KR20160068963A - 항-Ly6E 항체 및 사용 방법 - Google Patents

항-Ly6E 항체 및 사용 방법 Download PDF

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요티 아순디
론 파이어슈타인
폴 폴라키스
치에 사카나카
피터 창
레이나 타카키 베눅
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 항-Ly6E 항체, 면역접합체 및 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-Ly6E 항체 및 사용 방법 {ANTI-Ly6E ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 항-Ly6E 항체 및 면역접합체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
림프구 항원 6 복합체, 로커스 E (Ly6E)는 레티노산 유래 유전자 E (RIG-E) 및 줄기 세포 항원 2 (SCA-2)로도 공지되어 있다. 이는 기지의 결합 파트너가 없는 미지의 기능의 GPI 연결된 131개 아미노산 길이의 ~8.4kDa 단백질이다. 이는 처음에 마우스의 미성숙 흉선세포, 흉선 수질 상피 세포에서 발현되는 전사체로서 확인되었다. 문헌 [RIG-E, a human homolog of the murine Ly-6 family, is induced by retinoic acid during the differentiation of acute promyelocytic leukemia cell. Mao M., Yu M., Tong J.-H., Ye J., Zhu J., Huang Q.-H., Fu G., Yu L., Zhao S.-Y., Waxman S., Lanotte M., Wang Z.-Y., Tan J.-Z., Chan S.-J., Chen Z. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:5910-5914 (1996)].
Ly6E-연관 상태, 예컨대 암의 진단 및 치료를 위한 Ly6E를 표적화하는 작용제에 대한 필요가 관련 기술분야에 존재한다. 본 발명은 그 필요를 충족시키고, 다른 이익을 제공한다.
본 발명은 항-Ly6E 항체, 면역접합체 및 그의 사용 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, (a) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는, Ly6E에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 28의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 27의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열 28의 VH 서열 및 서열 27의 VL 서열을 포함하는, Ly6E에 결합하는 단리된 항체가 제공된다.
일부 실시양태에서, Ly6E에 결합하는 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 마우스, 토끼, 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG이다. 다른 실시양태에서, IgG는 IgG1, IgG2a 또는 IgG2b 또는 IgG3 또는 IgG4이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 항체를 생산하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 면역접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 표지에 접합된다. 일부 실시양태에서, 표지는 양전자 방출체이다. 일부 이러한 실시양태에서, 양전자 방출체는 89Zr이다.
일부 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 인간 Ly6E를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플을 본원에 기재된 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E에 대한 항-Ly6E 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플에서 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 유방암 샘플, 췌장암 샘플, 결장암 샘플, 결장직장암 샘플, 흑색종 암 샘플, 난소암 샘플, 비소세포 폐암 샘플, 식도암 샘플, 두경부암 샘플, 신장암 샘플, 연부 조직암 샘플, 자궁내막암 샘플 또는 위암 샘플이다.
일부 실시양태에서, Ly6E-양성 암을 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 (i) 본원에 기재된 항-Ly6E 항체를 포함하는 표지된 항-Ly6E 항체를 Ly6E-양성 암을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하고, (ii) 대상체에서 표지된 항-Ly6E 항체를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표지된 항-Ly6E 항체의 검출은 대상체에서의 Ly6E-양성 암을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 표지된 항-Ly6E 항체는 양전자 방출체에 접합된 본원에 기재된 항-Ly6E 항체를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 양전자 방출체는 89Zr이다.
일부 실시양태에서, 암 환자를 Ly6E-양성 암을 갖는 것으로서 확인하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자로부터의 암 샘플을 본원에 기재된 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E에 대한 항-Ly6E 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 암 샘플에서 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 생검 샘플에서 본원에 기재된 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E 사이의 복합체가 검출된 경우에 암 환자는 Ly6E-양성 암을 갖는 것으로서 확인된다.
