CN105873618A - 关节软骨成像组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供能够将关节软骨的正常部位和非正常的变性部位明确区别并可视化的关节软骨成像组合物。关节软骨成像组合物含有阳性带电分子，阳性带电分子用标记分子进行了标记。
Description
技术领域
本发明涉及通过特异性吸附于关节软骨的损伤部位，使关节软骨的损伤部位可视化的关节软骨成像组合物。
背景技术
变形性关节症(OA；osteoarthritis)是被认为是关节软骨的变性为主要原因而产生的关节疾病，多见于膝或胯、大腿骨等。作为其发病原因，除了年龄增加和超负荷以外，也因运动损伤和肥胖而引起。其中，变形性膝关节症的患者数在日本国内推测为2530万人(2009年、东京大学医学部附属病院22世纪医疗中心ROAD项目)，在美国推测为日本的一倍以上。另外，在人口密集地、被认为劳动条件和环境条件等比日本严峻的中国和印度、非洲诸国等，OA的患者数今后会不断增加。现在，在日本国内，一年7万5000人(2011年、矢野经济研究所)接受了作为最终治疗法的、全人工膝关节置换手术。人工关节置换其自身为高度侵入性的治疗，同时，人工关节有机械寿命，需要根据情况反复更换。
为了防止变形性膝关节症的恶化，避免最终的人工关节置换手术，重要的是早期接受恰当的治疗。因此，软骨变性的早期发现成为必要，但是，在以往的X射线(伦琴射线)摄像和MRI检查中，很难发现初期阶段的软骨变性。另外，通过使用作为内窥镜的一种的关节镜来观察软骨，也能检查有无软骨变性，但是，该方法是担当医生通过在关节镜下用钳子等器具感受软骨表层部位的触觉来判断的。因此，对于早期发现而言，依赖于医生的经验和技能的部分较大，而且，存在正常软骨与变性软骨的边界不能明确识别的问题。
若有不仅仅依赖医生的经验和技能、能够早期发现软骨变性的非侵入性或低侵入性的检查方法，就容易把握有无软骨变性和软骨变性的发展情况，确立治疗方针。作为非侵入性或低侵入性的检查方法，有利用将肌体组织可视化的in vivo成像技术的方法。关于in vivo成像技术，有正电子放射断层造影法(PET)或核磁共振成像(MRI)、超声波成像(Ultrasonography：US)或光声成像(Photoacoustic Imaging：PAI)等各种技术。除此之外，使荧光物质集中于肌体内的相关部位、高灵敏度地捕获的荧光分子断层成像(Fluorescence Molecular Tomography：FMT)等荧光成像技术，由于能非侵入地使相关部位进行特异性的可视化，从而被关注。
为了将上述in vivo荧光成像技术适用于关节软骨，提出了几种与关节软骨组织特异性结合并集聚的成像探针的技术。在专利文献1中，作为与软骨基质特异性结合的软骨标记物，记载有使荧光物质等信号发生机构与6～20个精氨酸残基的聚精氨酸肽或6～20个赖氨酸残基的聚赖氨酸肽结合而得到的软骨标记物。另外，在专利文献2中，记载有由赖氨酸低聚物衍生物构成的软骨组织标记物，该赖氨酸低聚物衍生物是通过使能产生或吸收电磁波的基团结合于赖氨酸低聚物上而得到的，所述赖氨酸低聚物是赖氨酸的ε-氨基和羧基利用肽键连接而成的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-023993号公报
专利文献2：国际公开第2013/137302号
发明内容
发明要解决的课题
但是，在专利文献1以及专利文献2中，虽然记载了这些软骨标记物相对于正常关节软骨特异性结合，但是，没记载相对于非正常的、例如变形性关节症那样的变性了的软骨显示何种性质。即，现状是存在下述问题：不存在将关节软骨的正常部位和非正常部位明确区别并可视化的诊断用的关节软骨成像组合物。
