KR20160094943A - 관절 연골 이미징 조성물 - Google Patents
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Abstract
관절 연골의 정상 부위와 정상이 아닌 변성 부위를 명확하게 구별하여 가시화 가능한 관절 연골 이미징 조성물을 제공한다.
관절 연골 이미징 조성물은 양성 하전 분자를 함유하며, 양성 하전 분자는 표식 분자로 표식되어 있다.
관절 연골 이미징 조성물은 양성 하전 분자를 함유하며, 양성 하전 분자는 표식 분자로 표식되어 있다.
Description
본 발명은 관절 연골의 손상 부위에 특이적으로 흡착하는 것에 의해 관절 연골의 손상 부위를 가시화하는 관절 연골 이미징 조성물에 관한 것이다.
변형성 관절증(OA; osteoarthritis)은 관절 연골의 변성이 주요 원인으로 생기는 것으로 생각되어지는 관절 질환으로, 무릎이나 넓적 다리, 대퇴골 등에 많이 나타난다.
그 발병 원인으로는 노화나 과부하 외에도 스포츠 손상이나 비만에 의해서도 기인한다.
그 중에서도 변형성 무릎 관절증의 환자 수는 일본 내에서는 2530만명으로 추정되고(2009년, 동경대학 의학부 부속병원 22세기 의료센터 ROAD 프로젝트), 미국에서는 그 배 이상으로 추정된다.
또한, 인구 밀집 지역이며, 노동 조건이나 환경 조건 등이 일본에 비해 어려운 것으로 생각할 수 있는 중국이나 인도, 아프리카 등에서도 OA의 환자 수가 향후 증가 할 것으로 생각된다.
현재, 일본 내에서는 연간 7만5000명(2011년, 야노 경제연구소)이 최종적인 치료법으로 전체 인공 무릎 관절 치환 수술을 받았다고 한다.
인공 관절 치환 그 자체는 고도로 침습적(侵襲的)인 치료인 동시에, 인공 관절에는 기계 수명이 있어 상황에 따라서는 교환을 반복할 필요가 생긴다.
변형성 무릎 관절증의 악화를 방지하고, 궁극적인 인공 관절 치환 수술을 피하기 위해서는 조기에 적절한 치료를 받는 것이 중요하다.
그러기 위해서는, 연골 변성의 조기 발견이 필요하지만 종래의 X선(뢴트겐) 촬영이나 MRI 검사로는 초기 단계에서의 연골 변성의 발견은 어렵다.
또한, 내시경의 일종인 관절경(關節鏡)을 이용하여 연골을 관찰하는 것에 의해, 연골 변성의 유무를 검사하는 것도 가능하지만, 이 방법은 담당 의사가 관절경 하에 겸자(鉗子) 등의 기구를 이용하여 연골 표층 부위의 촉각을 감지하는 것에 의해 판단되는 것이다.
그 때문에, 조기 발견은 의사의 경험과 기량에 맡겨지는 부분이 크고, 게다가 정상 연골과 변성 연골의 경계가 명확하게 식별 가능하지 않다는 문제가 있다.
의사의 경험이나 기량에만 의지하지 않고, 연골 변성의 조기 발견을 가능하게 하는 비 침습적 혹은 저 침습적인 검사 방법이 있다면, 연골 변성의 유무나 연골 변성의 진행 상황을 파악하여 치료 방침을 세우기 쉽다.
비 침습적 혹은 저 침습적인 검사 방법으로는 생체 조직을 가시화하는 in vivo 이미징 기술을 이용하는 방법이 있다.
in vivo 이미징 기술에는, 포지트론 단층법(PET)이나 핵 자기 공명 이미징(MRI), 초음파 이미징(Ultrasonography : US) 또는 광음향 이미징(Photoacoustic Imaging : PAI) 등 다양한 기술이 있다.
그 외, 생체 내의 관심 부위에 형광 물질을 집중시켜, 고감도로 파악하는 형광 분자 토모그래피(Fluorescence Molecular Tomography : FMT) 등의 형광 이미징 기술이 비 침습적으로 관심 부위에 대한 특이적인 가시화를 가능하게 하기 위하여 주목 받고 있다.
상술한 in vivo 형광 이미징 기술을 관절 연골에 대하여 적용 할 수 있도록, 관절 연골 조직에 특이적으로 결합하여 집적하는 이미징 프로브(probe)에 관한 기술이 몇 가지 제안되고 있다.
특허문헌1에는 연골 기질에 특이적으로 결합하는 연골 마커(marker)로서, 아르기닌 잔기 6~20개의 폴리 아르기닌 펩티드 또는 리신 잔기 6~20개의 폴리 리신 펩티드에 형광 물질 등의 신호 발생 수단을 결합시켜 얻은 연골 마커가 기재되어 있다.
또한, 특허문헌2에는 리신의 ε-아미노기와 카르복실기가 펩티드 결합으로 연결된 리신 올리고머에 전자파를 발생 또는 흡수하여 얻은 기를 결합시켜서 얻어진 리신 올리고머 유도체로 이루어진 연골 조직 마커가 기재되어 있다.
그렇지만, 특허문헌1 및 특허문헌2에는 이러한 연골 마커는 정상인 관절 연골에 대하여 특이적으로 결합하는 것은 기재되어 있지만, 정상이 아닌 예를 들어, 변형성 관절증과 같은 변성된 연골에 대해서는 어떠한 성질을 나타내는 지는 기재되어 있지 않다.
즉, 현재 상태에서는 관절 연골의 정상 부위와 정상이 아닌 부위를 명확하게 구별하여 가시화하는 진단용의 관절 연골 이미징 조성물이 존재하지 않는다는 문제가 있었다.
또한, 상술한 바와 같이, 의사의 경험이나 기량을 그다지 필요로 하지 않아도 연골 변성의 조기 발견을 가능하게 하는 검사 방법이 요구되고 있었다.
