KR20150136656A - 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베타-글루콘산칼슘 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 베타-글루콘산칼슘 또는 자일리톨 단독 조성물에 비하여 더 우수한 항균, 항염 및 항산화 효과를 나타내므로, 치주질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Compositions for preventing, improving or treating periodontal diseases}

본 발명은 치주질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 치주질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 및 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물에 관한 것이다.

치주질환은 치아 주위의 연조직 및 치주골이 만성염증으로 파괴되어 잇몸에서 출혈이 일어나고, 이가 흔들리며, 최후에는 치아를 상실시키는 질환으로서 풍치라고도 알려져 있다.

우리나라 치주질환 환자는 2010년 기준 만성질환별 진료인원 현황에서 알 수 있듯이 1,402만 명이며(출처: 국민건강보험공단), 외래환자 기준으로 2번째로 많이 진료를 받은 질병이다. 한국건강관리협회에 따르면 40세 이상의 90％가 치주염을 앓고 있으며, 우리나라의 경우 35세 이후에는 4명중 3명이, 그리고 40세 이상의 장 노년층은 80∼90％가 치주염을 앓고 있다.

이러한 치주질환의 치료는 환자의 개선된 구강위생의 확립, 비외과적 혹은 외과적인 치석 제거술, 치근활택술, 치은소파술을 응용한 치주조직의 재생술 등이 이용되어져 왔다. 부가적인 치료로서 페니실린 등의 항생제를 이용한 치면세균막을 형성하는 원인균의 퇴치가 이루어지고 있으나, 장기간의 사용 시 발생되는 항생제 내성균으로 인하여 효과 면에서 큰 성과를 얻지 못하고 있는 실정이다.

또한, 치주질환의 치료를 위하여 비스테로이드성 항염증제가 널리 사용되고 있으나, 상기 비스테로이드성 항염증제는 위장출혈, 복통, 두통 및 부종 등의 부작용을 수반하는 문제가 있다. 이에, 비스테로이드성 항염증제를 대체할 수 있는 안전한 치료제의 개발이 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 치주 질환의 예방 및 치료제를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 치주질환 동물 모델에 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 복합 조성물을 투여하는 경우, 자일리톨의 병용 투여에 의하여 치주질환에 대한 베타-글루콘산칼슘의 유효한 효과가 상승적으로 증가됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 치주질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 치주질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 치주 질환의 예방 및 치료제를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 치주질환 동물 모델에 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 복합 조성물을 투여하는 경우, 자일리톨의 병용 투여에 의하여 치주질환에 대한 베타-글루콘산칼슘의 유효한 효과가 상승적으로 증가됨을 확인하였다.

본 명세서에서 사용된 용어, "베타-글루콘산칼슘"은 베타-글루칸과 글루콘산칼슘을 포함하는 복합 제제를 의미한다.

상기 베타 글루칸(β-glucan)은 미생물, 곡물, 버섯, 해초, 효모 등에서 추출되는 글루코오스의 폴리머이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 베타 글루칸은 베타-1,3/1,6-글루칸일 수 있다. 상기 베타-1,3/1,6-글루칸은 주쇄로서 베타-1,3 결합으로 연결된 포도당 5 분자당 베타-1,6 결합을 하고 있는 단당류가 1 분자씩 연결된 분지형의 수용성 베타-글루칸으로, 베타-1,3 및 베타-1,6 결합이 서로 혼재되어 있는 분지된 베타-글루칸(branched β-glucan)이다. 이러한 베타-1,3/1,6-글루칸은 Aureobasi dium pullulans(예컨대, Aureobasidium pullulans SM2001)를 배양하여 수득할 수 있다.

상기 글루콘산칼슘은 백색 결정성 또는 알맹이 모양의 분말로 냄새가 없고 맛이 없는 칼슘염류 강화제로서, 과자류 및 두부제조에 칼슘강화제로 사용하며, 유지 및 도넛에 첨가하면 산화방지에 도움이 되는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 복합 제제 내 베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 중량비는 0.5-10:99.5-90일 수 있다.

보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 중량비는 1.5-5:98.5-95이고, 보다 더 구체적인 일구현예에서는 1.5-3:98.5-97이다.

본 발명의 특징 중 하나는 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 일정량 포함한다는 것이다. 하기 실시예에서 확인된 바와 같이, 자일리톨을 베타-글루콘산칼슘과 병용 투여하는 경우, 항염, 항균 및 항산화 효과와 같은 베타-글루콘산칼슘의 생리활성이 상승적으로 증진되어, 자일리톨 또는 베타-글루콘산칼슘 단독 투여 시 보다 더 우수한 치주질환 치료 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성은 (i) 치주골 소실 억제, (ii) 치은 조직 내 세균에 대한 항균 활성, (ii) 치은 조직 내 중성호성 백혈구의 MPO(myeloperoxidase) 생성 억제, (iii) 치은 조직 내 염증성 사이토카인(예컨대, TNF-α, IL-1β 등) 생성 억제, (iv) 치은 조직 내 항산화 활성(예컨대, 지질 과산화 억제, iNOS 활성 억제, NO 생성 억제 등), (v) 치은 조직의 부종 억제, 및 (vi) 염증세포의 치은 조직으로의 침윤 억제로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 중량비는 1:0.1-3.9일 수 있다.

