CN111320682A - 多肽在制备促进软骨修复和/或治疗骨关节炎药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽及其盐在制备促进软骨修复和/或治疗骨关节炎药物中的用途，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的多肽分子量小，免疫原性低，合成简单，具有显著的促进软骨修复和治疗骨关节炎的作用，可作为治疗骨关节炎的新型药物，应用前景广泛。

Description

多肽在制备促进软骨修复和/或治疗骨关节炎药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及多肽在制备促进软骨修复和/或治疗骨关节炎药物中的用途及含有其的药物。

背景技术

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的关节疾病，表现为关节疼痛、僵硬，软骨损伤是导致骨关节炎的主要成因。本病在中年以后多发，女性多于男性，40岁人群的患病率为10％-17％，60岁以上为50％，而在75岁以上人群则高达80％。该病致残率可高达53％。而随着人口的日益老龄化，骨关节炎将成为影响人们生活质量的重要问题，骨关节炎药物市场需求将不断扩大。

目前临床上对于骨关节炎的治疗药物分为特异性治疗药物与非特异性治疗药物。非特异性治疗药物以镇痛和控制症状为主，但对软骨没有保护作用，如非甾体抗炎药等。特异性治疗药物可保护关节软骨，延缓骨关节炎进展，如氨基葡萄糖、硫酸软骨素等，但一般起效较慢，需治疗数月才见效，而且对受损软骨的再生没有作用。因此开发一种安全性好、疗效突出的新型骨关节炎治疗药物成为医学界的一大目标。

如上文所述，软骨损伤是导致骨关节炎的主要成因，关节软骨是由丰富的细胞外基质(ECM)和嵌于其中的少数软骨细胞所组成。软骨细胞的代谢受到许多细胞因子的调节，其中骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)对骨和软骨的合成和代谢具有重要的作用。骨形态发生蛋白又称骨形成蛋白，是一类能在骨骼外异位诱导骨和软骨形成的酸性多肽。BMP是疏水性酸性糖蛋白，其分子量为18000D，由10余种氨基酸组成。在酸性条件下性能稳定，在pH值7.2的溶液中具有一定的溶解度，当pH值大于8.5时完全失活。

BMP是属于TGF-β超家族的一类多功能生长因子，现已有超过20个家族成员被证实和描述，大量文献指出，BMP可以诱导间充质细胞增殖、分化为成骨细胞或软骨细胞，在骨的发生、诱导、修复等方面发挥关键作用，能够影响细胞的生长、分化和凋亡，它能够明显促进培养的软骨细胞的生长和成熟，并且在多种组织的发生发育过程中起着关键作用。BMP-2是一种酸性多肽，其诱导骨髓间充质干细胞向成骨定向分化的能力在BMP超家族中最强，其在体内以自分泌和旁分泌的形式诱导骨、软骨及骨相关结缔组织的形成(参见非专利文献2)。

本专利公开了一种来源于BMP-2的多肽，其具有促进软骨再生和修复，治疗骨关节的作用。有文献报道显示，这种肽具有增强成骨细胞分化和新骨形成(参见专利文献1-3)，但尚未见文献报道其具有促进软骨再生活性。

专利文献1：CN1752103A，骨形态发生蛋白2活性肽及制备方法和应用

专利文献2：CN105175501A，一种促进骨生成的多肽及其合成方法与应用

专利文献3：US2019125838A1，METHOD FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OFOSTEOARTHRITIS

非专利文献1：Obradovic Wagner D,Sieber C,Bhushan R,et al.BMPs:frombone to body morphogenetic proteins[J].Science signaling,2010,3(107):mr1.

非专利文献2：Vlacic-Zischke J,Hamlet S M,Friis T,et al.The influenceof surface microroughness and hydrophilicity of titanium on the upregulationof TGFβ/BMP signalling in osteoblasts[J].Biomaterials,2011,32(3):665-671。

发明内容

基于此，针对上述技术问题，本发明旨在以BMP-2的氨基酸序列为来源，开发出一种稳定的可以用于修复软骨和/或治疗骨关节炎的新型肽，命名为KIP20。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：多肽KIP20在制备促进软骨修复和/或治疗骨关节炎药物中的用途，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述多肽为药学上可接受的盐形式，所述盐为多肽KIP20的醋酸盐、盐酸盐或磷酸盐。

