CN115990244A - 重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白药物组合物对骨质疏松的作用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在骨质疏松疾病治疗中可施用的药物组合物，其包括生物活性物质重组人成纤维细胞生长因子‑18(rhFGF18)蛋白及I型胶原蛋白，能够抵抗氧化损伤引起的成骨细胞凋亡，改善骨代谢，并增加成骨形成，尤其对雌激素缺乏引起的骨量减少具有显著效果，具有广阔的应用前景。

Description

重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白药物组合物对骨质疏松的作用

技术领域

本发明属于蛋白质/多肽药物生物技术领域，更为具体的，本发明涉及一种含重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的的药物组合物及其在治疗骨质疏松中的应用。

背景技术

随着人口老龄化的加剧，骨质疏松症成为了中老年常见病、多发病，并有逐年上升态势。据不完全统计，60岁以上的老年人骨质疏松症发病率男性为60.72％，女性高达90.84％，每年因骨质疏松症而并发骨折的发病率约为10％。当前，全球已有骨质疏松症患者达2亿人，其中我国约9000万人患有不同程度的骨质疏松症，居世界之首。罹患骨质疏松症的老年骨密度明显降低，轻则腰背部剧烈疼痛，活动受限、重则导致瘫痪，严重影响老年人的生命健康和生活质量，给家庭和社会带来严重的经济负担。

骨质疏松症在绝经后女性中尤为突出，称为绝经后骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis，PMOP)，是最常见的骨质疏松类型(Black DM et al.N Engl J Med,2016,374(3):254-262.)。研究表明，雌激素缺乏会增加骨转化，影响小梁骨(连接性丧失)和皮质骨(皮质变薄)的正常发育，其特征是骨密度(BMD)降低和病理性骨折(Eastell R etal.Nat Rev Dis Primers,2016,2:160-169；Weitzmann M.N et al.Journal of ClinicalInvestigation.2006,116(5):1186-1194.)。此外，由雌激素缺乏引起的氧化应激可促进绝经后骨质疏松症的发生发展(Almeida M et al.J Biol Chem,2007,282(37):85-97；LeanJM et al.Journal of Clinical Investigation,2003,112(6):915-923；ManolagasSC.Endocr Rev,2010,31(3):266-300；Shi C et al.Bone,2015,79:94-104.)。越来越多的研究证据表明，过量的ROS一方面增强破骨细胞分化，另一方面能够抑制成骨细胞增殖和分化，最终导致骨吸收增加。尽管目前在雌激素缺乏与氧化应激如何诱导PMOP方面取得了进展，但其潜在的致病机制仍然是复杂和多方面的(Weitzmann M.N et al.Journal ofClinical Investigation.2006,116(5):1186-1194.)。

成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)是一类在细胞保护、细胞有丝分裂、血管生成以及组织修复等过程中起关键作用的细胞因子。研究表明，多数FGFs还与骨骼发育和生长密切相关，如FGF-FGFR在肢芽、软骨内和膜内间充质凝结的发展中起关键作用，并调节软骨形成、成骨作用以及骨骼和矿物质的体内平衡(Degnin et al.Journalof cellular biochemistry,2010,110(5):1046-1057；Ornitz et al.Genes Dev,2015,29(14):1463-1486.)。作为FGF家族成员之一，FGF18在骨骼生长发育过程中扮演着重要的角色。它是通过调控FGFR、BMP(骨形态发生蛋白)及多个信号通路，调控骨骼发育、软骨形成及刺激成骨细胞和破骨细胞的增生，对治疗软骨障碍、软骨发育不全及骨骼修复等骨骼性疾病具有潜在的临床应用价值，而越来越受到人们的关注(Moore EE et al.OsteoarthritisCartilage,2005,13:623-631；Gigout A et al.Osteoarthritis Cartilage,2017,25(11):1858-1867；Ditte Reker et al.J Transl Med,2017,15(1):250；D Reker etal.Sci Rep,2020,10(1):6011.Jia Li et al.Expert Opin Investig Drugs,2021,30(9):923-930.)。目前对FGF18生物学作用的研究多集中在软骨与骨关节炎上，而对成骨细胞的功能障碍和死亡作为重要诱因的骨质疏松症方面却未见相关研究报道。