另外，如上所述，一直在寻求不那么需要医生的经验和技能、能早期发现软骨变性的检查方法。
本发明鉴于上述的点而提出，其目的在于提供能够将关节软骨的正常部位和非正常部位明确区别并可视化的关节软骨成像组合物。
另外，本发明的另一个目的在于提供能够容易进行软骨变性的早期发现和变性程度的精密的识别、有助于早期的治疗方针的决定的关节软骨成像组合物。
用于解决课题的手段
为解决上述课题，本发明的关节软骨成像组合物含有阳性带电分子，该阳性带电分子用标记分子进行了标记。正常软骨中，表面平坦的细胞构成多层重叠而成的表层，但是，变性了的软骨成为细胞层剥离从而纤维质多的不规则的组织结构的软骨基质露出的状态、或者从表层向深部缺损的状态。本发明的关节软骨成像组合物含有用标记分子进行了标记的阳性带电分子，该阳性带电分子重点渗透及吸附于露出的软骨基质上。这样，本发明的关节软骨成像组合物重点吸附于软骨发生了变性的部分，因此，能将关节软骨的正常部位和非正常的变性部位区别并可视化。
另外，本发明的关节软骨成像组合物的阳性带电分子优选为阳性带电的蛋白质或肽化合物。作为构成关节软骨成像组合物的阳性带电分子，选择肌体内也广泛存在、安全性高、操作也容易、标记分子的标记也能够简单地进行的物质。
本发明的关节软骨成像组合物的蛋白质或肽化合物优选为白蛋白、白蛋白分解物或白蛋白的修饰化合物。由此，可选择合适的物质作为构成阳性带电分子的蛋白质或肽化合物。
而且，本发明的关节软骨成像组合物的阳性带电分子优选为阳性带电的糖链化合物。作为构成关节软骨成像组合物的阳性带电分子，选择肌体内也广泛存在、安全性高、操作也容易、标记分子的标记也能够简单进行的物质。
本发明的关节软骨成像组合物的糖链化合物优选为葡聚糖、环糊精或它们的衍生物。由此，可选择合适的物质作为构成阳性带电分子的糖链化合物。
而且，本发明的关节软骨成像组合物的标记分子优选选自由荧光物质、放射性同位素、X射线吸收物质、抗体分子及具有可被特异性抗体识别的识别部位的分子组成的组中的至少一种物质。上述阳性带电分子等用标记分子进行了标记，因此，能够利用荧光物质、放射性同位素、X射线吸收物质、抗体分子或具有可被特异性抗体识别的识别部位的分子等标记分子，将吸附于软骨变性的部分的阳性带电分子等的位置可视化。
另外，上述标记分子中，荧光物质优选为吲哚菁绿。由此，可选择安全性高、能够有效进行可视化和检测的标记分子。
另外，本发明的关节软骨成像组合物的标记分子还优选为选自由磁性粒子、金属粒子、金属纳米粒子以及含其他纳米材料的物质组成的组中的至少一种物质。因此，关于吸附于软骨变性的部分的阳性带电分子等的位置，还能利用X射线CT、MRI、拉曼分光法、等离子体共振法等进行检测。
发明效果
根据本发明，能够提供具有以下良好效果的关节软骨成像组合物。
(1)能够将关节软骨的正常部位和非正常的变性部位明确区别并可视化。
(2)能够容易进行软骨变性的早期发现和变性程度的精密识别。
(3)在利用关节镜进行的诊断或手术时，通过使用关节软骨成像组合物，在肌体内，能够使关节软骨的变性部位可视化，从而进行诊断或治疗。
(4)通过在关节腔中注入关节软骨成像组合物等，能够利用in vivo成像技术，非侵入或低侵入地诊断软骨的变性状态。
(5)由于由安全性高的物质构成，因此，也容易操作。另外，关于分解产物，安全性也同样地高。
(6)检查或手术结束后，通过代谢、水解或利用组织液进行稀释，从而有效地被排除。
附图说明
图1是表示实施例1中的阳性带电的牛血清白蛋白的等电点电泳的结果的照片。
图2是表示由实施例2中的阳性带电白蛋白或白蛋白与吲哚菁绿的结合带来的荧光发光的结果的照片。
图3是表示实施例3中的利用本发明的关节软骨成像组合物进行的损伤软骨模型的成像结果的照片。
图4是表示利用实施例4中的本发明的关节软骨成像组合物进行的对于软骨损伤模型及无伤模型的成像结果的照片。