본 발명은 상술한 점에 감안하여 안출된 것으로, 그 목적은 관절 연골의 정상 부위와 정상이 아닌 부위를 명확하게 구별하여 가시화 할 수 있는 관절 연골 이미징 조성물을 제공하는 것에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 연골 변성의 조기 발견이나 변성 정도의 정밀한 식별을 용이하게 행하고, 조기의 치료 방침 결정에 기여할 수 있는 관절 연골 이미징 조성물을 제공하는 것에 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물은 양성 하전(荷電) 분자를 함유하고, 그 양성 하전 분자는 표식(標識) 분자로 표식되어 있다.
정상 연골은 표면이 평평한 세포가 다층으로 겹겹이 층을 이루는(重層) 표층을 구성하고 있지만, 변성된 연골은 세포층이 박리하여 섬유질의 많은 불규칙한 조직 구조를 한 연골 기질이 노출된 상태, 혹은 표층으로부터 심부(深部)를 향하여 결손된 상태로 되어 있다.
본 발명의 관절 연골 이미징 조성물은 표식 분자로 표식된 양성 하전 분자를 함유하고 있어, 이 양성 하전 분자는 노출된 연골 기질에 중점적으로 침투 및 흡착한다.
이와 같이, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물은 연골이 변성하고 있는 부분에 중점적으로 흡착하기 때문에, 관절 연골의 정상 부위와 정상이 아닌 변성 부위를 구별하여 가시화하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물의 양성 하전 분자는, 양성 하전화(荷電化) 된 단백질 또는 펩티드 화합물인 것이 바람직하다.
관절 연골 이미징 조성물을 구성하는 양성 하전 분자로서, 생체 내에도 넓게 존재하고, 안전성이 높으며, 취급도 용이하고, 표식 분자의 표식도 간단하게 행하는 것이 가능한 물질이 선택된다.
본 발명의 관절 연골 이미징 조성물의 단백질 또는 펩티드 화합물은 알부민, 알부민 분해물 또는 알부민의 수식(修飾) 화합물인 것이 바람직하다.
이에 따라, 양성 하전 분자를 구성하는 단백질 또는 펩티드 화합물로서 적합한 물질이 선택된다.
게다가, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물의 양성 하전 분자는 양성 하전화 된 당쇄(糖鎖) 화합물인 것이 바람직하다.
관절 연골 이미징 조성물을 구성하는 양성 하전 분자로서 생체 내에도 넓게 존재하고, 안전성이 높으며, 취급도 용이하고, 표식 분자의 표식도 간단하게 행하는 것이 가능한 물질이 선택된다.
본 발명의 관절 연골 이미징 조성물의 당쇄 화합물은 덱스트란, 사이클로 덱스트린 또는 이들의 유도체인 것이 바람직하다.
이에 따라, 양성 하전 분자를 구성하는 당쇄 화합물로서 적합한 물질이 선택된다.
더욱이, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물의 표식 분자는 형광 물질, 방사성 동위 원소, X선 흡수 물질, 항체 분자 및 특이적 항체에 의해 인식되는 인식 부위를 갖는 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 물질인 것이 바람직하다.
상술한 양성 하전 분자 등은 표식 분자로 분류되어 있기 때문에, 연골이 변성하고 있는 부분에 흡착하는 양성 하전 분자 등의 위치를 형광 물질, 방사성 동위 원소, X선 흡수 물질, 항체 분자 또는 특이적 항체에 의해 인식되는 인식 부위를 갖는 분자 등의 표식 분자에 의해 가시화하는 것이 가능하다.
또한, 상술한 표식 분자 중, 형광 물질은 인도시아닌 그린인 것이 바람직하다.
이에 따라, 안전성이 높고, 효율적으로 가시화나 검출을 행하는 것이 가능한 표식 분자가 선택된다.
또한, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물의 표식 분자는 자성 입자, 금속 입자, 금속 나노 입자 및 기타 나노 소재 함유 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 물질인 것도 바람직하다.
이에 따라, 연골이 변성하고 있는 부분에 흡착하는 양성 하전 분자 등의 위치에 대하여 X선 CT, MRI, 라만 분광법, 플라즈몬 공명법 등에 의한 검출도 가능하게 된다.
본 발명에 따르면, 아래과 같은 우수한 효과를 갖는 관절 연골 이미징 조성물을 제공하는 것이 가능하다.
(1) 관절 연골의 정상 부위와 정상이 아닌 변성 부위를 명확하게 구별하여 가시화하는 것이 가능하다.
(2) 연골 변성의 조기 발견이나 변성 정도의 정밀한 식별을 용이하게 행하는 것이 가능하다.
(3) 관절경에 의한 진단 또는 수술의 경우에, 관절 연골 이미징 조성물을 사용하는 것에 의해 생체 내에 있어서 관절 연골의 변성 부위를 가시화시켜 진단 또는 치료하는 것이 가능하다.
(4) 관절강(關節腔)에 관절 연골 이미징 조성물을 주입하는 것 등에 의해, in vivo 이미징 기술을 이용하여 비 침습적 또는 저 침습적으로 연골의 변성 상태를 진단하는 것이 가능하다.
(5) 안전성 높은 물질로 구성되어 있기 때문에, 취급도 용이하다.
또한, 분해 산물에 대해서도 동일하게 안전성이 높다.
(6) 검사나 수술이 종료된 후에는 대사(代謝), 가수 분해 또는 조직액에 의한 희석에 의해 효율 좋게 배제된다.