일부 실시양태에서, 항-Ly6E 항체를 포함하는 면역접합체를 사용한 치료를 위해 암 환자를 선택하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자로부터의 암 샘플을 본원에 기재된 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E에 대한 항-Ly6E 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 암 샘플에서 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 생검 샘플에서 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E 사이의 복합체가 검출된 경우에 암 환자가 선택된다. 일부 이러한 실시양태에서, 암 환자는 (a) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-Ly6E 항체를 포함하는 면역접합체를 사용한 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 암 환자는 서열 5의 VH 서열 및 서열 3의 VL 서열을 포함하는 항-Ly6E 항체를 포함하는 면역접합체를 사용한 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역접합체는 세포독성제에 접합된 항-Ly6E 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 암 샘플은 유방암 샘플, 췌장암 샘플, 결장암 샘플, 결장직장암 샘플, 흑색종 암 샘플, 난소암 샘플, 비소세포 폐암 샘플, 식도암 샘플, 두경부암 샘플, 신장암 샘플, 연부 조직암 샘플, 자궁내막암 샘플 또는 위암 샘플이다. 일부 실시양태에서, 유방암 샘플은 Her2 양성 유방암, Her2 음성 유방암, Her2 음성/호르몬 수용체 양성 (Her2-/ER+/PR+) 유방암 또는 삼중 음성 (Her2-/ER-/PR-) 유방암으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 위암 샘플은 Her2 양성 위암 또는 Her2 음성 위암으로부터의 것이다.
도 1은 인간 (서열 1), 시노몰구스 원숭이 (서열 2), 레서스 (서열 35), 마우스 (서열 36) 및 래트 종 (서열 37)으로부터의 Ly6E 오르토로그의 서열을 비교하는 서열 정렬을 제시한다. 세포외 도메인 (ECD)에서 이들 서열 사이의 아미노산 수준에서의 퍼센트 동일성은 인간 및 시노몰구스 원숭이 Ly6E 사이에서 ~96% 및 인간 및 래트 Ly6E 사이에서 ~52%인 것으로 제시된다.
도 2는 실시예 1에 추가로 기재된 바와 같은 Ly6E mRNA 발현의 진로직(Genelogic) 프로파일을 제시한다. 측정은 아피메트릭스(Affymetrix) U133P 칩 상에서 수행하고, 인간 조직에서의 Ly6E 발현의 규모화된 평균 차이로서 표현하였다. 각각의 점은 정상 (녹색), 종양 (적색) 또는 이환된 비종양 (청색) 인간 조직 시편을 나타낸다. 직사각형은 각각의 분포에 대해 25 내지 75 백분위수 범위를 포괄한다. WBC = 백혈구. Ly6E의 과다-발현이 특히 유방암, 췌장암, 결장직장암, 폐암, 흑색종 및 난소암에서 나타난다.
도 3은 실시예 2에 기재된 바와 같은 정상 인간 조직 및 선택 암 세포주 및 조직의 패널에서 RPL19 대조군 유전자의 발현에 대해 정규화된 Ly6E 전사체 발현에서의 QRT-PCR 상대 배수 변화를 도시한다. 결과는 정상 조직에서의 Ly6E 전사체 발현이 유방암 및 췌장암에서의 Ly6E의 발현에 비해 낮다는 것을 나타낸다.
도 4는 토끼 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1의 경쇄 가변 도메인 서열 및 중쇄 가변 도메인 서열을 제시한다. 초가변 영역 (HVR)은 밑줄표시된다. 위치는 카바트(Kabat)에 따라 넘버링된다.