图5是表示利用实施例5中的本发明的关节软骨成像组合物进行的对于人损伤软骨的成像结果的照片。
具体实施方式
本发明的关节软骨成像组合物中含有经标记的阳性带电分子。在本发明中，所谓“阳性带电分子”是指，具有阳性带电(正电荷)、能够选择性地吸附于变性的软骨上的分子。
软骨被分类为结缔组织，由作为丰富的细胞外基质的软骨基质和散布在其中的软骨细胞构成。构成关节的软骨被称作透明软骨，该透明软骨的软骨基质的主成分主要是胶原和蛋白多糖。该蛋白多糖含有硫酸软骨素、硫酸角质素以及硫酸乙酰肝素等具有阴性电荷的侧链，整体具有阴性电荷。正常软骨中，表面平坦的细胞构成多层重叠而成的表层，但是，变性了的软骨成为细胞层剥离从而纤维质多的不规则的组织结构的软骨基质露出的状态、或者从表层向深部缺损的状态。推测本发明的关节软骨成像组合物中所含的阳性带电分子特异性地吸附于因软骨组织的表层剥离而露出的软骨基质中的蛋白多糖上。
作为本发明中的阳性带电分子，若为能够选择性地吸附于变性的软骨上的分子，就没有特别的限定，但是，从安全性和操作的容易性的观点考虑，优选阳性带电的蛋白质或肽化合物、或阳性带电的糖链化合物。此外，在本说明书中，就“蛋白质”而言，广泛地包含糖蛋白或脂蛋白、核苷酸结合蛋白等。
作为通过阳性带电化而被用作本发明中的阳性带电分子的蛋白质或肽化合物，优选血浆蛋白质或各种白蛋白，特别优选血清白蛋白。另外，就血浆蛋白质和各种白蛋白而言，也包含它们的分解物或修饰化合物。该阳性带电化的白蛋白(阳离子化白蛋白)具有特异性地吸附于软骨基质、但是难以侵入软骨组织的细胞内的性质。因而，该阳离子化白蛋白难以从正常软骨组织的表层被摄入细胞内部，存在于正常的软骨组织的表层内的软骨基质几乎未被吸附。因此，阳离子化白蛋白被重点吸附于关节软骨组织中非正常的变性部位。另外，作为白蛋白或其分解物、修饰化合物的阳性带电化的状态，从向软骨损伤部位进行重点吸附的观点考虑，优选被阳性带电化至等电点pI为8以上，特别优选为被阳性带电化至等电点pI为10以上。这样，通过选择具有难以侵入到软骨组织的细胞中的性质的白蛋白，将关节软骨成像组合物适用于肌体时的安全性得以进一步提高。另外，通过选择分子量大的白蛋白分子，能够增加标记分子的标记数，因此，例如，使用荧光物质作为标记分子时，能够进行提高亮度等的调节，利用标记分子进行的检测、即可视化变得容易。
另外，作为通过与上述白蛋白同样地阳性带电化而被用作本发明中的阳性带电分子的糖链化合物，优选直链状或环状的糖链化合物，作为直链状的糖链化合物，特别优选葡聚糖或葡聚糖衍生物，作为环状的糖链化合物，特别优选环糊精或环糊精衍生物。这些阳性带电的葡聚糖、环糊精或它们的衍生物与上述白蛋白同样地具有特异性地吸附于软骨基质、但是难以侵入到软骨组织的细胞内的性质。而且，这些阳离子化的葡聚糖或环糊精难以从正常软骨组织的表层被摄入细胞内部，存在于正常的软骨组织的表层内的软骨基质几乎未被吸附。因此，阳离子化的葡聚糖或环糊精被吸附于关节软骨组织中非正常的变性部位。此时，作为葡聚糖或环糊精，从难以侵入到软骨组织的细胞内的观点考虑，分子量优选为3,000以上，进一步优选为10,000以上。这样，通过选择具有难以侵入到软骨组织的细胞中的性质的葡聚糖或环糊精，将关节软骨成像组合物适用于肌体时的安全性得以进一步提高。另外，通过选择分子量大的葡聚糖或环糊精，能够增加标记分子的标记数，因此，例如使用荧光物质作为标记分子时，能够进行提高亮度等的调节，利用标记分子进行的检测、即可视化变得容易。另外，关于环糊精，容易将标记分子包接于该分子的内部空洞，因此，能够容易地得到本发明的关节软骨成像组合物。
此外，在本发明中，所谓“关节软骨成像”是指，使用裸眼或装置等，利用图像或数值或向量等手段将关节软骨的状态可视化(可见化)。对于可视化，也包括取关节软骨组织的一部分进行检测的情况、在肌体内(in situ)检测的情况中的任一种，关于在肌体内的可视化，除了通常的手术中的可视化以外，还包括使用了关节镜的低侵入性的检查或手术、或使用注射器等将本发明的组合物注入关节腔内这样的低侵入性的检查中的可视化。