도 1은 실시예1에 있어서 양성 하전화 된 소 혈청 알부민의 등전점(等電點) 전기 영동(泳動)의 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 실시예2에 있어서 양성 하전화 알부민 또는 알부민과 인도시아닌 그린의 결합에 의한 형광 발광의 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 실시예3에 있어서 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에 의한 손상 연골 모델의 이미징의 결과를 나타내는 사진이다
도 4는 실시예4에 있어서 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에 의한 연골 손상 모델 및 손상 없는 모델에 대한 이미징의 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 실시예5에 있어서 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에 의한 인간 손상 연골에 대한 이미징의 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 실시예2에 있어서 양성 하전화 알부민 또는 알부민과 인도시아닌 그린의 결합에 의한 형광 발광의 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 실시예3에 있어서 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에 의한 손상 연골 모델의 이미징의 결과를 나타내는 사진이다
도 4는 실시예4에 있어서 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에 의한 연골 손상 모델 및 손상 없는 모델에 대한 이미징의 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 실시예5에 있어서 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에 의한 인간 손상 연골에 대한 이미징의 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에는 표식된 양성 하전 분자가 포함된다.
본 발명에 있어서 '양성 하전 분자'는 양성 하전(정전하)을 구비하여 변성된 연골에 선택적으로 흡착 가능한 분자의 것을 말한다.
연골은 결합 조직으로 분류되며, 풍부한 세포 외 기질인 연골 기질과 그 안에 점재(點在)하는 연골 세포로 구성되어 있다.
관절을 구성하는 연골은 초자(硝子) 연골이라 불리고 있으며, 그 초자 연골의 연골 기질의 주성분은 주로 콜라겐과 프로테오글리칸이다.
이 프로테오글리칸은 콘드로이틴 황산, 케타란 황산 및 헤파란 황산 등의 음성 하전을 갖는 측쇄(側鎖)를 함유하고 있어 전체적으로 음성 하전을 가진다.
정상 연골은 표면이 평평한 세포가 다층으로 겹겹이 층을 이루는 표층을 구성하고 있지만, 변성된 연골은 세포층이 박리하여 섬유질의 많은 불규칙한 조직 구조를 한 연골 기질이 노출된 상태, 혹은 표층으로부터 심부를 향하여 결손된 상태로 되어 있다.
본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에 포함되는 양성 하전 분자는 연골 조직의 표층이 박리하여 노출된 연골 기질 내의 프로테오글리칸에 특이적으로 흡착하는 것으로 추측된다.
본 발명에 있어서 양성 하전 분자로는 변성된 연골에 선택적으로 흡착 가능한 분자라면 특별히 한정되지 않지만, 안전성이나 취급의 용이함의 관점에서 양성 하전화 된 단백질 혹은 펩티드 화합물, 또는 양성 하전화 된 당쇄 화합물이 바람직하다.
또한, 본 명세서에 있어서 '단백질'로는 당 단백질이나 리포 단백질, 뉴클레오티드 결합 단백질 등이 넓게 포함된다.
양성 하전화 되는 것에 의해 본 발명에 있어서 양성 하전 분자로 이용되는 단백질 또는 펩티드 화합물로는 혈장 단백질이나 각종의 알부민이 바람직하고, 특히 혈청 알부민이 바람직하다.
또한, 혈장 단백질이나 각종 알부민에는 이들의 분해물이나 수식 화합물도 포함된다.
이 양성 하전화 된 알부민(카티온화 알부민)은 연골 기질에 특이적으로 흡착하지만, 연골 조직의 세포 내에는 침입하기 어려운 성질을 가지고 있다.
그래서, 이 카티온화 알부민은 정상 연골 조직의 표층으로부터는 세포 내부로 받아들여지기 어렵고, 정상인 연골 조직의 표층 내에 존재하는 연골 기질은 거의 흡착되지 않는다.
이 때문에, 카티온화 알부민은 관절 연골 조직 중 정상이 아닌 변성 부위에 중점적으로 흡착된다.
또한, 알부민 또는 그의 분해물·수식 화합물의 양성 하전화 상태로는 연골 손상 부위로의 중점적인 흡착이 이루어진다는 관점에서, 등전점 pI가 8이상으로 되도록 양성 하전화 되어 있는 것이 바람직하고, 10이상으로 되도록 양성 하전화 되어 있는 것이 특히 바람직하다.
이와 같은 연골 조직의 세포에 침입하기 어려운 성질을 갖는 알부민을 선택하는 것에 의해, 관절 연골 이미징 조성물을 생체에 적용할 때의 안전성이 더욱 높아진다.
또한, 분자량이 큰 알부민 분자를 선택하는 것에 의해, 표식 분자에 의한 표식 수를 늘리는 것이 가능하기 때문에, 예를 들면 표식 분자로서 형광 물질을 이용한 경우에는 휘도를 향상시키는 등 조정이 가능하며, 표식 분자에 의한 검출, 즉 가시화가 용이해진다.
또한, 상술한 알부민 같이 양성 하전화 되는 것에 의해, 본 발명에 있어서 양성 하전 분자로 이용되는 당쇄 화합물로는 직쇄 형상 또는 고리 형상의 당쇄 화합물이 바람직하고, 직쇄 형상의 당쇄 화합물로는 덱스트란 또는 덱스트란 유도체가 특히 바람직하고, 고리 형상의 당쇄 화합물로는 사이클로 덱스트린 또는 사이클로 덱스트린 유도체가 특히 바람직하다.
이러한 양성 하전화 된 덱스트란, 사이클로 덱스트린 또는 이들의 유도체는 상술한 알부민 같이 연골 기질에 특이적으로 흡착하지만, 연골 조직의 세포 내에는 침입하기 어려운 성질을 가지고 있다.
그러므로, 이러한 카티온화 된 덱스트란이나 사이클로 덱스트린은 정상 연골 조직의 표층으로부터는 세포 내부에 침입하기 어려워, 정상인 연골 조직의 표층 내에 존재하는 연골 기질은 거의 흡착되지 않는다.
이 때문에, 카티온화 된 덱스트란 또는 사이클로 덱스트린은 관절 연골 조직 중 정상이 아닌 변성 부위에 흡착된다.
이 때, 덱스트란 또는 사이클로 덱스트린으로는 연골 조직의 세포 내로 침입하기 어렵다는 관점에서, 분자량이 3,000 이상인 것이 바람직하고, 10,000 이상인 것이 더욱 바람직하다.
