生型CHO-S細胞はおよそ1.5 × 107 cells/flaskで100%コンフルエント相当になり、継代時は、フラスコあたり0.3 × 107 cells（1/5ほど）で継代すると、2日後にはコンフルエントに達した。また、CHO/NH-SDCは、およそ1.2 × 107 cells/flaskで100%コンフルエント相当になり、継代時は、フラスコあたり0.3 × 107 cells（1/4ほど）で継代すると、3日後にはコンフルエントに達した。後述するように無血清馴化等の実験では、まき込み濃度を上げることで増殖状態を維持させた。
　なお、抗生物質及びグルタミンは、以下の手順で濃縮液を作製し、添加した。抗生物質については、69.9 mgのペニシリン及び100 mgのストレプトマイシンを0.85% NaCl水10 mLで溶解し、クリーンベンチ内で0.45 μmシリンジフィルターにてろ過滅菌し100×ストック溶液とした。グルタミンについては、1.169 gのL-グルタミンを0.85% NaCl水10 mLで溶解し、クリーンベンチ内で0.45 μmシリンジフィルターにてろ過滅菌し200 mMストック溶液とした。
　細胞を接着状態で培養させる際は、次の手順で培地を作製した。10%（v/v）ウシ胎児血清（FBS）（Cat. No.FB-1280/500、Lot. No.015BS281, Biosera）を含む基本培地F12（10.6 g/L, Cat. No. N6760, Sigma）を用いた。抗生物質として、70 mg/Lペニシリン及び100 mg/Lストレプトマイシンを、また炭酸水素ナトリウム（Cat. No. 191-01305, Wako）を1.176 g/Lで用いた。ノーマルディッシュ（Cat. No. 130182, Thermo）上で、37℃、5% CO2インキュベーター内で培養した。
(2)　細胞接着化及び無血清順化
　CHO-S細胞及び本発明者らの研究室で樹立されたCHO-S/NH-SDC（特許文献５参照）はもともと無血清培地であるFreeStyle CHO Expression Mediumで浮遊培養されていた。しかし、リポフェクションによる遺伝子導入や限界希釈法によるクローニングの際は接着培養する必要があった。そこで、接着させる際はF12＋10% FBS培地を用いた。また、接着培養の必要がなくなった際は無血清馴化を行った。無血清馴化においては、F12＋10% FBSとFreeStyleCHO-S Expression Mediumを任意の割合で調製することで5%、1%、0.5%及び0.1%血清入り培地を作製し、使用した。まずF12＋10% FBS培地による培養下の細胞を5%血清入り培地で、2、3回継代した。その後、順に同じ工程を繰り返して血清濃度を下げていき、無血清馴化を完了した。無血清馴化を行う際には、通常の培養時よりも高い細胞密度（0.5 × 106 cells/flask）を維持しながら、継代培養するよう努めた。
２．細胞産生物の評価方法
(1)　培養上清の抗凝固第Xa因子活性の測定
　細胞の培養上清中に含まれるヘパリン様物質について、抗凝固第Xa因子活性（抗FXa活性）を測定することで抗凝固活性を評価した。樹立した細胞クローン又は各細胞株を0.6 × 106 cells/wellの細胞密度で2 mL/wellとなるように6 wellプレート（Cat. No. 130184, Thermo）にFreeStyleCHO-S Expression Mediumを用いて播種し、day 0とした。培地交換や継代を行わず培養し、day 3に培養上清を回収した。培養上清の原液をサンプルとして用いた。
　サンプルの活性が低い場合はBIOPHEN HEPARIN ANTI-Xa 2 stage（Cat.No. 221005, HBM）を、高活性が見込まれる場合はテストチームヘパリンS 測定キット（Cat. No. 30564000, 積水メディカル株式会社）を用いて測定した。操作はキットのマニュアルに従った。
　各キットにおける測定原理は同一である。ヘパリンを含むサンプルにアンチトロンビンIIIを加え、ヘパリン・アンチトロンビンIII複合体とし、これに一定過剰量のファクターXa（FXa）を加えて反応させると、ヘパリン・アンチトロンビンIII複合体は、その量に応じてFXaと結合し、活性のないヘパリン・アンチトロンビンIII-FXa複合体を形成する。これにFXa特異的発色気質を加え、残存FXa活性に相当する発色基質を遊離した。FXaの残存活性は、サンプル中ヘパリンの抗凝固活性を反映するため、この遊離した発色基質を405 nmにて比色定量した。次に、各キットの簡単な操作方法を示す。
　(a) BIOPHEN HEPARIN ANTI-Xa 2 stage
