JP2017502003A - プロテアーゼ耐性ペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、プロテアーゼ耐性ペプチド、そのようなペプチドの製造方法、ならびにプロテアーゼ耐性ペプチドを含む組成物、およびそのようなペプチドを用いる治療方法を提供する。本明細書に記載の方法論による、標準ペプチド合成中の、アルファ−メチル官能基化アミノ酸の主鎖への直接的組み込みが、プロテアーゼ耐性ペプチドを生成するために決定された。【選択図】図１

Description

本発明は、プロテアーゼ耐性ペプチド、そのようなペプチドの製造方法、ならびにプロテアーゼ耐性ペプチドを含む組成物、およびそのようなペプチドを用いる治療方法を提供する。本明細書には、標準ペプチド合成中の、アルファ−メチル官能基化アミノ酸の主鎖への直接的組み込みが方法論を用いて記載されている。

主にペプチドが酵素による分解を受けやすいという性質のために、血中濃度半減期が短い、経口による生体利用効率が低いなどの要因によって、長時間作用型治療用ペプチドの開発が妨げられている。細胞表面におけるペプチドシグナル伝達現象の停止、消化中のタンパク質およびペプチドの胃での分解などの、必須生体分子プロセスの調節を含むタンパク質分解機能の多くは必要である。したがって、多くの場合、他の代謝障害を引き起こさずに、重要なタンパク質分解酵素の活性を簡単に阻害することはできない。したがって、分解を防止するために、対象のペプチドの酵素耐性を増大させることが望ましい。

酵素耐性を増大させるために、一般に、次の２つの基本的な方法、配列の特異的修飾、すなわちペプチド自身の一次構造に影響を与えるような修飾、および全体的に有効な修飾、すなわち、ペプチド全体のある物理化学的特性を変えるような修飾、がある。戦略的に導入すれば、そうしなければ作用が望まれるペプチドを除去または不活性化するであろう自然の生理的プロセス、例えば酵素分解および／または腎臓の限外濾過などの影響を、そのような修飾は低減し得る。

配列の特異的修飾には、タンパク質分解耐性異常アミノ酸の組み込み、あるいは自然に発生する側鎖官能基間の環化、例えば、ジスルフィド形成（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）、またはラクタム化（Ｌｙｓ−ＧｌｕもしくはＬｙｓ−Ａｓｐ）などのより複雑な修飾が含まれる。修飾には、さらに、ペプチド骨格内での非天然アミノ酸サロゲートなどの環化、例えば、オレフィンメタセシスステープリングが含まれる。

全体的修飾には、ペプチドの脂質化、例えばパルミトイル化、ペグ化などのプロセスが含まれる。パルミトイル化は、血清中の天然に豊富なアルブミンと弱く結合する、ペプチドの循環リザーバを形成する効果を有する。アルブミンと結合したペプチドは、その会合錯体の大きさが糸球体濾過のカットオフより大きいため、腎臓の限外濾過を効果的に免れる。ペプチドはアルブミンの表面から解離するので、再び内因性受容体と自由に相互作用することができる。ペグ化は、タンパク質分解からペプチドを物理的に保護する効果を有し、かつかなりの親水性を付与し、水和時、治療分子の流体力学半径を大きく増大させ、これによりペプチドは腎臓による除去が免れる。しかし、脂質化もペグ化も、ペプチド主鎖のタンパク質分解に対する感受性の高さに大きく影響を及ぼすものではない。

これらの技術は、一般の治療用ペプチドに広く提供可能であり、ある程度、循環上の半減期を長くできるものの、ペプチドおよびタンパク質の酵素分解に対する安定性を高める方法が、特に経口投与用ペプチドの製造を望む観点から、今もなお要望されている。

上記要求を満たす実施形態を記載する。

一実施形態においては、天然アミノ酸残基のアルファ−メチル官能基化アミノ酸による少なくとも１つの置換を含む合成ペプチドが提供される。合成ペプチドは、置換を含まない対応する合成ペプチドと同じ受容体効力および選択性を実質的に維持していることが好ましい。

実施形態では、少なくとも１つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、置換された天然アミノ酸残基に対応している。少なくとも１つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸には、アルファ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルアラニン、アルファ−メチルイソロイシン、アルファ−メチルアルギニン、アルファ−メチルロイシン、アルファ−メチルアスパラギン、アルファ−メチルリシン、アルファ−メチルアスパラギン酸、アルファ−メチルメチオニン、アルファ−メチルシステイン、アルファ−メチルフェニルアラニン、アルファ−メチルグルタミン酸、アルファ−メチルスレオニン、アルファ−メチルグルタミン、アルファ−メチルトリプトファン、アルファ−メチルグリシン、アルファ−メチルバリン、アルファ−メチルオルニチン、アルファ−メチルプロリン、アルファ−メチルセレノシステイン、アルファ−メチルセリンおよび／またはアルファ−メチルチロシンが含まれることが好ましい。

実施形態では、合成ペプチドは、タンパク質分解、例えば、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、エラスターゼ、トリプシンおよび／またはペプシンによる分解などに実質的に耐性を有している。

天然アミノ酸残基は、タンパク質分解による切断に感受性の高い部位であることが好ましい。

実施形態では、ペプチドは、限定はされないが、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルコース依存性インスリン分泌促進ペプチド（ＧＩＰ）、エクセナチドペプチドプラスグルカゴン、セクレチン、テノモジュリン、オキシントモジュリン、および血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）などの、インクレチンに分類されるペプチドである。

他の実施形態では、ペプチドはインスリンである。

さらに他の実施形態では、好ましくは、天然アミノ酸残基のアルファ−メチル官能基化アミノ酸による少なくとも３つの置換を含むＧＬＰ−１ペプチドであって、その合成ＧＬＰ−１ペプチドは、置換を含まない対応する合成ＧＬＰ−１ペプチドと同じ受容体効力および選択性を実質的に維持しているＧＬＰ−１ペプチドが提供される。実施形態では、少なくとも３つ、または少なくとも４つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、アルファ−メチルフェニルアラニンである。アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、Ｐｈｅ６、Ｔｒｙ１３、Ｐｈｅ２２およびＴｒｐ２５の位置で置換されたアルファ−メチルフェニルアラニンであることが好ましい。

ＧＬＰ−１ペプチドは、さらに、２の位置のアミノイソ酪酸置換（Ａｉｂ２）、５の位置のセリン修飾（Ｓｅｒ５）、２０および２８の位置のアルファ−メチルリシン置換（α−ＭｅＬｙｓ２０）（α−ＭｅＬｙｓ２８）、２６の位置のバリン修飾（Ｖａｌ２６）、および／またはカルボキシ末端側の脂質化もしくはペグ化を含むことが好ましい。

置換するペプチド中の少なくとも１つの天然アミノ酸残基を特定すること、およびその特定した天然アミノ酸残基をアルファ−メチル官能基化アミノ酸で置換することを含む、合成ペプチドの調製方法もまた提供される。合成ペプチドは、置換を含まない対応する合成ペプチドと同じ受容体効力および選択性を実質的に維持しており、かつタンパク質分解に対する耐性を実質的に有していることが好ましい。

さらに他の実施形態では、１種以上のプロテアーゼにペプチドを暴露すること、少なくとも１つの、タンパク質分解による切断を受けやすい部位の天然アミノ酸残基を特定すること、およびその特定したアミノ酸残基をアルファ−メチル官能基化アミノ酸で置換することを含む、タンパク質分解に安定なペプチドを調製する方法が提供される。合成ペプチドは、置換を含まない対応する合成ペプチドと同じ受容体効力および選択性を実質的に維持しており、かつタンパク質分解に対する耐性を実質的に有していることが好ましい。

本明細書に記載の合成ペプチドを薬学的に有効な量投与することを含む、患者を治療する方法もまた提供される。

さらに他の実施形態では、下記のアミノ酸配列を含む合成ＧＬＰ−１ペプチドが提供される。
Ｒ¹−Ｈｉｓ−Ｘ１−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ４−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘ５−Ｇｌｕ−Ｘ６−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｒ２（配列番号：２）（但し、
Ｒ¹は、Ｈｙ、ＡｃまたはｐＧｌｕであり；
Ｒ²は、−ＮＨ₂または−ＯＨであり；
Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｉｂ、ＰｒｏまたはＧｌｙであり；
Ｘ２は、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；
Ｘ３は、Ａｉｂ、Ｂｉｐ、β，β−Ｄｉｐ、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｎｌｅ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、Ｎ−ＭｅＰｈｅ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩ、Ｐｒｏまたはジ−β，β−ＭｅＰｈｅであり；
Ｘ４は、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、β，β−Ｄｉｐ、Ｇｌｎ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｎｌｅ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩ、Ｐｒｏ、ジ−β，β−ＭｅＰｈｅ、α−ＭｅＴｙｒまたはジ−β，β−ＭｅＴｙｒであり；
Ｘ５は、Ａｉｂ、Ｌｙｓ、Ｄ−ｐｒｏ、Ｐｒｏもしくはα−ＭｅＬｙｓまたはジ−β，β−ＭｅＬｙｓであり；
Ｘ６は、Ａｉｂ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、２Ｃｌ−Ｐｈｅ、３Ｃｌ−Ｐｈｅ、４Ｃｌ−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、ホモＰｈｅ、２Ｍｅ−Ｐｈｅ、３Ｍｅ−Ｐｈｅ、４Ｍｅ−Ｐｈｅ、２ＣＦ₃−Ｐｈｅ、３ＣＦ₃−Ｐｈｅ、４ＣＦ₃−Ｐｈｅ、β−Ｐｈｅ、β−ＭｅＰｈｅ、Ｄ−ｐｈｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、３Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、β，β−Ｄｉｐ、β−Ａｌａ、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩまたはジ−β，β−ＭｅＰｈｅ；α−ＭｅＴｙｒ、ジ−β，β−ＭｅＴｙｒ、α−ＭｅＴｒｐまたはジ−β，β−ＭｅＴｒｐであり；
Ｘ７は、Ａｉｂ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、β，β−Ｄｉｐ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、２Ｍｅ−Ｐｈｅ、３Ｍｅ−Ｐｈｅ、４Ｍｅ−Ｐｈｅ、Ｎｌｅ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｎ−ＭｅＴｒｐ、α−ＭｅＴｒｐ、ジ−β，β−ＭｅＴｒｐ、ジ−β，β−Ｍｅ−Ｐｈｅ；α−ＭｅＴｙｒまたはジ−β，β−ＭｅＴｙｒであり；
Ｘ８は、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｎ−ＭｅＬｅｕ、α−ＭｅＬｅｕ、Ｖａｌまたはα−ＭｅＶａｌであり；
Ｘ９は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、α−ＭｅＶａｌまたはα−ＭｅＬｅｕであり；
Ｘ１０は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏまたはα−ＭｅＬｙｓであり；
Ｘ１１は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；かつ
Ｘ１２は、Ａｉｂ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、α−ＭｅＡｒｇまたはα−ＭｅＬｙｓである。）