이와 같이, 연골 조직의 세포에 침입하기 어려운 성질을 갖는 덱스트란이나 사이클로 덱스트린을 선택하는 것에 의해, 관절 연골 이미징 조성물을 생체에 적용하는 경우의 안전성이 더욱 높아진다.
또한, 분자량이 큰 덱스트란이나 사이클로 덱스트린을 선택하는 것에 의해, 표식 분자에 의한 표식 수를 늘리는 것이 가능하기 때문에, 예를 들어 표식 분자로 형광 물질을 이용한 경우에는 휘도를 향상시키는 등 조정이 가능하며, 표식 분자에 의한 검출, 즉 가시화가 용이해진다.
또한, 사이클로 덱스트린에 대해서는 그 분자의 내부 공동(空洞)에 표식 분자를 용이하게 포접(包接)하기 때문에, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물을 용이하게 얻는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에 있어서 '관절 연골 이미징'이란 관절 연골의 상태를 육안 또는 장치 등을 이용하여 화상이나 수치 또는 벡터 등의 수단에 의해 가시화(시각화)하는 것을 말한다.
가시화에 있어서는 관절 연골 조직의 일부를 채취하여 검출하는 경우, 생체 내에서(in situ) 검출하는 경우 모두를 포함하며, 생체 내에서의 가시화에 대해서는 통상의 수술에 있어서 가시화 외에도 관절경을 이용한 저 침습적인 검사 또는 수술이나, 본 발명의 조성물을 관절강 내에 주사기 등을 이용하여 주입하는 것과 같은 저 침습적인 검사에 있어서 가시화도 포함한다.
본 발명에 있어서 표식 분자로는 양성 하전 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되거나, 양성 하전 분자에 포접되는 것에 의해 양성 하전 분자로 표시를 하고, 양성 하전 분자의 존재를 나안(裸眼)이나 장치 등에 의해 검출하는 것이 가능한 분자의 것을 말한다.
표식 분자로는 특별히 한정되지 않지만, 형광 물질, 방사성 동위 원소, 발광 물질, 효소, X선 흡수 물질, 항체 분자, 특이적 항체에 의해 인식되는 인식 부위를 갖는 분자(항체 인식 분자), 자성 입자, 금속 입자, 유리 코팅된 금속 나노 입자 등을 적절하게 이용하는 것이 가능하다.
본 발명의 일 실시형태로는, 가시화나 검출이 용이하다는 관점에서, 표식 분자로 형광 물질이 바람직하게 이용된다.
형광 색소로는 일례로서 인도시아닌 그린, Alexa Fluor(등록 상표) 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, BODIPY(등록 상표) FL, 텍사스 레드(등록 상표), 오레곤 그린(등록 상표) 488, 로다민 B, 로다민 그린, 테트라메틸 로다민, 플루오레세인, 플루오레세 인 이소티오시아네이트, 피코에리스린, 피코시아닌, Cy3, Cy5, Cy7 등이 바람직하게 이용된다.
이 가운데, 안전성이 높고, 가시화나 검출이 용이한 관점에서, 인도시아닌 그린을 이용하는 것이 특히 바람직하다.
인도시아닌 그린은 일정 조건 하에 있어서 근 적외광을 조사하는 것에 의해, 조사한 근 적외광보다도 파장이 긴 근 적외 영역의 형광을 발한다.
발생된 빛은 직접 육안으로는 거의 관찰 할 수 없고, 관찰을 위해서는 적외광 검출을 위한 장치를 필요로 하지만, 암시야를 가능하게 하기 때문에 관절경 하에서의 관찰에서는 콘트라스트를 부여하기 쉽고 검출하기 쉽다.
이러한 형광 분자는 아비딘·비오틴법에 의한 결합 외에도 포접, 그 외 공지의 방법에 의해 양성 하전 분자를 표식하는 것이 가능하다.
또한, 표식 분자로 항체 인식 분자를 이용한 경우는 아비딘·비오틴법 외에도 각종 형광 항체 반응을 이용하여 형광 관찰이 가능하다.
또한, 루시페린을 표식 분자로 이용한 경우에는, 루시페린·루시페라아제 반응을 이용한 발광 관찰도 가능하다.
게다가, 표식 분자로서 X선 흡수 물질이나 자성 나노 입자, 금속 나노 입자 등을 이용하는 것도 가능하다.
이들을 표식 분자로 이용하는 것에 의해, X선 CT, MRI, 라만 분광법, 플라즈몬 공명법 등에 의한 관찰도 가능해진다.
또한, 상술한 표식 분자에 의한 검출에 더하여, 연골 조직 하에 풍부하게 존재하는 헤모글로빈의 적외광 흡수나 콜라겐 섬유의 자가 발광 현상의 검출, MR 에라스토그래피(MR elastography : MRE)의 진동에 의한 전단 응력에 대한 조직의 점탄성을 비 침습적으로 평가하는 것도 가능하다.
더욱이, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에는 상술한 분자 이외의 다른 성분을 포함하는 것이 가능하다.
그러한 첨가물로는 예를 들어, 등장화제(等張化劑), 완충제, 보존제, 항산화제 등을 들 수 있다.
등장화제로는 염화나트륨, 글리세린, D-마니톨, D-솔비톨, 포도당 등이 바람직하게 이용된다.
완충제로는 인산염, 초산염, 탄산염, 구연산염 등의 완충액 등을 들 수 있다.
게다가, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에는 상술한 첨가물 외에도 양성 하전 분자의 연골 조직 내로의 침입을 추가로 방지하는 물질을 포함시키는 것도 가능하다.