在本发明中，所谓标记分子是指，通过直接或间接地结合于阳性带电分子、或包接于阳性带电分子中，从而在阳性带电分子上作记号，能够利用裸眼或装置等检测阳性带电分子的存在的分子。作为标记分子，没有特别的限定，但是，可以适当使用荧光物质、放射性同位素、发光物质、酶、X射线吸收物质、抗体分子、具有可被特异性抗体识别的识别部位的分子(抗体识别分子)、磁性粒子、金属粒子、经玻璃涂敷的金属纳米粒子等。
作为本发明的一种实施方式，从容易可视化或检测的观点考虑，优选使用荧光物质作为标记分子。作为荧光色素，作为一个例子，优选使用吲哚菁绿、Alexa Fluor(注册商标)488、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor647、BODIPY(注册商标)FL、Texas Red(注册商标)、Oregon Green(注册商标)488、罗丹明B、罗丹明绿、四甲基罗丹明、荧光素、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、藻青蛋白、Cy3、Cy5、Cy7等。其中，从安全性高、容易可视化或检测的观点考虑，特别优选使用吲哚菁绿。吲哚菁绿在一定条件下，通过照射近红外光，发出波长比照射的近红外光长的近红外区域的荧光。发出的光直接用肉眼几乎不能观察，为了观察，需要用于红外光检测的装置，但由于可设为暗视野，因此，在关节镜下的观察中，容易产生对比度，容易检测。这些荧光分子除了利用亲和素-生物素法进行的结合以外，能够利用包接、其它公知的方法标记阳性带电分子。
另外，使用抗体识别分子作为标记分子时，除了亲和素-生物素法以外，利用各种荧光抗体反应，能进行荧光观察。另外，将荧光素用作标记分子时，还能够进行利用了荧光素、荧光素酶反应的发光观察。而且，作为标记分子，还能使用X射线吸收物质或磁性纳米粒子、金属纳米粒子等。通过将它们用作标记分子，还能够利用X射线CT、MRI、拉曼分光法、等离子体共振法等进行观察。此外，除了利用上述标记分子进行的检测以外，在软骨组织下丰富存在的血红蛋白的红外光吸收或胶原纤维的自发光现象的检测、对相对于由MR弹性成像(MR elastography：MRE)的振动带来的剪切应力的组织的粘弹性进行非侵入性评价成为可能。
而且，本发明的关节软骨成像组合物中可以含有上述分子以外的其它成分。作为这样的添加物，例如可举出等渗剂、缓冲剂、保存剂、抗氧剂等。作为等渗剂，优选使用氯化钠、甘油、D－甘露醇、D－山梨糖醇、葡萄糖等。作为缓冲剂，可举出磷酸盐、醋酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等缓冲液等。
而且，在本发明的关节软骨成像组合物中，除上述添加物以外，还能含有进一步防止阳性带电分子侵入软骨组织内的物质。作为这样的物质，例如可举出胶原或未阳性带电化的白蛋白或它们的衍生物或分解物等。
此外，本发明的关节软骨成像组合物通过结合使用具有损伤软骨修复作用的治疗用药剂、或成为利用细胞片等进行的再生医疗、细胞治疗的基础的I型胶原等支架分子来代替上述标记分子，能够用作选择性结合于软骨损伤部位的药物传递系统。另外，还能利用于支架移植后的术后管理。
