BR112016013652B1 - Composição para visualizar um sítio degenerativo em cartilagem articular - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO DE IMAGEM DE CARTILAGEM ARTICULAR. A presente invenção refere-se a uma composição de imagem de cartilagem articular que pode visualizar distinguivelmente de maneira clara um sítio normal e um sítio anormal, isto é, um sítio degenerativo, da cartilagem articular. A composição de imagem de cartilagem articular contém uma molécula positivamente carregada que é marcada com uma molécula marcadora.

Description

Campo Técnico

[001]A presente invenção refere-se a uma composição de imagem de cartilagem articular especificamente absorvente a um sítio danificado de cartilagem articular, desse modo visualizando o sítio danificado de cartilagem articular.

Fundamentos da Técnica

[002]Osteoartrite (OA) é um transtorno da articulação, que é presumivelmente induzida por degeneração da cartilagem articular como uma causa principal e frequentemente observada em, por exemplo, as articulações do joelho, quadril e fêmur. OA é causada não só por envelhecimento e sobrecarga, mas também lesão desportiva e obesidade. Particularmente, o número de pacientes com osteoartrite do joelho é estimado ser 25.300.000 no Japão (projeto ROAD, 22o Century Medical and Research Center, The University of Tokyo Hospital, 2009) e é duas vezes ou mais nos Estados Unidos do que no Japão. Também, em áreas densamente povoadas tais como China, Índia e países africanos onde, por exemplo, condições de trabalho e condições ambientais são consideradas ser mais severas do que no Japão, o número de pacientes com OA aumentará a partir de agora. Atualmente, no Japão, 75.000 (Yano Research Institute Ltd., 2011) pacientes se submetem à cirurgia de reposição da articulação do joelho artificial total como uma terapia final. Reposição da articulação artificial por si é uma terapia altamente invasiva. Além disso, a vida mecânica da articulação artificial é limitada e dependendo de circunstâncias, a articulação artificial deve ser repetidamente trocada.

[003]De modo a prevenir a exacerbação de osteoartrite do joelho e evitar a cirurgia de reposição da articulação artificial final, é importante receber um tratamento apropriado precoce. Para o tratamento precoce, a detecção precoce de degeneração de cartilagem é necessária; entretanto, é difícil detectar a degeneração de car- tilagem no estágio precoce por uma imagem de raio X convencional (roentgenfoto- grafia) e varredura de MRI. A presença ou ausência de degeneração de cartilagem também pode ser verificada observando a cartilagem através do uso de um artros- cópio (um tipo de endoscópio); entretanto, neste método, um médico encarregado toca o sítio da camada de superfície da cartilagem através do uso de uma ferramenta, tal como fórceps sob um artroscópio e determina a presença ou ausência de degeneração de cartilagem com base em um sentido do tato. Por causa disso, a detecção precoce é principalmente deixada para a experiência e habilidade do médico. Além disso, existe um problema que a linha de borda entre cartilagem normal e carti-lagem degenerativa não pode ser claramente identificada.

[004]Se existe um método de exame não invasivo ou menos invasivo que permite a detecção precoce de degeneração de cartilagem sem depender da experiência e habilidade de um médico, a presença ou ausência e o progresso de degeneração de cartilagem podem ser descobertos e a estratégia terapêutica pode ser facilmente criada. Como o método de exame não invasivo ou menos invasivo, um método usando uma técnica de imagem in vivo para visualizar um tecido vivo é conhecido. Como a técnica de imagem in vivo, várias técnicas são conhecidas, incluindo tomografia por emissão de pósitrons (PET), imagem por ressonância magnética nuclear (MRI), ultrassonografia (US) e imagem fotoacústica (PAI). Exceto estas, uma técnica de imagem por fluorescência tal como tomografia molecular fluorescente (FMT) é conhecida, em que uma substância fluorescente é focada em um sítio de interesse em um organismo vivo e o sítio é capturado sensitivamente de forma alta. A técnica de imagem por fluorescência tem atraído atenção porque pode visualizar de forma não invasiva um sítio de interesse em uma maneira específica para o sítio.

[005]De modo a aplicar a técnica de imagem por fluorescência in vivo anteriormente mencionada à cartilagem articular, várias técnicas referem-se a uma soda de imagem especificamente que se liga a um tecido de cartilagem articular e se acumula, têm sido propostas. Na Literatura de Patente 1, um marcador de cartilagem especificamente se liga à matriz de cartilagem é descrito, que é obtido permitindo um meio de geração de sinal, tal como uma substância fluorescente, para se ligar a um peptídeo de poliarginina tendo 6 a 20 resíduos de arginina ou um peptídeo de polili- sina tendo 6 a 20 resíduos de lisina. Além disso, na Literatura de Patente 2, um marcador de tecido de cartilagem é descrito, que consiste em um oligômero de lisina derivado obtido permitindo um grupo capaz de gerar ou absorver uma onda eletromagnética para se ligar a um oligômero de lisina em que grupo ε-amino de lisina e um grupo carboxila estão conectados por intermédio de uma ligação de peptídeo. Lista de Citação Literatura de Patente Literatura de Patente 1 Patente Japonesa Aberta ao Público No 2009-023993 Literatura de Patente 2 Publicação Internacional No WO 2013/137302

Sumário da Invenção Problema Técnico

[006]Literatura de Patente 1 e Literatura de Patente 2, estado que estes marcadores de cartilagem especificamente se ligam à cartilagem normal articular; entretanto, eles são silenciosos acerca de como agir em cartilagem anormal, isto é, cartilagem degenerativa, tal como osteoartrite. Para descrever mais especificamente, atualmente, existe um problema tal que não há qualquer composição de imagem de cartilagem articular de diagnóstico que pode visualizar distinguivelmente de maneira clara um sítio normal e um sítio anormal em cartilagem articular.

