KR20160098406A - 프로테아제 내성 펩티드 - Google Patents

프로테아제 내성 펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로테아제 내성 펩티드, 상기 펩티드의 제조 방법, 프로테아제 내성 펩티드를 포함하는 조성물, 및 상기 펩티드를 이용한 치료 방법을 제공한다. 본원에 기재된 방법에 의한 표준 펩티드 합성 과정에서 주쇄에 직접적으로 알파-메틸 작용기화 아미노산을 도입하는 것은 프로테아제 내성 펩티드를 생성한다고 확인되었다. 바람직한 알파-메틸 작용기화 아미노산은 알파-메틸 페닐알라닌이고 바람직한 펩티드는 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1: glucagon-like peptide-1)이다.

Description

프로테아제 내성 펩티드{PROTEASE RESISTANT PEPTIDES}
본 발명은 프로테아제 내성 펩티드, 상기 펩티드의 제조 방법, 프로테아제 내성 펩티드를 포함하는 조성물, 및 상기 펩티드를 이용한 치료 방법을 제공한다. 본원에 기재된 방법에 의한 표준 펩티드 합성 과정에서 주쇄에 직접적으로 알파-메틸 작용기화 아미노산을 도입하는 것에 관한 것이다.
지속적으로 작용하는 펩티드 치료제의 개발은 주로 효소 분해에 대한 펩티드의 본래의 민감성으로 인한 짧은 혈장 반감기 및 낮은 경구 생체이용률과 같은 요인에 의해 제한받고 있다. 세포 표면에서 펩티드 신호전달 현상의 차단, 또는 소화 과정에서 단백질 및 펩티드의 위 분해와 같은 필수적인 생체분자 프로세스의 조절을 포함하는 대부분의 단백질 분해 기능은 필수적이다. 따라서, 담당 프로테아제의 활성을 단순히 억제하게 되면 많은 경우에 다른 대사 장애를 일으킬 수 있다.
따라서, 분해를 극복하기 위하여, 관심 펩티드의 효소 내성을 증가시키는 것이 바람직하다. 일반적으로, 효소 내성을 증가시키는데 이용되는 두 가지 주요 방법은 서열 특이적 변형, 즉 펩티드 자체의 1차 구조에 영향을 주는 것과 전체에 효과적인 변형, 즉 펩티드 전체의 어떤 물리화학적 특성을 변경하는 것이다. 전략적으로 도입된다면, 이러한 변형은 그 작용이 요망되는 펩티드를 달리 제거하거나 불활성화시키는 자연의 생리학적 프로세스, 예를 들어 효소 분해 및/또는 신장 초미세여과에 의한 청소의 효과를 감소시킬 수 있다.
서열 특이적 변형은 단백질 분해 내성을 갖는 이상 아미노산의 도입, 또는 더 많이 수반되는 것으로 자연 발생(naturally occurring) 측쇄 작용기 사이의 고리화, 예를 들어, 이황화물 형성(Cys-Cys), 또는 락탐화(Lys-Glu 또는 Lys-Asp)를 포함한 변형을 포함한다. 또 다른 변형은 펩티드 골격 내에 비자연 아미노산 치환체 사이의 고리화, 예를 들어 올레핀 복분해 스테플링을 포함한다.
전체 변형은 펩티드 지질화, 예를 들어 팔미토일화 및/또는 페길화와 같은 프로세스를 포함한다. 팔미토일화는 혈청 내에 본래 풍부한 알부민과 약하게 결합하는 펩티드의 순환 저장소를 생성하는 효과를 갖는다. 알부민과 결합된 펩티드는 결합된 복합체의 크기가 사구체 여과 차단 기준을 초과하기 때문에 신장 초미세여과를 효과적으로 피할 수 있다. 펩티드가 알부민의 표면으로부터 분리되면서, 펩티드는 다시 유리되어 내인성 수용체와 상호작용한다. 페길화는 펩티드를 단백질 분해로부터 물리적으로 보호하는 효과를 가지며 상당한 친수성을 부여하여 수화시 치료 분자의 유체역학적 반경을 상당히 증가시켜서 신장 청소를 극복하도록 한다. 그러나 지질화 또는 페길화 어느 것도 단백질 분해에 대한 펩티드 주쇄의 민감성에 대해서는 상당한 영향을 주지 못한다.
상기 기술은 일반적으로 치료 펩티드에 광범위하게 적용될 수 있으며, 순환 반감기를 어느 정도까지는 연장할 수 있지만, 특히 경구 투여되는 펩티드를 생산하고자 하는 경우, 효소 분해에 대한 펩티드 및 단백질의 안정성을 증가시키는 방법이 여전히 요구된다.
상기에 기재된 요구를 충족시키는 실시양태를 전체에 걸쳐 기재한다.
한 실시양태에서, 천연(native) 아미노산 잔기에 1개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산 치환을 포함하는 합성 펩티드를 제공한다. 적합하게는, 합성 펩티드는 상기 치환을 전혀 포함하지 않는 상응하는 합성 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 유지한다.
실시양태에서, 1개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산이 치환된 천연 아미노산 잔기에 상응한다. 적합하게는, 1개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 알파-메틸 히스티딘, 알파-메틸 알라닌, 알파-메틸 이소류신, 알파-메틸 아르기닌, 알파-메틸 류신, 알파-메틸 아스파라긴, 알파-메틸 리신, 알파-메틸 아스파르트산, 알파-메틸 메티오닌, 알파-메틸 시스테인, 알파-메틸 페닐알라닌, 알파-메틸 글루탐산, 알파-메틸 트레오닌, 알파-메틸 글루타민, 알파-메틸 트립토판, 알파-메틸 글리신, 알파-메틸 발린, 알파-메틸 오르니틴, 알파-메틸 프롤린, 알파-메틸 셀레노시스테인, 알파-메틸 세린 및/또는 알파-메틸 티로신을 포함한다.
실시양태에서, 합성 펩티드는 예를 들어, DPP-IV, 네프릴리신, 키모트립신, 플라스민, 트롬빈, 칼리크레인, 엘라스타아제, 트립신 및/또는 펩신 분해를 포함한 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다.
적합하게는, 천연 아미노산 잔기는 단백질 분해 절단에 민감한 부위이다.
실시양태에서, 펩티드는 인크레틴 부류 펩티드이며, 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1: glucagon-like peptide-1), 글루코스 의존성 인슐린 분비 자극 펩티드(GIP: glucose-dependent insulinotropic peptide), 엑세나타이드 펩티드 플러스 글루카곤, 세크레틴, 테노모듈린, 옥신토모듈린 및 혈관 활성 장 펩티드(VIP: vasoactive intestinal peptide)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다른 실시양태에서, 펩티드는 인슐린이다.
또 다른 실시양태에서, 적합하게는 천연 아미노산 잔기에 3개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산 치환을 포함하는 GLP-1 펩티드로서, 합성 GLP-1 펩티드가 상기 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 GLP-1 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 유지하는 합성 GLP-1 펩티드를 제공한다. 실시양태에서, 3개 이상, 또는 4개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 알파-메틸 페닐알라닌이다. 적합하게는, 알파-메틸 작용기화 아미노산은 위치 Phe6, Try13, Phe22 및 Trp25에서 치환된 알파-메틸 페닐알라닌이다.
적합하게는, GLP-1 펩티드는 위치 2에 아미노이소부티르산 치환(Aib2), 위치 5에 세린 변형(Ser5), 위치 20(α-MeLys20) 및 28(α-MeLys28)에서 치환된 알파-메틸 리신, 위치 26에 발린 변형(Val26), 및/또는 카복시 말단 지질화 또는 페길화를 더 포함한다.
또한, 합성 펩티드의 제조 방법으로서, 치환을 위한 펩티드 내 1개 이상의 천연 아미노산 잔기를 확인하는 단계, 및 확인된 천연 아미노산 잔기를 알파-메틸 작용기화 아미노산으로 치환하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 적합하게는, 합성 펩티드는 상기 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 유지하고, 합성 펩티드는 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 단백질 분해에 안정한 펩티드의 제조 방법으로서, 펩티드를 1종 이상의 프로테아제에 노출시키는 단계, 단백질 분해 절단에 민감한 부위인 1개 이상의 천연 아미노산 잔기를 확인하는 단계, 및 확인된 아미노산 잔기를 알파-메틸 작용기화 아미노산으로 치환하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 적합하게는, 합성 펩티드는 상기 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 유지하고, 합성 펩티드는 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다.
또한, 환자의 치료 방법으로서, 상기에 기재된 합성 펩티드의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 하기 아미노산 서열을 포함하는 합성 GLP-1 펩티드를 제공한다.
R1-His-X1-Glu-Gly-X2-X3-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X4-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X5-Glu-X6-Ile-Ala-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2 (서열 번호 2).
상기 서열에서,
R1은 Hy, Ac 또는 pGlu이고,
R2는 -NH2 또는 -OH이고,
X1은 Ala, Aib, Pro 또는 Gly이고,
X2는 Thr, Pro 또는 Ser이고,
X3은 Aib, Bip, β,β-Dip, F5-Phe, Phe, PhG, Nle, 호모Phe, 호모Tyr, N-MePhe, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, Tyr, Trp, Tyr-OMe, 4I-Phe, 2F-Phe, 3F-Phe, 4F-Phe, 1-Nal, 2-Nal, Pro 또는 디-β,β-MePhe이고,
X4는 Aib, Ala, Asp, Arg, Bip, Cha, β,β-Dip, Gln, F5-Phe, PhG, Nle, 호모Phe, 호모Tyr, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, Phe, Thr, Trp, Tyr-OMe, 4I-Phe, 2F-Phe, 3F-Phe, 4F-Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Pro, 디-β,β-MePhe, α-MeTyr 또는 디-β,β-MeTyr이고,
X5는 Aib, Lys, D-pro, Pro 또는 α-MeLys 또는 디-β,β-MeLys이고,
X6은 Aib, Asp, Arg, Bip, Cha, Leu, Lys, 2Cl-Phe, 3Cl-Phe, 4Cl-Phe, PhG, 호모Phe, 2Me-Phe, 3Me-Phe, 4Me-Phe, 2CF3-Phe, 3CF3-Phe, 4CF3-Phe, β-Phe, β-MePhe, D-phe, 4I-Phe, 3I-Phe, 2F-Phe, β,β-Dip, β-Ala, Nle, Leu, F5-Phe, 호모Tyr, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, Ser, Tyr, Trp, Tyr-OMe, 3F-Phe, 4F-Phe, Pro, 1-Nal, 2-Nal 또는 디-β,β-MePhe; α-MeTyr, 디-β,β-MeTyr, α-MeTrp 또는 디-β,β-MeTrp이고,
X7은 Aib, Arg, Bip, Cha, β,β-Dip, F5-Phe, PhG, Phe, Tyr, 호모Phe, 호모Tyr, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, 2Me-Phe, 3Me-Phe, 4Me-Phe, Nle, Tyr-OMe, 4I-Phe, 1-Nal, 2-Nal, 2F-Phe, 3F-Phe, 4F-Phe, Pro, N-MeTrp, α-MeTrp, 디-β,β-MeTrp, 디-β,β-Me-Phe; α-MeTyr 또는 디-β,β-MeTyr이고,
X8은 Aib, Ala, Arg, Asp, Glu, Nle, Pro, Ser, N-MeLeu, α-MeLeu, Val 또는 α-MeVal이고,
X9는 Aib, Glu, Lys, Pro, α-MeVal 또는 α-MeLeu이고,
X10은 Aib, Glu, Lys, Pro 또는 α-MeLys이고,
X11은 Aib, Glu, Pro 또는 Ser이고,
X12는 Aib, Gly, Glu, Lys, Pro, α-MeArg 또는 α-MeLys이다.
