KR20160090581A - 이중 약물 전달을 위한 다공성 생분해성 고분자 미립자 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

이중 약물 전달을 위한 다공성 생분해성 고분자 미립자 및 그의 제조 방법을 제공한다. 상기 다공성 생분해성 고분자 미립자 및 그의 제조 방법은 초기 방출이 크지 않고, 두 가지 약물을 일정한 양으로 오랜 지속시간 동안 동시에 방출이 가능하며, 화학적 결합이나 유기 용매에 의한 약물의 손상 및 변성을 방지할 수 있고, 원하는 약물의 양을 효율적으로 담지할 수 있다.

Description

이중 약물 전달을 위한 다공성 생분해성 고분자 미립자 및 그의 제조 방법{Porous biodegradable polymer microsphere for dual-loaded drug delivery and method for producing thereof}

이중 약물 전달을 위한 다공성 생분해성 고분자 미립자 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

약물전달용 미립자는 치료부위에 질병 치료용 약물을 효율적으로 전달함으로써 약물의 부작용을 줄이고 약물에 대한 환자의 순응도를 높이며 약물의 효능 및 효과를 극대화할 수 있도록 제형을 설계하는 것이 중요하다. 특히 생분해성 고분자를 이용한 약물전달용 미립자는 지용성 또는 수용성의 생리활성물질을 미립자에 쉽게 함유시킬 수 있어야 하고, 인체 내에서 약물을 담지하고 일정기간 유지할 수 있는 물성과 인체에 무해한 물질로 분해되는 안정성 및 인체에 투입된 초기에는 약물을 방출하지 않다가 목표지점에 도달한 이후에 원하는 기간 동안 충분히 약물을 방출할 수 있는 지속성을 가지고 있어야 한다.

상기와 같은 생분해성 고분자를 이용한 미립자의 제조방법으로는 용매증발 건조법(미국 특허 제4,652,441호), 상분리법(미국 특허 제4,675,189호), 분무건조법(미국 특허 제6,709,650호) 및 저온 용매추출법(미국 특허 제 5,019,400호) 등이 알려져 있다. 또한, 다공성 미립자를 제조하는 방법으로는 염 침출/가스 발포법과 용매/비용매를 이용한 상 분리법 등이 알려져 있는데, 염 침출/가스 발포법은 암모늄바이카보네이트(NH4HCO3) 등을 비등성 물질로 사용하여 미립자에 다공성을 부여하는 방법(김 등, Biomaterials 27: 152-159, 2006)이고, 용매/비용매 상 분리법은 고분자를 용매에 녹인 다음 사용되는 용매와는 혼화성이 있지만 사용되는 고분자에는 비용매로 작용하는 물질을 첨가하여 미립자에 다공성을 부여하는 방법이다(홍 등, Polym. Adv. Technol. 16: 622-627, 2005).

그러나, 현재까지 개발된 미립자는 높은 초기 방출율을 가지며, 일정양이 방출된 이후에는 지연시간과 낮은 약물 지속기간을 갖는 단점이 있다. 또한 W/O/W(water in oil in water) 이중 에멀젼을 이용하여 미립자 제조 시 크기 조절이 어렵고 담지할 수 있는 약물의 양이 내부 표면적에 의해 제한된다는 단점이 있고, 중간 단계 및 최종단계에서 약학적 활성 물질인 성장 인자를 도입하는 방법인 내부포접, 화학적 처리를 통한 표면개질 및 이온결합시 유기 용매 또는 pH 변화 등에 의해 성장 인자의 응집, 비접힘 또는 변성과 같은 약물의 손상을 가져온다.

일 양상은 속이 비어있는(hollow) 다공성 생분해성 고분자 미립자로서, 상기 미립자는, 기공을 갖는 외부 표면에 제1 약학적 활성 물질이 담지되고;및 내부의 빈 공간에 제2 약학적 활성 물질을 포함하는 하이드로겔(hydrogel)이 담지된 것인 약물 전달을 위한 미립자를 제공하는 것이다.

다른 양상은 생분해성 고분자 및 제1 약학적 활성 물질을 유기 용매에 용해시켜 제1 약학적 활성 물질을 함유한 고분자 용액을 제조하는 단계; 상기 고분자 용액에 기공 형성제(pore forming agent)를 첨가하여 W/O(water in oil) 에멀젼을 제조하는 단계; 상기 W/O 에멀젼을 에멀젼 안정화제 용액에 첨가하여 W/O/W(water in oil in water) 에멀젼을 제조하는 단계; 및 상기 W/O/W 에멀젼을 제2 약학적 활성 물질을 포함하는 하이드로겔에 침지시키는 단계를 포함하는 속이 비어있는 다공성 생분해성 고분자 미립자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 속이 비어있는(hollow) 다공성 생분해성 고분자 미립자로서, 상기 미립자는, 기공을 갖는 외부 표면에 제1 약학적 활성 물질이 담지되고;및 내부의 빈 공간에 제2 약학적 활성 물질을 포함하는 하이드로겔(hydrogel)이 담지된 것인 약물 전달을 위한 미립자를 제공한다.