[007]Além disso, como descrito acima, foi desejado desenvolver um método de examinação que permite a detecção precoce de degeneração de cartilagem sem necessitar muita experiência e habilidade de um médico.

[008]A presente invenção foi concebida em consideração às circunstâncias anteriormente mencionadas. Um objetivo da presente invenção é fornecer uma composição de imagem de cartilagem articular que pode visualizar distinguivelmente de maneira clara um sítio normal e um sítio anormal em cartilagem articular.

[009]Um outo objetivo da presente invenção é fornecer uma composição de imagem de cartilagem articular que facilita a detecção precoce de degeneração de cartilagem e identificação exata de um grau de degeneração, desse modo contribuindo para uma imediata determinação de estratégia de tratamento.

Solução para o Problema

[010]Para alcançar os objetivos anteriormente mencionados, a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção contém uma molécula positivamente carregada, que é marcada com uma molécula marcadora. Cartilagem normal tem uma camada de superfície formada de uma pluralidade de camadas consistindo em células planas. Por outro lado, a cartilagem degenerativa tem um estado onde uma camada de célula é removida e a matriz de cartilagem rica em fibra e tendo uma estrutura de tecido irregular é exposta ou um estado onde um defeito é formado a partir da camada de superfície para o sítio profundo. A composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção contém uma molécula positivamente carregada marcada com uma molécula marcadora. A molécula positivamente carregada intensivamente penetra na matriz de cartilagem exposta e absorve a ela. Do mesmo modo, visto que a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é adsorvida intensivamente a um sítio degenerativo de cartilagem, um sítio normal e um sítio degenerativo da cartilagem articular pode ser distin- guivelmente visualizado.

[011]A molécula positivamente carregada da composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é preferivelmente um composto de proteína ou peptídeo positivamente carregado. Como a molécula positivamente carregada serve como um constituinte da composição de imagem de cartilagem articular, uma substância ubiquamente presente em um organismo vivo, tendo alta segurança e, sendo facilmente manejada e simplesmente marcada com uma molécula marcadora é selecionada.

[012]O composto de proteína ou peptídeo da composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é preferivelmente uma albumina, um produto de decomposição de albumina ou um composto de albumina modificado. Consequentemente, uma substância preferível como um composto de proteína ou peptídeo constituindo a molécula positivamente carregada é selecionada.

[013]A molécula positivamente carregada da composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é ainda preferivelmente um composto positivamente carregado tendo uma cadeia de açúcar. Como a molécula positivamente carregada serve como um constituinte da composição de imagem de cartilagem articular, uma substância ubiquamente presente em um organismo vivo, tendo alta segurança e, sendo facilmente manejada e simplesmente marcada com uma molécula marcadora é selecionada.

[014]O composto tendo uma cadeia de açúcar da composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é preferivelmente dextrano, ciclodextrina ou um derivado dos mesmos. Consequentemente, uma substância preferível como um composto tendo uma cadeia de açúcar constituindo a molécula positivamente carregada é selecionada.

[015]A molécula marcadora da composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é preferivelmente pelo menos uma substância selecionada a partir do grupo que consiste em uma substância fluorescente, um radioisótopo, uma substância absorvente de raio X, uma molécula de anticorpo e uma molécula tendo um sítio de reconhecimento reconhecido por um anticorpo específico. Visto que cada uma das moléculas positivamente carregadas anteriormente mencionadas é marcada com uma molécula marcadora, a posição da molécula positivamente carregada adsorvida em um sítio de cartilagem degenerativa pode ser visualizada por uma substância fluorescente, um radioisótopo, uma substância absorvente de raio X, uma molécula de anticorpo ou uma molécula tendo um sítio de reconhecimento reconhecido por um anticorpo específico.

[016]Das moléculas marcadoras anteriormente mencionadas, a substância fluorescente é preferivelmente indocianina verde. Consequentemente, uma molécula marcadora tendo alta segurança, visualizando e detectando eficazmente um sítio degenerativo pode ser selecionada.

[017]A molécula marcadora da composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é preferivelmente pelo menos uma substância selecionada a partir do grupo que consiste em uma partícula magnética, uma partícula de metal, uma nanopartícula de metal e um outro nano-material contendo substância. Consequentemente, a posição da molécula positivamente carregada adsorvida em um sítio degenerativo de cartilagem pode ser detectada por, por exemplo, CT de raio X, MRI, espectroscopia Raman ou um método de ressonância de plasmão.

Efeitos Vantajosos da Invenção

[018]De acordo com a presente invenção, é possível fornecer uma composição de imagem de cartilagem articular tendo os efeitos excelentes seguintes. (1) Um sítio normal e um sítio anormal (sítio degenerativo) em cartilagem articular pode ser visualizado distinguivelmente de maneira clara. (2) Degeneração de cartilagem pode ser precocemente detectada e um grau de degeneração pode ser fácil e precisamente identificada. (3) Diagnóstico ou tratamento pode ser feito visualizando um sítio degenerativo em cartilagem articular in vivo usando uma composição de imagem de cartilagem articular em diagnóstico ou cirurgia sob um artroscópio. (4) Um estado degenerativo de cartilagem pode ser de forma não invasiva ou menos invasivamente diagnosticado usando uma técnica de imagem in vivo, por exemplo, injetando a composição de imagem de cartilagem articular em um espaço da articulação. (5) A composição de imagem de cartilagem articular é fácil de manusear visto que é constituída de substâncias altamente seguiras. Também, os seus produtos de decomposição também são altamente seguros. (6) Depois do exame e cirurgia serem concluídos, a composição de imagem de cartilagem articular é eficientemente removida através do metabolismo, hidrólise ou diluição com fluido de tecido.

Breve Descrição dos Desenhos

[019]A Figura 1 é uma fotografia que mostra os resultados de eletroforese de ponto isoelétrico de uma albumina de soro bovino positivamente carregada no Exemplo 1.

