WO2015182993A1 - 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2015182993A1
WO2015182993A1 PCT/KR2015/005316 KR2015005316W WO2015182993A1 WO 2015182993 A1 WO2015182993 A1 WO 2015182993A1 KR 2015005316 W KR2015005316 W KR 2015005316W WO 2015182993 A1 WO2015182993 A1 WO 2015182993A1
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WO
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beta
calcium gluconate
gluconate
composition
compared
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PCT/KR2015/005316
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English (en)
French (fr)
Inventor
성수현
구세광
정재준
이영준
조형래
문승배
Original Assignee
주식회사 아리바이오
주식회사 글루칸
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/047—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates having two or more hydroxy groups, e.g. sorbitol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans

Definitions

  • composition for preventing, ameliorating or treating periodontal disease
  • the present invention relates to a composition for preventing, ameliorating or treating periodontal disease.
  • Periodontal disease is a disease that causes bleeding from the gums due to chronic inflammation of the soft tissues and periodontal bones around the teeth, shaking the teeth, and eventually losing the teeth.
  • the treatment of periodontal disease has been used to establish improved oral hygiene, non-surgical or surgical calculus removal, root graft surgery, and periodontal tissue regeneration using gingival sopa.
  • the causative agents of forming dental plaques using antibiotics such as penicillin have been eliminated.
  • antibiotic-resistant bacteria due to antibiotic-resistant bacteria that occur during long-term use, the results have not been very effective.
  • nonsteroidal anti-inflammatory agents are widely used for the treatment of periodontal disease, the nonsteroidal anti-inflammatory agents have problems associated with side effects such as gastrointestinal hemorrhage, abdominal pain, headache and edema. Accordingly, there is a need for the development of safe treatments that can replace nonsteroidal anti-inflammatory drugs.
  • many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.
  • the present inventors have tried to develop a preventive and therapeutic agent for periodontal disease.
  • the beta-calcium gluconate-complex composition was administered to the animal model of periodontal disease, the combination effect of beta-calcium gluconate on the periodontal disease was synergistically increased. And the present invention has been completed.
  • an object of the present invention is a pharmaceutical for the prevention or treatment of periodontal disease There is provided a composition.
  • Another object of the present invention to provide a food composition for the prevention or improvement of periodontal disease.
  • Another object of the present invention to provide a quasi-drug composition for the prevention or improvement of periodontal disease.
  • Another object of the present invention to provide a use of beta- calcium gluconate and xyl for the preparation of the composition.
  • Another object of the present invention to provide a method for preventing, ameliorating or treating a major disease by administering the composition.
  • the present invention is a beta- glucan and calcium gluconate complex of beta- calcium gluconate; And it provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of periodontal disease, including xili as a biological activity enhancer of the beta- calcium gluconate.
  • the present inventors have tried to develop a preventive and therapeutic agent for periodontal disease. As a result, when the beta-gluconate and xylide complex composition was administered to the animal model of periodontal disease, the effective effect of beta-gluconate on periodontal disease was synergistically increased by the co-administration of xylide. .
  • beta-gluconate means a complex formulation comprising beta-glucan and calcium gluconate.
  • the beta glucan ( ⁇ -glucan) is a polymer of glucose extracted from microorganisms, grains, mushrooms, seaweed, yeast, and the like.
  • the beta glucan may be beta -1,3 / 1, 6-glucan.
  • the beta-1, 3/1, 6-glucan is a beta-1, 3 as a main chain
  • Branched water-soluble beta-glucan is a branched water-soluble beta-glucan per 1 molecule of beta ⁇ 1,6 bonds per 5 molecules of glucose linked by a bond, and the branched beta-1,3 and beta-1,6 bonds are common to each other.
  • These beta-1,3 / 1 , 6-glucans are Aureobasi dium For example, it can be obtained by culturing Aureobasi dium pullulans SM2001).
  • the calcium gluconate is a white crystalline or kernel-like powder that is a odorless and tasteless calcium salt enhancer, used as a calcium fortification in confectionery and tofu production, and is known to help prevent oxidation when added to oils and donuts. have.
  • the weight ratio of beta-glucan and gluconate in the complex formulation may be 0.5-10: 99.5-90. According to a more specific embodiment, the weight ratio of the beta-glucan and calcium gluconate is 1.5-5: 98.5-95, and in a more specific embodiment 1.5-3: 98.5-97.
  • One of the features of the present invention is that it contains a certain amount of xylyl as a bioactivity enhancer of beta-calcium gluconate.
  • xylyl when xylyl is administered in combination with calcium beta-gluconate, the physiological activity of calcium beta-gluconate such as anti-inflammatory, antibacterial and antioxidant effects is synergistically enhanced, and xyl or beta-glu The treatment of periodontal disease can be obtained better than the administration of calcium chorate alone.
  • the physiological activity of the beta-calcium gluconate is
  • Periodontal bone loss inhibiting (i) periodontal bone loss inhibiting, (ii) "bacterial activity within the gingival tissues of bacteria, (ii) the gingival tissue neutral hoseong leukocyte MPO (myeloperoxidase) generation inhibition, (iii) inflammatory cytokines gingival tissues (e.g., TNF-a, IL- ⁇ ) inhibition of production, (iv) antioxidant activity in gingival tissues (eg, inhibition of lipid peroxidation, inhibition of iNOS activity, inhibition of NO production, etc.), (V) inhibition of edema of gingival tissues, and (vi)
  • the salt cells may be selected from the group consisting of inhibition of infiltration into gingival tissue.
  • the weight ratio of the beta-calcium gluconate and xylyl may be 1: 0.1-3.9.
  • the weight ratio of the beta-calcium gluconate and xylyl is 1: 0.3-3.5, in a more specific embodiment 1: 0.3-3.0, in another more specific embodiment 1: 0.3-2.5, and In another more specific embodiment 1: 0. 5-2.0.
  • Periodontal diseases that can be prevented and treated by the present invention include, for example, periodontitis, gingivitis, stomatitis, peri-implantitis, periodontal bone loss, osteolysis (eg, titanium particles—induced osteolysis), peritonitis, periodontal pus and I can hear periodontitis.
  • prevention means any action that inhibits or delays the progression of periodontal disease by administration of a composition of the present invention
  • improvement and “treatment” are periodontal by administration of the composition It means any activity that improves or beneficially changes the symptoms caused by a disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in the preparation, lactose, textose, sucrose, sorbbi, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, 3 ⁇ 4 Latin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil Including, but not limited to.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, and a preservative in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a stearate, a stearate, a stearate, a stearate, a stearate, stevia, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, a glycerin, a glycerin, a glycerin, a glycerin, a stea stea stea stea stea stea stea stea ste
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction in response to the patient. It may be prescribed.
  • the dosage of calcium beta-gluconate and xyllet in the pharmaceutical composition of the present invention may be in the range of 0.001-10000 mg / kg on an adult basis.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be a solution, a suspension, a syrup or an oil or an aqueous medium. It may be in the form of an emulsion or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the present invention is a beta- glucan and calcium gluconate beta-calcium gluconate; And it provides a food composition for the prevention or improvement of periodontal disease, including xyl as a biological activity enhancer of the beta- calcium gluconate.
  • the food composition is not particularly limited to this, but all forms of health functional foods, nutritional supplements, nutritional supplements, pharmafood (healthfood), health food, nutraceutical (1 ( ⁇ ⁇ 611 31), designer food, food additives, etc.
  • Food products include, but are not limited to, dairy products including meat, sausages, breads, chocolates, candy, snacks, snacks, pizzas, ramen noodles, other noodles and 3 ⁇ 4 ice creams, various soups, drinks, teas, drinks, alcoholic beverages. And vitamin complexes.
  • the food composition of the present invention includes ingredients that are commonly added during food production, and may include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents.
  • carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose sucrose, oligosaccharides, and the like; And sugar alcohols such as polysaccharides such as conventional sugars such as textine and cyclodextrins, and sorbitol and erythritol.
  • flavoring agents natural flavoring agents [tauumatin, stevia extract (for example rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)] and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame dung) can be used.
  • the food composition of the present invention includes a variety of nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), dietary ingredients, synthetic flavors and natural flavors, such as flavoring agents, colorants and neutralizing agents (cheese, chocolate dung), pectic acid and its Salts, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks and the like.
  • the food composition of the present invention when the food composition of the present invention is prepared as a drink, in addition to beta-calcium gluconate and xyl, citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, and various plant extracts may be further included. .
  • the food of the present invention is very useful for the prevention and improvement of periodontal disease.
  • the present invention is a beta- glucan and calcium gluconate complex of beta- calcium gluconate; And it provides a quasi-drug composition for the prevention or improvement of periodontal disease, including xili as a physiological activity enhancer of the betty bovine gluconate.
  • Calcium beta gluconate and xylyl may be added to the quasi-drug composition for the purpose of preventing or ameliorating periodontal disease.