도 5는 실시예 7에 기재된 바와 같은 표피 성장 인자 수용체, Her2 증폭된 유방암 이종이식편 마우스 모델에서의 항-Ly6E ADC의 생체내 효능을 제시한다. 패널 a는 HCC1569 X2 유방암 세포를 접종한 면역결핍 마우스에서 확립된 피하 종양을 제시한다. 종양 부피가 대략 100-250 mm3에 도달하였을 때 (제0일), 동물에게 나타낸 용량의 대조군 ADC (대조군-vc-MMAE) 또는 인간화 항-Ly6E (hu9B12 v12) ADC (MC-vc-PAB-MMAE)의 단일 IV 주사를 제공하였다. 평균 종양 부피와 표준 편차를 군당 9마리 동물로부터 결정하였다 (그래프 상에 나타냄). 패널 b는 유동 세포측정법에 의해 나타난 바와 같은 살아있는 HCC1569 X2 세포에서의 표면 Ly6E 단백질 발현을 제시하고, 여기서 회색 피크는 2차 검출 시약 단독에 대해 처리된 세포를 나타내고, 흑색 피크는 3μg/mL Ly6E 항체 (hu9B12 v12) ADC에 이어서 2차 검출 시약으로서 인간 IgG에 접합된 알렉사플루오르(Alexafluor) 488로 처리된 세포를 나타낸다. 기하평균 값으로서의 Ly6E의 발현이 히스토그램의 우측에 제시된다. 패널 c는 유방암 세포주 HCC1569 X2에 대한 hu9B12 v12 ADC 적정에 의한 세포 사멸을 제시한다. 나타낸 농도의 hu9B12 v12 ADC, 대조군 IgG-vc-MMAE, 또는 등량의 PBS 비히클 대조군을 세포와 함께 5일 동안 인큐베이션하고, 상대 세포 생존률 (y-축)을 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)를 사용하여 평가하였다. 패널 d는 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 면역조직화학에 의한 HCC1569 X2 종양에 대한 1+/2+ Ly6E 염색을 제시한다. 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 Ly6E에 대한 1+ 수준으로의 종양 세포 염색의 퍼센트가 나타나 있다. 패널 e는 토끼 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1을 사용한 면역조직화학에 의한 HCC1569 X2 세포 펠릿에 대한 3+ Ly6E 염색을 제시한다.
도 6은 췌장암 이종이식편 마우스 모델에서의 항-Ly6E ADC의 생체내 효능을 제시한다. 패널 a는 SU.86.86 췌장암 세포를 접종한 면역결핍 마우스에서 확립된 피하 종양을 제시한다. 종양 부피가 대략 100-250 mm3에 도달하였을 때 (제0일), 동물에게 도 5에 기재된 바와 같이 나타낸 용량의 대조군 ADC (대조군-vc-MMAE) 또는 항-Ly6E ADC의 단일 IV 주사를 제공하였다. 평균 종양 부피와 표준 편차를 군당 9마리 동물로부터 결정하였다 (그래프 상에 나타냄). 패널 b는 토끼 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1을 사용한 이뮤노블롯팅에 의한 HCC1569 X2 및 SU.86.86 세포 용해물에서의 총 Ly6E 단백질 발현을 비교한다. 총 β-튜불린 단백질 수준을 로딩 대조군으로서 역할을 하기 위해 병행하여 측정하였다. 패널 c는 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 면역조직화학에 의한 SU.86.86 종양에 대한 1+ Ly6E 염색을 제시한다. 패널 d는 췌장암 세포주 SU.86.86에 대한 항-Ly6E ADC 적정에 의한 세포 사멸을 제시한다. 나타낸 농도의 항-Ly6E ADC, 대조군 IgG-vc-MMAE, 또는 등량의 PBS 비히클 대조군을 세포와 함께 5일 동안 인큐베이션하고, 상대 발광 단위 (RLU)로의 상대 세포 생존율 (y-축)을 셀타이터-글로를 사용하여 평가하였다. 패널 e는 토끼 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1을 사용한 면역조직화학에 의한 SU.86.86 종양에 대한 2+ Ly6E 염색을 제시한다.
