KR20160082823A

KR20160082823A - 마치현 및 금전초 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환 예방 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20160082823A
Application number: KR1020140192330A
Authority: KR
Inventors: 오홍근; 강양규; 이학용; 문대인; 박영미; 김영필; 박연주; 박상훈; 이봉근; 김옥진; 손민우
Original assignee: (주)휴벳
Priority date: 2014-12-29
Filing date: 2014-12-29
Publication date: 2016-07-11

Abstract

본 발명은 마치현(Portulaca oleracea) 추출물과 금전초(Glechoma hederacea) 추출물을 혼합한 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물, 약학 조성물 및 구강청결제 조성물에 관한 것이다.

Description

마치현 및 금전초 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환 예방 또는 개선용 조성물{Composition for preventing or improving periodontal disease comprising mixture of Portulaca oleracea and Glechoma hederacea extracts as effective component}

마치현(Portulaca oleracea) 및 금전초(Glechoma hederacea)는 전통의학에서 치료용 약제로서, 마치현의 경우 피부 내 항염제 및 설사, 세균성 이질 등에 사용되었으며 금전초는 주로 천식과 같은 염증의 완화를 목적으로 사용되었다. 최근 이러한 전통약재 추출물들의 생체 내 약물 작용기전에 대한 많은 연구가 이뤄지고 있다. 마치현 성분 중 베타시아닌(betacyanin) 및 다당류(polysaccharide)는 각각 노화에 의한 인식장애 증상과 피로감을 완화시키며, 마치현 에탄올 추출물(Portulaca oleracea ethanol extract; POEE)은 섬유아세포에서 UV에 의한 세포독성을 억제시킨다고 보고된 바 있다. 금전초 에탄올 추출물(Glechoma hederacea ethanol extract; GHEE)은 HepG2 세포 내 NF-κB의 활성을 억제하며, 또한 대식세포 내 LPS에 의한 NO(nitric oxide)의 생성을 억제하는 기능이 보고되었다. 그러나 이들 추출물들의 치주 미생물에 대한 항균력 및 치주질환에서의 생리 활성에 대한 연구는 아직까지 이뤄지지 않고 있다.

치주염은 치주조직에서 발생하는 대표적 염증질환으로서, 치주조직 내 미생물의 이상증식 및 구강 내 환경변화와 같은 복합적인 요인에 의해 잇몸(gingiva) 및 치근막(periodontal ligament) 등의 연조직에서 최초 염증반응이 시작됨으로써 발병하는 것으로 알려져 있다. 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)는 이러한 치주염을 유발하는 대표적 그람양성 세균으로써, 주로 치태 및 치은열구에 서식하며 젖산(lactic acid) 생성과 같은 물질대사를 통해 병리적 활성을 갖는다.

한국공개특허 제1994-0011006호에는 황금추출물을 유효성분으로 하는 치주질환 예방 및 치료제 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2003-0032359호에는 유백피 추출물을 함유하는 치주질환 치료용 경구 약제조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 마치현 및 금전초 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환 예방 또는 개선용 조성물과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 마치현(Portulaca oleracea) 추출물과 금전초(Glechoma hederacea) 추출물을 혼합한 혼합 추출물이 치주염 억제에 현저한 효과를 보임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 마치현(Portulaca oleracea) 추출물과 금전초(Glechoma hederacea) 추출물을 혼합한 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 마치현(Portulaca oleracea) 추출물과 금전초(Glechoma hederacea) 추출물을 혼합한 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 마치현(Portulaca oleracea) 추출물과 금전초(Glechoma hederacea) 추출물을 혼합한 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 구강청결제 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 마치현(Portulaca oleracea) 추출물과 금전초(Glechoma hederacea) 추출물을 혼합한 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 치주염 및 염증반응을 억제하므로, 치주염과 같은 치주질환 예방 또는 개선용 조성물뿐만 아니라, 염증억제제로도 이용이 가능하다.