  • quasi-drug additives e.g. layer deterrents (sodium fluoride, sodium phosphate, amine fluoride, etc.), fungicides (chloronucidine, cetylpyridium chloride, triclosan, etc.)
  • additional anti-inflammatory agents e.g. layer deterrents (sodium fluoride, sodium phosphate, amine fluoride, etc.), fungicides (chloronucidine, cetylpyridium chloride, triclosan, etc.)
  • additional anti-inflammatory agents e.g. layer deterrents (sodium fluoride, sodium phosphate, amine fluoride, etc.), fungicides (chloronucidine, cetylpyridium chloride, triclosan, etc.)
  • additional anti-inflammatory agents allantoin, amino
  • the quasi-drug composition may further include any one or more substances selected from the group consisting of an abrasive, a humectant, a binder foam, a sweetener, a surfactant, a perfume, and a pigment, and the form of the composition may be in the form of a paste, a powder, or a liquid (a gargle). Form).
  • the quasi-drug composition may be a toothpaste, mouthwash (gagle), mouth protector, antiseptic cleaner or ointment.
  • the present invention provides a method for preventing, ameliorating or treating periodontal disease, comprising administering the composition to an individual in need thereof.
  • the present invention provides a method for enhancing the physiological activity of calcium beta-gluconate, comprising co-administering xylite with a beta-calcium gluconate to an individual in need thereof. have.
  • the subject is a mammal, including a human.
  • the combination administration may be simultaneous or sequentially.
  • the biological activity of the beta-calcium gluconate is as described above.
  • the present invention provides a composition for preventing, ameliorating or treating periodontal disease, including xyl, as a beta-calcium gluconate and a physiological activity enhancer of the beta-calcium gluconate.
  • composition of the present invention exhibits superior antibacterial, anti-inflammatory and antioxidant effects as compared to beta-calcium gluconate or xylitol alone, and thus can be usefully used for the prevention, improvement and treatment of periodontal disease.
  • A normal control rat
  • B EPD control rat
  • C indomethacin 5 mg / kg treated rat
  • D beta-gluconate single formulation 100 mg / kg: treated rat
  • E xili single formulation 100 mg / kg treated rats
  • F beta-gluconate bovine: xylitol 1: 0.5 mixed formulation (g / g) 100 mg / kg treated rats
  • G beta-calcium gluconate: xylitol 1: 1 mixed formulation (g / g) 100 mg / kg treated rats
  • H beta-calcium gluconate: xylitol 1: 2 mixed formulation (g / g) 100 mg / kg treated rats
  • 1 beta-calcium gluconate: 1: 4 mixed formulation g / g) 100 mg / kg treated rats.
  • a p K01 compared to the normal control by the test
  • b p ⁇ 0.01 compared to the EPD control by the MW test
  • c pO.01, compared to the beta-calcium gluconate single-formation administration group by the test.
  • d p ⁇ 0.01 compared to xyl by test VII compared to a single formulation dose group.
  • Figure 4 shows the viable cell count in the gingival tissue of normal rats and EPD 3 ⁇ 4.
  • a p ⁇ 0.01 compared to the normal control by the MW test
  • b p ⁇ 0.05 compared to the normal control by the MW test
  • c pO.01
  • d MW test compared to the EPD control by the test PO.01 compared to the beta-calcium gluconate single dosage group
  • e xyl by the test was compared to pO.01.
  • 5 shows the MP0 activity in the gingival tissue of normal rats and EPD rats.
  • a p ⁇ 0.01 compared to the normal control by the MW test
  • b p ⁇ 0.05 ⁇ compared to the normal control by the MW test
  • c p ⁇ 0.01 compared to the EPD control by the MW test
  • d P ⁇ 0.01 compared to the beta-calcium gluconate single-formulation group compared to the beta-calcium gluconate single-formulation group by the e: MW test, compared to the xyl by the p ⁇ 0.05
  • f ⁇ .01.
  • a p ⁇ 0.01 compared to the normal control group by the LSD test
  • b p ⁇ 0.01 compared to the EPD control group by the LSD test
  • c ⁇ ⁇ 0.01 compared to the beta-calcium gluconate single dosage form group by the LSD test.
  • d p ⁇ 0.05 compared to beta-calcium gluconate single formulation administration group by LSD test
  • e xyl by LSD test compared to single formulation administration group, ⁇ .01.
  • a pO.Ol compared to the normal control group by the Li test
  • b p ⁇ 0.01 compared to the EPD control by the MW test
  • d ⁇ ⁇ 0.05 compared with the beta-calcium gluconate single-dose group by the test
  • e xyl by the ⁇ -test compared to the single-formulation group
  • p ⁇ 0.01 f: xyl by the lia-test P ⁇ 0.05 compared with administration group.
  • Figure 8 shows the gingival tissue MDA levels in normal rats and EPD rats.
  • a p ⁇ 0.01 compared to the normal control group by the LSD test
  • b p ⁇ 0.01 compared to the EPD control group by the LSD test
  • c p ⁇ 0.01 compared to the beta-calcium gluconate single dosage form group by the LSD test
  • d p ⁇ 0.01 compared to xyl by the LSD test compared to the single dosage group.
  • A normal control rat
  • B EPD control rat
  • C indomethacin 5 mg / kg treated rat
  • D beta-calcium gluconate single formulation 100 mg / kg treated rat
  • E xylitol single formulation 100 mg / kg treated Rat
  • F Beta-Gluconate: Xylyl 1: 0.5 Mixed Formula (g / g) 100 mg / kg Treatment Rat :
  • G Beta-Gluconate: Xylitol 1: 1 Mixed Formula (g / g) 100 mg / kg treated rats
  • H beta-calcium gluconate: xylitol 1: 2 mixed formulation (g / g) 100 mg / kg treated rats
  • 1 beta-gluconate bovine: xyl 1: 4 combination formulation (g / g g) 100 mg / kg treated rats.
  • A normal control rat
  • B EPD control rat, O indomethacin 5 mg / kg treated rat
  • D beta-calcium gluconate single formulation 100 mg / kg treated rat
  • E xylitol single formulation 100 mg / kg treated Rat
  • F Beta-Gluconate: Xylyl 1: 0.5 Mixed Formula (g / g) 100 mg / kg Treated Rat
  • G Beta-Gluconate: Xylitol 1: 1 Mixed Formula (g / g) 100 mg / kg treated rats
  • H beta-calcium gluconate: xylitol 1: 2 mixed formulation (g / g) 100 mg / kg treated rats
  • 1 beta-calcium gluconate: 1: 4 mixed formulation (g / g) ) 100 mg / kg treated rats.
  • a p ⁇ 0.01 compared to the normal control by the test
  • b p ⁇ 0.05 compared to the normal control by the MW test
  • c ⁇ 0.01
  • d MW test compared to the EPD control by the test P ⁇ 0.05 compared with the EPD control group
  • e p ⁇ 0.05 compared with the beta-calcium gluconate single-dose group by the test
  • p p ⁇ 0.05 compared with the beta-calcium gluconate single-formation group by the test 0.05.
  • the experimental group was as Table 1 below.
  • Beta-gluconate was an off white powder that dissolved well in distilled water.
  • Beige indomethacin powder was purchased from Sigma-Aldrich.
  • An appropriate amount of beta-gluconate calcium and xylite was directly dissolved in distilled water to prepare four types of combination formulations.
  • beta-gluconate, xylyl, and beta-gluconate 1: 0.5, 1: 1, 1: 2 and 1: 4 mixture (g / g) 100 mg / kg, or Indomethacin 5 mg / kg was administered orally once daily for 10 days at a dose of 5 mi / kg. Equivalent amounts of distilled water were orally administered to the normal and EPD controls.
  • Body weights were measured daily from 1 day before ligation. In order to reduce the difference between each experimental animal, the weight gain after 10 days of administration was calculated according to the following equation (1).
  • the gingival tissue around the upper left incisor was removed and placed in a 0.3 BHI broth (brain heart infusion broth, Becton, Dicknson and Company).
  • BHI broth brain heart infusion broth, Becton, Dicknson and Company.
  • the collected sections were then homogenized, distilled 1: 100 and 1: 1000 and dispensed into blood agar medium (BHI agar; Dicknson and Company with 5% defiber sheep blood and henin / menadione 10 / g /). Incubate for 48 hours at 37 ° C, 5% C0 2 conditions. After 48 hours, the colonies formed were counted as X 10 5 CFU / g tissue.
  • Oral epithelial tissues were taken from sites around the ligation 11 days after EPD induction. The harvested tissue was homogenized and treated according to the previously reported literature (J Ethnopharmacol-2007; 113: 471-478). The concentrations of IL- ⁇ and TNF-ci were measured by ELISA. Micro titer fulate was coated overnight at 4 ° C. with antibodies against rat IL- ⁇ or TNF-a (10 ug / ml). After blocking the plates, samples of various dilution concentrations and standards were added and incubated for 24 hours at 4 ° C. The plate was washed three times with buffer.