　BIOPHEN HEPARIN ANTI-Xa 2 stageを利用する際の検量線には、活性値が既知であるBIOPHEN UFC Calibrator（Cat. No. 222301-RUO, HBM）を使用した。BIOPHEN UFC Calibratorキット内の5種類の各粉末資料に滅菌水1 mLを加えて溶解させた。これにTris NaCl EDTA PEG buffer-pH8.40（Cat. No.AR030, HBM）を加えて15倍希釈して5種類のスタンダード溶液を調製した。キット内のアンチトロンビンIII粉末（R1）とFXa粉末（R2）、FXa特異的発色基質粉末（R3）に滅菌水1 mLを加えて完全に溶解させた。これらの試薬は通常は冷蔵保存しており、アッセイ前に恒温振とう培養機（Model. No. M・RB-022UP, Taitec）で100 rpm、25℃で、30分間振盪させた。必要量だけ分注して、R1溶液及びR2溶液はTris NaCl EDTA PEG buffer-pH8.40で、R3溶液は滅菌水でそれぞれ5倍希釈した。アッセイに使用する直前に、37℃で保温した。
　培養上清はアッセイ前に13,200gで5分間遠心して、上清10μLをサンプルとして利用した。スタンダード10μL及びサンプル10μLを384 well ELISAプレート（Cat. No. 3711-384, Iwaki）に移し、37℃で5分間保温した。なお、ここで384 well ELISAプレートを使用しているのは、これより大きな容器よりも、各試薬を添加した際に混和しやすいからである。ここにR1溶液10μLを加えて37℃で2分間保温した。反応後、R2溶液10μLを加えて37℃で正確に2分間保温した。反応後、R3溶液10μLを加えて37℃で正確に2分間保温させて、発色反応を起こした。反応後、20%酢酸（Cat. No.017-00256, Wako）水溶液20μLを加えて反応を停止し、吸光度（405 nm）をプレートリーダー（Model. No, Enspire, PerkinElmer）で測定した。
　(b) テストチームヘパリンS測定キット
　テストチームヘパリンS 測定キット標準品ヘパリンではヘパリンナトリウム（Cat. No. 081-00136, Wako, Lot：WDR1808）を用いて調製した。キット内のアンチトロンビンIII粉末とFXa粉末、FXa特異的発色気質粉末に滅菌水をキット規定量だけ加えて完全に溶解させた。必要量のみを分注して、アッセイに使用する直前に37℃で保温した。スタンダードについては、まず始めに、1000 IU/mLとなるように0.85% NaCl水溶液で調製後、10倍希釈を2段階行って10 IU/mlを調整した。さらに、キット同包の緩衝液で50倍希釈して0.2 IU/mlとした。これを、キットに同包されている緩衝液及びヒト血漿と、96 well ELISAプレート（Cat.No.3801-096, Iwaki）上で混和し、スタンダードとした。
　培養上清はアッセイ前に13,200 gで5分間遠心して、上清5μLをサンプルとして利用した。サンプル5μlを96 well ELISAプレートに移して、キット同包の緩衝液40μLを添加して合計45μlとした。その後、スタンダードとサンプルを37℃で5分間保温した。ここにアンチトロンビンIII溶液5μLを加えて37℃で6分間保温した。反応後、FXa溶液25μLを加えて37℃で正確に30秒間保温した。反応後、FXa特異的発色気質溶液50μLを加えて37℃で正確に3分間保温させて、発色反応を起こした。反応後、20%酢酸水溶液75μLを加えて反応を停止した。その後、384 well ELISAプレートに各試料を100μl移して、吸光度（405 nm）をプレートリーダー（Model. No, Enspire, PerkinElmer）で測定した。
(2) sGAG Assay Kit による培養上清におけるsGAG量の測定方法
　使用する培養上清のサンプルについて、播種及び回収方法は抗FXa活性測定と同一である。樹立した細胞クローン又は各細胞株を0.6 × 106cells/wellの細胞密度で2 mL/well となるように6 wellプレートにFreeStyleCHO-S Expression Mediumを用いて播種し、day 0とした。培地交換や継代を行わず培養し、day 3に培養上清を回収した。培養上清の原液をサンプルとして用いた。得られたサンプルにおいて、Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit（Cat. No. B1000, QBS）によるサンプル中のsGAG（硫酸化グリコサミノグリカン類、sulphatedglycosaminoglycans）濃度の測定を行った。なお、アッセイはキットのマニュアルに従って行った。手順を以下に示す。