도 1의 (A)는 금전초 추출물(GHEE), 마치현 추출물(POEE)과 이들의 혼합 추출물의 농도별 처리에 따른 스트렙토코커스 뮤탄스 저해능을 비교한 그래프이다.
8:2 - 마치현 추출물 및 금전초 추출물을 8:2 비율로 혼합한 추출물 처리, 2:8 - 마치현 추출물 및 금전초 추출물을 2:8 비율로 혼합한 추출물 처리
도 1의 (B)는 인공치에 스트렙토마이신 뮤탄스 및 마치현 추출물(POEE) 처리 시 인공치아 내 생체막(biofilm) 형성 정도를 비교한 것이다.
Normal: 스트렙토마이신 뮤탄스 및 마치현 추출물 무처리구
도 2의 (A)는 LPS에 의한 세포 내 염증반응에서 마치현 추출물(POEE) 처리 시, 세포 내 MMP1, MMP8의 발현 정도를 비교한 것이다.
도 2의 (B)는 6주간 LPS 주입에 의해 치주염을 유발하면서, 마치현 및 금전초 혼합 추출물의 섭취 시 치주염 발생 정도를 임상 점수로 나타낸 것이다.
Normal: LPS 및 추출물 무처리구, Vehicle: LPS 처리구, PO: 마치현 추출물, GH: 금전초 추출물
도 3은 치주염이 유발된 각 실험군으로부터 혈액을 채취하여 혈액 내 해당 세포들의 수를 백혈구 전체 수를 기준으로 백분율로 환산하여 비교한 그래프이다.
(A) 호중구(NE), (B) 임파구(LY), (C) 단핵구(MO), (D)호산구(EO)
Normal - 무처리구, Control - LPS 처리구, 2:8 - LPS와 마치현 추출물 및 금전초 추출물을 2:8 비율로 혼합한 추출물 처리구, 5:5 - LPS와 마치현 추출물 및 금전초 추출물을 5:5 비율로 혼합한 추출물 처리구, 8:2 - LPS와 마치현 추출물 및 금전초 추출물을 8:2 비율로 혼합한 추출물 처리구

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 마치현(Portulaca oleracea) 추출물과 금전초(Glechoma hederacea) 추출물을 혼합한 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

용어 '치주질환(periodontal disease)'이란 흔히 풍치라고도 하는데, 병의 정도에 따라 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis)으로 나뉜다. 비교적 가볍고 회복이 빠른 형태의 치주질환으로 잇몸 즉, 연조직에만 국한된 형태를 치은염이라고 하고, 이러한 염증이 잇몸과 잇몸뼈 주변까지 진행된 경우를 치주염이라고 하는데, 상기 치주질환은 바람직하게는 치주염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 건강기능식품 조성물에서, 상기 마치현 또는 금전초 추출물은 건조된 마치현 또는 금전초의 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 이의 혼합 용매 추출물일 수 있고, 바람직하게는 건조된 마치현 또는 금전초의 에탄올 추출물일 수 있고, 구체적으로는 건조된 마치현 또는 금전초 0.8~1.2 kg에 80%(v/v) 에탄올 6~10 L 첨가한 후 60~80℃에서 2~4시간 동안 추출하고 여과하여 제조된 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 건강기능식품 조성물에서, 상기 혼합 추출물은 바람직하게는 마치현 에탄올 추출물과 금전초 에탄올 추출물을 7~9:1~3 부피비율로 혼합한 추출물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 마치현 에탄올 추출물과 금전초 에탄올 추출물을 8:2 부피비율로 혼합한 추출물일 수 있는데, 상기 배합비로 혼합한 혼합 추출물은 다른 배합비로 혼합한 혼합 추출물에 비해 정상군과 가장 유사한 수준으로 치주염을 억제할 수 있었다.