进一步地，所述盐优选为醋酸盐，其生物相容性更好。

进一步地，所述多肽KIP20用于修复软骨和/或治疗骨关节炎的有效剂量为1-5mg。

本发明另一目的在于提供一种融合蛋白，由如上所述的多肽KIP20与免疫球蛋白恒定区(Fc)或人血清白蛋白(HSA)融合形成。

本发明另一目的在于提供一种促进软骨修复和/或治疗骨关节炎的药物，所述药物包含如上所述的多肽KIP20或如权利要求7所述的融合蛋白，和药学上可接受的载体。

进一步地，所述药物中还可以包括其它的治疗骨关节炎的药物。

进一步地，所述其它的治疗骨关节炎的药物为透明质酸或非甾体抗炎药，当与上述两种药联用时，可以在治疗骨关节炎治疗方面取得协同增效的作用。

进一步地，所述药学上可接受的载体为生理盐水溶液。

进一步地，所述药物的给药方式为注射给药，包括膝关节腔注射或皮下注射。

本发明的发明人经体外实验证明，多肽KIP20可显著促进COL2A1、ACAN的mRNA表达量增加，并表现出明显的量效关系和时效关系；可显著促进软骨细胞的增殖，且量效关系明显；多肽KIP20体外可以促进软骨细胞增殖及II型胶原蛋白的表达；对斑马鱼软骨损伤模型显示出明显的软骨修复作用，上述证明肽KIP20促进受损软骨再生的作用，可用于促进软骨修复。

经体外证明，多肽KIP20可显著降低大鼠骨关节炎模型的大鼠骨关节炎评分，且中、高剂量组具有统计学意义，证明多肽KIP20可用于治疗骨关节炎。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的多肽KIP20分子量小，免疫原性低，合成简单，具有显著的促进软骨修复和治疗骨关节炎的作用，应用前景广泛。

附图说明

图1为多肽KIP20固相合成的HPLC检测图谱；

图2为多肽KIP20对Ⅱ型胶原(COL2A1)mRNA表达的作用结果统计图；

图3为多肽KIP20对蛋白多糖(ACAN)mRNA表达的作用结果统计图；

图4为多肽KIP20对大鼠软骨细胞增殖的作用结果统计图；

图5为多肽KIP20处理软骨细胞的COL2A1免疫组化结果统计图；

图6为多肽KIP20对斑马鱼受损软骨的修复作用结果统计图；

图7为多肽KIP20对斑马鱼受损软骨的修复作用的照片；其中A)为正常对照组；B)为模型对照组；C)为阳性对照组；D)为多肽KIP20低剂量组；E)为多肽KIP20中剂量组；F)为多肽KIP20高剂量组；

图8为多肽KIP20治疗大鼠OA模型的病理评分结果统计图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一、多肽KIP20的固相合成

多肽KIP20(SEQ ID NO：1)采用常规固相工艺合成，合成的肽纯度＞95％(见图1)，合成500mg。

实施例二、多肽KIP20体外对间充质干细胞分化的作用

人间充质干细胞的培养和传代：将人骨髓间质干细胞(BMSCs，购自广州赛业生物科技有限公司)复苏，加入完全培养基，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。复苏后的第二天，给复苏的细胞换用新鲜的完全培养基，每两天给细胞换新鲜的完全培养基直到细胞达80％-90％的汇合度，然后进行传代培养。

成软骨诱导：将肽KIP20用磷酸缓冲液(PBS)溶解。用含不同浓度的肽KIP20(0.1μM、1μM和10μM)的完全成软骨培养基重悬细胞，使得BMSCs的浓度为每毫升5.0×10⁵个细胞，并以PBS为阴性对照，1μM人胰岛素生长因子1(IGF-1)为阳性对照。

处理的BMSCs置于37℃，5％CO₂饱和湿度条件下孵育，每2-3天更换培养基，每管加入0.5mL新鲜完全成软骨培养基。

qPCR检测：收集细胞，Trizol法提取总RNA，逆转录得cDNA，反应条件为：30℃保温10分钟；42℃保温60分钟；85℃保温10分钟。

以cDNA为模板，利用下列引物，对II型胶原(Col2A1)和蛋白聚糖(Ag grecan，Acan)进行定量PCR，反应条件为：50℃2分钟；95℃2分钟；95℃15秒，60℃32秒读板，40个循环。