  • tissue was homogenized with a homogenization buffer consisting of 50 mM Tris-HCl, 0.1 mM EGTA and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (pH .4).
  • the oral cavity is a sample of tissue lysate (100 to 200% of 8.1% (w / v) sodium dodecyl sulfite (Sigma— Aldrich), 1500 ⁇ to 20% (v / v) acetic acid (pH 3.5), 1500 ⁇
  • tissue lysate 100 to 200% of 8.1% (w / v) sodium dodecyl sulfite (Sigma— Aldrich)
  • acetic acid pH 3.5
  • L- of L- [3H] -arginine in homogenate The conversion of [3 H] -citrulline was measured. Briefly, the homogenate is labeled with L- [3H] -arginine (10 mM, 5 kBq / tube), NADPH (1 mM), calmodulin (30 nM), tetrahydrobiopterin (5 mM) and calcium (2 incubated for 30 min in the presence of mM) (22 ° C).
  • the reaction was terminated by dilution with 0.5 m of cold HEPES buffer (pH 5.5) containing EGTA (2 mM) and EDTA (2 mM).
  • the amount of L- [3H] -citrine formation was measured separately from the NO activity.
  • Calcium-independent NOS activity was measured in experiments in the presence of NADH (without breast) and EGTA (5 mM).
  • the reaction mixture was applied to a Dowex 50W (Na / form) column and the eluted L- [3H] -citrine activity was measured with a liquid scintillation counter (Wall lac). Histopathological Analysis
  • the maxillary area around the ligation was sampled and fixed in 10% neutral buffered formalin. After fixation, the samples were washed with decalcification solution (24.4% formic acid and 0.5N sodium hydroxide); Daily descaling. Then, the sample was cut in the longitudinal direction to include the left and right incisors, paraffin embedded and cut into 3-4 mm and subjected to H & E staining. Witches were examined for histopathological profiles of tissues and periodontal bone compared to normal controls. The area between the left and right incisors, where the ligation was present, was observed under a microscope and scored from 0-3 points to account for inflammatory cell influx and periodontal bone and cementum integrity (Table 2).
  • Invasive inflammatory cells (number / position is mm 2 of tissue) and collagen charge area (% / position of tissue tissue) on the upper teeth region between the first and second molars as a histological analysis in longitudinal cut samples prepared using 2 ) was measured. Furthermore, the periodontal bone volume (% / periodontal bone area mm 2 ), osteoclast number (number / periodontal) on the periodontal area between the right and left incisors (tooth root removed) in longitudinal cut samples prepared using an image analysis program Mm 2 of the bone surface and the percentage they occupy (% / mm 2 of the periodontal bone surface) were measured. Histopathologists did not provide information about group distribution. Statistical analysis
  • the indomethacin (IND) group started to show significant weight loss ( ⁇ .01 or p ⁇ 0.05) compared to the EPD control group 5 days after the start of administration. p01) decreased (Table 3, Figure 1).
  • the weight gain during the administration period of 10 days showed -57.11% change in the EPD control group compared to the normal control group, and indomethacin, beta-calcium gluconate and xyl alone composition, calcium beta-gluconate: xyl
  • the 1: 0.5, 1: 1, 1: 2 and 1: 4 complex composition administration groups showed -75.84, 44.38, 35.39, 91.57, 96.07, 99.44 and 60.11% changes compared to the EPD control group, respectively.
  • the periodontal bone loss was -319.84% in the EPD control group compared to the normal control group.
  • the 1: 2 and 1: 4 complex composition administration groups showed -26.97, -22.81, -17.33, -36.66, -36.93, -42.53 and -23.82% changes compared to the EPD control group, respectively. Changes in Viable Cell Number in Gingival Tissues
  • the increase in the number of viable cells in the gingival tissue was significantly increased ( ⁇ .01) compared to the normal control group.
  • a decrease in the number of living organisms ( ⁇ .01) was observed, especially in the beta-calcium gluconate: xyl 1: 0.5, 1: 1 and 1: 2 composite composition groups, respectively.
  • xyl 1 0.5, 1: 1 and 1: 2 composite composition groups, respectively.
  • a significant decrease in the number of viable ( ⁇ .01) viable cells was observed.
  • the number of viable cells in the gingival tissue was 238.16% in the EPD control group compared to the normal control group.
  • Indomethacin, beta-calcium gluconate and xylitol alone composition beta-calcium gluconate: xylitol 1: 0.5, 1: 1 , 1: 2 and 1: 4, the hybrid composition administered group, respectively, compared to the control group EPD -2.14, -1.36, - shows the change of 34.63, -53.31, -53.70, -54.28, and -39.69%.
  • MP0 activity in the gingival tissue was 387.19% in the EPD control group compared to the normal control group.
  • Indomethacin, beta-calcium gluconate and xyl alone composition, beta-calcium gluconate: xylitol 1: 0.5, 1: 1 , 1: 2 and 1: 4 complex composition administration group showed -59.30, -51.03, -39.83, -66.23, -69.50, -70.50 and -52.18% changes compared to the EPD control group, respectively.
  • IL- ⁇ content in the gingival tissue was 178.88% in the EPD control group compared to the normal control group.
  • the 1: 1, 1: 2 and 1: 4 complex composition administration groups showed -35.69, -31.67, -18.22, -44.21, -46.03, -48.53 and -35.30% changes compared to the EPD control group, respectively.
  • the increase in TNF- ⁇ content in the gingival tissue was significant (P ⁇ 0.01) compared to the normal control group.
  • the (P ⁇ 0.01) TNF-a content was significantly higher than that in the EPD control group.
  • the beta-calcium gluconate: xylitol 1: 0.5, 1: 1, and 1: 2 combination composition group was significantly higher than that of the beta-gluconate group and xyl group alone. 01 or p ⁇ 0.05)
  • a decrease in the TNF-a content was recognized.
  • the beta-calcium gluconate: xyl 1: 4 composite composition group a significant (p ⁇ 0.05) decrease in TNF-a content was observed compared to the xylitol alone composition group (FIG. 7).
  • the TNF-a content in the gingival tissue was 243.25% in the EPD control group compared to the normal control group, and indomethacin, beta-calcium gluconate and xyl alone composition, beta-calcium gluconate: xylitol 1: 0.5, 1
  • the 1: 1, 1: 2, and 1: 4 combination composition administration groups showed -33.56, -37.82, -24.33, -55.09, -57.06, -58.80, and -39.63% changes compared to the EPD control group, respectively. Changes in MDA Content in Gingival Tissues
  • the MDA content in the gingival tissue was 379.25% in the EPD control group compared to the normal control group.
  • the 1, 1: 2 and 1: 4 complex composition administration groups showed -26.46, -33.65, -21.24, -47.49, -51.75, -55.43 and -37.88% changes compared to the EPD control group, respectively. Changes in iNOS Activity in Gingival Tissues
  • the iNOS activity in the gingival tissues was 632.11% in the EPD control group compared to the normal control group.
  • Indomethacin beta-gluconate and xyl alone composition, beta-calcium gluconate: xyl 1: 0.5, 1: 1 , 1: 2 and 1: 4 complex composition administration group showed -27.40, -35.81, -21.33, -47.94, -53.51, -55.30 and -38.26% changes compared to the EPD control group, respectively.
  • xylitol 1 4 combination composition administration group, significant periodontitis and related periodontal bone loss inhibition were recognized as compared to the xylitol alone composition administration group (Table 4 and FIGS. 10-12). Histopathological Score Changes
  • the histopathological score was 475.00% in the EPD control group compared to the normal control group.
  • Indomethacin, beta-calcium gluconate and xyl alone composition, beta-calcium gluconate: xyl 1: 0.5, 1: 1 , 1: 2 and 1: 4 complex composition administration group showed -30.43, -26.09, -21.74, -52.17, -52.17, -56.52 and -34.78% change compared to the EPD control group, respectively.
  • the number of infiltrating inflammatory cells was 10425.33% in the EPD control group compared to the normal control group.
  • Indomethacin, beta-gluconate and xyl alone composition, beta-calcium gluconate: xylitol 1: 0.5, 1: 1 , 1: 2 and 1: 4 complex composition administration group showed -73.41, -67.15, -28.92, -81.85, -87.64, -91.79 and -61.27% change compared to the EPD control group, respectively.
  • the number of infiltrating inflammatory cells was -57.8OT in the EPD control group compared to the normal control group.
  • the 1, 1: 2 and 1: 4 composite composition administration groups showed 71.84, 54.24, 41.00, 78.96, 85.30, 97.82 and 59.82% changes compared to the EPD control group, respectively.