さらに他の実施形態、特徴、および実施形態の利点、ならびに各種実施形態の構成および動作を、添付図面を参照しながら、以下に詳細に記載する。

グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）におけるアミノ酸置換部位の例を示す。（配列番号：３） ＧＬＰ−１コンパレータのネプリライシンによる分解を示す。 ネプリライシンに暴露された、本明細書に記載の実施形態による合成ＧＬＰ−１タンパク質の安定性を示す。 ネプリライシンに２４０時間暴露後の、本明細書に記載の実施形態による合成ＧＬＰ−１タンパク質の安定性を示す。 ＧＬＰ−１コンパレータのキモトリプシンによる分解を示す。 キモトリプシンに暴露された、本明細書に記載の実施形態による合成ＧＬＰ−１タンパク質の安定性を示す。 キモトリプシンに暴露された、本明細書に記載の実施形態による合成ＧＬＰ−１タンパク質の安定性を示す。 ＧＬＰ−１コンパレータのトリプシンによる分解を示す。 トリプシンに暴露された、本明細書に記載の実施形態による合成ＧＬＰ−１タンパク質の安定性を示す。 トリプシンに暴露された、本明細書に記載の実施形態による合成ＧＬＰ−１タンパク質の安定性を示す。 ＧＬＰ−１コンパレータの血清による分解を示す。 血清に暴露された、本明細書に記載の実施形態による合成ＧＬＰ−１タンパク質の安定性を示す。 胃液に暴露された、脂質付加コンパレータと、本明細書に記載の実施形態による脂質付加合成ＧＬＰ−１タンパク質の安定性を示す。 胃液に暴露された、商業的に入手可能なＧＬＰ−１タンパク質と、本明細書に記載の実施形態による合成ＧＬＰ−１タンパク質の安定性を示す。 胃液に暴露された、商業的に入手可能なＧＬＰ−１タンパク質と、本明細書に記載の実施形態による合成ＧＬＰ−１タンパク質の安定性試験の結果を示す拡大スペクトルを示す。

ここで説明し記載する特定の実施は、例であって、本願の特許請求の範囲を決して他の方法で限定することを意図するものではないことは認められるべきであろう。

本明細書で言及する、公開された特許、特許出願、ウェブサイト、会社名、科学文献は、参照することにより、その全内容が、それぞれが参照することにより特にかつ個々に本明細書に組み込まれると指示されたのと同じ程度まで、本明細書に組み込まれる。本明細書に引用された参照文献と本明細書に固有の教示に矛盾があれば、その解決には後者が選択されるであろう。同様に、ある用語または句がこの分野で理解されている定義と、本明細書で特に教示されているその用語または句の定義に矛盾があれば、その解決には後者が選択されるであろう。

本明細書で使用されるとき、文脈上明白に他の意味で使用されている場合を除き、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特別に、それらが言及する用語の複数形も包含するものとする。「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、本明細書では、「略（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、「〜辺り（ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ）」、「およそ（ｒｏｕｇｈｌｙ）」または「〜程度（ａｒｏｕｎｄ）」の意味で使用される。「約（ａｂｏｕｔ）」という用語が数値範囲と共に使用されるときは、示された数値の上限および下限を超える範囲に拡げる。一般に、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、本明細書では、数値を、示した値の上下２０％まで変化させるために使用される。

本明細書で使用される技術用語および科学用語は、他に定義されていなければ、本願が属する技術分野において通常の技術を有する人に一般に理解される意味を有する。本明細書では、当業者に知られる様々な方法および材料が記載される。ペプチド合成の一般原理が記載された標準的な参考文献としては、Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ．，“Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（２００４）が挙げられる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」および「タンパク質フラグメント」の用語は、アミノ酸残基のポリマーを指し、本明細書では互いに置き換えて使用できる。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸ポリマーの人工化学類似物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然のアミノ酸ポリマーおよび非天然のアミノ酸ポリマーに適用される。

「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似の機能を有するアミノ酸アナログおよびアミノ酸類似物を指す。天然アミノ酸は遺伝子コードによってコードされたもの、およびそれらのアミノ酸が後で修飾されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、例えば、水素原子、カルボキシ基、アミノ基およびＲ基に結合するアルファ炭素原子を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのようなアナログは修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）、または修飾されたペプチド骨格を有することができるが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸類似物は、アミノ酸の一般化学構造と異なる化学構造を有するが、天然アミノ酸と類似の機能を有する化学化合物を指す。「アミノ酸」および「アミノ酸残基」という用語は、全体を通して互いに置き換えて使用することができる。

ペプチドの代謝的安定性を改善することを意図した化学修飾の大半は、ペプチド主鎖の合成後に、追加の化学的操作、例えば、ラクタム化、ジスルフィド架橋による閉鎖、脂質化またはペグ化を含む。そのような修飾は時間かかることが多く、また製品の最終価格を大きく上昇させるおそれがある。

本明細書に記載するように、標準的なペプチド合成中に主鎖にアルファ−メチル官能基化アミノ酸を組み込むことにより、本明細書に記載の方法がより容易になり、また大規模製造により適したものとなる。ＧＬＰ−１、グルカゴン、ＶＩＰおよびセクレチンを含むインクレチンクラスなどの、本来らせん状であるペプチドの化学合成に関し、本明細書に記載されるように、アルファ−メチル官能基化アミノ酸の天然のターン誘導効果が合成時のペプチドの粗収量を改善する。

本明細書に記載するように、アルファ−メチルアミノ酸は合成ペプチドの合成中に所望の部位に戦略的に組み込まれる。この修飾アミノ酸は、ペプチドの受容体効力に一般に不可欠とされる、天然の側鎖の官能性をペプチドに保持させる。

本明細書では、ペプチドの天然酵素により受ける不利益に対処し得る組成物および方法が提供される。アルファ−メチル官能基化アミノ酸の部位特異的組み込みによって感受性の高い部位（例えば、切断しやすい結合）を保護することによって、野生型ペプチドと同じ受容体効力および選択制を実質的に維持しながら、酵素分解に対し高い耐性を有するペプチドが提供される。

プロテアーゼ耐性を示す合成ペプチド
実施形態では、天然アミノ酸残基のアルファ−メチル官能基化アミノ酸による少なくとも１つの置換を含む合成ペプチドが提供される。他の実施形態では、天然アミノ酸残基のアルファ−メチル官能基化アミノ酸による少なくとも２つの置換を含む合成ペプチドが提供される。

本明細書に記載されるように、「合成ペプチド」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基またはＣ末端と他のアミノ酸のアミノ基またはＮ末端とを化学的に結合することによって生成されたアミノ酸残基のポリマーを指す。化学的なペプチド合成は、ペプチドのＣ末端で始まり、Ｎ末端で終わる。この分野では、合成ペプチドを生成する様々なペプチド合成法がよく知られている。

本明細書に記載されるように、「アルファ−メチル官能基化アミノ酸」は、アミノ酸の最初の（アルファ）炭素原子が、そのアルファ炭素原子に結合したメチル置換基（ＣＨ₃）を含むアミノ酸を指す。アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、そのような機能化を含む２１種のアミノ酸のいくつかを含む。

明細書全体を通して記載されるように、アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、ペプチド中の任意の天然アミノ酸と置換され得る、すなわち、代り得る。「天然」アミノ酸は、天然または野生型ペプチドに存在するアミノ酸を指し、それは置換される。

置換は、天然アミノ酸のアルファ−官能基化アミノ酸による置換を指す。合成ペプチドの化学合成中、天然アミノ酸はアルファ−官能基化アミノ酸によって容易に置換され得る。

本明細書に記載の合成ペプチドは、任意の長さ、すなわち、任意の数のアミノ酸からなる長さであってよいが、好ましくは、約５個〜約２００個のアミノ酸であり、好ましくは、約１０個〜約１５０個のアミノ酸であり、約２０個〜約１００個のアミノ酸、約３０個〜約７５個のアミノ酸、または約２０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、もしくは約１００個のアミノ酸の長さである。

明細書全体を通して記載されるように、天然アミノ酸を置換した１つ以上のアルファ−官能基化アミノ酸を含む本明細書に記載の合成ペプチドは、置換を含まない対応する合成ペプチドと同じ受容体効力および選択性を実質的に維持している。ある場合には、天然アミノ酸を置換した２つ以上のアルファ−官能基化アミノ酸を含む。

「受容体効力」という用語は、ペプチドの半数（５０％）効果濃度（ＥＣ₅₀）の逆数を指す。ＥＣ₅₀は、特定の暴露時間後、ペプチドの選択されたターゲットに対するベースライン応答と最大応答の中間の生物学的応答を誘発するペプチドの濃度を指す。したがって、ＥＣ₅₀が小さい値を示すペプチドは対応する高い受容体効力を有し、一方、ＥＣ₅₀が大きい値を示すペプチドは対応する低い受容体効力を有し、受容体に関係する応答を誘発するのに必要なペプチドが多いほど、その受容体に対するそのペプチドの効力は小さい。

受容体効力およびＥＣ₅₀を測定する方法はこの分野ではよく知られており、適切には、１つ以上の細胞性受容体応答の刺激を測定することが含まれる。例えば、ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）、またはグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（胃抑制ポリペチド）受容体（ＧＩＰＲ）を発現する好適な細胞株を標準法により生成する。これらの種々の受容体のペプチド活性化により、機能的活性アッセイで測定し得るｃＡＭＰ二次メッセンジャーの下流生成がもたらされる。これらの測定からＥＣ₅₀が容易に測定される。

明細書全体を通して記載されるように、アルファ−官能基化アミノ酸（本明細書では、「置換ペプチド」とも称する）による１つ以上の置換を含む合成ペプチドは、置換を含まない対応する合成ペプチドと「実質的に同じ」受容体効力を維持している。本明細書で使用されるとき、「実質的に同じ」は、受容体効力について言及した場合、置換ペプチドが、置換を含まず、むしろ元の修飾されていない野生型配列、または他の適切なコンパレータ配列（すなわち、対照）を含んでいるペプチドの受容体効力と比較して、好ましくは７５％の受容体効力を示ことを意味する。さらに他の実施形態では、置換ペプチドは、置換を含まず、むしろ元の修飾されていない野生型配列、または他の適切なコンパレータ配列（すなわち、対照）を含んでいるペプチドの受容体効力と比較して、好ましくは約８０％の受容体効力、約８５％の受容体効力、約９０％の受容体効力、約９１％の受容体効力、約９２％の受容体効力、約９３％の受容体効力、約９４％の受容体効力、約９５％の受容体効力、約９６％の受容体効力、約９７％の受容体効力、約９８％の受容体効力、約９９％の受容体効力、約９９．１％の受容体効力、約９９．２％の受容体効力、約９９．３％の受容体効力、約９９．４％の受容体効力、約９９．５％の受容体効力、約９９．６％の受容体効力、約９９．７％の受容体効力、約９９．８％の受容体効力、約９９．９％の受容体効力、または、好ましくは約１００％の受容体効力を示す。

明細書全体を通して記載されるように、アルファ−官能基化アミノ酸による１つ以上の置換を含む合成ペプチドは、また、置換を含まない対応する合成ペプチドと「実質的に同じ選択性」を維持していることが好ましい。本明細書で使用されるとき、「選択性」は、ペプチドがそのターゲット（すなわち、結合するように設計されているアゴニスト）と結合する一方、他のターゲットではないタンパク質と結合しない能力を指す。置換ペプチドは、置換を含まず、むしろ元の修飾されていない野生型配列、または他の適切なコンパレータ配列（すなわち、対照）を含んでいるペプチドの受容体効力と比較したとき、「実質的に同じ選択性」を示し、したがって、約７５％の選択性を示ことが好ましい。さらに他の実施形態では、置換ペプチドは、置換を含まず、むしろ元の修飾されていない野生型配列、または他の適切なコンパレータ配列（すなわち、対照）を含んでいるペプチドの選択性と比較して、好ましくは約８０％の選択性、約８５％の選択性、約９０％の選択性、約９１％の選択性、約９２％の選択性、約９３％の選択性、約９４％の選択性、約９５％の選択性、約９６％の選択性、約９７％の選択性、約９８％の選択性、約９９％の選択性、約９９．１％の選択性、約９９．２％の選択性、約９９．３％の選択性、約９９．４％の選択性、約９９．５％の選択性、約９９．６％の選択性、約９９．７％の選択性、約９９．８％の選択性、約９９．９％の選択性、または、好ましくは約１００％の選択性を示す。

アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、野生型タンパク質の置換天然アミノ酸に対応していることが好ましい。すなわち、元の野生型ペプチド配列中のアミノ酸が、同じ側鎖を有するアルファ−官能基化アミノ酸で置換されている。換言すれば、例えば、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒなどが、それぞれα−ＭｅＰｈｅ、α−ＭｅＴｒｐ、α−ＭｅＴｙｒなどで置換されている。

さらに他の実施形態では、アルファ−メチル官能基化アミノ酸は置換天然アミノ酸と同じクラスに対応している。例えば、脂肪族アルファ−メチル官能基化アミノ酸は脂肪族天然アミノ酸を置換し、ヒドロキシルアルファ−メチル官能基化アミノ酸はヒドロキシル天然アミノ酸を置換し、硫黄含有アルファ−メチル官能基化アミノ酸は硫黄含有天然アミノ酸を置換し、環状アルファ−メチル官能基化アミノ酸は環状天然アミノ酸を置換し、芳香族アルファ−メチル官能基化アミノ酸は芳香族天然アミノ酸を置換し、塩基性アルファ−メチル官能基化アミノ酸は塩基性天然アミノ酸を置換し、かつ／または酸性アルファ−メチル官能基化アミノ酸は酸性天然アミノ酸と置換する。

さらなる実施形態では、アルファ−メチル官能基化アミノ酸は置換天然アミノ酸に対応していない。

アルファ−メチル官能基化アミノ酸の商業的供給源としては、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのＢａｃｈｅｍ ＡＧが挙げられる。

例示的実施形態では、本明細書に記載の合成ペプチドにおける少なくとも１つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、アルファ−メチルフェニルアラニンである。

さらに他の実施形態では、本明細書に記載の合成ペプチドにおける少なくとも１つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、アルファ−メチル官能基化ヒスチジン、アルファ−メチル官能基化アラニン、アルファ−メチル官能基化イソロイシン、アルファ−メチル官能基化アルギニン、アルファ−メチル官能基化ロイシン、アルファ−メチル官能基化アスパラギン、アルファ−メチル官能基化リシン、アルファ−メチル官能基化アスパラギン酸、アルファ−メチル官能基化メチオニン、アルファ−メチル官能基化システイン、アルファ−メチル官能基化フェニルアラニン、アルファ−メチル官能基化グルタミン酸、アルファ−メチル官能基化スレオニン、アルファ−メチル官能基化グルタミン、アルファ−メチル官能基化トリプトファン、アルファ−メチル官能基化グリシン、アルファ−メチル官能基化バリン、アルファ−メチル官能基化オルニチン、アルファ−メチル官能基化プロリン、アルファ−メチル官能基化セレノシステイン、アルファ−メチル官能基化セリンおよびアルファ−メチル官能基化チロシンから選択される。

明細書全体を通して記載されるように、本明細書に記載の合成ペプチドは、タンパク質分解に対し実質的に耐性を有している。

本明細書で使用されるとき、「タンパク質分解」は、ペプチドがより小さいペプチドまたはアミノ酸に分解されることを意味し、一般に酵素によるペプチド結合の加水分解によって引き起こされる。

タンパク質分解に「実質的に耐性」を有する、明細書全体を通して示されている合成ペプチドは、合成ペプチドの少なくとも約５０％が、酵素が所定期間一般に活性である条件（すなわち、適切なｐＨ、温度、その他の環境条件）の下で、酵素に暴露された後も完全のままであることを示している。本明細書で示される合成ペプチドは、少なくとも４時間、タンパク質分解に実質的に耐性を有していることが好ましく、より好ましくは、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１６８時間、少なくとも１９２時間、少なくとも２１６時間、少なくとも２４０時間、または、約３６時間〜約２４０時間、約４８時間〜２４０時間、約７２時間〜約２４０時間、約９６時間〜約２４０時間、約１２０時間〜約２４０時間、約１４４時間〜約２４０時間、約１６８時間〜約２４０時間、約１９２時間〜約２４０時間、もしくは約２１６時間〜約２４０時間である。さらなる実施形態では、合成ペプチドの少なくとも約８０％が、酵素が所定期間一般に活性である条件下で、酵素に暴露された後も完全のままであり、より好ましくは、合成ペプチドの少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、少なくとも約９９．９％、または少なくとも約１００％が、酵素が所定期間一般に活性である条件下で、酵素に暴露された後も完全のままである。

示されている合成ペプチドは、哺乳類の体内、好ましくはヒトの体内に見出される１種以上の酵素によるタンパク質分解に対し実質的に耐性を有していることが好ましい。例えば、合成ペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）、ネプリライシン、キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよびペプシンの１種以上によるタンパク質分解に対し耐性を有していることが好ましい。好ましい実施形態では、合成ペプチドは上に挙げた酵素の２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、または好ましくは全てによるタンパク質分解に対し耐性を有している。本明細書に記載の合成ペプチドはまた、この分野で知られている他の酵素によるタンパク質分解に対し実質的に耐性を有することができる。実施形態では、本明細書に記載の合成ペプチドは、消化（胃の）酵素および／または血中／血清中酵素によるタンパク質分解に対し実質的に耐性を有している。

実施形態では、本明細書に記載の合成ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶおよびネプリライシンによるタンパク質分解に対し実質的に耐性を有している。実施形態では、本明細書に記載の合成ペプチドは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼによるタンパク質分解に対し実質的に耐性を有している。実施形態では、本明細書に記載の合成ペプチドは、プラスミン、トロンビンおよびカリクレインによるタンパク質分解に対し実質的に耐性を有している。実施形態では、本明細書に記載の合成ペプチドは、ペプシン、トリプシンおよびキモトリプシンによるタンパク質分解に対し実質的に耐性を有している。実施形態では、本明細書に記載の合成ペプチドは、ペプシンおよびトリプシンによるタンパク質分解に対し実質的に耐性を有している。

明細書全体を通して示されている方法を含む、本明細書に記載されているように、アルファ官能基化アミノ酸による天然アミノ酸の置換は、タンパク質分解による切断を受けやすい部位の天然アミノ酸残基で起こることが好ましい。すなわち、置換される残基は、タンパク質分解酵素が天然（すなわち野生型）ペプチド中のペプチド結合の切断に活性な部位であると決定される。タンパク質分解による切断部位を決定する方法は、この分野ではよく知られており、本明細書中に記載している。

本明細書に示した上述の特性を有する合成ペプチドを得るための方法によれば、任意のクラスのペプチドを調製することができる。

例示的な実施形態では、合成ペプチドは、インクレチンに分類されるペプチドである。本明細書に記載のように調製することができるインクレチンに分類される合成ペプチドの例としては、限定はされないが、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルコース依存性インスリン分泌促進ペプチド（ＧＩＰ）、エクセナチドペプチド、プラスグルカゴン、セクレチン、テノモジュリン、オキシントモジュリン、または血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）が挙げられる。

他に分類されるペプチドを、本明細書に記載されるように調製することができる。

実施形態では、本明細書に記載の合成ペプチドは、ＧＬＰ−１ペプチドである。他の実施形態では、本明細書に記載の合成ペプチドは、インスリンである。

種々のペプチド、および上述した特性を有する合成ペプチドを得るため調製することができる本明細書に記載の様々なペプチド類の天然（野生型）ペプチド配列は、この分野でよく知られている。

ＧＰＬ−１の天然のアミノ酸配列はこの分野で知られており、下記に示すとおりである。
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（配列番号：１）

実施形態では、天然アミノ酸残基のアルファ−メチル官能基化アミノ酸による少なくとも３つの置換を含む合成ＧＬＰ−１ペプチドが提供される。明細書全体を通して記載されているように、合成ＧＬＰ−１ペプチドは、置換を含まない対応する合成ＧＬＰ−１ペプチドと同じ受容体効力および選択性を実質的に維持していることが好ましい。

実施形態では、少なくとも３つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸で、対応する天然アミノ酸残基が置換されている。すなわち、本明細書に記載されるように、天然タンパク質のアミノ酸が、同じ、対応するアルファ−メチル官能基化アミノ酸で置換されている。

さらなる実施形態では、３つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、アルファ−メチルフェニルアラニンである。そのような実施形態では、アルファ−メチル官能基化フェニルアラニンによって置換される天然アミノ酸自身が、フェニルアラニンである必要はない。それどころか、本明細書に記載されるように、天然芳香族アミノ酸を同じ分類のアルファ−メチル官能基化アミノ酸、すなわち、芳香族アミノ酸で単に置換することによって、本明細書に記載の合成ペプチドが、受容体効力および選択性の維持、ならびに安定性の増大という、所望の特性を示すことがわかった。

さらなる実施形態では、本明細書に記載の合成ペプチドは、カルボキシル末端もしくはアミノ末端の脂質化、または主鎖の脂質化などの、脂質化による修飾をさらに含むことができる。そのような脂質化を含む合成ペプチドの調製方法は、この分野で知られている。Ｃ末端の脂質化を、天然アミノ酸をアルファ−メチル官能基化アミノ酸で置換した本明細書に記載の実施形態と組み合わせることにより、安定性が増し、特に血清および胃液に暴露された時の安定性が増すことがわかった。

本明細書に示した合成ＧＬＰ−１ペプチドは、４つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸を含むことが好ましい。実施形態では、４つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸が、対応するアミノ酸と置換する。例示的実施形態では、４つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、Ｐｈｅ６、Ｔｒｙ１３、Ｐｈｅ２２およびＴｒｐ２５の位置で置換され、さらなる実施形態では、４つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、Ｐｈｅ６、Ｔｒｙ１３、Ｐｈｅ２２およびＴｒｐ２５で置換したアルファ−メチルフェニルアラニンである。

本明細書に示した合成ＧＬＰ−１ペプチドは、６つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸を含むことが好ましい。実施形態では、６つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸が、対応するアミノ酸と置換する。例示的実施形態では、６つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、Ｐｈｅ６、Ｔｒｙ１３、Ｌｙｓ２０、Ｐｈｅ２２、Ｔｒｐ２５およびＬｙｓ２８の位置で置換され、さらなる実施形態では、６つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、Ｐｈｅ６、Ｔｒｙ１３、Ｐｈｅ２２およびＴｒｐ２５の位置で置換された４つのアルファ−メチルフェニルアラニンと、Ｌｙｓ２０およびＬｙｓ２８の位置で置換された２つのアルファ−メチルリシンである。

好ましい実施形態では、本明細書に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチドは、２の位置のアミノイソ酪酸の置換（Ａｉｂ２）をさらに含むことが好ましい。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチドは、５の位置のスレオニンのセリンによる置換（Ｔｈｒ５Ｓｅｒ；Ｔ５Ｓ）をさらに含むことが好ましい。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチドは、２６の位置のロイシンのバリンによる置換（Ｌｅｕ２６Ｖａｌ；Ｌ２６Ｖ）をさらに含むことが好ましい。

実施形態では、本明細書に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチドは、タンパク質分解、例えば、限定はされないが、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよびペプシンの１種以上による分解に対し実質的に耐性を有する。

さらなる実施形態では、下記のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１ペプチドが提供される。順に：