본 발명의 상기 혼합 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 혼합 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 혼합 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 혼합 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 혼합 추출물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 혼합 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 혼합 추출물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 혼합 추출물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 혼합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 혼합 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 혼합 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 혼합 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 구강청결제 조성물은 통상적으로 치약에 사용되는 성분들이 배합되어 제조된다. 예를 들어 침강 실리카, 실리카겔, 탄산칼슘, 함수알루미나, 피로인산나트륨, 제이인산칼슘 이수화물 등 연마제; 솔비톨, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜과 같은 습윤제; 라우릴 황산나트륨, 라우일 사르코시네이트 나트륨염, 도데셀벤젠설포네이트와 같은 계면활성제, 카복시메틸셀룰로오스, 카라기난, 폴리아크릴레이트와 같은 결합제; 사카린, 락토오스, 말토오스, 자일리톨, 아스파탐산, 스테비오사이드와 같은 감미료; 불화나트륨, 불화인산나트륨과 같은 불소화합물; 파라옥시안식향산메칠, 안식향산, 안식향산나트륨, 살리실산과 같은 미생물 오염 방지제; 향료; 색소; pH 조절제 등이 각기 단독 또는 2종 이상이 혼합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 마치현 및 금전초 에탄올 추출물 제조

실험에 사용된 마치현(Portulaca oleracea L.) 추출물과 금전초(Glechoma hederacea) 추출물은 건조된 시료 1 kg에 농도별 에탄올(0%, 25%, 50%, 80%, 100%) 8 L를 첨가하여 70℃에서 3시간 동안 추출한 후 상층액을 8 ㎛ 여과지에 여과하였다. 그 다음 78℃에서 진공 감압 농축하여 에탄올을 제거한 후 각 추출물별 건조중량을 측정한 증류수로 추출물의 농도가 동일하도록 희석하여 총 페놀 및 플라보노이드 함량 시험 물질로 사용하였고, 동물 실험 등 나머지 실험에서는 80% 에탄올 추출물을 사용하였다.

2. 실험동물

샘타코 바이오코리아(오산 한국)에서 SPF(Specific-pathogen free) 상태의 SD 랫트 6주령을 분양받아 실험에 사용하였다. 식이는 일반 고형사료(Samtako, Gyunggi, Korea)를 급여하였다. 본 실험은 원광대학교의 동물실험윤리규정을 준수하여 수행하였다(WKU14-69). 실험군은 정상군(Normal group), 대조군(치주염 유발 및 살린 처리), 그리고 치주염 유발 후 마치현 에탄올 추출물(POEE)과 금전초 에탄올 추출물(GHEE) 추출물의 혼합비에 따라 8:2, 5:5, 2:8 실험군으로 구분하여 군당 10~14마리씩 실험에 사용하였다. 각 실험군별 시료 투여는 POEE와 GHEE 간의 혼합물과 음수를 10주간 제공하였으며 대조군은 음용수를 제공하였다.

3. 스트렙토코커스 뮤탄스( S. mutans )에 대한 항균력 분석(minimum inhibitory concentration assay)

스트렙토코커스 뮤탄스(ATCC25175) 단일 균종을 BHI(brain heart infusion) 액상배양 배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하여 사용하였다(O.D=1). 금전초(1 ㎎/mL) 및 마치현(1 ㎎/mL) 추출물을 지정한 비율로 혼합하여 각 웰 당 100 ㎕로 농도별로 처리하고 다시 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 각 웰의 광학 밀도(흡광도=600 nm)를 측정함으로써 각 추출물들의 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 항균력을 측정하였다.

4. 인공치아 내 생체막(biofilm) 형성 분석

인공치(Endura, Shofu inc., kyoto, Japan)에 BHI 액체배지와 마치현 추출물을 첨가한 후 5×10⁵CFU/mL/dish가 되게 균을 도포하였다. 37℃ 배양기에서 24시간 배양 후 남은 액을 모두 제거하였다. 각각의 인공치에 증류수 1.5 mL씩 넣어서 세척한 뒤, 0.1%의 사프라닌으로 30초 동안 염색한 후 증류수에 두번 세척 후 사진 촬영을 시행하였다.