  • All dose groups showed significant decreases in the number and proportion of osteoclasts ( ⁇ .01 or p ⁇ 0.05) compared to the EPD controls, in particular beta-calcium gluconate: xylitol 1: 0.5, 1: 1 and In the 1: 2 complex composition-administered group, a significant decrease in the number and ratio of ( ⁇ .01 or p ⁇ 0.05) osteoclasts was observed as compared to the beta-gluconate calcium and xylitol-only composition-administered groups.
  • the number of osteoclasts was 584.00% in the EPD control group compared to the normal medium control group.
  • The: 2 and 1: 4 composite composition administration groups showed -36.55, -53.80, -33.92, -67.25, -65.50, -69.88 and -56.43% changes compared to the EPD control group, respectively.
  • the percentage of osteoclasts was 2407.82% in the EPD control group compared with the normal control group.
  • Indomethacin, beta-calcium gluconate and xyl alone composition, beta-calcium gluconate: Xyllet 1: 5, 1: 1 , 1: 2 and 1: 4 complex composition administration group showed -47.15, -56.48, -32.34, -70.39, -71.97, -74.88 and -58.28% change compared to the EPD control group, respectively.

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Abstract

본 발명은 베타-글루콘산칼슘 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 베타-글루콘산칼슘 또는 자일리톨 단독 조성물에 비하여 더 우수한 항균, 항염 및 항산화 효과를 나타내므로, 치주질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
[발명의 명칭】
치주질환의 예방， 개선 또는 치료용 조성물
【기술분야】
본 발명은 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
치주질환은 치아 주위의 연조직 및 치주골이 만성염증으로 파괴되어 잇몸에서 출혈이 일어나고, 이가 흔들리며， 최후에는 치아를 상실시키는 질환으로서 풍치라고도 알려져 있다 . 치주질환의 치료는 환자의 개선된 구강위생의 확립， 비외과적 혹은 외과적인 치석 제거술， 치근활택술， 치은소파술을 응용한 치주조직의 재생술 등이 이용되어져 왔다. 부가적인 치료로서 페니실린 등의 항생제를 이용한 치면세균막을 형성하는 원인균의 퇴치가 이루어지고 있으나 장기간의 사용 시 발생되는 항생제 내성균으로 인하여 효과 면에서 큰 성과를 얻지 못하고 있는 실정이다.：
또한, 치주질환의 치료를 위하여 비스테로이드성 항염증제가 널리 사용되고 있으나, 상기 비스테로이드성 항염증제는 위장출혈, 복통， 두통 및 부종 등의 부작용을 수반하는 문제가 있다. 이에， 비스테로이드성 항염증제를 대체할 수 있는 안전한 치료제의 개발이 요구된다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 치주 질환의 예방 및 치료제를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과， 치주질환 동물 모델에 베타-글루콘산칼슘과 자일리를의 복합 조성물을 투여하는 경우, 자일리를의 병용 투여에 의하여 치주질환에 대한 베타-글루콘산칼슘의 유효한 효과가 상승적으로 증가됨을 확인하고， 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서， 본 발명의 목적은 치주질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 테 있다.
본 발명의 다른 목적은 치주질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물의 제조를 위한 베타- 글루콘산칼슘과자일리를의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 투여하여 주질환을 예방， 개선 또는 치료하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 베타-글루콘산칼슘의 생리활성을 증진시키는 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은ᅵ 베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리를을 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 치주 질환의 예방 및 치료제를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과， 치주질환 동물 모델에 베타-글루콘산칼슘과 자일리를의 복합 조성물을 투여하는 경우， 자일리를의 병용 투여에 의하여 치주질환에 대한 베타-글루콘산칼슘의 유효한 효과가 상승적으로 증가됨을 확인하였다.
본 명세서에서 사용된 용어, "베타-글루콘산칼슘"은 베타-글루칸과 글루콘산칼슘을 포함하는 복합 제제를 의미한다 .
상기 베타 글루칸 ( β -glucan)은 미생물, 곡물， 버섯, 해초， 효모 등에서 추출되는 글루코오스의 폴리머이다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 베타 글루칸은 베타 -1,3/ 1 , 6- 글루칸일 수 있다. 상기 베타 -1 , 3/1 , 6-글루칸은 주쇄로서 베타 -1 , 3 결합으로 연결된 포도당 5 분자당 베타ᅳ1，6 결합을 하고 있는 단당류가 1 분자씩 연결된 분지형의 수용성 베타-글루칸으로， 베타 -1,3 및 베타 -1，6 결합이 서로 흔재되어 있는 분지된 베타-글루칸 (branched β-glucan)이다. 이러한 베타 -1,3/1， 6-글루칸은 Aureobasi dium
Figure imgf000005_0001
예컨대, Aureobasi dium pullulans SM2001)를 배양하여 수득할수 있다.
상기 글루콘산칼슘은 백색 결정성 또는 알맹이 모양의 분말로 냄새가 없고 맛이 없는 칼슘염류 강화제로서, 과자류 및 두부제조에 칼슘강화제로 사용하며， 유지 및 도넛에 첨가하면 산화방지에 도움이 되는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 복합 제제 내 베타-글루칸과 글루콘산칼슴의 중량비는 0.5-10 :99.5-90일 수 있다. 보다 구체적인 일구현예에 따르면， 상기 베타—글루칸과 글루콘산칼슘의 중량비는 1.5- 5:98.5-95이고， 보다 더 구체적인 일구현예에서는 1.5-3:98.5-97이다.
본 발명의 특징 중 하나는 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리를을 일정량 포함한다는 것이다. 하기 실시예에서 확인된 바와 같이， 자일리를을 베타-글루콘산칼슘과 병용 투여하는 경우 항염， 항균 및 항산화 효과와 같은 베타-글루콘산칼슘의 생리활성이 상승적으로 증진되어， 자일리를 또는 베타-글루콘산칼슘 단독 투여 시 보다 더 우수한 치주질환 치료 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성은
(i) 치주골 소실 억제， (ii) 치은 조직 내 세균에 대한 "균 활성， (ii) 치은 조직 내 중성호성 백혈구의 MPO(myeloperoxidase) 생성 억제， (iii) 치은 조직 내 염증성 사이토카인 (예컨대, TNF-a , IL-Ι 둥) 생성 억제， (iv) 치은 조직 내 항산화 활성 (예컨대, 지질 과산화 억제， iNOS 활성 억제, N0 생성 억제 등), (V) 치은 조직의 부종 억제， 및 (vi) 염중세포의 치은 조직으로의 침윤 억제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 베타-글루콘산칼슘과 자일리를의 중량비는 1:0.1-3.9일 수 있다.
보다 구체적인 일구현예에 따르면， 상기 베타—글루콘산칼슘과 자일리를의 중량비는 1:0.3-3.5이고, 보다 더 구체적인 일구현예에서는 1:0.3-3.0이며， 보다 더 구체적인 다른 구현예에서는 1:0.3-2.5이고, 보다 더 구체적인 또 다른 구현예에서는 1 : 0. 5-2.0이다.
본 발명에 의하여 예방 및 치료 가능한 치주질환으로는， 예를 들어, 치주염, 치은염, 구내염， 임플란트 주위염， 치주골 소실， 골용해 (예컨대， 티타늄 입자—유도성 골용해) , 치관주위염， 치주 고름집 및 치주증을 들 수 밌다.
본 명세서에서 사용된 용어， "예방''은 본 발명의 조성물의 투여로 치주질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 용어， "개선" 및 "치료 "는 조성물 투여에 의해 치주질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 텍스트로스, 수크로스， 솔비를， 만니톨， 전분， 아카시아 고무, 인산 칼슘， 알기네이트， ¾라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피롤리돈， 셀를로스， 물， 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드톡시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 둥을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미제, 향미제， 유화제， 현탁제 , 보존제 둥을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington 's Pharmaceutical Sciences^ 19th ed . , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령, 체중, 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간, 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함된 베타-글루콘산칼슘과 자일리틀의 투여량은 성인 기준으로 0 .0001—10000 mg/kg 범위 내일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제， 산제， 분말제， 과립제， 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 베타-글루칸과 글루콘산칼슴의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베타—글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리를을 포함하는 치주질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. ί
상기 식품 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나， 건강기능식품， 영양 보조제， 영양제， 파머푸드 (pharmafood) , 건강식품, 뉴트라슈티칼( 1(^ ^611 31 )， 디자이너 푸드 , 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있으며， 이의 예로는 육류， 소세지， 빵， 쵸코렛, 캔디류， 스넥류, 과자류， 피자, 라면， 기타 면류， ¾류 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수， 차， 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며， 예를 들어， 단백질， 탄수화물, 지방， 영양소， 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드 예를 들어， 포도당， 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스 슈크로스， 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 텍스트린， 사이클로덱스트린 둥과 같은 통상적인 당 및 소르비를， 에리트리를 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴 , 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등] ) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 둥)를사용할수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제， 비타민류， 광물 (전해질)， 식이성분， 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제， 착색제 및 중진제 (치즈， 초콜릿 둥)， 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제， 안정화제, 방부제， 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할수 있다.