용어 "미립자(microsphere)" 는 제형에 약물을 봉입시키기 위한 입자를 의미할 수 있으며, 미립구, 나노입자(nanoparticle) 또는 나노구(nanosphere)와 호환적으로 사용된다. 미립자는 미크론 또는 ㎛ 범위 정도, 또는 더 작은 크기의 입자, 예를 들면, 약 0.01 ㎛ 내지 약 1000 ㎛, 약 1 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 또는 약 400 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 직경을 가진 임의의 입자들을 포함한다. 미립자는 예를 들면, 대략적인 구형(예컨대, 미소구체), 구형, 타원형, 원통형, 막대 모양 등과 같은 임의의 모양의 것일 수 있다.

또한, 상기 미립자는 다공성이며, 속이 비어있는 것(hollow)일 수 있다. 즉, 외부 표면은 기공을 갖는 다공성이며, 내부에는 비어있는 공간을 갖는 것일 수 있다. 상기 내부의 비어있는 공간의 직경은 예를 들면, 약 200 내지 약 400 ㎛, 약 200 내지 약 300 ㎛, 약 300 내지 약 400 ㎛, 약 350 내지 약 400 ㎛ 일 수 있다. 또한, 상기 기공의 직경은 예를 들면, 약 2 내지 약 80 ㎛, 약 5 내지 약 40 ㎛, 약 5 내지 약 20 ㎛ 일 수 있다.

본 발명에서 용어 "약학적 활성 물질(pharmacologically active agent)"은 생물이 생을 영위함에 있어서 생체의 기능을 증진시키거나 혹은 억제시키는 물질로서, 생체 내에서 기능 조절에 관여하는 물질의 결핍이나 과도한 분비에 의해 비정상적인 병태를 보일 때 이를 바로잡아주는 역할을 하는 물질을 의미할 수 있다. 상기 약학적 활성 물질은 예를 들면, 성장인자, 성장 호르몬, 펩타이드 또는 단백질 의약품, 소염진통제, 항암제, 항바이러스제, 성호르몬, 항생제, 항균제 또는 저분자 화합물일 수 있으며, 더욱 상세하게는 덱사메타손(dexamethasone), 프로게스테론(progesterone) 할로페리돌(haloperidol), 티오틱센(thiothixene), 올란자핀(olanzapine), 클로자핀(clozapine), 브롬페리돌(bromperidol), 피모자이드(pimozide), 리스페리돈(risperidone), 지프라시돈(ziprasidone), 디아제프마(diazepma), 에틸 로플라제페이트(ethyl loflazepate), 알프라졸람(alprazolam), 네모나프라이드(nemonapride), 플루옥세틴(fluoxetine), 세르트랄린(sertraline), 베늘라팍신(venlafaxine), 도네페질(donepezil), 타크린(tacrine), 갈란타민(galantamine), 리바스티그민(rivastigmine), 셀레길린(selegiline), 로피니롤(ropinirole), 페르골리드(pergolide), 트리헥시페니딜(trihexyphenidyl), 브로모크립틴(bromocriptine), 벤즈트로핀(benztropine), 콜치킨(colchicine), 노르다제팜(nordazepam), 에티졸람(etizolam), 브로마제팜(bromazepam), 클로티아제팜(clotiazepam), 멕사졸룸(mexazolum), 부스피론(buspirone), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 소마토트로핀(somatotropin), 루프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate), 옥트레오티드(octreotide), 세트로렐릭스(cetrorelix), 산도스타틴 아세테이트(sandostatin acetate), 고나도트로핀(gonadotropin), 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 미조리빈(mizoribine), 사이클로스포린(cyclosporin), 타크롤리무스(tacrolimus), 날록손(naloxone), 날트렉손(naltrexone), 클라드리빈(cladribine), 클람부실(chlorambucil), 트레티노인(tretinoin), 카르무시틴(carmusitne), 아나그렐리드(anagrelide), 독소루비신(doxorubicin), 아나스트로졸(anastrozole), 이다루비신(idarubicin), 시스플라틴(cisplatin), 닥티노마이신(dactinomycin), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 랄티트렉세드(raltitrexed), 에피루비신(epirubicin), 레트로졸(letrozole), 메플로퀸(mefloquine), 프리마퀸(primaquine), 옥시부티닌(oxybutynin), 톨트레로딘(toltrerodine), 알릴에스트레놀(allylestrenol), 로보스타틴(lovostatin), 심바스타틴(simvastatin), 프로바스타틴(provastatin), 아트로바스타틴(atrovastatin), 알렌드로네이트(alendronate), 살카토닌(salcatonin), 랄록시펜(raloxifene), 옥사드롤론(oxadrolone), 콘쥬게이티드 에스트로겐(conjugated estrogen), 에스트라디올(estradiol), 에스트라디올 발러레이트(estradiol valerate), 에스트라디올 벤조에이트(estradiol benzoate), 에티닐 에스트라디올(ethinylestradiol), 에토노게스트렐(etonogestrel), 레보노르게스트렐(levonorgestrel), 티볼론(tibolone), 노르에티스테론(norethisterone)일 수 있으며, 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), 종양괴사인자(tumor necrosis fiactor), 인슐린(insulin), 글루카곤(glucagon), 성장호르몬(growth hormone), 생식선자극호르몬(gonadotropin), 옥시토신(자궁수축호르몬, oxytocin), 갑상선 자극호르몬(thyroid stimulating hormone), 부갑상선호르몬(parathyroid hormone), 칼시토닌(calcitonin), 콜로니 촉진 인자(colony stimulation factor), 에리쓰로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietion), 인슐린양 성장인자(insulin-line growth factor), 상피세포 성장인자(epidermal growth factor), 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor), 형질전환 성장인자(transforming growth factor), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor) 또는 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)을 포함할 수 있다. 상기 골 형성 단백질은 BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 제1 약학적 활성 조성물 및 제2 약학적 활성 조성물은 동일한 것이거나, 동일하지 않을 수 있고, 제1 약학적 활성 조성물 및 제2 약학적 활성 조성물은 특정 병리 상태에 대해 상승적 효과를 나타낼 수 있는 서로 다른 물질일 수 있으나, 그에 한정되는 것은 아니다.