또 다른 실시양태, 그 실시양태의 특징, 및 장점, 및 다양한 실시양태의 구조 및 실시내용은 수반되는 도면과 관련하여 하기에 상세하게 기재된다.
[도 1]은 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1)에서 아미노산 치환의 대표 부위를 나타낸다. (서열 번호 3)
[도 2a-2c]는 GLP-1 대조군의 네프릴리신 분해를 나타낸다.
[도 3a-3d]는 네프릴리신에 노출된 본원에서 기재된 실시양태에 따른 합성 GLP-1 단백질의 안정성을 나타낸다.
[도 4a-4d]는 네프릴리신에 노출된 240시간 후에 본원에서 기재된 실시양태에 따른 합성 GLP-1 단백질의 안정성을 나타낸다.
[도 5a-5c]는 GLP-1 대조군의 키모트립신 분해를 나타낸다.
[도 6a-6d]는 키모트립신에 노출된 본원에서 기재된 실시양태에 따른 합성 GLP-1 단백질의 안정성을 나타낸다.
[도 7a-7d]는 키모트립신에 노출된 본원에서 기재된 실시양태에 따른 합성 GLP-1 단백질의 안정성을 나타낸다.
[도 8a-8c]는 GLP-1 대조군의 키모트립신 분해를 나타낸다.
[도 9a-9c]는 트립신에 노출된 본원에서 기재된 실시양태에 따른 합성 GLP-1 단백질의 안정성을 나타낸다.
[도 10a-10c]는 트립신에 노출된 본원에서 기재된 실시양태에 따른 합성 GLP-1 단백질의 안정성을 나타낸다.
[도 11a-11b]는 GLP-1 대조군의 혈청 분해를 나타낸다.
[도 12a-12b]는 혈청에 노출된 본원에서 기재된 실시양태에 따른 합성 GLP-1 단백질의 안정성을 나타낸다.
[도 13a-13d]는 위액에 노출된 지질화 대조군 및 본원에서 기재된 실시양태에 따른 지질화 합성 GLP-1 단백질의 안정성을 나타낸다.
[도 14a-14e]는 위액에 노출된 시판 GLP-1 단백질 및 본원에서 기재된 실시양태에 따른 합성 GLP-1 단백질의 안정성 연구를 나타낸다.
[도 15a-15e]는 위액에 노출된 시판 GLP-1 펩티드 및 본원에서 기재된 실시양태에 따른 합성 GLP-1 펩티드의 안정성 연구를 보여주는 확대 스펙트럼을 나타낸다.
본원에 제시되고 기재된 구체적 수행 내용은 예시이며 어떤 경우에든 출원의 범위를 달리 제한하고자 하는 것은 아님을 알아야 한다.
본원에서 언급된 공개 특허, 특허 출원, 웹사이트, 회사명, 및 과학 문헌은 마치 각각이 참고에 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 이로써 그 전문으로 참고에 포함된다. 본원에 인용된 어떤 참조와 본 명세서의 구체적인 교시가 상충되는 경우 후자의 편에서 해결될 것이다. 유사하게, 업계에서 이해되는 단어 또는 구의 정의와 본 명세서에서 구체적으로 교시된 단어 또는 구가 상충되는 경우 후자의 편에서 해결될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 단수 형태("a," "an" 및 "the")는, 내용이 달리 명백하게 지시하지 않는다면, 그들이 언급하는 용어의 복수 형태도 구체적으로 포함한다. 용어 "약"은 대략적, 약~ 정도, 거의, 약 ~쯤을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 개시된 수치보다 크거나 작은 범위로 확장하여 그 범위를 한정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 본원에서 언급된 수치보다 20% 차이로 크거나 작은 수치를 한정하는데 사용된다.
본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 달리 정의되지 않는다면 본 출원이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 의미를 나타낸다. 당 업자에게 공지된 다양한 방법론 및 재료가 본원에서 언급된다. 펩티드 합성의 일반 원리를 개시하는 표준 참고서에는 문헌(W.C.Chan and P.D.White., "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach", Oxford University Press, Oxford (2004))이 포함된다.
용어 "폴리펩티드," "펩티드," "단백질," 및 "단백질 단편"은 본원에서 호환적으로 사용되며 아미노산 잔기의 중합체를 언급한다. 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학 모방체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사하게 기능을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 나타낸다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것뿐 아니라, 나중에 변형되는 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 예를 들어 수소, 카복실기, 아미노기, 및 R기에 결합된 알파 탄소를 가진 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 나타낸다. 이 같은 유사체는 변형된 R기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지할 수 있다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 상이한 구조를 가지지만 자연 발생 아미노산과 유사하게 기능을 하는 화학 화합물을 나타낸다. 용어 "아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 전체에 호환적으로 사용된다.
펩티드의 대사 안정성을 향상시키기 위해 의도된 대부분의 화학적 변형은 펩티드 주쇄 합성 후 추가의 화학적 조작, 예를 들어 람탐화, 이황화 가교 결합(disulfide bridge closure), 지질화 또는 페길화를 수반한다. 이 같은 변형은 대개 시간 소모적이며 제품의 최종 비용을 크게 상승시킬 가능성이 있다.
본원에서 기재된 바와 같이, 표준 펩티드 합성과정에서, 주쇄에 직접적으로 알파-메틸 작용기화 아미노산의 도입으로 본원에서 기재된 방법은 대규모 제조를 더 간단하고 다루기 쉽게 만든다. 본원에서 기재된 GLP-1, 글루카곤, GIP, VIP 및 세크레틴을 포함하는 인크레틴 부류와 같은 자연 나선형 펩티드의 화학 합성과 관련하여, 알파-메틸 아미노산의 자연적인 회전 유도 효과는 합성 과정에서 펩티드의 조 생산량을 향상시키는 것으로 생각된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 알파-메틸 아미노산은 합성 펩티드의 합성 과정에서 원하는 부위(들)에 도입된다. 변형된 아미노산은 펩티드가 흔히 펩티드의 수용체 효능에 중요한 천연 측쇄 작용성을 유지하도록 해준다.
본원에서 펩티드의 본래의 효소 취약성을 다루는 조성물 및 방법을 제공한다. 알파-메틸 작용기화 아미노산의 부위 특이적 도입으로 민감한 부위(예를 들어 절단되기 쉬운 결합)를 보호함으로써 야생형 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 여전히 유지하면서 효소 분해에 대해 증가된 내성을 보여주는 펩티드를 제공한다.
프로테아제 내성을 보여주는 합성 펩티드
실시양태에서, 천연 아미노산 잔기에 1개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산 치환을 포함하는 합성 펩티드를 제공한다. 다른 실시양태에서, 천연 아미노산 잔기에 2개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산의 치환을 포함하는 합성 펩티드를 제공한다.
본원에 기재된 "합성 펩티드"는 한 아미노산의 카복실기 또는 C-말단을 또 다른 아미노산의 아미노기 또는 N-말단에 화학적으로 결합시킴으로써 생성된 아미노산 잔기 중합체를 나타낸다. 화학적 펩티드 합성은 펩티드의 C-말단에서 시작하여 N-말단에서 끝난다. 합성 펩티드를 생성하는 다양한 펩티드 합성 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다.
본원에서 기재된 "알파-메틸 작용기화 아미노산"은 아미노산의 첫째(알파) 탄소 원자가 알파 탄소에 결합된 메틸기(CH3) 치환기를 포함하는 아미노산을 나타낸다. 알파-메틸 작용기화 아미노산은 이 같은 작용기를 포함하는 21개의 아미노산 중 하나를 포함한다.
전체 걸쳐 기재된 바와 같이, 알파-메틸 작용기화 아미노산은 치환될 수 있다. 즉, 펩티드 내 임의의 천연 아미노산을 대체할 수 있다. "천연" 아미노산은 자연 또는 야생형 펩티드에 존재하는 아미노산을 나타내며, 이는 치환될 수 있다.
치환은 천연 아미노산을 알파-작용기화 아미노산으로 대체를 나타낸다. 합성 펩티드의 화학 합성 과정에서, 천연 아미노산은 알파 작용기화 아미노산으로 쉽게 대체될 수 있다.
본원에 기재된 합성 펩티드는 어느 길이이든, 즉 임의 개수의 아미노산 길이가 될 수 있지만, 적합하게는 합성 펩티드는 약 5개 아미노산 내지 약 200개 아미노산 길이, 적합하게는 약 10개 아미노산 내지 약 150개 아미노산 길이, 약 20개 아미노산 내지 약 100개 아미노산 길이, 약 30개 아미노산 내지 약 75개 아미노산 길이, 또는 약 20개 아미노산, 약 30개 아미노산, 약 40개 아미노산, 약 50개 아미노산, 약 60개 아미노산, 약 70개 아미노산, 약 80개 아미노산, 약 90개 아미노산 또는 약 100개 아미노산 길이 정도이다.
전체에 걸쳐 기재된 바와 같이, 천연 아미노산에서 치환된 1개 이상의 알파-작용기화 아미노산을 포함하는 본원에 기재된 합성 펩티드는 상기 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 유지한다. 일부 경우에, 합성 펩티드는 천연 아미노산에서 치환된 두 개 이상의 알파-작용기화 아미노산을 포함한다.
용어 "수용체 효능"은 펩티드의 반수 최대(50%) 유효 농도(EC50 : half maximum effective concentration)의 역수를 나타낸다. EC50은 명시된 노출 시간 후에 선택된 펩티드 표적에 대해 기저 반응과 최대 반응 사이의 절반의 생물 반응을 유도하는 펩티드의 농도를 나타낸다. 따라서, 작은 값의 EC50을 나타내는 펩티드는 상응하는 수용체 효능이 높은 반면, 큰 값의 EC50은 상응하는 수용체 효능이 낮다 - 수용체와 관련된 반응을 유도하는데 필요한 펩티드가 많을수록, 그 수용체에 대한 펩티드의 효능은 더 낮다.
수용체 효능 및 EC50의 결정 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 적합하게는 한 가지 이상의 세포 수용체 반응의 촉진을 측정하는 단계를 수반한다. 예를 들어, GLP-1 수용체(GLP-1R), 글루카곤 수용체(GCGR) 또는 글루코스 의존성 인슐린 분비 자극 펩티드(위 억제성 폴리펩티드) 수용체(GIPR)를 발현하는 적합한 세포주는 표준 방법에 의해 생성된다. 상기 다양한 수용체를 펩티드가 활성화시키면 결과적으로 cAMP 2차 전달자가 하류에 생산되고 이것을 기능 활성 분석법으로 측정할 수 있다. 이러한 측정값으로부터, EC50 값은 쉽게 결정된다.
전체에 걸쳐 기재된 바와 같이, 1개 이상의 알파-작용기화 아미노산 치환을 포함하는 합성 펩티드(본원에서 "치환된 펩티드"라고도 불림)는 상기 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 펩티드와 "실질적으로 동일한" 수용체 효능을 유지한다. 수용체 효능을 언급할 때 본원에서 사용되는 "실질적으로 동일한"은 치환된 펩티드가 치환을 전혀 포함하지 않고 오히려 고유의 비변형된 야생형 서열, 또는 기타 적합한 대조 서열(즉, 대조군)을 포함하는 펩티드의 수용체 효능과 비교하여 적합하게는 수용체 효능의 약 75%를 나타낸다는 것을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 치환된 펩티드는 치환된 펩티드가 치환을 전혀 포함하지 않고 오히려 고유의 비변형된 야생형 서열, 또는 기타 적합한 대조 서열(즉, 대조군)과 비교하여 적합하게는 수용체 효능의 약 80%, 또는 수용체 효능의 약 85%, 또는 수용체 효능의 약 90%, 또는 수용체 효능의 약 91%, 또는 수용체 효능의 약 92%, 또는 수용체 효능의 약 93%, 또는 수용체 효능의 약 94%, 또는 수용체 효능의 약 95%, 또는 수용체 효능의 약 96%, 또는 수용체 효능의 약 97%, 또는 수용체 효능의 약 98%, 또는 수용체 효능의 약 99%, 또는 수용체 효능의 약 99.1%, 또는 수용체 효능의 약 99.2%, 또는 수용체 효능의 약 99.3%, 또는 수용체 효능의 약 99.4%, 또는 수용체 효능의 약 99.5%, 또는 수용체 효능의 약 99.6%, 또는 수용체 효능의 약 99.7%, 또는 수용체 효능의 약 99.8%, 또는 수용체 효능의 약 99.9%, 또는 적합하게는 수용체 효능의 약 100%를 나타낸다.