Ｒ¹−Ｈｉｓ−Ｘ１−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ４−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘ５−Ｇｌｕ−Ｘ６−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｒ²（配列番号：２）
（但し、
Ｒ¹は、Ｈｙ、ＡｃまたはｐＧｌｕであり；
Ｒ²は、−ＮＨ₂または−ＯＨであり；
Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｉｂ、ＰｒｏまたはＧｌｙであり；
Ｘ２は、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；
Ｘ３は、Ａｉｂ、Ｂｉｐ、β，β−Ｄｉｐ、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｎｌｅ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、Ｎ−ＭｅＰｈｅ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩ、Ｐｒｏまたはジ−β，β−ＭｅＰｈｅであり；
Ｘ４は、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、β，β−Ｄｉｐ、Ｇｌｎ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｎｌｅ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩ、Ｐｒｏまたはジ−β，β−Ｍｅ−Ｐｈｅであり；
Ｘ５は、Ａｉｂ、Ｌｙｓ、Ｄ−ｐｒｏ、Ｐｒｏまたはα−ＭｅＬｙｓであり；
Ｘ６は、Ａｉｂ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、２Ｃｌ−Ｐｈｅ、３Ｃｌ−Ｐｈｅ、４Ｃｌ−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、ホモＰｈｅ、２Ｍｅ−Ｐｈｅ、３Ｍｅ−Ｐｈｅ、４Ｍｅ−Ｐｈｅ、２ＣＦ₃−Ｐｈｅ、３ＣＦ₃−Ｐｈｅ、４ＣＦ₃−Ｐｈｅ、β−Ｐｈｅ、β−ＭｅＰｈｅ、Ｄ−ｐｈｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、３Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、β，β−Ｄｉｐ、β−Ａｌａ、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩまたはジ−β，β−ＭｅＰｈｅであり；
Ｘ７は、Ａｉｂ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、β，β−Ｄｉｐ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ， ２Ｍｅ−Ｐｈｅ、３Ｍｅ−Ｐｈｅ、４Ｍｅ−Ｐｈｅ、Ｎｌｅ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｎ−ＭｅＴｒｐ、α−ＭｅＴｒｐまたはジ−β，β−Ｍｅ−Ｐｈｅであり；
Ｘ８は、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｎ−ＭｅＬｅｕ、α−ＭｅＬｅｕまたはＶａｌであり；
Ｘ９は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、α−ＭｅＶａｌまたはＰｒｏであり；
Ｘ１０は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、α−ＭｅＬｙｓまたはＰｒｏであり；
Ｘ１１は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；かつ
Ｘ１２は、Ａｉｂ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏまたはα−ＭｅＡｒｇである。）

ＧＬＰ−１ペプチドは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる、すなわち、配列番号：２に記載されるような、完全な配列および上記順序の、上記アミノ酸のみからなることが好ましい。

合成ペプチドの調製方法
合成ペプチドの調製方法もまた提供される。

いくつかの実施形態では、方法は、置換するペプチド中の少なくとも１つの天然アミノ酸残基を特定することを含むことが好ましい。他の実施形態では、方法は、置換するペプチド中の少なくとも２つの天然アミノ酸残基を特定することを含むことが好ましい。その後、特定された天然アミノ酸残基が、アルファ−メチル官能基化アミノ酸で置換される。

明細書全体を通して記載されるように、本願で提供される方法によって調製される合成ペプチドは、置換を含まない対応する合成ペプチドと同じ受容体効力および選択性を実質的に維持していること好ましい。さらに、本明細書に記載の方法により調製される合成ペプチドは、また、タンパク質分解に対する耐性を実質的に有している。

本明細書に示される方法においては、置換アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、置換天然アミノ酸残基に対応していることが好ましく、さらなる実施形態では、置換アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、置換天然アミノ酸残基と同じ分類に対応していることが好ましい。

さらに他の実施形態では、置換アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、アルファ−メチルフェニルアラニンである。例示的な実施形態では、アルファ−メチルフェニルアラニンは対応する天然アミノ酸と置換するが、方法のさらなる実施形態では、アルファ−メチルフェニルアラニンは置換が起こる同じ天然アミノ酸に対応している必要はない。

好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法により調製される合成ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよびペプシンの１種以上による分解に対し実質的に耐性を有する。

実施形態では、ＮＯＶＡＳＹＮ（登録商標）ＴＧＲ樹脂上にＣ末端カルボキサミドとして調製される。好ましくは、ＮＭＰ中、ＨＣＴＵ／ＤＩＰＥＡを用いて、周囲温度で、アミノ酸（天然および非天然共に）結合させ、無水酢酸およびピリジンの溶液で残存する官能基をキャップする。好ましくは、ＤＭＦ中、ピペリジンを用いて、周囲温度で、Ｆｍｏｃを脱保護する。

本明細書に記載されるように、置換するペプチド中の少なくとも１つの天然アミノ酸残基の特定は、酵素による切断を受けやすい部位のアミノ酸を特定することを含むことが好ましい。酵素による切断を受けやすい部位のアミノ酸を特定する方法の例は、この分野でよく知られている。実施形態では、酵素による切断を受けやすい部位のアミノ酸を特定する方法は、天然ペプチド（すなわち、野生型ペプチド）を単一の酵素に、その酵素が所定期間一般に活性である条件（例えば、適切なｐＨ、緩衝条件、温度など）下で暴露すること、および酵素によるペプチドの分解生成物を測定することを含むことが好ましい。酵素による分解生成物を測定する方法の例としては、例えば、逆相液体クロマトグラフィ−質量分析が挙げられる。

所望のプロテアーゼ溶液に、ペプチド溶液を加えることが好ましい。ペプチドと酵素を一緒に、好ましくは約３７℃でインキュベートする。インキュベートしたペプチド−酵素混合物を定期的に一定分量ずつ分取し、冷却してタンパク質分解活性を止め、逆相液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により分析した。好ましくは、分析はＵＶ吸収（例えば、２１０ｎｍで）および質量検出器（ＥＳＩ＋モード）を用いるイオン化の両方で検出して行う。ペプチドの酵素による切断によって得られたペプチド種（フラグメント）をプロセス後、分析し、分子質量から正確な切断位置を特定する（各例で切断しやすい結合をハイライトする）。

実施形態では、本明細書に記載の方法は、上述した特徴を有するペプチド類を調製するために使用することが好ましい。

例示的な実施例では、方法は、インクレチンに分類されるペプチドの調製に使用される。本明細書に記載されるように調製することができるインクレチンに分類される合成ペプチドの例としては、限定はされないが、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルコース依存性インスリン分泌促進ペプチド（ＧＩＰ）、エクセナチドペプチド、プラスグルカゴン、セクレチン、テノモジュリンおよびオキシントモジュリンが挙げられる。

他に分類されるペプチドを、本明細書に記載されるように調製することができる。

実施形態では、方法は、合成ＧＬＰ−１ペプチドの調製に使用される。他の実施形態では、方法は、合成インスリンの調製に使用される。

他の実施形態では、タンパク質分解に安定なペプチドを調製する方法が提供される。そのような方法は、１種以上のプロテアーゼにペプチドを暴露すること、少なくとも２つの、タンパク質分解による切断を受けやすい部位の天然アミノ酸残基を特定すること、およびその特定したアミノ酸残基をアルファ−メチル官能基化アミノ酸で置換することを含む。

明細書全体を通して記載されるように、そのような方法は、置換を含まない対応する合成ペプチドと同じ受容体効力および選択性を実質的に維持している合成ペプチドを提供することが好ましい。さらに他の実施形態では、方法はまた、タンパク質分解に対し実質的に耐性を有する合成ペプチドを提供する。

本明細書に示される方法においては、置換アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、置換天然アミノ酸残基に対応していることが好ましく、さらなる実施形態では、置換アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、置換天然アミノ酸残基と同じ分類に対応していることが好ましい。

さらに他の実施形態では、置換アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、アルファ−メチル官能基化ヒスチジン、アルファ−メチル官能基化アラニン、アルファ−メチル官能基化イソロイシン、アルファ−メチル官能基化アルギニン、アルファ−メチル官能基化ロイシン、アルファ−メチル官能基化アスパラギン、アルファ−メチル官能基化リシン、アルファ−メチル官能基化アスパラギン酸、アルファ−メチル官能基化メチオニン、アルファ−メチル官能基化システイン、アルファ−メチル官能基化フェニルアラニン、アルファ−メチル官能基化グルタミン酸、アルファ−メチル官能基化スレオニン、アルファ−メチル官能基化グルタミン、アルファ−メチル官能基化トリプトファン、アルファ−メチル官能基化グリシン、アルファ−メチル官能基化バリン、アルファ−メチル官能基化オルニチン、アルファ−メチル官能基化プロリン、アルファ−メチル官能基化セレノシステイン、アルファ−メチル官能基化セリンおよびアルファ−メチル官能基化チロシンから選択される。

さらに他の実施形態では、置換アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、アルファ−メチルフェニルアラニン、および／またはアルファ−メチルフリシンである。例示的実施形態では、アルファ−メチルフェニルアラニン、および／またはアルファ−メチルフリシンは、対応する天然アミノ酸と置換するが、方法のさらなる実施形態では、アルファ−メチルフェニルアラニン、および／またはアルファ−メチルフリシンは、置換が起こる同じ天然アミノ酸に対応している必要はない。

好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法により調製される合成ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼおよびペプシンの１種以上による分解に対し実質的に耐性を有する。

実施形態では、本明細書に記載の方法は、上述した特徴を有するペプチド類の調整に使用されることが好ましい。

例示的な実施例では、方法は、インクレチンに分類されるペプチドの調製に使用される。本明細書に記載されるように調製することができるインクレチンに分類される合成ペプチドの例としては、限定はされないが、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルコース依存性インスリン分泌促進ペプチド（ＧＩＰ）、エクセナチドペプチド、プラスグルカゴン、セクレチン、テノモジュリンおよびオキシントモジュリンが挙げられる。

他に分類されるペプチドを、本明細書に記載されるように調製することができる。

実施形態では、方法は、合成ＧＬＰ−１ペプチドの調製に使用される。他の実施形態では、方法は、合成インスリンの調製に使用される。

合成ペプチドを含む製剤
本明細書に記載の合成ペプチドを含む製剤（または医薬組成物）もまた提供される。そのような製剤は、本明細書に記載の合成ペプチドと、担体とを含むことが好ましい。そのような製剤は、明細書全体を通して記載されている様々な方法で容易に投与することができる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体を含む。

「薬学的に許容される担体」という用語は、合成ペプチドの生物学的活性能を阻害しない１種以上の毒性のない材料を意味する。そのような調合物には、通常、塩、緩衝剤、保存料、相溶性のある担体、および任意選択により他の治療薬を含み得る。製剤はまた、通常、混合可能で、ヒトへの投与に適した、固体もしくは液体充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質を含み得る。「担体」という用語は、合成ペプチドの適用を促進するために組み合わせて使用する、天然または合成の、有機または無機の成分を意味する。

本明細書に記載されるように、製剤は特定に用量で製剤化され得る。投与計画は所望する最適な応答が得られるように調整し得る。例えば、単回ボーラス投与でも、時間をかけた分割投与でもよく、あるいは用量を治療の状態によって比例的に増減してもよい。投与を容易にし、かつ投与量を均一にするため、非経口組成物を単位用量の形態で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用されるとき、単位用量形態とは、治療する患者の単位用量として適した物理的に不連続な単位を指す。各単位には、所望の治療効果が得られるように計算された所定量の合成ペプチドが必要な医薬担体と共に含まれる。単位用量形態の明細は、（ａ）合成ペプチド固有の特性と達成されるべき治療効果、および（ｂ）そのような合成ペプチドの配合技術が本来有する制約により、またそれらに直接依存して決められる。

本明細書に記載の製剤は、経口、鼻腔、肺、局所（口腔および舌下を含む）、直腸、膣、および／または非経口など、具体的な投与経路のために製剤化することができる。製剤は、都合よく、単位用量形態で提供されてもよく、薬剤の分野で知られた任意の方法で調製されてもよい。単位用量形態を作製するために担体材料と組み合わせることができる合成ペプチドの量は、治療する患者、および具体的な投与方法により変わるであろう。単位用量形態を作製するために担体材料と組み合わせることができる合成ペプチドの量は、一般に、治療効果が得られる組成物の量であろう。