보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 중량비는 1:0.3-3.5이고, 보다 더 구체적인 일구현예에서는 1:0.3-3.0이며, 보다 더 구체적인 다른 구현예에서는 1:0.3-2.5이고, 보다 더 구체적인 또 다른 구현예에서는 1:0.5-2.0이다.

본 발명에 의하여 예방 및 치료 가능한 치주질환으로는, 예를 들어, 치주염, 치은염, 구내염, 임플란트 주위염, 치주골 소실, 골용해(예컨대, 티타늄 입자-유도성 골용해), 치관주위염, 치주 고름집 및 치주증을 들 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 치주질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 용어, "개선" 및 "치료"는 조성물 투여에 의해 치주질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함된 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 투여량은 성인 기준으로 0.0001-10000 ㎎/kg 범위 내일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 치주질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강기능식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있으며, 이의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물을 드링크제로 제조하는 경우에는 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 각 종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 치주질환의 예방 및 개선에 매우 유용하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

베타-글루콘산칼슘과 자일리톨은 치주질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가될 수 있다. 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 다른 의약외품 성분[예컨대, 충치 예방제(불화나트륨, 불화인산나트륨, 불화아민 등), 살균제(클로로헥시딘, 세틸피리디움 클로라이드, 트리클로산 등), 추가의 염증 완화제(알란토인, 아미노카프론산, 트라넥사민산, 초산토코페롤 등) 등]과 함께 첨가할 수 있고, 첨가량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 의약외품 조성물은 연마제, 습윤제, 결합제, 기포제, 감미제, 계면 활성제, 향료 및 색소로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 물질을 추가로 포함할 수 있고, 조성물의 형태는 페이스트상, 분말상 또는 액상(가글 형태)일 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 의약외품 조성물은 치약, 구강청정제(가글), 구강보호제, 소독청결제 또는 연고제일 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 베타-글루콘산칼슘 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 치주질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

(ii) 본 발명의 조성물은 베타-글루콘산칼슘 또는 자일리톨 단독 조성물에 비하여 더 우수한 항균, 항염 및 항산화 효과를 나타내므로, 치주질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 정상 랫트와 EPD 랫트의 체중 변화를 보여준다. 그래프 중 'before'는 결찰 하루 전을 나타내며, LP는 결찰 시를 나타낸다.
도 2는 정상 랫트와 EPD 랫트의 위 왼쪽 절치 주위의 이미지이다.
A= 정상 대조군 랫트, B= EPD 대조군 랫트, C= 인도메타신 5 mg/kg 처리 랫트, D= 베타-글루콘산칼슘 단일 제형 100 mg/kg 처리 랫트, E= 자일리톨 단일 제형 100 mg/kg 처리 랫트, F= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트, G= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:1 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트, H= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:2 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트, I= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:4 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트.
도 3은 정상 랫트와 EPD 랫트의 치주골 손실율을 보여준다.
도 4는 정상 랫트와 EPD 랫트의 치은 조직 내 생균수를 보여준다.
도 5는 정상 랫트와 EPD 랫트의 치은 조직 내 MPO 활성을 보여준다.
도 6은 정상 랫트와 EPD 랫트의 치은 조직 내 IL-1β 수준을 보여준다.
도 7은 정상 랫트와 EPD 랫트의 치은 조직 내 TNF-α 수준을 보여준다.
도 8은 정상 랫트와 EPD 랫트의 치은 조직 내 MDA 수준을 보여준다.
도 9는 정상 랫트와 EPD 랫트의 치은 조직 내 iNOS 활성을 보여준다.
도 10a 및 10b는 정상 랫트와 EPD 랫트의 윗절치 사이의 치은 조직의 조직학적 이미지이다. 스케일 바 = 120 ㎛.
A= 정상 대조군 랫트, B= EPD 대조군 랫트, C= 인도메타신 5 mg/kg 처리 랫트, D= 베타-글루콘산칼슘 단일 제형 100 mg/kg 처리 랫트, E= 자일리톨 단일 제형 100 mg/kg 처리 랫트, F= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트, G= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:1 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트, H= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:2 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트, I= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:4 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트.
도 11a 및 11b는 정상 랫트와 EPD 랫트의 윗절치 사이의 치주골 영역의 조직학적 이미지이다. 스케일 바 = 120 ㎛.
A= 정상 대조군 랫트, B= EPD 대조군 랫트, C= 인도메타신 5 mg/kg 처리 랫트, D= 베타-글루콘산칼슘 단일 제형 100 mg/kg 처리 랫트, E= 자일리톨 단일 제형 100 mg/kg 처리 랫트, F= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트, G= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:1 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트, H= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:2 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트, I= 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:4 혼합 제형(g/g) 100 mg/kg 처리 랫트.
도 12는 정상 랫트와 EPD 랫트의 조직학적 스코어를 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

실험동물 및 관리

총 160 마리의 건강한 수컷 스프라그-돌리 랫트(6주령, 체중 170-190g, SLC, 일본)를 9일간 순응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험동물을 우리 당 4 또는 5 마리씩 분배하였다(온도 20-25℃, 습도 50-55%). 암주기는 12 hr:12 hr이었고, 표준 설치류 사료와 물을 제한 없이 공급하였다. 실험그룹은 다음 표 1과 같았다.