　培養上清はアッセイ前に13,200gで5分間遠心して、100μlをサンプルとして使用した。サンプル又はスタンダード100μLを1.5 mLマイクロチューブに入れ、Blyscan Dye (1,9-dimethyl-methylene blue) Reagent  1,000μLを加えた後、30分間、100 rpm、室温で混合した（Model. No. M・BR-022UP, マキシマイザー, Taitec）。遠心分離（20,000×g、10分間、4℃）を行い、sGAGとBlyscan Dye Reagentの反応物質をペレットとして得た後に上清を除去し、Dye Dissociation Reagent 500μLを用いてペレットを溶解した。上清を除去する際、ペレットはマイクロチューブの壁面からはがれやすいため、デカントである程度の上清を取り除いた後、マイクロピペットでなるべく上清が余らないように慎重に除去した。最後に遠心分離（20,000×g、10分間、4℃）を行った上で200μLを6 well ELISAプレート（Cat.No.3801-096, Iwaki）に移して、吸光度（656 nm）をプレートリーダー（Model. No, Enspire, PerkinElmer）で測定した。
(3) 各種アッセイ結果における有意差の検定
　各種アッセイで得られた結果について、n=3以上で実験したものについては、対照実験におけるコントロール（非操作条件など）との有意差を適宜導出した。まず始めに、コントロール及び取得結果の2つのデータ群に対してF検定を行った。有意水準を0.1として、導出された両側確率が0.1より大きい場合は等分散、0.1以下の場合は非等分散であると判断した。次に、コントロール及び取得結果の2つのデータ群に対してStudent's t検定（t検定）を行った。等分散/非等分散の判断を踏まえて両側検定を行い、有意水準0.05より大きい場合を有意差なし、0.05以下の場合を有意差ありと判断した。
３．一過性遺伝子発現用の動物細胞発現ベクターの取得
　一過性発現の実験に利用した動物細胞発現ベクターはORIGEN社及びHorizon Discovery社から購入した。大腸菌の凍結ストックとして取得したベクターは、後述する手順にしたがって培養して、プラスミドDNAを抽出した。プラスミドDNAとして取得したものはコンピテントセルへの形質転換をしたのちに、同じく培養してプラスミドDNAを抽出した。実験に使用する前に、シークエンス解析（Prism 3130 Genetic Analyzer、Applied Biosystems）により目的遺伝子配列を確認した。
４．ベクターの作製方法
(1) 形質転換用大腸菌コンピテントセルの作製
　LB寒天培地（1%ポリペプトン、1% NaCl、0.5%酵母エキス、2%アガー）に大腸菌株（DH5α（Takara））を播種し、37℃で一晩培養した。その後、寒天培地からシングルコロニーを単離して、30 mLのコンピテントセル作製用LB培地（1%ポリペプトン、1% NaCl、0.5%酵母エキス、0.02M MgSO4・7H2O、0.02M MgCl2・6H2O（pH 7.2～7.3））に移植して振とう培養に移した。培養液の濁度がOD600=0.45に達した約3時間後に培養を終了した。次いで、菌体を遠心分離（3,000×g、10分間、4℃）して回収し、上清を捨てた。得られた菌体にトランスフォーメーションバッファー（10 mM PIPES、15 mM CaCl2・2H2O、250 mM KCl、55 mM MnCl2・4H2O（pH6.7～6.8））を10 mL加えて、菌体を穏やかに懸濁し、氷上で10分間静置した。さらに、4℃で3,000×g、10分間遠心分離して菌体を集め、上清を捨てて得られたペレットに、トランスフォーメーションバッファー2.4 mLとDMSO 100μLを加えて懸濁し、微量遠心チューブに100μLずつ分注して、液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。
(2) コンピテントセルを用いた形質転換
　プラスミドDNA（数ng）を含む試料溶液10μLと、大腸菌コンピテントセル100μLを微量遠心チューブに加えて、穏やかにピペットで撹拌した後、氷上で30分間静置した。42℃の恒温槽で45秒ヒートショックを与えた後、氷上に5分間放置した。次いで、プラスミドとコンピテントセルの混合液に、LB培地 0.4 mL を加えて全量を0.5 mL とし、37℃で1時間培養した。そして、培養液全量を抗生物質入りのLB寒天培地に、コンラージ棒を使って均等に塗り広げて播種した。この菌体を37℃で一晩培養し、目的のプラスミドをもつコロニーを取得した。なお、青白選択が可能なプラスミドを用いた場合には、X-gal（20μg/mL : 50μL）及びIPTG（100 mM: 25μL）を塗布した後に、大腸菌を播種し、目的のプラスミドをもつと考えられる白色のコロニーを得た。
(3) 大腸菌のグリセロールストック作製
　形質転換した目的のDNAを持つ大腸菌（遺伝子組換え大腸菌）は、50%グリセロール溶液800μLと菌体を200μLを懸濁し、-80℃で保存した。50%グリセロール溶液は、グリセリン（Cat. No. 075-00616, Wako）と滅菌水を体積比で1対1となるように作製した。
(4) 小スケールプラスミドDNA調製（アルカリ法）