용어 "생분해성 고분자(biodegradable polymer)"('생체 적합성' 또는 '생체 흡수성'과 호환적으로 사용됨)는 생체 내에서 흡수될 수 있는 임의의 물질을 의미할 수 있다. 생분해성 물질은 생체내에서 화학적으로 분해되거나, 또는 화학적으로 분해될 필요는 없지만, 약물의 정상적인 생체내 수명보다 상당히 긴 기간 동안 약물의 치료 효과량을 방출할 수 있는 방식으로 생체내에서 분산되거나 용해되거나 또는 분해되는 물질을 포함할 수 있다. 생분해성 물질은 생체 내에서 분해될 수 있는 무독성 고분자라면 모두 사용할 수 있는데, 예로는 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 그들의 공중합체 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생분해성 물질은 단일 중합체 또는 공중합체, 또는 중합체들의 임의의 조합 또는 블렌드일 수 있다. 생분해성 중합체 물질의 예는 분해시 생리학적으로 허용되는 분해 생성물을 생성하는 에스터, 에테르, 무수물, 아마이드, 또는 오르쏘에스터와 같은 단량체로 이루어지는 중합체를 포함할 수 있다. 중합체 물질은 가교 결합되거나 비-가교 결합될 수 있다. 가교 결합되는 경우, 이들은 약하게 예를 들면, 5% 또는 1% 미만으로 가교 결합될 수 있다.

또한, 상기 제2 약학적 활성 물질은 하이드로겔(hydrogel)에 포함된 것, 즉 하이드로겔 매트릭스 상에 존재하는 것일 수 있다. 상기 하이드로겔은 가교 결합되거나 비-가교 결합될 수 있으며, 가교 결합되는 경우 약 40% 미만으로 가교 결합될 수 있다.

용어 "하이드로겔(hydrogel)"은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어져 만들어진 3차원 망상구조물을 의미할 수 있다. 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 및 수성환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤하지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는 성질을 가지고 있다. 따라서 구성성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로겔이 만들어질 수 있으며 일반적으로 다량의 수분을 함유하고 있으므로 액체와 고체의 중간성질을 갖는 것일 수 있다.

하이드로겔의 제조 방법은 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 이온 가교(ionic cross-linking), 공유 가교(covalent cross-linking), 광 가교(photo cross-linking) 또는 세포 가교(cell cross-linking)로 하이드로겔을 제조할 수 있다. 이온 가교는 고분자 수용액과 2가 양이온 수용액의 혼합으로 생성될 수 있다. 2가 양이온은 예를 들면, Ca^{2 +}일 수 있고, 염화칼슘, 황산칼슘, 또는 탄산칼슘 등을 포함할 수 있다. 공유 결합을 이용한 가교는 이온 결합을 이용한 가교보다 높은 물성을 가진 하이드로겔을 형성할 수 있다. 예를 들면 다양한 분자량의 PEG-디아민을 가교제로 사용할 수 있다. 광 가교는 인 시추(in situ)로 겔을 형성할 수 있는 방법으로 특정 파장의 자외선에 노출시켜 하이드로겔을 제조할 수 있다. 세포 가교는 세포 자체가 가교제 역할을 하는 가교법으로, 예를 들면 RGD(arginine-glycine-aspartic acid) 펩티드를 고분자 주사슬에 도입하여 특이적인 상호작용을 유발시킴으로써 하이드로겔을 형성할 수 있다.

상기 하이드로겔은 예를 들면, 천연 하이드로겔 또는 합성 하이드로겔일 수 있으며, 더욱 상세하게는 칼슘 알지네이트, 알긴산, 히알루론산(hyaluronic acid), 실크(silk), 케라틴(keratin), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 엘라스터(elaster), 셀룰로오스(cellulose), 또는 키토산(chitosa) 하이드로겔을 포함할 수 있다.

상기 고분자 생분해성 미립자는 공지된 방법에 의해 제조된 것일 수 있다. 예를 들면, 유제를 통한 용매증발/추출 또는 용매 분해 방법, 분무 건조에 의한 방법 또는 상분리에 의한 방법, 고분자 화합물, 약물 및 분산용매를 포함하는 O/W(oil-in-water)형, O/O(oil-in-oil)형 또는 W/O/W(water-in oil-in-water)형 유제를 제조하고, 이를 미립자로 응집시키는 방법, 고분자 화합물, 약물을 포함한 유기용매를 가열된 공기 중에 분무하여, 고분자를 고화시켜 미립자로 응집시키는 방법 또는 고분자 화합물, 약물을 포함한 유기용매에 비용매를 첨가하여 상분리를 유도하고, 이를 추가적인 비용매에 옮기어 고분자를 고화시켜 미립자로 응집시키는 방법에 의해서 고분자 미립자를 제조할 수 있다.