시험물질의 투여

글루콘산 칼슘과 β-1,3/1,6-글루칸의 2:98 혼합물(g/g)인 베타-글루콘산 칼슘과, 자일리톨은 아리바이오(Aribio, 서울, 한국)로부터 공급받았다. 베타-글루콘산칼슘은 오프 화이트(off white) 분말로서 증류수에 잘 용해되었다. 베이지 색의 인도메타신 분말은 시그마-알드리치에서 구입하였다. 적량의 베타-글루콘산 칼슘과 자일리톨을 직접 증류수에 용해하여 4종류의 혼합 제형을 제조하였다. 결찰 하루 후, 베타-글루콘산칼슘, 자일리톨, 및 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 혼합물(g/g) 100 mg/kg, 또는 인도메타신 5 mg/kg을 5 ㎖/kg의 용량으로 10일 동안 하루 한 번 경구 투여하였다. 정상 및 EPD 대조군에는 동량의 증류수를 경구 투여하였다.

치주질환 유발

실험적 치주질환(Experimental periodontal diseases, EPD)을 이전의 방법 (Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2011;108:241-250; ISRN Vet Sci. 2012;2012:862104)을 변형시켜, 실험동물을 25 mg/kg의 졸레틸 혼합물(Zoletile 50; Virbac Lab) 복강 주사로 마취한 다음, 왼쪽 절치의 치아 경부에 3-0 나일론 봉합사를 이용하여 결찰을 실시하여 치주염 및 질환을 유발하였다. 정상 대조군에서는 절치의 치아 경부 부분만 확인한 후 결찰하지 않았다.

체중 변화

결찰 1일 전부터 매일 체중을 측정하였다. 각 실험동물간의 차이를 감소시키기 위하여, 투여 10일 후의 체중 증가를 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

수학식 1

시험물질 처리 10일 동안의 체증 증가(g) = 희생 시 체중 - 투여 개시 시의 체중(결찰 후 24시간)

치주골 손실 측정

실험동물을 투여 후 10일째(결찰 후 11일) 희생시키고, 상악골 함유 결찰 부위(두 번째 어금니)를 절개한 다음, 가로 치주골 손실, 교두정(cusp tip)과 치주골 사이 거리를 이전의 방법(J Periodontal Res.1990;25:308-315)을 변형하여 측정하였다. 측정은 윗 왼쪽 절치(incisior teeth)의 뿌리 축을 따라 이루어졌다.

미생물학적 분석

위 왼쪽 절치 주변의 치은 조직을 제거하고, 0.3 ㎖의 BHI 브로스(brain heart infusion broth, Becton, Dicknson and Company)에 위치시켰다. 이후, 모은 절편을 균질화하고, 1:100과 1:1000으로 희석하여 혈액한천배지(5% 탈섬유소 양 혈액과 henin/menadione 10 ㎍/㎖이 첨가된 BHI agar; Dicknson and Company)에 분주한 다음, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 48시간 동안 인큐베이션 하였다. 48시간 후, 형성된 콜로니 수를 X 10⁵ CFU/g 조직과 같이 계수하였다.

MPO 활성 측정

호중구 축적으로서 MPO 활성을 측정하기 위하여, EPD 유발 11일째에 결찰 주위 윗치은 조직을 채취하였다. MPO 활성을 측정하기 위하여 분광광도법을 사용하였다. 상단 왼쪽 절치 주변의 치은 조직을 제거하고, -70℃에서 저장하였다. MPO를 용해시키기 위하여 50 mM 인산칼륨 버퍼(pH 6.0)에 용해된 0.5% HTAB(hexadecyltrimethyl ammonium bromide, Gibco)에 재료를 현탁시켰다. 얼음 수조에서 균질화 한 후(15초), 시료를 두 번 동결-해동시켰다. 조직 15 mg 당 400 ㎕의 버퍼에 도달시키기 위하여, 테스트 튜브에 추가의 버퍼를 첨가하였다. 12분간 1000 X g로 원심분리한 후, 상청액 0.1 ㎖를 0.167 mg/㎖ o-디아니시딘 디하이드로클로라이드(Sigma-Aldrich), 증류수 및 0.0005% 과산화수소가 함유된 인산염 버퍼(50 mM, pH 6.0) 2 ㎖에 첨가하여, 튜브 당 2.1 ㎖의 최종 부피가 되도록 하였다. 흡광도를 분광광도계로 측정하였다(460 nm). 활성 1 유닛을 25℃에서 1 μmol의 과산화물 분해/분으로 정의하였다. 결과는 MPO 유닛/㎖로 표현하였다.