이러한 물질로는 예를 들어, 콜라겐이나 양성 하전화 되지 않은 알부민 또는 이들의 유도체나 분해물 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물은 상술한 표식 분자로 바꾸고, 손상 연골 복원 작용을 갖는 치료용 약제나, 세포 시트 등에 의한 재생 의료·세포 치료의 발판이 되는 I형 콜라겐 등의 스카폴드(scaffold) 분자를 결합하여 이용하는 것으로, 연골 손상 부위에 선택적으로 결합하는 약제 전달 시스템으로 이용이 가능하다.
또한, 스카폴드 이식 후의 수술 후 관리에도 이용이 가능하다.
다음으로, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물의 사용 방법에 대하여 설명한다.
본 발명의 관절 연골 이미징 조성물은 적용이 용이하다는 관점에서, 액체 제제(製劑)인 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물을 생체 내에 적용하는 경우에는 관절경 하에서의 관절 연골 표층으로의 분무, 적하 혹은 도포, 또는 관절강 내로의 주사를 행하는 것이 가능하다.
관절경 하에서의 적용의 경우에는 젖산 링겔액 또는 생리적 식염수 등으로 연골 표면을 세정하고 관절강 내의 점액(활액)을 제거한 후, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물의 분무나 도포 등을 행하는 것이 바람직하다.
또한, 관절 연골 이미징 조성물의 분무 등을 행한 후에는, 일정 시간 방치하여 관절 연골 이미징 조성물을 침투시킨다.
이 일정 시간으로는 구체적으로 대상 조직으로의 침투성의 관점에서, 3분~30분 정도가 바람직하며, 5분~20분 정도가 보다 바람직하고, 10분~15분 정도가 더욱 바람직하다.
그 후, 관절 연골을 젖산 링겔액 등으로 헹구어, 비 특이적인 흡착이나 잉여의 관절 연골 이미징 조성물을 제거한다.
그 후, 표식 분자에 의한 형광 등의 검출을 행한다.
표식 분자에 의한 검출 방법으로는 특별히 한정되지 않지만, 관절경 및 표식 분자에 적합한 여기광(勵起光)으로 조정하는 필터를 구비한 광학 섬유를 삽입하여 표식 분자의 측정을 행하는 것이 바람직하다.
일예로서, 표적 분자에 형광 지시약인 인도시아닌 그린을 이용한 경우에는 적정한 필터를 통한 CCD 카메라의 화상에 의해 인도시아닌 그린의 녹색 형광 (피크 파장 800~850nm)을 간이적으로 관찰하는 것이 가능하다.
게다가, 검출 결과의 이미징에 있어서는 적당한 소프트웨어를 이용하여 형광 강도 등을 관찰자가 원하는 색조나 수치 등으로 변환하여 표시하는 것이 가능하다.
또한, 상술한 바와 같이하여 관절 연골 이미징 조성물이 가시화한 연골 변성 부분에 묻어, 시인 가능한 화상 상의 농담(濃淡)이나 색조의 전이 등을 식별 혹은 검출하는 것에 의해, 변성된 연골 조직 표면의 거칠기, 즉 연골의 변성 수준을 검지하는 것도 가능하다.
관절경을 이용한 진단이나 수술에 걸리는 시간은 통상 1~3시간으로 단시간이기 때문에, 관절 연골 이미징 조성물의 작용 시간도 동일하게 1~3시간 정도이면 좋으며, 진단이나 수술이 끝난 후에는 젖산 링겔액이나 생리적 식염수 등으로 여러번 세정하는 것에 의해, 그 대부분이 배출되며, 잔존하는 부분에 대해서도 가수 분해 등에 의해 분해되어 배출될 수 있다.
본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에 따르면, 정상인 연골 조직에 대해서는 그 표층 세포가 형성하는 껍질 같은 구조가 양성 하전 분자를 배제하며, 연골 세포 내로의 침입도 발생하기 어렵기 때문에, 정상인 연골 조직은 가시화되지 않는다.
한편, 변성되어 표층 세포층이 없는 연골 조직에 대해서는 노출된 연골 기질에 지향적으로 흡착하기 때문에, 변성된 연골 조직은 강조된다.
통상의 검출 방법으로는 연골 변성의 조기, 즉 표층 세포층이 손실된 것뿐인 '연골 변성 그레이드1'은 검출이나 식별이 매우 곤란하였다.
본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에 따르면, 이와 같은 '연골 변성 그레이드1'에 대해서도 식별, 검출이 가능하게 되어 환자의 조기 치료를 가능하게 할 수있다.
또한, 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물에 따르면, 관절경을 사용하여 관절 내의 조직(연골, 십자인대 및 반월판)의 손상 상태를 파악하고 치료를 행하는 것이 가능하기 때문에, 저 침습성의 진단 및 치료가 가능해진다.
지금까지 관절경에 의해 가시광 하에서 모니터에 비춰지는 관절 연골은 백색의 높은 휘도를 갖아 연골 표층의 변성이나 손상을 판별하는 것이 곤란하였지만, 본 발명의 조성물을 이용하는 것에 의해 연골 표면의 변성이나 결손 부분을 표식하는 것이 가능하며, 암시야에서 표식 분자에 의한 적외 형광을 발광시키는 등으로 가시 광으로는 보는 것이 어려웠던 연골의 손상 상태를 발견하는 것이 가능하게 된다.
이하, 본 발명의 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예1]
1. 양성 하전화 알부민의 조정
소 혈청 알부민 5g(시그마-알드리치 합동 회사 제품)을 순수(純水) 25mL에 용해시켰다.
한편, 무수 에틸렌디아민 67mL(시그마-알드리치 합동 회사 제품)를 순수 500mL에 첨가하고, 얼음물 안에서 6N의 염산 약 350mL를 서서히 가하여 pH를 4.75로 조제하였다.
추가로, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염 1.8g(시그마-알드리치 합동 회사 제품)을 상기 에틸렌디아민 용액에 첨가하고, 앞서 조제한 소 혈청 알부민 수용액을 더하였다.
얼음물에서 조정 용기를 냉각하여 온도와 pH를 유지하면서 2시간 교반한 후, 4M의 초산 완충액을 5mL 가하여 반응을 정지시켰다.
