KR20160078062A

KR20160078062A - 슈도사이펠라리아 코리아세아 추출물, 또는 피스키오스포린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20160078062A
Application number: KR1020140188732A
Authority: KR
Inventors: 김항건; 허재선; 양의
Original assignee: 순천대학교 산학협력단; (재) 순천천연물의약소재개발연구센터
Priority date: 2014-12-24
Filing date: 2014-12-24
Publication date: 2016-07-04
Also published as: KR101643058B1

Abstract

본 발명은 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 피스키오스포린(physciosporin) 및 이의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.

Description

슈도사이펠라리아 코리아세아 추출물, 또는 피스키오스포린 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 조성물{Composition for inhibition of lung cancer metastasis comprising extracts of Pseudocyphellaria coriacea, or physciosporin or salt thereof as an active ingredient}

본 발명은 폐암 전이 억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 폐암 세포의 이동과 침윤을 억제하는 효능을 나타내는 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 또는 피스키오스포린(physciosporin) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.

암(cancer)이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생하는 비정상적인 세포의 집단을 의미하며, 악성종양이라고도 한다. 일반적으로 암은 장기, 백혈구, 뼈, 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에서 발병하며, 주변조직으로 침윤하는 현상 및 다른 기관으로 이동하는 전이를 통해 심각한 증상으로 발전하여 최종적으로 사망에 이루게 된다(WHO, 2006).

암(cancer)은 전 세계적으로 사망원인 1위로서 매년 암으로 사망하는 환자가 대략 13%에 이른다. 특히, 암 중에서 폐암으로 사망하는 환자는 1.37 백만명으로 가장 발생 빈도가 높으며, 그 다음으로 위암(736,000명 사망), 간암(695,000명 사망), 대장암(608,000명 사망) 및 유방암(458,000명 사망)에 의해 사망하고 있다.

현재 암을 치료하는 방법으로는 초기에 발견되는 암일 경우 수술, 항암제, 방사선 치료 등이 이용되고 있으나 그 부작용 또한 큰 문제로 대두되고 있으며, 대부분 1차 종양이 관찰된 시점에서는 이미 암의 전이가 발견된다. 또한, 말기 암이나 전이된 암의 경우 특별한 치료법이 없어 시한부 인생으로 삶을 마감하는 상황이다. 이에 따라, 암 치료를 위한 새로운 접근방법으로 독성이 비교적 낮은 천연물로부터 부작용이 적고 암 종의 전이를 억제하거나 감소시키는 효능이 뛰어난 발암 억제제 및 암 치료제를 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다.

한편, 지의류(lichen)는 곰팡이(fungi, mycobionts)와 조류(algae, photobionts)가 복합체가 되어 생활하는 공생생물로서 모양, 크기 및 색깔이 매우 다양하며 주로 바위, 수피 및 토양에서 서식한다. 이러한 지의류는 디디믹 산(didymic acid), 스트렙실린(strepsilin), 소듐 우스네이트(sodium usnate), 레카노릭 산(lecanoric acid), 프소로믹 산(psoromic acid) 등 1, 2차 대사산물들을 생성하여 항미생물 (곰팡이, 세균, 바이러스), 제초제, 항암, 면역강화, 정신질환 개선 등에 우수한 생리활성을 가지므로 예로부터 동서양을 막론하고 전통적으로 식품 또는 약재의 원료로 사용되어 왔다.

하나의 예로, 석이(Umbilicaris esculenta)는 한국, 중국, 일본 등지에서 특유의 향에 의해 식품으로 사용되거나 복통, 염증 등에 대한 약재로서 다양하게 사용되어 왔으며, 우스네아 종(Usnea sp.)은 항균, 강심, 진해, 지혈 등에, 네프롬옵시스 오르나타(Nephromopsis ornata)는 건위제로, 탐노리아 종(Thamnolia sp.), 레타릴라 종(Lethariella sp.)등은 고혈압, 진통, 진정, 해열에 사용되었고, 이 밖에 에버니아 프룬아스트리(Evernia prunastri)는 향료에, 파멜리아 옴파로데스(Parmelia omphalodes)는 염료에 이용되어 있다(Mason et al.,1983). 최근에는 주로 향수나 항생제 제조 및 의약용으로도 이용되고 있으며, 중국 운남성 지역에서는 고급 차의 원료 또는 약재로 이용되고 있다.