[020]A Figura 2 é uma fotografia que mostra emissão fluorescente resultante da ligação de uma albumina positivamente carregada ou uma albumina para indoci- anina verde no Exemplo 2.

[021]A Figura 3 é uma fotografia que mostra os resultados de imagem de um modelo de dano de cartilagem pela composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção do Exemplo 3.

[022]A Figura 4 é uma fotografia que mostra os resultados de imagem de um modelo danificado de cartilagem e um modelo intacto de cartilagem pela composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção do Exemplo 4.

[023]A Figura 5 é uma fotografia que mostra os resultados de imagem de uma cartilagem danificada de um ser humano pela composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção do Exemplo 5.

Descrição das Formas de Realização

[024]A composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção contém uma molécula marcada positivamente carregada. Na presente invenção, a “molécula positivamente carregada” refere-se a uma molécula tendo uma carga posi-tiva (carga catiônica) e capaz de adsorver seletivamente à cartilagem degenerativa.

[025]Cartilagem é classificada no tecido conjuntivo e constituída de matriz de cartilagem como uma matriz extracelular, predominantemente presente e as células da cartilagem presentes como pontos. A cartilagem constituindo uma articulação é chamada como cartilagem hialina. Os componentes principais de matriz de cartilagem da cartilagem hialina são colágeno e proteoglicano. O proteoglicano contém uma cadeia lateral tendo uma carga negativa tal como sulfato de condroitina, sulfato de queratano e sulfato de heparano e negativamente carregado no todo. Cartilagem normal tem uma camada de superfície formada de uma pluralidade de camadas consistindo em células planas. Por outro lado, a cartilagem degenerativa tem um estado onde uma camada de célula é removida e a matriz de cartilagem rica em fibra e tendo uma estrutura de tecido irregular é exposta ou um estado onde um defeito é formado a partir da camada de superfície para o sítio profundo. A molécula positivamente carregada contida na composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é presumida absorver especificamente ao proteoglicano presente na matriz de cartilagem exposta depois da camada de superfície do tecido de cartilagem ser removida.

[026]A molécula positivamente carregada na presente invenção não é particularmente limitada tanto quanto a molécula pode absorver seletivamente à cartilagem degenerada; entretanto, no ponto de vista de segurança e facilidade de manejo, um composto de proteína ou peptídeo positivamente carregado ou um composto positivamente carregado tendo uma cadeia de açúcar é preferível. Observe que, a “proteína” aqui inclui uma ampla variedade de proteínas tais como uma glicoproteí- na, uma lipoproteína e uma proteína que se liga ao nucleotídeo.

[027]Como os compostos de proteína ou peptídeo positivamente carregados para ser usados como a molécula positivamente carregada na presente invenção, proteínas do plasma e vários tipos de albuminas são preferíveis e, particularmente uma albumina do soro é preferível. As proteínas do plasma e vários tipos de albuminas incluem produtos de decomposição e compostos modificados de albuminas. A albumina positivamente carregada (albumina cationizada) é especificamente adsor- vida à matriz de cartilagem; entretanto, é menos invasiva às células dentro de um tecido de cartilagem. Assim, a albumina cationizada não é facilmente tomada por células a partir da superfície do tecido de cartilagem normal e virtualmente não ad- sorvida à matriz de cartilagem presente dentro da superfície do tecido de cartilagem normal. Por causa disso, a albumina cationizada é intensivamente adsorvida por um sítio degenerativo (anormal) do tecido de cartilagem articular. De modo a ser adsor- vida intensivamente por um sítio danificado de cartilagem, uma albumina ou um composto decomposto/modificado de uma albumina é preferivelmente carregado assim como para satisfazer um ponto isoelétrico (pI) de 8 ou mais e particularmente preferivelmente 10 ou mais. A segurança da composição de imagem de cartilagem articular a ser aplicada a um organismo vivo pode ser ainda melhorada selecionado uma albumina que é menos invasiva às células dentro de um tecido de cartilagem, como descrito acima. Além disso, se uma albumina molécula tendo um grande peso molecular é selecionado, o número de marcadores (moléculas marcadoras) pode ser aumentado. Por esta razão, se por exemplo, uma substância fluorescente é usada como uma molécula marcadora, o brilho pode ser melhorado. Visto que um tal controle pode ser feito, a detecção com base em uma molécula marcadora, em outras palavras, visualização, pode ser facilmente feita.

[028]Como o composto tendo uma cadeia de açúcar a ser positivamente carregada na mesma maneira como na albumina anteriormente mencionada e usada como a molécula positivamente carregada da presente invenção, um composto linear ou cíclico tendo uma cadeia de açúcar é preferível. Como o composto linear tendo uma cadeia de açúcar, dextrano ou um derivado de dextrano é particularmente preferível. Como o composto cíclico tendo uma cadeia de açúcar, ciclodextrina ou um derivado de ciclodextrina é particularmente preferível. Estes compostos positivamente carregados, isto é, dextrano, ciclodextrina e um derivado dos mesmos, são especificamente adsorvidos à matriz de cartilagem similarmente à albumina anteriormente mencionada; entretanto, eles são menos invasivos às células dentro de um tecido de cartilagem. Assim, o dextrano e ciclodextrina cationizados não são facilmente tomados por células a partir da superfície do tecido de cartilagem normal e não são adsorvidos virtualmente à matriz de cartilagem presente na camada de superfície do tecido de cartilagem normal. Por causa disso, ciclodextrina ou dextrano cationizado é adsorvido a um sítio degenerativo (anormal) do tecido de cartilagem articular. A fim de não fazer uma invasão sobre as células do tecido de cartilagem, dextrano ou ci-clodextrina preferivelmente tem um peso molecular de 3.000 ou mais e mais preferivelmente 10.000 ou mais. A segurança da composição de imagem de cartilagem articular a ser aplicada a um organismo vivo pode ser ainda melhorada selecionando ciclodextrina ou dextrano menos invasivo às células dentro de um tecido de cartilagem, como descrito acima. Se o dextrano ou ciclodextrina tendo um grande peso molecular é selecionado, o número das moléculas marcadoras pode ser aumentado. Por esta razão, se por exemplo, uma substância fluorescente é usada como uma molécula marcadora, o brilho pode ser melhorado. Visto que um tal controle pode ser feito, a detecção com base em uma molécula marcadora, em outras palavras, visua-lização, pode ser facilmente feita. Além disso, no caso de ciclodextrina, visto que uma molécula marcadora pode ser facilmente inclusa na cavidade interior da molécula, a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção pode ser facilmente obtida.