　形質転換した大腸菌コロニーを単離し、LB液体培地2 mLに加えて37℃で一晩振とう培養して、十分に増殖させた。翌日、微量遠心チューブに大腸菌の培養液1 mLをとり、菌体を遠心分離（6,000×g、1分間、室温）して、上清を除いて菌体を回収した。この菌体にグルコース溶液（50 mMグルコース、25 mM Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM EDTA）100μLを加えて、ボルテックスにより懸濁した。次いで、アルカリ-SDS溶液（0.2N NaOH、1%（w/v）SDS）を加え、微量遠心チューブをおだやかに数回反転し、菌体を溶解させた。さらに、3 M 酢酸カリウム（pH 4.5）150μLを加えて、微量遠心チューブをおだやかに数回反転して中和した。その後、フェノール-クロロホルム混液450μLを加え、よく混和して乳濁化させた後、遠心分離（12,000×g、5分間、室温）することで有機層とDNAを含む水層に分離させた。この水層の4分の3程度を、別の微量遠心チューブに移し、イソプロパノール300μLを加え、ボルテックスした後、遠心分離（20,000×g、10分間、4℃）し、DNAを沈殿させた。その後、上清を除き、70%（v/v）エタノール 200μLを加えて、遠心分離（20,000×g、5分間、4℃）することによりDNAペレットを洗浄した。上清を捨て、ヒートブロックを用いて乾燥（5分間、55℃）した。最後に1%（v/v）RNaseを含んだ超純水30μLにピペッティング等でよく懸濁し溶出させた。
(5) 制限酵素によるDNAの切断
　プラスミド溶液、制限酵素及び制限酵素に対応するバッファーを微量遠心チューブに必要量とって混和し、37℃で2時間反応させてDNAを切断した。この際、DNA断片を精製する場合にはプラスミド5μgを含んだプラスミド溶液と制限酵素及びバッファーを用いて、反応溶液の全量を40μLとした。また、制限酵素解析を行う場合はプラスミド300 ngを含んだプラスミド溶液を同様に用いて反応溶液の全量を10μLとした。
(6) アガロースゲル電気泳動による制限酵素断片の確認
　DNA溶液試料にローディングバッファーを添加し、DNA断片の分子量に適した濃度のアガロースゲルを用いて試料を泳動した。すでに泳動模式図がわかっているマーカー（Lamda-HindIII-digested又はphiX174-HincII-digested marker）を同時に泳動し、試料のバンドの位置を確認した。
(7) アガロースゲルからのDNA断片の精製
　アガロース電気泳動後、エチジウムブロマイドでDNA断片を染色し、UV照射下でDNA断片を確認しながら、目的のバンドの部分をカッターで切り出した。そして、切り出したアガロースゲルを小さく断片化し、微量遠心チューブに移した。その後、DNA Fragment Purification Kit（Cat. No. NPK-601, MagExtractor-PCR & Gel Clean Up-、Toyobo）を用いて、DNA断片を精製した。なお、操作はキットに付随するプロトコールに従った。
(8) DNAリガーゼによるDNAの連結（ライゲーション）
　プラスミドベクター及びインサートDNAを含むDNA溶液5μLを調製し、LigaFastTM Rapid DNA Ligation System（Cat. No. M8221, Promega）を用いて、16℃で12時間もしくは、室温で2時間反応させることでDNAの連結を行った。なお、操作はキットに付随するプロトコールに従った。
(9) プラスミドDNAの大量抽出
　形質転換した、目的のDNAを持つ大腸菌をLB液体培地2 mLに加えて37℃で8時間振とう培養した。その後、LB液体培地40 mLにこの培養液100μLを加えて、さらに1～16時間振とう培養を行った。次いで、培養液を遠心分離（6,000 × g、15分間、4℃）し、上清を除去して菌体のペレットを回収した。そして、プラスミド抽出キット（QIAfilter Plasmid Midi Kits（Cat. No. 12445, Qiagen））によりプラスミドの大量抽出を行った。なお、操作はキットに付随するプロトコールに従った。以下に簡単に説明する。
　菌体のペレットを4 mLのBuffer P1で再懸濁した。次に4 mLのBuffer P2を添加後4～6回激しく転倒させ十分に混和し、5分間室温に放置した。QIAfilter Cartridge の中にライセートを注いで、室温で10分間インキュベートした。QIAGEN-tip 100に4 mLのBuffer QBTを加え、カラムが空になるまで静置流出して平衡化した。プランジャーをQIAfilter Midi Cartridgeに入れ、細胞ライセートをあらかじめ平衡化したQIAGEN-tip 100に注ぎ込んでろ過した。ライセートを自然落下により樹脂に浸透させた。QIAGEN-tipを10 mLのBuffer QCで2回洗浄した。5 mLのBuffer QFでDNAを溶出し、そこへ3.5 mLのイソプロパノール（室温）を添加してDNAを沈殿させた。混和後、直ちに4℃、15,000×gで30分間遠心分離した。上清を注意深くデカントし、室温で5分間インキュベートした。DNAペレットを2 mLの70%エタノールで洗浄し、4℃、15,000×gで10分間遠心分離した。上清を同様に注意深くデカントして、ペレットを5～10分間乾燥させた後、概ね50μLのTEバッファーで再溶解し、プラスミド溶液とした。