또한, 다양한 지의류의 생리활성물질에 대한 탐색 연구가 시작됨에 따라 지의체(thallus)의 2차 대사산물이 항생물질로 이용되는 등 약리작용이 뛰어난 것으로 알려지고 있다(Ingolfsd, 2002). 대표적인 생리활성 물질로 석이에 주로 들어 있는 지로포르산(gyrophoirc acid)은 중국 한방에서 강장, 각혈, 하혈 등에 지혈제로 이용되고, 레카노르산(lecanoric acid)은 항염증 치료제로 쓰이고 있다(Oh, 2005). 이렇듯 지의류에서 유래된 다당체는 항암, 항균, 면역 강화와 같은 생리학적 활성이 매우 우수한 것으로 알려져 있다(Kramer et al., 1995). 그러나 아직까지 지의류 또는 이로부터 유래된 다당류의 생리활성에 관한 체계적인 연구들이 이루어지지 않고 있다. 또한, 본 발명에서와 같은 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 또는 피스키오스포린(physciosporin)을 이용하여 암 전이를 억제하는 효능에 대해서는 연구된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 독성 및 부작용이 없는 천연물 유래의 암 전이 억제용 조성물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 또는 피스키오스포린(physciosporin) 또는 이의 염은 폐암 세포의 침윤과 이동을 감소시키는 효능이 있으므로 폐암 전이 억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 피스키오스포린(physciosporin) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물 및 피스키오스포린(physciosporin)의 식품학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물은 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea)를 유기용매로 추출하여 획득한 폐암의 이동 및 침윤을 억제하는 효능을 포함하는 물질을 말한다.

상기 유기용매는 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 부탄올, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.

또한, 상기 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물은 유기용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서, 폐암 전이 억제는 폐암 세포의 이동 및 침윤을 억제하거나 감소시켜 폐암 세포의 전이에 의한 사망을 지연시키는 것을 말한다.

상기 폐암 세포의 이동 및 침윤의 억제 또는 감소는 N-카데린 및 베타-카테닌의 발현을 감소시켜 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물은 폐암 세포의 이동 및 침윤을 억제하거나 감소시키므로 폐암을 예방 또는 치료할 수 있는 용도로 사용될 수 있다.

하나의 구체적 실시에서, 폐암 세포주에 5 ㎍/mL의 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물을 처리하고 72시간 배양한 경우 DMSO를 처리한 폐암 세포주에 비하여 세포 이동거리가 약 82% 감소되었고, 침윤된 세포의 수가 약 35% 감소되었다(도 4 및 도 5 참조). 또한, 폐암 세포주에 5 ㎍/mL의 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물을 처리한 경우 DMSO를 처리한 폐암 세포주에 비하여 N-카데린 및 베타-카테닌의 함량이 각각 45% 및 40% 감소하였다(도 6 참조).

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물은 약제학적 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 함량인 0.001 중량% 미만인 경우에는 암 세포의 침윤 및 이동을 억제하는 효과가 너무 미약하고, 10 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하므로 비경제적이다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 피스키오스포린(physciosporin) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 피스키오스포린(physciosporin)은 지의류에 포함되어 있는 뎁시돈 유도체 중 하나로, IUPAC명은 2-클로로-4-포르밀-3-디하이드록시-1,6,9-트리메틸-11-옥소-11H-디벤조[b,e][1,4]디옥스에핀-7-카르복실산 메틸 에테르(2-chloro-4-formyl-3,8-dihydroxy-1,6,9-trimethyl-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepine-7-carboxylic acid methyl ester)로 하기 화학식 1의 구조를 가진다.

