KR20160101163A - 알지네이트/콜라겐 히드로겔 중의 fgf-18 제형물 - Google Patents

알지네이트/콜라겐 히드로겔 중의 fgf-18 제형물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약제학적 제형물의 분야와 관련된다. 보다 특히, 본 발명은 섬유아세포 성장 인자 18(FGF-18) 화합물을 포함하는 균질한 히드로겔 및 이러한 히드로겔을 제조하는 방법과 관련된다. 본 발명의 히드로겔은, 일단 동일계 내에서 형성되면, 연골 장애, 예컨대 골관절염 또는 연골 부상의 치료에 사용할 수 있다.

Description

알지네이트/콜라겐 히드로겔 중의 FGF-18 제형물 {FGF-18 FORMULATION IN ALGINATE/COLLAGEN HYDROGELS}
본 발명은 약제학적 제형물의 분야와 관련된다. 보다 특히, 본 발명은 알지네이트(alginate)/콜라겐 히드로겔 중의 섬유아세포 성장 인자 18 (FGF-18) 단백질 제형물 및 이러한 히드로겔/제형물을 제조하는 방법과 관련된다.
섬유아세포 성장 인자 18(FGF-18)은 FGF-8 및 FGF-17과 밀접하게 관련된, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 단백질 패밀리의 구성원이다. FGF 패밀리의 구성원은 헤파린 결합 도메인에 의해 특징지어 진다. 이러한 추정 헤파린-결합 도메인은 FGF-18로 확인되었다. 수용체-매개 신호전달이 세포-표면 헤파린 술페이트 프로테오글리칸으로 복합체화된 FGF 리간드의 결합에 따라 개시된다고 가정되었다.
FGF-18이 연골세포 및 골모세포에 대한 증식제임이 밝혀졌다 (문헌 [Ellsworth et al., 2002; Shimoaka et al., 2002]). FGF-18은 연골 장애, 예컨대 골관절염(OA) 및 연골 부상(CI)의 치료에, 단독 (WO2008/023063) 또는 히알루론산과의 병용 (WO2004/032849) 중 어느 하나로써 제안되어 왔다.
FGF 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물은 당업계에 알려져 있다. WO2012172072는 FGF-18을 함유하는 동결-건조 제형물을 기술하며, 여기서 상기 조성물은 FGF-18, 완충액, 폴록사머(poloxamer) 계면활성제 및 안정화제로서 당을 포함한다. 상기 FGF-18 동결-건조 제형물은 OA 또는 CI 치료에 유망한 결과를 보이고 있다. 상기 동결-건조 제형물을 사용하는 현재의 투약 요법은, 3 주 동안 매주 1 회 주사의 치료 주기이다. 치료 주기는 반복될 수 있다.
CI의 경우, 현재 제형물의 주된 결점은, 관절내(i.a.) 주사되면, 활액 내 FGF-18의 존재가 건강한 영역에서도 통제되지 않은 연골 성장을 유발할 수 있다는 것이다. 물론 이것은, 원치 않은 효과, 예컨대 줄어든 관절 가동성을 유발할 수 있다. 선택적으로 표적 부위 수준에서의 FGF-18의 전달은 오직 손상된 영역에서의 연골 성장을 촉진할 수 있다. 특히, 손상된 영역 수준에서의 FGF-18의 전달은 미세골절과 결합된 CI 치료에 매우 이로울 수 있다. 미세골절은 기저 골격에 작은 골절을 생성시킴으로써 수행되는 관절 연골 복구 수술 기법이다. 이것은 골수로부터 다능성 중간엽 줄기 세포의 방출을 야기한다 (문헌 [Ringe J. et al., 2012]). 연골 구멍을 FGF-18을 함유하는 주사가능한 겔로 채우는 것은, 이후, 세포 성장에 대한 기계적 지지체 및 동시에 약물 저장소로서 역할을 할 수 있는 겔 내의 세포와 관련될 수 있다. 이런 이유로, FGF-18이 겔로부터 방출되지 않고 기질 안에 갇힌 상태로 머무는 것이 바람직할 것이다.
조직 공학에서의 전형적인 접근법은, 수용자 부위의 형상을 추정하기 위하여, 기계적 성질에 따라 이식 또는 주사될 수 있는, 3D 기질, 즉, 스캐폴드(scaffold) 내에 성장 인자의 격리이다. 스캐폴드의 필수 특징은 생체적합성 및 재흡수가능성(resorbability)이다. 추가적으로, 스캐폴드는 세포에게 성장, 증식 및 손상된 조직을 재건하는 데에 이상적인 환경을 제공할 수 있어야 한다. 이상적으로, 기질은 원래 조직의 동일한 기계적 성질을 닮아야 하며 세포를 수용할 수 있는 미세다공성 (상호연결된 충분한 크기의 세공) (문헌 [Tessmar and Goepferich, 2007])을 나타내야 한다.
예를 들어, WO2012113812는 한 층 이상의 다가음이온 및 한 층 이상의 다가양이온으로 코팅된 나노섬유 스캐폴드를 기술한다. 치료 분자, 예컨대 FGF18은 스캐폴드에 포함될 수 있다. 특히, 치료 분자는 다가음이온 층을 형성할 수 있다. 상기 스캐폴드는 임의로 콜라겐 히드로겔 내의 골모세포 및 알지네이트 히드로겔 내의 연골세포를 더 포함할 수 있으며, 각 히드로겔은 코팅된 스캐폴드 상에 침착되었다. 상기 스캐폴드는 수술을 통해 동일계 내(in situ)에 이식될 수 있다.
히드로겔은 다량의 물을 흡수 및 보유할 수 있는 친수성 중합체 사슬의 3차원 네트워크이다. 이들의 주된 특성은 이들이 수성 매질에서 팽창 또는 수축할 수 있지만 용해되지 않는다는 것이다. 따라서, 이들의 기질에, 이후, 기질과 API 간의 특정한 상호작용의 존재에 따라 천천히 방출되거나 머무르는 활성 분자 (활성 약제학적 성분, 즉, API)를 가두는 것이 가능하다 (문헌 [Lo Presti et al., 2011]). 연골 장애 치료에 주사가능한 히드로겔을 사용하는 것의 장점은 고체 스캐폴드를 사용하는 임의의 침습적 수술을 필요로 하지 않으면서, 관절경에 의해 스캐폴드를 연골 결함에 주사할 가능성이다.
이미 알려진 다양한 히드로겔 중에서, 일부 제형물은 특정 물리적 또는 화학적 자극에 반응하여 겔화 과정을 거칠 수 있는 중합체에 기반한다. 이들은, 주사되면, 주사 부위에서의 환경적 자극, 예컨대 온도, pH 또는 이온 강도의 변화에 반응하여 육안으로 보이는 겔로 변하는 점성 주사액으로서 존재한다. 제형물의 조성물은 상이한 특징, 예컨대 점탄성 성질, 미세다공성, 등을 갖는 히드로겔을 얻기 위해 조정될 수 있다 (WO2008063418; 문헌 [Lo Presti et al., 2011]; 문헌 [C. Dispenza et al, 2011]). 생물활성 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제조할 경우, 상기 조성물은 단백질의 활성이 적당한 시간의 기간 동안 유지되는 방식으로 제형화되어야 한다. 단백질의 활성 / 안정성 손실은 단백질의 화학적 또는 물리적 불안정성, 특히 변성, 응집 또는 산화로 인해 일어날 수 있다. 따라서, 얻어진 생성물은 약제학적으로 허용불가능할 수 있다. 비록 부형제(들) 및/또는 히드로겔(들)의 사용이 주어진 단백질의 안정성을 증가시킨다고 알려져 있을지라도, 이들 부형제의 안정화 효과는 겔 중의 중합체, 부형제의 속성 및 생물활성 단백질 자체에 매우 의존적이다.
이것은 활성 성분으로서 FGF-18을 함유하는 추가적인 제형물에 대한 필요를 남기며, 여기서 상기 제형물은, 주사, 바람직하게는 관절내 주사에 사용하기에 적절하면서 활성 성분의 생물활성을 유지하는 동안, 치료에 필요한 주사 횟수를 감소시키는 것을 허용한다. 이것은 수술이나 침습적인 이식을 요구하지 않으므로, 이러한 특징은 감염의 위험성을 감소시키고 환자의 편의를 증가시킬 수 있을 것이다. 상기 제형물은 환자의 연골 장애, 예컨대 골관절염 또는 연골 부상의 치료에서의 투여에 유용할 수 있다.
FGF-18 단백질을 함유하는 신규한 제형물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 보다 특히, 상기 제형물은 FGF-18을 함유하는 균질한 히드로겔이며, 여기서 상기 히드로겔은 바람직하게는 이온-반응성 히드로겔이며, 보다 바람직하게는 알지네이트/콜라겐 겔이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 균질한 히드로겔을 제조하는 방법을 제공한다. 본원에 기술된, FGF-18을 함유하는 히드로겔은, 연골 장애의 치료에서의 투여에 유용할 수 있다. 특히 흥미로운 것은 FGF-18 단백질을 더 함유하는 알지네이트/콜라겐 히드로겔이다.
제1 측면에서, 본 발명은 알지네이트, 콜라겐, FGF-18, 등장화제/안정화제로서 당, 뿐만 아니라 염을 포함하거나 이로 구성되는, 균질한 히드로겔 (즉, 겔 제형물)을 제공한다. 이 제형물은 2 구성성분-겔화 시스템으로서 제공되며, 각 시스템은 분리된 경우 액체 형태이다. 대안적으로, 알지네이트를 포함하는 구성성분-겔화 시스템은 동결-건조 형태일 수 있다. 구성성분 중 하나는 알지네이트, 콜라겐, FGF-18, 및 당의 액체 또는 동결-건조 조성물을 포함하거나 이로 구성된다 (용액 1). 구성성분은 균질한 조성물을 형성한다. 제2 구성성분은 또한 액체 형태의 염을 포함하거나 이로 구성된다 (용액 2). 2 구성성분-겔화 시스템 (용액 1 및 용액 2)이 함께 혼합되면 (또는 합쳐지면), 겔을 형성한다. 상기 겔은 또한 균질하다. 바람직한 실시양태에서, 안정화제는 당 또는 당-알콜, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스, D-소르비톨이며 염은 2양이온성 염 (예컨대 마그네슘 염, 구리 염, 아연 염 또는 칼슘 염, 예를 들어, 염화칼슘)이다. 바람직한 실시양태에서, 제1 구성성분-겔화 시스템 (즉, 용액 1)에서, 알지네이트의 농도는 약 1 내지 5 중량%, 바람직하게는 약 2.5 내지 4.5, 훨씬 바람직하게는 약 3 또는 4 중량%이며, 콜라겐은 약 0.1 내지 5 μg/mL, 바람직하게는 약 1 또는 2 μg/mL의 농도이며, 수크로스의 농도는 약 10 내지 100 mg/mL, 바람직하게는 약 30 내지 70 mg/mL, 예컨대 약 30, 40, 50, 60 또는 70 mg/mL, 훨씬 바람직하게는 70 mg/mL이며; 염 용액의 농도는, 제2 구성성분-겔화 시스템 (즉, 용액 2)에서, 약 1 내지 20 mg/mL, 바람직하게는 10 mg/mL이다. 함께 혼합될 경우, 용액 1:용액 2의 부피비는 5:1 내지 1:2, 보다 바람직하게는 2:1 (동결-건조 제형물의 경우에서, 용액 1의 부피는 동결건조 공정 전에 고려된다)이다. 바람직하게는, FGF-18은: 1) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)을 포함하거나 이로 구성되는 서열에 대응하는, 성숙한 형태의 인간 FGF-18을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 2) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 196(Lys)을 포함하거나 이로 구성되는 인간 FGF-18의 말단절단된(truncated) 형태를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 및 3) 서열 2를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, FGF-18은, 이하에서 정의된 바와 같이, 스프리퍼민(sprifermin)이다. 제1-구성성분 겔화 시스템은 완충액, 및/또는 임의의 다른 부형제를 더 포함할 수 있다.
용액 1을 바람직하게는 히드로겔을 동일계 내에 형성하도록 용액 2와 공동-주사한다.
제2 측면에서, 본 발명은:
1) 알지네이트, 콜라겐 및 등장화제/안정화제와 함께 FGF-18을 포함하거나 이로 구성되는 용액 1을 제조하는 단계,
2) 염을 포함하거나 이로 구성되는 용액 2를 제조하는 단계, 및
3) 겔을 형성하도록 두 용액을 공동-주사하는 단계
를 포함하는, FGF-18의 균질한 히드로겔을 제조하는 방법을 제공하며,
여기서 등장화제/안정화제는 당 또는 당-알콜, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 D-소르비톨이며, 염은 2양이온성 염, 예컨대 마그네슘 염, 구리 염, 아연 염 또는 칼슘 염 (예를 들어, 염화칼슘)이다. 바람직하게는 최종 제형물의 pH를 약 6 내지 8 및, 보다 특히 약 7로 유지한다. 바람직한 실시양태에서, FGF-18은: 1) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)을 포함하거나 이로 구성되는 서열에 대응하는, 성숙한 형태의 인간 FGF-18을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 2) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 196(Lys)을 포함하거나 이로 구성되는 인간 FGF-18의 말단절단된 형태를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 및 3) 서열 2를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, FGF-18은, 이하에서 정의된 바와 같이, 스프리퍼민이다. 용액 1은 완충액, 및/또는 임의의 다른 부형제를 더 포함할 수 있다.
제3 측면에서, 본 발명은:
1) 알지네이트, 콜라겐, FGF-18 단백질, 및 등장화제/안정화제를 포함하는 (용액 1) 제1 용기 (상기 조성물은 균질하다), 및
2) 염을 포함하는 (용액 2) 제2 용기
를 포함하는, 약제학적 또는 수의과적 용도를 위한 제조품을 제공하며,
여기서 등장화제/안정화제는 당 또는 당-알콜, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 D-소르비톨이며, 염은 2양이온성 염, 예컨대 마그네슘 염, 구리 염, 아연 염 또는 칼슘 염 (예를 들어, 염화칼슘)이다. 바람직하게는, FGF-18은: 1) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)을 포함하거나 이로 구성되는 서열에 대응하는, 성숙한 형태의 인간 FGF-18을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 2) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 196(Lys)을 포함하거나 이로 구성되는 인간 FGF-18의 말단절단된 형태를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 및 3) 서열 2를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, FGF-18은 이하에서 정의된 바와 같이, 스프리퍼민이다. 용액 1은 완충액, 및/또는 임의의 다른 부형제를 더 포함할 수 있다. 각 용기의 내용물을 이후 동시 주사에 따라 동일계 내에서 함께 혼합한다. 바람직하게는, 제조품의 제1 용기 및 제2 용기는 이중-챔버 또는 이중 주사 시스템의 두 구획이다.
정의
- 본원에서 사용되는 용어 "FGF-18 단백질" 또는 "FGF-18"은, 인간 FGF-18 단백질의 생물학적 활성을 하나 이상 유지하는 단백질이도록 의도된다. FGF-18은 천연(native), 그 성숙한 형태, 또는 이들의 말단절단된 형태일 수 있다. 인간 FGF-18 단백질의 생물학적 활성은 특히 골모세포성 활성 (WO98/16644를 참조한다) 또는 연골 형성 (WO2008/023063을 참조한다)의 증가를 포함한다.