[029]Observe que, na presente invenção, a “imagem de cartilagem articular” refere-se a visualização do estado da cartilagem articular, em outras palavras, tra- zendo o estado da cartilagem articular observado a olho nu ou através, por exemplo, um dispositivo, com a ajuda de um meio tal como imagens, valores ou vetores numéricos. Visualização inclui tanto visualização (para detecção) de uma amostra tomada de um tecido de cartilagem articular quanto visualização (para detecção) in vivo (in situ) de um tecido de cartilagem articular. Exemplos da visualização in vivo incluem visualização para cirurgia comum, visualização para exame ou cirurgia menos inva- siva usando um artroscópio e visualização para exame menos invasiva realizada injetando a composição da presente invenção em um espaço da articulação por meio de, por exemplo, uma seringa.

[030]Na presente invenção, a molécula marcadora refere-se a uma molécula que direta ou indiretamente se liga a uma molécula positivamente carregada ou é inclusa por uma molécula positivamente carregada, desse modo marcando a molécula positivamente carregada e permitindo a detecção da presença da molécula positivamente carregada a olho nu ou através de, por exemplo, um dispositivo. Como a molécula marcadora, que não é particularmente limitada, por exemplo, uma substância fluorescente, um radioisótopo, uma substância luminescente, uma enzima, uma substância absorvente de raio X, uma molécula de anticorpo, uma molécula (molécula de reconhecimento de anticorpo) tendo um sítio de reconhecimento reconhecido por um anticorpo específico, uma partícula magnética, uma partícula de metal ou uma nanopartícula de metal revestida com vidro pode ser apropriadamente usada.

[031]Como uma forma de realização da presente invenção, uma substância fluorescente é preferivelmente usada como a molécula marcadora porque é facilmente visualizada ou detectada. Como o corante fluorescente, por exemplo, indoci- anina verde, Alexa Fluor (marca registrada) 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, BODIPY (marca registrada) FL, Texas Red (marca registrada), Oregon Green (marca registrada) 488, rodamina B, rodamina verde, tetrametil rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, fi- coeritrina, ficocianina, Cy3, Cy5, Cy7, são preferivelmente usados. Deles, indociani- na verde é particularmente preferivelmente usada, por esta razão que é altamente segura e facilmente visualizada ou detectada. Indocianina verde, que é irradiada com luz infravermelha próxima nas condições pré-determinadas, emite fluorescência caindo dentro da região infravermelha próxima e tendo um comprimento de onda mais longo do que a luz infravermelha próxima aplicada. A emissão de luz não pode ser virtualmente reconhecida diretamente a olho nu. Para observação, um dispositivo para detectar luz infravermelha é necessário; entretanto, visto que a observação pode ser feita em um campo escuro, o ajuste de contraste pode ser facilmente controlado quando a observação é feita por um artroscópio, facilitando a detecção. Estas moléculas fluorescentes são usadas para marcar uma molécula positivamente carregada por um método de ligação de avidina-biotina, inclusão ou outros métodos conhecidos na técnica.

[032]Quando uma molécula de reconhecimento de anticorpo é usada como uma molécula marcadora, a fluorescência pode ser observada através do uso de não apenas o método de avidina-biotina mas também de vários tipos de reações de anticorpo fluorescente. Quando a luciferina é usada como uma molécula marcadora, a emissão de luz usando uma reação de luciferina-luciferase pode ser observada. Como uma molécula marcadora, por exemplo, uma substância absorvente de raio X, uma nanopartícula magnética e uma nanopartícula de metal pode ser usada. Se estas são usadas como uma molécula marcadora, a observação pode ser feita por CT de raio X, MRI, espectroscopia Raman ou um método de ressonância de plasmão. Observe que, na adição de detecção pela molécula marcadora anteriormente mencionada, a absorção da luz infravermelha de hemoglobina abundantemente presente sob o tecido de cartilagem e fenômeno com luz própria de uma fibra de colágeno pode ser avaliada de forma não invasiva. Também, a viscoelasticidade do tecido em relação à tensão de cisalhamento por elastografia de MR (MRE) pode ser avaliada de forma não invasiva.

[033]A composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção pode conter ainda componentes exceto as moléculas anteriormente mencionadas. Exemplos dos componentes (aditivos) incluem um agente isotônico, um tampão, um conservante e um antioxidante. Como o agente isotônico, por exemplo, cloreto de sódio, glicerina, D-manitol, D-sorbitol ou glicose é preferivelmente usado. Como o tampão, por exemplo, um tampão fosfato, um tampão acetato, um tampão carbonato e um tampão citrato são mencionados.

[034]A composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção pode conter, exceto os aditivos anteriormente mencionados, uma substância para prevenir ainda a invasão de uma molécula positivamente carregada no tecido de cartilagem. Como um tal material, por exemplo, colágeno e uma albumina não positivamente carregada ou um derivado e produto de decomposição dos mesmos, são mencionados.