5. 웨스턴 블롯(Western blot)

치은섬유아세포(1×10⁶)에 마치현 추출물을 1시간 동안 전처리한 후에 LPS (20 ㎍/mL)를 처리하고 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 내 단백질은 Mammalian Protein Extraction Reagent(M-PER; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 분리 후 브래드포드법(Bradford method)을 사용하여 단백질을 정량하였다. 샘플(20 ㎍/well)은 10% 아크릴아미드와 함께 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 사용하여 분리하였고, Hybond™-polyvinylidene fluoride membranes(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 이동하였다. 각각의 멤브레인은 2% 소혈청 알부민 또는 5% 탈지유를 사용하여 2시간 동안 블록킹하였고, 일차 항체 처리 후 4℃ 냉장고에서 하룻밤 방치하였다. 이차 항체는 HRP-conjugated IgG(1:2000 dilution)를 사용하였다. 단백질 발현양은 이미지 분석기(Fuji-Film, Tokyo, Japan)를 사용하여 확인하였다.

6. 치주염 유발 및 임상점수 분석

치주염 유발은 총 10주간 진행되었다. 실험군은 xylazine(럼푼, 바이엘동물약품)과 Ketamine(케타민, 유한양행)을 1:3으로 혼합 후 0.4 mL/250 g 비율로 근육 주사하여 마취를 유도하였다. 대조군 및 POEE, GHEE 혼합 추출물 처리 실험군의 3개의 어금니 중 가운데 어금니 주위로 코튼 실을 묶어 치은열구 내로 삽입하여 미생물의 점착을 유도하였다. 치주염 유발 5주차부터 6주간 6차례에 걸쳐 LPS를 치은조직에 주사함으로써 염증 유발을 증폭시켰다. LPS 주사는 구강 전정(vestibular fornix)에서 치주쪽으로 LPS 3 ㎕(10 ㎍/㎕)를 주3회 2주간(총 6회, 180 ㎍ of LPS) 주사하였으며 대조군은 실험군의 LPS 주사량과 동일한 증류수를 주사하였다.

치주염 유발여부를 확인하기 위하여 LPS 투여 1주차부터 주 1회 간격으로 치아 주위 조직을 관찰하여 치은지수와 치태지수를 계산하여 점수화하였다. 치주질환 임상 점수는 치은점수(협면 중앙부, 원심 협면, 근심 협면, 설면 등을 관찰)와 치태지수(치태의 육안적인 두께를 관찰), 치은출혈(치간유두의 근심면과 원심면을 탐침하여 출혈 유무 및 양을 관찰), 치주낭 깊이(치아장축에 평행하여 치주낭의 기저부까지 삽입한 뒤 치은변연에서부터 깊이를 측정)를 평가하여 계산하였다. 각 군당 전체 치주염 임상점수는 개체별 점수의 평균치로 구하였으며, 치주질환 임상 점수에 대한 평가 기준은 표 1과 같다.

치주질환 임상 점수 평가 기준

점수	평가 기준
0	정상 치은. 치아가 부착되어 있지 않고 출혈이 없으며 치주낭의 깊이가 2 mm 미만인 경우
1	경한 염증. 경미한 색조변화와 가벼운 부종, 치주 탐침에 의한 출혈 성향이 크지 않고 치은변연에 부착된 치태가 확인되며 치주낭의 깊이가 2 mm 이상~3 mm 미만인 경우
2	중등도 염증. 발적, 부종, 치은의 색조 변화, 과량의 치태가 붙어있고 치간사이에는 치태가 부착되어 있지 않음. 또한 치주 탐침에 의한 출혈이 선상으로 유두끝에서 확산되고, 치주낭의 깊이가 3 mm 이상~5 mm 미만인 경우
3	중증 염증. 상당한 발적과 부종, 쉐양이 있으며 계속적인 출혈이 있고, 치은변연과 치간사이에 치태가 침착되어 있음. 치간 유두 전체에 출혈이 확산되고 치주낭의 깊이가 5 mm 이상인 경우

7. 일반 혈액학적 분석

치주염 유발 이후 혈액은 복대정맥에서 채혈하여 EDTA 튜브와 원뿔 튜브에 나눠 분석에 사용하였다. 혈액 분석은 혈액을 EDTA 튜브(DB Caribe, Ltd., USA)에 담아 롤 믹서에 약 30분 회전시킨 후 혈액분석기(Hemavet 950Fs, Drew scientific inc, TX, USA)를 이용하여 백혈구(WBC), 호중구(neutrophil), 임파구(lymphocyte), 단핵구(monocyte)를 측정하였다.