천연, 또는 야생형, 인간 FGF-18은 관절 연골의 연골세포에 의해 발현된 단백질이다. 인간 FGF-18은 처음에는 zFGF-5로 표시되었으며 WO98/16644에 완전히 기술되어 있다. 서열 1은 아미노산 잔기 1(Met) 내지 27(Ala)로 구성된 신호 펩티드를 갖는 천연 인간 FGF-18의 아미노산 서열에 대응한다. 성숙한 형태의 인간 FGF-18은 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala) (180 아미노산)의 아미노산 서열에 대응한다.
본 발명에 있어서 FGF-18은, 예컨대 출원 WO2006/063362에 교시된 바와 같은 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 발현 시스템 및 조건에 따라, 본 발명에서의 FGF-18은 시작 메티오닌 (Met 잔기) 또는 분비를 위한 신호 서열과 함께 재조합 숙주 세포에서 발현된다. 원핵 숙주, 예컨대 대장균(E. coli)에서 발현된 경우, FGF-18은 그 서열의 N-말단에 추가적인 Met 잔기를 함유한다. 예를 들어, 인간 FGF-18의 아미노산 서열은, 대장균에서 발현된 경우, N-말단 (위치 1)의 Met 잔기로 시작하며 서열 1의 잔기 28 (Glu) 내지 잔기 207 (Ala)이 이어진다.
- 본원에서 사용되는 용어 FGF-18의 "말단절단된 형태"는, 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 196(Lys)을 포함하거나 이로 구성되는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, FGF-18 단백질의 말단절단된 형태는, (N-말단의) Met 잔기로 시작하고 야생형 인간 FGF-18의 아미노산 잔기 28 (Glu) 내지 196 (Lys)이 이어지는, "trFGF-18" (170 아미노산)로 표시된 폴리펩티드이다. trFGF-18의 아미노산 서열은 서열 2 (서열 2의 아미노산 잔기 2 내지 170은 서열 1의 아미노산 잔기 28 내지 196에 대응한다)에서 보여진다. trFGF-18은, 대장균에서 생산된 인간 FGF-18의 재조합 말단절단된 형태이다 (WO2006/063362를 참조한다). FGF-18의 이 특정 형태에 대한 국제 일반명(International Nonproprietary Name, INN)은 스프리퍼민이다. 스프리퍼민은 성숙한 인간 FGF-18과 유사한 활성을 나타내는 것으로 보여져 왔으며, 예를 들어, 이것은 다양한 연골 조직에 대한 복구 및 재건을 가져오는 연골세포 증식 및 연골 침착을 증가시킨다 (WO2008/023063을 참조한다).
- 용어 "활성 분자" 및 "활성 성분"은 활성 약제학적 성분, 즉, API와 관련된다. 바람직한 API는, 본 발명의 맥락에서, FGF-18이다.
- 용어 "겔" 또는 "히드로겔"은 본 출원에서 혼용될 수 있다. 이들은 약제학적 제형물로서 유용한 3D 기질, 또는 스캐폴드를 지칭한다. 이들은 고체 스캐폴드가 아니다.
- 용어 "균질한"은 제형물의 다양한 구성성분이 함께 혼합, 블렌딩, 교반 또는 녹아있음, 즉, 이들이 구성성분의 분리된 층을 형성하지 않음을 의미한다.
- 알긴산 또는 알긴으로도 알려진, 용어 "알지네이트"는, 임의의 형태의 알지네이트를 지칭한다. 이것은 특히 2양이온성 염과 함께 사용될 경우 잘 알려진 겔화제이다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 형태 중 하나는 나트륨 알지네이트이다.
- 용어 "콜라겐"은 자연적으로 발생하는 단백질의 군을 지칭한다. 비록 거의 30 가지의 상이한 형태의 콜라겐이 존재하지만, 주된 것은 I 형 콜라겐이다. I 형 콜라겐뿐만 아니라 II 형 콜라겐도 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 바람직한 형태이다. 그러나, 다른 형태의 콜라겐을 사용할 수 있다.
- 본 출원에서 사용되는 용어 "알지네이트/콜라겐"은 알지네이트 및 콜라겐의 조합을 지칭한다.
- 용어 "2양이온성 염"은 예를 들어 마그네슘, 구리, 아연 또는 칼슘을 포함하는 염을 지칭하나 이에 제한되지 않는다. 염화마그네슘, 염화구리, 염화아연 또는 염화칼슘을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 2양이온성 염은 다가양이온성 염이 아니거나, 다가양이온성 구성성분 (예컨대 WO2012/113812에서 개시된 것)으로부터 유도되지 않았다.
- 본원에서 사용되는 용어 "안정한" 용액 또는 제형물은, 그 안의 단백질의 생물학적 활성의 상실, 응집, 변경, 열화의 정도 등이 허용가능하게 통제되고, 시간에 따라 허용불가능하게 증가하지 않는 용액 또는 제형물이다. 바람직하게는, 제형물은 실온에서 12 개월 이상의 기간 동안 적어도 80 % 초과의 FGF-18 활성을 보유한다. FGF-18을 포함하는 본 발명의 안정화된 제형물은, 예를 들어 실온 또는 2 내지 8 ℃에서 저장될 경우, 바람직하게는 약 12 개월, 18 개월 이상, 보다 바람직하게는 20 개월 이상, 보다 바람직하게는 약 24 개월의 저장수명(shelf-life)을 갖는다. 본 발명의 FGF-18 제형물의 안정성을 모니터링하는 방법은 당업계에서 입수가능하다.
- 본원에서 사용되는 용어 "안정화제(stabilizing agent)", "안정제(stabilizer)" 또는 "등장화제"는, 생리학적으로 관용되고 제형물에 적절한 안정성/긴장성을 부여하는 화합물이다. 이것은 특히 제형물과 접촉해있는 세포막을 가로지르는 물의 순 유동(net flow)을 방지한다. 동결-건조 (freeze-drying (동결건조(lyophilisation))) 공정 동안, 안정제는 또한 동해방지제(cryoprotectant) (즉, 동결보호제(lyoprotectant))로서도 효과적이다. 화합물, 예컨대 글리세린이 이러한 목적을 위해 흔히 사용된다. 다른 적절한 안정성 시약은, 아미노산 또는 단백질 (예를 들어, 글리신 또는 알부민), 염 (예를 들어, 염화나트륨), 및 당 또는 당-알콜 (예를 들어, 덱스트로스, 만니톨, 트레할로스, 수크로스, D-소르비톨 또는 락토스)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따르면, 바람직한 안정화제/긴장성 조절제는 당, 훨씬 보다 바람직하게는 수크로스이다.
- 본원에서 사용되는 용어 "완충액"은, 약제학적 또는 수의과적 용도를 위한 제형물에서 안전한 것으로 알려지고 제형물의 pH를 제형물에 바람직한 pH 범위로 유지하거나 조절하는 효과를 갖는 화합물의 용액을 지칭한다. pH를 중간 정도의 산성 pH 내지 중간 정도의 염기성 pH로 조절하는 허용가능한 완충액은 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 아르기닌, TRIS, 및 히스티딘 완충액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "TRIS"는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3,-프로판디올, 및 임의의 약학적으로 허용가능한 이들의 염을 지칭한다. 바람직한 완충액은 히스티딘 완충액일 수 있다.
- 본원에서 사용되는 용어 "용매"는, 수성 또는 비-수성인 액체 용매를 지칭한다. 용매의 선택은 특히 상기 용매에 대한 약물 화합물의 용해도 및 투여 방법에 의존한다. 수성 용매는 물만으로 구성될 수 있거나, 물에 더해 하나 이상의 혼화성 용매로 구성될 수 있으며, 용해된 용질, 예컨대 당, 완충액, 염 또는 다른 부형제를 함유할 수 있다. 보다 흔히 사용되는 비-수성 용매는 단쇄 유기 알콜, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 단쇄 케톤, 예컨대 아세톤, 및 다가알콜, 예컨대 글리세롤이다. 본 발명에 따르면, 바람직한 용매는 수성 용매 예컨대 물 또는 식염 용매이다.
- 본원에서 사용되는 용어 "바이알(vial)" 또는 "용기"는, 널리 액체 형태, 또는 동결-건조 형태의 알지네이트/콜라겐을 보유하는 데에 적절한 저장소를 지칭한다. 유사하게, 이것은 액체 염 혼합물을 보유할 것이다. 본 발명에 사용할 수 있는 바이알의 예는 시린지, 앰플, 카트리지, 또는 주사를 통해, 바람직하게는 관절내 주사를 통해 환자에게 FGF-18 제형물을 전달하기에 적절한 다른 이러한 저장소를 포함한다. 대안적으로, 알지네이트/콜라겐 용액을 보유한 바이알 및 염을 보유한 것은 이중-챔버 시스템의 2 구획 (시린지 또는 카트리지, 예를 들어, 이중 챔버 시린지 또는 이중-바늘 주사 기구, 등)으로서 나타난다. 관절내 투여용 제품 포장에 적절한 바이알이 당업계에 잘 알려지고 인식되어 있다.
- 본원에서 사용되는 용어 "연골 장애"는, 외상성 부상 또는 연골병증으로 인한 손상으로부터 발생한 장애를 아우른다. 본원에 기술된 FGF-18 제형물의 투여에 의해 치료될 수 있는 연골 장애의 예는 관절염, 예컨대 골관절염 또는 류마티스성 관절염, 및 연골 부상을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
- 용어 "골관절염"은 가장 흔한 형태의 관절염을 의미하는 데에 사용된다. 이것은 연골의 파괴에 의해 야기될 수 있다. 연골 비트(bit)가 갈라지고 뼈 사이의 관절에 고통 및 부종을 야기할 수 있다. 시간이 지남에 따라 연골은 완전히 닳을 수 있으며 뼈가 서로 맞비벼지게 될 것이다. 골관절염은 임의의 관절에 영향을 끼칠 수 있지만 통상적으로 손 및 체중-지지 관절, 예컨대 엉덩이, 무릎, 발, 및 척추에 관한다. 바람직한 실시예에서, 골관절염은 무릎 골관절염 또는 엉덩이 골관절염이다. 당업자는 당업계에 사용되는 골관절염 분류, 특히 OARSI 평가 시스템 (예를 들어 문헌 [Custers et al., 2007]을 참조한다)을 완전히 인식하고 있다. 골관절염은 본 발명에 따른 FGF-18 제형물의 투여에 의해 치료될 수 있는 바람직한 연골 장애 중 하나이다.
- 본원에서 사용되는 용어 "연골 부상"은 특히 외상으로 인한 연골 장애 또는 연골 손상이다. 연골 부상은 외상성 기계적 파손, 특히 추가적으로 사고 또는 수술 (예컨대, 미세골절 기술)의 결과로서 일어날 수 있다. 이 정의 내에서 또한 고려되는 것은 스포츠-관련 부상 또는 스포츠-관련 관절 조직의 마모이다.
- 용어 "μg" 또는 "mcg"은 혼용되며 질량에 대한 SI 단위의 분할을 지칭한다.
본 발명의 주된 목적은 알지네이트, 콜라겐, FGF-18 단백질, 안정화제로서 당, 및 염을 포함하거나 이로 구성되는 알지네이트/콜라겐 겔 제형물 (또는 히드로겔)이다. 상기 히드로겔은 균질하다. 히드로겔은 완충액, 및/또는 임의로 다른 부형제를 더 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 안정화제는 당 또는 당-알콜 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 D-소르비톨이며 염은 2양이온성 염 예컨대 마그네슘 염, 구리 염, 아연 염 또는 칼슘 염 (예를 들어, 염화칼슘)이다. 상기 히드로겔은 연골 수준에서의 주사에 적절하다. 바람직하게는, FGF-18 단백질은: 1) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)을 포함하거나 이로 구성되는 서열에 대응하는, 성숙한 형태의 인간 FGF-18을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 2) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 196(Lys)을 포함하거나 이로 구성되는 인간 FGF-18의 말단절단된 형태를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 및 3) 서열 2를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, FGF-18은 스프리퍼민이다.
주사가능한 균질한 히드로겔의 사용의 장점은 고체 스캐폴드를 사용하는 임의의 침습적인 수술을 필요로 하지 않으면서, 이미 FGF-18을 함유하는 스캐폴드 (또는 스캐폴드의 구성성분)를 연골 결함에 주사할 가능성이다. 바람직하게는, 이러한 히드로겔의 주사를 관절경에 의해 수행한다.
가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 균질한 히드로겔을, 하나는 중합체 (본원에서 알지네이트 시스템; 용액 1)를 함유하고 다른 하나는 이온 (본원에서 염의 형태로; 용액 2)을 함유하며, 주사에 따라, 2 용액을 혼합함 (또는 합침)으로써 동일계 내에서 형성되는 두 용액으로부터 제조한다. 2 용액의 혼합 (또는 합침)은 바람직하게는 공동-주사를 통해 수행된다. 용액 1은 완충액, 및/또는 임의의 다른 부형제를 더 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 투여되면, 이온 농도 변화로 인해 겔화 과정을 거칠 수 있는 균질한 액체 중합체성 용액의 사용과 관련된다. 대안적인 실시양태에서, 중합체성 용액은 동결-건조 형태일 수 있다. 중합체성 용액이 이러한 동결-건조 형태일 때, 상기 용액은 임의로 동결보호제를 더 포함할 수 있다. 알려진 동결보호제는, 예를 들어 일반적으로 당, 및 폴리올, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 D-소르비톨이다.
용액 1이 동결-건조 형태여야 하므로, 동결건조를 바람직하게는 통상적인 절차를 사용하여 수행한다.
용액 1 중의 FGF-18의 농도는, 바람직하게는 약 0.1 내지 300 mcg/mL, 바람직하게는 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 54, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 300 mcg/mL이다. 보다 바람직하게는 FGF-18은 약 0.1 내지 100 mcg/mL, 훨씬 보다 바람직하게는 약 10 내지 60 mcg/mL의 농도이다. 제형화 중에 발생할 수 있는 가능한 단백질 손실을 방지하기 위해, FGF-18을 5 % 초과하여 첨가할 수 있다. 예를 들어, 30 mcg/mL의 FGF-18 농도에서, 화합물을 31.5 mcg/mL의 양으로 첨가할 수 있다.
용액 1 중의 겔화 구성성분, 즉, 알지네이트는, 약 1 내지 5 중량%, 바람직하게는 약 2.5 내지 4.5 중량%, 훨씬 바람직하게는 약 3 또는 4 중량%의 농도이다.
본 발명의 안정화제는 바람직하게는 당 또는 당-알콜, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 D-소르비톨이다. 바람직한 당은 수크로스다. 바람직하게는, 용액 1 중의 안정화제의 농도는 약 10 내지 100 mg/mL, 보다 바람직하게는 약 30 내지 70 mg/mL, 예컨대 약 30, 40, 50, 60 또는 70 mg/mL, 훨씬 바람직하게는 약 70 mg/mL이다.
용액 1 중의 본 발명에 따른 콜라겐은, 바람직하게는 약 0.1 내지 5 mcg/mL, 보다 바람직하게는 약 1 내지 2 mcg/mL, 보다 특히 약 1 또는 2 mcg/mL의 농도이다.
제2 구성성분-겔화 시스템 (즉, 용액 2) 중의 염은, 바람직하게는 2양이온성 염, 예컨대 마그네슘 염, 구리 염, 아연 염 또는 칼슘 염 (예를 들어, 염화칼슘)이다. 염 용액의 농도는, 약 1 내지 20 mg/mL, 바람직하게는 약 10 mg/mL이다.