전체에 걸쳐 기재된 바와 같이, 1개 이상의 알파-작용기화 아미노산 치환을 포함하는 합성 펩티드는 또한 적합하게는 상기 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 펩티드와 "실질적으로 동일한 선택성"을 유지한다. 본원에서 사용되는 "선택성"은 펩티드가 다른 기타 비표적 단백질에 결합하지 않으면서 그의 표적(결합하도록 설계된 작용제)에 결합하는 능력을 나타낸다. 적합하게는 치환된 펩티드는 "실질적으로 동일한 선택성"을 나타내며, 따라서 치환된 펩티드가 치환을 전혀 포함하지 않고 오히려 고유의 비변형된 야생형 서열, 또는 기타 적합한 대조 서열(즉, 대조군)을 포함하는 펩티드의 선택성과 비교하여 선택성의 약 75%를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 치환된 펩티드는 치환된 펩티드가 치환을 전혀 포함하지 않고 오히려 고유의 비변형된 야생형 서열, 또는 기타 적합한 대조 서열(즉, 대조군)을 포함하는 펩티드의 선택성과 비교하여 적합하게는 선택성의 약 80%, 또는 선택성의 약 85%, 또는 선택성의 약 90%, 또는 선택성의 약 91%, 또는 선택성의 약 92%, 또는 선택성의 약 93%, 또는 선택성의 약 94%, 또는 선택성의 약 95%, 또는 선택성의 약 96%, 또는 선택성의 약 97%, 또는 선택성의 약 98%, 또는 선택성의 약 99%, 또는 선택성의 약 99.1%, 또는 선택성의 약 99.2%, 또는 선택성의 약 99.3%, 또는 선택성의 약 99.4%, 또는 선택성의 약 99.5%, 또는 선택성의 약 99.6%, 또는 선택성의 약 99.7%, 또는 선택성의 약 99.8%, 또는 선택성의 약 99.9%, 또는 적합하게는 선택성의 약 100%를 나타낸다.
적합하게는, 알파-메틸 작용기화 아미노산은 야생형 단백질 내 치환된 천연 아미노산에 상응한다. 즉, 고유의 야생형 펩티드 서열 내 아미노산은 동일한 측쇄를 가진 알파-메틸 작용기화 아미노산으로 치환된다. 다시 말해, 예를 들어, Phe, Trp, Tyr 등은 각각 α-MePhe, α-MeTrp, α-MeTyr 등으로 치환된다.
또 다른 실시양태에서, 알파-메틸 작용기화 아미노산은 치환된 천연 아미노산과 동일한 부류에 상응한다. 예를 들어, 지방족 알파-메틸 작용기화 아미노산은 지방족 천연 아미노산에서 치환되고, 히드록실 알파-메틸 작용기화 아미노산은 히드록실 천연 아미노산에서 치환되고, 황 함유 알파-메틸 작용기화 아미노산은 황 함유 천연 아미노산에서 치환되고, 시클릭 알파-메틸 작용기화 아미노산은 시클릭 천연 아미노산에서 치환되고, 방향족 알파-메틸 작용기화 아미노산은 방향족 천연 아미노산에서 치환되고, 염기성 알파-메틸 작용기화 아미노산은 염기성 천연 아미노산에서 치환되고/거나 산성 알파-메틸 작용기화 아미노산은 산성 천연 아미노산에서 치환된다.
추가의 실시양태에서, 알파-메틸 작용기화 아미노산은 치환된 천연 아미노산에 상응하지 않는다.
알파-메틸 작용기화 아미노산의 판매처에는 예를 들어 바켐 아게(Bachem AG, Switzerland)가 포함된다.
대표적인 실시양태에서, 본원에 기재된 합성 펩티드 내 1개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 알파-메틸 페닐알라닌이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 합성 펩티드 내 1개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 알파-메틸 작용기화 히스티딘, 알파-메틸 작용기화 알라닌, 알파-메틸 작용기화 이소류신, 알파-메틸 작용기화 아르기닌, 알파-메틸 작용기화 류신, 알파-메틸 작용기화 아스파라긴, 알파-메틸 작용기화 리신, 알파-메틸 작용기화 아스파르트산, 알파-메틸 작용기화 메티오닌, 알파-메틸 작용기화 시스테인, 알파-메틸 작용기화 페닐알라닌, 알파-메틸 작용기화 글루탐산, 알파-메틸 작용기화 트레오닌, 알파-메틸 작용기화 글루타민, 알파-메틸 작용기화 트립토판, 알파-메틸 작용기화 글리신, 알파-메틸 작용기화 발린, 알파-메틸 작용기화 오르니틴, 알파-메틸 작용기화 프롤린, 알파-메틸 작용기화 셀레노시스테인, 알파-메틸 작용기화 세린 및 알파-메틸 작용기화 티로신으로부터 선택된다.
전체에 걸쳐 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 합성 펩티드는 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다.
본원에서 사용되는 "단백질 분해"는 펩티드가 더 작은 펩티드 또는 심지어 아미노산으로 분해되는 것을 의미하며, 일반적으로 효소에 의한 펩티드 결합의 가수분해에 의해 유발된다.
전체에 걸쳐 제공된 단백질 분해에 "실질적으로 내성을 가진" 합성 펩티드는 효소가 일반적으로 활성을 갖는 조건(즉, 적합한 pH, 온도, 기타 환경 조건)에서 정해진 기간에 효소에 노출된 후 합성 펩티드의 적어도 약 50%가 원상태로 남아있다는 것을 나타낸다. 적합하게는, 본원에 제공된 합성 펩티드는 적어도 4시간, 보다 적합하게는 적어도 8시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 96시간, 적어도 120시간, 적어도 144시간, 적어도 168시간, 적어도 192시간, 적어도 216시간, 적어도 240시간, 또는 약 36시간 내지 약 240시간, 약 48시간 내지 240시간, 약 72시간 내지 약 240시간, 약 96시간 내지 약 240시간, 약 120시간 내지 약 240시간, 약 144시간 내지 약 240시간, 약 168시간 내지 약 240시간, 약 192시간 내지 약 240시간, 또는 약 216시간 내지 약 240시간의 기간에 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 효소가 일반적으로 활성을 갖는 조건에서 정해진 기간에 효소에 노출된 후 적어도 약 80%의 합성 펩티드가 원상태로 남아있거나, 보다 적합하게는 효소가 일반적으로 활성을 갖는 조건에서 정해진 기간에 효소에 노출된 후 합성 펩티드의 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.1%, 적어도 약 99.2%, 적어도 약 99.3%, 적어도 약 99.4%, 적어도 약 99.5%, 적어도 약 99.6%, 적어도 약 99.7%, 적어도 약 99.8%, 적어도 약 99.9%, 또는 적어도 약 100%가 원상태로 남아있는다.
제공된 합성 펩티드는 포유동물 체내, 적합하게는 인간 체내에서 발견되는 1가지 이상의 효소에 의한 단백질 분해에 적합하게는 실질적으로 내성을 갖는다. 예를 들어, 합성 펩티드는 적합하게는 디펩티딜 펩티다아제-IV(DPP-IV), 네프릴리신, 키모트립신, 플라스민, 트롬빈, 칼리크레인, 트립신, 엘라스타아제 및 펩신 중 1가지 이상에 의한 단백질 분해에 내성을 갖는다. 적합한 실시양태에서, 합성 펩티드는 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상, 6가지 이상, 7가지 이상, 또는 적합하게는 열거된 모든 효소에 의한 단백질 분해에 내성을 갖는다. 또한, 본원에서 기재된 합성 펩티드는 당 업계에 공지된 기타 효소에 의한 단백질 분해에도 실질적으로 내성을 가질 수 있다. 실시양태에서, 본원에서 기재된 합성 펩티드는 소화(위) 효소 및/또는 혈액/혈청 내 효소에 의한 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다.
실시양태에서, 본원에서 기재된 합성 펩티드는 DPP-IV 및 네프릴리신에 의한 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다. 실시양태에서, 본원에서 기재된 합성 펩티드는 펩신, 트립신, 키모트립신, 및 엘라스타아제에 의한 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다. 실시양태에서, 본원에서 기재된 합성 펩티드는 플라스민, 트롬빈 및 칼리크레인에 의한 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다. 실시양태에서, 본원에서 기재된 합성 펩티드는 펩신, 트립신 및 키모트립신에 의한 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다. 실시양태에서, 본원에서 기재된 합성 펩티드는 펩신 및 트립신에 의한 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다.
전체에 걸쳐 제공된 방법을 포함하여 본원에서 기재된 바와 같이, 천연 아미노산에 알파-작용기화 아미노산으로 치환은 적합하게는 단백질 분해 절단에 민감한 부위인 천연 아미노산 잔기에서 일어난다. 즉, 치환되는 아미노산 잔기는 단백질 분해효소가 천연(즉, 야생형) 펩티드 내 펩티드 결합을 절단하는데 활성을 갖는 부위가 되도록 결정된다. 단백질 분해 절단 부위를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며 본원에서 기재된다.
열거된 특성을 갖는 합성 펩티드를 생산하기 위해 본원에서 제공된 방법에 따라 어떤 부류의 펩티드이든 제조될 수 있다.
대표적인 실시양태에서, 합성 펩티드는 인크레틴 부류 펩티드이다. 본원에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있는 대표적인 합성 인크레틴 부류 펩티드는 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1), 글루코스 의존성 인슐린 분비 자극 펩티드(GIP), 엑세나타이드 펩티드, 플러스 글루카곤, 세크레틴, 테노모듈린, 옥신토모듈린 또는 혈관 활성 장 펩티드(VIP)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
펩티드의 또 다른 부류가 본원에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
실시양태에서, 본원에서 기재된 합성 펩티드는 GLP-1 펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 기재된 합성 펩티드는 인슐린이다.
열거된 특성을 갖는 합성 펩티드를 생산하기 위해 제조될 수 있는 본원에서 기재된 다양한 펩티드 및 펩티드 부류의 천연(야생형) 펩티드에 대한 서열은 당 업계에 잘 알려져 있다.
GPL-1에 대한 천연 아미노산 서열은 하기에 개시된 바와 같이 당 업계에 공지되어 있다.
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (서열 번호 1)
실시양태에서, 천연 아미노산 잔기에 3개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산 치환을 포함하는 합성 GLP-1 펩티드를 제공한다. 전체에 걸쳐 기재된 바와 같이, 적합하게는 합성 GLP-1 펩티드는 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 GLP-1 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 유지한다.
실시양태에서, 3개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산이 상응하는 천연 아미노산 잔기에서 치환된다. 즉, 본원에서 기재된 바와 같이, 천연 단백질 내 아미노산이 상응하는 동일한 알파-메틸 작용기화 아미노산으로 치환된다.