8. 통계분석

모든 분석결과의 통계적 유의성 검정에 따른 통계분석은 ANOVA(one-way analysis of variance test)를 실시한 후 유의성이 있는 경우, p<0.05일 때 Ducan's multiple range test로 사후 검정하였다.

실시예 1: 에탄올 농도별 추출에 따른 마치현 추출물과 금전초 추출물의 총 페놀 함량

추출 조건에 따른 마치현 추출물의 총 페놀 함량은 0%의 에탄올 추출물에서 2,988.27±42.95 mg/100 g, 25%의 에탄올 추출물에서 5,516.61±147.37 mg/100 g, 50%의 에탄올 추출물에서 7,128.23±239.05 mg/100 g, 80%의 에탄올 추출물에서 7,665.56±159.97 mg/100 g, 100%의 에탄올 추출물에서 12,348.18±202.43 mg/100 g으로 나타나 100% 에탄올 추출물에서 가장 높게 나타났다. 반면, 금전초 추출물은 0%의 에탄올 추출물에서 4,778.72±131.54 mg/100 g, 25%의 에탄올 추출물에서 5,952.29±80.54 mg/100 g, 50%의 에탄올 추출물에서 6,084.07±54.08 mg/100 g, 80%의 에탄올 추출물에서 16,557.96±215.72 mg/100 g으로 나타났으나 100%의 에탄올 추출물에서 12,153.94±209.71 mg/100 g으로 확인되어 80%의 에탄올 추출물에서 총 페놀함량이 가장 높게 조사되었다(표 2).

마치현과 금전초 추출물의 추출조건에 따른 총 페놀함량(mg/100 g)

에탄올 추출농도	마치현 추출물	금전초 추출물
0%	2988.27±42.95	4778.72±131.54
25%	5516.61±147.37	5952.29±80.54
50%	7128.23±239.05	6084.07±54.08
80%	7665.56±159.97	16557.96±215.72
100%	12348.18±202.43	12153.94±209.71

실시예 2: 에탄올 농도별 추출에 따른 마치현 추출물과 금전초 추출물의 총 플라보노이드 함량

추출 조건에 따른 마치현 추출물의 총 플라보노이드 함량은 0%의 에탄올 추출물에서 276.7±36.07 mg/100 g, 25%의 에탄올 추출물에서 316.57±28.56 mg/100 g, 50%의 에탄올 추출물에서 236.67±82.83 mg/100 g, 80%의 에탄올 추출물에서 263.37±27.04 mg/100 g으로 나타났으나 100%의 에탄올 추출물에서는 검출되지 않아 80%의 에탄올 추출물에서 총 페놀함량이 가장 높게 조사되었다. 반면, 금전초 추출물은 0%의 에탄올 추출물에서 1,268.81±13.93 mg/100 g, 25%의 에탄올 추출물에서 1,409.88±39.10 mg/100 g, 50%의 에탄올 추출물에서 1,673.8±163.66 mg/100 g, 80%의 에탄올 추출물에서 1,722.17±147.09 mg/100 g으로 나타났으나 100%의 에탄올 추출물에서 3,300.27±98.48 mg/100 g으로 확인되어 100%의 에탄올 추출물에서 총 페놀함량이 가장 높게 조사되었다(표 3).

마치현과 금전초 추출물의 추출조건에 따른 총 플라보노이드 함량(mg/100 g)

에탄올 추출농도	마치현 추출물	금전초 추출물
0%	276.70±36.07	1268.81±13.93
25%	316.57±28.56	1409.88±39.10
50%	236.67±82.83	1673.80±163.66
80%	263.37±27.04	1722.17±147.09
100%	ND	3300.27±98.48

실시예 3: 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 마치현 추출물과 금전초 추출물의 항균 효과