바람직한 실시양태에서, 용액 1은 FGF-18 약 0.1 내지 100 mcg/mL, 알지네이트 약 4 중량%, 수크로스 약 70 mg/mL 및 콜라겐 약 2 mcg/mL를 포함하거나 이로 구성되며; 용액 2는 2양이온성 염 (예컨대 염화칼슘) 약 10 mg/mL를 포함하거나 이로 구성된다. 용액 1은 완충액, 및/또는 임의로 다른 부형제를 더 포함할 수 있다. 용액 1은 균질하다.
함께 혼합될 경우, 용액 1: 용액 2의 부피비는 5:1 내지 1:2, 보다 바람직하게는 2:1 (동결-건조 제형물의 경우, 용액 1의 부피는 동결건조 공정 전에 고려된다)이다.
함께 혼합되면, 각 구성성분의 최종 농도는 바람직하게는 다음과 같다:
- FGF-18: 0.00006 내지 0.2 % w/v, 예컨대 0.0036 % w/v (혼합 전 FGF-18이 0.1 내지 300 mcg/mL일 때, 실시예 단락에서 주어진 FGF-18 농도에 기반함)
- 알지네이트: 0.6 내지 3.33 % w/v, 예컨대 2.67 % w/v (혼합 전 알지네이트가 4 % w/v일 때)
- 콜라겐: 0.00006 내지 0.003 % w/v 범위, 예컨대 0.000133 % w/v (혼합 전 콜라겐이 2 mcg/mL일 때)
- 안정화제: 0.6 내지 6 % w/v 예컨대 4.67 % w/v (혼합 전 수크로스가, 예를 들어 70 mg/mL일 때)
- 2양이온성 염: 0.033 내지 0.66 % w/v 예컨대 0.33 % w/v (혼합 전 염이 10 mg/mL일 때)
바람직한 실시양태에서, 최종 제형물의 pH를 약 6 내지 8, 보다 특히 약 7로 유지한다.
본 발명은:
1) 알지네이트, 콜라겐 및 안정화제와 함께 FGF-18을 포함하거나 이로 구성되는 제1 용액 (용액 1)을 제조하는 단계,
2) 염을 포함하거나 이로 구성되는 제2 용액 (용액 2)을 제조하는 단계, 및
3) 겔을 형성하도록 두 용액을 공동-주사하는 단계
를 포함하는, FGF-18의 균질한 히드로겔을 제조하는 방법을 더 제공하며,
여기서 안정화제는 당 또는 당-알콜, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 D-소르비톨이며, 염은 2양이온성 염, 예컨대 마그네슘 염, 구리 염, 아연 염 또는 칼슘 염 (예를 들어, 염화칼슘)이다. 용액 1은 완충액, 및/또는 임의의 다른 부형제를 더 포함할 수 있다. 용액 1은 균질하다. 바람직한 실시양태에서 최종 제형물의 pH를 약 6 내지 8 및, 보다 특히 약 7로 유지한다. 바람직하게는, FGF-18은: 1) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)을 포함하거나 이로 구성되는 서열에 대응하는, 성숙한 형태의 인간 FGF-18을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 2) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 196(Lys)을 포함하거나 이로 구성되는 인간 FGF-18의 말단절단된 형태를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 및 3) 서열 2를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, FGF-18은, 본원에서 정의된 바와 같이 스프리퍼민이다.
각 화합물 (즉, FGF-18, 알지네이트, 콜라겐, 안정화제 및 염)을 상기에 기술된 임의의 농도, pH, 및/또는 비 중 하나에 따라 사용할 수 있다. 바람직하게는, 용액 1:용액 2의 비 (부피 대 부피, 즉, v:v)는 약 1:2 내지 5:1, 보다 바람직하게는 약 2:1 (동결-건조 제형물의 경우, 용액 1의 부피는 동결건조 공정 전에 고려된다)이다.
본 발명의 히드로겔의 용액 1이 동결-건조 형태일 때, 이것은 단계 3) 전에 (즉, 공동-주사 전에) 재구성되어야 한다.
제3 측면에서, 본 발명은:
1) 알지네이트, 콜라겐, FGF-18 단백질, 및 안정화제 (용액 1)를 포함하거나 이로 구성되는 제1 용기, 및
2) 염을 포함하거나 이로 구성되는 제2 용기 (용액 2)
를 포함하는, 약제학적 또는 수의과적 용도를 위한 제조품을 제공하며,
여기서 안정화제는 당 또는 당-알콜, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 D-소르비톨이며, 염은 2양이온성 염 예컨대 마그네슘 염, 구리 염, 아연 염 또는 칼슘 염 (예를 들어, 염화칼슘)이다. 용액 1은 완충액, 및/또는 임의의 다른 부형제를 더 포함할 수 있다. 용액 1은 균질하다. 바람직하게는, FGF-18은: 1) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)을 포함하거나 이로 구성되는 서열에 대응하는, 성숙한 형태의 인간 FGF-18을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 2) 서열 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 196(Lys)을 포함하거나 이로 구성되는 인간 FGF-18의 말단절단된 형태를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 및 3) 서열 2를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, FGF-18은, 본원에서 정의된 바와 같이, 스프리퍼민이다.
각 화합물 (즉, FGF-18, 알지네이트, 콜라겐, 안정화제 및 염)을 상기에 기술된 임의의 농도, pH, 및/또는 비 중 어느 하나에 따라 사용할 수 있다. 바람직하게는, 용액 1: 용액 2 부피비 (v:v)는 약 1:2 내지 5:1, 보다 바람직하게는 약 2:1 (동결-건조 제형물의 경우, 용액 1의 부피는 동결건조 공정 전에 고려된다)이다. 각 용기의 내용물을 이후 동시 주사에 따라 동일계 내에서 함께 혼합한다 (예를 들어, 공동-주사).
바람직하게는, FGF-18 제형물을 보유하는 용기 및 염을 보유하는 것은 이중-챔버 시스템의 또는 이중 주사 시스템의 두 구획 (예를 들어, 시린지 또는 카트리지)에 대응한다.
중합체성 용액 (즉, 용액 1)이 동결-건조 형태일 때, 제조품은 재구성에 필요한, 용매, 예컨대 물 또는 식염수 (예를 들어, 주사용 0.9 % w/v 염화나트륨)를 포함하거나 이로 구성되는 제3 용기를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 히드로겔을, 바람직하게는 동일계 내에서 형성하도록 지침을 제공하는 포장 재료가 또한 기술된다.
중요하게, 놀랍게도 두 용액의 동시기의 주사를 허용하는 시린지 연결기를 사용하여 겔을 형성할 때, 임의의 중합체 농도에서 남아있는 액체 상이 관찰되지 않았다는 것이 발명자에 의해 보여졌다 (실시예 단락을 참조한다). 사실상, 두 용액의 상황에 맞는 주사는, 즉각적인 겔화를 일으키는, 두 유동물의 더 빠르고 보다 균질한 혼합을 허용한다.
본 발명의 히드로겔의 상이한 구성성분은 적어도 약 12 개월 내지 약 24 개월 동안 저장할 수 있다. 바람직한 저장 조건 하에서, 처음 사용하기 전에, 제형물을 밝은 빛을 피해 (바람직하게는 어둠 속에서), 냉장 온도 (약 2 내지 8 ℃)에서 보관해야 한다.
본 발명의 히드로겔은 주사 동안 제조될 필요가 있다.
본 발명의 히드로겔의 용액 1이 동결-건조 형태일 때, 이것을 사용 전에 재구성해야 한다. 이것을 바람직하게는 멸균 조건 하에서 용매, 예컨대 물 또는 식염수 (예를 들어, 주사용 0.9 % w/v 염화나트륨)와 함께, 사용 전, 즉, 용액 2와 합쳐지기 (또는 혼합) 전, 및 따라서 주사 전에 재구성한다. 재구성 후, 부피는 바람직하게는 동결건조 전과 동일하며, 예컨대 약 0.5 mL 내지 5 mL, 보다 바람직하게는 약 0.5, 1 또는 2 mL이다. 시스템을, 예를 들어 30 분 동안, 이것이 주사를 위한 준비가 되기 전에, 용해되고 균질화해야 한다. 상기 용액을 바람직하게는 재구성 한 시간 내에 사용해야 한다.
본 발명은 특히 단일 용도에 대해, 약제학적 또는 수의과적 용도에 적절한 FGF-18을 포함하는 균질한 히드로겔을 제공한다. 본 발명에 따른 FGF-18을 포함하는 히드로겔은, 연골 복구 개선 또는 연골 장애, 예컨대 골관절염 또는 연골 부상의 치료를 위한 투여에 사용할 수 있다.
이들 균질한 히드로겔은 주사 및 대안적인 전달 시스템에 사용하기에 적절하다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제형물은 관절내 (i.a.) 주사용이다. 이들을 결함 내로 직접적 주사에 의해 투여할 수 있으며, 여기서 겔은 바람직하게는 동일계 내에서 형성된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 관절내 투여를 엉덩이, 무릎, 팔꿈치, 손목, 발목, 척추, 발, 손가락, 발가락, 손, 어깨, 늑골, 견갑골, 대퇴부, 정강이, 발꿈치 및 척추의 뼈점에 따른 관절로부터 선택되는 관절에서 수행한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 관절내 투여를 엉덩이 또는 무릎의 관절에서 수행한다.
다음의 실시예가 본 발명의 제형물 및 히드로겔의 제조를 추가적으로 설명하기 위해 제공된다. 본 발명의 범위를 단지 다음의 실시예로 구성되는 것으로 해석해선 안 될 것이다.
[도면의 간단한 설명]
도 1: 플라시보 (FGF 없음), 알지네이트 용액 중 FGF-18 54 mcg/mL가 있는 (FGF (54) 있음), 및 알지네이트 용액 중 FGF-18 540 mcg/mL가 있는 (FGF (540) 있음) 3 중량% 알지네이트-기반 겔에 대해 수행한 주파수 스윕(frequency sweep) 시험.
도 2: 4 중량% 알지네이트 기반 겔에 대해 수행한 주파수 스윕 시험: 플라시보 (FGF 없음), 알지네이트 용액 중 FGF-18 54 mcg/mL 있음 (FGF (54) 있음), 및 알지네이트 용액 중 FGF-18 540 mcg/mL 있음 (FGF (540) 있음).
도 3: 3 중량% 파마그레이드(PharmaGrade, PG) 알지네이트 기반 겔에 대해 수행한 주파수 스윕 시험: 플라시보 (FGF 없음), 알지네이트 용액 중 FGF-18 54 mcg/mL 있음 (FGF (54) 있음), 및 알지네이트 용액 중 FGF-18 540 mcg/mL 있음 (FGF (540) 있음).
도 4: 4 중량% PG-알지네이트 기반 겔에 대해 수행한 주파수 스윕 시험: 플라시보 (FGF 없음), 알지네이트 용액 중 FGF-18 54 mcg/mL 있음 (FGF (54) 있음), 및 알지네이트 용액 중 FGF-18 540 mcg/mL 있음 (FGF (540) 있음).
도 5: 비-PG 나트륨 알지네이트로 제조한, 활성 (FGF 있음) 알지네이트-기반 겔 및 후보 플라시보 (FGF 없음)의 팽창률.
도 6: 비-PG 나트륨 알지네이트로 제조한, I 형 콜라겐이 없는 활성 (FGF 있음) 알지네이트-기반 겔 및 플라시보 (FGF 없음)의 팽창률.
도 7: PG 나트륨 알지네이트로 제조한, 활성 (FGF 있음) 알지네이트-기반 겔 및 후보 플라시보 (FGF 없음)의 팽창 정도
도 8: 2 mcg/mL의 I 형 콜라겐을 갖는 4 중량% 알지네이트 겔에서의 FGF-18 생물검정(bioassay)
도 9: 0, 1 또는 2 mcg/mL의 I 형 콜라겐 및 FGF-18 54 mcg/mL를 함유하는, 3 중량% 또는 4 중량%에서의 중합체 액체 용액으로부터의 알지네이트-기반 겔의 SEM 이미지 (100x).
도 10: (a) 72 시간 동안 HTB94 세포로 인큐베이션 후의, 2 μg/mL의 I 형 콜라겐을 갖는 알지네이트-기반 겔, 및 (b) 144 시간 동안 HTB94 세포로 인큐베이션 후의, 콜라겐이 없는 알지네이트-기반 겔에 대해 CLSM에 의하여 얻은 3D 이미지의 단면도. 흰색은, 로다민(Rhodamine) B로 표지된 HTB94 세포. 우측: 겔의 상부; 좌측: 겔의 하부.
도 11: 서열 1에 대응하는 인간 FGF-18의 서열 (a) 및 서열 2에 대응하는 스프리퍼민의 서열 (b)
도 12: 정상 저장 조건 (5 ℃), 가속 조건 (25 ℃) 및 스트레스 조건 (40 ℃)에서의 안정성의, 3-개월의 시간에 걸친 동결-건조(FD) 제형물의 pH 변화
도 13: 정상 저장 조건 (5 ℃), 가속 조건 (25 ℃) 및 스트레스 조건 (40 ℃)에서의 안정성의, 3-개월의 시간에 걸친 동결-건조(FD) 제형물의 % 수분 함량의 변화
도 14: 정상 저장 조건 (5 ℃), 가속 조건 (25 ℃) 및 스트레스 조건 (40 ℃)에서의 안정성의, 3-개월의 시간에 걸친 동결-건조(FD) 제형물의 FGF-18 함량 변화
도 15: 정상 저장 조건 (5 ℃), 가속 조건 (25 ℃) 및 스트레스 조건 (40 ℃)에서의 안정성의, 3-개월의 시간에 걸친 동결-건조(FD) 제형물의 알지네이트 함량 변화
도 16: a) 정상 저장 조건 (5 ℃), 가속 조건 (25 ℃) 및 스트레스 조건 (40 ℃)에서의 안정성의, 3-개월의 시간에 걸친 동결-건조(FD) 제형물의, 10 내지 50 초-1의 전단 속도 내에서 평균 ± 표준 편차로 계산된, 고유 점도 변화. 도 16b: 0 시간 및 3-개월 후의 정상 저장 조건 (5 ℃), 가속 조건 (25 ℃) 및 스트레스 조건 (40 ℃)에서의 안정성의, 동결-건조 제형물(FD)의 고유 전단 점도에 대한 전단 속도의 영향
도 17: 기계적 성질 평가. 도 17a: 정상 저장 조건 (5 ℃), 가속 조건 (25 ℃) 및 스트레스 조건 (40 ℃)에서의 안정성의, 3-개월의 시간에 걸친 동결-건조(FD) 제형물의 저장 모듈러스(modulus)(G') 변화. XXX. 도 17b: 제로(zero) 시간 및 3-개월 후의 정상 저장 조건 (5 ℃), 가속 조건 (25 ℃) 및 스트레스 조건 (40 ℃)에서의 안정성의, 동결-건조 제형물(FD)에 대해 수행한 주파수 스윕 시험
서열의 설명
서열 1: 천연 인간 FGF-18의 아미노산 서열.
서열 2: 재조합 말단절단된 FGF-18 (스프리퍼민)의 아미노산 서열.
실시예
재료
본 실시예의 재조합 말단절단된 FGF-18 (trFGF-18 또는 스프리퍼민)은 출원 WO2006/063362에 기술된 기술에 따라, 대장균에서의 발현에 의해 인 하우스로 제조되어 왔다. 다음의 실시예에서, 스프리퍼민 및 FGF-18은 혼용된다.