合成ペプチドを用いる治療方法
本明細書に記載の合成ペプチド、例えば、製剤を、治療を必要としている患者に投与することを含む、患者を治療する方法もまた、本願において提供される。

合成ペプチドを本明細書に記載の様々な方法で投与することができる患者は、哺乳類、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、霊長類、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタなどである。

本明細書に記載の各種方法で患者に合成ペプチドを投与することができる方法の例としては、限定はされないが、静脈内投与（ＩＶ）、腫瘍内投与（ＩＴ）、病巣内投与（ＩＬ）、エアロゾル投与、経皮投与、経口投与、内視鏡投与、局所投与、筋肉内投与（ＩＭ）、皮内投与（ＩＤ）、眼内投与（ＩＯ）、腹腔内投与（ＩＰ）、経皮投与（ＴＤ）、鼻腔内投与（ＩＮ）、脳内投与（ＩＣ）、臓器内投与（例えば、肝内投与）、徐放性インプラント、または皮下投与、あるいは浸透圧もしくは機械的ポンプによる投与が挙げられる。

合成ペプチドは、適切な診断後できるだけ早く、例えば、数時間または数日内に、投与することが好ましい。合成ペプチドの投与期間および投与量は、当業者であれば容易に決定され、一般には、ペプチドの種類および治療する病気もしくは疾患による。

本明細書に記載されるように、各種方法は、任意の年齢の成人および小児を含むヒトである哺乳類の患者に行うことが好ましい。

実施形態では、治療方法は、本明細書に記載のペプチド、好ましくは本明細書に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチドを治療に有効な量投与することを含む、糖尿病と診断された患者を治療することを含む。

本明細書で使用されるとき、「治療に有効な量」という用語は、病気もしくは疾患（またはその１つ以上の症状）の重症度を十分に軽減する、そのような病気もしくは疾患の１つ以上の症状を改善する、そのような病気もしくは疾患の進行を抑える、そのような病気もしくは疾患の退行させる、あるいは他の療法の治療効果を増大もしくは改善する、合成ペプチド、または製剤の量を指す。いくつかの実施形態では、治療に有効な量は、前もって特定できず、医療提供者、例えば、医師または他のヘルスケア提供者が、様々な手段、例えば、用量漸増法によって決定することができる。適正な治療に有効な量はまた、例えば動物モデルを用いる日常の実験によっても決定することができる。

実施形態では、合成インスリンを治療に有効な量患者に投与することを含む、糖尿病と診断された患者の治療方法が提供される。

本明細書に記載されるように、本明細書に記載の合成ペプチドまたは製剤を投与する方法は、経口で送達されることが好ましい。本明細書に記載されるように、合成ペプチドは、タンパク質分解、すなわち、経口投与後の胃での酵素による分解に対し、実質的に耐性を有する。

関連する分野において通常の技術を有するものであれば、本明細書に記載の方法や応用に対し、任意の実施形態の範囲から逸脱することなく、他の適切な変更や修正を行うことができる。以下の例は説明のためにのみここに記載されているものであって、限定することを意図したものではない。

実施例１：タンパク質分解耐性ペプチドの化学合成および試験
ペプチド
１．緒言
本明細書に記載のタンパク質分解耐性ペプチドの調製方法の例を以下に示す。

２．略語
Ｂｏｃ，ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基；ＤＩＰＥＡ，Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ，ジメチルスルホキシド；ＥＳＩ，エレクトロスプレーイオン化；Ｆｍｏｃ，９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基；ＧＩＰ，胃抑制ポリペチド；ＧＬＰ−１，グルカゴン様ペプチド１；ＨＣＴＵ，Ｏ−（１Ｈ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；ＲＰ−ＨＰＬＣ，逆相高速液体クロマトグラフィ；ＥＣ₅₀，半数（５０％）効果濃度；ＬＣ／ＭＳ，液体クロマトグラフィ結合質量分析法；ＭｅＣＮ，アセトニトリル；ＮＭＰ，Ｎ−メチルピロリジノン；Ｐｂｆ，２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル基；ＰＢＳ，リン酸緩衝生理食塩水；^tＢｕ，ターシャリー−ブチル基；ＴＦＡ，トリフルオロ酢酸；ＴＩＳ，トリイソプロピルシラン；Ｔｒｉｓ，Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン；Ｔｒｔ，トリフェニルメチル基；ＵＶ，紫外線。

３．実験
３．１ペプチド合成
３．１．１材料
Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸をＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのＢａｃｈｅｍ ＡＧから入手した。異常アミノ酸をＧｅｒｍａｎｙのＩｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧから入手するか、またはＣｈｉｎａのＰｈａｒｍａｒｏｎにより製造された。ＮＯＶＡＳＹＮ（登録商標）ＴＧＲ（ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｒｉｎｋ）およびＮＯＶＡＳＹＮ（登録商標）ＴＧＡ （ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｗａｎｇ）合成樹脂をＧｅｒｍａｎｙ、ＤａｒｍｓｔａｄのＭｅｒｃｋ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手した。すべてのペプチドを自動合成（ＰＴＩ Ｐｒｅｌｕｄｅ）により、Ｆｍｏｃ／^tＢｕプロトコルを用いて調製した。アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）を側鎖のトリチル（Ｔｒｔ）誘導体として組み込んだ。トリプトファン（Ｔｒｐ）およびリシン（Ｌｙｓ）を側鎖のＢｏｃ誘導体として組み込んだ。セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）およびチロシン（Ｔｙｒ）を側鎖の^tＢｕエーテルとして組み込み、アスパラギン酸塩（Ａｓｐ）およびグルタミン酸塩（Ｇｌｕ）を側鎖のＯ^tＢｕエステルとして組み込んだ。アルギニン（Ａｒｇ）を側鎖のＰｂｆ誘導体として組み込んだ。合成試薬をＵｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、ＤｏｒｓｅｔのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。入手可能な最高グレードの溶媒をＧｅｒｍａｎｙ、ＤａｒｍｓｔａｄのＭｅｒｃｋから入手し、さらなる精製を行わずに使用した。

３．１．２α−メチルアミノ酸を含むペプチドの化学合成の基本手順
特に明記しない限り、ＮＯＶＡＳＹＮ（登録商標）ＴＧＲ樹脂上にＣ末端カルボキサミドとして調製した（初期置換０．２４ｍｍｏｌｅ／ｇ）。すべてのアミノ酸（天然および非天然）をＮＭＰ中、ＨＣＴＵ／ＤＩＰＥＡを用いて周囲温度で結合し、無水酢酸およびピリジンの溶液で残基の官能基をキャップした。ＤＭＦ中ピペリジン（２０体積％）を用いてＦｍｏｃを脱保護した。

３．１．３線状ペプチドの切断および精製
周囲温度で、ＴＦＡ（９５体積％）、ＴＩＰＳ（２．５体積％）、水（２．５体積％）の混合液により、撹拌しながら処理することにより、粗ペプチドを樹脂支持体から切断した。切断分液を一緒にし、回転蒸発により濃縮し、冷ジエチルエーテルを添加して沈澱させ、固形分を遠心分離により単離した。粗ペプチドを乾燥窒素流で乾燥させ、２０体積％ＭｅＣＮ／水で再構成して、再構成した。粗ペプチドを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ８−Ａ固定相（２１．２×２５０ｍｍ、５ミクロン）を使用し、水（０．１体積％ＴＦＡ）中１０％〜７０％のＭｅＣＮ（０．１体積％ＴＦＡ）の線状の溶媒勾配で、Ｖａｒｉａｎ ＳＤ−１ Ｐｒｅｐ Ｓｔａｒバイナリポンプ装置により３０分間かけて溶出して、クロマトグラフィによる精製を行い、２１０ｎｍの紫外線の吸収によって観察した。目的のペプチドを含有するフラクションを集め、ドライアイス／アセトンで凍らせ、凍結乾燥させた。

３．１．４ペプチドの分析および特性評価（合成後）
精製したペプチドの特性を、Ｗａｔｅｒｓ Ｍａｓｓ Ｌｙｎｘ ３１００プラットフォームを用い、シングル四重極型ＬＣ／ＭＳにより評価した。周囲温度で、分析物を、Ｗａｔｅｒｓ Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８固定相（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）により、水（０．１体積％ＴＦＡ）中１０〜９０％のＭｅＣＮ（０．１体積％ＴＦＡ）の線状のバイナリ勾配をかけ、１．５ｍＬ ｍｉｎ^-1で、１０分間に亘って溶出し、クロマトグラフィ処理を行った。分析物を、２１０ｎｍのＵＶ吸収、およびＷａｔｅｒｓ ３１００質量検出器（ＥＳＩ⁺モード）によるイオン化によって検出し、計算により算出した理論値に対する分子量を確認した。４０℃で、分析物を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ８−Ａ固定相（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）により、水（０．１体積％ＴＦＡ）中１０〜９０％のＭｅＣＮ（０．１体積％ＴＦＡ）の線状のバイナリ勾配をかけ、１．５ｍＬ ｍｉｎ^-1で、１５分間に亘って溶出し、クロマトグラフィ処理を行った。

４ 酵素による切断の調査
４．１ α−メチル残基を含むペプチドのタンパク質分解に対する耐性の評価
下記の商業的に入手可能な精製プロテアーゼが、野生型インクレチンおよびα−メチル残基を含む修飾インクレチンを切断する能力を、知られた責任ある場所で評価した。

中性エンドペプチダーゼ（ネプリライシン）：１．０μｇのｒｈＮＥＰを、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨＣＯ₃を含み、ＮａＯＨ（１．０Ｍ）によってｐＨを８．３に調節したアッセイ用緩衝液９００μＬで再構成した。

ペプシン：ブタの胃粘膜からの凍結乾燥ペプシン１．０ｍｇを、次のアッセイ用緩衝液：１０ｍＭのＨＣＬでｐＨ２．０とした０．４重量／体積％溶液、９００μＬで再構成した。

トリプシン：ブタの膵臓からの凍結乾燥トリプシン１ｍｇ／ｍＬ溶液を、次のアッセイ用緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＨＣｌ、ｐＨ７．８に調整、で再構成した。

キモトリプシン：１．０μｇのｒｈＣＴＲＣを、次のアッセイ用緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＨＣｌ、ｐＨ７．８に調整、９００μＬで再構成した。

４．１．２ 手順
評価用ペプチドを、純水、注射用無菌食塩水（０．９重量／体積％ ＮａＣｌ／水）または１Ｘ ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）で、１．０ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液に調製した。これらの溶液１００μＬ（１００μｇ／ｍＬペプチド）を各プロテアーゼ溶液９００μＬに加えた。血清および胃液に暴露している間のタンパク質の分解を調べる追加実験を行った。血清の実験では、５０％の雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ株のラットの血清（ＳＤラット血清）でペプチドをインキュベートした。胃液の実験では、１：１（体積：体積）の新鮮なラットの胃液でペプチドをインキュベートした。

ペプチドおよび酵素（または血清もしくは胃液）を、実験の間、３７℃の温度に制御した水浴で共にインキュベートした。各実験中、インキュベートしたペプチド−酵素混合物から１００μＬの一定分量（ペプチド１０μｇ）を定期的に取り出し、１：１水／アセトニトリル中５重量％のＴＦＡ溶液を同体積添加することによって、タンパク質分解活性を止め、液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ８−Ａ固定相（４．６×１００ｍｍ、３ミクロン）、水（０．１体積％ＴＦＡ）中１０〜９０％のＭｅＣＮ（０．１体積％ＴＦＡ）の線状のバイナリ勾配を使用し、周囲温度で、１．５ｍＬ ｍｉｎ^-1で、３０分間に亘って溶出）によって分析した。分析物を、２１０ｎｍのＵＶ吸収、およびＷａｔｅｒｓ ３１００質量検出器（ＥＳＩ⁺モード）によるイオン化の両方で検出した。プロセス後、ペプチドの酵素による切断によって誘導された新しいペプチド種（フラグメント）を分析し、その分子量を使用して正確な切断位置を特定した（各例で切断しやすい結合をハイライトする）。