추가의 실시양태서, 3개의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 알파-메틸 페닐알라닌이다. 이러한 실시양태에서, 알파-메틸 작용기화 페닐알라닌에 의해 치환되고 있는 천연 아미노산 자체가 반드시 페닐알라닌일 필요는 없다. 오히려, 본원에서 기재된 바와 같이, 천연 방향족 아미노산을 동일한 부류, 즉 방향족 아미노산의 알파-메틸 작용기화 아미노산으로 간단히 대체함으로써, 본원에서 기재된 합성 펩티드가 수용체 효능 및 선택성이 유지되고 안정성이 증가된 원하는 특성을 나타낸다는 것이 확인되었다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 기재된 합성 펩티드는 카복실- 또는 아미노-말단의 지질화, 또는 주쇄 지질화를 포함한 지질화에 의한 변형을 더 포함할 수 있다. 이러한 지질화를 가진 합성 펩티드의 제조 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 천연 아미노산이 알파-메틸 작용기화 아미노산으로 치환된 본원에 기재된 실시양태와 함께, C-말단 지질화가 특히 혈청 및 위액에 노출되는 동안 추가의 안정성을 제공한다는 것이 밝혀졌다.
적합하게는, 본원에서 제공된 합성 GLP-1 펩티드는 4개의 알파-메틸 작용기화 아미노산을 포함한다. 실시양태에서, 4개의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 상응하는 아미노산에서 치환된다. 대표적인 실시양태에서, 4개의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 위치 Phe6, Try13, Phe22 및 Trp25에서 치환되고, 또 다른 실시양태에서, 4개의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 위치 Phe6, Try13, Phe22 및 Trp25에서 치환된 알파-메틸 페닐알라닌이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에서 제공된 합성 GLP-1 펩티드는 6개의 알파-메틸 작용기화 아미노산을 포함한다. 실시양태에서, 6개의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 상응하는 아미노산에서 치환된다. 대표적인 실시양태에서, 6개의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 위치 Phe6, Try13, Lys20, Phe22, Trp25 및 Lys28에서 치환되고, 또 다른 실시양태에서, 6개의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 Phe6, Try13, Phe22 및 Trp25에서 치환된 4개의 메틸 페닐알라닌과 위치 Lys20 및 Lys28에서 치환된 2개의 알파-메틸 리신이다.
적합한 실시양태에서, 본원에서 기재된 GLP-1 합성 펩티드는 적합하게는 위치 2에 아미노이소부티르산(Aib2) 치환을 더 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 기재된 GLP-1 합성 펩티드는 위치 5(Thr5Ser; T5S)의 트레오닌에 세린으로 치환을 더 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에서 기재된 GLP-1 합성 펩티드는 적합하게는 위치 26의 류신에 발린으로 치환(Leu26Val; L26V)을 더 포함한다.
실시양태에서, 본원에서 기재된 합성 GLP-1 펩티드는 DPP-IV, 네프릴리신, 키모트립신, 플라스민, 트롬빈, 칼리크레인, 트립신, 엘라스타아제 및 펩신 중 1가지 이상에 의한 분해를 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 하기 순서의 하기 아미노산 서열을 포함하는 GLP-1 펩티드를 본원에서 제공한다.
R1-His-X1-Glu-Gly-X2-X3-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X4-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X5-Glu-X6-Ile-Ala-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2 (서열 번호 63),
여기서,
R1은 Hy, Ac 또는 pGlu이고,
R2는 NH2 또는 -OH이고,
X1은 Ala, Aib, Pro 또는 Gly이고,
X2는 Thr, Pro 또는 Ser이고,
X3은 Aib, Bip, β,β-Dip, F5-Phe, Phe, PhG, Nle, 호모Phe, 호모Tyr, N-MePhe, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, Tyr, Trp, Tyr-OMe, 4I-Phe, 2F-Phe, 3F-Phe, 4F-Phe, 1-Nal, 2-Nal, Pro 또는 디-β,β-Me-Phe이고,
X4는 Aib, Ala, Asp, Arg, Bip, Cha, β,β-Dip, Gln, F5-Phe, PhG, Nle, 호모Phe, 호모Tyr, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, Phe, Thr, Trp, Tyr-OMe, 4I-Phe, 2F-Phe, 3F-Phe, 4F-Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Pro 또는 디-β,β-Me-Phe이고,
X5는 Aib, Lys, D-pro, Pro 또는 α-MeLys이고,
X6은 Aib, Asp, Arg, Bip, Cha, Leu, Lys, 2Cl-Phe, 3Cl-Phe, 4Cl-Phe, PhG, 호모Phe, 2Me-Phe, 3Me-Phe, 4Me-Phe, 2CF3-Phe, 3CF3-Phe, 4CF3-Phe, β-Phe, β-MePhe, D-phe, 4I-Phe, 3I-Phe, 2F-Phe, β,β-Dip, β-Ala, Nle, Leu, F5-Phe, 호모Tyr, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, Ser, Tyr, Trp, Tyr-OMe, 3F-Phe, 4F-Phe, Pro, 1-Nal, 2-Nal 또는 디-β,β-Me-Phe이고,
X7은 Aib, Arg, Bip, Cha, β,β-Dip, F5-Phe, PhG, Phe, Tyr, 호모Phe, 호모Tyr, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, 2Me-Phe, 3Me-Phe, 4Me-Phe, Nle, Tyr-OMe, 4I-Phe, 1-Nal, 2-Nal, 2F-Phe, 3F-Phe, 4F-Phe, Pro, N-MeTrp, α-MeTrp 또는 디-β,β-Me-Phe이고,
X8은 Aib, Ala, Arg, Asp, Glu, Nle, Pro, Ser, N-MeLeu, α-MeLeu 또는 Val이고,
X9는 Aib, Glu, Lys, α-MeVal 또는 Pro이고,
X10은 Aib, Glu, α-MeLys 또는 Pro이고,
X11은 Aib, Glu, Pro 또는 Ser이고,
X12는 Aib, Gly, Glu, Pro 또는 α-MeArg이다.
적합하게는, GLP-1 펩티드는 서열 번호 2에 개시된 아미노산 서열로 이루어진다. 즉, 서열 번호 2에 개시된 바와 같이 전체 서열과 열거된 순서로 열거된 아미노산만으로 이루어진다.
합성 펩티드의 제조 방법
또한, 합성 펩티드의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 방법은 적합하게는 치환을 위한 펩티드 내 1개 이상의 천연 아미노산 잔기를 확인하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 방법은 적합하게는 치환을 위한 펩티드 내 2개 이상의 천연 아미노산 잔기를 확인하는 단계를 포함한다. 그 후 확인된 천연 아미노산 잔기를 알파-메틸 작용기화 아미노산으로 치환한다.
전체에 걸쳐 기재된 바와 같이, 본원에서 제공된 방법에 의해 제조된 합성 펩티드는 적합하게는 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 유지한다. 게다가, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 합성 펩티드는 또한 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는다.
본원에 제공된 방법에서 적합하게는, 치환된 알파-메틸 작용기화 아미노산은 치환된 천연 아미노산 잔기에 상응하고, 또 다른 실시양태에서, 치환된 알파-메틸 작용기화 아미노산은 치환된 천연 아미노산 잔기와 동일한 부류에 상응한다.
또 다른 실시양태에서, 치환된 알파-메틸 작용기화 아미노산은 알파-메틸 페닐알라닌이다. 대표적인 실시양태에서, 알파-메틸 페닐알라닌이 상응하는 천연 아미노산에서 치환되지만, 방법의 또 다른 실시양태에서, 알파-메틸 페닐알라닌은 치환이 일어나는 동일한 천연 아미노산에 상응할 필요는 없다.
적합한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 합성 펩티드는 DPP-IV, 네프릴리신, 키모트립신, 플라스민, 트롬빈, 칼리크레인, 트립신, 엘라스타아제 및 펩신 분해 중 1가지 이상에 실질적으로 내성을 갖는다.
실시양태에서, 합성 펩티드는 노바신(NOVASYN®) TGR 수지 상에서 C-말단 카복사미드로서 제조된다. 적합하게는, 아미노산(자연 및 비자연 모두)을 NMP 중 HCTU/DIPEA를 이용하여 실온에서 커플링하고, 아세트산 무수물 및 피리딘의 용액으로 잔여 작용성을 캡핑한다. Fmoc를 적합하게는 DMF 중 피페리딘을 이용하여 실온에서 디블록(deblock)한다.
본원에서 기재된 바와 같이, 치환을 위한 펩티드 내 1개 이상의 천연 아미노산 잔기를 확인하는 단계는 적합하게는 효소 절단에 민감한 부위의 아미노산을 확인하는 단계를 포함한다. 효소 절단에 민감한 부위의 아미노산을 확인하는 대표적인 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 실시양태에서, 효소 절단에 민감한 부위의 아미노산을 확인하는 방법은 적합하게는 효소가 일반적으로 활성을 갖는 조건(예를 들어, 적합한 pH, 완충 조건, 온도 등) 하에서 예정된 기간에 자연 펩티드(즉, 야생형 펩티드)를 단일 효소에 노출시키는 단계 및 펩티드의 효소 분해 산물을 측정하는 단계를 포함한다. 효소 분해 산물을 측정하는 대표적인 방법에는 예를 들어 역상 액체 크로마토그래피 질량 분석법이 포함된다.
적합하게는, 펩티드 용액을 원하는 프로테아제 용액에 첨가한다. 펩티드와 효소를 적합하게는 약 37℃에서 동시 인큐베이션한다. 인큐베이션된 펩티드-효소 혼합물의 분액을 정기적으로 취해, 켄치시켜 단백질 분해 활성을 정지시키고, 액체 크로마토그래피 질량 분석(LC/MS)에 의해 분석한다. 분석물을 적합하게는 UV 흡광도(예를 들어, 210 nm) 및 질량 검출기(ESI+ 방식)를 이용한 이온화 두 가지 모두에 의해 검출한다. 처리 후 펩티드의 효소 절단에서 유래한 펩티드 종(단편)을 분석하고 그의 분자량을 이용하여 정확한 절단 부위(각 경우 절단 가능한 결합을 강조)를 확인한다.
실시양태에서, 본원에서 기재된 방법은 열거된 특성을 갖는 임의의 부류의 펩티드를 제조하는데 적합하게 이용된다.
대표적인 실시양태에서, 방법은 인크레틴 부류 펩티드를 제조하는데 이용된다. 본원에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있는 대표적인 합성 인크레틴 부류 펩티드는 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1), 글루코스 의존성 인슐린 분비 자극 펩티드(GIP), 엑세나타이드 펩티드, 플러스 글루카곤, 세크레틴, 테노모듈린 및 옥신토모듈린을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또 다른 부류의 펩티드가 본원에 기재된 바에 따라 제조될 수 있다.
실시양태에서, 방법은 합성 GLP-1 펩티드를 제조하는데 이용된다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 합성 인슐린을 제조하는데 이용된다.
또 다른 실시양태에서, 단백질 분해에 안정한 펩티드의 제조 방법을 제공한다. 적합하게는, 이러한 방법은 펩티드를 1종 이상의 프로테아제에 노출시키는 단계, 단백질 분해에 민감한 부위인 2개 이상의 천연 아미노산을 확인하는 단계, 및 확인된 아미노산 잔기를 알파-메틸 작용기화 아미노산으로 치환하는 단계를 포함한다.
전체에 걸쳐 기재된 바와 같이, 적합하게는 이러한 방법은 치환(들)을 포함하지 않는 상응하는 합성 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 유지하는 합성 펩티드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 또한 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는 합성 펩티드를 제공한다.