[035]Observe que a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção pode ser usada em um sistema de administração de fármaco ligando-se seletivamente a um sítio danificado de cartilagem, ligando-se a um agente terapêutico tendo uma ação de reparo da cartilagem danificada ou uma molécula estruturada tal como colágeno tipo I servindo como uma estrutura para, por exemplo, uma camada de células para a medicina regenerativa e terapia celular no lugar da molécula marcadora anteriormente mencionada e, também usada em manejo pós- operatório depois de transplante da estrutura.

[036]Agora, um método para usar a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção será descrito. A composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é preferivelmente uma preparação líquida porque um líquido pode ser facilmente aplicado. Quando a composição da presente invenção é aplicada dentro de um organismo vivo, pode ser aplicada a uma camada de superfí- cie da cartilagem articular por pulverização, gotejamento ou revestimento sob um artroscópio ou injeção em um espaço da articulação. No caso de aplicação sob um artroscópio, é preferível que uma superfície de cartilagem seja lavada com, por exemplo, lactato de Ringer ou solução salina fisiológica para remover fluido da mucosa (fluido sinovial) em um espaço da articulação e, depois disso, a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é aplicada tal como por pulverização ou revestimento. Depois da composição de imagem de cartilagem articular ser aplicada por, por exemplo, pulverização, a composição de imagem de cartilagem articular é deixada repousar ainda por um tempo pré-determinado para a penetração. O tempo pré-determinado aqui é especificamente, preferivelmente cerca de 3 minutos a 30 minutos, mais preferivelmente cerca de 5 minutos a 20 minutos e ainda preferivelmente cerca de 10 minutos a 15 minutos, no ponto de vista de permeabilidade a um tecido alvo. Depois disso, a cartilagem articular é enxaguada com, por exemplo, lactato de Ringer para remover adsorção não específica e composição de imagem de cartilagem articular em excesso. Depois disso, por exemplo, a fluorescência de uma molécula marcadora é detectada.

[037]Como o método de detecção usando uma molécula marcadora, que não é particularmente limitada, um método em que uma molécula marcadora é medida inserindo um artroscópio e uma fibra ótica tendo um filtro que controla a luz de excitação a ser adequada para a molécula marcadora. Por exemplo, quando um indicador fluorescente, indocianina verde, é usada como uma molécula marcadora, fluorescência verde (comprimento de onda de pico: 800 a 850 nm) de indocianina verde pode ser facilmente observada por imagens de uma câmera CCD através de um filtro apropriado. No resultado de detecção de imagem, por exemplo, a intensidade de fluorescência pode ser convertida em, por exemplo, cor e valores numéricos desejados pelo operador através do uso de software apropriado e, exibida. Além disso, em uma imagem visível de um sítio degenerativo de cartilagem visualizado pela composição de imagem de cartilagem articular, como mencionado acima se, por exemplo, a densidade de contraste e mudança de cor são identificadas ou detectadas, a rugosidade da superfície de tecido de cartilagem degenerativa, mais especificamente, o nível de degeneração da cartilagem pode ser detectado. Visto que o tempo necessário para o diagnóstico ou cirurgia usando o artroscópio é usualmente tão curto quanto 1 a 3 horas, é suficiente que o tempo de trabalho da composição de imagem de cartilagem articular é similarmente cerca de 1 a 3 horas. Depois da conclusão do diagnóstico ou cirurgia, lavando com, por exemplo, lactato de Ringer ou solução salina fisiológica é realizada em uma pluralidade de tempos. Nesta maneira, a composição é quase descarregada (removida). O resíduo se permanece pode ser decomposto por, por exemplo, hidrólise e descartado (removido).

[038]Quando a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é aplicada a um tecido de cartilagem normal, a molécula positivamente carregada nela é rejeitada por uma estrutura do tipo concha formada de células lamelares e não pode fazer uma invasão sobre as células da cartilagem. Como um resultado, o tecido de cartilagem normal não é visualizado. Ao contrário, no caso de tecido de cartilagem degenerativa não tendo nenhuma camada de célula lamelar, a composição de imagem de cartilagem articular é adsorvida à matriz de cartilagem exposta de maneira orientada. Como um resultado, o tecido de cartilagem degenerativa é destacado. Em um método de detecção convencional, foi difícil detectar e identificar o estágio precoce de degeneração de cartilagem, em outras palavras, “degeneração de cartilagem grau 1” onde a camada de célula lamelar é apenas removida. Entretanto, a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção torna- se possível identificar e detectar a “degeneração de cartilagem grau 1” e permite terapia imediata de pacientes.

[039]A composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção torna-se possível descobrir o estado de danificar no tecido (cartilagem, ligamento cruzado e menisco) dentro da articulação através do uso de um artroscópio e tratar o dano, com o resultado que diagnóstico e tratamento menos invasivo pode ser feito. Até agora, uma imagem da cartilagem articular exibida em um monitor por um ar- troscópio sob luz visível parece branca e um nível de brilho é alto. Por esta razão, foi difícil de determinar a degeneração e dano de uma camada de superfície da cartilagem. Entretanto, sítios de degeneração e defeituosos em uma superfície de cartilagem podem ser marcados através do uso da composição da presente invenção, com o resultado que o estado de um dano de cartilagem, que é raramente observado sob luz visível, pode ser observado permitindo uma molécula marcadora emitir fluorescência infravermelho em um campo escuro.

[040]Agora, os Exemplos da presente invenção serão descritos abaixo; entretanto, a presente invenção não é limitada a estes Exemplos.