本明細書に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチドの生物学的活性／受容体効力は、適切には、生物学的活性、例えば、１つ以上の細胞性受容体応答で試験される。ヒト、マウス、ラットまたはイヌのＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）、またはグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（胃抑制ポリペチド）受容体（ＧＩＰＲ）を発現する安定な細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞で標準的方法によって得られる。これらの種々の受容体のペプチド活性化により、機能的活性アッセイで測定し得るｃＡＭＰ二次メッセンジャーの下流生成がもたらされる。

ｃＡＭＰアッセイは、「アッセイ用緩衝液」を用いて行った。アッセイ用緩衝液：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ ＃ Ｈ８２６４）中、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ ♯ Ａ３０５９）、ｐＨ７．４、および０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ ＃ Ｉ７０１８）を含有。

低タンパク質結合３８４ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＃ ７８１２８０）を使用して、アッセイ用緩衝液で調製した試験用サンプルの５系列の希釈液中でイレブン１を行った。試料希釈液すべて、２液作成した。

対象の受容体を発現する細胞の入った凍結クリオバイアルを水浴で急速に解凍し、予備加熱したアッセイ用緩衝液に移し、２４０×ｇで５分間回転させた。細胞を再びアッセイ用緩衝液に、バッチに最適な濃度（例えば、ｈＧＣＧＲ細胞２×１０⁵個／ｍｌ、ｈＧＬＰ−１ＲおよびｈＧＩＰＲ細胞１×１０⁵個／ｍｌ）で再懸濁した。

希釈プレートから、５μＬのレプリカを、黒シャローウエル丸底ボトム３８４ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃ ３６７６）に押し当てた。これに、５μｍの細胞懸濁液を加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした。

ｃＡＭＰ濃度は、商業的に入手可能なｃＡＭＰダイナミック２−ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ，Ｃａｔ ＃ ６２ＡＭ４ＰＥＪ）を使用し、製造業者が推奨するように２段階のプロトコルの後に測定する。要約すると、抗ｃＡＭＰクリプテート（ドナー蛍光物質）およびｃＡＭＰ−ｄ２（アクセプター蛍光物質）を、キットで提供された結合用および溶解用緩衝液でそれぞれ１／２０に希釈して個別に作成する。５μＬの抗ｃＡＭＰクリプテートをアッセイプレートの全ウエルに加え、５μＬのｃＡＭＰ−ｄ２を、結合用および溶解用緩衝液が加えられている非特異的結合（ＮＳＢ）ウエルを除くすべてのウエルに加える。プレートを室温で１時間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で、励起波長３２０ｎｍおよび発光波長６２０ｎｍおよび６６５ｎｍにより読み取る。ｃＡＭＰアッセイで測定した合成ペプチドのＥＣ₅₀値を、その測定する。

生物学的活性／受容体効力を測定する追加の実験においては、ヒト、マウス、またはラットのＧＣＧＲまたはＧＬＰ−１受容体を安定に組換え発現するＣＨＯ細胞を、上記のようなアッセイ用緩衝液で培養する。凍結保存細胞ストックを血清フリーの１×細胞凍結用培地−ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中、１×１０⁷または２×１０⁷／バイアルで調製し、−８０℃で保存する。細胞を３７℃で急速に解凍した後、血清アルブミンを、ヒト、ラットおよびマウスでそれぞれ４．４、３．２および３．２％含むアッセイ用緩衝液（上記緩衝液）で希釈する。ペプチドを順次１００％ＤＭＳＯで希釈し、上記最終濃度で血清アルブミンを含む上記アッセイ用緩衝液で１００倍に希釈する。希釈したペプチドをその後、３８４黒シャローウエルマイクロタイターアッセイプレートに移す。アッセイプレートに細胞を加え、室温で３０分間インキュベートする。インキュベート後、アッセイを中止し、ｃＡＭＰ濃度を、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから入手可能なＨＴＲＦ（登録商標）ダイナミック ｄ２ ｃＡＭＰアッセイキットを使用して、製造業者のガイドラインに記載されるように測定する。ペプチドを、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）蛍光プレートリーダーで読み取る。ヒトおよびラットの血清アルブミンは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、マウスの血清アルブミンは、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ Ｂｉｏ Ｌｔｄから購入する。

製造業者のガイドラインに記載されるように、データを％Ｄｅｌｔａ Ｆに変換し、４パラメーターロジスティック曲線により解析してＥＣ₅₀値を求めた。測定されたＥＣ₅₀値は、組換え細胞株のＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体での試験ペプチドの効力と、そのペプチドの血清アルブミンに対する親和性（遊離ペプチドの量を決定する）に依存する。血清アルブミンを相関して、得られるＥＣ₅₀値は上昇する。アルブミンの血漿濃度での遊離ペプチドのフラクションおよび０％の血清アルブミン（ＳＡ）でのＥＣ₅₀は、ＳＡ濃度によるｃＡＭＰ産生の変化に基づき算出することができる。ＧＬＰ−１ＲおよびＧＣＧＲでの活性の、異種ペプチド間および条件の違いによる差を比較すると、これら相互に関連しており、ＥＣ₅₀は、コンパレータペプチドのそれと関連している。

本明細書に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチドの生物学的活性／受容体効力は、適切には、生物学的活性、例えば、１つ以上の細胞性受容体応答で試験される。ヒト、マウス、ラットまたはイヌのＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）、またはグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（胃抑制ポリペチド）受容体（ＧＩＰＲ）を発現する安定な細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞で標準的方法によって得られる。これらの種々の受容体のペプチド活性化により、機能的活性アッセイで測定し得るｃＡＭＰ二次メッセンジャーの下流生成がもたらされる。

ｃＡＭＰアッセイは、「アッセイ用緩衝液」を用いて行った。
アッセイ用緩衝液：ＤＭＥＭ中、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＃ ４１９６６）、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ ＃ Ｉ７０１８）を含有。

低タンパク質結合３８４ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＃ ７８１２８０）を使用して、アッセイ用緩衝液で調製した試験用サンプルの５系列の希釈液中でイレブン１を行った。試料希釈液すべて、２液作成した。

対象の受容体を発現する細胞の入った凍結クリオバイアルを水浴で急速に解凍し、予備加熱したアッセイ用緩衝液に移し、２４０×ｇで５分間回転させた。細胞を再びアッセイ用培養液に、最適な濃度（例えば、ｈＧＣＧＲ細胞１×１０⁵個／ｍｌ、ｈＧＬＰ−１ＲおよびｈＧＩＰＲ細胞０．５×１０⁵個／ｍｌ）で再懸濁した。

希釈プレートから、５μＬのレプリカを、黒シャローウエル丸底ボトム３８４ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃ ３６７６）に押し当てた。これに、５μｍの細胞懸濁液を加え、プレートを室温で３０分間インキュベートした。

ｃＡＭＰ濃度は、商業的に入手可能なｃＡＭＰダイナミック２−ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ，Ｃａｔ ＃ ６２ＡＭ４ＰＥＪ）を使用し、製造業者が推奨するように２段階のプロトコルの後に測定する。要約すると、抗ｃＡＭＰクリプテート（ドナー蛍光物質）およびｃＡＭＰ−ｄ２（アクセプター蛍光物質）を、キットで提供された結合用および溶解用緩衝液でそれぞれ１／２０に希釈して個別に作成する。５μＬの抗ｃＡＭＰクリプテートをアッセイプレートの全ウエルに加え、５μＬのｃＡＭＰ−ｄ２を、結合用および溶解用緩衝液が加えられている非特異的結合（ＮＳＢ）ウエルを除くすべてのウエルに加える。プレートを室温で１時間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で、励起波長３２０ｎｍおよび発光波長６２０ｎｍおよび６６５ｎｍにより読み取る。ｃＡＭＰアッセイで測定した合成ペプチドのＥＣ₅₀値を、その測定する。

生物学的活性／受容体効力を測定する追加の実験においては、ヒト、マウス、またはラットのＧＣＧＲまたはＧＬＰ−１受容体を安定に組換え発現するＣＨＯ細胞を、上記のようなアッセイ用緩衝液で培養する。凍結保存細胞ストックを血清フリーの１×細胞凍結用培地−ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中、２×１０⁷／バイアルで調製し、−８０℃で保存する。細胞を３７℃で急速に解凍した後、血清アルブミンを、ヒト、ラットおよびマウスでそれぞれ４．４、３．２および３．２％含むアッセイ用緩衝液（上記緩衝液）で希釈する。ペプチドを順次１００％ＤＭＳＯで希釈し、上記最終濃度で血清アルブミンを含む上記アッセイ用緩衝液で１００倍に希釈する。希釈したペプチドをその後、３８４黒シャローウエルマイクロタイターアッセイプレートに移す。アッセイプレートに細胞を加え、室温で３０分間インキュベートする。インキュベート後、アッセイを中止し、ｃＡＭＰ濃度を、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから入手可能なＨＴＲＦ（登録商標）ダイナミック ｄ２ ｃＡＭＰアッセイキットを使用して、製造業者のガイドラインに記載されるように測定する。ペプチドを、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）蛍光プレートリーダーで読み取る。ヒトおよびラットの血清アルブミンは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、マウスの血清アルブミンは、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ Ｂｉｏ Ｌｔｄから購入する。

製造業者のガイドラインに記載されるように、データを％Ｄｅｌｔａ Ｆに変換し、４パラメーターロジスティック曲線により解析してＥＣ₅₀値を求めた。測定されたＥＣ₅₀値は、組換え細胞株のＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体での試験ペプチドの効力と、そのペプチドの血清アルブミンに対する親和性（遊離ペプチドの量を決定する）に依存する。血清アルブミンを相関して、得られるＥＣ₅₀値は上昇する。アルブミンの血漿濃度での遊離ペプチドのフラクションおよび０％のＨＳＡでのＥＣ₅₀は、ＨＳＡ濃度によるｃＡＭＰ産生の変化に基づき算出することができる。ＧＬＰ−１ＲおよびＧＣＧＲでの活性の、異種ペプチド間および条件の違いによる差を比較すると、これらは相互に関連しており、ＥＣ₅₀は、コンパレータペプチドのそれと関連している。

４．１．３結果
グルカゴン様ペプチドの酵素による切断の解析は、図１に示すように、適切な置換部位を示し、Ａｉｂ²、Ｐｈｅ⁶、Ｔｙｒ¹³、Ｌｙｓ²⁰、Ｐｈｅ²²、Ｔｒｐ²⁵、Ｌｙｓ²⁸およびＡｒｇ³⁰であった。下記の表２は、本明細書に記載の合成グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）を展開するための反復を示す設計フローの一例を示しており、そこでは、これらのアミノ酸部位も他の部位も置換した。そのような設計フローは任意の所望のペプチドにも容易に適用して、所望のプロテアーゼから保護されたペプチドを生成することができることは認められるべきである。