본원에서 제공된 방법에서 적합하게는, 치환된 알파-메틸 작용기화 아미노산은 치환된 천연 아미노산 잔기에 상응하고, 추가의 실시양태에서, 치환된 알파-메틸 작용기화 아미노산은 치환된 천연 아미노산 잔기와 동일한 부류에 상응한다.
또 다른 실시양태에서, 치환된 알파-메틸 작용기화 아미노산은 알파-메틸 작용기화 히스티딘, 알파-메틸 작용기화 알라닌, 알파-메틸 작용기화 이소류신, 알파-메틸 작용기화 아르기닌, 알파-메틸 작용기화 류신, 알파-메틸 작용기화 아스파라긴, 알파-메틸 작용기화 리신, 알파-메틸 작용기화 아스파르트산, 알파-메틸 작용기화 메티오닌, 알파-메틸 작용기화 시스테인, 알파-메틸 작용기화 페닐알라닌, 알파-메틸 작용기화 글루탐산, 알파-메틸 작용기화 트레오닌, 알파-메틸 작용기화 글루타민, 알파-메틸 작용기화 트립토판, 알파-메틸 작용기화 글리신, 알파-메틸 작용기화 발린, 알파-메틸 작용기화 오르니틴, 알파-메틸 작용기화 프롤린, 알파-메틸 작용기화 셀레노시스테인, 알파-메틸 작용기화 세린 및 알파-메틸 작용기화 티로신으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 치환된 알파-메틸 작용기화 아미노산은 알파-메틸 페닐알라닌 및/또는 알파-메틸 리신이다. 대표적인 실시양태에서, 알파-메틸 페닐알라닌 및/또는 알파-메틸 리신은 상응하는 천연 아미노산에서 치환되지만, 방법의 또 다른 실시양태에서, 알파-메틸 페닐알라닌 및/또는 알파-메틸 리신은 치환이 일어나는 동일한 천연 아미노산에 상응할 필요는 없다.
적합한 실시양태에서, 본원에서 기재된 방법에 따라 제조된 합성 펩티드는 DPP-IV, 네프릴리신, 키모트립신, 플라스민, 트롬빈, 칼리크레인, 트립신, 엘라스타아제 및 펩신 분해 중 1가지 이상에 실질적으로 내성을 갖는다.
실시양태에서, 본원에서 기재된 방법은 적합하게는 열거된 특징을 갖는 임의 부류의 펩티드를 제조하는데 이용된다.
대표적인 실시양태에서, 방법은 인크레틴 부류 펩티드를 제조하는데 이용된다. 본원에 기재된 바와 같이 제조될 수 있는 대표적인 합성 인크레틴 부류 펩티드는 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1), 글루코스 의존성 인슐린 분비 자극 펩티드(GIP), 엑세나타이드 펩티드, 플러스 글루카곤, 세크레틴, 테노모듈린 및 옥신토모듈린을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또 다른 부류의 펩티드가 본원에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
실시양태에서, 방법은 합성 GLP-1 펩티드를 제조하는데 이용된다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 합성 인슐린을 제조하는데 이용된다.
합성 펩티드를 포함하는 제제
또한, 본원에서 기재된 합성 펩티드를 포함하는 제제(또는 약학 조성물)를 제공한다. 적합하게는 이러한 제제는 본원에서 기재된 합성 펩티드 및 담체를 포함한다. 이러한 제제는 전체에 걸쳐 기재된 다양한 방법에서 용이하게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 합성 펩티드의 생물학적 활성의 효능을 방해하지 않는 1가지 이상의 비독성 물질을 의미한다. 이러한 제제는 통상적으로 염, 완충제, 방부제, 적합성 담체, 및 선택적으로 기타 치료제를 포함할 수 있다. 또한, 제제는 통상적으로 인간에게 투여하기 적합한 적합성 고상 또는 액상 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함할 수 있다. 용어 "담체"는 적용을 용이하게 하기 위하여 합성 펩티드와 조합되는 자연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 나타낸다.
본원에서 기재된 제제는 특정 투여용으로 제제화될 수 있다. 최적의 투약 요법은 최적의 원하는 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼러스를 투여할 수 있고, 여러 개의 분리된 용량을 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나 용량을 치료 상황에 따라 지시된 바에 따라 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 투여의 용이성 및 투여의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료받는 피험체에 단일 투여량에 맞추어진 물리적 개별 단위를 나타내며, 각 단위는 요구되는 약학 담체와 함께 원하는 치료 효과를 가져 오도록 계산된 예정된 양의 합성 펩티드를 포함한다. 투여 단위 형태에 대한 세부 사항은 (a) 합성 펩티드의 고유 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 (b) 상기 합성 펩티드의 조제 기술에 내재하는 제약에 의해 좌우되고, 이들에 직접적으로 의존한다.
본원에서 기재된 제제는 특정 투여 경로, 예를 들어, 경구, 코, 폐, 국소(협측 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 제제는 편리하게는 단위 제형으로 제공될 수 있으며 약학 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 결합할 수 있는 합성 펩티드의 양은 치료받는 피험체 및 구체적인 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 결합할 수 있는 합성 펩티드의 양은 일반적으로 치료 효과를 가져 오는 조성물의 양일 것이다.
합성 펩티드를 이용한 치료 방법
또한, 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법으로서, 본원에서 기재된 합성 펩티드, 예를 들어 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
적합하게는 본원에 기재된 다양한 방법에서 합성 펩티드를 투여받을 수 있는 피험체는 예를 들어 인간, 개, 고양이, 영장류, 소, 양, 말, 돼지 등과 같은 포유동물이다.
합성 펩티드가 본원에 기재된 다양한 방법 중 임의의 방법에서 피험체에 투여될 수 있는 대표적인 방법은 정맥 내(IV), 종양 내(IT), 병변 내(IL), 분무, 경피, 경구, 내시경, 국소, 근육 내(IM), 피 내(ID), 안 내(IO), 복강 내(IP), 피부통과(TD), 비 내(IN), 뇌 내(IC), 기관 내(예를 들어, 간 내), 서방성 이식편, 또는 피하 투여, 또는 삼투 또는 기계식 펌프를 이용한 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
적합하게는, 합성 펩티드는 적절한 진단 후 되도록 빨리 예를 들어 수 시간 또는 수일 내에 투여된다. 투여되는 기간 및 합성 펩티드의 양은 당 업자에 의해 쉽게 결정되며 일반적으로 펩티드의 유형 및 치료될 질환 또는 장애에 따라 결정된다.
본원에 기재된 바와 같이, 적합하게는 다양한 방법은 임의의 연령의 성인 및 어린이를 포함한 인간인 포유동물 피험체에서 수행된다.
실시양태에서, 치료 방법은 본원에서 기재된 적합한 합성 펩티드, 적합하게는 본원에서 기재된 합성 GLP-1 펩티드의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병으로 진단받은 환자의 치료를 포함한다.
본원에서 기재된 용어 "치료 유효량"은 질환 또는 장애(또는 그의 1가지 이상의 증상)의 중증도를 감소시키거나, 상기 질환 또는 장애의 1가지 이상의 증상을 개선하거나, 상기 질환 또는 장애의 진행을 방지하거나, 상기 질환 또는 장애의 관해를 유발하거나, 또 다른 요법의 치료 효과(들)를 상승시키거나 향상시키기에 충분한 합성 펩티드, 또는 제제의 양을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량은 미리 명시될 수 없으며 의료인, 예를 들어 주치의 또는 기타 의료 전문가에 의해 다양한 방법, 예를 들어 용량 적정법을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 적절한 치료 유효량은 예를 들어 동물 모델을 이용하여 통상의 실험에 의해 결정될 수 있다.
실시양태에서, 당뇨병으로 진단받은 환자의 치료 방법으로서 합성 인슐린의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원에서 기재된 바와 같이, 적합하게는 본원에서 기재된 합성 펩티드 또는 제제의 투여방법은 경구로 전달된다. 본원에서 기재된 바와 같이, 합성 펩티드는 경구 투여 후 위에서 단백질 분해, 즉 효소에 의한 분해에 실질적으로 내성을 갖는다.
본원에 기재된 방법 및 용도는 임의의 실시양태의 범위를 벗어나지 않으면서 기타 적합하게 변형되거나 응용될 수 있다는 것은 당 업자에게 너무나 자명할 것이다. 하기 실시예는 단지 예시를 위한 목적으로 여기에 포함되며 제한하려는 의도는 아니다.
<실시예>
실시예 1: 단백질 분해 내성 펩티드의 화학 합성 및 시험
1. 도입
다음은 본원에 기재된 단백질 분해 내성 펩티드의 대표적인 제조 방법을 제공한다.
2. 약어
Boc, tert-부틸옥시카보닐; DIPEA, N,N-디이소프로필에틸아민; DMF, N,N-디메틸포름아미드; DMSO, 디메틸설폭시드; ESI, 전자분무 이온화; Fmoc, 9-플로오레닐메틸옥시카보닐; GIP, 위억제성 폴리펩티드; GLP-1, 글루카곤 유사 펩티드 1; HCTU, O-(1H-6-클로로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트; RP-HPLC, 역상 고성능 액체 크로마토그래피; EC50, 반수 최대(50%) 유효 농도; LC/MS, 액체 크로마토그래피 결합된 질량 분석법; MeCN, 아세토니트릴; NMP, N-메틸피롤리디논; Pbf, 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐; PBS, 인산완충 식염수; tBu, 삼차-부틸; TFA, 트리플루오로아세트산; TIS, 트리이소프로필실란; Tris, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄; Trt, 트리페닐메틸; UV, 자외선.
3. 실험
3.1 펩티드합성
3.1.1 재료
N-α-Fmoc-L-아미노산은 바켐 아게(Switzerland)로부터 구입하였다. 이상 아미노산은 아이리스 바이오테크 아게(Iris Biotech AG, Germany)로부터 구입하거나 파마론(Pharmaron, China)에서 제조하였다. 노바신® TGR(TentaGel Rink) 및 노바신® TGA(TentaGel Wang) 합성수지는 노바바이오켐, 머크 바이오사이언스(Novabiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. 모든 펩티드는 Fmoc/tBu 프로토콜을 이용하여 자동화 합성(PTI Prelude)에 의해 제조하였다. 아스파라긴(Asn) 및 글루타민(Gln)은 그들의 측쇄 트리틸(Trt) 유도체로서 도입하였다. 트립토판(Trp) 및 리신(Lys)은 그들의 측쇄 Boc 유도체로서 도입하였다. 세린(Ser), 트레오닌(Thr) 및 티로신(Tyr)은 측쇄 tBu 에테르로서, 아스파테이트(Asp) 및 글루타메이트(Glu)는 그들의 측쇄 OtBu 에스테르로서 도입하였다. 아르기닌(Arg)은 측쇄 Pbf 유도체로서 도입하였다. 합성 시약은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, Dorset, United Kingdom)로부터 구입하였다. 용매는 허용되는 최고 등급으로 머크(Merck, Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 추가의 정제 없이 사용하였다.
3.1.2 α-메틸 아미노산을 포함하는 펩티드의 화학 합성을 위한 일반적 절차
달리 언급되지 않는다면, 모든 펩티드는 노바신® TGR 수지(초기 치환 0.24 mmole/g) 상에서 C-말단 카복사미드로서 제조하였다. 모든 아미노산(자연 및 비자연 모두)을 NMP 중 HCTU/DIPEA를 이용하여 실온에서 커플링하고, 아세트산 무수물 및 피리딘의 용액으로 잔여 작용성을 캡핑하였다. Fmoc를 DMF(20% v/v) 중 피페리딘을 이용하여 실온에서 디블록하였다.