结果：

1、肽KIP20对COL2A1和ACAN基因表达的诱导作用

从图2和图3可看出，0.1μM、1μM和10μM的肽KIP20可显著促进COL2A1、ACAN的mRNA表达量增加，并表现出明显的量效关系和时效关系(见图2、图3)，说明肽KIP20促进间充质干细胞向软骨细胞的分化。

实施例三、肽KIP20对软骨细胞增殖的作用

软骨细胞培养：无菌条件下切取2月龄新西兰大白兔关节软骨，剪成1mm大小，37℃下分别以2mg/ml透明质酸酶消化45分钟、2mg/ml胰蛋白酶消化45分钟、4mg/ml的Ⅱ型胶原酶消化3小时，冲洗离心(1500r/分钟)5分钟，将沉淀物置入含15％胎牛血清DMEM培养基中进行培养。

软骨细胞的鉴定：取少量原代软骨细胞涂片后用I型胶原抗体SABC免疫检测，染成棕黄色，说明分泌I型胶原，证实为软骨细胞。

MTS法测软骨细胞增殖：软骨细胞按照2×10⁴个/孔接种于96孔板，加入不同浓度的肽KIP20(0.1μM、1μM和10μM)，并以PBS为阴性对照组，IGF-1(1μM)为阳性对照组，37℃、5％CO₂的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养5天。每孔加20μl MTS混合液，继续培养3-4小时显色。检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm处检测各孔的光吸收值(OD)。

免疫组化测COL2A1：软骨细胞以3.5×10⁵/ml接种于放置有盖玻片的6孔培养板中，加入不同浓度的肽KIP20(0.1μM、1μM和10μM)，并以PBS为阴性对照组，IGF-1(1μM)为阳性对照组。37℃、5％CO₂的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养5天。处理的软骨细胞以4％多聚甲醛固定24～36小时，切成合适大小材料，进行石蜡包埋。蜡块切成5μm厚的切片，经二甲苯脱蜡后，PBS洗3次，每次5分钟。于微波炉中高火加热至沸腾，低火维持沸腾继续加热8分钟(柠檬酸抗原修复液)，待水温自然降至室温。PBS洗3次，每次5分钟；10％山羊血清室温封闭30分钟；一抗4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5分钟；二抗室温孵育30分钟，PBS洗3次，每次5分钟；DAB显色，PBS洗3次，每次5分钟；苏木素复染，水洗去多余染液，分化数秒。水洗，返蓝。50％、75％、85％、95％和100％乙醇梯度脱水各1次，二甲苯透明2次，每次5分钟。中性树胶封片。

结果：

1、肽KIP20对软骨细胞增殖的促进作用

不同浓度的肽KIP20处理5天后，与PBS组相比，0.1μM、1μM和10μM的肽KIP20显著促进软骨细胞的增殖，且量效关系明显(见图4)。

2、肽KIP20对COL2A1表达的促进作用

与PBS处理组相比，0.1μM、1μM和10μM的肽KIP20处理组的COL2A1免疫组化染色明显增加，表明COL2A1蛋白表达量显著提高，1μM时达到最高(见图5)。

综合以上结果，说明肽KIP20在体外可以促进软骨细胞增殖及II型胶原蛋白的表达。

实施例四、肽KIP20对斑马鱼软骨损伤模型的修复作用

随机选取受精后2天的转基因软骨荧光斑马鱼于六孔板中，每孔(即每浓度组)30尾斑马鱼，水溶给予地塞米松建立斑马鱼软骨损伤模型。模型斑马鱼分别静脉注射给予生理盐水溶解的肽KIP20，剂量为20、100、500ng/尾，水溶给予阳性对照药硫酸软骨素1000μg/mL浓度，同时设置正常对照组(给予生理盐水)和模型对照组(给予生理盐水)，每孔容量为3mL，28℃培养箱孵育72小时。实验结束后，每组随机选取10尾斑马鱼在显微镜下观察、拍照并保存图片，用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件，测定斑马鱼软骨荧光强度、斑马鱼角舌骨和Meckel’s软骨的长度和角度。软骨再生作用计算公式如下：