５．Hs6st3遺伝子発現ベクターの作製
(1) 目的遺伝子の決定
　一過性発現下において、ヘパリン様物質産生細胞培養上清の抗FXa活性を最も向上させたマウス由来のヘパラン硫酸グルコサミン6硫酸転移酵素3（Hs6st3：Accesion No. NM_015820）に着目し、ターゲット遺伝子とした。
(2) Hs6st3遺伝子発現ベクターの作製方法
　Hs6st3発現トランスポゾンベクターの作製手順を図１に示す。以下、ベクターの作製手順を簡単に説明する。一過性発現下での実験で使用したHs6st3発現プラスミドベクター（ORIGEN, Catalog ID：MR217272）を鋳型として、PCR法でHs6st3遺伝子を増幅した。PCRの操作ではKOD-Plus-Neo（Cat. No. KOD-401, Toyobo）を利用し、キットのマニュアルに従って行った。使用したプライマー、PCR条件を下表に示す。PCR産物はアガロースゲルで電気泳動し、バンドの増幅を確認した後、DNA精製キット（Mag Extractor-PCR & Gel clean up-）により回収した。PCR産物とEcoRVで処理したpBluescript II KS (-)とライゲーションをしてコンピテントセルへ形質転換し、目的遺伝子配列を有する大腸菌をクローニングした。プラスミドDNAの大量抽出の後、XbaI及びNruIで目的遺伝子領域のみ切断した。同じく制限酵素で処理したトランスポゾンベクターPB/chEF1aEBNA1-TKHygとライゲーションすることで、PB-chEF1a-Hs6st3を得た。そしてシークエンス解析（Prism 3130 Genetic Analyzer、Applied Biosystems）により目的遺伝子配列を確認した。なお、シークエンス解析は北海道システムサイエンスに委託した。
６．遺伝子導入及び遺伝子組換え細胞の樹立方法
(1) トランスフェクション（リポフェクション）
　トランスフェクションの前日に、無血清培地で培養している遺伝子導入CHO-S/NH-SDC細胞を1.2× 106cells/well、2 mL/wellで6 wellプレート（Cat. No. 130184, Thermo）にF12 + 10% FBSを用いて播種した。翌日、ベクター4,000 ngを、Opti-MEM（Cat. No. 31985-070, Invitrogen）250μLを加えてDNA溶液を調製した。また、Lipofectamine2000（LF2000, Cat. No. 11668-019, Invitrogen）12.5μLをOpti-MEM（Invitrogen）250μLに加え、5分間静置した。この2液を混合して、30分間室温で静置した。この間に、6 wellプレートで培養している細胞について、無血清F12培地2mlへの培地交換を行った。そして、DNA/LF2000混合液を500μL/wellの量で添加して、37℃で培養した。6時間後、無血清培地に交換した。一過性発現での実験の際にはトランスフェクション後48時間放置して培養上清を回収した。安定発現株を取得する場合は、既に述べたようにトランスフェクション後48時間放置して細胞をF12+10% FBSを用いてノーマルTCディッシュないしプレートへ再播種し、接着状態にて培養・選抜した。
(2) 薬剤によるスクリーニング
　安定発現株を取得する場合は、トランスフェクション後48時間が経過した時点で、遺伝子導入細胞を6 well プレートへ継代し、Hygromycin B溶液（Cat. No. 080-07683, Wako, 最終濃度：400μg/mL）による薬剤選抜を行った。4～5継代細胞増殖を繰り返しながら、細胞選抜を行い、およそ14日後に薬剤耐性細胞を取得した。
(3) 限界希釈による細胞のクローニング
　細胞懸濁液を段階的に薄め、1 cell/wellとなるように調製してコラーゲンコート96 wellプレート（Cat. No. 4860-010, Iwaki）に播種した。培地はF12+10%FBS培地を用いた。適宜、細胞の存在及び増殖を確認して培養を行い、バルク状態の細胞から単一クローンを得た。
［結果］
１．一過性発現時の抗FXa活性
　硫酸化経路の各ステップに関与する遺伝子を、ヘパリン様糖鎖分泌細胞クローンに導入し、ヘパリン様物質の硫酸化・抗凝固活性の向上を目指した。具体的には、候補遺伝子を含む一過性発現用のベクターで本発明者らの研究室で樹立されたCHO-S/NH-SDC細胞（特許文献５参照）（1.2×106cells/well、2 mL/well）をトランスフェクションし、無血清培地中で48時間放置した後、培養上清を回収し、培養上清の抗凝固第Xa因子活性（抗FXa活性）を評価した。硫酸化経路を図２に、各ステップに関与する遺伝子を以下に示す。