下面对本发明的关节软骨成像组合物的使用方法进行说明。本发明的关节软骨成像组合物，从容易适用的观点考虑，优选液体制剂。将本发明的组合物适用于肌体内时，可以进行在关节镜下的向关节软骨表层的喷雾、滴加或涂布、或者向关节腔内的注射。在关节镜下的适用时，优选利用乳酸林格液或生理盐水等清洗软骨表面，除去关节腔内的粘液(滑液)后，进行本发明的关节软骨成像组合物的喷雾或涂布等。另外，进行关节软骨成像组合物的喷雾等后，放置一定时间使关节软骨成像组合物渗透。关于该一定时间，具体而言，从向对象组织的渗透性的观点考虑，优选为3分钟～30分钟左右，更优选为5分钟～20分钟左右，进一步优选为10分钟～15分钟左右。之后，利用乳酸林格液等洗涤关节软骨，除去非特异性的吸附和剩余的关节软骨成像组合物。之后，利用标记分子进行荧光等的检测。
作为利用标记分子进行的检测方法，没有特别的限定，但是，优选插入关节镜以及具有调整成适用于标记分子的激发光的滤波器的光纤，进行标记分子的测定。作为一个例子，对靶分子使用作为荧光指示剂的吲哚菁绿时，利用介入有最佳滤波器的CCD相机的图像，能够简易观察吲哚菁绿的绿色荧光(峰值波长为800～850nm)。而且，对于检测结果的成像，能够使用适当的软件，将荧光强度等变换成观察者希望的色调或数值等进行显示。另外，如上所述，关于关节软骨成像组合物进行可视化后的软骨变性部分，通过识别或检测能够视觉辨认的图像上的浓淡和色调的转变等，还能够检测变性的软骨组织表面的粗细、即软骨的变性水平。使用了关节镜的诊断或手术所花的时间通常为1～3小时，为短时间，因此，关节软骨成像组合物的作用时间也同样地为1～3小时左右即可，诊断或手术结束后，通过利用乳酸林格液或生理盐水等清洗多次，大都被排出，关于残留的部分，也能通过水解等被分解、排出。
根据本发明的关节软骨成像组合物，对于正常的软骨组织，其表层细胞形成的壳样的结构排除阳性带电分子，也难以发生向软骨细胞内的侵入，因此，正常的软骨组织不被可视化。另一方面，对于变性后无表层细胞层的软骨组织，指向性地吸附于露出的软骨基质，因此，变性的软骨组织被强调。在通常的检测方法中，软骨变性的早期、即仅失去表层细胞层的“软骨变性等级1”被认为检测和识别非常困难。根据本发明的关节软骨成像组合物，关于这样的“软骨变性等级1”，能够进行识别、检测，能够进行患者的早期治疗。
另外，根据本发明的关节软骨成像组合物，能够使用关节镜把握关节内的组织(软骨、十字韧带以及半月板)的损伤状态，进行治疗，因此，能够进行低侵入性的诊断以及治疗。到目前为止，利用关节镜在可见光下显示于监视器上的关节软骨具有白色高亮度，难以判断软骨表层的变性或损伤，但是，通过使用本发明的组合物，能够标记软骨表面的变性或缺损部分，在暗视野下使标记分子的红外荧光发光等，能够发现在可见光下难以看见的软骨的损伤状态。
以下，示出本发明的实施例，但是本发明并不限定于这些实施例。
实施例
[实施例1]
1.阳性带电化白蛋白的调制
使5g牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich合同会社产品)溶解于25mL纯水。另一方面，将无水乙二胺67mL(Sigma-Aldrich合同会社产品)添加于纯水500mL中，在冰水中缓缓加入6N的盐酸约350mL，将pH调节到4.75。进而，将1－乙基－3－(3－二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐1.8g(Sigma-Aldrich合同会社产品)添加于上述乙二胺溶液中，加入之前调制的牛血清白蛋白水溶液。用冰水将调制容器冷却，保持温度和pH的同时，搅拌2小时后，加入5mL 4M的乙酸缓冲液，使反应停止。将所得到的溶液在4℃下用纯水透析72小时后，进行冻干。通过冻干得到的晶体为白色，有光泽，呈薄膜状的外观。
对上述调制的冻干产物、和用作原料的牛血清白蛋白测定两者的等电点，确认是否得到了阳性带电化白蛋白。将冻干产物以及牛血清白蛋白溶解于纯水，应用于Novex(注册商标)IEF凝胶(Life Technologies Japan株式会社产品)，进行等电点电泳。结果表示在图1中。如图1所示，通常的牛血清白蛋白的pI约为4.9，但是，冻干产物的pI为11左右，较高，可知被高度阳离子化了。由此，确认得到了阳性带电化白蛋白。