Exemplos Exemplo 1 1. Preparação de albumina positivamente carregada

[041]Uma albumina de soro bovino (produto fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) (5 g) foi dissolvida em água pura (25 mL). Separadamente, etilenodiamino anidro (67 mL) (produto fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) foi adicionado em água pura (500 mL). A este, ácido clorídrico 6N (cerca de 350 mL) foi gradualmente adicionado para ajustar o pH a 4,75 em água gelada. À solução de etilenodiamino resultante, cloridreto de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (1,8 g) (produto fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) foi adicionado e a solução aquosa de albumina de soro bovino preparada acima foi adicionada. A mistura foi agitada por 2 horas enquanto o recipiente de preparação foi esfriado em água gelada para controlar a temperatura e pH da mistura. A reação foi terminada adicionando um tampão acetato 4 M (5 mL). A solução resultante foi dialisada contra água pura a 4°C por 72 horas e, em seguida, liofilizada. O cristal obtido por liofilização foi branco e brilhante e teve aparência do tipo película fina.

[042]O produto liofilizado preparado como mencionado acima e a albumina de soro bovino usado como uma matéria-prima foram submetidos à medição de pontos isoelétricos para verificar se ou não uma albumina positivamente carregada foi obtida. O produto liofilizado e albumina de soro bovino foram cada um dissolvido em água pura e, aplicado a gel IEF (produto fabricado por Life Technologies Corporation) Novex (marca registrada) e submetido à eletroforese de ponto isoelétrico. Os resultados são mostrados na Figura 1. Como é mostrado na Figura 1, o pI de uma albumina de soro bovino é usualmente cerca de 4,9; entretanto, o pI do produto liofi- lizado foi tão alto quanto cerca de 11. A partir disso, foi descoberto que o produto liofilizado foi altamente cationizada. A partir disso, foi confirmada que albumina posi-tivamente carregada foi obtida.

Exemplo 2 2. Investigação em concentração ótima de albumina positivamente carregada e indocianina verde

[043]Um corante fluorescente, indocianina verde (ICG), não emite fluorescência no estado de uma solução aquosa (contendo ICG sozinha); entretanto, ICG emite fluorescência dentro de uma região infravermelha próxima quando se liga a uma proteína. ICG foi deixada se ligar à albumina positivamente carregada preparada no Exemplo 1 e a intensidade de fluorescência emitida de ICG foi medida como segue. Observe que, a intensidade de fluorescência emitida de ICG quando uma albumina não positivamente carregada, servindo como um controle, ligada a este foi medida.

[044]A albumina positivamente carregada preparada no Exemplo 1 foi dissolvida em água pura para preparar soluções tendo uma concentração de 1,250 mg/mL, 0,625 mg/mL, 0,313 mg/mL, 0,156 mg/mL e 0,078 mg/mL. Separadamente, indocianina verde (produto fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) foi dissolvido em água pura para preparar uma solução de 0,025 mg/mL. Uma alíquota (50 μL) foi tomada a partir de cada uma das soluções de albumina positivamente carregada diferentes em concentração e a solução de ICG, adicionada em cada poço de uma placa ELISA de 96 poços e misturada. Fluorescência infravermelha emitida a partir da solução resultante foi tomada por um sistema da câmera de observação infravermelha (pde-neo C10935-20, fabricada por Hamamatsu Photonics K. K.) (luz de excitação: 760 nm, fluorescência 830 nm). Um controle foi preparado na mesma maneira como acima exceto que a albumina de soro bovino (produto fabricado por Sigma- Aldrich Co. LLC.) foi usada no lugar da albumina positivamente carregada e, submetida ao mesmo teste. Os resultados são mostrados na Figura 2.

[045]Como é mostrado na fotografia da Figura 2, a fluorescência a partir da albumina não positivamente carregada foi capaz de ser identificada em parcelas experimentais tendo uma concentração de albumina de 0,313 mg/mL (concentração de albumina; 0,156 mg/mL, concentração de ICG; 0,0125 mg/mL) ou mais a olho nu. Ao contrário, a fluorescência a partir da albumina positivamente carregada foi capaz de ser identificada em parcelas experimentais tendo uma concentração de albumina de 0,156 mg/mL (concentração de albumina positivamente carregada; 0,078 mg/mL, concentração de ICG; 0,0125 mg/mL) ou mais a olho nu. A partir disso, foi descoberto que a fluorescência pode ser identificada na albumina positivamente carregada, que foi mais baixa em concentração do que uma albumina geralmente usada. Observe que, quando um teste foi realizado adicionando ICG em uma concentração mais alta do que a concentração de teste anteriormente mencionada (0,0125 mg/mL), foi confirmado que o brilho de fluorescência aumenta.

Exemplo 3 3. Imagem (1) de modelo danificado de cartilagem usando cartilagem normal articular bovina por composição de imagem de cartilagem articular

[046]Cartilagem articular do membro anterior do ombro de um gado (2 a 3 semanas de idade) foi extirpada e cortada em peças de cerca de 1,5 cm x cerca de 2 cm em tamanho e osso subcondral foi removido. Subsequentemente, como mostrado na ilustração de um modelo danificado de cartilagem da Figura 3, as peças de superfícies da cartilagem articular excisadas foram parcialmente fatiadas por uma navalha em uma profundidade de cerca de 0,1 a 0,2 mm para fazer um defeito na superfície de cartilagem. Em consideração ao uso em sítios clínicos reais, cada uma das peças de cartilagem articular foi lavada pulverizando solução salina (cerca de 5 mL) por uma seringa. Em seguida, 200 μl da composição de imagem de cartilagem articular (concentração de albumina positivamente carregada: 2,5 mg/mL, concentração de ICG: 0,125 mg/mL) preparada dissolvendo uma albumina positivamente carregada e ICG em água pura, foram adicionados gota a gota na superfície de uma placa plástica hidrofóbica e a peça de cartilagem articular foi colocada virada para baixo na superfície da placa plástica hidrofóbica para imergir a peça na composição de imagem de cartilagem articular. Cerca de 10 a 15 minutos, mais tarde, a composição de imagem de cartilagem articular em excesso foi lavada fora com solução salina. Imagens de peças individuais de cartilagem articular foram tomadas por uma câmera infravermelha (produto fabricado por Hamamatsu Photonics K. K.) e regis-tradas.