[화학식 1]

상기 피스키오스포린(physciosporin)은 화학적으로 합성하여 사용할 수 있으나, 바람직하게는 지의류, 보다 바람직하게는 슈도사이펠라리아(Pseudocyphellaria) 속 지의류, 보다 더 바람직하게는 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 지의류의 추출물로부터 분리하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피스키오스포린(physciosporin)의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염이 유용하다. 하나의 예로, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 주석산, 젖산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. 그러나 반드시 이로 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 피스키오스포린(physciosporin)은 폐암 세포 내에서 N-카데린 및 베타-카테닌의 발현을 감소시키고, 폐암 세포의 이동 및 침윤을 억제하거나 감소시키므로 폐암을 예방 또는 치료할 수 있는 용도로 사용될 수 있다.

하나의 구체적 실시에서, 폐암 세포주에 5 ㎍/mL의 피스키오스포린(physciosporin)을 처리하고 72시간 배양한 경우 DMSO를 처리한 폐암 세포주에 비하여 세포 이동거리가 약 75% 감소되었고, 침윤된 세포의 수가 약 58% 감소되었다(도 4 및 도 5 참조). 또한, 폐암 세포주에 5 ㎍/mL의 피스키오스포린(physciosporin)을 처리한 경우 DMSO를 처리한 폐암 세포주에 비하여 N-카데린 및 베타-카테닌의 함량이 각각 35% 및 9% 감소하였다(도 6 참조).

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 피스키오스포린(physciosporin) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 10 중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 함량인 0.001 중량% 미만인 경우에는 암 세포의 침윤 및 이동을 억제하는 효과가 너무 미약하고, 30 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하므로 비경제적이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 피스키오스포린(physciosporin) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분 이외에 약제학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 윤활제, 습윤제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 담체를 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물로 적합한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구, 비경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 직장 또는 정맥 내 주입, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등으로 투여될 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 보다 구체적으로, 치료될 개체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 함량을 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 환자에게 투여되는 조성물의 투여량은 환자 체중의 약 0.5-1,000 ㎎/kg 일 수 있다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 현탁액, 과립제, 정제, 분말제, 에멀젼제 또는 갑셀제 등의 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 피스키오스포린(physciosporin) 및 이의 식품학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물 및 피스키오스포린(physciosporin)의 구조, 추출물, 효능, 용도, 제형 등에 관한 구체적인 내용은 상술한 바와 같으므로, 이하에서는 생략한다.

본 발명의 식품학적으로 허용가능한 염은 식품학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염 또는 염기에 의해 형성되는 금속염이 유용하다. 하나의 예로, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있다. 무기산으로는 염산, 황산, 브롬산, 아황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레인산, 푸마산, 글루콘산, 메탄술폰산 등을 사용할 수 있다. 또한, 금속염으로는 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염, 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 사용할 수 있다. 그러나 반드시 이로 제한되지는 않는다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 피스키오스포린(physciosporin) 및 이의 식품학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 성분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 상기 성분은 원료에 대하여 10 중량% 이하, 바람직하게는 5 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 피스키오스포린(physciosporin) 및 이의 식품학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 성분 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물은 포도당 및 과당 당의 모노사카라이드, 말토스, 수크로스 및 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린 및 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 성분을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품이 음료일 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 식품은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 폐암 전이 억제용 조성물은 폐암 세포 내에서 N-카데린 및 베타-카테닌의 발현을 감소시키고, 폐암 세포의 이동 및 침윤을 억제하거나 감소시키므로 폐암 세포의 전이에 의한 사망을 지연시키거나 폐암을 치료할 수 있다. 아울러, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분은 천연물인 지의류로부터 유래하여 인체에 대한 부작용이 극히 적어 매우 안전하게 사용될 수 있다.