실시예에 사용한 다른 주된 물질은 다음과 같다:
- 나트륨 알지네이트, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) A2158,
- 나트륨 알지네이트, FMC 바이오폴리머 켈톤(BioPolymer Keltone) LVCR (파마그레이드 알지네이트),
- 수크로스, 머크(Merck) 1.07653.9029
- 인간 피부의 I 형 콜라겐, 칼바이오켐(CalbioChem) 234149, 및 칼바이오켐 234138
- 염화칼슘 (CaCl2), 머크 1.02382.0250,
- D-(+)-글루콘산 δ-락톤, 시그마 알드리치 G4750
- 키토산 75 % DD HMW, 시그마 알드리치 419419,
- 키토산 95 % DD LMW, 파라벨리(Faravelli) 43000,
- 키토산 95 % DD HMW, 헤페 메디칼(Heppe medical) 24711,
다음의 실시예는 두 종류의 히드로겔, 즉, 이온-반응성 및 온도-반응성 히드로겔의 제조 및 특징을 보고한다. 온도-민감성 히드로겔이 온도 민감성 다당류로 잘 알려진 키토산으로 특히 제조되는 반면 (문헌 [Tomme et al., 2008]), 이온-반응성 히드로겔은 2가 양이온의 존재 하에서 히드로겔을 형성할 수 있는 나트륨 알지네이트로 특히 제조된다. 본 연구에 사용한 두 중합체는 생체적합 자연 다당류이다.
본 단락에서 겔화 과정 전의 제형물 및 겔이 형성된 후의 제형물을 명확히 구별하기 위하여, 전자는 "액체 용액", 및 후자는 "겔"로 각각 지칭하였다.
방법
겔화 시간 및 온도
겔화 시간을 "틸팅(tilting) 시험"에 의해 모든 제형물에 대해 평가하였다. 겔을 3 cm 직경의 유리 페트리 디쉬에서 제조하였으며 상이한 온도에서 인큐베이션 하였다. 소정의 시간 간격에서, 페트리 디쉬를 틸팅하였으며 겔화 시간은 제형물이 아무 유동을 보이지 않는 시간으로 간주하였다.
기계적 성질
히드로겔의 유동학적(rheological) 성질을 원뿔-평판 형상 (1° 기울기)의 40 mm 직경의 AR 2000 레오미터 (TA 인스트루먼트(Instrument))를 사용하여 조사하였다. 시험 도중 샘플이 미끌어지는 것을 피하기 위해, 두 플레이트에 연마 디스크를 적용하였다. 모든 샘플의 두께는 샘플 부피에 따라 약 1 내지 2 mm에 포함되었다. 측정 동안 용매의 증발을 방지하도록 수분-포화된 대기를 유지하기 위해 용매 트랩을 사용하였다.
히드로겔의, 패트리 디쉬 안의 이들의 원래 액체 용액으로부터의 완전한 팽창 후, 샘플을 레오미터에 놓았으며 37 ℃에서 2 분간 평형화하였다. 이후, 샘플을 0.1 내지 100 rad/초의 주파수 범위에 걸친 주파수 스윕 시험 하에서 시험하였다. 진동(oscillatory) 스트레스를 10 Pa로 설정했으며, 저장 G', 및 손실 G'' 모듈러스를 주파수의 함수로서 기록하였다.
팽창 거동 분석
히드로겔의 전형적인 성질 중 하나는 이들의 친수성 속성으로 인한 수성 용액 존재 하에서의 이들의 팽창 능력이다. 겔의 팽창 거동을 평가하기 위해, 이들을 모의 활액(MSF) 용액에 담갔으며 시간에 걸쳐 칭량하였다. 실험을 바닥에 0.4 μm 다공성 막을 갖는 행잉 인서트(hanging insert)를 구비한 12-웰 플레이트에서 세 번 수행하였다.
오직 알지네이트 겔만을 본 시험을 위해 선택하였다. 겔을 5 mL 바이알에서, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 제조된 400 μL의 중합체 액체 용액 및 200 μL의 염화칼슘 용액을 혼합함으로써 겔을 제조하였으며, 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 겔을, 이후, 미리 칭량한 빈 인서트로 옮겼다. 겔 샘플을 가진 인서트를 칭량하였으며 대응하는 중량을 0 시간에서의 기준 중량으로 간주하였다. 겔을 함유하는 인서트를 플레이트에 놓았으며 1.5 mL의 MSF를 웰에 첨가하여, 인서트의 다공성 바닥이 용액에 담가졌는지 확인하였다. 플레이트를 증발 현상을 피하기 위해 파라필름으로 잘 밀봉했으며 37 ℃에서 궤도 진탕기에서 인큐베이션하였다. 소정의 시간 지점에서, 겔을 함유하는 인서트를 웰에서 제거하였다. 과량의 MSF를 여과지를 갖는 다공성 바닥을 블로팅(blotting)함으로써 제거하였으며, 이후, 겔을 갖는 인서트를 칭량하였다. 웰 안의 용액을 수집하고, -80 ℃에 저장하였으며 신선한 MSF로 교체하였다. MSF의 조성물은: PBS 완충액 1X pH 7.3, F68 (즉, 폴록사머 188) 0.25 g/L, 인간 혈청 알부민 (HSA) 1 중량%, 펜스트렙(PenStrep) 1 중량%였다. 사용 전에, MSF를 0.22 μm 필터를 통해 여과하였다. 결과를 팽창률, 즉, t 시간에서의 무게 및 t=0에서의 무게비로 보고하였다.
주사 전자 현미경 ( SEM ) 분석
겔이 형성되면, 주사 전자 현미경 기술을 중합체성 네트워크의 3차원 구조를 분석하기 위해 사용하였다. 활성 알지네이트-기반 겔을 3 cm 직경의 유리 페트리 디쉬에서, "겔화 시간"에 관련된 문단에서 보고된 절차를 따라, 1 mL의 중합체 액체 용액 및 0.5 mL의 칼슘 용액을 혼합하여 제조하였다. 이후, 얻어진 겔을 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 6 샘플을 둘 다 0, 1 또는 2 μg/mL의 I 형 콜라겐 중 하나를 함유하는 3 중량% 또는 4 중량% 농도의 알지네이트에서의 중합체 액체 용액으로부터 출발하여 제조하였다. 이후 겔을 48 시간 동안 동결건조하였다. 동결-건조 주기는 동결 단계, 1차 건조 단계 및 2차 건조 단계를 포함하였다. 동결 단계 동안, 실온에서부터 - 45 ℃로의 온도 램프(temperature ramp)를 적용하였고, 4 시간 동안 -45 ℃의 단계가 이어졌다. 1 ℃/분의 속도로 50 mTorr의 압력에서 -45 ℃에서부터 -10 ℃로의 온도 램프를 적용할 때, 이것은 1차 건조 단계로 이어졌으며, 24 시간 및 30 분 동안 -10 ℃ 및 50 mTorr의 단계가 이어졌다. 2차 건조 단계는 두 단계를 포함하였다: 1 ℃/분의 속도로 50 mTorr의 압력에서 -10 ℃에서부터 21 ℃로의 제1 온도 램프를 적용하였고, 12 시간 및 30 분 동안 21 ℃ 및 50 mTorr에서의 단계가 이어졌으며, 이후, 1 ℃/분의 속도로 50 mTorr에서 21 ℃에서부터 37 ℃로의 제2 온도 램프를 적용하였고, 6 시간 동안 37 ℃ 및 50 mTorr의 단계가 이어졌다. 최종적으로, 실온 및 대기압에 도달하였다. 이후, 각 샘플을 염색하였고 SEM에 의해 분석하였다.
시험관 내(In vitro) 방출 연구
팽창 시험에 사용된 동일한 샘플을 시험관내 방출 시험에 대해서도 또한 분석하였다. 특히, -80 ℃에 저장된 (상기 "팽창 거동 분석" 단락에 기술된 바와 같은) 수집한 상을 HPLC에 의해 분석하였다. 선택된 샘플을 또한 바이아코어(Biacore)에 의해 분석하였다 (데이터 미도시).
동물 모델에서의 생체 외(Ex vivo ) 시험
알지네이트 제형물의 실제 무릎 관절에 부착하는 능력을 조사하도록 생체 외 동물 모델에서의 예비 시험을 수행하였다. 시험한 제형물은 실시예 9에서 보고된, 세포 침습 분석의 결과에 기초하여 선택하였다. 특히, 사용된 모델은 소의 무릎을 구성하는 정강이골의 상부 및 대퇴골의 하부로 구성되어 있다. 미세골절을 수행할 때 외과 의사에 의해 만들어지는 구멍을 모방하기 위해, 코어러(corer)를 사용하여 무릎의 두 부위에 1 cm 깊이 및 0.4 cm 직경의 구멍을 내었다. 이후, 이 구멍을, 겔 중에 1.3 μg/mL I 형 콜라겐 및 36 μg/mL FGF-18의 최종 농도를 함유하는 4 중량% 알지네이트 제형물로 채웠다. 하나는 알지네이트 용액을 함유하고 하나는 칼슘 용액을 함유하는 두 상이한 시린지를 연결하기 위해 주입용 밸브를 사용하여 시험을 수행하였다. 두 시린지의 플런저(plunger)를 동시에 밀어 밸브가 용액을 혼합할 수 있도록 하였다. 생체 내(in vivo)에서, 상이한 가능한 실제 시나리오에서의 투여 가능성을 입증하도록, 제형물을 구멍에 거꾸로 및 수직 위치 모두로 주사하였다. 37 ℃에서 약 2 시간의 인큐베이션 후, 겔을, 육안 검사로 그의 상태를 입증하기 위해 구멍으로부터 제거하였다.
시험관 내 생물검정
기저 히드로겔의 형성을 허용하도록, 발광측정법(luminometry) (분석 플레이트)을 위한 96-웰 플레이트를 50 μL/웰의 나트륨 알지네이트 4 % 용액 및 25 μL/웰의 CaCl2 10 mg/mL 용액으로 코팅하고, 30 분 동안 37 ℃, 5 % CO2에서 인큐베이션하였다.
96-웰 플레이트 (마스터 플레이트)에 160 μL/웰의 분석 매질을 B 열부터 H 열까지 분배하였다. 이후, FGF-18 참고 표준 및 샘플을 분석 매질에서 10 μg/mL로 희석하였으며, 컬럼의 군을 복제물로 간주하여 A 열에 3 배 (100 μL/웰)를 첨가하였다. 멀티-채널 피펫을 사용하여, 1:5의 연속적 희석을 A 열의 웰에서부터 H 열의 웰까지, 40 μL를 A 열부터 H 열까지 옮기면서 수행하였다.
마스터 플레이트로부터 25 μL/웰의 FGF-18 참고 표준 희석물을 기저 히드로겔 코팅된 96-웰 플레이트 (분석 플레이트)로 옮겼으며 1 시간 동안 37 ℃ 및 5 % CO2에서 인큐베이션하였다.
10.000.000 SM에서 75 cm2 플라스크에 시딩(seeding)되고 분석 전 24 시간 동안 영양 고갈 상태에서 배양된, BaF3/FGFR3c 세포 배양물을 분석 매질에서 800.000 세포/mL로 희석하고 이후 25 μL/웰을 (20.000 세포/웰) FGF-18 및 기저 히드로겔 코팅된 플레이트에 대한 각 웰에 37 ℃ 및 5 % CO2에서 48 시간 동안 첨가하였다.
플레이트를 천천히 혼합하고 방출된 발광을 발광 계수기로 판독하여, 증식을 나타내도록 100 μL/웰의 "ATP라이트(ATPlite) 1 단계" 시약을 첨가하였다.
실시예 1: 예비제형물
예비제형화 작업 동안, 관절내 주사에 대해 허용가능한 삼투질 농도(osmolality) (표적: 350 mOsm/Kg)를 갖는 수성 용액을 얻기 위하여 알지네이트 또는 키토산을 다른 부형제와 혼합하였다. 이후, 액체 용액을 이들의 겔화 시간 및 온도에 대해 시험하였다. 5 분 내에 및/또는 약 37 ℃ 온도에서 히드로겔을 형성할 수 있는 제형물을 상이한 농도의 FGF-18로 더 제형화하였다 (데이터 미도시).
실시예 2: 이온-반응성 겔 ( 알지네이트 )의 제조
일반론
중합체 사슬 사이에서 가교결합제(cross-linking agent)로 작용하는 2가 양이온, 예컨대 Ca2 +의 존재 하에서와 같이, 나트륨 알지네이트를 사용해 이온-반응성 겔을 얻었으며, 이것은 히드로겔을 일으키는 중합체성 네트워크를 형성할 수 있다. 제형물은, 하나는 중합체를 함유하고 다른 하나는 이온을 함유하는 두 용액으로 구성된다. 함께 혼합하면, 용액은 겔을 형성한다.
칼슘 용액은 플라시보 및 활성 겔에 대해 동일했으며 밀리큐 물(milliQ water) 중 10 mg/mL의 농도의 염화칼슘 CaCl2의 용액으로 구성되었다. 중합체 액체 용액에서, 알지네이트에 더하여, I 형 콜라겐 및 활성 분자 (본원에서, 스프리퍼민), 뿐만 아니라 삼투질 농도 값 조정을 위한 수크로스를 첨가하였다. 플라시보 중합체 액체 용액을 다음과 같이 제조하였다: 밀리큐 물 중 70 mg/mL의 농도의 수크로스 용액을 제조하였으며, 교반 하에서, 3 중량% 또는 4 중량% 농도로 나트륨 알지네이트를 용해하는 데에 사용하였다. 중합체 액체 용액 중의 각각 1 μg/mL 또는 2 μg/mL의 콜라겐 농도를 얻기 위하여, 알지네이트가 용해하면, 염산에 용해되고 밀리큐 물에 30 μg/mL 또는 60 μg/mL의 농도로 희석된 I 형 콜라겐 용액을 교반 하에서 첨가하였다. 활성 중합체 액체 용액의 제조를 위해, 3 중량% 또는 4 중량% 농도의 알지네이트를 54 μg/mL 농도의 FGF-18 벌크를 함유하는, 밀리큐 물 중 70 mg/mL 농도의 수크로스 용액과 용해시켰다. 이후, 플라시보에 대해 보고된 동일한 절차를 I 형 콜라겐의 첨가에 대해서 수행하였다. 중합체 액체 용액을 칼슘 용액과 2:1 (v:v)의 비로 혼합함으로써 겔을 제조하였다. 추가적인 특징분석 전에, 겔을 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
플라시보 제형물의 예비 스크리닝:
생리학적 이온량이 겔화 과정을 촉진하는 데에 충분하지 않음을 시험한 뒤, 2가 양이온 Ca2 +을 가교결합제로서, 염화칼슘의 형태로 선택하였다. 원하지 않는 칼슘침착 현상에 잠재적 책임이 있는 칼슘의 사용을 피하기 위해, 염화마그네슘을 또한 시험하였으나, 이 시도는 덜 성공적이었다.
이후, 가능한 제형물의 스크리닝을 수행하였으며, 예비 플라시보 제형물을 선택하였다. 상이한 파라미터, 예컨대 알지네이트 농도, CaCl2 농도, 중합체 및 칼슘 용액의 부피비, 겔화 지연제로 사용되는 다른 부형제, 예컨대 D-(+)-글루콘산 δ-락톤의 존재, 또는 생리학적 조건을 더 잘 모방하기 위해 PBS에 첨가되는 HSA를 스크리닝 동안 고려하였고 변화시켰다. HSA 또는 D-글루콘산의 존재가 얻어진 겔에 현저한 효과를 갖지 않음을 발견하였으며, 따라서 유용하지 않은 구성성분의 첨가를 피하기 위해 이들을 폐기하였다.