예컨대， 본 발명의 식품 조성물을 드링크제로 제조하는 경우에는 베타—글루콘산칼슘과 자일리를 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산， 사과산， 과즙， 각 종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면， 본 발명의 식품은 치주질환의 예방 및 개선에 매우유용하다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베티ᅳ글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리를을 포함하는 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다 .
베타ᅳ글루콘산칼슘과 자일리를은 치주질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다. 베타—글루콘산칼슘과 자일리를을 의약외품 첨가물로 사용할 경우， 다른 의약외품 성분 [예컨대 , 층치 예방제 (불화나트륨 , 불화인산나트륨， 불화아민 등)， 살균제 (클로로핵시딘， 세틸피리디움 클로라이드， 트리클로산 등) , 추가의 염증 완화제 (알란토인， 아미노카프론산， 트라넥사민산， 초산토코페를 등) 둥]과 함께 첨가할 수 있고， 첨가량은 사용 목적 (예방， 건강 또는 치료적 처치 )에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 또한， 상기 의약외품 조성물은 연마제， 습윤제, 결합제 기포제， 감미제， 계면 활성제， 향료 및 색소로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 추가로 포함할 수 있고， 조성물의 형태는 페이스트상, 분말상 또는 액상 (가글 형태)일 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 의약외품 조성물은 치약， 구강청정제 (가글)， 구강보호제， 소독청결제 또는 연고제일 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 이를 필요로하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 치주질환의 예방， 개선 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 자일리틀을 베타- 글루콘산칼슘과 함께 이를 필요로하는 개체에게 병용 투여하는 단계를 포함하는 베타-글루콘산칼슘의 생리활성을 증진시키는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 개체는 인간을 포함하는 포유동물이다.
상기 병용 투여는 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성은 상술한 바와 같다 .
【유리한 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 베타-글루콘산칼슘 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리를을 포함하는 치주질환의 예방， 개선 또는 치료용조성물을 제공한다.
(ii) 본 발명의 조성물은 베타-글루콘산칼슘 또는 자일리톨 단독 조성물에 비하여 더 우수한 항균， 항염 및 항산화 효과를 나타내므로, 치주질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 정상 랫트와 EPD 랫트의 체중 변화를 보여준다. 그래프 중 'before'는 결찰 하루 전을나타내며 , LP는 결찰 시를 나타낸다.
도 2는 정상 랫트와 EPD 랫트의 위 왼쪽 절치 주위의 이미지이다. A= 정상 대조군 랫트， B= EPD 대조군 랫트, C= 인도메타신 5 mg/kg 처리 랫트， D= 베타-글루콘산칼슴 단일 제형 100 mg/kg：처리 랫트, E= 자일리를 단일 제형 100 mg/kg 처리 랫트, F= 베타-글루콘산칼슴：자일리틀 1:0.5 혼합 제형 (g/g) 100 mg/kg 처리 랫트， G= 베타- 글루콘산칼슘：자일리톨 1:1 흔합 제형 (g/g) 100 mg/kg 처리 랫트， H= 베타- 글루콘산칼슘：자일리틀 1:2 흔합 제형 (g/g) 100 mg/kg 처리 랫트， 1= 베타- 글루콘산칼슘：자일리를 1:4흔합 제형 (g/g) 100 mg/kg 처리 랫트.
도 3은 정상 랫트와 EPD 랫트의 치주골 손실율을 보여준다.
a: 丽 테스트에 의한 정상 대조군과 비교하여 p K01, b: MW 테스트에 의한 EPD 대조군과 비교하여 p<0.01, c: 丽 테스트에 의한 베타- 글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 pO.01, d: 隱 테스트에 의한 자일리를 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.01.
도 4는 정상 랫트와 EPD ¾트의 치은조직 내 생균수를 보여준다. a: MW 테스트에 의한 정상 대조군과 비교하여 p<0.01, b: MW 테스트에 의한 정상 대조군과 비교하여 p<0.05, c: 丽 테스트에 의한 EPD 대조군과 비교하여 pO.01, d: MW 테스트에 의한 베타—글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 pO.01, e: 丽 테스트에 의한 자일리를 단일 제형 투여군과 비교하여 pO.01. 도 5는 정상 랫트와 EPD 랫트의 치은 조직 내 MP0활성을 보여준다. a: MW 테스트에 의한 정상 대조군과 비교하여 p<0.01, b: 丽 테스트에 의한 정상 대조군과 비교하여 p<0.05ᅳ c: MW 테스트에 의한 EPD 대조군과 비교하여 p<0.01, d: MW 테스트에 의한 베타-글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.01, e: MW 테스트에 의한 베타-글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.05, f: 隱 테스트에 의한 자일리를 단일 제형 투여군과 비교하여 ρθ.01.
도 6 은 정상 랫트와 EPD 랫트의 치은 조직 내 IL-Ιβ 수준을 보여준다.
a: LSD 테스트에 의한 정상 대조군과 비교하여 p<0.01, b: LSD 테스트에 의한 EPD 대조군과 비교하여 p<0.01, c: LSD 테스트에 의한 베타- 글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 ρ<0.01, d: LSD 테스트에 의한 베타-글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.05, e: LSD 테스트에 의한 자일리를 단일 제형 투여군과 비교하여 ρθ.01.
도 7 은 정상 랫트와 EPD 랫트의 치은 조직 내 TNF-α 수준을 보여준다.
a: 丽 테스트에 의한 정상 대조군과 비교하여 pO.Ol, b: MW 테스트에 의한 EPD 대조군과 비교하여 p<0.01, c: 丽 테스트에 의한 베타- 글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.01, d: 丽 테스트에 의한 베타-글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 ρ<0.05, e: 厦 테스트에 의한 자일리를 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.01, f： 丽 테스트에 의한 자일리를 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.05.
도 8은 정상 랫트와 EPD 랫트의 치은 조직 내 MDA수준을 보여준다. a: LSD 테스트에 의한 정상 대조군과 비교하여 p<0.01, b: LSD 테스트에 의한 EPD 대조군과 비교하여 p<0.01, c: LSD 테스트에 의한 베타- 글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.01, d: LSD 테스트에 의한 자일리를 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.01.
도 9 는 정상 랫트와 EPD 랫트의 치은 조직 내 iNOS 활성을 보여준다. a: LSD 테스트에 의한 정상 대조군과 비교하여 p<0.01, b: LSD 테스트에 의한 EPD 대조군과 비교하여 pO.Ol, c: LSD 테스트에 의한 베타- 글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 pO.Ol, d: LSD 테스트에 의한 베타-글루콘산칼슴 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.05, e: LSD 테스트에 의한 자일리를 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.01.
도 10a 및 10b 는 정상 랫트와 EPD 랫트의 윗절치 사이의 치은 조직의 조직학적 이미지이다. 스케일 바 = 120 ΐα.
Α= 정상 대조군 랫트, B= EPD 대조군 랫트, C= 인도메타신 5 mg/kg 처리 랫트， D= 베타-글루콘산칼슘 단일 제형 100 mg/kg 처리 랫트， E= 자일리톨 단일 제형 100 mg/kg 처리 랫트， F= 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5 흔합 제형 (g/g) 100 mg/kg 처리 랫트：， G= 베타- 글루콘산칼슘：자일리톨 1:1 흔합 제형 (g/g) 100 mg/kg 처리 랫트， H= 베타- 글루콘산칼슘：자일리톨 1:2 혼합 제형 (g/g) 100 mg/kg 처리 랫트， 1= 베타- 글루콘산칼슴：자일리를 1:4 흔합 제형 (g/g) 100 mg/kg 처리 랫트.
도 lla 및 lib 는 정상 랫트와 EPD 랫트의 윗절치 사이의 치주골 영역의 조직학적 이미지이다. 스케일 바 = 120 -
A= 정상 대조군 랫트， B= EPD 대조군 ¾트, O 인도메타신 5 mg/kg 처리 랫트, D= 베타-글루콘산칼슘 단일 제형 100 mg/kg 처리 랫트， E= 자일리톨 단일 제형 100 mg/kg 처리 랫트, F= 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5 흔합 제형 (g/g) 100 mg/kg 처리 랫트， G= 베타- 글루콘산칼슘：자일리톨 1:1 혼합 제형 (g/g) 100 mg/kg 처리 랫트， H= 베타- 글루콘산칼슘：자일리톨 1:2 흔합 제형 (g/g) 100 mg/kg 처리 랫트， 1= 베타- 글루콘산칼슘：자일리를 1:4 흔합 제형 (g/g) 100 mg/kg처리 랫트.