본 발명의 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 또는 피스키오스포린(physciosporin) 및 이의 염은 폐암 세포 내에서 N-카데린 및 베타-카테닌의 발현을 감소시키고, 폐암 세포의 이동 및 침윤을 억제시키므로 폐암 전이 억제를 위한 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분은 천연물인 지의류로부터 유래하여 인체에 대한 부작용이 극히 적어 매우 안전하게 사용될 수 있다.

도 1은 13종의 지의류로부터 추출한 추출물을 폐암세포에 처리한 후 72시간 동안 배양한 폐암세포의 창상(wound) 넓이를 측정하여 백분율로 나타낸 그래프 및 지의류 추출물 중 리조플라카 멜라노프탈마(Rhizoplaca melanophthalma), 하이포트라시나 신우사(Hypotrachyna sinuosa), 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea), 네프로마 종(Nephroma sp.) 및 슈도사이펠라리아 글라브로(Pseudocyphellaria glabra)로부터 추출한 추출물을 처리한 폐암 세포의 이동(migration)을 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2는 지의류 추출물 중 리조플라카 멜라노프탈마(Rhizoplaca melanophthalma), 하이포트라시나 신우사(Hypotrachyna sinuosa), 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea), 네프로마 종(Nephroma sp.) 및 슈도사이펠라리아 글라브로(Pseudocyphellaria glabra)로부터 추출한 추출물을 처리한 폐암 세포의 침윤을 현미경으로 관찰한 폐암 세포 및 폐암 세포의 침윤을 정량화한 그래프이다.
도 3은 지의류 추출물 중 리조플라카 멜라노프탈마(Rhizoplaca melanophthalma), 하이포트라시나 신우사(Hypotrachyna sinuosa), 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea), 네프로마 종(Nephroma sp.) 및 슈도사이펠라리아 글라브로(Pseudocyphellaria glabra)로부터 추출한 추출물에 함유된 2차 대사산물을 확인한 결과이다.
도 4는 5 ㎛/ml의 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물 및 이로부터 분리된 피스키오스포린(physciosporin)을 농도에 따라 처리한 폐암 세포의 침윤을 현미경으로 관찰한 폐암 세포 및 이를 바탕으로 폐암 세포의 침윤을 정량화한 그래프이다.
도 5는 5 ㎛/ml의 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물 및 이로부터 분리된 5 ㎛/ml의 피스키오스포린(physciosporin)를 처리한 폐암세포의 창상 넓이를 현미경으로 관찰한 폐암세포 및 이를 바탕으로 폐암세포의 이동성(migration)을 정량화한 그래프이다.
도 6은 5 ㎛/ml의 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물 및 이로부터 분리된 피스키오스포린(physciosporin)을 농도에 따라 처리한 폐암 세포에서 발현하는 E-카데린, N-카데린 및 베타-카테닌의 함량을 확인한 웨스턴 블롯(western blot) 사진 및 이를 정량화한 그래프이다.

이하, 제조예 및 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 제조예 및 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

제조예 1 : 칠레 지의류 추출물 제조

순천대학교의 한국 지의류 연구센터(Korean Lichen Research Institute; KoLRI)으로부터 13종의 칠레 지의류를 분양받았다. 그 다음 상기 지의류를 배양한 후 건조시키고, 건조된 지의류를 분쇄한 후 아세톤을 첨가하여 쏙시렛 추출장치(Soxhlet extracter)로 추출하였다. 그 다음 상기 지의류 추출물을 여과하고, 회전증발기를 이용하여 농축한 후 -25℃에 보관하였다. 상기 한국 지의류 연구센터로부터 분양받은 칠레 지의류의 시료번호 및 지의류 명칭은 하기 표 1에 나타내었다.