시험한 값 중 최적의 알지네이트 농도는 2.5 중량% 내지 4.5 중량% 및, 특히 3 중량% 또는 4 중량%라는 것을 또한 관찰하였다. 실제로, 더 낮은 알지네이트 농도, 즉 1 중량% 또는 2 중량%는, 완전한 겔 형성이 나타나지 않았으므로 적용할 수 없었다. 다른 한편으로는, 너무 높은 알지네이트 농도 (5 중량%)는 매우 점성이고 매우 다루기 어려운 중합체 액체 용액을 가져온다.
선택한 예비 플라시보 제형물은 2:1 (v:v) 비의, 물 중 3 중량% 농도의 알지네이트의 액체 용액 및 PBS 중 10 mg/mL 농도의 CaCl2의 칼슘 용액으로 구성된다.
FGF -18의 첨가
활성 제형물을 얻기 위해, 두 용액에의 FGF-18의 첨가에 대한 시험을 수행하였다. 다음의 모든 시험에서, 두 용액의 비를 2:1 vol/vol의 알지네이트 용액 대 칼슘 용액으로 일정하게 유지하였다. 알지네이트 용액에의 FGF-18의 첨가는 육안 검사로 탐지되는 침전 현상을 야기하였다. 가능한 용액으로서, 알지네이트를 0.25 g/L의 F68 계면활성제를 함유하는 PBS 완충액에 용해시켰다. 그러나, 침전이 여전히 발생했다. 이 쟁점을 극복하기 위하여, FGF-18을 알지네이트의 용해 전에 완충액에 첨가하였다. 본 방법에서, 중합체 용액 중의 침전을 피하고 단백질을 균일하게 분포시켰지만, 얻어진 겔의 물리적 일관성은 물에서 제조한 플라시보에 비해 저하된 것으로 보였다. 이에 더해, 겔 형성 후 잔여 액체상을 분석하자 미시적 침전이 발견되었다. 추가적인 조사는 인산칼슘의 형성을 가져오는 경향이 있는 CaCl2 및 PBS 간의 상호작용에 의해 야기된다는 것을 증명하였다. 이런 이유로, PBS를 중합체 액체 용액 및 칼슘 용액 모두로부터 제거하였으며, 오직 밀리큐 물만을 용매로서 사용하였다.
제형물의 최적화
더 치밀한 메쉬 크기의 겔을 얻을 목적으로, 알지네이트 농도를 4 중량%까지 증가시키는 것을 고려하였다. 이것은 재료에 생체 내에서 더 오래 견디고 캡슐화된 단백질의 더 긴 보존을 부여하는 능력을 준다. 잠재적 부가 작용을 줄이도록 칼슘 함량의 최소화를 또한 조사하였으며: 모든 다른 파라미터를 일정하게 유지하는 겔을 얻는 데에 요구되는 최소량은 4 mg/mL로 밝혀졌다. 칼슘 및 중합체 용액의 혼합이 즉각적인 겔 형성을 야기하므로, 최종 제형물의 pH 및 삼투질 농도를 측정하는 것은 가능하지 않았다. 따라서, 중합체 액체 용액의 삼투질 농도를 수크로스 70 mg/mL를 사용하여 ~300 mOsm/kg의 값으로 조정하였다. 이 첨가는 잔여 액체상이 수크로스의 부재 하에서 관찰되지 않는, 겔 형성의 변경을 야기하였다. 수크로스가 알지네이트 또는 칼슘과 상호작용함으로써 겔 형성에 개입한다고 가정하였다. 따라서, 칼슘의 농도를 잔여 액체 및 침전물 없는 겔의 형성을 가져오는 10 mg/mL로 다시 상승시켰다.
중합체 용액의 pH를 측정하여 7.0의 값을 얻었다. 칼슘 용액은 5.3의 pH 값 및 약 170 mOsm/kg의 삼투질 농도를 보였다.
중합체 액체 용액에 적재된 단백질 양을 54 μg/mL로 설정하였다.
최종적으로, 문헌 [Rayatpisheh et al. (2011)]에서 보고된 바와 같이, 겔의 세포 침습 능력을 개선하도록, I 형 콜라겐을 중합체 액체 용액에 첨가하였다. 문헌에 따라 (문헌 [Tsai et al., 1998]) 1 및 2 μg/mL의 두 가지 상이한 농도를 시험하였다.
이 예비 스크리닝 마지막에, 네 가지 후보 제형물을 선택하였다. 이들 모두에 대하여, 중합체 용액이 알지네이트 및 I 형 콜라겐 함량 모두에서 표 1에서 보여지는 바와 같이 상이한 반면 칼슘 용액을 밀리큐 물 중 10 mg/mL 염화칼슘으로 구성하였다.
모든 실험은 시그마 알드리치에서 제공된 쉽게 입수가능한 나트륨 알지네이트를 사용하여 수행하였다. 연구의 마지막 부분에서, 동일한 특징을 갖지만 파마그레이드(PG)로서 인증된 나트륨 알지네이트를 FMC 바이오폴리머 켈톤으로부터 구입하였다. 이후, 네 가지 후보 제형물을, PG 알지네이트를 사용하여 재-제조하였으며, 비-PG와 비교하여 육안 검사로 필적할 만한 결과를 얻었다. PG 및 비-PG 알지네이트로 얻은 겔을 또한 이들의 팽창 및 기계적 성질에 대해 비교하였다.
비록 실험을 염화칼슘으로 수행했지만, 유사한 결과가 임의의 추가적인 2양이온성 염, 예컨대 마그네슘 염, 구리 염, 또는 아연 염으로도 얻어질 수 있음이 예상된다.
실시예 3: 온도-반응성 겔 (키토산)의 제조
일반론
키토산 제형물의 스크리닝에 대해, 중합체 액체 용액의 제조는 세 가지 상이한 키토산을 사용한다: 고 분자량(HMW)을 갖는 95 % 탈아세틸화도(deacetylation degree, DD), 낮은 MW(LMW)를 갖는 95 % DD 및 높은 MW(HMW)를 갖는 75 % DD. 5 ℃ 또는 25 ℃에서 격렬한 교반 하에서 키토산을 0.1 N의 아세트산 용액에 서서히 첨가함으로써 중합체 액체 용액을 제조하였다. 중합체 액체 용액 중 1 중량%, 1.5 중량% 또는 2 중량%의 최종 중합체 농도를 갖도록 중합체 양을 계산하였다. 키토산이 완전히 용해되면, 밀리큐 물 중 10 mM, 100 mM 또는 500 mM 농도의 KH2PO4 용액을 교반 하에서 첨가하여, 중합체 액체 용액의 최종 농도가 1 mM, 10 mM 또는 50 mM를 갖도록 한다. 최종적으로, 최종 액체 용액의 pH를 6.0, 6.5 또는 7.0의 값으로 조정하기 위해 밀리큐 물 중 20 중량% 농도의 β-글리세로포스페이트(β-GP) 용액을 첨가하였다. 중합체 액체 용액 중 β-GP의 최종 농도는 허용된 제형물에 대해 0.5 중량% 내지 7 중량% 범위였다. 350 mOsm/Kg의 표적 삼투질 농도 값을 초과하거나 겔을 이미 실온에서 얻는 너무 많은 양의 β-GP가 필요했으므로 목적하는 pH 값에 도달하는 것이 항상 가능하지는 않았다. 적용가능할 경우, 중합체 액체 용액을, 이후 37 ℃에서 겔 형성까지 인큐베이션 하였다. 모든 스크리닝된 제형물의 삼투질 농도를 측정하였으며, 350 mOsm/Kg보다 높은 삼투질 농도를 갖는 제형물, 즉, 2.5 중량%보다 높은 최종 β-GP 농도를 갖는 제형물은 폐기하였다.
플라시보 제형물의 예비 스크리닝:
온도-반응성 겔은 국부적 환경의 온도를 변화시키면서 용액-겔화 (졸-겔) 전이를 겪는 중합체성 재료에 기반한다. 키토산은 온도 변화에 따른 졸-겔 전이를 겪을 수 있다고 보고되었으나, 이 과정은 중합체 분자량(MW), 이의 탈아세틸화도(DD), 용액 중의 중합체 농도, 온도, 중합체의 용해 동안의 혼합 시간 및 속도, 용액의 최종 pH 및 다른 부형제의 존재에 의해 매우 영향 받는다.
따라서, 상이한 가능한 조합의 철저한 스크리닝이 요구되었다. 키토산이 오직 산성 pH의 물에만 용해될 수 있다는 것이 주목할 만하다. pH의 증가는 이의 응집 및 침전을 야기한다. 이 쟁점을 극복하기 위한 한 방법은 용액 중의 키토산을 유지하면서 pH를 증가시키도록 β-GP를 사용하는 것이다.
연구는 시작부터 75 % DD를 갖는 HMW 키토산에 초점을 맞췄다. 여러 중합체 액체 용액을, 최종 키토산 농도가 1 중량% 내지 2.5 중량%로, 최종 β-GP 농도가 1.6 중량% 내지 50 중량% (1.6, 5, 5.6, 8, 30, 50 %)로 상이한 0.1 N 염산, 상이한 부형제, 즉 젤라틴, 글루코사민, 히알루론산, 히드록시-에틸 셀룰로스, 카르복시-메틸 셀룰로스, 트레할로스, 및 6.0 내지 7.0의 상이한 최종 pH 값에서 제조하였다. 이들 부형제는 겔 형성 유발에 있어서 역할을 한다고 보고되었다 (문헌 [Cheng et al., 2010; Schuetz et al., 2008; Yan et al, 2010]).
스크리닝된 제형물 중 오직 한 가지만 5 분의 37 ℃ 인큐베이션 후 37 ℃에서 겔을 형성할 수 있지만, β-GP의 양은, 문헌에서 그 값 초과에서 세포독성이 기록된 한계값으로서 보고된 (문헌 [Ahmadi et al., 2008]) 8 중량%보다 높다. 따라서, 다음의 모든 제형물을 이 한계를 고려하여 제조하였다. 스크리닝은 더 높은 DD 값을 갖는 키토산으로 계속 이동하였다. 제1 시험은 95 % DD를 갖는 LMW 키토산에 기반하였다. 중합체 용액을 항상 0.1 N 염산에서, 5 ℃ 또는 25 ℃에서 격렬한 교반 하에서 중합체를 용해시켜 제조하였다.
중합체의 완전한 용해 후, 다른 부형제를 첨가하였으며, β-GP는 오직 마지막에 첨가하였다. β-GP는 pH 값 증가를 일으키며, 이후, 겔화 과정을 촉진한다. 제1 시험은 오직 상대적인 농도의 상이한 조합의 키토산 및 β-GP에만 기반한 제형물에 초점을 맞추었다. 고농도의 키토산 (2 % 또는 3 중량%) 및 고농도의 β-GP (8 중량%)를 사용할 때, 겔의 형성이 이미 실온에서 발생하며, 일부 경우에서는 또한 5 ℃에서도 발생함을 관찰하였다.
구성성분 중 어느 하나의 농도를 감소시키면, 제형물은 액체로 남으며, 긴 37 ℃ 인큐베이션 후에도 마찬가지이다. 오직 한 경우에서만, 겔 형성이 나타났지만, 본 연구의 목적에 너무 긴 시간인 2 시간의 37 ℃ 인큐베이션 후였다. 따라서, 제형물을 개선하기 위한 부형제의 첨가가 의무적이었다. 히드록시-에틸 셀룰로스(HEC)를 가장 적당한 부형제로서 선택하였으며 추가적인 스크리닝을 수행하였다. 본 평가 동안, 키토산 농도는 1.5 중량% 내지 2 중량% 범위였으며 시작 HEC 농도는 0.5 중량%였지만, 이들 조건에서, 중합체 용액은 β-GP의 첨가 동안 만일 이것의 농도가 1.8 중량%를 초과했다면 심지어 실온에서 겔이 된다. 37 ℃에서 13 분의 인큐베이션 후 겔이 될 수 있는 액체 용액을 다음의 조성물과 함께 얻었다: 1.5 중량%의 키토산, 0.5 중량%의 HEC 및 1.7 중량%의 β-GP.
제형물의 최적화
본 제형물을 개선하기 위한 시도에서, 다음의 시험을 1.65 내지 1.7 중량%의 값으로 거의 일정한 β-GP의 농도, 1.5 중량% 내지 1.8 중량%로 변하는 키토산 농도를 유지하면서 수행하였으며 HEC의 양은 서서히 0.1 중량%까지 감소되었다.
여러 후보 제형물을 본 전략에 따라 선택하였다. 그러나, HEC 부형제가 세포독성인 것으로 보고되고, 다른 한편으로, 키토산의 존재 하에서의 겔화 과정 모듈화(modulation)를 일으킬 수 있는 오염물을 함유할 수 있음이 발견되었으므로 (문헌 [Hoemann et al., 2007]) 조사는 본 방향으로 계속되지 않았다. 이전의 실험에서 시험된 다른 부형제, 예컨대 젤라틴 또는 글루코사민은 긍정적인 결과를 주지 않았다.
분자량 및 DD가 다른 세 종류의 키토산 중합체: 75 % DD를 갖는 HMW 키토산, 95 % DD를 갖는 HMW 키토산 및 95 % DD를 갖는 LMW 키토산을 사용하여, 이후 최종 스크리닝 작업을 시작했다. 작업을 85 % DD를 갖는 LMW 키토산에 대해서도 또한 계획했으나, 연구 종결 시까지 재료가 입수되지 않았다. 본 작업에서, 각 키토산을 세 가지 고정된 농도, 1, 1.5 및 2 중량%로 시험하였으며, 중합체 용액을 6.0, 6.5 및 7.0의 최종 pH 값을 갖도록 제조하였다. 용액의 pH 값을 증가시키는 데에 사용된 β -GP의 양을 줄이기 위해, 중합체를 이전 실험에서 사용한 0.1 N HCl 대신, 0.1 N 아세트산에 녹였다. 최종 용액의 삼투질 농도를 또한 모니터링하였으며 ~350 mOsm/kg 값 미만으로 유지했다. 따라서, 목적하는 pH에 도달하기 위해, 너무 많은 양의 β-GP를 요구하고, 너무 높은 삼투질 농도 값을 또한 가져오는 제형물을 폐기하였다. 염의 존제가 겔화 과정에 긍정적인 기여를 할 수 있음이 보고되었으므로 (문헌 [Filion et al., 2007]) 이들 스크리닝 시험에서, 이온 강도의 기여를 또한 연구하였다.