고분자 미립자의 제조 방법 중, 유제를 제조하여 이를 고분자 미립자로 응집시키는 방법으로 제조하기 위하여 우선 고분자 화합물, 약물 및 분산용매를 포함하는 O/W형, O/O형 또는 W/O/W형 유제를 제조한다. 유제의 제조는 당업계에 공지된 통상적인 방법이 이용될 수 있으며, 보다 구체적으로, O/W형 또는 O/O형 유제의 제조를 위해서는 고분자 화합물 및 약물을 포함하는 분산상을 분산용매에 첨가하여 제조할 수 있으며, W/O/W형 유제의 제조를 위해서는 약물이 녹아있는 수용액을 고분자 화합물이 녹아있는 용매에 유화시켜 W/O형 유제를 만든 후 이를 다시 분산용매에 첨가하여 W/O/W형 유제를 제조할 수 있다.

다른 양상은 상기 미립자를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.

상기 약물 전달체는 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 pH 조절제를 포함할 수 있다. 상기 약물 전달체는 주사제의 형태일 수 있으며, 미립자들은 매우 작기 때문에, 이들은 약 25 게이지 내지 30 게이지와 같이 매우 작은 바늘을 통해 전달될 수 있다. 작은 바늘의 사용은 바늘로 인한 심각한 부작용의 위험을 줄일 수 있다.

다른 양상은 상기 속이 비어있는 다공성 생분해성 고분자 미립자를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 생분해성 고분자 및 제1 약학적 활성 물질을 유기 용매에 용해시켜 제1 약학적 활성 물질을 함유한 고분자 용액을 제조하여 분산상을 제조하는 단계; 상기 분산상에 기공 형성제(pore forming agent)를 첨가하여 O/W(oil-inwater)형, O/O(oil-in-oil)형 또는 W/O/W(water-in oil-in-water)형 유제를 제조하는 단계; 상기 O/W(oil-inwater)형, O/O(oil-in-oil)형 또는 W/O/W(water-in oil-in-water)형 유제를 제2 약학적 활성 물질을 포함하는 하이드로겔에 침지시키는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 방법은 생분해성 고분자 및 제1 약학적 활성 물질을 유기 용매에 용해시켜 제1 약학적 활성 물질을 함유한 고분자 용액을 제조하는 단계; 상기 고분자 용액에 기공 형성제(pore forming agent)를 첨가하여 W/O(water in oil) 에멀젼을 제조하는 단계; 상기 W/O 에멀젼을 에멀젼 안정화제 용액에 첨가하여 W/O/W(water in oil in water) 에멀젼을 제조하는 단계; 및 상기 W/O/W 에멀젼을 제2 약학적 활성 물질을 포함하는 하이드로겔에 침지시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 생분해성 고분자, 약학적 활성 물질, 및 미립자에 대해서는 상기한 바와 같다.

본 발명의 "분산상"은 고분자 화합물 및 약물이 유기용매에 녹아 혼합되어 있는 것을 의미할 수 있다

상기 속이 비어있는 다공성 생분해성 고분자 미립자를 제조하는 방법은 생분해성 고분자 및 제1 약학적 활성 물질을 유기 용매에 용해시켜 제1 약학적 활성 물질을 함유한 고분자 용액을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 생분해성 고분자는 유기 용매에 대해 1 내지 20 중량%로 첨가되는 것일 수 있고, 상기 제1 약학적 활성 물질은 생분해성 고분자에 대해 0.1 내지 10 중량%로 첨가되는 것일 수 있다. 또한, 상기 단계 (1)의 유기 용매는 사용되는 고분자의 종류에 따라 달라질 수 있지만, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 사염화탄소, 아세톤, 다이옥산, 테트라하이드로퓨란, 또는 헥사플루오로 아이소프로판올 등을 포함할 수 있다.

상기 속이 비어있는 다공성 생분해성 고분자 미립자를 제조하는 방법은 상기 고분자 용액에 기공 형성제를 첨가하여 W/O 에멀젼을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 첨가되는 상기 기공 형성제(Sucrose Solution) 는 수크로오즈와 DW(증류수)의 비율이 약 0.3 g/ml 내지 약 3 g/ml, 예를 들면 O.5 내지 1.5 g/ml, 0.8 내지 1.5 g/ml, 또는 1.2 g/ml (7.2 g/ml)의 농도로 첨가될 수 있다. 상기 기공 형성제 예를 들면 수크로오스(sucrose)일 수 있다. 상기 W/O 에멀젼을 제조하는 단계는 상기 기공 형성제를 첨가한 후에, 약 100 내지 2,500 rpm에서 10초 내지 5분간 교반을 수행하여 제조되는 것일 수 있다.