	시료번호	지의류 학명
1	CL120113(3)	Rhizoplaca melanophthalma
2	CL120181	Pseudocyphellaria argyracea
3	CL120206	Pseudocyphellaria verrucosa
4	CL120340	Protousnea sp.
5	CL120371	Xanthoparmelia sp.
6	CL120051	Flavoparmelia caperata
7	CL120055(6)	Hypotrachyna sinuosa
8	CL120124	Rhizoplaca melanophthalma
9	CL12330	Xanthoparmelia sp.
10	CL09002(A1)	Pseudocyphellaria coriacea
11	CL09003(A2)	Nephroma sp.
12	A5	Physcia sp.
13	CL09001(A15)	Psudocyphellaria glabra

제조예 2 : 세포 배양

폐암 세포(A549)를 10% FBS(fetal bovine serum, Gen Depot, USA), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함되어 있는 RPMI 1640 배양배지(Roswell park memorial institute 1640 medium, Gen Depot, USA)를 이용하여 배양하였다. 상기 배양은 온도 37℃, 5% CO₂가 존재하는 배양기에서 이루어졌으며, 상기 세포들은 한국세포주은행(korean cell line bank, Korea)에서 구입하였다.

실시예 1 : 지의류 추출물의 암 세포 이동(migration) 억제 효과 확인

먼저, 상기 제조예 2에서 배양한 폐암세포(A549)를 24-웰 플레이트에 500 ㎕/웰로 분주한 후 37℃, 5% CO₂가 존재하는 배양기에서 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지로 12시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기 웰 가운데를 팁을 이용하여 창상(wound)을 생성하였다. 원을 생성한 웰에 상기 제조예 1에서 제조한 13종의 지의류 추출물을 넣고, 37℃, 5% CO₂가 존재하는 세포 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 이때, 배양 0, 24, 48 및 72시간 마다 사진 촬영하여 세포의 이동성을 관찰하였으며, 배양시간에 따른 각 웰의 창상(wound) 넓이를 측정하여 백분율로 나타내었다. 대조군으로는 지의류 추출물 대신 DMSO를 처리한 폐암세포(A549)를 사용하였다. 상기 실험은 3회 반복 실시하였으며, 그 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 유의성 검증은 일원분산분석(One-way ANOVA, Tukey's HSD)으로 p<0.05 유의수준에서 분석하였고, SPSS 17.0(Chicago, USA) 통계 프로그램을 사용하였다. 그 결과를 도 1 및 표 2에 나타내었다.

	시료번호	지의류 학명	배양시간(%)
	시료번호	지의류 학명	24시간(%)	48시간(%)	72시간(%)
	대조군(DMSO)		100	100	100
1	CL120113(3)	Rhizoplaca melanophthalma	45	60	53
2	CL120181	Pseudocyphellaria argyracea	96	90	96
3	CL120206	Pseudocyphellaria verrucosa	106	90	105
4	CL120340	Protousnea sp.	115	122	118
5	CL120371	Xanthoparmelia sp.	104	109	94
6	CL120051	Flavoparmelia caperata	92	80	89
7	CL120055(6)	Hypotrachyna sinuosa	82	60	56
8	CL120124	Rhizoplaca melanophthalma	90	76	71
9	CL12330	Xanthoparmelia sp.	105	75	69
10	CL09002(A1)	Pseudocyphellaria coriacea	52	56	54
11	CL09003(A2)	Nephroma sp.	70	65	57
12	A5	Physcia sp.	79	111	120
13	CL09001(A15)	Psudocyphellaria glabra	40	42	50

실험결과, 폐암세포(A549)에 CL120113(3)(R. melanophthalma) 추출물, CL120055(6)(H. sinuosa) 추출물, CL09002(A1)(P. coriacea) 추출물, CL09003(A2)(Nephroma sp.) 추출물 및 CL09001(A15)(P. glabra) 추출물을 처리한 후 72시간 배양한 세포의 경우 이동거리가 대조군에 비하여 약 50% 감소한 것을 확인하였다.