发明人在前期完成FGF18基因重组表达和蛋白纯化、活性鉴定的基础上，开展稳定的冻干制剂组方，并通过体内外实验研究其对骨质疏松的作用及其相关机制。FGF18是肝素结合蛋白，其氨基酸组成中含有大量碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸等，导致肽键不稳定易断裂。在冻干组合物处方筛选中发现一定浓度的I型胶原蛋白的加入对蛋白生物学活性的稳定性起到至关重要的作用。长期稳定性试验结果，冻干组合物中添加5倍FGF18蛋白质量的I型胶原蛋白作为保护剂时，即可有效保护FGF18生物学活性的长期稳定。

体外研究结果表明，对H₂O₂氧化损伤MC3T3-E1成骨细胞模型给予FGF18蛋白，可有效保护成骨细胞的活力，并通过抑制成骨细胞中caspase 3蛋白表达，降低Bax/Bcl-2的比率，显著改善氧化损伤引起的成骨细胞的凋亡。体内研究结果表明，对ICR小鼠卵巢切除术(OVX)建立PMOP模型给予FGF18蛋白，可显著提升血清中雌二醇E2、骨碱性磷酸酶BALP水平，降低抗酒石酸酸性磷酸酶TRACP水平，表明rhFGF18能够改善OVX小鼠骨代谢情况。进一步通过Micro-CT与HE结果表明，给予rhFGF18治疗明显改变OVX小鼠股骨的骨小梁结构、骨密度BMD、骨体积分数BV/TV、骨小梁数Tb.N和骨小梁厚度Tb.Th、骨小梁分离度Tb.Sp和结构模式指数SMI。其主要作用机制是FGF18能够有效改善雌激素缺乏诱导的氧化应激及抗氧化酶水平和活性，保护氧化损伤引起的成骨细胞的凋亡，改善骨代谢，增加骨形成。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于治疗骨质疏松的药物组合物，尤其适用于绝经后骨质疏松症(PMOP)。另外，本发明还提供了包括该药物组合物的药物制剂、应用等。

具体而言，本发明的第一方面，提供了用于治疗骨质疏松的药物组合物，其包括重组人成纤维细胞生长因子-18(rhFGF18)蛋白和对蛋白稳定性具有保护作用的I型胶原蛋白、L-精氨酸和赖氨酸盐酸盐。

FGF18由于其氨基酸序列中含有大量碱性氨基酸，易造成肽键不稳定包括N端和C端均易断裂，现有技术热衷于研究FGF18的截短或突变体。而发明人发现，天然序列的FGF18具备更好的生物学活性，因此在本发明的具体实施方式中(实施例1除外)，FGF18是人天然全序列，其制备方法参见已获得的授权专利ZL201510702841.1。

优选在本发明第一方面的药物组合物中，具有生物学活性的成分包括rhFGF18蛋白和I型胶原蛋白。I型胶原蛋白可作为rhFGF18的稳定剂和保护剂，同时对成骨蛋白也具有一定的促增殖作用。

在第二方面，本发明提供了用于治疗骨质疏松的药物冻干制剂，其包括本发明第一方面的药物组合物和冻干制剂所需的赋形剂、稳定剂、保护剂、缓冲体系或其他制剂辅料。如以甘露醇为赋形剂，海藻糖、吐温80、乙二胺四乙酸二钠作为蛋白的稳定剂和保护剂、以PBS(pH 7.0)为缓冲体系等。

优选在本发明的药物制剂中，所用辅料是注射级药用辅料。即，本发明第二方面的药物制剂是注射制剂。应用过程中，本发明的药物组合物冻干制剂可以用生理盐水或灭菌注射用水溶解或稀释，配置成注射剂。