도 12는 정상 ¾트와 EPD 랫트의 조직학적 스코어를 보여준다.
a: 棚 테스트에 의한 정상 대조군과 비교하여 p<0.01, b: MW 테스트에 의한 정상 대조군과 비교하여 p<0.05, c: 丽 테스트에 의한 EPD 대조군과 비교하여 p<0.01, d: MW 테스트에 의한 EPD 대조군과 비교하여 p<0.05, e: 丽 테스트에 의한 베타-글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.05, f： 丽 테스트에 의한 베타-글루콘산칼슘 단일 제형 투여군과 비교하여 p<0.05.
【발명을 실시를 위한 형태】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험재료 및 실험방법
실험동물 및 관리
총 160 마리의 건강한 수컷 스프라그 -돌리 랫트 (6 주령, 체중 170- 190g, SIX , 일본)를 9 일간 순응시킨 후 실험에 사용하 다. 실험동물을 우리 당 4 또는 5 마리씩 분배하였다 (온도 20-25°C , 습도 50-55%) . 암주기는 12 hr： 12 hr 이었고, 표준 설치류 사료와 물을 제한 없이 공급하였다. 실험그룹은 다음 표 1과 같았다.
【표 1】
Figure imgf000012_0001
시험물질의 투여
글루콘산 칼슘과 β -1,3/1 ,6-글루칸의 2:98 흔합물 (g/g)인 베타- 글루콘산 칼슘과， 자일리를은 아리바이오 (Aribio, 서울， 한국)로부터 공급받았다. 베타-글루콘산칼슴은 off white 분말로서 증류수에 잘 용해되었다. 베이지 색의 인도메타신 분말은 시그마-알드리치에서 구입하였다. 적량의 베타-글루콘산칼슘과 자일리틀을 직접 증류수에 용해하여 4 종류의 흔합 제형을 제조하였다. 결찰 하루 후, 베타- 글루콘산칼슴， 자일리를， 및 베타-글루콘산칼슴：자일리를 1:0.5, 1:1， 1:2 및 1:4 흔합물 (g/g) 100 mg/kg, 또는 인도메타신 5 mg/kg 을 5 mi/kg 의 용량으로 10 일 동안 하루 한 번 경구 투여하였다. 정상 및 EPD 대조군에는 동량의 증류수를 경구 투여하였다. 치주질환 유발
실험적 치주질환 (Experimental periodontal diseases, EPD)을 이전의 방법 (Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2011； 108:241-250； ISRN Vet Sci . 2012 ;2012 :862104)을 변형시켜, 실험동물을 25 mg/kg 의 졸레틸 흔합물 (Zoletile 50； Virbac Lab) 복강 †사로 마취한 다음， 왼쪽 절치의 치아 경부에 3-0 나일론 봉합사를 이용하여 결찰을 실시하여 치주염 및 질환을 유발하였다. 정상 대조군에서는 절치의 치아 경부 부분만 확인한 후 결찰하지 않았다. 체중 변화
결찰 1 일 전부터 매일 체중을 측정하였다. 각 실험동물간의 차이를 감소시키기 위하여， 투여 10 일 후의 체중 증가를 하기 수학식 1 에 따라 계산하였다.
수학식 1
시험물질 처리 10 일 동안의 체증 증가 (g) = 희생 시 체중 - 투여 개시 시의 체중 (결찰후 24시간) 치주골 손실 측정 실험동물을 투여 후 10일째 (결찰후 11일) 회생시키고, 상악골 함유 결찰 부위 (두 번째 어금니 )를 절개한 다음， 가로 치주골 손실 , 교두정 (cusp tip)과 치주골 사이 거리를 이전의 방법 (J Periodontal Res.1990 ;25： 308- 315)을 변형하여 측정하였다. 측정은 윗 왼쪽 절치 (incisior teeth)의 뿌리 축을 따라 이루어졌다. 미생물학적 분석
위 왼쪽 절치 주변의 치은 조직을 제거하고， 0.3 의 BHI 브로스 (brain heart infusion broth, Becton, Dicknson and Company)에 위치시켰다. 이후, 모은 절편을 균질화하고, 1:100과 1:1000으로 회석하여 혈액한천배지 (5% 탈섬유소 양 혈액과 henin/menadione 10 /g/ 이 첨가된 BHI agar； Dicknson and Company)에 분주한 다음， 37°C, 5% C02 조건에서 48 시간 동안 인큐베이션 하였다. 48 시간 후， 형성된 콜로니 수를 X 105 CFU/g조직과 같이 계수하였다.
MP0활성 측정
호중구 축적으로서 MP0 활성을 측정하기 위하여， EPD유발 11 일째에 결찰 주위 윗치은 조직을 채취하였다. MP0 활성을 측정하기 위하여 분광광도법을 사용하였다. 상단 왼쪽 절치 주변의 치은 조직을 제거하고， - 70°C에서 저장하였다ᅳ MP0 를 용해시키기 위하여 50 mM 인산칼륨 버퍼 (pH 6.0)에 용해된 0.5% HTABChexadecyl t r imethyl a隱 onium bromide, Gibco)에 재료를 현탁시켰다. 얼음 수조에서 균질화 한 후 (15 초)， 시료를 두 번 동결-해동시켰다. 조직 15 mg 당 400 ^의 버퍼에 도달시키기 위하여， 테스트 튜브에 추가의 버퍼를 첨가하였다ᅳ 12 분간 1000 X g로 원심분리한 후, 상청액 0.1 를 0.167
Figure imgf000014_0001
： o-디아니시딘 디하이드로클로라이드 (Sigma-Aldrich), 증류수 및 0.0005% 과산화수소가 함유된 인산염 버퍼 (50 mM, pH 6.0) 2 ηΐ·Ηᅵ 첨가하여， 튜브 당 2.1 rnft의 최종 부피가 되도톡 하였다. 흡광도를 분광광도계로 측정하였다 (460 nm). 활성 1 유닛을 25°C에서 1 ymol 의 과산화물 분해 /분으로 정의하였다. 결과는 MP0유닛 / ^로 표현하였다. 상악골치은 조직에서 IL-Ιβ 및 TNF-a의 검출
결찰 주변 부위로부터 구강 윗치은 조직을 EPD 유발 후 11 일째에 채취하였다. 채취한 조직을 균질화하고， 이전에 보고된 문헌 (J Ethnopharmacol - 2007; 113 :471-478)에 따라 처리하였다. IL-Ιβ 및 TNF- ci의 농도를 ELISA 로 측정하였다. 랫트 IL-Ιβ 또는 TNF-a (10 ug/ml)에 대한 항체로 마이크로 타이터 풀레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 코팅하였다 . 플레이트를 블록킹 한 후， 다양한 희석 농도의 시료와 표준을 첨가하고， 4°C에서 24 시간 동안 인큐베이션 하였다. 버퍼로 플레이트를 세 번 세척하였다. 세척 후， 100 ^의 비오틴화 양 폴리클로날 항 -랫트 TNF-a 또는 항 -랫트 IL-1]3(어세이 버퍼 1% BSA 로 1/1000 으로 희석; abeam)를 웰에 첨가하였다. 상온에서 1 시간 동안 추가적으로 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척하고, 100 ^의 아비딘 -HRP( 1:5000 희석; abeam)를 첨가하였다. 15 분 후에 발색 시약 페닐렌디아민 (100 βί,' Sigma- Aldrich)을 첨가하고， 플레이트를 암조건에서 37°C의 온도로 20 분간 인큐베이션 하였다. H2S04를 사용하여 효소 반응을 정지시키고， 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
MDA 측정
결찰 주변 부위에서 채취한 구강 윗치은 조직 내 MDA 의 수준 (지질 과산화의 지표)을 측정하였다. 간략히 설명하면， 조직을 50 mM Tris-HCl, 0.1 mM EGTA 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (pH .4)로 이루어진 균질화 버퍼로 균질화하였다. 구강 윗치은 조직 파쇄액의 표본 (100 을 200 ^의 8.1%(w/v) 소듐 도데실 설파이트 (Sigma— Aldrich), 1500 ^의 20%(v/v) 아세트산 (pH 3.5)， 1500 ^의 0.8%(w/v) 티오바르비틀산 (Si gma- Aldrich) 및 700 ^의 증류수가 함유된 반응 흔합물에 첨가하였다. 이후， 시료에 95°C의 열을 1 시간 동안 가하고， 3000 X g 로 10분간 원심분리를 하였다. 상청액의 흡광도를 650 nm에서 측정하였다. iNOS활성 측정
윗치은 조직 내 iNOs 활성을 이전에 보고된 방법 (Free Radic Biol 1998 ;24 :450-459)으로 평가하였다. 균질액에서 L-[3H]-아르기닌의 L- [3H]-시트를린의 변환을 측정하였다. 간략히 설명하면, 균질액을 L-[3H]- 아르기닌 ( 10 mM, 5 kBq/튜브) , NADPH(1 mM)， 칼모들린 (30 nM) , 테트라하이드로바이오프테린 (5 mM) 및 칼슘 (2 mM)의 존재 하에서 30 분간 인큐베이션 하였다 (22°C ) . EGTA(2 mM)과 EDTA(2 mM)이 함유된 차가운 HEPES 버퍼 (pH 5.5) 0.5 m로 회석하여 반웅을 종결시켰다. ： ADPH 가 없는 조건에서 수행한 실험에서는， N0S 활성과는 별도로 L-[3H]-시트를린 형성량을 측정하였다. NADH 존재 (칼슴이 없는) 및 EGTA(5 mM) 존재 하에서의 실험에서는 칼슘-독립적 N0S 활성을 측정하였다. 반응 흔합물을 Dowex 50W(Na/form) 컬럼에 적용하고， 용출된 L-[3H]-시트를린 활성을 액체섬광 계수기 ( l iquid scint i l lat ion counter ; Wal lac)로 측정하였다. 조직병리학적 분석
EPD유발 후 11 일째에 결찰주위의 상악골 영역을 시료로 만든 다음 10% 중성 버퍼 포르말린에 고정하였다. 고정 후， 시료를 석회질 제거 용액 (24.4% 포름산 및 0.5N 수산화나트륨)을 사용하여 5; 일간 석회질을 제거하였다. 이후， 시료를 왼쪽과 오른쪽 절치가 포함되도록 세로 방향으로 잘라내고， 파라핀 포매 후 3—4 卿로 절단하고 H&E 염색을 실시하였다. 윗치은 조직과 치주골의 조직병리학적 프로파일을 정상 대조군과 비교하여 관찰하였다. 결찰이 존재하는， 왼쪽과 오른쪽 절치 사이의 영역을 현미경으로 관찰하고， 염증성 세포 인플럭스 및 치주골과 시멘트질 온전성 (cementum integr i ty)을 고려하여 0-3점으로 점수화하였다 (표 2) .