상악골 치은 조직에서 IL-1β 및 TNF-α의 검출

결찰 주변 부위로부터 구강 윗치은 조직을 EPD 유발 후 11일째에 채취하였다. 채취한 조직을 균질화하고, 이전에 보고된 문헌(J Ethnopharmacol. 2007;113:471-478)에 따라 처리하였다. IL-1β 및 TNF-α의 농도를 ELISA로 측정하였다. 랫트 IL-1β 또는 TNF-α(10 ug/ml)에 대한 항체로 마이크로 타이터 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트를 블록킹 한 후, 다양한 희석 농도의 시료와 표준을 첨가하고, 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 버퍼로 플레이트를 세 번 세척하였다. 세척 후, 100 ㎖의 비오틴화 양 폴리클로날 항-랫트 TNF-α 또는 항-랫트 IL-1β(어세이 버퍼 1% BSA로 1/1000으로 희석; abcam)를 웰에 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 추가적으로 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척하고, 100 ㎕의 아비딘-HRP(1:5000 희석; abcam)를 첨가하였다. 15분 후에 발색 시약 o-페닐렌디아민(100 ㎕; Sigma-Aldrich)을 첨가하고, 플레이트를 암조건에서 37℃의 온도로 20분간 인큐베이션 하였다. H₂SO₄를 사용하여 효소 반응을 정지시키고, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

MDA 측정

결찰 주변 부위에서 채취한 구강 윗치은 조직 내 MDA의 수준(지질 과산화의 지표)을 측정하였다. 간략히 설명하면, 조직을 50 mM Tris-HCl, 0.1 mM EGTA 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(pH 7.4)로 이루어진 균질화 버퍼로 균질화하였다. 구강 윗치은 조직 파쇄액의 표본(100 ㎕)을 200 ㎕의 8.1%(w/v) 소듐 도데실 설파이트(Sigma-Aldrich), 1500 ㎕의 20%(v/v) 아세트산(pH 3.5), 1500 ㎕의 0.8%(w/v) 티오바르비툴산(Sigma-Aldrich) 및 700 ㎕의 증류수가 함유된 반응 혼합물에 첨가하였다. 이후, 시료에 95℃의 열을 1시간 동안 가하고, 3000 X g로 10분간 원심분리를 하였다. 상청액의 흡광도를 650 nm에서 측정하였다.

iNOS 활성 측정

윗치은 조직 내 iNOs 활성을 이전에 보고된 방법(Free Radic Biol Med. 1998;24:450-459)으로 평가하였다. 균질액에서 L-[3H]-아르기닌의 L-[3H]-시트룰린의 변환을 측정하였다. 간략히 설명하면, 균질액을 L-[3H]-아르기닌(10 mM, 5 kBq/튜브), NADPH(1 mM), 칼모듈린(30 nM), 테트라하이드로바이오프테린(5 mM) 및 칼슘(2 mM)의 존재 하에서 30분간 인큐베이션 하였다(22℃). EGTA(2 mM)과 EDTA(2 mM)이 함유된 차가운 HEPES 버퍼(pH 5.5) 0.5 ㎖로 희석하여 반응을 종결시켰다. NADPH가 없는 조건에서 수행한 실험에서는, NOS 활성과는 별도로 L-[3H]-시트룰린 형성량을 측정하였다. NADH 존재(칼슘이 없는) 및 EGTA(5 mM) 존재 하에서의 실험에서는 칼슘-독립적 NOS 활성을 측정하였다. 반응 혼합물을 Dowex 50W(Na/form) 컬럼에 적용하고, 용출된 L-[3H]-시트룰린 활성을 액체섬광 계수기(liquid scintillation counter; Wallac)로 측정하였다.

조직병리학적 분석

EPD 유발 후 11일째에 결찰 주위의 상악골 영역을 시료로 만든 다음, 10% 중성 버퍼 포르말린에 고정하였다. 고정 후, 시료를 석회질 제거 용액(24.4% 포름산 및 0.5N 수산화나트륨)을 사용하여 5일간 석회질을 제거하였다. 이후, 시료를 왼쪽과 오른쪽 절치가 포함되도록 세로 방향으로 잘라내고, 파라핀 포매 후 3-4 ㎛로 절단하고 H&E 염색을 실시하였다. 윗치은 조직과 치주골의 조직병리학적 프로파일을 정상 대조군과 비교하여 관찰하였다. 결찰이 존재하는, 왼쪽과 오른쪽 절치 사이의 영역을 현미경으로 관찰하고, 염증성 세포 인플럭스 및 치주골과 시멘트질 온전성(cementum integrity)을 고려하여 0-3점으로 점수화하였다(표 2).

또한, 이미지 분석 프로그램(iSolution FL ver 9.1; IMT i-solution Inc.,)을 사용하여 제조한 세로 절단 시료에서 조직형태 분석으로서 제1 및 제2 어금니 사이의 윗치은 영역 상의 침입한 염증성 세포(수/윗치은 조직의 mm²) 및 콜라겐 차지 영역(%/윗치은 조직의 mm²)을 측정하였다. 나아가, 이미지 분석 프로그램을 사용하여 제조한 세로 절단 시료에서 오른쪽과 왼쪽 절치(치아 뿌리 제거됨) 사이의 치주골 영역 상에서 치주골 부피(%/치주골 영역의 mm²), 파골세포 수(수/치주골 표면의 mm²) 및 이들이 차지하는 퍼센트(%/치주골 표면의 mm²)를 측정하였다. 조직병리학자들에게는 그룹 분배에 대한 정보를 제공하지 않았다.