3.1.3 선형 펩티드의 절단 및 정제
TFA(95% v/v), TIPS(2.5% v/v), 물(2.5% v/v)의 칵테일을 실온에서 교반하면서 처리하여 수지 지지체로부터 조 펩티드를 절단하였다. 절단 분액을 합하여, 회전 증발시켜 농축하고 냉각 디메틸에테르를 첨가하여 침전시키고, 원심분리에 의해 고체를 단리하였다. 조 펩티드를 건조 질소 흐름 하에 건조하여, 20% MeCN/물(v/v)로 원상태로 만들어 여과하였다. 조 펩티드를 애질런트 폴라리스(Agilent Polaris) C8-A 정지상(21.2 x 250 mm, 5 마이크론)을 이용하면서 베리언 SD-1 프렙 스타(Varian SD-1 Prep Star) 이원 펌프 시스템을 이용하여 물(0.1% TFA v/v) 중에 10% 내지 70% MeCN(0.1% TFA v/v)의 선형 용매 구배로 30분에 걸쳐 용리하여 크로마토그래피하고, 210 nm에서 UV 흡광도를 모니터하였다. 원하는 펩티드를 함유하는 분획을 모아 동결(드라이아이스/아세톤)시키고 동결건조하였다.
3.1.4 펩티드 분석 및 특성화(합성 후)
정제된 펩티드를 워터스 매쓰 링크스(Waters Mass Lynx) 3100 플랫폼을 이용한 단일 4극자 LC/MC에 의해 특성화하였다. 분석물을 워터스 X-브릿지(Bridge) C18 정지상(4.6 x 100 mm, 3 마이크론)에서 물(0.1% TFA v/v) 중 10-90% MeCN(0.1% TFA v/v)의 선형 이원 구배를 이용하여 1.5　mL　min-1 으로 실온에서 10분에 걸쳐 용리하여 크로마토그래피하였다. 분석물을 210 nm에서 흡광도 및 워터스 3100 질량 검출기(ESI+ 방식)를 이용한 이온화 두 가지 모두에 의해 검출하고, 계산된 이론값에 대해 분자량을 확인하였다. 분석 RP-HPLC 스펙트럼을 애질런트 1260 인피니티(Infinity) 시스템을 이용하여 기록하였다. 분석물을 애질런트 폴라리스 C8-A 정지상(4.6 x 100 mm, 3 마이크론)에서 물(0.1% TFA v/v) 중 (10-90% MeCN(0.1% TFA v/v)의 선형 이원 구배로 1.5　mL　min- 1으로 40℃에서 15분에 걸쳐 용리하여 크로마토그래피하였다.
4. 효소 절단 연구
4.1 α-메틸 잔기를 포함하는 펩티드의 단백질 분해 내성의 평가
하기 시판되는 정제 프로테아제를 야생형 인크레틴 및 공지된 취약성 부위에 α-메틸 아미노산을 포함하는 변형된 인크레틴을 절단하는 능력에 대해 평가하였다.
Figure pct00001
중성 엔도펩티다아제 ( 네프릴리신 ): 1.0 μg rhNEP를 NaOH(1.0 M)를 이용하여 pH8.3으로 조정된 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 50 mM NaHCO3을 포함하는 분석 완충액 900 ㎕에 재구성하였다.
펩신: 돼지 위점막의 동결건조된 펩신 1.0 mg을 pH 2.0에서 0.4% (w/v) 용액을 제공하는 분석 완충액 10 mM HCl 900 ㎕에 재구성하였다.
트립신: 돼지 췌장의 동결건조된 트립신 1 mg/mL 용액을 pH 7.8로 조정된 분석 완충액 50 mM Tris, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 1 mM HCl에 재구성하였다.
키모트립신: 1.0 μg rhCTRC를 pH 7.8로 조정된 분석 완충액 50 mM Tris, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 1 mM HCl 900 ㎕에 재구성하였다.
4.1.2 절차
평가를 위한 펩티드를 순수 물, 주사용 멸균 식염수(0.9% w/v NaCl/물) 또는 1X PBS(Dulbecco) 중에 1.0　mg/mL 농도의 용액으로 제조하였다. 100 ㎕(100 μg/mL 펩티드)의 상기 용액을 900 ㎕의 각 프로테아제 용액에 첨가하였다. 혈청 및 위액에 노출되는 과정에서 단백질 분해를 조사하는 추가의 실험을 실시하였다. 혈청 연구의 경우, 펩티드를 50% 암컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley)종 랫트 혈청(SD 랫트 혈청)과 인큐베이션하였다. 위액 연구의 경우, 펩티드를 신선한 랫트 위액과 1:1(부피:부피)로 인큐베이션하였다.
펩티드와 효소(또는 혈청 또는 위액)를 실험 기간에 37℃에 온도 제어된 수조에서 동시 인큐베이션하였다. 각 실험 과정에서, 인큐베이션된 펩티드-효소 혼합물의 100 ㎕ 분액(10 μg 펩티드)을 정기적으로 취해, 1:1 물/아세토니트릴 중 5% TFA(v/v)를 동일부피로 첨가하여 켄치시켜 단백질 분해 활성을 정지시키고, 액체 크로마토그래피 질량 분석(LC/MS)에 의해 분석하였다. 애질런트 폴라리스 C8-A 컬럼(4.6 x 100 mm, 3 마이크론)에서 물(0.1% TFA v/v) 중 (10-90% MeCN(0.1% TFA v/v)의 선형 이원 구배를 이용하여 1.5　mL　min- 1으로 실온에서 30분에 걸쳐 용리하여 크로마토그래피하였다. 분석물을 210 nm에서 UV 흡광도 및 워터스 3100 질량 검출기(ESI+ 방식)을 이용한 이온화 두 가지 모두에 의해 검출하였다. 처리 후 펩티드의 효소 절단으로부터 유래한 새로운 펩티드 종(단편)을 분석하고, 그들의 분자량을 이용하여 정확한 절단 부위를 확인하였다(각 경우 절단 가능한 결합을 강조).
본원에서 기재된 합성 GLP-1 펩티드의 생물학적 활성/수용체 효능을 적합하게는 생물학적 활성, 예를 들어 1가지 이상의 세포 수용체 반응의 촉진에 대해 시험한다. 인간, 마우스, 랫트, 또는 개 GLP-1 수용체(GLP-1R), 글루카곤 수용체 (GCGR) 또는 글루코스 의존성 인슐린 분비 자극 펩티드(위억제성 폴리펩티드) 수용체 (GIPR)를 발현하는 안정 세포주를 표준 방법에 의해 HEK293 세포 또는 CHO 세포에서 생성하였다. 상기 다양한 수용체를 펩티드가 활성화시키면 cAMP 2차 전달자가 하류에 축적되고, 이것을 기능 활성 분석법으로 측정할 수 있다.
cAMP 분석을 "분석 완충액"을 이용하여 수행하였다. 분석 완충액: 25 mM HEPES와 HBSS(Sigma # H8264), pH 7.4 중 0.1% BSA(Sigma # A3059), 그리고 0.5 mM IBMX(Sigma # I7018) 포함.
저단백질 결합 384 웰 플레이트(Greiner # 781280)를 사용하여 분석 완충액에 만들어진 5회 연속 희석된 시험 시료에서 eleven 1을 수행한다. 모든 시료 희석액은 2개씩 만든다.
냉동 용기에 관심의 수용체를 발현하는 동결된 세포를 수조에서 신속하게 해동시켜, 예열된 분석 완충액에 옮기고 240xg에서 5분간 회전시킨다. 세포를 배치(batch)에 따라 최적화된 농도(예를 들어, hGCGR 세포는 2x105 세포/ml, hGLP-1R 및 hGIPR 세포는 1x105 세포/ml)로 분석 완충액에 재현탁한다.
희석 플레이트로부터, 5 ㎕ 레플리카를 검정 얕은 웰 u-바닥형 384 웰 플레이트(Corning # 3676) 위에 찍는다. 여기에 5 ㎕ 세포 현탁액을 첨가하고 플레이트를 실온에서 30분간 인큐베이션한다.
시판되는 cAMP 다이나믹 2 HTRF 키트(Cisbio, Cat # 62AM4PEJ)를 이용하여 제조사에서 권장하는 두 단계 프로토콜을 따라 cAMP 수준을 측정한다. 간략하게, 항-cAMP 크립테이트(공여 형광단) 및 cAMP-d2(수용 형광단)를 키트에 제공된 접합 & 용해(conjugate & lysis) 완충액에 각각 1/20로 희석하여 별도로 구성한다. 5 ㎕ 항-cAMP 크립테이트를 분석 플레이트의 모든 웰에 첨가하고, 5 ㎕ cAMP-d2를 접합 및 용해 완충액이 첨가된 비특이적 결합(NSB) 웰을 제외한 모든 웰에 첨가한다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션한 후 여기 파장 320 nm와 방출 파장 620 nm & 665 nm를 이용하여 인비젼(Envision)(Perkin Elmer)에서 판독한다. 그 후 cAMP 분석에서 결정된 합성 펩티드의 EC50 값을 결정한다.
생물학적 활성/수용체 효능을 결정하기 위한 추가의 실험에서, 인간, 마우스 또는 랫트 GCGR 또는 GLP-1 수용체를 안정적으로 재조합 발현하는 CHO 세포를 상기와 같은 분석 완충액 중에 배양한다. 냉동보존된 세포 저장액을 1x 무혈청 세포 동결 배지-DMSO(Sigma Aldrich) 중에 바이알당 1x107 또는 2x107개로 제조하고 -80℃에 저장한다. 세포를 37℃로 신속하게 해동시킨 후 인간, 랫트, 및 마우스 혈청 알부민을 각각 4.4, 3.2 및 3.2%를 포함하는 분석 완충액(상기와 같은 완충액)에 희석한다. 펩티드를 100% DMSO 중에 연속 희석한 후 언급한 최종 농도의 혈청 알부민을 포함하는 상기와 같은 분석 완충액에 100배 희석한다. 이어서 희석된 펩티드를 검정 얕은 384 웰 마이크로타이터 분석 플레이트에 옮긴다. 세포를 분석 플레이트에 첨가하고 실온에서 30분간 인큐베이션한다. 인큐베이션 후 분석을 정지시키고, 시스바이오 바이오에세이(CisBio Bioassays)의 HTRF® 다이나믹 d2 cAMP 분석 키트를 이용하여 제조사의 가이드라인에 따라 cAMP 수준을 측정한다. 플레이트를 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 인비젼® 형광 플레이트 판독기에서 판독한다. 인간 및 랫트 혈청 알부민은 시그마 알드리치로부터 구입하고 마우스 혈청 알부민은 이퀴테크 바이오(Equitech Bio Ltd)로부터 구입한다.
데이터를 제조사의 가이드라인에 기재된 바와 같이 %델타 F로 변환하고 4-모수 로지스틱 모형에 의해 분석하여 EC50 값을 결정한다. 결정된 EC50 값은 재조합 세포주에서 GLP-1 및 글루카곤 수용체에 시험된 펩티드의 효능 및 유리 펩티드의 양을 결정하는 혈청 알부민에 대한 펩티드의 친화성 두 가지 모두에 따라 결정된다. 혈청 알부민과의 결합은 얻어진 EC50 값을 증가시킨다. 혈장 농도의 알부민에서 유리 펩티드의 비율 및 0% 혈청 알부민(SA)에서 EC50은 SA 농도에 따른 cAMP 생산에 있어 변화를 기초로 하여 계산될 수 있다. 상이한 펩티드 사이에서와 상이한 조건에서 GLP-1R과 GCGR에 대한 활성의 밸런스를 비교하기 위하여 EC50이 대조 펩티드와 연관되는 경우 이들을 서로 연관시킬 수 있다.