스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans)는 치은염 및 치주염을 유발하는 대표적 구강 내 미생물로서 치태 형성 시 최초 점착 후 다른 미생물들의 점착을 유도하는 것으로 잘 알려져 있다. 이렇게 생성된 치태 및 치석은 생체막(biofilm)을 형성함으로써 지속적으로 치주조직 내 염증반응을 유도하며 치주염을 유발한다. 마치현 및 금전초 추출물들의 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 직접적인 항균성을 분석하고자 MIC(minimal inhibitory concentration) 테스트 및 인공치아를 이용한 생체막 형성도를 측정하였다. 실험결과, 추출물 처리구와 무처리구는 스트렙토코커스 뮤탄스 성장도 및 생체막 형성에서 유의적 차이를 나타내지 않음이 확인되었다(도 1).

이러한 결과는 마치현 및 금전초 추출물 내 구성성분에는 스트렙토코커스 뮤탄스의 성장 및 생체막 형성 관련 기전을 억제하는 성분이 없음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 치주염 병리기전에서 마치현 추출물과 금전초 추출물의 활성 분석

치근 섬유아세포(Gingival fibroblast)는 치주조직 내 잇몸을 구성하는 대표적 세포로서 LPS 및 외부자극에 의해 세포 내 MMP1, MMP8(matrix metalloproteinase 1, 8)의 발현이 증가되고 세포염증 반응을 유도함이 보고된 바 있다. 이러한 세포 단위에서의 염증반응은 치주조직 내 연조직에서의 염증을 유발하고 이어 치주염을 유발하는 주원인으로, 마치현 추출물이 위 세포 내 MMP1, MMP8의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인함으로써 세포 단위에서의 치주염 유발에서의 활성을 분석하고자 하였다. 도 2의 (A)에서 보는 바와 같이, LPS에 의한 세포 내 염증반응에서 마치현 추출물(POEE) 처리에 의한 유의적인 차이를 나타내지 않음을 알 수 있었다.

다음으로, 치주염 발생에서 마치현 및 금전초 혼합 추출물의 섭취가 어떠한 영향을 미치는지 치주염 동물모델을 이용하여 확인하였다. 10주간 코튼실을 이용하여 미생물 점착을 유도하고 마지막 6주간 LPS를 잇몸조직에 직접 주사함으로써 염증반응을 극대화하였다. LPS 처리 6주 동안 치은조직 내 염증발생 정도를 표 1을 기준으로 임상점수를 체크함으로써 마치현 및 금전초 추출물의 섭취가 치주염 발생 정도에 미치는 영향을 비교 분석하였다. 실험결과, 대조군(치주염 유발, Vehicle)에서 LPS 주사 3주차부터 증가하기 시작하여 6주차까지 증가하는 결과에 비하여, 마치현과 금전초 혼합물을 섭취한 실험군에서는 4, 5, 6주차 염증의 정도가 크게 감소함을 나타내었다(도 2의 B). 또한, 8:2(마치현:금전초) 혼합물을 섭취한 실험군에서는 LPS 주사 후 3, 4주차에서 거의 정상군에 가까운 수치를 나타내었는데, 이는 마치현 추출물 내 성분들이 염증 억제에 보다 효과적임을 알 수 있었다. 위 결과들은 마치현 및 금전초 추출물이 세포 염증반응에는 직접적으로 영향을 미치지 않으며, 추출물들의 섭취에 의해서만 치주염 증상 억제 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 이는 추출물 내 특정성분이 치주조직 내 세포들에 직접적 영향이 아닌, 인체 내 염증반응 관련 다른 세포들에 영향을 가짐으로써 치주염 유발을 억제하고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 마치현 추출물과 금전초 추출물의 섭취에 따른 면역관련 혈액 세포의 변화

현재까지의 실시예 3 및 4의 결과는 마치현 추출물과 금전초 추출물의 섭취에 따른 효과로서 치주염의 염증 정도를 완화하고 있음을 제시하고 있다. 혈액 내에는 면역기능을 담당하는 백혈구 세포(white blood cell)가 존재하며 이러한 백혈구 세포에는 그 형태와 기능에 따라 단핵구(monocyte), 호중구(neutrophil), 임파구(lymphocyte), 호산구(eosinophil), 호염구(basophil) 5가지의 세포로 분류된다. 본 실험에서 마치현과 금전초 추출물의 섭취가 생체 내 면역기능을 담당하는 백혈구 내 각 세포의 수에 어떠한 변화가 유발되는지 확인하고자, 치주염이 유발된 각 실험군으로부터 혈액을 채취하여 혈액 내 해당 세포들의 수를 백혈구 전체 수를 기준으로 백분율로 환산하여 비교분석하였다.