[实施例2]
2.阳性带电化白蛋白与吲哚菁绿的最佳浓度的研究
作为荧光色素的吲哚菁绿(ICG)在仅包含ICG的水溶液的状态下，无法看到荧光，但是，与蛋白质结合时，发出近红外光区域的荧光。使ICG与在实施例1中制备的阳性带电化白蛋白结合，如下所述测定由ICG发出的荧光强度。此外，作为对照实验，还测定了由未被阳性带电化的白蛋白与ICG的结合带来的荧光强度。
使在实施例1中制备的阳性带电化白蛋白溶解于纯水，调制了1.250mg/mL、0.625mg/mL、0.313mg/mL、0.156mg/mL及0.078mg/mL的浓度的溶液。另外，使吲哚菁绿(Sigma-Aldrich合同会社产品)溶解于纯水中，调制了0.025mg/mL的溶液。将各浓度的阳性带电化白蛋白溶液和ICG溶液分别各取50μL，添加于96孔的ELISA板的各孔中而混合。利用红外线观察相机系统(pde-neo C10935－20、浜松Photonics株式会社产品)拍摄从溶液产生的红外荧光(激发光为760nm、荧光为830nm)。作为对照实验，将阳性带电化白蛋白替换为牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich合同会社产品)，利用与上述同样的内容进行实验。结果如图2所示。
如图2的照片所示，未阳性带电化的白蛋白在白蛋白浓度为0.313mg/mL(白蛋白浓度；0.156mg/mL、ICG浓度；0.0125mg/mL)以上的实验区中，能够用肉眼识别荧光。另一方面，阳性带电化白蛋白在阳性带电化白蛋白浓度为0.156mg/mL(阳性带电化白蛋白浓度；0.078mg/mL、ICG浓度；0.0125mg/mL)以上的实验区，能够用肉眼识别荧光。这样得知，阳性带电化白蛋白与通常的白蛋白相比，能在低浓度下进行荧光识别。此外，关于ICG，在比上述实验浓度(0.0125mg/mL)高的浓度下进行了实验后，确认了荧光的亮度也高。
[实施例3]
3.利用关节软骨成像组合物进行的使用了牛正常关节软骨的损伤软骨模型的成像(1)
以约1.5cm×约2cm的大小切割出生后2～3周的上等肉用牛的前肢肩部的关节软骨，除掉下骨。然后，如图3的损伤软骨模型图所示，用剃刀以0.1～0.2mm左右的深度将切割出的关节软骨片的表面部分切除，在软骨表面产生缺损部。设想在实际的临床中的利用，利用注射筒对各关节软骨片喷射约5mL的生理盐水而进行清洗。然后，将使阳性带电化白蛋白和ICG溶解于纯水而调制的关节软骨成像组合物(阳性带电化白蛋白浓度：2.5mg/mL、ICG浓度：0.125mg/mL)200μL滴加于疏水性塑料面，将关节软骨片的表面向下置于疏水性塑料面，使其浸渍到关节软骨成像组合物中。在约10～15分钟后，利用生理盐水冲洗多余的关节软骨成像组合物，使用红外线相机(浜松Photonics株式会社产品)，记录各关节软骨切片的表面的图像。
利用红外线相机观察的图像表示在图3中。关于对照区的关节软骨片(未切除表面)，不能确认从软骨表面的关节软骨成像组合物的渗透以及吸附。白线状的发光为剩余的关节软骨成像组合物利用毛细管现象附着于关节软骨片的外周侧面而形成的。另一方面，关于实验区1(软骨表面中，利用剃刀切除单侧半面，使之缺损)，确认了关节软骨成像组合物从表面的缺损部分渗透、吸附而产生的发光。此外，白线状的发光为剩余的关节软骨成像组合物利用毛细管现象附着于关节软骨片的外周侧面而形成的。进而，关于实验区2(软骨表面中，利用剃刀切除中央部分，使之缺损)，确认了关节软骨成像组合物从表面的中央部的缺损部分渗透、吸附而产生的发光。如此表明，本发明的关节软骨成像组合物渗透至深部并吸附，切除面发出强的荧光。
[实施例4]