選択したプロテアーゼに暴露後の、これらの各種ペプチドの安定性、およびＥＣ₅₀の測定結果を、その後、所望の合成ペプチドの選択の指針として使用した。

図２Ａ〜２Ｃは、修飾アナログの安定性／効力と比較した標準ＧＬＰ−１コンパレータ、Ｈ−（Ａｉｂ）²−ＥＧＴ⁵ＦＴＳＤＶ¹⁰ＳＳＹＬＥ¹⁵ＧＱＡＡＫ²⁰ＥＦＩＡＷ²⁵ＬＶＫＧＲ³⁰、配列番号：４、のネプリライシンに対する安定性の試験結果を示す。矢印は、元のピークの位置と、プロテアーゼと４時間、２１時間および６８時間インキュベートした後の分解を示している。示されるように、４つのすべての芳香族残基のアミノ基末端で急速な分解が起きており、ペプチドは２４時間で完全に分解した。

図３Ａ〜３Ｄは、合成ＧＬＰ−１ペプチド、Ｈ−（Ａｉｂ）²−ＥＧ−（Ｓ）⁵−（α−ＭｅＦ）⁶−ＴＳＤＶ¹⁰ＳＳ−（α−ＭｅＦ）¹³−ＬＥ¹⁵ＧＱＡＡＫ²⁰Ｅ−（α−ＭｅＦ）²²−ＩＡ−（α−ＭｅＦ）²⁵ＬＶＫＧＲ³⁰、配列番号：３８、のネプリライシンに対する安定性の試験結果を示す。示されるように、Ｐｈｅ６、Ｔｒｙ１３、Ｐｈｅ２２およびＴｒｐ２５の位置でアルファ−メチルフェニルアラニンにより置換され、５の位置でスレオニンがセリンに置換された合成ＧＬＰ−１ペプチドは、９６時間経過後もタンパク質分解を示さなかった。本明細書に記載のようにして測定した効力は、合成ＧＬＰ−１ペプチドはＧＬＰ−１コンパレータペプチド、配列番号：４、と同じであった。

ネプリライシン酵素が実験中活性であったことを示すために、２４０時間後に、ＧＬＰ−１コンパレータペプチド、配列番号：４、を加えた。図４Ａに示すように、配列番号：３８の合成ＧＬＰ−１ペプチドは１０日後もなお安定であった。（図４Ａ〜４Ｄ中、囲み１を参照。）図４Ａ〜４Ｄにおいては、コンパレータペプチドが追加後直ちに、僅か１時間を分解し始め（囲み２を参照）、２４時間までに分解が非常に進んだ（囲み３を参照）。

図５Ａ〜５Ｃは、標準ＧＬＰ−１コンパレータ、配列番号：４、のキモトリプシンに対する安定性の試験結果を示す。矢印は、元のピークの位置と、プロテアーゼと４５分および２時間インキュベートした後の分解を示している。示されるように、すべての疎水性残基のカルボキシル基末端で急速な分解が起きており、ペプチドは４５分で完全に分解した。

図６Ａ〜６Ｃは、合成ＧＬＰ−１ペプチド、配列番号：３８、のキモトリプシンに対する安定性の試験結果を示す。示されるように、合成ＧＬＰ−１ペプチドは、４８時間までに分解が始まったことを示した。切断はＬｅｕ２６／Ｖａｌ２７でのみ観察された。

図７Ａ〜７Ｃは、合成ＧＬＰ−１ペプチド、Ｈ−（Ａｉｂ）²−ＥＧ−（Ｓ）⁵−（α−ＭｅＦ）⁶−ＴＳＤＶ¹⁰ＳＳ−（α−ＭｅＦ）¹³−ＬＥ¹⁵ＧＱＡＡ−（α−ＭｅＫ）²⁰Ｅ−（α−ＭｅＦ）²²−ＩＡ−（α−ＭｅＦ）²⁵−（Ｖ）²⁶−Ｖ−（α−ＭｅＫ）²⁸−Ｇ−（Ｇ）３０、配列番号：５１、のキモトリプシンに対する安定性の試験結果を示す。示されるように、ロイシン２６のバリンへの置換により、６０時間安定な合成ＧＬＰ−１ペプチドが得られ、大きな切断生成物は認められなかった。

図８Ａ〜８Ｃは、標準ＧＬＰ−１コンパレータ、配列番号：４、のトリプシンに対する安定性の試験結果を示す。９０分までにＬｙｓ²⁰、Ｌｙｓ²⁸およびＡｒｇ³⁰のカルボキシル基側で急速なタンパク質分解は起きなかった。

図９Ａ〜９Ｃは、合成ＧＬＰ−１ペプチド、配列番号：３８、のトリプシンに対する安定性の試験結果を示す。示されるように、合成ＧＬＰ−１ペプチドは、９０分までにＬｙｓ²⁰、Ｌｙｓ²⁸およびＡｒｇ³⁰のカルボキシル基側での分解を示した。

図１０Ａ〜１０Ｃは、合成ＧＬＰ−１ペプチド、配列番号：５１、のトリプシンに対する安定性の試験結果を示す。示されるように、Ｌｙｓ２０およびＬｙｓ２８のアルファ−メチルリシンによる置換、Ａｒｇ３０のＧｌｙ３０による置換、ならびにＬｅｕ２６のＶａｌ２６による置換により、１８時間超の非常に長時間安定性を示す合成ＧＬＰ−１ペプチドが得られた。

図１１Ａ〜１１Ｂは、標準ＧＬＰ−１コンパレータ、配列番号：４、の血清に対する安定性の試験結果を示す。６０時間後、急速なタンパク質分解が起き、完全なペプチドは微量となり、血清プロテアーゼの大量の自己分解によりスペクトルを埋めるペプチドフラグメントを生成された。

図１２Ａ〜１２Ｂは、合成ＧＬＰ−１ペプチド、配列番号：３８、の血清に対する安定性の試験結果を示す。６０時間後、ペプチドのほぼ６４％が完全なまま残っており、血清プロテアーゼの自己分解によりスペクトルを埋めるペプチドフラグメントを生成された。

図１３Ａ〜１３Ｄは、脂質化コンパレータＧＬＰ−１ペプチド、Ｈ−（Ａｉｂ）²−ＥＧＴ⁵ＦＴＳＤＶ¹⁰ＳＳＹＬＥ¹⁵ＧＱＡＡＫ²⁰ＥＦＩＡＷ²⁵ＬＶＫＧＲ³⁰−（Ｋ−パーム）、配列番号：５、および脂質化プロテアーゼ保護ＧＬＰ−１ペプチド、Ｈ−（Ａｉｂ）²−ＥＧ−（Ｓ）⁵−（α−ＭｅＦ）⁶−ＴＳＤＶ¹⁰ＳＳ−（α−ＭｅＦ）¹³−ＬＥ¹⁵ ＧＱＡＡ−（α−ＭｅＫ）²⁰Ｅ−（α−ＭｅＦ）²²−ＩＡ−（α−ＭｅＦ）²⁵−（Ｖ）²⁶−Ｖ−（α−ＭｅＫ）²⁸−Ｇ−（Ｇ）³⁰−Ｋ（パーム）、配列番号：５２、の胃液に対する安定性の試験結果を示す。脂質化プロテアーゼ保護ＧＬＰ−１タンパク質の安定性は、脂質化コンパレータよりはるかに優れている。

図１４Ａ〜１４Ｅは、脂質化プロテアーゼ耐性配列番号：５２と比較した、商業的に入手可能なＧＬＰ−１アゴニスト（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ，Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）の胃液に対する安定性の試験結果を示す。脂質化プロテアーゼ耐性ＧＬＰ−１ペプチドの安定性は、Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅよりはるかに優れている。安定性の大きな差は、スペクトルを拡大して示した図１５Ａ〜１５Ｅでさらに示されており、保護ＧＬＰ−１ペプチド、配列番号５２の、実質的に同じ経時変化を示している。

本願に引用された全ての文献、特許、論文その他は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態とともに、図面を参照しながら、本発明を十分に説明してきたが、当業者であれば、様々な変更および修正は明らかであることは理解されよう。そのような変更および修正は、添付の特許請求の範囲から逸脱しない限り、それによって特定される本発明の範囲に含まれることは理解されるべきである。

さらに他の実施形態では、下記のアミノ酸配列を含む合成ＧＬＰ−１ペプチドが提供される。
Ｒ^１−Ｈｉｓ−Ｘ１−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ４−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘ５−Ｇｌｕ−Ｘ６−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｒ２（配列番号：２）（但し、
Ｒ^１は、Ｈｙ、ＡｃまたはｐＧｌｕであり；
Ｒ^２は、−ＮＨ_２または−ＯＨであり；
Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｉｂ、ＰｒｏまたはＧｌｙであり；
Ｘ２は、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；
Ｘ３は、Ａｉｂ、Ｂｉｐ、β，β−Ｄｉｐ、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｎｌｅ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、Ｎ−ＭｅＰｈｅ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｐｒｏまたはジ−β，β−ＭｅＰｈｅであり；
Ｘ４は、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、β，β−Ｄｉｐ、Ｇｌｎ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｎｌｅ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｐｒｏ、ジ−β，β−ＭｅＰｈｅ、α−ＭｅＴｙｒまたはジ−β，β−ＭｅＴｙｒであり；
Ｘ５は、Ａｉｂ、Ｌｙｓ、Ｄ−ｐｒｏ、Ｐｒｏもしくはα−ＭｅＬｙｓまたはジ−β，β−ＭｅＬｙｓであり；
Ｘ６は、Ａｉｂ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、２Ｃｌ−Ｐｈｅ、３Ｃｌ−Ｐｈｅ、４Ｃｌ−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、ホモＰｈｅ、２Ｍｅ−Ｐｈｅ、３Ｍｅ−Ｐｈｅ、４Ｍｅ−Ｐｈｅ、２ＣＦ_３−Ｐｈｅ、３ＣＦ_３−Ｐｈｅ、４ＣＦ_３−Ｐｈｅ、β−Ｐｈｅ、β−ＭｅＰｈｅ、Ｄ−ｐｈｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、３Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、β，β−Ｄｉｐ、β−Ａｌａ、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌまたはジ−β，β−ＭｅＰｈｅ；α−ＭｅＴｙｒ、ジ−β，β−ＭｅＴｙｒ、α−ＭｅＴｒｐまたはジ−β，β−ＭｅＴｒｐであり；
Ｘ７は、Ａｉｂ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、β，β−Ｄｉｐ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、２Ｍｅ−Ｐｈｅ、３Ｍｅ−Ｐｈｅ、４Ｍｅ−Ｐｈｅ、Ｎｌｅ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｎ−ＭｅＴｒｐ、α−ＭｅＴｒｐ、ジ−β，β−ＭｅＴｒｐ、ジ−β，β−Ｍｅ−Ｐｈｅ；α−ＭｅＴｙｒまたはジ−β，β−ＭｅＴｙｒであり；
Ｘ８は、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｎ−ＭｅＬｅｕ、α−ＭｅＬｅｕ、Ｖａｌまたはα−ＭｅＶａｌであり；
Ｘ９は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、α−ＭｅＶａｌまたはα−ＭｅＬｅｕであり；
Ｘ１０は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏまたはα−ＭｅＬｙｓであり；
Ｘ１１は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；かつ
Ｘ１２は、Ａｉｂ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、α−ＭｅＡｒｇまたはα−ＭｅＬｙｓである。）