【표 2】
Figure imgf000017_0001
또한， 이미지 분석 프로그램 (/Solution FL ver 9.1； IMT i -solution
Inc. ,)을 사용하여 제조한 세로 절단 시료에서 조직형태 분석으로서 제 1 및 제 2 어금니 사이의 윗치은 영역 상의 침입한 염증성 세포 (수 /윗치은 조직의 mm2) 및 콜라겐 차지 영역 (%/윗치은 조직의 麵 2)을 측정하였다. 나아가， 이미지 분석 프로그램을 사용하여 제조한 세로 절단 시료에서 오른쪽과 왼쪽 절치 (치아 뿌리 제거됨) 사이의 치주골 영역 상에서 치주골 부피 (%/치주골 영역의 mm 2), 파골세포 수 (수 /치주골 표면의 mm 2) 및 이들이 차지하는 퍼센트 (%/치주골 표면의 mm2)를 측정하였다. 조직병리학자들에게는 그룹 분배에 대한 정보를 제공하지 않았다. 통계 분석
모든 데이터는 8 마리 ¾트의 mean 土 표준편차 (S.D.)로 표현되었다. 복용량이 다른 그룹을 위한 다중비교 검사를 수행하였다. 변이 균질성 (Variance homogeneity)^- Levene test(Levene A, CI in Ot alary, 1981 ;6 :145-51)를 사용하여 조사하였다. Levene test 결과가 변이 균질성으로부터 유의성 없는 편차가 도출된 경우， 그룹 비교의 어느 그룹 쌍이 상당히 상이한가를 결정하기 위하여 , 얻어진 데이터를 one way ANOVA test 후의 least-signi f icant di f ferences(LSD) mult i -comparison test 에 의하여 분석하였다. 또한， 변이 균질성으로부터 유의성 있 편차가 Levene test 에서 관찰되는 경우에는 non-parametric comparison test 및 Kruskal- Wallis H test 를 수행하였다. Kruskal-Wal 1 is H test 에서 유의성 있는 차이가 관찰된 경우， 상당히 다른 차이를 보이는 특정 그룹 쌍을 결정하기 위하여 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test 를 수행하였다. 통계학적 분석은 SPSS(Release 14. OK, IBM SPSS Inc.,; Ludbrook, Clin Exp Pharmacol Physiol, 1997 ;24 :294-6)를 사용하여 수행하였다. 또한, 본 연구에서 결찰에 의하여 유발된 EPD 의 심각도를 확인하기 위하여, 정상 대조군과 EPD 대조군 사이의 퍼센트 변화를 계산하였고， 시험물질의 효능을 이해하는데 도움이 되도록 하기 수학식 2 및 3 에 따라 : EPD 대조군 및 시험물질 처리 랫트와 비교한 퍼센트 변화를 계산하였다.
수학식 2
정상 대조군과 비교한 퍼센트 변화 (%) = [((EPD 대조군의 데이터 - 정상 대조군 랫트의 데이터 )/정상 대조군 랫트의 데이터) X 100]
수학식 3
EPD 대조군과 비교한 퍼센트 변화 (%) = [ ((시험물질 처리 랫트의 데이터 - EPD 대조군 랫트의 데이터 )/EPD 대조군 랫트의 데이터) X 100] 실험결과
체중 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 감소가 결찰 후 2 일 (투여시작 후 1 일)부터 인정되기 시작하였으며， 10 일간의 투여기간 동안의 증체량 역시 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타내었다. 베타—글루콘산칼슘 및 자일리틀 단독 조성물 투여군에서는 투여 시작 6 및 7 일 후부터 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 인정되기 시작하였으며, 투여기간 동안의 증체량 역시 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타내었고, 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5， 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 투여 시작 2 일부터 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 나타나기 시작하였으며， 투여기간 동안의 증체량 역시 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01) 증가를 각각 나타내었다.
특히, 베타-글루콘산칼슴：자일리를 1:으 5， 1:1 및 i:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리틀 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 각각 투여시작 5, 6 및 8 일 후부터 인정되어， 투여기간 동안의 증체량 역시 각각의 베타- 글투콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01) 중가를 나타내었다.
인도메타신 (IND) 투여군에서는 투여시작 5 일 후부터 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01 또는 p<0.05) 체중의 감소를 나타내기 시작하였고, 투여 기간 동안의 증체량 역시 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (p으 01) 감소를 나타내었다 (표 3， 도 1).
【표 3】
Figure imgf000019_0001
구체적으로， 투여 기간인 10 일 동안의 증체량은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 -57.11%의 변화를 나타내었으며， 인도메타신, 베타- 글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5， 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -75.84， 44.38, 35.39, 91.57， 96.07， 99.44 및 60.11%의 변화를 나타내었다. 치주골소실율의 변화
EPD 대조군의 경우 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 치주골 소실에 의한 절치 치근 노출부위의 증가， 즉 치주골 소실율 증가가 인정되었으나， 인도메타신과 모든 베타-글루콘산칼슘 및 자일리틀 단독 및 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 치주골 소실율의 감소가 인정되었고， 특히, 베타-글루콘산칼슘：자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타 -:글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (ρθ.01) 치주골 소실율의 감소가 인정되었다 (도 2 및 3).
치주골 소실율은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 -319.84%의 변화를 나타내었으며， 인도메타신， 베타-글루콘산칼슴 및 자일리를 단독 조성물, 베타—글루콘산칼슘：자일리톨 1:0.5, 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -26.97， -22.81, -17.33, -36.66, - 36.93, -42.53 및 -23.82%의 변화를 나타내었다. 치은조직 내 생균수의 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01) 치은 조직 내 생균수의 증가가 인정되었으나, 자일리틀 단독과， 모든 베타- 글루콘산칼슘 및 자일리톨 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01) 생균수의 감소가 인정되었고， 특히 베타- 글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5， 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (ρθ.01) 생균수의 감소가 인정되었다.
인도메타신 및 베타-글루콘산칼슘 단독 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 의미 있는 치은 조직 내 생균수의 변화는 인정되지 않았다. 베타- 글루콘산칼슘：자일리를 1:4 복합 조성물 투여군에서는 베타-글루콘산칼슘 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 생균수의 감소가 인정되었다 (도 4).
치은 조직 내 생균수는 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 238.16%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘：자일리틀 1:0.5， 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 ,EPD 대조군에 비해 —2.14, -1.36, - 34.63, -53.31, -53.70, -54.28 및 -39.69%의 변화를 나타내었다. 치은조직 내 MPO활성의 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 치은 조직 내 MP0 활성의 증가가 인정되었으나， 인도메타신과 모든 베타ᅳ 글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 및 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (pO.01) MPO 활성의 감소가 인정되었고， 특히 베타—글루콘산칼슘：자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (ρθ.01 또는 p<0.05) MP0활성의 감소가 인정되었다 (도 5). 치은 조직 내 MP0 활성은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 387.19%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물， 베타-글루콘산칼슘：자일리톨 1:0.5， 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -59.30, -51.03, - 39.83， —66.23， -69.50, -70.50 및 -52.18%의 변화를 나타내었다. 치은 조직 내 IL-Ιβ 함량의 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 치은 조직 내 IL-Ιβ 함량의 증가가 인정되었으나, 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) IL-Ιβ 함량의 감소가 인정되었고， 특히 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5， 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) IL-Ιβ 함량의 감소가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) IL-Ιβ 함량의 감소가 인정되었다 (도 6).