4.利用关节软骨成像组合物进行的使用了牛正常关节软骨的损伤软骨模型的成像(2)
以约1cm×约1.5cm的大小无菌切割出生后2～3周的上等肉用牛的前肢肩部的关节软骨，尽可能除掉下骨。切割出的软骨浸渍于生理磷酸缓冲液中。然后，用手术用刀(No.11)以约0.1～0.2mm左右的深度切除所切割出的关节软骨片的表面的大致半面(俯视、右侧半面)，在软骨表面作成缺损部。通过该处理，关节软骨片的俯视左侧半面成为无伤的对照区，俯视右侧半面成为软骨的表层损伤模型。另外，为了在测定以及观察时进行位置确认，斜着削除损伤面的一端的角。荧光观察前，利用注射筒对各关节软骨片喷出约2～3mL的生理磷酸缓冲液而进行清洗。利用KimWipes(注册商标)除去剩余的缓冲液。然后，将后述的样品液1～4各50μL分别滴入到疏水性浅底盘中，将各关节软骨片的表面向下放置于滴在浅底盘上的样品液上，使样品液浸渍于关节软骨片的表面。在约10分钟后，利用2～3mL的生理磷酸缓冲液冲洗多余的样品液，剩余的缓冲液利用KimWipes除去。将各关节软骨片放置在黑色的纸片上，在近红外光下以及可见光下进行照片拍摄。
本实施例中使用的样品液1～4均使各成分溶解于纯水中进行调制，形成样品液1：仅纯水、样品液2：ICG浓度0.125mg/mL、样品液3：白蛋白浓度2.5mg/mL以及ICG浓度0.125mg/mL以及样品液4：阳性带电化白蛋白浓度2.5mg/mL以及ICG浓度0.125mg/mL。另外，在近红外光下的拍摄利用使16根近红外发光二极管以圆形排列而成的光源(激发波长：770nm、各30mA)，使各关节软骨片的样品液激发，经由ICG用832nm的滤波器(Semrock公司产品、BrightLine ICG－B)，利用高灵敏度CCD相机(浜松Photonics株式会社产品、ORCA－ER)，在全部相同条件(100ms、low light以及8×binning mode)下进行。在近红外光下的拍摄后，进行在可见光下的单色拍摄。
结果表示在图4中。在可见光拍摄照片以及近红外光拍摄照片的任一者中，左侧半面表示无伤的对照，右侧半面表示损伤模型。样品液1(仅纯水)时，在所有面均未确认到发光。但是，样品液2(仅ICG)时，仅无伤的对照部分的面见到荧光。认为该荧光是ICG吸附于软骨表面的蛋白质而成的。另一方面，从在损伤模型的面上未观察到荧光发光来看，认为这是由于通过软骨的表面损伤，与蛋白质相比，糖胺聚糖等的糖链丰富地露出于软骨表面，ICG未被吸附于这些糖链。另一方面，样品液3(白蛋白+ICG)时，在所有的面上均观察到非常弱的荧光发光，但是，其发光强度没有差别。由此，认为这是由于白蛋白几乎不存在对于软骨基质或细胞层的吸附特异性、以及样品液中所含的白蛋白与ICG结合，从而使得失去了ICG向软骨表面的对蛋白质的吸附活性。而且，样品液4(阳性带电化白蛋白+ICG)时，在损伤面观察到强荧光。推测这是由于阳性带电化白蛋白从受到损伤的面渗透到内部、吸附于含有较多阴性电荷的软骨中层的缘故。认为无伤的对照部分的面上，细胞层密集排列，阴性电荷也少，阳性带电化白蛋白的吸附少。另外，认为ICG被包含于阳性带电化白蛋白中等，并在蛋白质中饱和，不会重新吸附到软骨表面的蛋白质上。如此表明，由阳性带电化白蛋白和ICG构成的本发明的关节软骨成像组合物渗透吸附于软骨损伤部，比正常的软骨表面部分发出更强的荧光，由此使损伤部分可视化。
[实施例5]
5.利用关节软骨成像组合物进行的人损伤软骨的成像