실험결과, 호중구(NE)는 정상군(Normal)에서 30.03±1.13%, 대조군(Control)에서 41.70±1.03%, 마치현과 금전초 추출물 2:8 실험군에서 38.65±1.99%, 마치현과 금전초 추출물 5:5 실험군에서 33.33±2.43%, 마치현과 금전초 추출물 8:2 실험군에서 37.94±0.90%로 확인되었다. 또한 임파구(LY)는 정상군에서 65.50±1.07%, 대조군에서 55.08±1.12%, 마치현과 금전초 추출물 2:8 실험군에서 57.86±2.15%, 마치현과 금전초 추출물 5:5 실험군에서 62.28±2.29%, 마치현과 금전초 추출물 8:2 실험군에서 58.03±0.50%로 조사되었다. 단핵구(MO)는 정상군에서 3.56±0.25%, 대조군에서 2.45±0.34%, 마치현과 금전초 추출물 2:8 실험군에서 2.71±0.37%, 마치현과 금전초 추출물 5:5 실험군에서 3.36±0.31%, 마치현과 금전초 추출물 8:2 실험군에서 3.01±0.37%로, 호산구(EO)는 정상군에서 0.67±0.16%, 대조군에서 0.59±0.09%, 마치현과 금전초 추출물 2:8 실험군에서 0.64±0.13%, 마치현과 금전초 추출물 5:5 실험군에서 0.87±0.13%, 마치현과 금전초 추출물 8:2 실험군에서 0.77±0.26%로 나타났다(도 3). 반면 호염구(BA)의 경우 각 실험군별 유의적인 차이를 보이지 않았다(데이터 미제시).

최근 연구보고에 따르면 외부인자에 의한 초기 염증반응 시 정상 상태에 비교하여 혈액 내 호중구(NE)의 함량은 증가하고 임파구(LY)의 함량은 감소한다고 알려져 있다. 본 실험에서 혈액 내 호중구와 임파구의 함량(백분율)을 비교하여보면 정상군에 비해 대조군의 호중구는 급격히 증가하였으나 임파구는 현저히 감소된 것으로 확인되었다. 반면 마치현과 금전초 추출물을 배합하여 처리한 실험군의 경우 모두 대조군에 비해 호중구의 함량은 낮고 임파구의 함량은 높은 경향을 보였는데, 이 중 마치현과 금전초의 배합비가 5:5인 실험군이 타실험군과 비교하여 가장 정상군과 유사한 수준을 보이는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 마치현 및 금전초 추출물 섭취가 혈액 내 임파구와 호중구 함량을 변화시킴으로써 염증의 초기단계를 억제한다는 것을 나타내는데, 치주염 3주차부터 염증의 정도가 억제된다는 앞선 결과와 일치함을 알 수 있다. 마치현 및 금전초의 면역세포에의 영향은 비단 치주염뿐만 아니라 인체 내 다양한 염증반응을 조절할 수 있음을 나타낸다.

Claims

마치현(Portulaca oleracea) 추출물과 금전초(Glechoma hederacea) 추출물을 혼합한 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 이의 혼합 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 마치현 에탄올 추출물과 금전초 에탄올 추출물을 7~9:1~3 부피비율로 혼합한 추출물인 것을 특징으로 하는 치주질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
마치현(Portulaca oleracea) 추출물과 금전초(Glechoma hederacea) 추출물을 혼합한 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
마치현(Portulaca oleracea) 추출물과 금전초(Glechoma hederacea) 추출물을 혼합한 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 치주질환의 예방 또는 개선용 구강청결제 조성물.