在第三方面，本发明提供了FGF18在治疗绝经后骨质疏松症中的应用。所述方法包括施用FGF18药物组合物冻干制剂，其中，所述的FGF18药物组合物皮下或腹腔注射给药，每周给药3次，优选每间隔1天给药一次。

优选在本发明第三方面的应用中，FGF18和I型胶原蛋白作为药物活性成分。即，本发明第三方面优选提供了FGF18和I型胶原蛋白作为药物活性成分的药物组合物冻干制剂在骨质疏松症中的应用。药物中包含1～10mg FGF18蛋白和10～30mg I型胶原蛋白，优选3～9mg FGF18蛋白和15～25mg I型胶原蛋白g，最优选4mg FGF18蛋白和20mg I型胶原蛋白。

本发明取得的有益效果在于：本发明的重组人成纤维细胞生长因子-18药物组合物冻干制剂具备较好的生物学活性，能用于治疗骨质疏松症，尤其适用于绝经后骨质疏松症；该药物通过皮下或腹腔注射给药，通过有效降低氧化应激水平及调节抗氧化酶水平和活性，从而减缓雌激素水平的下降，保护成骨细胞的凋亡、改善骨代谢、增加骨形成，从而改善骨质疏松症尤其是绝经后骨质疏松症。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1重组人成纤维细胞生长因子-18天然序列蛋白(rhFGF18)、N-端截短蛋白(rhFGF18△N)、C-端截短蛋白(rhFGF18△C)对MC3T3-E1成骨细胞的生物学活性；

图2重组人成纤维细胞生长因子-18冻干组合物中，不同浓度I型胶原蛋白对其生物学活性稳定性的影响及对成骨细胞的促增殖生物学活性；

图3重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白对H₂O₂刺激造成氧化损伤模型的MC3T3-E1成骨细胞活力的影响；

图4重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白对H₂O₂刺激造成氧化损伤模型的MC3T3-E1成骨细胞凋亡作用的影响；

图5重组人成纤维细胞生长因子-18药物组合物冻干制剂对OVX小鼠体重的影响；

图6重组人成纤维细胞生长因子-18药物组合物冻干制剂对OVX小鼠骨代谢的影响；

图7重组人成纤维细胞生长因子-18药物组合物冻干制剂对OVX小鼠骨形态结构的作用。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1MTT比色法检测重组人成纤维细胞生长因子-18天然序列和截短序列对成骨细胞的促增殖生物学活性

以MC3T3-E1成骨细胞为检测细胞株，通过细胞增殖法/MTT比色法测定重组人成纤维细胞生长因子-18天然序列(rhFGF18)、N-端截短蛋白(rhFGF18△N)、C-端截短蛋白(rhFGF18△C)对检测细胞株促增殖的生物学活性。具体操作如下：

1)供试品溶液的制备：将FGF18蛋白用维持培养液稀释至每1ml约含160ng/ml。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共做9个稀释度，每个稀释度做2个孔。以上操作均在无菌条件下进行。

2)生物学活性测定：MC3T3-E1细胞株用DMEM完全培养液于37℃、5％CO₂培养条件下培养。弃去培养瓶中的培养液，用0.25％胰酶-EDTA消化并收集细胞，用完全培养液将细胞浓度调至5×10⁴个细胞/ml细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5％CO₂条件下培养。24h后更换DMEM饥饿培养液每孔100μl，于37℃、5％CO₂条件下继续培养24h。弃去96孔板中的维持液，加入用新的DMEM饥饿培养液稀释的供试品溶液，使得蛋白按终浓度梯度：0、0.06、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160ng/ml，每孔100μl加入到96孔板中，设置PBS组作为阴性对照，于37℃、5％CO₂条件下继续培养6h。每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育4h。弃去96孔板中的液体后，向每孔加入二甲基亚砜25μl，振荡混匀10min。放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长490nm测定吸光度，记录测定结果。