　候補遺伝子の詳細を下表に示す。
　結果を図３に示す。候補遺伝子のうち、硫酸化経路中、硫酸基の修飾において6-O-硫酸化に寄与する3つの酵素Hs6st3、Hs6st2、及びHs6st1をコードする遺伝子を導入した場合に、培養上清の抗FXa活性が有意に向上した。
２．比活性の導出
　培養上清の硫酸化グルコサミノグリカン（sGAG）濃度は、いずれの遺伝子を一過性発現させた場合も有意な向上は見られなかった。そこで、各々の場合について培養上清の比活性（sGAG 1 mgあたりの抗FXa活性）を求めた。結果を図４に示す。Hs6st3遺伝子の導入が、ヘパリン様物質の生産のために重要であることが分かった。Hs6st3遺伝子は、これまでに導入した両機能性ヘパラン硫酸エステルＮ－脱アセチラーゼ／Ｎ－硫酸転移酵素（NDST2）、へパラン硫酸エステルグルコサミン３　硫酸転移酵素１（Hs3st1）をコードする遺伝子（特許文献５）と同様に、CHO細胞での発現が確認されていない。
３．Hs6st3発現細胞の比活性
　先の実験で効果の高かったHs6st3遺伝子をCHO-S/NH-SDC細胞へリポフェクション法で導入した後、ハイグロマイシンで薬剤選抜し、安定発現株を取得した。得られた細胞を0.6 × 106 cells/wellの密度で2 mL/wellとなるように6 wellプレートに播種し、FreeStyleCHO-S Expression Mediumを用いて、途中培地交換や継代を行わずに3日間培養し、培養上清を回収した。回収した培養上清の抗FXa活性を求めた。
　結果を図５に示す。Hs6st3遺伝子を導入した細胞（CHO/NH-SDC/Hs6st3）を培養した場合、sGAG 1 mgあたりの抗FXa活性（比活性）は、元のCHO-S/NH-SDC細胞の場合より、比活性は9.7倍向上し、95 IU/mgだった。
　市販ヘパリンの比活性は248 IU/mgである。CHO/NH-SDC/Hs6st3が産生するヘパリン様物質はその38％程度の活性を有している。
４．Hs6st3発現細胞クローンの評価
　上記で得たHs6st3遺伝子を導入した細胞を段階的に希釈して1 cell/wellとなるようにコラーゲンコートプレートに播種した。培養には血清を10%含むFBS培地を用いた。適宜、細胞の存在及び増殖を確認して培養を行い、バルク状態の細胞から単一クローンを28個取得した。
　得られたクローンの比活性を図６に示す。バルク細胞から1.5～9倍の比活性の向上を確認できた。遺伝子組換えCHO細胞により、市販ヘパリンと同等の活性を有する抗凝固物質が得られたといえる。
［CHO/NH-SDC/Hs6st3(#17)の評価］
　先の実験出られた安定発現株の培養上清中に含まれるヘパリン様物質について、上述の記載に準じて抗FXa活性を測定し、また下述の方法で抗FIIa活性を評価した。
(1) 方法
(a) BIOPHEN HEPARIN ANTI-IIa 2 stage
　BIOPHEN HEPARIN ANTI-IIa 2 stageを利用する際の検量線には、活性値が既知であるBIOPHEN UFC Calibrator（Cat. No. 222301-RUO）を使用した。BIOPHEN UFC Calibratorキット内の5種類の各粉末試料に滅菌水1 mLを加えて溶解させた。これにTris EDTA NaCl BSA buffer-pH8.40（Cat. No.AR031K）を加えて15倍希釈して5種類のスタンダード溶液を調製した。キット内のアンチトロンビンIII粉末（R1）とFIIa粉末（R2）、FIIa特異的発色基質粉末（R3）に滅菌水1 mLを加えて完全に溶解させた。これらの試薬は通常は冷蔵保存しており、アッセイ前に恒温振とう培養機（Model. No. M?RB-022UP, Taitec）で100 rpm、25oCで、30分間振盪させた。必要量だけ分注して、R1溶液及びR2溶液はTris NaCl EDTA PEG buffer-pH8.40で、R3溶液は滅菌水でそれぞれ5倍希釈した。アッセイに使用する直前に、37oCで保温した。
　培養上清はアッセイ前に13,200 gで5分間遠心して、上清10 μLをサンプルとして利用した。スタンダード10 μL及びサンプル10 μLを96 well Assayプレート（Cat. No. 3882-096, Iwaki）に移し、37oCで5分間保温した。なお、ここで96 well Assayプレートを使用しているのは、これより大きな容器よりも、各試薬を添加した際に混和しやすいからである。ここにR1溶液10 μLを加えて37oCで2分間保温した。反応後、R2溶液10 μLを加えて37oCで正確に2分間保温した。反応後、R3溶液10 μLを加えて37oCで正確に2分間保温させて、発色反応を起こした。反応後、20%酢酸（Cat. No.017-00256, Wako）水溶液20 μLを加えて反応を停止し、384 well ELISA plate(Cat.No.3711-384,Iwaki)へ50 μL移し、吸光度（405 nm）をプレートリーダー（Model. No, Enspire, PerkinElmer）で測定した。