用T检验进行统计学分析，统计学处理结果用

表示，p<0.05表明具有显著性差异。

结果：与模型对照组相比，中、高剂量(分别为100、500ng/尾)的肽KIP20处理，显示出明显的软骨修复作用，表现为肽KIP20中、高剂量组的斑马鱼的荧光明显强于模型对照组(**代表P＜0.01)，且量效关系明显(见图6、7)，提示肽KIP20有促进受损软骨再生的作用。

表1 KIP20对斑马鱼软骨损伤的治疗作用

注：**代表与模型对照相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

实施例五、肽KIP20对大鼠骨关节炎(OA)模型的作用

建模：采用手术切断前交叉韧带(ACLT)联合半月板切除(MMT)的方法，建立大鼠OA模型，具体操作如下：SD大鼠肌注一定剂量的抗生素(庆大霉素，20mg/kg)，皮下注射阿托品(0.05mg/kg)，1.5-3.0％异氟烷用于维持手术中麻醉。动物麻醉后，对一侧(右侧)膝关节进行备毛，并用碘伏清洁消毒，做好手术准备。股骨-胫骨关节内侧将被切开，通过钝性分离显露内侧半月板，并在半月板最窄的处进行全厚度切割，同时切断前交叉韧带，完成后关节复位，缝合膝关节肌肉、韧带及皮肤，并对术部消毒。所有动物术后连续3天给予一定量的镇痛剂痛立定(4％托芬那酸，0.1mg/kg，i.m.)，每日一次。所有动物手术结束后给予一定量的抗生素(庆大霉素，20mg/kg，i.m.)。麻醉恢复期动物允许自由的活动及完全负重，动物实验人员在麻醉恢复期须密切监控所有动物。

治疗：手术后两周，成模动物随机分为正常对照组、模型对照组、肽KIP20低、中、高剂量组，分别给予生理盐水、生理盐水、0.2mg、1mg、5mg的肽KIP20，给药方式为右后肢膝关节腔注射，给药体积为50μl。

检测：给药治疗28天后，动物安乐死，取所有组右膝关节及模型组左膝关节，10％NBF固定48小时以上，甲酸脱钙，石蜡包埋，冠状面切片，H&E和Safranin-O染色；由专业病理师对切片进行退行性改变评分(软骨退变，骨赘，软骨钙化和软骨下骨损伤的数量和程度，滑膜炎症的数量)，评分标准参考Osteoarthritis Research Society International(OARSI)scoring system。

统计分析：利用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA,USA)或PASW Statistics18.0(SPSS Inc.)进行数据分析。当P<0.05认为有显著性差异.

结果：与模型对照组相比，肽KIP20各治疗组OA评分均下降，且量效关系明显，其中中、高剂量组有统计学意义(见图8、表2)，提示肽KIP20对大鼠OA模型有治疗作用。

表2 KIP20大鼠OA的治疗作用(OARSI评分)

正常对照组	模型对照组	KIP20低剂量组	KIP20中剂量组	KIP20高剂量组
					3.26±0.53	31.45±6.67	26.12±5.52	18.34±6.56<sup>**</sup>	12.64±5.13**

注：**代表与模型对照相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所述技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州领晟医疗科技有限公司

<120> 多肽在制备促进软骨修复和/或治疗骨关节炎药物中的用途

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Ile Pro Lys Ala Ser Ser Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser

1 5 10 15

Thr Leu Tyr Leu

20

Claims (10)

1.多肽在制备促进软骨修复和/或治疗骨关节炎药物中的用途，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多肽为药学上可接受的盐形式，所述盐为多肽的醋酸盐、盐酸盐或磷酸盐。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述盐为醋酸盐。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多肽用于修复软骨和/或治疗骨关节炎的有效剂量为1-5mg。

5.一种融合蛋白，其特征在于，由如权利要求1～5任一项所述的多肽与免疫球蛋白恒定区(Fc)或人血清白蛋白(HSA)融合形成。

6.一种促进软骨修复和/或治疗骨关节炎的药物，其特征在于，所述药物包含如权利要求1～5任一所述的多肽或如权利要求7所述的融合蛋白，和药学上可接受的载体。

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物中还可以包括其它的治疗骨关节炎的药物。

8.如权利要求7所述的药物，其特征在于，所述其它的治疗骨关节炎的药物为透明质酸或非甾体抗炎药。

9.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体为生理盐水溶液。

10.如权利要求6～9任一项所述的药物，其特征在于，所述药物的给药方式为注射给药，包括膝关节腔注射或皮下注射。

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