치은 조직 내 IL-Ιβ 함량은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 178.88%의 변화를 나타내었으며， 인도메타신， 베타-글루콘산칼슘 및 자일리틀 단독 조성물， 베타-글루콘산칼슴：자일리틀 1:0.5， 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -35.69， -31.67， - 18.22, -44.21, -46.03, -48.53 및 -35.30%의 변화를 나타내었다. 치은조직 내 TNF-a 함량의 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (ρ<0·01) 치은 조직 내 TNF-α 함량의 증가가 인정되었으나， 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) TNF-a 함량의 감소가 인정되었고， 특히 베타-글루콘산칼슘：자일리틀 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슴 및 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (ρθ.01 또는 p<0.05) TNF-a 함량의 감소가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) TNF-a 함량의 감소가 인정되었으다 (도 7).
치은 조직 내 TNF-a 함량은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 243.25%의 변화를 나타내었으며， 인도메타신， 베타-볼루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물， 베타-글루콘산칼슘：자일리톨 1:0.5， 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -33.56， -37.82, - 24.33, -55.09， -57.06, -58.80 및 -39.63%의 변화를 나타내었다. 치은조직 내 MDA 함량의 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (ρ<0·01) 치은 조직 내 MDA 함량의 증가가 인정되었으나， 인도메타신을 포함한 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) MDA 함량의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5， 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) MDA 함량의 감소가 인정되었다. 베타—글루콘산칼슘：자일리틀 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리틀 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는 (pO.Ol) MDA 함량의 감소가 인정되었다 (도 8).
치은 조직 내 MDA 함량은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 379.25%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신， 베타ᅳ 루콘산칼슴 및 자일리틀 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘：자일리롤 1:0.5， 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -26.46, -33.65, - 21.24, -47.49, -51.75, -55.43 및 -37.88%의 변화를 나타내었다. 치은조직 내 iNOS 활성의 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01) 치은 조직 내 iNOS 활성의 중가가 인정되었으나, 인도메타신과 모든 베타- 글루콘산칼슘 및 자일리틀 단독 및 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (pO.01) i OS 활성의 감소가 인정되었고， 특히 베타-글투콘산칼슘：자일리를 1:0.5， 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 ρ<0·05) iNOS 활성의 감소가 인정되었다. 베타- 글루콘산칼슘：자일리를 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는 (pO.01) iNOS :활성의 감소가 인정되었다 (도 9).
치은 조직 내 iNOS 활성은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 632.11%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물， 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5, 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -27.40, -35.81, - 21.33, -47.94, -53.51, —55.30 및 —38.26%의 변화를 나타내었다. 상악골의조직병리학적 변화
EPD 대조군의 경우， 치은 부위에 현저한 염증세포 침윤과 부종 현상이 관찰되었으며， 치주골 부위에서는 파골세포 활성의 증가와 함께 치주골량의 감소, 즉 치주염 및 이와 관련된 치주골 소실이 인정되었으나， 모든 인도메타신과 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 및 복합 조성물 투여에 의해 이러한 치주염 및 이와 관련된 치주골 소실에 대한 조직병리학적 소견이 현저히 억제되었고， 특히 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5， 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해서도 현저한 치주염 및 이와 관련된 치주골 소실의 억제가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘：자일리톨 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해 의미 있는 치주염 및 이와 관련된 치주골소실 억제가 인정되었다 (표 4 및 도 10-12). 조직병리학적 점수 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 조직병리학적 점수의 증가가 인정되었으나， 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물을 포함한 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 현저한 조직병리학적 점수의 감소가 인정되었고， 특히 베타—글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.05) 조직병리학적 점수의 감소가 인정되었다 (도 12).
조직병리학적 점수는 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 475.00%의 변화를 나타내었으며， 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물， 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5， 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -30.43， -26.09, - 21.74, -52.17, -52.17, -56.52 및 -34.78%의 변화를 나타내었다. 치은 조직 내 침윤 염증세포의 수적 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01) 치은 조직 내 침윤 염증세포의 수적 증가가 인정되었으나， 인도메타신과 모든 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 및 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 침윤 염증세포의 수적 감소가 인정되었고， 특히 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (ρθ.01) 침윤 염중세포의 수적 감소가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) ：침윤 염증세포의 수적 감소가 인정되었다 (표 4).
침윤 염증세포의 수는 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 10425.33%의 변화를 나타내었으며， 인도메타신， 베타-글루콘산칼슴 및 자일리를 단독 조성물， 베타-글루콘산칼슘：자일리톨 1:0.5， 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -73.41， -67.15, - 28.92, -81.85, -87.64, -91.79 및 -61.27%의 변화를 나타내었다. 치은 조직 내 콜라겐 섬유의 함량 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 치은 조직 내 콜라겐 섬유 함량의 감소가 인정되었으나, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물을 포함한 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 콜라겐 섬유 함량의 증가가 인정되었고， 특히 베타ᅳ 글루콘산칼슘：자일리톨 1:0.5， 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리틀 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 콜라겐 섬유 함량의 증가가 인정되었다 (표 4).
침윤 염증세포의 수는 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 - 57.8OT의 변화를 나타내었으며， 인도메타신， 베타-글루콘산칼슴 및 자일리를 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘：자일리톨 1:0.5， 1:1， 1:2 및 1：4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 71.84， 54.24, 41.00, 78.96， 85.30, 97.82 및 59.82%의 변화를 나타내었다. 치주골량의 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 치주골량의 감소가 인정되었으나, 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (P<0.01) 치주골량의 중가가 인정되었고， 특히 베타- 글루콘산칼슘：자일리틀 1:0.5， 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 치주골량의 증가가 인정되었다 (표 4). 치주골량은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 -46.78%의 변화를 나타내었으며, IND, 베타—글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물， 베타- 글투콘산칼슘：자일리를 1:0.5， 1:1， 1:2 및 1:4 복합조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 31.21， 39.04, 23.22, 58.61, 60.89, 65.20 및 41.10%의 변화를 나타내었다. 파골세포의 변화
EPD 대조군의 경우， 정상 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 파골세포의 수 및 치주골 표면 당 파골세포가 차지하는 비율인 파골세포 비율의 증가가 각각 인정되었으나， 베타-글루콘산칼슴 및 자일리를 단독 조성물을 포함한 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01 또는 p<0.05) 파골세포의 수 및 비율의 감소가 인정되었고， 특히 베타—글루콘산칼슘：자일리톨 1:0.5， 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리틀 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 (ρθ.01 또는 p<0.05) 파골세포의 수 및 비율의 감소가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘：자일리를 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리를 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01) 파골세포의 수 및 비율의 감소가 인정되었다 (표 4).
파골세포의 수는 EPD 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 584.00%의 변화를 나타내었으며， 인도메타신 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘：자일리톨 1:0.5， 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -36.55， -53.80, - 33.92, -67.25, -65.50, —69.88 및 -56.43%의 변화를 나타내었다.
파골세포 비율은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 2407.82%의 변화를 나타내었으며， 인도메타신， 베타-글루콘산칼슘 및 자일리를 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘：자일리틀 1:으 5， 1:1， 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -47.15， -56.48, -32.34, -70.39， - 71.97， -74.88 및 -58.28%의 변화를 나타내었다. 【표 4】
Figure imgf000027_0001
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 둥가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

[청구의 범위]
【청구항 1】
베타-글루칸과 글루콘산칼슴의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 치주질환의 예방또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 베타-글루콘산칼슘과 자일리를의 중량비는 1 : 0. 1-3 .9인 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 3】
제 2 항에 있어서, 상기 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 중량비는
1 : 0 .3-3 .0인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성은 치주골 소실 억제， 치은 조직 내 세균에 대한 항균 활성， 치은 후직 내 중성호성 백혈구의 MPO myel oper ox i dase) 생성 억제, 치은 조직 내 염증성 사이토카인 생성 억제, 치은 조직 내 항산화 활성， 치은 조직의 부종 억제， 및 염증세포의 치은 조직으로의 침윤 억제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서, 상기 치주질환은 치주염，. 치은염， 구내염, 임플란트 주위염， 치주골 소실， 골용해， 치관주위염， 치주 고름집 및 치주증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6】
베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 치주질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
【청구항 7】
베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리를을 포함하는 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
【청구항 8】 베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 복합제인 베타—글루콘산칼슘; 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 조성물을 이를 필요로하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 치주질환의 예방， 개선 또는 치료방법.
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