상기 속이 비어있는 다공성 생분해성 고분자 미립자를 제조하는 방법은 상기 W/O 에멀젼을 에멀젼 안정화제 용액에 첨가하여 W/O/W 에멀젼을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 에멀젼 안정화제는 입자의 형성을 용이하게 하기 위한 것으로 0.3%(w/v) 내지 5.0%(w/v)의 농도로 첨가되는 것일 수 있다. 에멀젼 안정화제의 예로는 수성 분산용매 또는 비수성 분산용매를 포함하며, O/W형 및 W/O/W형 유제 제조시에는 수성 분산용매가, O/O형 유제 제조시에는 비수성 분산용매가 사용될 수 있다. 수성 분산용매로는 친수성 유화제, 예를 들어 폴리비닐 알코올, 폴록사머, 폴리에틸렌글리콜 및 폴리소베이트(Polysorbate) 계열(예를 들면 폴리소베이트 20, 폴리소베이트 60, 폴리소베이트 65, 폴리소베이트 80, 폴리소베이트 85)과 같은 유화제를 함유하는 수용액 또는 이의 공용매를 사용할 수 있다. 비수성 분산용매로는 친유성 유화제, 예를 들어 글리세린지방산에스터(Glycerin Esters of Fatty Acids), 레시틴(lecithin)과 같은 유화제를 함유하는 실리콘 오일, 야채 기름, 톨루엔 또는 자일렌을 사용할 수 있다.

상기 W/O/W 에멀젼을 제조하는 단계는 상기 에멀젼 안정화제를 첨가한 후에, 상기 유기 용매를 증발시키고 원심분리에 의해 미립자를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 속이 비어있는 다공성 생분해성 고분자 미립자를 제조하는 방법은 상기 W/O/W 에멀젼을 제2 약학적 활성 물질을 포함하는 용액에 침지시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제2 약학적 활성 물질을 담지하는 단계는 제2 약학적 활성 물질을 하이드로겔에 포함시켜 담지하는 것일 수 있다. 하이드로겔에 대해서는 상기한 바와 같다. 또한, 상기 하이드로겔의 농도는 약 10 mg/ml 내지 약 500 mg/ml, 약 10 mg/ml 내지 약 400 mg/ml, 약 10 mg/ml 내지 약 350 mg/ml, 약 10 mg/ml 내지 약 300 mg/ml, 또는 약 20 mg/ml 내지 약 250 mg/ml일 수 있다. 제2 약학적 활성 물질/하이드로겔 혼합물에 상기 W/O/W 에멀젼을 침지함으로써, 다공성 생분해성 고분자 미립자를 제조할 수 있다.

또한, 상기 단계는 침지한 후에, 초음파 처리 또는 감압 등의 과정을 수행하고, 약 1,000 rpm 내지 30,000 rpm 으로 약 1분 내지 1시간 동안 원심 분리하여, 미립자를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 추가적으로 미립자를 원심 분리에 의해 분리한 후에, 동결 건조 등의 건조 과정을 수행하여 미립자를 제조할 수 있다.

일 구체예에 따른 다공성 생분해성 고분자 미립자에 의하면, 화학적 처리 없이 하이드로겔의 농도를 조절함으로써, 초기 방출이 크지 않으며, 두 가지 약물을 일정한 양으로 오랜 지속시간 동안 동시 방출이 가능하다.

일 구체예에 따른 다공성 생분해성 고분자 미립자의 제조방법에 의하면 화학적 결합이나 유기 용매에 의한 약물의 손상 및 변성을 방지할 수 있고, 원하는 약물의 양을 효율적으로 담지할 수 있다.

도 1은 일구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 수크로오스 양에 따른 주사 전자 현미경 사진을 나타낸 도면이다; (a,f) 0g, (b,g) 1.8g, (c,h) 3.6g, (d,i) 7.2g, (e,j) 14g, 위: 표면 형태, 아래: 단면.
도 2는 일구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 덱사메타손 양에 따른 주사 전자 현미경 사진을 나타낸 도면이다; (a,e,f) 0g, (b,f,j) 5 mg, (c,g,k) 10 mg, (d,h,l) 20mg.
도 3은 일구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 콜라겐 양에 따른 주사 전자 현미경 사진을 나타낸 도면이다; (a,e) 0.025% ; (b,f) 0.5%; (c,g) 10%; (d,h) 20%
도 4는 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 수크로오스 양에 따른 크기 분산 및 다공성을 그래프로 나타낸 도면이다.
도 5는 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 폴리비닐 알코올에 따른 크기 분산 및 다공성을 그래프로 나타낸 도면이다.
도 6은 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 수크로오스 양에 따른 수분 흡수율 그래프로 나타낸 도면이다.
도 7은 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 덱사메타손 농도에 따른 FT-IR 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 콜라겐 농도에 따른 덱사메타손 및 BMP2 방출 프로파일을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 이중 약물 전달용 다공성 생분해성 미립자의 제조

1. 덱사메타손이 담지된 다공성 생분해성 고분자 미립자의 제조

속이 비어있는 다공성 생분해성 고분자 미립자를 제조하기 위해 W/O/W(water-in-oil-in-water) 용매 증발 기법을 사용하였다.