통계 분석

모든 데이터는 8마리 랫트의 mean ± 표준편차(S.D.)로 표현되었다. 복용량이 다른 그룹을 위한 다중비교 검사를 수행하였다. 변이 균질성(Variance homogeneity)은 Levene test(Levene A, Clin Otalary, 1981;6:145-51)를 사용하여 조사하였다. Levene test 결과가 변이 균질성으로부터 유의성 없는 편차가 도출된 경우, 그룹 비교의 어느 그룹 쌍이 상당히 상이한가를 결정하기 위하여, 얻어진 데이터를 one way ANOVA test 후의 least-significant differences(LSD) multi-comparison test에 의하여 분석하였다. 또한, 변이 균질성으로부터 유의성 있는 편차가 Levene test에서 관찰되는 경우에는 non-parametric comparison test 및 Kruskal-Wallis H test를 수행하였다. Kruskal-Wallis H test에서 유의성 있는 차이가 관찰된 경우, 상당히 다른 차이를 보이는 특정 그룹 쌍을 결정하기 위하여 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test를 수행하였다. 통계학적 분석은 SPSS(Release 14.0K, IBM SPSS Inc.,; Ludbrook, Clin Exp Pharmacol Physiol, 1997;24:294-6)를 사용하여 수행하였다. 또한, 본 연구에서 결찰에 의하여 유발된 EPD의 심각도를 확인하기 위하여, 정상 대조군과 EPD 대조군 사이의 퍼센트 변화를 계산하였고, 시험물질의 효능을 이해하는데 도움이 되도록 하기 수학식 2 및 3에 따라 EPD 대조군 및 시험물질 처리 랫트와 비교한 퍼센트 변화를 계산하였다.

수학식 2

정상 대조군과 비교한 퍼센트 변화(%) = [((EPD 대조군의 데이터 - 정상 대조군 랫트의 데이터)/정상 대조군 랫트의 데이터) X 100]

수학식 3

EPD 대조군과 비교한 퍼센트 변화(%) = [((시험물질 처리 랫트의 데이터 - EPD 대조군 랫트의 데이터)/EPD 대조군 랫트의 데이터) X 100]

실험결과

체중 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 감소가 결찰 후 2일(투여시작 후 1일)부터 인정되기 시작하였으며, 10일간의 투여기간 동안의 증체량 역시 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 감소를 나타내었다. 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에서는 투여 시작 6 및 7일 후부터 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 인정되기 시작하였으며, 투여기간 동안의 증체량 역시 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 증가를 나타내었고, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 투여 시작 2일부터 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 나타나기 시작하였으며, 투여기간 동안의 증체량 역시 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 증가를 각각 나타내었다.

특히, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 각각 투여시작 5, 6 및 8일 후부터 인정되어, 투여기간 동안의 증체량 역시 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 증가를 나타내었다.

인도메타신(IND) 투여군에서는 투여시작 5일 후부터 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 감소를 나타내기 시작하였고, 투여 기간 동안의 증체량 역시 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 감소를 나타내었다(표 3, 도 1).

구체적으로, 투여 기간인 10일 동안의 증체량은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 -57.11%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -75.84, 44.38, 35.39, 91.57, 96.07, 99.44 및 60.11%의 변화를 나타내었다.

치주골 소실율의 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치주골 소실에 의한 절치 치근 노출부위의 증가, 즉 치주골 소실율 증가가 인정되었으나, 인도메타신과 모든 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 및 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치주골 소실율의 감소가 인정되었고, 특히, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01) 치주골 소실율의 감소가 인정되었다(도 2 및 3).

치주골 소실율은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 -319.84%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -26.97, -22.81, -17.33, -36.66, -36.93, -42.53 및 -23.82%의 변화를 나타내었다.

치은 조직 내 생균수의 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치은 조직 내 생균수의 증가가 인정되었으나, 자일리톨 단독과, 모든 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 생균수의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01) 생균수의 감소가 인정되었다.

인도메타신 및 베타-글루콘산칼슘 단독 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 의미 있는 치은 조직 내 생균수의 변화는 인정되지 않았다. 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:4 복합 조성물 투여군에서는 베타-글루콘산칼슘 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 생균수의 감소가 인정되었다(도 4).

치은 조직 내 생균수는 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 238.16%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -2.14, -1.36, -34.63, -53.31, -53.70, -54.28 및 -39.69%의 변화를 나타내었다.

치은 조직 내 MPO 활성의 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치은 조직 내 MPO 활성의 증가가 인정되었으나, 인도메타신과 모든 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 및 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) MPO 활성의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) MPO 활성의 감소가 인정되었다(도 5).

치은 조직 내 MPO 활성은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 387.19%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -59.30, -51.03, -39.83, -66.23, -69.50, -70.50 및 -52.18%의 변화를 나타내었다.

치은 조직 내 IL-1β 함량의 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치은 조직 내 IL-1β 함량의 증가가 인정되었으나, 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) IL-1β 함량의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) IL-1β 함량의 감소가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는(p<0.01) IL-1β 함량의 감소가 인정되었다(도 6).