(2) 結果
　結果を図7及び8に示す。CHO/NH-SDC/Hs6st3の#17クローンの培養上清中に含まれるヘパリン様物質の比活性を、市販ヘパリン（比活性は170 IU/mg）に対する相対値として表した。CHO/NH-SDC/Hs6st3(#17)が産生するヘパリン様物質は、市販ヘパリンの40％を超える活性を有しており、市販ヘパリンと同等の抗FXa/抗FIIa値を示した。低分子ヘパリンや合成ヘパリンでは、抗FXa活性のみが認められ、抗FIIa活性は認められない。両方の活性が市販ヘパリンと同等の割合で検出されたことは、市販ヘパリンと同様の構造を持ったものが生産されている可能性を示している。
[配列表に掲載した配列]
SEQ ID NO:1 Mouse Slc26a1(BC032151.1)
SEQ ID NO:2 Mouse Slc26a1, PRT sequence
SEQ ID NO:3 Mouse Slc26a2(BC028345.1)
SEQ ID NO:4 Mouse Slc26a2, PRT sequence
SEQ ID NO:5 Mouse Slc13a1 cDNA(BC040789.1)
SEQ ID NO:6 Mouse Slc13a1, PRT sequence
SEQ ID NO:7 Mouse Slc13a4 cDNA(BC089161.1)
SEQ ID NO:8 Mouse Slc13a4, PRT sequence
SEQ ID NO:9 Human PAPSS1 cDNA(BC040940.1)
SEQ ID NO:10 Human PAPSS1, PRT sequence
SEQ ID NO:11 Mouse Papss2 cDNA(NM_011864.2)
SEQ ID NO:12 Mouse Papss2, PRT sequence
SEQ ID NO:13 Mouse Slc35b2 cDNA(BC036992.1)
SEQ ID NO:14 Mouse Slc35b2, PRT sequence
SEQ ID NO:15 Mouse Slc35b3 cDNA(BC006881.1)
SEQ ID NO:16 Mouse Slc35b3, PRT sequence
SEQ ID NO:17 Mouse Glce cDNA(NM_033320.5)
SEQ ID NO:18 Mouse Glce, PRT sequence
SEQ ID NO:19 Human NDST1 cDNA(BC012888.1)
SEQ ID NO:20 Human NDST1, PRT sequence
SEQ ID NO:21 Human NDST2 cDNA(NM_003635)
SEQ ID NO:22 Human NDST2, PRT sequence
SEQ ID NO:23 Human HS2ST1 cDNA(BC108735.1)
SEQ ID NO:24 Human HS2ST1, PRT sequence
SEQ ID NO:25 Mouse Hs6st1 cDNA(BC052316.1)
SEQ ID NO:26 Mouse Hs6st1, PRT sequence
SEQ ID NO:27 Mouse Hs6st2 cDNA(BC037659.1)
SEQ ID NO:28 Mouse Hs6st2, PRT sequence
SEQ ID NO:29 Mouse Hs6st3 cDNA(NM_015820.2)
SEQ ID NO:30 Mouse Hs6st3, PRT sequence
SEQ ID NO:31 Mouse Hs3st1 cDNA(NM_010474)
SEQ ID NO:32 Mouse Hs3st1, PRT sequence
SEQ ID NO:33 Mouse Hs3st5 cDNA(NM_001081208.2)
SEQ ID NO:34 Mouse Hs3st5, PRT sequence
SEQ ID NO:35 mHs6st3_XbaI_FW
SEQ ID NO:36 mHs6st3_DraI_NruI_RV
SEQ ID NO:37 Human Extracellular domain of SDC, nucleotide sequence(特許文献5のSEQ ID NO:6に対応)
SEQ ID NO:38 Human Extracellular domain of SDC, PRT sequence(特許文献5のSEQ ID NO:1に対応)
SEQ ID NO:39 Human NDST2, nucleotide sequence(特許文献5のSEQ ID NO:4に対応)
SEQ ID NO:40 Human NDST2, PRT sequence(特許文献5のSEQ ID NO:2に対応)