[047]As imagens observadas por uma câmera infravermelha são mostradas na Figura 3. Na peça de cartilagem articular (superfície não é extirpada) do lote controle, penetração e adsorção da composição de imagem de cartilagem articular a partir da superfície da cartilagem não foram confirmados. A emissão como uma linha branca foi observada; entretanto, foi derivada a partir da fixação da composição de imagem de cartilagem articular em excesso por ação capilar à superfície lateral periférica externa da peça de cartilagem articular. Ao contrário, no lote experimental 1 (metade da porção de uma das superfícies de cartilagem foi extirpada por uma navalha para fazer um defeito), a emissão de luz derivada da composição de imagem de cartilagem articular, que penetrou através do defeito na superfície e adsorvido, foi confirmada. Observe que, a emissão como uma linha branca foi observada; entretanto, foi derivada a partir da composição de imagem de cartilagem articular em excesso adsorvida por ação capilar à superfície lateral periférica externa da peça de cartilagem articular. No lote experimental 2 (uma porção central de uma das superfícies de cartilagem por uma navalha), a emissão de luz derivada da composição de imagem de cartilagem articular, que penetrou a partir da porção com defeito da superfície central e adsorvida foi confirmada. Como descrito acima, foi demonstrado que na superfície extirpada, a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção penetra para a profundidade, absorve a ela e emite fluorescência intensiva.

Exemplo 4 4. Imagem (2) de modelo danificado de cartilagem usando cartilagem normal articular bovina por composição de imagem de cartilagem articular

[048]Cartilagem articular do membro anterior do ombro de um gado (2 a 3 semanas de idade) foi assepticamente extirpada e cortada em peças de cerca de 1 cm x cerca de 1,5 cm em tamanho e osso subcondral foi removido tanto quanto possível. As cartilagens excisadas foram mergulhadas em um tampão fosfato fisiológico. Subsequentemente, quase metade (a metade direita como vista a partir do topo) da superfície de cada uma das peças de cartilagem articular foi cortada por um bisturi (No 11) a uma profundidade de cerca de 0,1 a 0,2 mm para formar um defeito na superfície de cartilagem. Devido ao tratamento, a metade esquerda (como vista a partir do topo) da peça de cartilagem articular permanece intacta e usada como um lote controle; enquanto que a metade direita (como vista a partir do topo) é usada como um modelo de dano de superfície de cartilagem. De modo a confirmar a posição em medição e observação, um dos cantos da superfície danificada foi diagonalmente cortada. Antes da observação de fluorescência, um tampão fosfato fisiológico (cerca de 2 a 3 mL) foi pulverizado em cada uma das peças de cartilagem articular por uma seringa e lavado. O tampão de excesso foi removido com Kimwipe (marca registrada). Em seguida, as soluções de amostra 1 a 4 seguintes (50 μL para cada) foram adicionadas, gota a gota, às placas de petri hidrofóbicas respectivas e a peça de cartilagem articular foi colocada virada para baixo na solução de amostra adicionada gota a gota na superfície da placa de petri hidrofóbica para impregnar a superfície da peça de cartilagem articular com a solução de amostra. Cerca de 10 minutos mais tarde, solução de amostra em excesso foi lavada fora com um tampão fosfato fisiológico e tampão em excesso foi removido por Kimwipe. Cada uma das peças de cartilagem articular foi colocada em uma peça de papel preto e fotografada sob luz infravermelha próxima e luz visível.

[049]As soluções de amostra 1 a 4 usadas neste exemplo foram preparadas por componentes individuais separadamente dissolvidos em água pura. Solução de amostra 1 continha água pura sozinha; Solução de amostra 2 continha ICG em uma concentração de 0,125 mg/mL; Solução de amostra 3 continha uma albumina em uma concentração de 2,5 mg/mL e ICG em uma concentração de 0,125 mg/mL; e Solução de amostra 4 continha uma albumina positivamente carregada em uma concentração de 2,5 mg/mL e ICG em uma concentração de 0,125 mg/mL. No disparo sob luz infravermelha próxima, cada uma das soluções de amostra das peças de cartilagem articular foi excitada por uma fonte de luz (comprimento de onda de excitação: 770 nm, 30 mA para cada), que foi preparado arranjando 16 diodos emissores de luz infravermelha próxima na forma de um círculo e, imagens foram tomadas por câmera CCD altamente sensível (ORCA-ER, fabricada por Hamamatsu Photonics K. K.) por intermédio de um filtro para ICG (832 nm) (BrightLine ICG-B, fabricado por Semrock) todos nas mesmas condições (100 ms, luz baixa e 8 x modo binning). Depois do disparo sob luz infravermelha próxima, o disparo monocromático foi realizado sob luz visível.