얻어진 용액을 4℃에서 순수로 72시간 투석한 후, 동결 건조를 행하였다.
동결 건조에 의해 얻어진 결정은 흰색으로 광택이 있고, 박막 형상의 외관을 나타냈다.
상술한 바와 같이 하여 조정된 동결 건조 산물과, 원료로 이용한 소 혈청 알부민에 대하여 양자의 등전점을 측정하고, 양성 하전화 알부민이 얻어졌는지 여부의 확인을 행하였다.
동결 건조 산물 및 소 혈청 알부민을 순수에 용해하고, Novex(등록 상표) IEF 겔(라이프 테크놀로지스 제팬 주식회사 제품)에 적용하여 등전점 전기 영동을 행하였다.
결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이 통상의 소 혈청 알부민의 pI는 약 4.9이지만, 동결 건조 산물은 pI가 11 정도로 높고, 고도로 카티온화 되어 있는 것으로 나타났다.
이에 따라, 양성 하전화 알부민이 얻어진 것으로 확인되었다.
[실시예2]
2. 양성 하전화 알부민과 인도시아닌 그린의 적정 농도의 검토
형광 색소인 인도시아닌 그린(ICG)은 ICG만으로 이루어진 수용액의 상태에서는 형광을 인식할 수 없지만, 단백질과 결합하면 근 적외광 영역의 형광을 발한다.
실시예1에서 만든 양성 하전화 알부민에 ICG를 결합시켜, ICG에서 나오는 형광 강도를 다음과 같이 하여 측정하였다.
또한, 대조 시험으로 양성 하전화 되지 않은 알부민과 ICG의 결합에 의한 형광 강도도 측정하였다.
실시예1에서 만든 양성 하전화 알부민을 순수에 용해시키고, 1.250mg/mL, 0.625mg/mL, 0.313mg/mL, 0.156mg/mL 및 0.078mg/mL 농도의 용액을 조정하였다.
또한, 인도시아닌 그린(시그마-알드리치 합동 회사 제품)을 순수하게 용해시켜 0.025mg/mL의 용액을 조정하였다.
각 농도의 양성 하전화 알부민 용액과 ICG 용액을 각각 50μL 씩 취하고, 96 웰의 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하여 혼합 하였다.
용액에서 발생한 적외 형광을 적외선 관찰 카메라 시스템(pde-neo C10935-20, 하마마츠 포토닉스 주식회사 제품)으로 촬영하였다(여기광 760nm, 형광 830nm).
대조 시험으로 양성 하전화 알부민을 소 혈청 알부민(시그마-알드리치 합동 회사 제품)으로 바꾸어 상술한 것과 같은 내용으로 시험을 행하였다.
결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 사진에 나타난 바와 같이, 양성 하전화 되지 않은 알부민은 알부민 농도가 0.313mg/mL(알부민 농도; 0.156mg/mL, ICG 농도; 0.0125mg/mL) 이상의 시험구에 있어서 육안으로의 형광 식별이 가능하였다.
한편, 양성 하전화 알부민은 양성 하전화 알부민 농도가 0.156mg/mL(양성 하전화 알부민 농도; 0.078mg/mL, ICG 농도; 0.0125mg/mL) 이상의 시험구에 있어서 육안으로의 형광 식별이 가능하였다.
이와 같이, 양성 하전화 알부민은 통상의 알부민보다도 낮은 농도에서 형광 식별이 가능한 것으로 나타났다.
또한, ICG에 대해서는 상술의 시험 농도(0.0125mg/mL)보다도 높은 농도에서 시험을 행한 결과, 형광의 휘도도 높아지는 것이 확인되었다.
[실시예3]
3. 관절 연골 이미징 조성물에 의한 소 정상 관절 연골을 이용한 손상 연골 모델의 이미징(1)
생후 2~3주간의 정육용 소의 앞다리 어깨부의 관절 연골을 약 1.5cm×약 2cm의 크기로 잘라내어, 아래 뼈는 제거하였다.
다음으로, 도 3의 손상 연골 모델 그림에 나타낸 바와 같이, 잘라낸 관절 연골 조각의 표면을 면도칼로 0.1~0.2mm 정도의 깊이로 일부 절제하여, 연골 표면에 결손부를 생성시켰다.
실제 임상에서의 이용을 상정(想定)하여, 각 관절 연골 조각에 약 5mL의 생리 식염수를 주사통으로 분사하여 세정하였다.
다음으로, 순수에 양성 하전화 알부민과 ICG를 용해시켜 조제한 관절 연골 이미징 조성물(양성 하전화 알부민 농도 : 2.5mg/mL, ICG 농도 : 0.125mg/mL) 200μL를 소수성 플라스틱 면에 적하하고, 관절 연골 조각의 표면을 아래로 하여 소수성 플라스틱면에 놓고, 관절 연골 이미징 조성물에 침적시켰다.
약 10~15분 후에 생리 식염수로 여분의 관절 연골 이미징 조성물을 씻어내고, 적외선 카메라(하마마츠 포토닉스 주식회사 제품)를 이용하여 각 관절 연골 절편의 표면 화상을 기록하였다.
적외선 카메라로 관찰한 화상을 도 3에 나타내었다.
대조구의 관절 연골 조각(표면을 절제하지 않은 것)에 대해서는 연골 표면에서의 관절 연골 이미징 조성물의 침투 및 흡착은 확인할 수 없었다.
흰색 선 형상의 발광은 관절 연골 조각의 외주 측면에 잉여의 관절 연골 이미징 조성물이 모세관 현상으로 부착된 것이었다.
한편, 시험구1(연골 표면 중, 한쪽 절반면을 면도칼로 절제하여 결손시킨 것)에 대해서는 표면의 결손 부분에서 관절 연골 이미징 조성물이 침투하여 흡착하는 것에 의해 발생한 발광이 확인 가능하였다.