구체적으로, 각각 0mg, 5mg, 10mg, 및 20mg의 덱사메타손(Dexamethasome) 및 500mg의 PLGA를 함유하는 30ml의 염화 메틸렌(methylene chloride, MC)에 서로 다른 양의 수크로오스(sucrose)(0, 1.8, 3.6, 7.2, 14g)을 함유하는 탈염수(deionized water) 6 ml를 첨가하였다. 이후, Powergen 700 homogenizer를 사용하여 1,500 rpm에서 약 3분 동안 균질화 시켜 유중수형(water in oil, W/O) 에멀젼을 제조하였다. 상기 제조된 유중수형 에멀젼에 에멀젼 안정화제로 각각 0.6%(w/v), 1.25%(w/v), 2.5%(w/v) 폴리비닐알코올(PVA) 용액 300ml에 첨가하였다. 이후 200rpm에서 4시간 동안 교반하면서 다시 에멀젼화시켜 W/O/W(water in oil in water) 에멀젼을 제조하였다. 상기 제조된 수중유형 에멀젼의 메틸렌클로라이드를 증발시키고, 원심분리에 의해 분리하였다. 이후, 증류수로 200 rpm에서 6시간 동안 세척한 다음 동결건조 하여 최종적으로 덱사메타손이 담지된 속이 비어 있는 다공성 생분해성 고분자 미립자를 제조하였다.

2. 덱사메타손 및 BMP2 가 담지된 다공성 생분해성 고분자 미립자의 제조

상기 실시예 1의 1에서 제조한 미립자에 BMP2을 추가적으로 담지하여 이중 약물 전달체를 제조하였다.

구체적으로, 콜라겐 타입 I 용액(0.025g/ml, 0.05g/ml, 0.1g/ml, 0.2g/ml)을 37℃에서 2000 rpm에서 1시간 동안 교반한 후에, BMP-2(100ng/ml)를 첨가하여, BMP-2를 포함하는 콜라겐 하이드로겔을 제조하였다. 상기 실시예 1의 1에서 제조한 미립자에 상기 BMP-2를 포함하는 콜라겐 하이드로겔을 캡슐화하기 위해, 500 mg의 미립자를 5ml의 콜라겐/BMP2 혼합물을 침지시키고, 5분 동안 초음파 처리하였다. 이후 덱사메타손 및 BMP2가 담지된 미립자를 원심분리(16,000 rpm, 20분)에 의해 분리하였고, 탈염수로 3번 세척하여 초과의 콜라겐/BMP2 혼합물을 제거하였다. 이후, 2일 동안 동결 건조하여 최종적으로 덱사메타손 및 BMP2가 담지된 다공성 생분해성 고분자 미립자를 제조하였다.

실시예 2: 이중 약물 전달용 다공성 생분해성 미립자의 특성 분석

1. 형태 분석

상기 실시예 1의 1 및 2에서 제조한 미립자의 덱사메타손 및 수크로오스의 양에 따른 형태를 분석하였다.

구체적으로, 각 시료를 액체 질소로 동결시키고 수술용 날로 절편을 만들었다. 이후, 금/팔라듐을 박막 코팅하고, 탄소 테이프를 사용하여 알루미늄 스텁(stub)에 장착하고, 주사 전자 현미경(SEM; Jeol 6400-LINK AN 10000 at 10 KV)으로 관찰하였고, 그를 도 1 내지 3에 나타내었다.

도 1은 일구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 수크로오스 양에 따른 주사 전자 현미경 사진을 나타낸 도면이다; (a,f) 0g, (b,g) 1.8g, (c,h) 3.6g, (d,i) 7.2g, (e,j) 14g, 위: 표면 형태, 아래: 단면. 도 1에 나타낸 바와 같이, 수크로오스를 일정량 첨가한 미립자에서 속이 비어있는 다공성 생분해성 미립자가 형성됨을 알 수 있다.

도 2는 일구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 덱사메타손 양에 따른 주사 전자 현미경 사진을 나타낸 도면이다; (a,e,f) 0g, (b,f,j) 5 mg, (c,g,k) 10 mg, (d,h,l) 20mg. 도 2에 나타낸 바와 같이, 5mg의 덱사메타손을 도입하여도 덱사메타손을 도입하지 않은 미립자와 형태적으로 큰 차이를 보이지 않음을 확인할 수 있다.

도 3은 일구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 콜라겐 양에 따른 주사 전자 현미경 사진을 나타낸 도면이다; (a,e) 0.025% ; (b,f) 0.5%; (c,g) 10%; (d,h) 20%. 도 3에 나타낸 바와 같이, 덱사메타손 및 BMP2를 포함하는 콜라겐 하이드로겔이 담지된 다공성 생분해성 미립자가 형성됨을 확인할 수 있다.

2. 크기 분산 및 다공성 분석

상기 실시예 1의 1 및 2에서 제조한 미립자의 수크로오스, 및 폴리비닐알코올의 양에 따른 크기 분산 및 다공성을 분석하였다.

구체적으로, 물에 상기 미립자를 현탁하고, 광학 현미경(Leica/Leitz DM RBE Microscope system, Leica Microsystems, Wetzlar,Germany)으로 이미지를 얻었다. 상기 이미지에 대해 이미지 소프트웨어(image J)를 사용하여 크기 분산 및 다공성을 분석하였다. 분석 결과는 도 4 및 5로 나타내었다.

도 4는 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 수크로오스 양에 따른 크기 분산 및 다공성을 그래프로 나타낸 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 미립자 제조방법으로 다공성이 조절 가능함을 확인할 수 있으며, 수크로오스의 농도가 7.2 g/6ml일 경우 직경의 크기가 400 내지 500 ㎛을 갖고, 다공성이 80% 이상임을 확인할 수 있다.