通过生物学活性检测重组人成纤维细胞生长因子-18天然序列蛋白(rhFGF18)、N-端截短蛋白(rhFGF18△N)、C-端截短蛋白(rhFGF18△C)对MC3T3-E1成骨细胞促增殖的生物学活性。结果如图1所示，天然序列的rhFGF18具备更好的生物学活性。

实施例2重组人成纤维细胞生长因子-18和I型胶原蛋白的组合比例对其生物学活性稳定性的影响及对成骨细胞的促增殖生物学活性

将生物活性物质重组人成纤维细胞生长因子-18(rhFGF18)蛋白及I型胶原蛋白以1：0、1：2.5、1：5、1：10(质量比)进行混合，并加入其他制剂辅料后进行冻干。冻干后的产品放4℃，分别与0、1、3、6、12月取样，以MC3T3-E1成骨细胞为检测细胞株，通过细胞增殖法/MTT比色法测定制剂中重组人成纤维细胞生长因子-18的生物学活性，具体操作方法同实施例1。结果如图2所示，I型胶原蛋白对rhFGF18的生物学活性具有保护作用，同时对成骨细胞具有一定促增殖作用，并在一定范围内呈现剂量依赖性。根据实验结果(图2)及成本等因素的综合考虑，当冻干组合物中活性物质的添加比例为FGF18：I型胶原蛋白＝1：5(质量比)时为优选，既能并有效保护rhFGF18蛋白的生物学活性亦能发挥一定的协同作用。

实施例3重组人成纤维细胞生长因子-18药物组合物冻干制剂的制备方法

按照实施例2中优选比例(FGF18：I型胶原蛋白＝1：5(质量比))配制药物组合物冻干制剂溶液及灌装方法，组分如表1所示：

1)蛋白组合物溶液配制：将纯化的rhFGF18蛋白和I型胶原蛋白在20mM PBS缓冲液(pH7.0)中透析并超滤浓缩。配制1M的精氨酸与赖氨酸盐酸盐母液，加入蛋白溶液中至终浓度为50μM、rhFGF18蛋白浓度4.0mg/ml、I型胶原蛋白浓度为20mg/ml。用无菌的0.22μm微孔滤膜除菌过滤后待用。以上操作均在2-8℃条件下进行；

2)冻干辅料溶液配制：根据表1中冻干辅料比例精密称取各组分，用20mM PBS缓冲液(pH7.0)充分溶解，调节pH至7.0，并用无菌的0.22μm微孔滤膜除菌过滤后，放置2-8℃预冷待用；

3)将蛋白溶液与辅料溶液1：1(v/v)混合，使rhFGF18蛋白浓度为2.0mg/ml、I型胶原蛋白浓度为20mg/ml，制得冻干制剂溶液；

4)精密量取2ml冻干制剂溶液，分装至干热灭菌的7ml西林瓶中，半加塞后置于预冷的冻干机中进行冻干。

冻干过程操作及保存：

1)预冻：以1℃/min的速率降温，预冻温度为-40℃，保持2h；

2)一次干燥：真空度控制100mTorr，温度-40～-20℃，干燥32h。以每上升左右5℃为一个节点(即-35、-30、-25、-20℃)，隔板温度上升速率为0.5℃/min，每个温度节点维持8h。

3)二次干燥：真空度控制30mTorr左右，温度-20～20℃。隔板温度上升速率为1℃/min，到达20℃后维持6h。

4)二次干燥完成后，在一定真空条件下压塞，最后西林瓶用铝盖进行密封后2-8℃冷藏保存。

表1

实施例4：重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白对H₂O₂刺激造成氧化损伤模型的MC3T3-E1成骨细胞活力及抗凋亡作用的影响

MC3T3-E1成骨细胞培养、细胞铺板(96孔板)以及细胞饥饿方法同实施例1。弃旧的饥饿培养液，用新的DMEM饥饿培养液稀释H₂O₂配制成终浓度为25μM的培养基，刺激MC3T3-E1成骨细胞4h，造成H₂O₂细胞氧化损伤模型。弃尽培养液，用1ml PBS清洗，给予rhFGF18(0、5、10、20、40、80、160ng/ml)孵育4h，使用MTT法检测细胞活力，操作方法同实施例1。