또한, 흰색 선 형상의 발광은 관절 연골 조각의 외주 측면에 잉여 관절 연골 이미징 조성물이 모세관 현상으로 부착된 것이었다.
게다가, 시험구2(연골 표면 중, 중앙 부분을 면도칼로 절제하여 결손시킨 것)에 대해서는 표면 중앙부의 결손 부분에서 관절 연골 이미징 조성물이 침투하여 흡착하는 것에 의해 발생한 발광이 확인 가능하였다.
이와 같이, 절제면은 심부에까지 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물이 침투하여 흡착하여 고강도 형광을 발하는 것이 나타났다.
[실시예4]
4. 관절 연골 이미징 조성물에 의한 소 정상 관절 연골을 이용한 손상 연골 모델의 이미징(2)
생후 2~3주간의 정육용 소의 앞다리 어깨부의 관절 연골을 무균적으로 약 1cm×약 1.5cm의 크기로 잘라내어, 아래 뼈는 가급적 제거하였다.
잘라낸 연골은 생리적 인산 완충액에 침적시켰다.
다음으로 잘라낸 관절 연골 조각 표면의 대략 절반면(평면에서 보아 우측 절반면)을 수술용 메스(No.11)로 약 0.1~0.2mm 정도의 깊이로 절제하여 연골 표면에 결손부를 만들었다.
이 처리에 의해, 관절 연골 조각은 평면에서 보아 좌측 절반면은 손상 없는 대조구로 되며, 평면에서 보아 우측 절반면은 연골의 표층 손상 모델로 된다.
또한, 측정 및 관찰 시의 위치 확인을 위하여, 손상시킨 면의 한쪽 모서리를 경사지게 삭제하였다.
형광 관찰에 앞서, 각 관절 연골 조각에 약 2~3mL의 생리적 인산 완충액을 주사통으로 분사하여 세정 하였다.
잉여의 완충액은 킴 와이프(등록 상표)로 제거 하였다.
다음으로, 후술하는 시료액1~4를 50μL 씩 각각 소수성 샬레에 떨어트리고, 각 관절 연골 조각의 표면을 아래로 하여 샬레의 위에 떨어트린 시료액의 위에 놓고, 관절 연골 조각의 표면에 시료액을 침적시켰다.
약 10분 후에 여분의 시료액을 2~3mL의 생리적 인산 완충액으로 씻어내고, 잉여의 완충액은 킴 와이프로 제거하였다.
각 관절 연골 조각을 검은색의 종이 조각 위에 놓고, 근 적외광 하 및 가시광 하에서 사진 촬영을 행하였다.
본 실시예에서 이용한 시료액1~4는 모두 순수에 각 성분을 용해시켜 조제하여, 시료액1 : 순수만, 시료액2 : ICG 농도 0.125mg/mL, 시료액3 : 알부민 농도 2.5mg/mL 및 ICG 농도 0.125mg/mL, 및 시료액4 : 양성 하전화 알부민 농도 2.5mg/mL 및 ICG 농도 0.125mg/mL로 하였다.
또한, 근 적외광 하에서의 촬영은 근 적외 발광다이오드 16개를 원형으로 배열시킨 광원(여기 파장 : 770nm, 각 30mA)에서 각 관절 연골 조각의 시료액을 여기시켜, ICG용 832nm의 필터(Semrock사 제품, BrightLine ICG-B)를 통하여, 고감도 CCD 카메라(하마마츠 포토닉스 주식회사 제품, ORCA-ER)에서 모두 동일한 조건 (100ms, low light 및 8×binning mode)에서 행하였다.
근 적외광 하에서의 촬영 이후, 가시광 하에서의 흑백 촬영을 행하였다.
결과를 도 4에 나타내었다.
가시광 촬영 사진 및 근 적외광 촬영 사진 중에 있어서도, 좌측 절반면이 손상 없는 대조를 나타내고, 우측 절반면이 손상 모델을 나타내고 있다.
시료액1(순수만)의 경우에는, 어느 면에 있어서도 발광은 확인되지 않았다.
그러나, 시료액2(ICG만)의 경우에는, 손상 없는 대조 부분의 면에만 형광이 보였다.
이 형광은 ICG가 연골 표면의 단백질에 흡착한 것에 의한 것으로 생각된다.
한편, 손상 모델의 면에는 형광 발광이 관찰되지 않는 것으로부터, 연골의 표면이 손상하는 것에 의해 단백질보다도 글리코사미노글리칸 등의 당쇄가 연골 표면에 풍부하게 노출되어 있어, ICG가 이러한 당쇄에 흡착되지 않았기 때문이라고 생각되었다.
한편, 시료액3(알부민+ICG)의 경우에는, 어느 면에서도 매우 약한 형광 발광이 관찰 되었으나, 그 발광 강도에는 차이가 없었다.
이에 따라, 알부민은 연골 매트릭스나 세포층에 대한 흡착 특이성이 거의 없는 것, 및 시료액 중에 포함되는 알부민이 ICG와 결합하는 것에 의해, 연골 표면에서 단백질로의 ICG의 흡착 활성이 손실되었기 때문이라고 생각되었다.
게다가, 시료액4(양성 하전화 알부민+ICG)의 경우에는, 손상면 측에 강한 형광이 관찰되었다.
이것은 양성 하전화 알부민이 손상을 받은 면으로부터 내부로 침투하여 음성 하전을 많이 포함한 연골 중층에 흡착하였기 때문이라고 추측되었다.
손상 없는 대조 부분의 면은 세포층이 조밀하게 늘어서 있고, 음성 하전도 적어, 양성 하전화 알부민의 흡착이 적은 것으로 생각된다.
또한, ICG는 양성 하전화 알부민에 포섭되는 등으로 단백질에 포화하고 있으며, 연골 표면의 단백질에 새롭게 흡착하는 것은 아니라는 것으로 생각된다.