실시예 2 : 지의류 추출물의 암 세포 침윤 억제 효과 확인

8㎛ 공극크기를 가지는 폴리카보네이트 및 1% 젤라틴이 코팅된 필터가 있는 트랜스웰 챔버(transwell chamber, Corning Costerm Corning, NY, USA)를 이용하여 세포의 침윤 정도를 측정하였다. 먼저, 상기 제조예 2에서 배양한 폐암세포(A549)를 2.4 × 10⁶ 세포/웰이 되도록 챔버의 윗 부분에 각각 분주하였다. 챔버의 하층에는 0.2% BSA와 1 ㎍/mL 피브로넥틴(fibronectin)을 포함하는 배양배지를 분주하였다. 그 다음 상기 폐암세포(A549)에 5 μg/mL 농도의 CL120113(3)(R. melanophthalma) 추출물, CL120055(6)(H. sinuosa) 추출물, CL09002(A1)(P. coriacea) 추출물, CL09003(A2)(Nephroma sp.) 추출물 및 CL09001(A15)(P. glabra) 추출물을 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝난 세포는 Diff Quick 키트(sysmex, Kobe, Japan)을 이용하여 고정 및 염색시킨 후 광학현미경을 이용하여 침윤된 세포의 수를 계수하였다. 대조군으로는 지의류 추출물 대신 DMSO를 처리한 폐암세포(A549)를 사용하였다. 상기 실험은 3회 반복 실시하였으며, 그 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 유의성 검증은 일원분산분석(One-way ANOVA, Tukey's HSD)으로 p<0.05 유의수준에서 분석하였고, SPSS 17.0(Chicago, USA) 통계 프로그램을 사용하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실험결과, CL120113(3)(R. melanophthalma) 추출물, CL120055(6)(H. sinuosa) 추출물, CL09002(A1)(P. coriacea) 추출물, CL09003(A2)(Nephroma sp.) 추출물 및 CL09001(A15)(P. glabra) 추출물을 처리한 폐암세포에서 침윤된 세포의 수가 대조군에 비하여 각각 약 45%, 32%, 29%, 42% 및 11% 감소된 것을 확인하였다.

실시예 3 : 지의류 추출물에 포함된 2차 대사산물 확인

상기 제조예 1에서 제조한 CL120113(3)(R. melanophthalma) 추출물, CL120055(6)(H. sinuosa) 추출물, CL09002(A1)(P. coriacea) 추출물, CL09003(A2)(Nephroma sp.) 추출물 및 CL09001(A15)(P. glabra) 추출물을 톨루엔, 디옥산 및 아세트산 혼합용액(90:02.5:2.5, v/v/v)으로 녹인 후 190nm 및 400nm의 검출파장을 가진 분광광도계(photodiode array detector, SPD-M20A)를 갖춘 역상 고속액체크로마토그래피 컬럼(C18 컬럼, particle size 5㎛, pore size 12nm)에 흡착시켰다. 그 다음 석유 에테르, 아세트산에틸 및 아세트산 혼합용액(80:40:2, v/v/v)을 용매로 사용하여 용출속도 1 mL/분, 온도 40℃의 조건에서 HPLC를 실시하여 2차 대사산물을 얻었다. 비교군으로는 2차 대사산물의 구성성분이 알려진 Psudocyphellaria 종 및 L. cladonioides 추출물을 사용하였으며, 상기 지의류의 학명은 하기 표 3에 나타내었다. 그 결과를 도 3 및 표 4에 나타내었다.