[050]Os resultados são mostrados na Figura 4. Em cada uma das fotografias tomadas em luz visível e luz infravermelha próxima, a metade esquerda mostra um controle intacto e a metade direita mostra um modelo de dano. No caso da Solução de amostra 1 (água pura sozinha), foi confirmado que a luz não é emitida a partir de ambas as superfícies. Entretanto, na Solução de amostra 2 (ICG sozinha), a fluorescência foi emitida a partir do controle intacto. Fluorescência é concebivelmente derivada de ICG adsorvida a uma proteína na superfície de cartilagem. Ao contrário, nenhuma fluorescência foi observada no modelo de dano. Esta foi considerada que quando a superfície de cartilagem é danificada, a cadeia de açúcar tal como glico- saminoglicano é exposta na superfície de cartilagem em uma quantidade maior do que as proteínas e, assim ICG não é adsorvida a estas cadeias de açúcar. Ao contrário, na Solução de amostra 3 (albumina + ICG), a fluorescência extremamente fraca foi emitida a partir de ambas as superfícies; entretanto, não houve diferença em emissão intensidade entre elas. A partir disso, foi descoberto que uma albumina não tem especificidade de adsorção virtualmente à matriz de cartilagem e uma camada de célula e, considerada que a albumina contida em uma solução de amostra se liga a ICG e, assim ICG perde atividade de adsorção às proteínas na superfície de cartilagem. No caso de Solução de amostra 4 (albumina positivamente carregada + ICG), foi observado que a fluorescência intensiva foi emitida a partir da superfície danificada. Isto foi presumido que uma albumina positivamente carregada penetrou através de uma superfície danificada no interior e adsorvida a uma camada intermediária de cartilagem contendo uma quantidade maior de carga negativa. Na superfície de controle intacto, as camadas de células são densamente arranjadas e a quantidade de carga negativa é baixa. A partir disso, foi considerado que a quantidade de albumina positivamente carregada adsorvida é baixa. ICG foi saturada com proteínas devido à inclusão por uma albumina positivamente carregada e concebivelmente não quase adsorvida às proteínas na superfície de cartilagem. Como descrito acima, foi demonstrado que a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção constituída de uma albumina positivamente carregada e ICG, penetra a porção danificada de cartilagem, absorve e emite fluorescência mais intensivamente do que uma porção de superfície de cartilagem normal para visualizar a porção danificada.

Exemplo 5 5. Imagem de cartilagem danificada humana com composição de imagem de cartilagem articular

[051] Imagem de uma porção danificada de cartilagem articular humana com a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção foi realizada. Como um material de teste, a cartilagem degenerativa de artrite humana, que foi resíduo médico extirpado para cirurgia de articulação de joelho artificial, foi usada. A cartilagem articular foi assepticamente extirpada e cortada em peças de cerca de 1 cm x cerca de 1,5 cm em tamanho. A cartilagem extirpada foi mergulhada em um tampão fosfato fisiológico. Antes da observação de fluorescente, um tampão fosfato fisiológico (cerca de 2 a 3 mL) foi pulverizado às peças de cartilagem articular por uma seringa e lavados e, em seguida, as fotografias coloridas foram tomadas sob luz visível. Tampão em excesso foi removido com Kimwipe (marca registrada). Em seguida, 100 μL de uma composição de imagem de cartilagem articular (concentração de albumina positivamente carregada: 2,5 mg/mL, concentração de ICG: 0,125 mg/mL) preparada dissolvendo uma albumina positivamente carregada e ICG em água pura foram colocados em uma placa de petri hidrofóbica e a peça de cartilagem articular foi colocada virada para baixo na placa de petri para impregnar a superfície da peça de cartilagem articular com a composição de imagem de cartilagem articular. Cerca de 10 minutos mais tarde, composição de imagem em excesso foi lavada fora com um tampão fosfato fisiológico (2 a 3 mL) e tampão em excesso foi removido por Kimwipe. Cada uma das peças de cartilagem articular foi colocada em uma peça de papel preto e, a superfície superior e superfície lateral foram fotografadas sob luz infravermelha próxima. No disparo sob luz infravermelha próxima, a solução de amostra em cada uma das peças de cartilagem articular foi excitada por uma fonte de luz (comprimento de onda de excitação: 770 nm, 30 mA para cada), que foi preparada arranjando 16 diodos emissores de luz infravermelha próxima na forma de um círculo e, as imagens foram tomadas por uma câmera CCD altamente sensível (ORCA-ER, fabricado por Hamamatsu Photonics K. K.) por intermédio de um filtro para ICG (832 nm) (BrightLine ICG-B, fabricado por Semrock) todos nas mesmas condições (100 ms, luz baixa e 8 x modo binning, modo auto-contraste).

[052]Os resultados são mostrados na Figura 5. Visto que a cartilagem degenerativa humana usada no exemplo teve uma osteoartrite severa, fluorescência intensiva foi emitida a partir de quase todas as peças de cartilagem articular. A partir disso, foi descoberto que na composição contendo uma albumina positivamente carregada e ICG, a albumina positivamente carregada suprime a adsorção não específica de ICG a uma proteína biológica, preferencialmente adsorve à carga negativa abundantemente presente na camada intermediária de cartilagem e emite fluorescência. Observe que, como mostrado na Figura 5, foi descoberto que a fluorescência emitida a partir de uma porção vermelha fina de uma superfície da peça de cartilagem e confirmou quando a observação é feita sob luz visível ser baixa em intensidade comparada à porção periférica da mesma. Visto que a porção vermelha fina é um tecido perto do bordo da cartilagem articular, a porção foi considerada ser um tecido contendo vaso sanguíneo como um tecido sinovial formado na superfície de cartilagem e o tecido sinovial presumivelmente retardou a penetração da composição de imagem da presente invenção.

Aplicabilidade Industrial

[053]A composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção permite a detecção precoce de degeneração de cartilagem, que é uma causa de ga- tilho de osteoartrite do joelho e identificação definida do limite entre cartilagem normal e cartilagem de degeneração. A composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção não só visualiza um sítio degenerativo em cartilagem articular in vivo para, por exemplo, o diagnóstico ou cirurgia sob um artroscópio mas também de forma não invasiva ou menos invasivamente visualiza o estado degenerativo de cartilagem injetando a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção em um espaço da articulação e o estado degenerativo pode ser observado usando uma técnica de imagem in vivo. Além disso, a composição de imagem de cartilagem articular da presente invenção é útil em avaliar, um grau de dano de cartilagem e um grau de melhoria e, em pesquisa de descoberta de fármaco e pesquisa patológica em doenças de cartilagem articular em tecidos de cartilagem articular ou tecidos de cartilagem regenerados excisados.

Claims (1)

1. Composição para visualizar um sítio degenerativo em cartilagem articular CARACTERIZADA pelo fato de que contém uma albumina positivamente carregada e indocianina verde, em que a albumina positivamente carregada é marcada com indocianina verde.