Ｒ^１−Ｈｉｓ−Ｘ１−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ４−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘ５−Ｇｌｕ−Ｘ６−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｒ^２（配列番号：６３）
（但し、
Ｒ^１は、Ｈｙ、ＡｃまたはｐＧｌｕであり；
Ｒ^２は、−ＮＨ_２または−ＯＨであり；
Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｉｂ、ＰｒｏまたはＧｌｙであり；
Ｘ２は、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；
Ｘ３は、Ａｉｂ、Ｂｉｐ、β，β−Ｄｉｐ、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｎｌｅ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、Ｎ−ＭｅＰｈｅ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｐｒｏまたはジ−β，β−ＭｅＰｈｅであり；
Ｘ４は、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、β，β−Ｄｉｐ、Ｇｌｎ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｎｌｅ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｐｒｏまたはジ−β，β−Ｍｅ−Ｐｈｅであり；
Ｘ５は、Ａｉｂ、Ｌｙｓ、Ｄ−ｐｒｏ、Ｐｒｏまたはα−ＭｅＬｙｓであり；
Ｘ６は、Ａｉｂ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、２Ｃｌ−Ｐｈｅ、３Ｃｌ−Ｐｈｅ、４Ｃｌ−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、ホモＰｈｅ、２Ｍｅ−Ｐｈｅ、３Ｍｅ−Ｐｈｅ、４Ｍｅ−Ｐｈｅ、２ＣＦ_３−Ｐｈｅ、３ＣＦ_３−Ｐｈｅ、４ＣＦ_３−Ｐｈｅ、β−Ｐｈｅ、β−ＭｅＰｈｅ、Ｄ−ｐｈｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、３Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、β，β−Ｄｉｐ、β−Ａｌａ、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌまたはジ−β，β−ＭｅＰｈｅであり；
Ｘ７は、Ａｉｂ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、β，β−Ｄｉｐ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ， ２Ｍｅ−Ｐｈｅ、３Ｍｅ−Ｐｈｅ、４Ｍｅ−Ｐｈｅ、Ｎｌｅ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｎ−ＭｅＴｒｐ、α−ＭｅＴｒｐまたはジ−β，β−Ｍｅ−Ｐｈｅであり；
Ｘ８は、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｎ−ＭｅＬｅｕ、α−ＭｅＬｅｕまたはＶａｌであり；
Ｘ９は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、α−ＭｅＶａｌまたはＰｒｏであり；
Ｘ１０は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、α−ＭｅＬｙｓまたはＰｒｏであり；
Ｘ１１は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；かつ
Ｘ１２は、Ａｉｂ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏまたはα−ＭｅＡｒｇである。）

Claims (40)

1. 天然アミノ酸残基のアルファ−メチル官能基化アミノ酸による少なくとも１つの置換を含む合成ペプチドであって、前記置換を含まない対応する合成ペプチドと同じ受容体効力および選択性を実質的に維持している合成ペプチド。
2. 前記少なくとも１つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、置換された前記天然アミノ酸残基に対応している請求項１に記載の合成ペプチド。
3. 前記少なくとも１つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、アルファ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルアラニン、アルファ−メチルイソロイシン、アルファ−メチルアルギニン、アルファ−メチルロイシン、アルファ−メチルアスパラギン、アルファ−メチルリシン、アルファ−メチルアスパラギン酸、アルファ−メチルメチオニン、アルファ−メチルシステイン、アルファ−メチルフェニルアラニン、アルファ−メチルグルタミン酸、アルファ−メチルスレオニン、アルファ−メチルグルタミン、アルファ−メチルトリプトファン、アルファ−メチルグリシン、アルファ−メチルバリン、アルファ−メチルオルニチン、アルファ−メチルプロリン、アルファ−メチルセレノシステイン、アルファ−メチルセリンおよびアルファ−メチルチロシンからなる群から選択される請求項１に記載の合成ペプチド。
4. タンパク質分解に対し実質的に耐性を有している請求項１〜３のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
5. ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼ、および／またはペプシンによる分解に対し実質的に耐性を有している請求項１に記載の合成ペプチド。
6. 前記天然アミノ酸残基は、タンパク質分解による切断に感受性の高い部位である請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
7. インクレチンに分類されるペプチドである請求項１〜６のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
8. グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルコース依存性インスリン分泌促進ペプチド（ＧＩＰ）、エクセナチドペプチドプラスグルカゴン、セクレチン、テノモジュリン、オキシントモジュリン、および血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）からなる群から選択される請求項７に記載の合成ペプチド。
9. インスリンである請求項１に記載の合成ペプチド。
10. 天然アミノ酸残基のアルファ−メチル官能基化アミノ酸による少なくとも３つの置換を含む合成ＧＬＰ−１ペプチドであって、前記置換を含まない対応する合成ＧＬＰ−１ペプチドと同じ受容体効力を実質的に維持している合成ＧＬＰ−１ペプチド。
11. 前記少なくとも３つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、アルファ−メチルフェニルアラニンである請求項１０に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチド。
12. ４つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸を含む請求項１０に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチド。
13. 前記４つのアルファ−メチル官能基化アミノ酸は、Ｐｈｅ６、Ｔｒｙ１３、Ｐｈｅ２２およびＴｒｐ２５の位置で置換されたアルファ−メチルフェニルアラニンである請求項１２に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチド。
14. ２の位置でのアミノイソ酪酸置換（Ａｉｂ２）をさらに含む請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチド。
15. ５の位置でのセリン修飾（Ｓｅｒ５）をさらに含む請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチド。
16. Ｌｙｓ２０およびＬｙｓ２８の位置で置換されたアルファ−メチルリシンをさらに含む請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチド。
17. ロイシン２６を置換したバリンをさらに含む請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチド。
18. Ｃ末端の脂質化をさらに含む請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチド。
19. タンパク質分解に対し実質的に耐性を有している請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチド。
20. ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼ、および／またはペプシンによる分解に対し実質的に耐性を有している請求項１９に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチド。
21. ａ．置換するペプチド中の少なくとも１つの天然アミノ酸残基を特定すること、および
    ｂ．前記特定された天然アミノ酸残基を、アルファ−メチル官能基化アミノ酸で置換すること
    を含む合成ペプチドの調製方法であって、
    前記合成ペプチドが、前記置換を含まない対応する合成ペプチドと同じ受容体効力および選択性を実質的に維持しており、かつ
    前記合成ペプチドが、タンパク質分解に対し実質的に耐性を有している方法。
22. 前記置換アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、前記置換天然アミノ酸残基に対応している請求項２１に記載の方法。
23. 前記置換アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、アルファ−メチルフェニルアラニンである請求項２１に記載の方法。
24. 前記合成ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼ、および／またはペプシンによる分解に対し実質的に耐性を有している請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記特定は、酵素による切断を受けやすい部位のアミノ酸を特定することを含む請求項２１に記載の方法。
26. 前記ペプチドは、インクレチンに分類されるペプチドである請求項２１に記載の方法。
27. 前記ペプチドは、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン、グルコース依存性インスリン分泌促進ペプチド（ＧＩＰ）およびエクセナチドペプチドからなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
28. 前記ペプチドはインスリンである請求項２１に記載の方法。
29. ａ．ペプチドを１種以上のプロテアーゼに暴露すること、
    ｂ．少なくとも１つの、タンパク質分解による切断を受けやすい部位の天然アミノ酸残基を特定すること、および
    ｃ．前記特定したアミノ酸残基をアルファ−メチル官能基化アミノ酸で置換すること
    を含むタンパク質分解に安定なペプチドの調製方法であって、
    前記合成ペプチドが、前記置換を含まない対応する合成ペプチドと同じ受容体効力および選択性を実質的に維持しており、かつ
    前記合成ペプチドが、タンパク質分解に対し実質的に耐性を有している調製方法。
30. 前記置換アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、前記置換天然アミノ酸残基に対応している請求項２９に記載の方法。
31. 前記置換アルファ−メチル官能基化アミノ酸は、アルファ−メチルフェニルアラニンである請求項２９に記載の方法。
32. 前記合成ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ、ネプリライシン、キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、トリプシン、エラスターゼ、および／またはペプシンによる分解に対し実質的に耐性を有している請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記ペプチドは、インクレチンに分類されるペプチドである請求項３２に記載の方法。
34. 前記ペプチドは、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、グルコース依存性インスリン分泌促進ペプチド（ＧＩＰ）およびエクセナチドペプチドからなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
35. 前記ペプチドはインスリンである請求項２９に記載の方法。
36. 患者の治療方法であって、前記患者に請求項１に記載の合成ペプチドを薬学的に有効な量投与することを含む患者の治療方法。
37. 糖尿病と診断された患者の治療方法であって、前記患者に請求項１０に記載の合成ＧＬＰ−１ペプチドを薬学的に有効な量投与することを含む患者の治療方法。
38. 糖尿病と診断された患者の治療方法であって、前記患者に請求項９の合成インスリンを薬学的に有効な量投与することを含む患者の治療方法。
39. 前記投与は経口投与である請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 下記のアミノ酸配列を含む合成ＧＬＰ−１ペプチド。
    Ｒ¹−Ｈｉｓ−Ｘ１−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ４−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｘ５−Ｇｌｕ−Ｘ６−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｒ²（配列番号：２）（但し、
    Ｒ¹は、Ｈｙ、ＡｃまたはｐＧｌｕであり；
    Ｒ²は、−ＮＨ₂または−ＯＨであり；
    Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｉｂ、ＰｒｏまたはＧｌｙであり；
    Ｘ２は、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；
    Ｘ３は、Ａｉｂ、Ｂｉｐ、β，β−Ｄｉｐ、Ｆ５−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｎｌｅ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、Ｎ−ＭｅＰｈｅ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩ、Ｐｒｏまたはジ−β，β−Ｍｅ−Ｐｈｅであり；
    Ｘ４は、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、β，β−Ｄｉｐ、Ｇｌｎ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｎｌｅ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩ、Ｐｒｏ、またはジ−β，β−Ｍｅ−Ｐｈｅであり；
    Ｘ５は、Ａｉｂ、Ｌｙｓ、Ｄ−ｐｒｏ、Ｐｒｏもしくはα−ＭｅＬｙｓであり；
    Ｘ６は、Ａｉｂ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、２Ｃｌ−Ｐｈｅ、３Ｃｌ−Ｐｈｅ、４Ｃｌ−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、ホモＰｈｅ、２Ｍｅ−Ｐｈｅ、３Ｍｅ−Ｐｈｅ、４Ｍｅ−Ｐｈｅ、２ＣＦ₃−Ｐｈｅ、３ＣＦ₃−Ｐｈｅ、４ＣＦ₃−Ｐｈｅ、β−Ｐｈｅ、β−ＭｅＰｈｅ、Ｄ−ｐｈｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、３Ｉ−Ｐｈｅ、２Ｆ−Ｐｈｅ、β，β−Ｄｉｐ、β−Ａｌａ、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩまたはジ−β，β−Ｍｅ−Ｐｈｅであり；
    Ｘ７は、Ａｉｂ、Ａｒｇ、Ｂｉｐ、Ｃｈａ、β，β−Ｄｉｐ、Ｆ５−Ｐｈｅ、ＰｈＧ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ホモＰｈｅ、ホモＴｙｒ、α−ＭｅＰｈｅ、α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ， ２Ｍｅ−Ｐｈｅ、３Ｍｅ−Ｐｈｅ、４Ｍｅ−Ｐｈｅ、Ｎｌｅ、Ｔｙｒ−ＯＭｅ、４Ｉ−Ｐｈｅ、１−ＮａＩ、２−ＮａＩ、２Ｆ−Ｐｈｅ、３Ｆ−Ｐｈｅ、４Ｆ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｎ−ＭｅＴｒｐ、α−ＭｅＴｒｐまたはジ−β，β−Ｍｅ−Ｐｈｅであり；
    Ｘ８は、Ａｉｂ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｎｌｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｎ−ＭｅＬｅｕ、α−ＭｅＬｅｕまたはＶａｌであり；
    Ｘ９は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、α−ＭｅＶａｌまたはＰｒｏであり；
    Ｘ１０は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、α−ＭｅＬｙｓまたはＰｒｏであり；
    Ｘ１１は、Ａｉｂ、Ｇｌｕ、ＰｒｏまたはＳｅｒであり；かつ
    Ｘ１２は、Ａｉｂ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏまたはα−ＭｅＡｒｇである。）

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