	지의류 학명
1	Pseudocyphellaria neglecta
2	Pseudocyphellaria argvracea
3	Pseudocyphellaria verucosa
4	Pseudocyphellaria verucosa
5	Pseudocyphellaria dissimilis
6	Pseudocyphellaria glabra
7	Pseudocyphellaria coriacea
8	Pseudocyphellaria obvoluta
9	Pseudocyphellaria faveolata
10	Pseudocyphellaria valdiviana
11	Lethariella cladonioides
12	Pseudocyphellaria encoensis
13	Pseudocyphellaria granulata

시료번호	지의류 학명	주요 2차 대사산물
CL120113(3)	R. melanophthalma	우스닉 산(usnic acid)
CL120055(6)	H.sinuosa	우스닉 산(usnic acid)
CL09002(A1)	P. coriacea	피키오스포린(physciosporin)
CL09003(A2)	Nephroma sp.	우스닉 산(usnic acid)
CL09001(A15)	P. glabra	피스키오스포린(physciosporin)

실험결과, CL120113(3)(R. melanophthalma) 추출물, CL120055(6)(H. sinuosa) 추출물, 및 CL09003(A2)(Nephroma sp.) 추출물은 우스닉 산(usnic acid)을 주성분으로 함유하고 있는 것을 확인하였다.

또한, CL09002(A1)(P. coriacea) 추출물 및 CL09001(A15)(P. glabra) 추출물은 피스키오스포린(physciosporin)을 주성분으로 함유하고 있는 것을 확인하였다.

이에 본 발명자는 이후 수행되는 실험에 CL09002(A1)(P. coriacea) 추출물의 2차 대사산물인 피스키오스포린(physciosporin)을 사용하였다.

실시예 4 : P. coriacea 추출물 및 이로부터 분리된 피스키오스포린( physciosporin)의 암 세포 침윤 억제 효과 확인

8㎛ 공극크기를 가지는 폴리카보네이트 및 1% 젤라틴이 코팅된 필터가 있는 트랜스웰 챔버(transwell chamber, Corning Costerm Corning, NY, USA)를 이용하여 세포의 침윤 정도를 측정하였다. 먼저, 상기 제조예 2에서 배양한 폐암세포(A549)를 2.4 × 10⁶ 세포/웰이 되도록 챔버의 윗 부분에 각각 분주하였다. 챔버의 하층에는 0.2% BSA와 1 ㎍/mL 피브로넥틴(fibronectin)을 포함하는 배양배지를 분주하였다. 그 다음 상기 폐암세포(A549)에 5 μg/mL 농도의 P. coriacea 추출물, 및 0.625, 1.25, 2.5 및 5 μg/mL 농도의 피스키오스포린(physciosporin)을 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝난 세포는 Diff Quick 키트(sysmex, Kobe, Japan)을 이용하여 고정 및 염색시킨 후 광학현미경을 이용하여 침윤된 세포의 수를 계수하였다. 대조군으로는 지의류 추출물 대신 DMSO를 처리한 폐암세포(A549)를 사용하였다. 상기 실험은 3회 반복 실시하였으며, 그 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 유의성 검증은 일원분산분석(One-way ANOVA, Tukey's HSD)으로 p<0.05 유의수준에서 분석하였고, SPSS 17.0(Chicago, USA) 통계 프로그램을 사용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

실험결과, P. coriacea 추출물을 처리한 세포에서 침윤된 세포의 수는 대조군 세포에 비하여 약 35% 감소되었다. P. coriacea 추출물로부터 분리한 피스키오스포린(physciosporin)는 농도 의존적으로 폐암세포의 침윤을 억제하였으며, 5 ㎍/mL 농도의 피스키오스포린(physciosporin)을 처리한 세포에서 침윤된 세포의 수는 대조군 세포에 비하여 약 58% 감소되었다.