치은 조직 내 IL-1β 함량은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 178.88%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -35.69, -31.67, -18.22, -44.21, -46.03, -48.53 및 -35.30%의 변화를 나타내었다.

치은 조직 내 TNF-α 함량의 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치은 조직 내 TNF-α 함량의 증가가 인정되었으나, 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) TNF-α 함량의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) TNF-α 함량의 감소가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는(p<0.05) TNF-α 함량의 감소가 인정되었으다(도 7).

치은 조직 내 TNF-α 함량은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 243.25%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -33.56, -37.82, -24.33, -55.09, -57.06, -58.80 및 -39.63%의 변화를 나타내었다.

치은 조직 내 MDA 함량의 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치은 조직 내 MDA 함량의 증가가 인정되었으나, 인도메타신을 포함한 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) MDA 함량의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01) MDA 함량의 감소가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는(p<0.01) MDA 함량의 감소가 인정되었다(도 8).

치은 조직 내 MDA 함량은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 379.25%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -26.46, -33.65, -21.24, -47.49, -51.75, -55.43 및 -37.88%의 변화를 나타내었다.

치은 조직 내 iNOS 활성의 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치은 조직 내 iNOS 활성의 증가가 인정되었으나, 인도메타신과 모든 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 및 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) iNOS 활성의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) iNOS 활성의 감소가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는(p<0.01) iNOS 활성의 감소가 인정되었다(도 9).

치은 조직 내 iNOS 활성은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 632.11%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -27.40, -35.81, -21.33, -47.94, -53.51, -55.30 및 -38.26%의 변화를 나타내었다.

상악골의 조직병리학적 변화

EPD 대조군의 경우, 치은 부위에 현저한 염증세포 침윤과 부종 현상이 관찰되었으며, 치주골 부위에서는 파골세포 활성의 증가와 함께 치주골량의 감소, 즉 치주염 및 이와 관련된 치주골 소실이 인정되었으나, 모든 인도메타신과 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 및 복합 조성물 투여에 의해 이러한 치주염 및 이와 관련된 치주골 소실에 대한 조직병리학적 소견이 현저히 억제되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 현저한 치주염 및 이와 관련된 치주골 소실의 억제가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해 의미 있는 치주염 및 이와 관련된 치주골 소실 억제가 인정되었다(표 4 및 도 10-12).

조직병리학적 점수 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 조직병리학적 점수의 증가가 인정되었으나, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물을 포함한 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 현저한 조직병리학적 점수의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.05) 조직병리학적 점수의 감소가 인정되었다(도 12).

조직병리학적 점수는 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 475.00%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -30.43, -26.09, -21.74, -52.17, -52.17, -56.52 및 -34.78%의 변화를 나타내었다.

치은 조직 내 침윤 염증세포의 수적 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치은 조직 내 침윤 염증세포의 수적 증가가 인정되었으나, 인도메타신과 모든 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 및 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 침윤 염증세포의 수적 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01) 침윤 염증세포의 수적 감소가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 침윤 염증세포의 수적 감소가 인정되었다(표 4).

침윤 염증세포의 수는 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 10425.33%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -73.41, -67.15, -28.92, -81.85, -87.64, -91.79 및 -61.27%의 변화를 나타내었다.

치은 조직 내 콜라겐 섬유의 함량 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치은 조직 내 콜라겐 섬유 함량의 감소가 인정되었으나, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물을 포함한 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 콜라겐 섬유 함량의 증가가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 콜라겐 섬유 함량의 증가가 인정되었다(표 4).

침윤 염증세포의 수는 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 -57.80%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 71.84, 54.24, 41.00, 78.96, 85.30, 97.82 및 59.82%의 변화를 나타내었다.

치주골량의 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치주골량의 감소가 인정되었으나, 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 치주골량의 증가가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 치주골량의 증가가 인정되었다(표 4).

치주골량은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 -46.78%의 변화를 나타내었으며, IND, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 31.21, 39.04, 23.22, 58.61, 60.89, 65.20 및 41.10%의 변화를 나타내었다.

파골세포의 변화

EPD 대조군의 경우, 정상 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 파골세포의 수 및 치주골 표면 당 파골세포가 차지하는 비율인 파골세포 비율의 증가가 각각 인정되었으나, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물을 포함한 모든 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 파골세포의 수 및 비율의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 파골세포의 수 및 비율의 감소가 인정되었다. 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:4 복합 조성물 투여군에서도 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 파골세포의 수 및 비율의 감소가 인정되었다(표 4).

파골세포의 수는 EPD 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 584.00%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -36.55, -53.80, -33.92, -67.25, -65.50, -69.88 및 -56.43%의 변화를 나타내었다.

파골세포 비율은 EPD 대조군에서는 정상 대조군에 비해 2407.82%의 변화를 나타내었으며, 인도메타신, 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1, 1:2 및 1:4 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 -47.15, -56.48, -32.34, -70.39, -71.97, -74.88 및 -58.28%의 변화를 나타내었다.