본원에서 기재된 합성 GLP-1 펩티드의 생물학적 활성/수용체 효능을 적합하게는 생물학적 활성, 예를 들어 1가지 이상의 세포 수용체 반응의 촉진에 대해 시험한다. 인간, 마우스, 랫트, 또는 개 GLP-1 수용체(GLP-1R), 글루카곤 수용체 (GCGR) 또는 글루코스 의존성 인슐린 분비 자극 펩티드(위억제성 폴리펩티드) 수용체 (GIPR)를 발현하는 안정 세포주를 표준 방법에 의해 HEK293 세포 또는 CHO 세포에서 생성한다. 상기 다양한 수용체를 펩티드가 활성화시키면 cAMP 2차 전달자가 하류에 생산되고, 이것을 기능 활성 분석법으로 측정할 수 있다.
cAMP 분석을 "분석 배지" 중에서 수행하였다. 분석 배지: DMEM(Gibco #41966) 중 10% FBS, 0.5 mM IBMX (Sigma # I7018) 포함.
저단백질 결합 384 웰 플레이트(Greiner # 781280)를 사용하여 분석 배지에 만들어진 5회 연속 희석된 시험 시료에서 eleven 1을 수행한다. 모든 시료 희석액은 2개씩 만든다.
냉동 용기에 관심의 수용체를 발현하는 동결된 세포를 수조에서 신속하게 해동시켜, 예열된 분석 배지에 옮기고 240xg에서 5분간 회전시킨다. 세포를 최적화된 농도(예를 들어, hGCGR 세포는 1x105 세포/ml, hGLP-1R 및 hGIPR 세포는 0.5x105 세포/ml)로 분석 배지에 재현탁한다.
희석 플레이트로부터, 5 ㎕ 레플리카를 검정 얕은 웰 u-바닥형 384 웰 플레이트(Corning # 3676) 위에 찍는다. 여기에 5 ㎕ 세포 현탁액을 첨가하고 플레이트를 실온에서 30분간 인큐베이션한다.
시판되는 cAMP 다이나믹 2 HTRF 키트(Cisbio, Cat # 62AM4PEJ)를 이용하여 제조사에서 권장하는 두 단계 프로토콜을 따라 cAMP 수준을 측정한다. 간략하게, 항-cAMP 크립테이트(공여 형광단) 및 cAMP-d2(수용 형광단)을 키트에 제공된 접합 & 용해 완충액에 각각 1/20로 희석하여 별개로 구성한다. 5 ㎕ 항-cAMP 크립테이트를 분석 플레이트의 모든 웰에 첨가하고, 5 ㎕ cAMP-d2를 접합 및 용해 완충액이 첨가된 비특이적 결합(NSB) 웰을 제외한 모든 웰에 첨가한다. 플레이트를 실온에서 1시간 인큐베이션한 후 여기 파장 320 nm와 방출 파장 620 nm & 665 nm를 이용하여 인비젼(Perkin Elmer)에서 판독한다. 그 후 cAMP 분석에서 결정된 합성 펩티드의 EC50 값을 결정한다.
생물학적 활성/수용체 효능을 결정하기 위한 추가의 실험에서, 인간, 마우스 또는 랫트 GlucR 또는 GLP-1 수용체를 안정적으로 재조합 발현하는 CHO 세포를 DMEM 10% FBS 및 제네티신(100 μg/ml) 중에서 배양한다. 냉동보존된 세포 저장액을 1x 무혈청 세포 동결 배지-DMSO(Sigma Aldrich) 중에 바이알당 2x107개로 제조하고 -80℃에 저장한다. 세포를 37℃로 신속하게 해동시킨 후, 인간, 랫트, 및 마우스 혈청 알부민을 각각 4.4, 3.2 및 3.2%를 포함하는 분석 완충액(DMEM)에 희석한다. 펩티드를 DMSO 중에 연속 희석한 후 언급한 최종 농도의 혈청 알부민을 포함하는 DMEM에 100배 희석한다. 이어서 희석된 펩티드를 검정 얕은 384 웰 마이크로타이터 분석 플레이트에 옮긴다. 세포를 분석 플레이트에 첨가하고 실온에서 30분간 인큐베이션한다. 인큐베이션 후 분석을 정지시키고, 시스바이오 바이오에세이의 HTRF® 다이나믹 d2 cAMP 분석 키트를 이용하여 제조사의 가이드라인에 따라 cAMP 수준을 측정한다. 플레이트를 퍼킨 엘머 인비젼® 형광 플레이트 판독기에서 판독한다. 인간 및 랫트 혈청 알부민은 시그마 알드리치로부터 구입하고 마우스 혈청 알부민은 이퀴테크 바이오로부터 구입한다.
데이터를 제조사의 가이드라인에 기재된 바와 같이 %델타 F로 변환하고 4-모수 로지스틱 모형에 의해 분석하여 EC50 값을 결정한다. 결정된 EC50 값은 재조합 세포주에서 GLP-1 및 글루카곤 수용체에 시험된 펩티드의 고유한 효능 및 유리 펩티드의 양을 결정하는 혈청 알부민에 대한 펩티드의 친화성 두 가지 모두에 따라 결정된다. 혈청 알부민과의 결합은 얻어진 EC50 값을 증가시킨다. 혈장 농도의 알부민에서 유리 펩티드의 비율 및 0% 혈청 알부민에서 EC50은 HSA 농도에 따른 cAMP 생산에 있어 변화를 기초로 하여 계산될 수 있다. 상이한 펩티드 사이에서와 상이한 조건에서 GLP-1R과 GlucR에서 활성의 밸런스를 비교하기 위하여 EC50이 대조 펩티드와 연관되는 경우 이들을 서로 연관시킬 수 있다.
4.1.3 결과
글루카곤 유사 펩티드 1의 효소 절단 분석은 [도 1]에 나타낸 바와 같이 치환에 적합한 부위가 Aib2, Phe6, Tyr13, Lys20, Phe22, Trp25, Lys28, 및 Arg30이라는 것을 나타내었다. 본원에서 기재된 합성 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1)을 개발하기 위한 반복법을 나타내는 대표적인 설계 흐름을 하기 표 2에 나타내며, 여기에 상기 아미노산 부위 및 다른 부위가 치환된다. 이러한 설계 흐름은 원하는 바와 같이 프로테아제 보호된 펩티드를 생산하기 위해 원하는 어떤 펩티드에든 쉽게 적용될 수 있다는 것을 알아야 한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
선택 프로테아제에 노출 후 상기 다양한 펩티드의 안정성, 및 결정된 EC50을 이용하여 원하는 합성 펩티드의 선택을 안내한다.
[도 2a-2c]는 변형된 유사체의 안정성/효능이 비교되는 표준 GLP-1 대조군, H-(Aib)2-EGT5 FTSDV10 SSYLE15 GQAAK20 EFIAW25 LVKGR30, 서열 번호 4에 대한 네프릴리신 안정성 연구의 결과를 나타낸다. 화살표는 원래 피크 위치, 및 프로테아제와 인큐베이션 후 4시간, 21시간 및 68시간에서 분해를 나타낸다. 나타난 바와 같이, 4개의 모든 방향족 잔기의 아미노 말단에서 신속한 분해가 일어났으며, 24시간까지 펩티드가 완전히 분해되었다.
[도 3a-3d]는 합성 GLP-1 펩티드, H-(Aib)2-EG-(S)5-(α-MeF)6-TSDV10 SS-(α-MeF)13-LE15 GQAAK20 E-(α-MeF)22-IA-(α-MeF)25 LVKGR30, 서열 번호 38에 대한 네프릴리신 안정성 연구의 결과를 나타낸다. 증명된 바와 같이, 위치 Phe6, Tyr13, Phe22 및 Trp25에서 치환된 알파-메틸 페닐알라닌뿐만 아니라 위치 5에 트레오닌에 세린의 치환을 가진 합성 GLP-1 펩티드는 96시간의 시간 경과에 단백질 분해를 보이지 않았다. 본원에서 기재된 바와 같이 측정된 효능 측정값은 합성 GLP-1 펩티드가 GLP-1 대조 펩티드, 서열 번호 4와 동일한 효능을 갖는다는 것을 나타내었다.
실험에서 네프릴리신 효소가 여전히 활성을 갖는다는 것을 증명하기 위하여, GLP-1 대조 펩티드, 서열 번호 4를 240시간 후에 첨가하였다. [도 4]에 나타난 바와 같이, 서열 번호 38의 GLP-1 합성 펩티드는 10일 후에 여전히 안정하였다([도 4a-4d]에서 박스 1 참조). [도 4b-4d]에서, 대조 펩티드가 첨가되고 단지 1시간 후에 신속하게 분해하기 시작하였으며(박스 2 참조) 24시간까지 상당한 분해가 일어났다(박스 3 참조).
[도 5a-5c]는 표준 GLP-1 대조군, 서열 번호 4에 대한 키모트립신 안정성 연구의 결과를 나타낸다. 화살표는 원래 피크의 위치, 및 프로테아제와 인큐베이션 후 45분 및 2시간에 분해를 나타낸다. 나타난 바와 같이 모든 소수성 잔기의 카복실 말단에서 신속한 분해가 일어났으며, 펩티드가 45분까지 완전히 분해되었다.
[도 6a-6c]는 합성 GLP-1 펩티드, 서열 번호 38에 대한 키모트립신 안정성 연구의 결과를 나타낸다. 증명된 바와 같이, 합성 GLP-1 펩티드는 48시간까지 분해가 일어났으며, Leu26/Val27에서만 절단이 발견되었다는 것을 보여주었다.
[도 7a-7c]는 합성 GLP-1 펩티드, H-(Aib)2-EG-(S)5-(α-MeF)6-TSDV10 SS-(α-MeF)13-LE15 GQAA-(α-MeK)20 E-(α-MeF)22-IA-(α-MeF)25-(V)26-V-(α-MeK)28-G-(G)30, 서열 번호 51에 대한 키모트립신 안정성 연구의 결과를 나타낸다. 증명된 바와 같이 류신 26에 발린으로 치환은 결과적으로 주요 절단 산물이 발견되지 않으면서 60시간에 걸쳐 안정성을 증명하는 합성 GLP-1 펩티드를 얻었다.
[도 8a-8c]는 표준 GLP-1 대조군, 서열 번호 4에 대한 트립신 안정성의 결과를 나타낸다. Lys20, Lys28 및 Arg30의 카복실 쪽에서 90분까지 신속한 단백질 분해가 일어났다.
[도 9a-9c]는 합성 GLP-1 펩티드, 서열 번호 38에 대한 트립신 안정성 연구의 결과를 나타낸다. 증명된 바와 같이, 합성 GLP-1 펩티드는 Lys20, Lys28 및 Arg30의 카복실 쪽에서 90분까지 분해가 일어났다는 것을 보여주었다.
[도 10a-10c]는 합성 GLP-1 펩티드, 서열 번호 51에 대한 트립신 안정성 연구의 결과를 나타낸다. 증명된 바와 같이, 알파-메틸 리신으로 Lys20 및 Lys28의 치환, Gly30으로 Arg30의 치환 및 Val26으로 Leu26 치환은 결과적으로 18시간 넘는 동안 상당히 연장된 안정성을 보여주는 합성 GLP-1 펩티드를 얻었다.
[도 11a-11b]는 표준 GLP-1 대조군, 서열 번호 4에 대한 혈청 안정성 연구의 결과를 나타낸다. 60시간 후에 신속한 단백질 분해가 일어났으며, 결과적으로 소량의 온전한 펩티드를 생성하였으며 혈청 프로테아제의 상당한 자가분해로 스펙트럼을 가리는 펩티드 단편을 생성하였다.