실시예 5 : P. coriacea 추출물 및 이로부터 분리된 피스키오스포린( physciosporin)의 암 세포 이동( migration ) 억제 효과 확인

먼저, 상기 제조예 2에서 배양한 폐암세포(A549)를 24-웰 플레이트에 500 ㎕/웰로 분주한 후 37℃, 5% CO₂가 존재하는 배양기에서 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지로 12시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기 웰 가운데를 팁을 이용하여 창상(wound)을 생성하였다. 원을 생성한 웰에 5 μg/mL 농도의 P. coriacea 추출물 및 5 μg/mL 농도의 피스키오스포린(physciosporin)을 각각 처리한 후 처리한 후 37℃, 5% CO₂가 존재하는 세포 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 이때, 배양 0, 24, 48 및 72시간 마다 사진 촬영하여 세포의 이동성을 관찰하였으며, 배양시간에 따른 각 웰의 창상(wound) 넓이를 측정하여 백분율로 나타내었다. 대조군으로는 지의류 추출물 대신 DMSO를 처리한 폐암세포(A549)를 사용하였다. 상기 실험은 3회 반복 실시하였으며, 그 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 유의성 검증은 일원분산분석(One-way ANOVA, Tukey's HSD)으로 p<0.05 유의수준에서 분석하였고, SPSS 17.0(Chicago, USA) 통계 프로그램을 사용하였다. 그 결과를 도 5 및 표 5에 나타내었다.

실험결과, 폐암세포(A549)에 P. coriacea 추출물 및 피스키오스포린(physciosporin)을 처리한 후 72시간 배양한 세포의 경우 세포의 이동거리가 각각 약 82% 및 75% 감소되었다.

실시예 6 : P. coriacea 추출물 및 이로부터 분리된 피스키오스포린( physciosporin ) 처리에 따른 폐암 세포(A549)에서 상피- 간엽성 전이( epithelial - mesenchymal trnasition , EMT ) 표지자들의 mRNA 발현 확인

상기 제조예 2에서 배양한 폐암세포(A549)를 6-웰 플레이트에 분주한 후 5% CO₂가 존재하는 37℃ 세포 배양기에서 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 5 μg/mL 농도의 P. coriacea 추출물, 및 0.625, 1.25, 2.5 및 5 μg/mL 농도의 피스키오스포린(physciosporin)을 각각 처리한 후 5% CO₂가 존재하는 37℃ 세포 배양기에서 각각 48시간 동안 반응시켰다. 그 다음 상기 세포를 수확한 후 웨스턴 블롯(western bolt) 분석법을 이용하여 E-카데린(E-cadherin), N-카데린(N-cadherin) 및 베타-카테닌(β-catenin)의 발현 변화를 측정하였다. 대조군으로는 지의류 추출물 대신 DMSO를 처리한 폐암세포(A549)를 사용하였다. 상기 실험은 3회 반복 실시하였으며, 그 값은 평균±표준편차로 나타내었다. 또한, 유의성 검증은 일원분산분석(One-way ANOVA, Tukey's HSD)으로 p<0.05 유의수준에서 분석하였고, SPSS 17.0(Chicago, USA) 통계 프로그램을 사용하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

실험결과, 피스키오스포린(physciosporin)을 처리한 세포는 DMSO를 처리한 폐암 세포(대조군)에 비하여 농도 의존적으로 N-카데린 및 베타-카테닌 mRNA의 함량을 감소시켰다.

구체적으로, 5 μg/mL 농도의 P. coriacea 추출물 및 5 μg/mL 농도의 피스키오스포린(physciosporin)을 처리한 세포는 DMSO를 처리한 폐암 세포(대조군)에 비하여 N-카데린 mRNA의 함량을 각각 약 45% 및 35% 감소시켰으며, 베타-카데린 mRAN 함량을 각각 약 40% 및 9% 감소시켰다.

Claims

슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 피스키오스포린(physciosporin) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 피스키오스포린(physciosporin) 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 폐암 세포의 이동 및 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는 폐암 전이 억제용 약제학적 조성물.
슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 피스키오스포린(physciosporin) 및 이의 식품학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 폐암 전이 억제용 식품 조성물.
제3항에 있어서, 상기 슈도사이펠라리아 코리아세아(Pseudocyphellaria coriacea) 추출물, 피스키오스포린(physciosporin) 및 이의 식품학적으로 허용가능한 염은 폐암 세포의 이동 및 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는 폐암 전이 억제용 식품 조성물.