결론

치주질환은 대표적인 만성 염증질환으로 치은염과 함께 이와 관련된 치주골의 소실이 일어나는 것으로 알려져 있으며, 다양한 세균의 증식과 이와 관련된 염증이 강력한 병인으로 부각되고 있고, 근래에 들어 산화질소의 산화 스트레스가 발병에 기인하는 것으로 알려져 있다(Br J Pharmacol. 1998;123:353-360).

본 실험의 결과, 치아 경부 결찰 후 현저한 체중 및 증체량의 감소, 치주골 손실율, 치은 조직 내 생균수, MPO 및 iNOS 활성, IL-1β, TNF-α 및 MDA 함량의 현저한 증가가 인정되었으며, 조직병리학적 검사에서 치은 조직 내 염증세포의 침윤, 콜라겐 섬유의 감소, 치주골량의 감소, 파골세포의 수 및 활성의 증가, 즉, 전형적인 치주염 및 이와 관련된 치주골 소실이 유발되었다.

이러한 체중 감소, 치은 내 생균수의 증가, 치주염 및 치주골 감소 소견이 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 복합 조성물 투여에 의해 유의성 있게 억제되었으며, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 억제가 인정되었다. 따라서, 적절한 비율의 자일리톨 첨가는 항균, 항염 및 항산화 효과에 대한 상승작용을 통해 치아 경부 결찰로 유발되는 치주질환에 대한 베타-글루콘산칼슘의 효과를 상승적으로 증가시키는 것으로 관찰되었다.

치주골 질환 유발되는 치주염 및 치주골의 손상은 저작곤란으로 직결되고, 이 결과 현저한 체중 감소가 초래된다. 따라서, 이러한 체중 감소의 억제는 치주염 및 치주골 손상에 대한 예방 또는 치료 효과를 간접적으로 나타내주는 것으로 볼 수 있다. 본 실험의 결과, 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 복합 조성물 투여군에서 EPD 대조군에 비해 현저한 체중 및 증체량의 증가가 각각 인정되었으며, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 체중 및 증체량의 증가가 인정되었다. 이러한 결과는, 적절한 비율의 자일리톨 첨가에 의해 베타-글루콘산칼슘의 치아 경부 결찰로 유발되는 치주질환 관련 체중 감소억제 효과가 현저히 상승적으로 증가되는 직접적인 증거로 판단된다.

치주골 손실율(alveolar bone loss score)은 치주골 질환에서 염증반응에 의한 치주골 손실을 평가하는 가장 기본적인 육안기준으로 스코어가 높을수록 치주골의 손실이 큰 것으로 알려져 있다(J Ethnopharmacol. 2007;113:471-478). 본 실험의 결과, EPD 대조군에 비해 유의성 있는 치주골 손실율의 감소가 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 복합 조성물 투여군에서 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 치주골 손실율의 감소가 인정되었다. 이러한 결과는, 적절한 비율의 자일리톨 첨가에 의해 베타-글루콘산칼슘의 치아 경부 결찰로 유발되는 치주질환 관련 치주골의 손실 억제 효과가 상승적으로 증가됨을 보여준다.

세균 역시 치주질환의 중요한 원인으로 알려져 있으며, 병리학적으로 치주 질환 시 세균의 증식에 의해 염증반응이 시작되고, 현저한 치주골의 소실이 야기된다(J Periodontol. 2005;76:1901-1909). 또한, 치아 경부 결찰로 유발되는 치주질환 시에도 결찰 주변 치은 조직 내 생균수, 특히 호기성의 그람음성 간균의 현저한 증가가 초래되는 것으로 알려져 있으며(J Periodontol. 2005;76:1901-1909), 본 실험에서도 EPD 대조군의 결찰 주변 치은 조직 내에서 현저한 생균수의 증가가 인정되었으나, 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 생균수의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 생균수의 감소가 인정되었다. 이러한 결과는, 적절한 비율의 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 복합 조성에 의해 치아 경부 결찰로 유발되는 치주질환 관련 세균 증식 억제 효과가 상승적으로 증가함을 보여준다.

치주염 시 중성호성 백혈구의 현저한 침윤이 일어나며, 이들 중성호성 백혈구는 염증반응 시 원인이 되는 이물질 치료에 필수적인 역할을 하나, 독성 활성 산소를 생산하여 주변 조직을 파괴하는 것으로 알려져 있다(J Leukoc Biol. 2000;67:591-602). MPO는 중성호성 백혈구에서 생산되는 대표적인 세포독성 효소로, 치주질환 시에도 치주 조직 내에서 현저한 상승이 초래된다(J Periodontal Res. 2012;47:800-810). 본 실험에서도 조직병리학적 검사에서 인정된 염증세포 침윤의 증가와 함께 현저한 치은 조직 내 MPO 함량의 증가가 인정되었으나, 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 복합 조성물 투여군에서는 각각 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 MPO 활성의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 MPO 활성의 감소가 인정되었다. 이러한 결과는, 적절한 비율의 자일리톨 첨가에 의해 베타-글루콘산칼슘의 치아 경부 결찰로 유발 되는 치주질환 관련 중성호성 백혈구의 활성 억제 효과가 상승적으로 증가됨을 보여준다.