이와 같이, 양성 하전화 알부민과 ICG로 구성된 본 발명의 관절 연골 이미징 조성물은 연골 손상 부에 침투하여 흡착하고, 정상인 연골 표면 부분보다도 강한 형광을 발하는 것에 의해, 손상 부분을 가시화하는 것이 나타났다.
[실시예5]
5. 관절 연골 이미징 조성물에 의한 인간 손상 연골의 이미징
본 발명의 관절 연골 이미징 조성물을 이용한 인간의 관절 연골의 손상 부분의 이미징을 시험하였다.
시험 재료로서 인공 무릎 관절 수술을 위해 절제되어 의료 폐기된 인간의 관절 변성 연골을 이용 하였다.
무균적으로 약 1cm×약 1.5cm의 크기로 관절 연골 조각을 잘라 내었다.
잘라낸 연골은 생리적 인산 완충액에 침적시켰다.
형광 관찰에 앞서, 관절 연골 조각에 약 2~3mL의 생리적 인산 완충액을 주사통으로 분사하여 세정하고, 가시광 하에서 컬러 사진 촬영을 행하였다.
잉여의 완충액은 킴 와이프(등록 상표)로 제거 하였다.
다음으로, 순수에 양성 하전화 알부민과 ICG를 용해시켜 조제한 관절 연골 이미징 조성물(양성 하전화 알부민 농도 : 2.5mg/mL, ICG 농도 : 0.125mg/mL) 100μL를 소수성 샬레에 놓고, 관절 연골 조각의 표면을 아래로 하여 샬레의 위에 놓고, 관절 연골 조각의 표면에 관절 연골 이미징 조성물을 침적 시켰다.
약 10분 후에 여분의 이미징 조성물을 2~3mL의 생리적 인산 완충액으로 씻어내고, 잉여의 완충액은 킴 와이프로 제거 하였다.
관절 연골 조각을 검은색의 종이 조각 위에 놓고, 근 적외광 하에서 표면 및 측면의 사진 촬영을 행하였다.
근 적외광 하에서의 촬영은 근 적외 발광 다이오드 16개를 원형으로 배열시킨 광원(여기 파장 : 770nm, 각 30mA)에서 각 관절 연골 조각의 시료액를 여기시켜, ICG용 832nm의 필터(Semrock사 제품, BrightLine ICG-B)를 통해 고감도 CCD 카메라(하마마츠 포토닉스 주식회사 제품, ORCA-ER)에서 모두 동일한 조건(100ms, low light 및 8×binning mode, Auto-contrast mode)으로 행하였다.
결과를 도 5에 나타내었다.
본 실시예에서 이용한 인간 변성 연골은 심각한 변형성 관절증의 병변이기 때문에, 관절 연골 조각의 거의 전체에서 강한 형광이 나타났다.
이에 따라, 양성 하전화 알부민과 ICG의 조성물은 양성 하전화 알부민이 ICG의 생체 단백질로의 비 특이적 흡착을 억제하면서 연골 중층에 많이 존재하는 음성 하전에 우선적으로 흡착하여 형광을 발광하는 것으로 나타났다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 가시광 하에서 관찰했을 때에 확인된 연골 조각 표면의 연붉은색 부분에 대해서는 형광 강도가 주위와 비교하여 낮은 것으로 나타났다.
이 연붉은색 부분은 관절 연골의 변연(邊緣)에 가까운 곳의 조직인 것으로부터, 연골 표면에 형성된 활막 조직 모양의 혈관을 포함하는 조직인 것으로 생각되며, 그 활막이 본 발명의 이미징 조성물의 침투를 늦춘 것으로 추측되었다.
본 발명의 관절 연골 이미징 조성물은 변형성 무릎 관절증의 원인이 되는 연골의 변성을 조기에 검출 가능하고, 정상 연골과 변성 연골의 경계를 명확하게 구별하는 것이 가능하다.
본 발명의 관절 연골 이미징 조성물은 관절경에 의한 진단 또는 수술 등의 경우에 생체 내에 있어서 관절 연골의 변성 부위를 가시화시키는 것이 가능할 뿐만 아니라, 관절강에 주입하는 것 등에 의해, in vivo 이미징 기술을 이용하여 비 침습적 또는 저 침습적으로 연골의 변성 상태를 관찰하는 것이 가능하다.
더욱이, 적출 관절 연골 조직 또는 재생 관절 연골 조직에 있어서 연골 손상도의 평가 및 개선도의 평가, 및 관절 연골 질환에 관한 신약 개발 연구나 병리 연구에도 유용하다.
Claims (8)
- 양성 하전 분자를 함유하고, 상기 양성 하전 분자는 표식(標識) 분자로 표식되어 있는 것을 특징으로 하는 관절 연골 이미징 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 양성 하전 분자는 양성 하전화 된 단백질 또는 펩티드 화합물인 것을 특징으로 하는 관절 연골 이미징 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 단백질 또는 펩티드 화합물이 알부민, 알부민 분해물 또는 알부민의 수식(修飾) 화합물인 것을 특징으로 하는 관절 연골 이미징 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 양성 하전 분자는 양성 하전화 된 당쇄(糖鎖) 화합물 인 것을 특징으로 하는 관절 연골 이미징 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 당쇄 화합물이 덱스트란, 사이클로 덱스트린 또는 이들의 유도체인 것을 특징으로 하는 관절 연골 이미징 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표식 분자가 형광 물질, 방사성 동위 원소, X선 흡수 물질, 항체 분자 및 특이적 항체에 의해 인식되는 인식 부위를 갖는 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 물질인 것을 특징 및 하는 관절 연골 이미징 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 형광 물질이 인도시아닌 그린인 것을 특징으로 하는 관절 연골 이미징 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표식 분자가 자성 입자, 금속 입자, 금속 나노 입자 및 기타 나노 소재 함유 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 물질인 것을 특징으로 하는 관절 연골 이미징 조성물.
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