SEQ ID NO:41 Mouse Hs3st1, nucleotide sequence(特許文献5のSEQ ID NO:4に対応)
SEQ ID NO:42 Hs3st1, PRT sequence(特許文献5のSEQ ID NO:3に対応)
SEQ ID NO:43 Human heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 3 (HS6ST3) (NM_153456)
SEQ ID NO:44 Human HS6ST3, PRT sequence
SEQ ID NO:45 Human heparan sulfate-glucosamine 3-sulfotransferase 1 (HS3ST1) (NM_005114)
SEQ ID NO:46 Human HS3ST1, PRT sequence

Claims (9)

  1. 　以下が導入された動物細胞を培養し、ヘパリン様物質を含む培養上清を得る工程を含む、ヘパリン様物質を製造する方法：
    ・両機能性ヘパラン硫酸エステルN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素（NDST2）をコードするポリヌクレオチド；
    ・へパラン硫酸エステルグルコサミン3　硫酸転移酵素１（Hs3st1）をコードするポリヌクレオチド；
    ・シンデカン（SDC）の細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド；及び
    ・6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチド。
  2. 　6-O-硫酸化酵素が、へパラン硫酸エステル６－Ｏ－硫酸転移酵素１（Heparan Sulfate 6-O-Sulfotransferase 1、Hs6st1）、へパラン硫酸エステル６－Ｏ－硫酸転移酵素２（Heparan Sulfate 6-O-Sulfotransferase 2、Hs6st2）、及びへパラン硫酸エステル６－Ｏ－硫酸転移酵素３（Heparan Sulfate 6-O-Sulfotransferase 3、Hs6st3）からなる群より選択されるいずれかである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　6-O-硫酸化酵素が、Hs6st3である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　動物細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　請求項１から４のいずれか１項に記載の製造方法により製造された、1 mgあたりの抗凝固第Xa因子活性が、200 IU/mg以上である、組換えヘパリン様物質。
  6. 　少なくとも以下が導入された組換えＣＨＯ細胞：
    ・NDST2をコードするポリヌクレオチド；
    ・Hs3st1をコードするポリヌクレオチド；
    ・SDCの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド；及び
    ・6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチド。
  7. 　6-O-硫酸化酵素が、Hs6st1、Hs6st2、及びHs6st3からなる群より選択されるいずれかである、請求項６に記載の細胞。
  8. 　6-O-硫酸化酵素が、Hs6st3である、請求項６又は７に記載の細胞。
  9. 　6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチドが、下記のいずれかである、請求項６から８のいずれか１項に記載の細胞。
    (A)配列番号29又は43に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
    (B)配列番号29又は43に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (C)配列番号29又は43に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (D)配列番号30又は44に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (E)配列番号30又は44に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、ヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (F)配列番号30又は44に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
     
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