试用了使用了本发明的关节软骨成像组合物的人的关节软骨的损伤部分的成像。作为实验材料，使用了为了人工膝关节手术而被切除、被医疗废弃的人的关节的变性软骨。以约1cm×约1.5cm的大小无菌地切割出关节软骨片。切割出的软骨浸渍于生理磷酸缓冲液中。荧光观察前，利用注射筒对关节软骨片喷出约2～3mL的生理磷酸缓冲液而进行清洗，在可见光下进行彩色照片拍摄。剩余的缓冲液用KimWipes(注册商标)除去。然后，将使阳性带电化白蛋白和ICG溶解于纯水而调制的关节软骨成像组合物(阳性带电化白蛋白浓度：2.5mg/mL、ICG浓度：0.125mg/mL)100μL置于疏水性浅底盘中，将关节软骨片的表面朝下放置于浅底盘上，使关节软骨成像组合物浸渍于关节软骨片的表面。在约10分钟后，利用2～3mL的生理磷酸缓冲液冲洗多余的成像组合物，剩余的缓冲液利用KimWipes除去。将关节软骨片置于黑色的纸片上，在近红外光下进行表面以及侧面的照片拍摄。关于近红外光下的拍摄，利用使16根近红外发光二极管以圆形排列而成的光源(激发波长：770nm、各30mA)，使各关节软骨片的样品液激发，经由ICG用832nm的滤波器(Semrock公司产品、BrightLine ICG－B)，利用高灵敏度CCD相机(浜松Photonics株式会社产品、ORCA－ER)，在全部相同条件(100ms、low light以及8×binning mode、Auto-contrastmode)下进行。
结果表示在图5中。在本实施例中使用的人变性软骨由于重度的变形性关节症的病变，从关节软骨片的大致整体显示出强荧光。由此可知，阳性带电化白蛋白与ICG的组合物中，阳性带电化白蛋白抑制ICG向肌体蛋白质的非特异性吸附，并且优先吸附于软骨中层中存在较多的阴性电荷上，发出荧光。此外，如图5所示可知，关于在可见光下观察时确认的软骨片表面的淡红色部分，荧光强度变得比周围低。认为该淡红色部分为关节软骨的边缘附近的组织，因此，是包含形成于软骨表面的滑膜组织样的血管的组织，推测该滑膜使本发明的成像组合物的渗透延迟。
产业上的可利用性
本发明的关节软骨成像组合物能够早期检测成为变形性膝关节症的触发器的软骨的变性，能够明确区别正常软骨和变性软骨的边界。本发明的关节软骨成像组合物在利用关节镜进行的诊断或手术等时，在肌体内，不仅能够使关节软骨的变性部位可视化，而且通过注入到关节腔中等，能够利用in vivo成像技术，非侵入性或低侵入性观察软骨的变性状态。而且，在摘出关节软骨组织或再生关节软骨组织中，对软骨损伤度的评价以及改善度的评价、以及关于关节软骨疾病的创新药物研究和病理研究也有用。
Claims (8)
1.一种关节软骨成像组合物，其特征在于，含有阳性带电分子，所述阳性带电分子用标记分子进行了标记。
2.根据权利要求1所述的关节软骨成像组合物，其特征在于，所述阳性带电分子为阳性带电化的蛋白质或肽化合物。
3.根据权利要求2所述的关节软骨成像组合物，其特征在于，所述蛋白质或肽化合物为白蛋白、白蛋白分解物或白蛋白的修饰化合物。
4.根据权利要求1所述的关节软骨成像组合物，其特征在于，所述阳性带电分子为阳性带电化的糖链化合物。
5.根据权利要求4所述的关节软骨成像组合物，其特征在于，所述糖链化合物为葡聚糖、环糊精或它们的衍生物。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的关节软骨成像组合物，其特征在于，所述标记分子为选自由荧光物质、放射性同位素、X射线吸收物质、抗体分子以及具有可被特异性抗体识别的识别部位的分子组成的组中的至少一种物质。
7.根据权利要求6所述的关节软骨成像组合物，其特征在于，所述荧光物质为吲哚菁绿。
8.根据权利要求1～5中任意一项所述的关节软骨成像组合物，其特征在于，所述标记分子为选自由磁性粒子、金属粒子、金属纳米粒子以及含其他纳米材料的物质组成的组中的至少一种物质。
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| GR01 | Patent grant | ||
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