도 5는 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 폴리비닐 알코올에 따른 크기 분산 및 다공성을 그래프로 나타낸 도면이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 미립자 제조방법으로 PVA 용액의 농도를 조절함으로써 미립자의 입도, 즉 다공성이 조절 가능함을 확인할 수 있다.

3. 수분 흡수율 및 담지 효율 분석

상기 실시예 1의 1 및 2에서 제조한 미립자의 수크로오스 양에 따른 수분 흡수율 및 담지 효율을 분석하였다.

구체적으로 건조된 상기 미립자의 중량을 측정한 후에, 70% 에탄올에 침지시켰다. 이후, 탈염수로 세 번 세척한 후에, 포스페이트 버퍼 용액에서 12시간 동안 인큐베이션 시켰다. 미립자의 표면 상에 초과의 수분을 닦아낸 후에, 습윤 미립자의 중량을 측정하였다. 수분 흡수율은 다음과 같은 계산식으로 계산하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

식 중, Ww는 습윤 미립자의 중량이고, Wd는 건조 미립자의 중량이다.

도 6은 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 수크로오스 양에 따른 수분 흡수율 그래프로 나타낸 도면이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자는 수크로오스가 7.2g이 첨가된 시료에서 가장 높은 수분 흡수율을 나타내었다. 상기의 결과로 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자는 내부에 그 만큼 물을 많이 함유할 수 있어 내부의 공극이 크다는 것을 알 수 있다.

4. 덱사메타손 및 BMP2 방출 프로파일 분석

상기 실시예 1의 1에서 제조된 미립자 내에 덱사메타손이 존재하는지 여부를 확인하기 위하여, FT-IR(Fourier Transform Infra-Red Spectroscopy)방법을 수행하였다. 구체적으로 샘플을 분말화하고, KBr과 혼합한 후에, 펠렛팅(pelleting)을 수행하였다. FTIR 스펙트럼은 2 cm1의 해상도로 48 스캔으로 기록하였고(Shimadzu e IR prestige 21), 그 결과를 도 7에 나타내었다.

또한, 상기 실시예 1의 1에서 제조된 미립자의 덱사메타손 및 BMP2 방출 프로파일을 분석하기 위해 100 mg의 다공성 할로우 미립자를 사용하였고, 블랭크(blank) PLGA 미립자를 대조군으로 사용하였다. 구체적으로, 상기 미립자를 1 ml PBS에 넣고, 오비탈 진탕기(orbital shaker)에 두었다. 상이한 시간 간격으로 PBS 채취 후 동결시키고, 1 ml의 PBS를 보충하였고, BMP2의 농도는 ELISA KIT을 사용하여 분석하였다. 덱사메타손의 방출 농도를 결정하기 위해 상기와 유사하게, 미립자를 2 ml의 PBS (pH7.4)에 첨가하였다. 담지된 덱사메타손의 초기 농도는 235 nm에서 자외선 분광기(UV spectrophotometer)를 사용하여 정량화하였고, 방출된 덱사메타손의 양은 242 nm에서 자외선 분광기를 사용하여 결정하였다. 담지 효율 (%)은 초기 양에 대한 덱사메타손의 담지된 양의 비율로 결정하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 7은 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 덱사메타손 농도에 따른 FT-IR 실험 결과를 나타낸 도면이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자에는 덱사메타손이 유의적인 양으로 포함될 수 있음을 확인할 수 있었다.

도 8은 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자의 콜라겐 농도에 따른 덱사메타손(도 8의 좌측) 및 BMP2(도 8의 우측)의 방출 프로파일을 나타낸 그래프이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 다공성 생분해성 미립자는 콜라겐 하이드로겔의 농도가 증가할수록 덱사메타손 및 BMP2의 초기 방출이 크지 않으며, 일정한 양으로 오랜 지속 시간 동안 방출됨을 확인할 수 있었다.

Claims (15)