Western blot检测rhFGF18对H₂O₂刺激的成骨细胞中凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的影响。将细胞总蛋白样品与缓冲液按4:1(V/V)充分混匀，煮沸10min，13000rpm离心10min，制备样品备用。按电泳、转膜、封闭、洗膜、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、ECL显色等流程处理，最后使用Image lab软件(version 5.2)对图像进行光密度扫描分析，灰度值表示蛋白表达量。

采用流式细胞术和FITC Annexin V凋亡试剂盒检测MC3T3-E1成骨细胞凋亡情况。细胞培养方法同上，将MC3T3-E1成骨细胞接种于6孔板，用终浓度为25μM H₂O₂刺激细胞4h后，弃尽培养液，用1ml PBS清洗，给予rhFGF18(20、40、80ng/ml)孵育4h。收集对应6孔板中各孔细胞培养液，沿壁缓慢加入1ml PBS，清洗后回收。加500μl胰酶消化液(无EDTA)，显微镜下观察细胞，待细胞边缘亮起后，加2ml PBS稀释胰酶消化液，使所有细胞处于漂浮状态，收集细胞。用PBS反复清洗，1500rpm离心5min，去上清。加入100μl 1×Buffer，轻轻吹打重悬，转移至流式管中，分别加入5μl PI和5μl AV进行染色15min后，加400μl 1x Buffer进行检测。

rhFGF18蛋白对H₂O₂刺激的MC3T3-E1成骨细胞活力的影响，如图3A所示。给予5～160ng/ml rhFGF18蛋白均可显著提高H₂O₂氧化损伤的成骨细胞的活力，在浓度为80ng/ml时对氧化损伤成骨细胞的保护作用最为显著。通过Western blot检测，如图3B-D所示。给予20～80ng/ml rhFGF18蛋白可显著促进抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达，同时可明显抑制凋亡蛋白Bax和caspase-3蛋白的表达，减轻H₂O₂诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。进一步，通过流式细胞仪测定，如图4A、B所示，给予H₂O₂刺激后的MC3T3-E1成骨细胞凋亡水平显著增加。如图4C-F所示，给予20～80ng/ml rhFGF18蛋白能显著改善氧化损伤成骨细胞的凋亡情况，并呈剂量依赖性。

实施例5：重组人成纤维细胞生长因子-18药物组合物冻干制剂对OVX小鼠骨代谢影响及骨形态结构的作用

以8周龄ICR雌性小鼠为实验动物，进行卵巢切除术(OVX)建立PMOP模型，通过rhFGF18药物组合物给药组与阴性、SHAM组比较，考察rhFGF18药物组合物冻干制剂对骨质疏松的作用。具体操作如下：

1)受试药物：按照实施例3中所述方法配制的重组人成纤维细胞生长因子-18药物组合物冻干制剂，规格为4mg/支。使用时用生理盐水配制成0.5μg/ml和5μg/ml，现用现配。

阴性对照：0.9％生理盐水。

2)实验动物：7周龄ICR雌性小鼠，SPF级，体重在20-22g。购买后SPF级动物房适应饲养1周后造模。

3)实验分组及给药：随机分成四组(每组8只)，即SHAM组(假手术，小鼠腔注射生理盐水0.3ml/次)；阴性对照组(进行卵巢切除手术，小鼠腔注射生理盐水0.3ml/次)、rhFGF18低剂量组(进行卵巢切除手术，小鼠腔注射rhFGF 18蛋白0.15μg/0.3ml/次)、rhFGF18高剂量组(进行卵巢切除术，小鼠腔注射rhFGF 18蛋白1.5μg/0.3ml/次)。所用制剂均按照等体积(0.3ml)不等浓度的要求制备。术后第二天开始腹腔注射给药，所有组别小鼠均每隔一天给药。