[도 12a-12b]는 합성 GLP-1 펩티드, 서열 번호 38에 대한 혈청 안정성 연구의 결과를 나타낸다. 60시간 후에, 펩티드의 대략 64%가 온전하게 남아 있으며, 혈청 프로테아제의 자가 분해로 스펙트럼을 가리는 펩티드 단편을 생성하였다.
[도 13a-13d]는 지질화 대조군 GLP-1 펩티드, H-(Aib)2-EGT5 FTSDV10 SSYLE15 GQAAK20 EFIAW25 LVKGR30-(K-팜), 서열 번호 5, 및 지질화 프로테아제 보호된 GLP-1 펩티드, H-(Aib)2-EG-(S)5-(α-MeF)6-TSDV10 SS-(α-MeF)13-LE15 GQAA-(α-MeK)20 E-(α-MeF)22-IA-(α-MeF)25-(V)26-V-(α-MeK)28-G-(G)30-K(팜), 서열 번호 52에 대한 위액 안정성 연구의 결과를 나타낸다. 지질화 프로테아제 보호된 GLP-1 단백질의 안정성은 지질화 대조군의 안정성을 크게 능가한다.
[도 14a-14e]는 지질화 프로테아제 내성의 서열 번호 52와 비교하여 시판되는 GLP-1 작용제(리라글루티드(Liraglutide, Novo Nordisk))에 대한 위액 안정성 연구의 결과를 나타낸다. 지질화 프로테아제 내성인 GLP-1 펩티드의 안정성은 리라글루티드의 안정성을 크게 능가한다. 안정성에 있어 상당한 차이는 확대된 스펙트럼을 보여주는 [도 15a-15e]에서도 추가로 증명되는데, 여기서 시간 경과에 따라 보호된 GLP-1 펩티드, 서열 번호 52의 사실상 변화없는 스펙트럼을 나타낸다.
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Claims (40)

  1. 천연(native) 아미노산 잔기에 1개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산 치환을 포함하는 합성 펩티드로서, 상기 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 유지하는 합성 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 1개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산이 치환된 천연 아미노산 잔기에 상응하는 것인 합성 펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 1개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산이 알파-메틸 히스티딘, 알파-메틸 알라닌, 알파-메틸 이소류신, 알파-메틸 아르기닌, 알파-메틸 류신, 알파-메틸 아스파라긴, 알파-메틸 리신, 알파-메틸 아스파르트산, 알파-메틸 메티오닌, 알파-메틸 시스테인, 알파-메틸 페닐알라닌, 알파-메틸 글루탐산, 알파-메틸 트레오닌, 알파-메틸 글루타민, 알파-메틸 트립토판, 알파-메틸 글리신, 알파-메틸 발린, 알파-메틸 오르니틴, 알파-메틸 프롤린, 알파-메틸 셀레노시스테인, 알파-메틸 세린 및 알파-메틸 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 합성 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는 합성 펩티드.
  5. 제4항에 있어서, DPP-IV, 네프릴리신, 키모트립신, 플라스민, 트롬빈, 칼리크레인, 트립신, 엘라스타아제 및/또는 펩신 분해에 실질적으로 내성을 갖는 합성 펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 아미노산 잔기는 단백질 분해 절단에 민감한 부위인 합성 펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드가 인크레틴 부류 펩티드인 합성 펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 펩티드가 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1: glucagon-like peptide-1), 글루코스 의존성 인슐린 분비 자극 펩티드(GIP: glucose-dependent insulinotropic peptide), 엑세나타이드 펩티드 플러스 글루카곤, 세크레틴, 테노모듈린, 옥신토모듈린 및 혈관 활성 장 펩티드(VIP: vasoactive intestinal peptide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 합성 펩티드.
  9. 제1항에 있어서, 펩티드가 인슐린인 합성 펩티드.
  10. 천연 아미노산 잔기에 3개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산 치환을 포함하는 합성 GLP-1 펩티드로서, 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 GLP-1 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능을 유지하는 합성 GLP-1 펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 3개 이상의 알파-메틸 작용기화 아미노산이 알파-메틸 페닐알라닌인 합성 GLP-1 펩티드.
  12. 제10항에 있어서, 4개의 알파-메틸 작용기화 아미노산을 포함하는 합성 GLP-1 펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 4개의 알파-메틸 작용기화 아미노산은 위치 Phe6, Try13, Phe22 및 Trp25에서 치환된 알파-메틸 페닐알라닌인 합성 GLP-1 펩티드.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 2에 아미노이소부티르산 치환(Aib2)을 더 포함하는 합성 GLP-1 펩티드.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 5에 세린 변형(Ser5)을 더 포함하는 합성 GLP-1 펩티드.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 Lys20 및 Lys28에서 치환된 알파-메틸 리신을 더 포함하는 합성 GLP-1 펩티드.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 류신26에서 치환된 발린을 더 포함하는 합성 GLP-1 펩티드.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 지질화를 더 포함하는 합성 GLP-1 펩티드.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는 합성 GLP-1 펩티드.
  20. 제19항에 있어서, DPP-IV, 네프릴리신, 키모트립신, 플라스민, 트롬빈, 칼리크레인, 트립신, 엘라스타아제 및/또는 펩신 분해에 실질적으로 내성을 갖는 합성 GLP-1 펩티드.
  21. a. 치환을 위한 펩티드 내 1개 이상의 천연 아미노산 잔기를 확인하는 단계, 및
    b. 확인된 천연 아미노산 잔기를 알파-메틸 작용기화 아미노산으로 치환하는 단계
    를 포함하는 합성 펩티드의 제조 방법으로서,
    합성 펩티드는 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 유지하고,
    합성 펩티드는 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는 것인 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 치환된 알파-메틸 작용기화 아미노산이 치환된 천연 아미노산 잔기에 상응하는 것인 제조 방법.
  23. 제21항에 있어서, 치환된 알파-메틸 작용기화 아미노산이 알파-메틸 페닐알라닌인 제조 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 펩티드는 DPP-IV, 네프릴리신, 키모트립신, 플라스민, 트롬빈, 칼리크레인, 트립신, 엘라스타아제 및/또는 펩신 분해에 실질적으로 내성을 갖는 것인 제조 방법.
  25. 제21항에 있어서, 확인 단계는 효소 절단에 민감한 부위의 아미노산을 확인하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  26. 제21항에 있어서, 펩티드가 인크레틴 부류 펩티드인 제조 방법.
  27. 제26항에 있어서, 펩티드가 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1), 글루카곤, 글루코스 의존성 인슐린 분비 자극 펩티드(GIP), 및 엑세나타이드 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  28. 제21항에 있어서, 펩티드가 인슐린인 제조 방법.
  29. a. 펩티드를 1종 이상의 프로테아제에 노출시키는 단계,
    b. 단백질 분해 절단에 민감한 부위인 1개 이상의 천연 아미노산 잔기를 확인하는 단계, 및
    c. 확인된 아미노산 잔기를 알파-메틸 작용기화 아미노산으로 치환하는 단계
    를 포함하는, 단백질 분해에 안정한 펩티드의 제조 방법으로서,
    합성 펩티드는 치환을 포함하지 않는 상응하는 합성 펩티드와 실질적으로 동일한 수용체 효능 및 선택성을 유지하고,
    합성 펩티드는 단백질 분해에 실질적으로 내성을 갖는 것인 제조 방법.
  30. 제29항에 있어서, 치환된 알파-메틸 작용기화 아미노산이 치환된 천연 아미노산 잔기에 상응하는 것인 제조 방법.
  31. 제29항에 있어서, 치환된 알파-메틸 작용기화 아미노산이 알파-메틸 페닐알라닌인 제조 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 합성 펩티드는 DPP-IV, 네프릴리신, 키모트립신, 플라스민, 트롬빈, 칼리크레인, 트립신, 엘라스타아제 및/또는 펩신 분해에 실질적으로 내성을 갖는 것인 제조 방법.
  33. 제32항에 있어서, 펩티드가 인크레틴 부류 펩티드인 제조 방법.
  34. 제33항에 있어서, 펩티드가 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1), 글루코스 의존성 인슐린 분비 자극 펩티드(GIP), 및 엑세나타이드 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
  35. 제29항에 있어서, 펩티드가 인슐린인 제조 방법.
  36. 환자의 치료 방법으로서, 제1항의 합성 펩티드의 약학적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  37. 당뇨병으로 진단받은 환자의 치료 방법으로서, 제10항의 합성 GLP-1 펩티드의 치료 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  38. 당뇨병으로 진단받은 환자의 치료 방법으로서, 제9항의 합성 인슐린의 치료 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 경구 투여인 치료 방법.
  40. 하기 아미노산 서열을 포함하는 합성 GLP-1 펩티드:
    R1-His-X1-Glu-Gly-X2-X3-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X4-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X5-Glu-X6-Ile-Ala-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2 (서열 번호 63)
    여기서,
    R1은 Hy, Ac 또는 pGlu이고,
    R2는 -NH2 또는 -OH이고,
    X1은 Ala, Aib, Pro 또는 Gly이고,
    X2는 Thr, Pro 또는 Ser이고,
    X3은 Aib, Bip, β,β-Dip, F5-Phe, Phe, PhG, Nle, 호모Phe, 호모Tyr, N-MePhe, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, Tyr, Trp, Tyr-OMe, 4I-Phe, 2F-Phe, 3F-Phe, 4F-Phe, 1-Nal, 2-Nal, Pro 또는 디-β,β-Me-Phe이고,
    X4는 Aib, Ala, Asp, Arg, Bip, Cha, β,β-Dip, Gln, F5-Phe, PhG, Nle, 호모Phe, 호모Tyr, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, Phe, Thr, Trp, Tyr-OMe, 4I-Phe, 2F-Phe, 3F-Phe, 4F-Phe, Tyr, 1-Nal, 2-Nal, Pro 또는 디-β,β-Me-Phe이고,
    X5는 Aib, Lys, D-pro, Pro 또는 α-MeLys이고,
    X6은 Aib, Asp, Arg, Bip, Cha, Leu, Lys, 2Cl-Phe, 3Cl-Phe, 4Cl-Phe, PhG, 호모Phe, 2Me-Phe, 3Me-Phe, 4Me-Phe, 2CF3-Phe, 3CF3-Phe, 4CF3-Phe, β-Phe, β-MePhe, D-phe, 4I-Phe, 3I-Phe, 2F-Phe, β,β-Dip, β-Ala, Nle, Leu, F5-Phe, 호모Tyr, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, Ser, Tyr, Trp, Tyr-OMe, 3F-Phe, 4F-Phe, Pro, 1-Nal, 2-Nal 또는 디-β,β-Me-Phe이고,
    X7은 Aib, Arg, Bip, Cha, β,β-Dip, F5-Phe, PhG, Phe, Tyr, 호모Phe, 호모Tyr, α-MePhe, α-Me-2F-Phe, 2Me-Phe, 3Me-Phe, 4Me-Phe, Nle, Tyr-OMe, 4I-Phe, 1-Nal, 2-Nal, 2F-Phe, 3F-Phe, 4F-Phe, Pro, N-MeTrp, α-MeTrp 또는 디-β,β-Me-Phe이고,
    X8은 Aib, Ala, Arg, Asp, Glu, Nle, Pro, Ser, N-MeLeu, α-MeLeu 또는 Val이고,
    X9는 Aib, Glu, Lys, α-MeVal 또는 Pro이고,
    X10은 Aib, Glu, α-MeLys 또는 Pro이고,
    X11은 Aib, Glu, Pro 또는 Ser이고,
    X12는 Aib, Gly, Glu, Pro 또는 α-MeArg이다.
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