1. 속이 비어있는(hollow) 다공성 생분해성 고분자 미립자로서,
   상기 미립자는,
   기공을 갖는 외부 표면에 제1 약학적 활성 물질이 담지되고; 및
   내부의 빈 공간에 제2 약학적 활성 물질을 포함하는 하이드로겔이 담지된 것인 약물 전달을 위한 미립자.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 미립자는 100 내지 1000 ㎛의 직경을 갖고, 상기 기공은 2 내지 80 ㎛의 직경을 갖는 것인 미립자.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 내부의 빈 공간의 직경은 300 내지 400 ㎛인 것인 미립자.
4. 청구항 1에 있어서, 제1 약학적 활성 물질 및 제2 약학적 활성 물질은 독립적으로 덱사메타손(dexamethasone), 프로게스테론(progesterone) 할로페리돌(haloperidol), 티오틱센(thiothixene), 올란자핀(olanzapine), 클로자핀(clozapine), 브롬페리돌(bromperidol), 피모자이드(pimozide), 리스페리돈(risperidone), 지프라시돈(ziprasidone), 디아제프마(diazepma), 에틸 로플라제페이트(ethyl loflazepate), 알프라졸람(alprazolam), 네모나프라이드(nemonapride), 플루옥세틴(fluoxetine), 세르트랄린(sertraline), 베늘라팍신(venlafaxine), 도네페질(donepezil), 타크린(tacrine), 갈란타민(galantamine), 리바스티그민(rivastigmine), 셀레길린(selegiline), 로피니롤(ropinirole), 페르골리드(pergolide), 트리헥시페니딜(trihexyphenidyl), 브로모크립틴(bromocriptine), 벤즈트로핀(benztropine), 콜치킨(colchicine), 노르다제팜(nordazepam), 에티졸람(etizolam), 브로마제팜(bromazepam), 클로티아제팜(clotiazepam), 멕사졸룸(mexazolum), 부스피론(buspirone), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 소마토트로핀(somatotropin), 루프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate), 옥트레오티드(octreotide), 세트로렐릭스(cetrorelix), 산도스타틴 아세테이트(sandostatin acetate), 고나도트로핀(gonadotropin), 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 미조리빈(mizoribine), 사이클로스포린(cyclosporin), 타크롤리무스(tacrolimus), 날록손(naloxone), 날트렉손(naltrexone), 클라드리빈(cladribine), 클람부실(chlorambucil), 트레티노인(tretinoin), 카르무시틴(carmusitne), 아나그렐리드(anagrelide), 독소루비신(doxorubicin), 아나스트로졸(anastrozole), 이다루비신(idarubicin), 시스플라틴(cisplatin), 닥티노마이신(dactinomycin), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 랄티트렉세드(raltitrexed), 에피루비신(epirubicin), 레트로졸(letrozole), 메플로퀸(mefloquine), 프리마퀸(primaquine), 옥시부티닌(oxybutynin), 톨트레로딘(toltrerodine), 알릴에스트레놀(allylestrenol), 로보스타틴(lovostatin), 심바스타틴(simvastatin), 프로바스타틴(provastatin), 아트로바스타틴(atrovastatin), 알렌드로네이트(alendronate), 살카토닌(salcatonin), 랄록시펜(raloxifene), 옥사드롤론(oxadrolone), 콘쥬게이티드 에스트로겐(conjugated estrogen), 에스트라디올(estradiol), 에스트라디올 발러레이트(estradiol valerate), 에스트라디올 벤조에이트(estradiol benzoate), 에티닐 에스트라디올(ethinylestradiol), 에토노게스트렐(etonogestrel), 레보노르게스트렐(levonorgestrel), 티볼론(tibolone), 노르에티스테론(norethisterone), 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), 종양괴사인자(tumor necrosis fiactor), 인슐린(insulin), 글루카곤(glucagon), 성장호르몬(growth hormone), 생식선자극호르몬(gonadotropin), 옥시토신(자궁수축호르몬, oxytocin), 갑상선 자극호르몬(thyroid stimulating hormone), 부갑상선호르몬(parathyroid hormone), 칼시토닌(calcitonin), 콜로니 촉진 인자(colony stimulation factor), 에리쓰로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietion), 인슐린양 성장인자(insulin-line growth factor), 상피세포 성장인자(epidermal growth factor), 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor), 형질전환 성장인자(transforming growth factor), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor) 또는 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)인 미립자.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 약학적 활성 물질은 덱사메타손이고, 상기 제2 약학적 활성 물질은 골 형성 단백질인 것인 미립자.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 골 형성 단백질은 BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 미립자.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 생흡수성 고분자는 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 그들의 공중합체 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 미립자.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔은 칼슘 알지네이트, 알긴산, 히알루론산(hyaluronic acid), 실크(silk), 케라틴(keratin), 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 엘라스터(elaster), 셀룰로오스(cellulose), 또는 키토산(chitosa) 하이드로겔인 것인 미립자.
9. 청구항 1의 미립자를 포함하는 약물 전달용 조성물.
10. 생분해성 고분자 및 제1 약학적 활성 물질을 유기 용매에 용해시켜 제1 약학적 활성 물질을 함유한 고분자 용액을 제조하는 단계;
    상기 고분자 용액에 기공 형성제(pore forming agent)를 첨가하여 W/O(water in oil) 에멀젼을 제조하는 단계;
    상기 W/O 에멀젼을 에멀젼 안정화제 용액에 첨가하여 W/O/W(water in oil in water) 에멀젼을 제조하는 단계; 및
    상기 W/O/W 에멀젼을 제2 약학적 활성 물질을 포함하는 하이드로겔에 침지시키는 단계를 포함하는 속이 비어있는 다공성 생분해성 고분자 미립자를 제조하는 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 유기 용매에 대해 1 내지 20 중량%로 첨가되는 것인 방법.
12. 청구항 10에 있어서, 상기 제1 약학적 활성 물질은 생분해성 고분자에 대해 0.1 내지 10 중량%로 첨가되는 것인 방법.
13. 청구항 10에 있어서, 상기 기공 형성제는 0.3 mg/ml 내지 3mg/ml의 농도로 첨가되는 것인 방법.
14. 청구항 10에 있어서, 상기 에멀젼 안정화제는 0.3%(w/v) 내지 5.0%(w/v)의 농도로 첨가되는 것인 방법.
15. 청구항 10에 있어서, 상기 제2 약학적 활성 물질을 포함하는 하이드로겔의 농도는 10 mg/ml 내지 500 mg/ml 인 것인 방법.

Images