4)观测指标：每周称重并记录。治疗8周后，予以水合氯醛溶液麻醉，眼球取血，酶联免疫法检测小鼠血清E2、BALP、TRACP的含量。取双侧股骨，用10％ EDTA给样本脱钙，待注射器针头可以较轻松穿过组织，完成样本脱水、透明、浸蜡等步骤，进行包埋、切片与染色，镜下观察股骨远端骨小梁形态结构并拍照。Micro-CT扫描分析小鼠股骨形态结构，设置电压70kV、电流200μA、分辨率10μm、曝光时间300ms，选择股骨远端骨小梁进行三维重建，得到以下参数：骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离(Tb.Sp)以及结构模式指数(SMI)。

实验结果如图5所示，与未切除卵巢的SHAM组小鼠相比，切除卵巢的OVX组小鼠体重显著增加，而给予rhFGF18药物组合物治疗组小鼠的体重与OVX组相比明显降低。

实验结果如图6A所示，小鼠卵巢摘除后体内E2含量显著降低，即雌激素水平下降。与OVX组比较，给予rhFGF18治疗组E2含量均显著升高，说明rhFGF18可以改善OVX小鼠雌激素缺乏情况。图6B和6C中，OVX组小鼠血清BALP水平明显降低而TRACP含量增加，说明骨形成减少，与此对应的骨吸收增加。同样给予rhFGF18治疗后，给药组BALP水平升高，促进了骨形成；TRACP含量降低，减缓了骨吸收。

实验结果如图7A和7B所示，摘除小鼠卵巢改变了股骨远端骨小梁结构，使骨小梁数量减少。给予rhFGF18治疗后，该情况有效缓解，表现出较好的治疗作用。实验结果如图7C-H所示，Micro-CT扫描分析得出的相关形态结构参数与病理切片表现出一致的结果。OVX小鼠中，骨密度BMD、骨体积分数BV/TV、骨小梁数Tb.N以及骨小梁厚度Tb.Th水平均降低，且骨小梁分离度Tb.Sp与结构模式指数SMI显著升高。同样的，给予rhFGF18治疗后明显改变了这一趋势。

实验结果显示，重组人成纤维细胞生长因子-18药物组合物冻干制剂可显著改善雌激素缺乏及氧化应激引起的骨丢失。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种用于治疗骨质疏松的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白药物组合物，其特征在于，所述组合物的活性成分为重组人成纤维细胞生长因子-18(rhFGF18)蛋白和I型胶原蛋白。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述rhFGF18和I型胶原蛋白均为人天然序列。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括精氨酸、赖氨酸盐酸盐药用辅料。

4.如权利要求3所述的组合物的冻干制剂，其特征在于，所述冻干辅料组分包括甘露醇、海藻糖、吐温80、乙二胺四乙酸二钠以及PBS缓冲体系。

5.如权利要求4所述的组合物冻干制剂，其特征在于，所述组合物冻干制剂包括如下组分：1～10mg rhFGF18蛋白、10～30mgI型胶原蛋白、10～100μM精氨酸、10～100μM赖氨酸盐酸盐、10～100mg甘露醇、10～100mg海藻糖、0.05-0.5mg吐温80、1-10mM乙二胺四乙酸二钠、以及10～50mM PBS缓冲体系，制剂的pH范围为5.5～7.5。

6.如权利要求5所述的冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂的组分如下：重组人FGF-18蛋白4mg、I型胶原蛋白20mg、L-精氨酸16.42mg、赖氨酸盐酸盐18.26mg、甘露醇60mg、海藻糖40mg、吐温-80 0.2mg、、乙二胺四乙酸二钠2mM、PBS缓冲体系20mM，制剂的pH范围为7.0。

7.如权利要求1-6任一所述的组合物在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的应用，特别是用于绝经后骨质疏松症的药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述组合物的给药方式为注射给药。

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