나트륨 염이 단백질과의 가능한 상호작용 때문에 피해져야 하므로, KH2PO4를 선택하고 중합체 용액에 최종 농도 1 mM, 10 mM 또는 50 mM로 첨가하였다. 75 % DD를 갖는 키토산은 긍정적인 결과를 주지 않았으며 이것을 완전히 포기하였다. 95 % DD를 갖는 HMW 키토산도 긍정적인 결과를 주지 않았다: 고정 pH 값에 도달하기 위해, 1 중량%보다 높은 키토산 농도는 표적 삼투질 농도 값을 초과하는 너무 많은 양의 β-GP를 요구하였으며, 1 중량%의 제형물은 37 ℃에서 겔을 형성할 수 없었다. 두 가지 후보 제형물을, 이들이 37 ℃에서 졸-겔 전이를 겪으므로, 95 % DD를 갖는 LMW 키토산과 함께 선택하였으나, 이들 중합체 용액의 제조는 완전히 재현가능하지 않았다. 실제로, 겔 및 중합체 액체 용액의 육안으로 보이는 물리적 특징을 얻도록 요구되는 시간이, 중합체를 용해하는 데에 소모된 시간, 중합체 용해 동안 및 부형제의 혼합 동안의 혼합 속도, 및 최종적으로 제조된 용액의 온도 및 부피에 따라 현저히 달라지는 것을 관찰하였다.
본 결과의 큰 가변성이 본 중합체에 대한 연구의 중단 결정으로 이끌었다.
실시예 4: 겔화 시간 및 온도
본 작업에서 연구한 모든 제형물을 동일계 내에서 겔을 형성하는 것으로서 사용하도록 계획하였다. 따라서, 이온- 및 온도 반응성 겔 모두에 대해 중요한 요건은 빠른 겔화 시간이었다. 좋은 겔화 성질을 갖지만 그의 겔화 과정이 (주사를 허용하기에는) 너무 빠르거나 (재료를 느슨하게 하는 위험을 부담하지 않기에는) 너무 느리지 않은 제형물을 확인하는 것이 대단히 중요하다. 겔화 시간을 틸팅 시험에 의해 결정하였다: 용액을 거꾸로 뒤집었으며 겔은 액체의 유동이 관찰되지 않을 때 형성된 것으로 간주하였다.
이온-기반 제형물
알지네이트-기반 제형물의 경우, 겔화 과정은 칼슘 용액 농도 및 칼슘 및 알지네이트 용액의 상대비에 의해 영향 받는다. 먼저 알지네이트 용액을, 이후, 칼슘 용액을 첨가하여 가능한 한 두 용액을 균질하게 하도록 시도하여, 겔을 유리 페트리 디쉬에서 제조하였다. 만일 염화칼슘의 양이 충분하지 않았다면, 심지어 37 ℃에서 장시간 인큐베이션 했음에도 겔 형성이 관찰되지 않았을 것이다. 가교결합제 (칼슘)의 양을 증가시키고 중합체 용액을 조정하자: 칼슘 용액 비, 겔이 두 용액을 함께 혼합하자마자 거의 즉각적으로 형성되었다. 일부 경우에서, 남아있는 액체상이 관찰되었다. 37 ℃에서 인큐베이션 후, 액체의 총 소멸에 걸리는 시간을 겔화 시간으로 간주하였다.
겔화 시간은 5 분 내지 2 시간으로 다양하며, 일부 경우에서, 액체의 총 소멸에 도달하지 않는다. 겔화는 3 중량%보다 4 중량% 농도의 알지네이트에서의 중합체 액체 용액에서 더 빠르다. I 형 콜라겐의 첨가는 겔화 시간에 대해 아무런 영향을 보이지 않았다. 결과는 표 2에 요약되어 있다. 3 중량% 중합체 용액을 갖는 두 후보가 15 분 내에 완전한 겔화를 보이는 반면, 4 중량% 알지네이트 농도의 중합체 용액의 두 가지 후보 제형물은 5 분의 겔화 시간을 보였다.
중요하게, 두 용액의 동시기의 주사를 허용하는 시린지 연결기를 사용하여 겔이 형성될 때, 임의의 중합체 농도에서 남아있는 액체상이 관찰되지 않았다. 사실상, 두 용액의 상황에 맞는 주사는 즉각적인 겔화를 일으키는 더 빠르고 보다 균질한 두 유동물의 혼합을 허용한다.
비록 실험을 염화칼슘으로 수행하였지만, 유사한 결과가 임의의 추가적인 2양이온성 염, 예컨대 마그네슘 염, 구리 염, 또는 아연 염으로도 얻어질 수 있음이 예상된다.
온도-기반 제형물
온도-반응성 겔은 제조 및 취급 단계 동안 실온에서 액체이도록 설계되었으며, 주사 후 37 ℃ 생리학적 조건에서 겔이 된다. 시험은 틸팅 시험에 의해 온도의 함수로서의 겔화 시간을 모니터링하도록, 상이한 키토산-기반 제형물을 5 ℃, 25 ℃ 및 37 ℃에서 인큐베이션하여 수행하였다. 결과는 표 3에 요약되어 있다.
키토산 및 β-GP 농도에 따라서, 거동은 현저하게 바뀐다. β-GP가 지나치게 농축된 용액을 사용하자, 액체 용액의 제조 동안 겔화가 이미 실온에서 발생하였다. 이런 이유로, 성분의 농도를 변화시켜 제형물을 최적화하는 것뿐만 아니라 모든 성분을 5 ℃에서 용해 및 혼합하고, 이후, 액체 용액을 37 ℃에서 인큐베이션하는 것이 중요하다. 실시예 3에 기술된 바와 같이, 적절한 최적화 후, 15 분 뒤 37 ℃에서 겔 형성을 얻었으나, 본 결과를 재현할 수 없음이 밝혀졌다. 특히, 겔화 시간이 키토산을 용해하고 이것을 다른 구성성분과 혼합하는 데에 요구되는 혼합 속도 및 기간에 의해 영향 받는다는 것이 관찰되었다.
실시예 5: 기계적 성질
히드로겔은 높은 물 보유 용량을 갖는 친수성 중합체 네트워크로 만들어진 반-고체 재료의 군이다. 일반적으로, 히드로겔은 점성 액체 및 탄성 고체 사이의 중간적 기계적 특성 (점탄성 성질)을 갖는다 (문헌 [Anseth et al., 1996]). 이들의 기계적 성질을 표적 생체 내 환경을 닮은 조건 하에서 결정하고 측정하는 것이 중요하다.
동적 기계적 분석은 진동 스트레스 (전형적으로 전단)의 적용에 따라, 합쳐진 점성 및 탄성 반응을 반영하는 히드로겔의 점탄성 거동을 특징지을 수 있다. 점탄성 재료는 각각 동적 스트레스-스트레인 거동의 탄성적 및 점성적 기여의 척도를 주는 저장 모듈러스, G', 및 손실 또는 점성 모듈러스, G''을 특징으로 한다.
히드로겔은 G'>G"을 나타내고 G' 및 G" 모두 진동 주파수에 독립적인 점탄성 재료로서 유동학적 관점에서 정의되었다 (문헌 [Peppas et al., 2000]). 특히, G'이 높을수록, 히드로겔의 강도도 더 높아지며, G' 및 G"의 차이가 클수록 액체-유사 대 고체-유사 거동이 더 낮아진다. 본 단락에서, 발명자들은 주파수 스윕 시험을 수행함으로써 원뿔-평판 형상을 구비한 레오미터 (발명 단락을 참조한다)를 사용하여 알지네이트 히드로겔의 점탄성 성질의 조사를 보고하였다. 주파수 스윕 시험에서, 진동 전단 스트레스를 주파수의 범위로 적용한다 (0.1 내지 100 rad/초). 이후, G' 및 G"을, 대 주파수로 플롯팅하였다.
도 1은 상이한 알지네이트 용액 중의 콜라겐 함량 (0, 1, 2 μg/mL) 및 상이한 알지네이트 용액 중의 FGF-18 함량 (0, 54, 540 μg/mL)을 갖는, 3 중량% 알지네이트 겔에 관한 주파수 스윕 결과를 보여준다. 모든 샘플을 칼슘 용액 첨가 후 37 ℃에서의 30 분의 인큐베이션 후 분석하였다. 알지네이트 용액 중 540 μg/mL의 FGF-18으로의 측정을, 10 배 높은 단백질 농도가 재료의 내부 구조에 영향을 줄 수 있는지 조사하기 위해 수행하였다.
보이는 바와 같이, 모든 샘플은 G'>>G"을 나타내고 둘 다 각 주파수에 독립적인 겔의 전형적인 거동을 보였다. G' 값은 약 300 내지 400 Pa의 모든 샘플에 포함된다. 이러한 G'의 차이는 이들 재료의 탄성 반응의 상당한 차이를 표시하지는 않는다. 이것은 제형물 중의 낮은 콜라겐 농도 (1 또는 2 μg/mL)가 제로 시간에서 겔의 기계적 성질에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 게다가, 다음 단락에서 보여질 바와 같이, 이것은 인큐베이션에 따라 겔의 더 높은 안정성을 촉진할 수 있다.
FGF-18의 존재가, 알지네이트 용액 중의 54 또는 540 μg/mL에서, 재료의 기계적 성질에 영향을 미치지 않았음에 주목하는 것이 또한 중요하다. 사실상, 두 가지 상이한 단백질 농도에서의 플라시보 및 활성 겔 간의 현저한 차이 또는 경향이 확인될 수 없었다. 이것이 기질의 성질의 악화 없이 FGF-18을 광범위한 농도의 알지네이트 용액 중 단백질 (0 내지 540 μg/mL)로의 제형화를 허용하므로, 이것은 중요한 파라미터이다.
도 2는 대응하는 플라시보 및 콜라겐이 없는 플라시보인 4 중량% 알지네이트 후보에 대해 얻은 결과를 보여준다. 또한 이 경우에서, 모든 샘플은 G'>>G"을 갖고 둘 다 각 주파수에 독립적인 겔의 전형적인 거동을 보여준다. 다시, 콜라겐 및, 알지네이트 용액 중 54 또는 540 μg/mL의 FGF-18의 영향은, 모든 G' 값이 약 380 내지 500 Pa 사이에 있어, 가시적이지 않았다. 더 높은 농도의 알지네이트가 더 높은 가교결합 밀도, 따라서 탄성 모듈러스, G'를 일으킬 것이라고 기대할 수 있었다. 대신, 기록된 차이는 두드러지지 않았다.
게다가, 3 중량% 및 4 중량% 알지네이트 용액 모두에 첨가된 칼슘 용액이 동일하다는 사실을 강조하는 것이 중요하다. 이것은 3 중량% 알지네이트 용액이, 용액 중의 중합체 사슬의 재배열에 따라, 심지어 더 치밀한 메쉬를 가져올 수 있는 더 높은 상대 농도의 가교결합제에 노출되었음을 의미한다.
본 연구의 마지막에서, 파마그레이드(PG) 알지네이트를 입수할 수 있었다. 알지네이트의 순도가 겔 구조에 영향을 미치지 않았음을 보장하기 위하여, 주파수 스윕 시험을 또한 PG 알지네이트 기반 겔에 대해 수행하였다. 결과는 도 3 및 도 4에서 보여진다.
PG 알지네이트에 대해 얻은 결과는 비-PG 알지네이트로 얻은 것과 완벽하게 필적할 만하다. 유일한 차이는 둘 다 3 중량% 내지 4 중량% 겔 내에 있는 약간 더 넓은 결과의 분산이었다. 이것은 PG 및 비-PG 알지네이트의 제품 설명서가 동일한 사양을 보고한다는 사실에도 불구하고 원료의 분자량 분포에 있어서의 약간의 차이에 기인했을 수 있다.
게다가 다시, 3 중량% 및 4 중량% 시스템 내에서의 특정 경향 또는 괄목할 만한 차이를 관찰할 수 없었으며, 4 중량% 시스템에 대해 관찰된 약간 더 높은 G' 값이 또한 PG 원료에서도 확인되었다.
실시예 6: 팽창 거동
히드로겔 재료에 대해 평가되어야 하는 전형적인 파라미터는 액체의 존재하에서 이들의 팽창 또는 수축하는 능력이다. 시험은, 이것이 생리학적 활액과 접촉하게 될 생체 내 조건에 주사될 때의 재료의 거동을 예측하는 데에 사용하였다.
실시예 3에서 설명된 바와 같이, 키토산 제형물이 폐기됨에 따라 연구를 실시예 2에 따라 제조된 알지네이트-기반 겔에 대해서만 수행하였다. 따라서, 네 가지 후보 알지네이트-기반 겔을 37 ℃에서 MSF와 접촉하여 인큐베이션하였으며 이들의 거동을 30 일 동안 모니터링하였다 (방법 단락의 "팽창 거동 분석"을 참조한다).
도 5에서, 네 가지 후보 알지네이트-기반 겔의 1 개월 동안의 팽창 거동이 플라시보 및 활성 겔 모두에 대해 보고되어 있다. 기준으로서, I 형 콜라겐이 없는 동일한 겔을, 겔 구조적 특징에 대한 이것의 효과를 조사하기 위해, 또한 시험하였다. 이들 결과는 도 6에 보고되어 있다. 도 5 및 6 둘 다 비-파마그레이드 알지네이트 (비-PG)를 참조한다.
두 경우에서, 알지네이트의 농도가 더 높을수록, 팽창률이 더 높아진다. 이 거동은 명백하게 유동학적 측정으로 얻은 결과와 반대된다. 특히, 더 높은 중합체 농도는 결국, 통상적으로 더 낮은 수성 용액 흡수 능력과 연관되는 더 치밀한 네트워크를 형성한다. 또한, Ca2 +의 농도가 일정하게 유지되고, 따라서, 중합체 및 가교결합제의 비가 중합체 농도를 변화시킴에 의해 변화한다는 것을 고려해야 한다. 가교결합제의 더 낮은 이용가능성은 중합체가 가교결합되어 있지 않아 물이 쉽게 투과하도록 하는 영역을 형성하도록 할 수 있다. 이것은 3 중량% 및 4 중량% 알지네이트 후보 간의 팽창률 차이를 설명할 수 있으며 다음 단락에서 보여지는 SEM 사진에 의해 확인할 수 있다.
도 5 및 도 6의 비교는 I 형 콜라겐의 존재가 팽창 거동에, 특별히 동역학의 관점에서 영향을 미치는 것을 보여준다. 콜라겐의 부재 동안, 모든 겔은 약 15 일 동안 그들의 중량을 단조(monotonically) 증가시켰으며, 이후 평탄역에 도달하였고, 콜라겐의 존재는, 농도와 독립적으로, 사인형(sinusoidal) 경향을 가져온다. 콜라겐 존재 하에서 2 일 뒤에 도달한 제1 평탄역은 겔이 보유할 수 있는 최대 물의 양에 대응하는 평형 팽창을 표시하고 있다. 이 값은 콜라겐의 부재 하에서 대응하는 팽창률 값보다 낮았으며, 콜라겐의 첨가 후에 기대된 바와 같이, 더 단단한 겔 구조를 제시한다. 15 일의 인큐베이션 후의 후속적 팽창률 증가는 메쉬가 느슨해짐에 따라 결과적으로 일어나는 MSF 용액 흡수와 함께, 네트워크 부식 현상의 시작을 나타낸다. 이후, 제2 평탄역에 24 일 후 도달하며 1 개월의 관찰 기간의 마지막까지 유지되었다. 네트워크의 추가적인 부식은 완전한 부식이 발생할 때까지의 감소가 이어지는, 추가적인 중량, 따라서 팽창률, 증가를 가져오는 것으로 기대된다. 콜라겐의 부재 하에서 (도 6), 연속적인 팽창률 증가를 관찰하였으며 느린 부식이 이어졌다. 이 거동은 겔의 더 느슨한 구조에 기인한 물 흡수 및 동시기의 부식과 관련되는 경향이 있다.
언급한 바와 같이, 중합체 용액 중 1 또는 2 μg/mL의 I 형 콜라겐으로 얻은 겔 간의 차이는 기록되지 않았다.