치주질환에서 염증성 사이토카인, 특히 TNF-α와 IL-1β의 중요성은 이미 잘 알려져 있다(J Periodontol. 2004;75:162-168). 치주질환에서 TNF는 아이코사노이드(eicosanoids) 및 다른 사이토카인, 즉, TNF-α와 IL-1을 유리시켜 치주염을 악화시키고, IL-1은 중성호성 백혈구와 대식세포를 활성화시켜 활성산소와 NO의 유리를 촉진시키고, 그 결과적으로 주변 조직의 손상을 유래한다(J Immunol. 1998;160:403-409). 따라서, 이들 TNF-α와 IL-1β의 억제는 치주염 및 이와 관련된 치주골 손실을 억제할 수 있다.

본 연구결과, 모든 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) TNF-α 및 IL-1β 함량의 감소가 인정되었고, 특히 적절한 비율의 자일리톨 첨가에 의해 베타-글루콘산칼슘의 항염 효과가 상승적으로 증가되는 직접적인 증거의 일환으로, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 TNF-α 및 IL-1β 함량의 감소가 인정되었다.

근래에 들어 NO의 산화 스트레스가 치주질환의 발병에 관여하는 것으로 알려져 있다. MDA는 일반적으로 사용된 지질 과산화(lipid peroxidation) 마커로, 치주질환에서도 현저한 상승이 초래되는 것으로 알려져 있다(J Dent Res. 2004;83:343-348). iNOS는 박테리아 LPS, IL-1β, TNF-α 및 인터페론-γ 등의 염증 유발물질에 의해 다양한 세포에서 유도되며, iNOS의 작용에 의한 L-아르기닌의 산화에 의해 형성되는 NO는 생체에 다양한 종류의 생리학적 및 생리병리학적 변화를 일으키며, 쇼크와 염증 반응을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 치주 질환에서도 이들 NO의 상승이 초래되며, 이로 인한 주변 조직, 특히 치주골의 손실이 일어나는 것으로 알려져 있다(J Dent Res. 2004;83:343-348). 본 연구에서도 결찰을 실시한 치은 조직에서 현저한 MDA 함량 증가와 함께 iNOS의 활성 증가가 인정되었으나, 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 복합 조성물 투여군에서는 EPD 대조군에 비해 유의성 있는 MDA 함량 및 iNOS 활성의 감소가 인정되었고, 특히 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 각각의 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 유의성 있는 iNOS 활성의 감소가 인정되었다. 이러한 결과는, 적절한 비율의 자일리톨 첨가에 의해 베타-글루콘산칼슘의 항산화 효과가 상승적으로 증가되어 iNOS의 활성이 억제되고, 이에 따라 NO 생성이 차단되어 치주질환 시 주변 조직의 파괴가 억제됨을 보여준다.

본 연구에서는 조직병리학적으로 결찰부 주위에 염증세포 침윤과 부종을 특징으로 하는 치은염이 유발되었으며, 파골세포의 활성화에 의해 치주골의 흡수 소실이 인정되었다. 즉, 염증세포의 침윤 정도와 치주골 소실을 바탕으로 한 조직학적 스코어(histological score)의 증가, 중성호성 백혈구를 포함한 침윤 염증세포의 수적 증가, 부종에 따른 콜라겐 섬유 비율의 감소, 치주골량의 감소, 파골세포의 수 및 비율의 증가가 조직 형태 계측(histomorphometry)으로 각각 인정되었다.

그러나, 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 복합 조성물 투여에 의해 이러한 치주염 및 이와 관련된 치주골 소실에 대한 조직병리학적 소견이 현저히 억제되었고, 특히 적절한 비율의 자일리톨 첨가에 의해 베타-글루콘산칼슘의 효과가 상승적으로 증가 되는 증거의 일환으로, 베타-글루콘산칼슘:자일리톨 1:0.5, 1:1 및 1:2 복합 조성물 투여군에서는 베타-글루콘산칼슘 및 자일리톨 단독 조성물 투여군에 비해서도 현저한 치주염 및 이와 관련된 치주골 소실의 억제가 조직병리학적으로 인정되었다.

이상의 결과를 통하여, 자일리톨 첨가는 항균, 항염 및 항산화 효과에 대한 상승작용을 통하여, 치주질환에 대한 베타-글루콘산칼슘의 효과를 상승적으로 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 중량비는 1:0.1-3.9인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 베타-글루콘산칼슘과 자일리톨의 중량비는 1:0.3-3.0인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성은 치주골 소실 억제, 치은 조직 내 세균에 대한 항균 활성, 치은 조직 내 중성호성 백혈구의 MPO(myeloperoxidase) 생성 억제, 치은 조직 내 염증성 사이토카인 생성 억제, 치은 조직 내 항산화 활성, 치은 조직의 부종 억제, 및 염증세포의 치은 조직으로의 침윤 억제로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 치주질환은 치주염, 치은염, 구내염, 임플란트 주위염, 치주골 소실, 골용해, 치관주위염, 치주 고름집 및 치주증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 치주질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
7. 베타-글루칸과 글루콘산칼슘의 복합제인 베타-글루콘산칼슘; 및 상기 베타-글루콘산칼슘의 생리활성 증진제로서 자일리톨을 포함하는 치주질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.

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