흥미롭게도, 플라시보 및 활성 겔 간에도 또한 차이가 관찰되지 않았다. 이것은 겔 중 최종 36 μg/mL 농도의 FGF-18이 재료의 내부 구조에 영향을 미치지 않았음을 제시하였다. 실험을 이번에는 PG 알지네이트를 사용하여 제조한 동일한 제형물로 반복하였으며 결과는 도 7에 보고되어 있다.
보이는 바와 같이, 결과는 비-PG 알지네이트로 얻은 것과 완벽하게 필적할 만하며, 유일한 차이는 비-PG 재료에 비해 3 중량% 및 4 중량% 알지네이트 겔 팽창률 간의 더 낮은 편차였다. 실험을 50 일까지 예상한 거동, 즉, 느린 연속적인 부식을 나타내는 제2 평탄역 이후의 중량 감소를 보이는 4 중량% 겔에 대해 수행하였다.
실시예 7: 주사 전자 현미경 ( SEM ) 분석
겔이 형성될 때 재료의 미시적 구조를 조사하기 위해 SEM 이미지를 얻었다. 분석을 신선하게 제조되고, 이후 동결건조된 겔에 대해 수행하였다.
도 8에 나타나 있는, 두 중합체 농도에서의 I 형 콜라겐이 있는 것 및 없는 샘플의 비교는, 콜라겐이 3 중량% 알지네이트 겔의 미세다공성에 현저한 영향을 갖지 않으며 오직 1 또는 2 μg/mL의 콜라겐을 첨가했을 때 약간 더 단단한 구조를 보이는 4 중량%에 대해 약간의 효과를 갖는다는 것을 입증하였다.
현미경 사진으로부터, 두 재료 간의 다공성 차이가 명백하며, 4 중량% 알지네이트 겔이 3 중량%보다 더 큰 공동을 보인다. 이것은 다시 3 중량% 알지네이트 제형물 중의 가교결합제의 상대적 농도가 4 중량%의 경우보다 높다는 사실에 의해 설명할 수 있다. 이것은 3 중량% 겔의 더 치밀한 구조를 유도할 수 있다.
이들 이미지는 팽창 결과와 일치하며 기계적 성질 분석과 명백히 반대된다. 사실상, 4 중량% 겔 중에 나타난 더 큰 공동은 3 중량%에 비해 관찰된 더 높은 팽창 정도를 설명한다. 한편으로는, 4 중량%에 대해 관찰된 약간 더 높은 탄성 모듈러스, G'은, 큰 세공 내에서 비 가교결합되거나 느슨하게 가교결합된, 게다가, G'에 기여하는, 알지네이트 사슬의 존재에 의해 설명할 수 있다.
실시예 8: 시험관 내 방출 연구
시험관 내 방출 연구를, 고려되는 각 시간 지점에서의 각 웰의 수취 상을 수집하여 팽창 시험에 대해 상황에 맞게 수행하였다. 활성 알지네이트-기반 겔로부터 온 모든 샘플을 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 이에 더해, RP-HPLC로부터 얻은 결과의 확정을 밝히기 위한 시도로서, 선택한 샘플을 또한, 보다 구체적이고 민감한 분석 방법인 바이아코어에 의해 분석하였다.
이 실험을 시작하기 전에, 시험의 실행가능성을 평가하였다. 특히, 웰 플레이트 시스템에서의 FGF-18의 회수를 조사하였다. 사실상, 단백질이 상이한 플라스틱 재료, 예컨대 폴리스티렌, 및 막에 들러붙으려는 경향이 있음이 이전의 연구로부터 알려져 있다. 알려진 양의 유리 FGF-18의 회수를 상이한 실험 조건에서 평가하였다. F68 계면활성제의 존재 및/또는 FGF-18 또는 HSA의 농축된 용액으로의 웰의 전처리의 가능한 긍정적인 효과를 시험하였다. 실험을 인서트에 500 μg/mL 농도의 FGF-18 용액을 첨가함으로써 수행하였으며 각 웰에는 다음의 용액이 있다:
- a) PBS 중 1 중량%의 HSA 용액,
- b) PBS+F68 중 HSA 1 중량% 용액,
- c) 및 d)는 a) 및 b)와 같으나, 농축된 HSA 용액으로 웰을 전처리하였다,
- e) 및 f)는 a) 및 b)와 같으나, 농축된 FGF-18 벌크로 웰을 전처리하였다.
16 시간 동안 37 ℃에서의 인큐베이션 후, 웰 및 바스켓(basket)의 상을 분석하였으며 회수는 모든 샘플에 대해 약 75 %로 나타났다. 따라서, 회수가 필적할 만하므로 시험을 개선하려는 전략 중 어느 것도 현저한 긍정적인 효과를 갖지 않았다. 이후, 시험관 내 방출을, F68 0.25 g/L를 갖는 PBS 중의 HSA 1 중량% 용액을 수취 상으로서 사용하여 수행하였다.
실험을 30 일 동안의 인큐베이션 하에 겔을 두어 수행하였다. FGF-18은 HPLC 또는 바이아코어에 의해 수집된 분획 중 어느 것에서도 검출되지 않았다. 이것은 단백질이 관찰 기간 동안 겔 기질 내에 갇혀 있음을 제시한다.
이들 결과는 FGF-18 및 알지네이트 간에 발생하는 강한 상호작용을 고려하여 예상할 수 있다. 사실상, 두 분자의 구조를 고려할 때, 이온성 및 소수성 상호작용이 모두 발생하려는 경향이 있다. 이에 더해, FGF-18은 헤파린과 고에너지 2차 상호작용을 보이는 헤파린 결합 단백질이다. 알지네이트는 헤파린과 유사한 분자 구조를 갖는 자연 탄수화물이며, 따라서, 두 거대분자 간의 매우 강한 2차 상호작용이 일어나려는 경향이 있다.
이것을 확인하기 위해, 오직 HIC 또는 헤파린 코팅된 크로마토그래피 컬럼만이 알지네이트로부터 FGF-18을 분리할 수 있었음을 보여주는 분리 실험을 수행하였다.
실시예 9: 시험관 내 세포 침습 분석
주사 후 3D 구조를 생성할 수 있는 제형물 중의 FGF-18의 투여는, 알지네이트-기반 히드로겔의 경우와 같이, 활성 분자 (API)를 주사 부위에 국부화하려는 목적을 갖는다. 이와 동시에, 제형물은 성장하는 연골이 고정될 수 있는 스캐폴드를 생성한다. 이런 이유로, 선택된 알지네이트-기반 겔의 중요한 요건은 재료와 연골세포 세포의 양립가능성 및 세포에 의해 침습되는 능력이다. 따라서, 연구를 FGF-18이 적재된, 동일계 내에서 형성되는 히드로겔에 기반한 대안적인 제형물의 세포 침습, 세포독성 및 주화성 성질에 대해 수행하였다.
시험관 내 세포 침습 분석을, 연골세포 거동을 연구하는 데에 흔히 사용하는 두 가지 연골육종 세포주, ATDC5 뮤린(murine) 연골발생 세포주 및 CRL-7891 인간 연골육종 세포주로 수행하였다. 실험을 0, 1 또는 2 μg/mL의 I 형 콜라겐 및 54 μg/mL의 FGF-18을 함유하는 3 중량% 또는 4 중량%의 알지네이트 액체 용액으로부터 제조한 겔에 대해 수행하였다.
세포 침습을 24, 48, 72 및 144 시간의 인큐베이션 후 모니터링하였다. 겔을 웰로부터 제거하였으며 슬라이스를 절단하고 유리 위에 놓아 자이스(Zeiss) A-플랜 10x/0.25 대물 렌즈를 구비한 액시오버트(Axiovert) 200 현미경으로 관찰하였다. 본 방법에서, 겔 단면을 분석하고 세포를 상이한 침투 깊이 수준으로 국부화하는 것이 가능했다. 사진을 소프트웨어 액시오비젼(Software AxioVision) 4.2에 의해 캡쳐 및 처리하였다. 일부 샘플을 또한 제한된 데모 사용 기간 동안 이용가능한 FV10 올림푸스(Olympus)를 사용하는 공초점 레이저 스캐닝 현미경법 (confocal laser scanning microscopy, CLSM)에 의해 분석하였다. 이들 실험에 대하여, 분석 1 시간 전에 겔을 PBS 중 0.2 μg/mL 농도의 로다민 B 용액으로 처리하였으며, 웰 안의 매질에 첨가하였다. 로다민 B를 세포를 염색하는 데에 사용하였으며, 이후 553 nm의 레이저로 샘플을 여기시켜 가시화하였다.
콜라겐이 있거나 없는, 3 중량% 또는 4 중량%의 중합체 액체 용액을 갖는 알지네이트-기반 겔의 세포 침습을, 24, 48, 72 및 144 시간에서 모니터링 하였다. 각 시간 지점에서, 겔의 단면을 관찰하기 위해 겔 슬라이스를 절단하였다 (데이터 미도시). 제1 관찰은 알지네이트 기반 겔이 두 세포주에 독성이 없는 것으로 보이므로, 심지어 상이한 종 (생쥐 및 인간)으로부터 유래되었어도 필적할 만한 거동을 보이는 제형물의 세포와의 좋은 양립가능성이었다.
4 중량%의 알지네이트 겔을 갖는 제형물에서, 더 많은 세포 및 세포 클러스터가 겔 내부에서 발견되었다.
2 μg/mL의 I 형 콜라겐을 함유하는 4 중량%의 알지네이트 겔에 대해 상이한 거동을 관찰하였다. 다른 제형물에 비해 더 많은 세포가 겔을 침습하였다. 나아가, 세포는 클러스터를 생성하지 않았지만, 겔을 따라 단일 및 잘 분리된 세포로서 잘 분포되어 나타났다. 이들의 양상은 이들이 건강한 상태에 있음을 밝히는 것으로 보였다. 최종적으로, 이들이 시간에 따라 겔 기질 안으로 투과하는 것을 관찰하였다. 콜라겐 2 μg/mL가 있는 것 및 없는 4 중량%의 겔과 비교할 때, 침습이 콜라겐의 존재 하에서 더 빠르고 보다 균질함을 관찰하였다 (도 9를 참조한다). CLSM으로 수행된 분석은 겔 기질을 침습하는 세포의 능력을 확인하였다.
실시예 10: 동물 모델에서의 생체 외 시험
이들 알지네이트 제형물에 기반한 치료법은 미세골절 전략과 결합될 수 있다. 따라서, 겔의 이 기술과의 양립가능성을 증명하기 위해 생체 외 동물 모델에 대한 예비 연구가 요구되었으며, 이 목적을 위해서 소의 무릎을 사용하였다.
실험을 2 μg/mL의 I 형 콜라겐을 갖는 4 중량% 알지네이트 후보 겔에 대해 수행하였다. 이 겔을, 이것이 상기에 보여진 바와 같이 세포 침습의 관점에서 가장 유망한 결과를 보여주었으므로 다른 후보들 중에서 선택하였다.
미세골절 수술에 대해 예상되는 동일한 치수 (1 cm 깊이 x 4 mm 직경)를 갖는 정강이뼈 상부 및 대퇴골의 하부 모두에 구멍을 만들었다. 이후, 구멍을, 주사할 때에 알지네이트 용액 및 칼슘 용액을 혼합하는 시린지 연결기로 주사한, 후보 겔로 각각 채웠다. 이것은 임의의 적하(dripping) 현상 없이 즉각적으로 균질한 겔을 얻도록 허용한다. 주사를 거꾸로 및 수직 위치 모두에서 수행하여, 두 경우 모두에서 겔이 구멍 안에 남아있고 재료의 적하가 관찰되지 않았음을 확실히 하였다. 관절을 또한 진탕 및 빠른 움직임에 놓아, 겔이 구멍 안에 잘 고정되어 있음을 증명했으며 재료의 손실이 관찰되지 않았다. 이후, 주사된 겔을 갖는 관절을, 2 시간의 37 ℃ 인큐베이션 뒤 평가하였다: 겔은 여전히 구멍 전체를 채우고 있었고, 제거하자, 이것은 골절로부터 나온 피가 겔에 의해 흡수되었음을 의미하는, 약간 붉은 색으로 보였다.
이들 예비 결과는 미세골절 전략에서 알지네이트 제형물의 실현가능성을 제시한다.
실시예 11: 시험관 내 생물검정
방법 단락에 기술된 바와 같이 수행한 세포 증식 분석은, 겔에 갇힌 FGF-18이 도 10에서 보여진 바와 같이 명확한 용량-반응 곡선을 갖는 생물활성이라는 것을 보여주었다.
결론
임의의 중합체 침전 없이 pH를 조정하도록 β-GP의 첨가로 키토산으로부터 열-반응성 겔을 얻는 동안, 가교결합제로서 염화칼슘의 첨가에 따라 나트륨 알지네이트로부터 이온-반응성 겔을 얻었다.
알지네이트 또는 키토산에 기반한 제형물을 상이한 중합체 농도에서 시험하였으며 다른 부형제의 첨가를 제형물의 pH 및 삼투질 농도 및, 일부 경우에서, 겔화 과정을 유리하게 하기 위해 고려하였다.
겔화 시간 결과는 알지네이트-기반 겔이 키토산과 비교하여 극도로 빠르고 재현가능한 겔화를 나타냄을 보여주었다. 따라서, 알지네이트 겔을 추가적인 개발을 위해 선택하였다.
3 % 또는 4 중량% 알지네이트, 1 또는 2 μg/mL의 I 형 콜라겐, 수크로스 70 mg/mL 및 FGF-18 54 μg/mL를 함유하는 알지네이트 용액에 염화칼슘 10 mg/mL 용액을 첨가하여 형성된 네 가지 후보 겔 제형물을, 기계적 성질, 팽창, 시험관 내 방출 및 세포 침습의 관점에서 특징지어지도록 선택하였다. 알지네이트 용액 부피 대 칼슘 부피비는 2:1이었다.
후보 겔의 기계적 성질은 콜라겐 농도 또는 적어도 540 μg/mL 이하의 FGF-18 농도에 의해 영향 받지 않았다. 최종 겔의 특징을 악화시키지 않으면서 광범위한 농도로 이들 기질 중에서 FGF-18를 제형화하는 가능성을 허용하는, 히드로겔 중 FGF-18에 대한 표적 농도가 여전히 결정되지 않았으므로 이것은 매우 중요한 목적이다. 나타난 모든 값이 약 300 내지 500 Pa 사이에 포함되고, 4 중량% 겔에서 더 높은 값을 나타내는, 3 중량% 및 4 중량% 알지네이트 겔의 탄성 모듈러스, G'에서 주요한 차이가 관찰되지 않았다.
모든 후보 겔은 유사한 수화 및 열화 과정을 나타내는 동일한 팽창 프로파일을 보였다. 유일한 차이는 4 중량% 알지네이트 겔에서 약간 더 높은 절대값에 있었다. 이 결과는 이들 겔에 대한 더 높은 치수의 세공을 입증하는 SEM 현미경 사진과 일치한다.
15 일의 모의 활액에서의 37 ℃ 인큐베이션 후, 모든 후보는 중량 증가로 나타내는 제1 열화 과정을 보였다. 사실상, 네트워크의 초기 열화는 통상적으로 더 느슨한, 따라서 더 많은 양의 물을 수용할 수 있는 구조를 일으킨다. 1 개월 후, 연속적인 네트워크 열화는 느린 중량 손실로 나타나는 육안으로 보이는 겔 부식의 시작을 가져온다. 또한, 50 일의 관찰 후, 다공성 바스켓 (50 일에서의 팽창률 값) 내에 일부 겔의 존재로 나타난 바와 같이, 겔은 여전히 완전히 부식되지 않았다 (문헌 [Lo Presti C. et al., 2011]; 문헌 [Dang et al., 2011]).
세포 침습 분석을 개발하였다. 가장 유망한 세포 침습 결과를 보이는 겔 제형물은 알지네이트 4 중량% 및 콜라겐 2 μg/mL를 함유하였다. 이후, 이 제형물을, 겔의 부착 성질에 대한 생체 외 실험을 위해 선택하였다. 소의 무릎에 대해 수행한 이들 생체 외 실험은, 임의의 적하 없이 거꾸로 또는 수직 방향으로, 알지네이트 및 칼슘 용액에 대한 이중 주사기를 사용하여, 후보 알지네이트 겔을 주사할 수 있음을 보여주었다. 나아가, 겔은 미세골절 상황을 모방한 연골 구멍을 완벽하게 채우고 부착하는 것을 보여주었다 (데이터 미도시).
세포 증식 분석은 겔에 갇힌 FGF-18이 명확한 용량-반응 곡선을 갖는 생물활성임을 보여주었다. 50 일의 관찰 후 겔이 여전히 완전히 열화되지 않았고 시험관 내 방출 실험은 모의 활액으로 방출된 FGF-18의 임의의 증거를 보이지 않았으므로, FGF-18이 겔 내에 머물러 있을 것이라고 제시하며, 따라서 겔로 이주한 세포에 대한 장기간 작용에 대해 보다 효율적일 수 있을 것이다. 따라서 이들 결과는 유망하다.
실시예 12: 동결 건조 제형물
FGF18, 당 (수크로스) 및 I 형 콜라겐을 함유하는 중합체 액체 용액의 제조 후 (실시예 2를 참조한다), 용액을 바이알에 분배하였다. 각 바이알 (10 ml 피올락스 클리어(Fiolax Clear) 45x24, 포르마 비트룸(forma vitrum) 쇼트(SCHOTT))을 2 ml의 중합체 액체 용액으로 채웠다. 채운 모든 바이알을 동결건조 공정에 놓았다. 자세하게는, 공정은 다음의 단계를 예상한다:
- 생성물의 동결이 시작되는, 1 시간 동안 25 ℃부터 -40 ℃로의 냉각 단계
- 생성물이 동결된 채로 유지되는, 4 시간 동안 -40 ℃에서의 동결 단계
- 진공으로 압력의 급격한 강하가 있는, 진공 단계
- 30 분 동안 온도가 -40 ℃에서 -10 ℃가 되고 이후 10 시간 동안 -10 ℃에서 머무는, 제1 건조 단계
- 30 분 동안 온도가 -10 ℃에서 21 ℃가 되고 이후 34 시간 동안 21 ℃에서 머무는, 제2 건조 단계
- 16 분 동안 온도가 21 ℃에서 37 ℃가 되고 이후 20 시간 동안 37 ℃에서 머무는, 제3 건조단계.
동결건조 공정이 끝난 후, 바이알을 마개로 폐쇄하고 2 내지 8 ℃에서 저장하였다.
동결-건조 생성물은 주사로 사용하기 전에 재구성되어야 한다. 이것은 실온에서 평형화되어야 하며, 이후 2 ml의 WFI (주사용 물)를 바이알에 주사하였으며, 이후 케이크의 재구성을 촉진하도록 혼합 및 이동시켰다. 시스템을, 이것을 주사할 준비가 되기 전에, 30 분 동안 균질화 및 용해시켰다.
이후 동결-건조 제형물에 대해 상이한 3 가지 온도에서의 3-개월 안정성 연구를 수행하였다: 가속 안정성을 수행하기 위한 5 ℃, 25 ℃의 정상 저장 조건 및 40 ℃의 스트레스 조건. 2 ml의 물로 샘플을 재구성한 후, 분석을 0, 2, 4, 8 시간 및 12 주에서 수행하였다. 다음의 파라미터를 관찰하였다:
Figure pct00001
pH
Figure pct00002
수분 함량
Figure pct00003
FGF18 함량
Figure pct00004
알지네이트 함량
Figure pct00005
알지네이트 MW 분포
Figure pct00006
점성
Figure pct00007
기계적 성질
Figure pct00008
세포 침습 능력
이하 12 주까지의 주된 결과이다.
pH : 모든 세 가지 상이한 온도에서, 인큐베이션 시간에 걸쳐, 제형물의 pH 값의 현저한 변화가 기록되지 않았다. FD 제형물의 pH는 액체인 것보다 더 높았으나 (이것이 거쳤던 여과 및 동결건조 공정에 기인할 가능성이 가장 높다), 이것은 시간에 따라 변화되지 않았다. 도 12에 나타난 데이터는 제형물이 정상 저장 조건 하에서 12 주 이하까지 안정함을 제시한다.
수분 함량 : 잔여 수분 함량은 항상 허용 기준 (3 %) 내였다. 이 값은 이것이 25 ℃에서 12 주의 인큐베이션 기간 동안 약간 증가했으며, 40 ℃에서는 예상대로 이미 2 주 뒤에 훨씬 더 증가한 반면, 2 내지 8 ℃에서 저장된 제형물에 대해 일정했다. 데이터는 (도 13을 참조한다) 제형물이 정상 저장 조건 하에서 12 주 이하까지 안정함을 제시하였다.
FGF18 함량: 모든 세 가지 상이한 온도에서, 인큐베이션 시간에 걸쳐, 제형물의 FGF-18 함량 값의 현저한 변화가 관찰되지 않았으며, 54 μg/ml의 표적 농도보다 약간 낮은 총 함량을 가졌고, 상이한 제조 단계 동안, 특히 여과 동안의 재료 손실에 기인할 가능성이 가장 높았다. 상이한 시간 지점에서 관찰한 차이점은, 여전히 개발 중인 방법의 다양성, FGF18의 양이 방법의 검출 한계와 가까웠다는 사실, 및 또한 결과의 현저한 STD DEV에 의해 또한 증명된 바와 같은, 바이알 함량의 가변성에 기인했을 가능성이 가장 높았다: 사실상, 용액의 높은 점성은 연구실 규모에서 수행된 매우 정밀한 충전 부피를 허용하지 않았다. 일반적으로, 데이터는 제형물이 정상 저장 조건 하에서 12 주 이하까지 안정함을 제시한다 (도 14를 참조한다).
알지네이트 함량: 모든 세 가지 상이한 온도에서, 인큐베이션 시간에 걸쳐, 알지네이트 함량의 현저한 변화가 관찰되지 않았다. 관찰된 변화는 용액의 점성이 연구실 규모의 매우 정밀한 충전 공정을 얻도록 허용하지 않았음에 따라, 여전히 개발 중인 방법의 가변성, 및 바이알 함량의 가변성에 기인했을 가능성이 가장 높았다. 도 15에 따른 데이터는, 제형물이 정상 저장 조건 하에서 12 주 이하까지 안정함을 제시한다.
알지네이트 MW 분포: 크로마토그래피 프로파일, 및 따라서 모든 세 가지 상이한 온도에서, 시간에 걸쳐, 제형물의 전반적인 중합체 분자량 분포에 대해 변화가 관찰되지 않았다: 피크는 최대 약 520 kDa으로, 870 kDa 초과 내지 약 40 kDa의 넓은 MW 분포를 나타낸다. MW 분포를 잘 결정된 MW를 갖는 표준 기준과 비교에 의해 평가하였다. 피크의 왼쪽 부분에서 검출된 작은 숄더(shoulder)는 콜라겐에 기인할 수 있다. 데이터는 제형물이 정상 저장 조건 하에서 12 주 이하까지 안정함을 제시한다 (데이터 미도시).
점성: 제형물의 점성에 있어서 약간의 감소가, 정상 조건 (2 내지 8 ℃)에서 저장된 샘플에 대해 현저한 변화가 관찰되지 않은 반면, 열화 조건의 가속화로 인해 25 ℃ 및 40 ℃에서 저장된 샘플에 대해 제로 시간의 측면에서 관찰되었다: 관찰된 변화는 방법의 가변성 및 충전 공정과 관련되었을 가능성이 가장 높다. 데이터는 제형물이 정상 저장 조건 하에서 12 주 이하까지 안정함을 제시한다 (도 16을 참조한다).
기계적 성질: 안정성 연구의 각 시간 지점에서 물로 재구성된 알지네이트 FD 제형물을, 염화칼슘 용액과 혼합하여 히드로겔을 형성하는 데에 사용하였다. 얻은 히드로겔의 기계적 성질을 조사하였다. 저장 모듈러스 G' 및 따라서 모든 세 가지 상이한 온도에서, 시간에 걸친 기계적 성질의 변화가 관찰되지 않았다. 도 17에 나타난 결과는 제형물이 정상 저장 조건 하에서 12 주 이하까지 안정함을 제시한다.
세포 침습 능력: 안정성 연구의 각 시간 지점에서 물로 재구성된 알지네이트 FD 제형물을, 염화칼슘 용액과 혼합하여 히드로겔을 형성하는 데에 사용하였다. 히드로겔을 세포로 72 시간 동안 인큐베이션 하고, 이후 공초점 레이저 스캐닝 현미경법에 의해 샘플을 분석하여, 얻은 히드로겔의 세포 침습 능력을 조사하였다. 동일한 온도 조건에서 저장된 샘플을 고려할 때, 시간에 걸쳐 히드로겔 기질을 투과할 수 있는 살아있는 세포의 수의 현저한 변화가 관찰되지 않았다 (데이터 미도시). 각 시간 지점에서, 40 ℃에서 저장된 샘플은 고온에서의 인큐베이션이 중합체 기질의 부분적인 변경을 야기함을 제시하는, 2 내지 8 ℃에서 저장된 샘플보다 더 많은 수의 투과 세포를 보였다. 데이터는 제형물이 정상 저장 조건 하에서 12 주 이하까지 안정함을 제시한다.
결론: 동결-건조 알지네이트 제형물은 정상 저장 조건 (2 내지 8 ℃)에서 12 주 이하까지 좋은 안정성을 보였으며, 적어도 대응하는 액체 제형물만큼 안정한 것으로 나타났다.
<표>
<표 1>: 네 가지 알지네이트-기반 제형물의 중합체 액체 용액 및 칼슘의 조성물
Figure pct00009
<표 2>: 알지네이트-기반 제형물의 겔화 시간
Figure pct00010
<표 3>: 선택된 키토산-기반 제형물의 37 ℃에서의 겔화 시간
Figure pct00011
참고문헌
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> ARES TRADING S.A. <120> FGF-18 formulation in alginate/collagen hydrogels <130> P 13/241 <150> EP 13199591.2 <151> 2013-12-24 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human FGF-18 <400> 1 Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu 1 5 10 15 Leu Leu Cys Phe Gln Val Gln Val Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp 20 25 30 Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser 35 40 45 Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys 50 55 60 His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly 65 70 75 80 Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln 85 90 95 Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg 100 105 110 Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val 115 120 125 Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala 130 135 140 Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg 145 150 155 160 Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln Asp Val His Phe Met Lys 165 170 175 Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys Pro Phe Lys Tyr Thr 180 185 190 Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Ala 195 200 205 <210> 2 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recombinant truncated FGF-18(sprifermin) <400> 2 Met Glu Glu Asn Val Asp Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg 1 5 10 15 Ala Arg Asp Asp Val Ser Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr 20 25 30 Ser Arg Thr Ser Gly Lys His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser 35 40 45 Ala Arg Gly Glu Asp Gly Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr 50 55 60 Asp Thr Phe Gly Ser Gln Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe 65 70 75 80 Tyr Leu Cys Met Asn Arg Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly 85 90 95 Thr Ser Lys Glu Cys Val Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr 100 105 110 Thr Ala Leu Met Ser Ala Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr 115 120 125 Lys Lys Gly Arg Pro Arg Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln 130 135 140 Asp Val His Phe Met Lys Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln 145 150 155 160 Lys Pro Phe Lys Tyr Thr Thr Val Thr Lys 165 170

Claims (15)

  1. 섬유아세포 성장 인자 18(FGF-18), 알지네이트, 콜라겐, 안정화제로서 당 및 2양이온성 염을 포함하거나 이로 구성되는 균질한 히드로겔.
  2. 제1항에 있어서, 히드로겔이:
    a. FGF-18, 알지네이트, 콜라겐 및 안정화제로서 당을 포함하거나 이로 구성되는 제1 균질한 용액 (용액 1), 및
    b. 2양이온성 염을 포함하거나 이로 구성되는 제2 용액 (용액 2)
    의 두 가지 용액으로부터 형성되는 것인 균질한 히드로겔.
  3. a. FGF-18, 알지네이트, 콜라겐 및 안정화제로서 당을 포함하거나 이로 구성되는 제1 균질한 용액을 제조하는 단계,
    b. 2양이온성 염을 포함하거나 이로 구성되는 제2 용액을 제조하는 단계,
    c. 히드로겔을 형성하도록 두 용액의 주사 또는 공동-주사 전에 2 용액을 혼합하는 단계
    를 포함하는, 균질한 히드로겔의 제조 방법.
  4. 안정화제가 수크로스인, 제1항 또는 제2항에 따른 균질한 히드로겔 또는 제3항에 따른 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 2양이온성 염이 칼슘 염, 마그네슘 염, 구리 염 또는 아연 염인 균질한 히드로겔 또는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, FGF-18이:
    a. 서열 1의 아미노산 잔기 28 내지 207을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드,
    b. 서열 1의 아미노산 잔기 28 내지 196을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 및
    c. 서열 2를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 균질한 히드로겔 또는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 각 용액에서, 알지네이트가 3 내지 4 중량%의 농도, 콜라겐이 1 내지 2 mcg/mL의 농도, 안정화제가 10 내지 100 mg/mL의 농도, 및 염이 1 내지 20 mg/mL의 농도인 것인, 균질한 히드로겔 또는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 1:용액 2의 비 (부피 대 부피)가 2:1인 것인, 균질한 히드로겔 또는 방법.
  9. a. FGF-18, 알지네이트, 콜라겐 및 안정화제로서 당을 포함하거나 이로 구성된 제1 균질한 용액을 포함하거나 이로 구성되는 제1 용기 및
    b. 2양이온성 염을 포함하거나 이로 구성된 제2 용액을 포함하거나 이로 구성되는 제2 용기
    의 두 용기를 포함하는 제조품.
  10. 제9항에 있어서, 안정화제가 수크로스인 제조품.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 2양이온성 염이 칼슘 염, 마그네슘 염, 구리 염 또는 아연 염인 제조품.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, FGF-18이:
    a. 서열 1의 아미노산 잔기 28 내지 207을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드,
    b. 서열 1의 아미노산 잔기 28 내지 196을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드, 및
    c. 서열 2를 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 제조품.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 각 용액에서, 알지네이트가 3 내지 4 중량%의 농도, 콜라겐이 1 내지 2 mcg/mL의 농도, 안정화제가 10 내지 100 mg/mL의 농도, 및 염이 1 내지 20 mg/mL의 농도인 것인 제조품.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 1:용액 2의 비 (부피 대 부피)가 2:1인 것인 제조품.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용기 및 제2 용기가 이중-챔버 시스템의 또는 이중-바늘 주사 기구의 두 구획인 제조품.
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