도 7은 젠테크(XenTech) (프랑스 에브리)에서 확립된 원발성 삼중-음성 (Her2-/ER-/PR-) 유방암 종양 이종이식편 모델 HBCx-9에서의, 도 5에 기재된 바와 같은 항-Ly6E ADC의 생체내 효능을 제시한다. 패널 a는 환자 유래 유방암 종양 물질을 이식한 면역결핍 마우스에서 확립된 피하 종양을 제시한다. 종양 부피가 대략 100-250 mm3에 도달하였을 때 (제0일), 동물에게 나타낸 용량의 대조군 ADC (대조군-vc-MMAE) 또는 항-Ly6E ADC의 단일 IV 주사를 제공하였다. 평균 종양 부피와 표준 편차를 군당 9마리 동물로부터 결정하였다 (그래프 상에 나타냄). 패널 b는 마우스 항-Ly6E 항체 4D8을 사용한 이뮤노블롯팅에 의한 다양한 젠테크 원발성 종양 모델 및 HCC1569 X1 및 SU.86.86 세포 용해물에서의 총 Ly6E 단백질 발현을 비교한다. 총 β-액틴 단백질 수준을 로딩 대조군으로서 역할을 하기 위해 병행하여 측정하였다. 패널 c는 면역조직화학에 의한 HBCx-9 종양에 대한 Ly6E 염색을 제시한다. 다중 종양 샘플의 독립적 염색은 불균질한 염색 패턴을 보여주었다. 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 Ly6E에 대한 1+ 수준으로의 종양 세포 염색의 퍼센트가 나타나 있다. 패널 d는 토끼 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1을 사용한 면역조직화학에 의한 HBCx-9 종양에 대한 2+ Ly6E 염색을 제시한다. 패널 e는 항체 GEN-93-8-1을 사용한 이뮤노블롯팅에 의한 HBCx-9 세포 용해물에서의 총 Ly6E 단백질 발현을 제시한다. GAPDH 단백질 수준을 로딩 대조군으로서 역할을 하기 위해 병행하여 측정하였다.
도 8은 젠테크 (프랑스 에브리)에서 확립된 원발성 삼중-음성 (Her2-/ER-/PR-) 유방암 종양 이종이식편 모델 HBCx-8에서의, 도 5에 기재된 바와 같은 항-Ly6E ADC의 생체내 효능을 제시한다. 패널 a는 환자 유래 유방암 종양 물질을 이식한 면역결핍 마우스에서 확립된 피하 종양을 제시한다. 종양 부피가 대략 100-250 mm3에 도달하였을 때 (제0일), 동물에게 나타낸 용량의 대조군 ADC (대조군-vc-MMAE) 또는 항-Ly6E ADC의 단일 IV 주사를 제공하였다. 평균 종양 부피와 표준 편차를 군당 10마리 동물로부터 결정하였다 (그래프 상에 나타냄). 패널 b는 마우스 항-Ly6E 항체 4D8을 사용한 이뮤노블롯팅에 의한 다양한 젠테크 원발성 종양 모델 및 HCC1569 X1 및 SU.86.86 세포 용해물에서의 총 Ly6E 단백질 발현을 비교한다. 총 β-액틴 단백질 수준을 로딩 대조군으로서 역할을 하기 위해 병행하여 측정하였다. 패널 c는 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 면역조직화학에 의한 HBCx-8 종양에 대한 Ly6E 염색을 제시한다. 패널 d는 토끼 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1을 사용한 면역조직화학에 의한 HBCx-8 종양에 대한 1+/2+ Ly6E 염색을 제시한다. 다중 종양 샘플의 독립적 염색은 10G7.7.8 또는 GEN-93-8-1을 사용한 1+ 또는 2+ 수준의 염색 패턴을 보여주었지만, GEN-93-8-1을 사용한 염색은 10G7.7.8 염색과 비교하여 보다 강건하고 균질하였다. 패널 e는 항체 GEN-93-8-1을 사용한 이뮤노블롯팅에 의한 HBCx-8 세포 용해물에서의 총 Ly6E 단백질 발현을 제시한다. GAPDH 단백질 수준을 로딩 대조군으로서 역할을 하기 위해 병행하여 측정하였다.
도 9는 온코테스트 게엠베하(Oncotest GmbH) (독일 프라이부르크)에서 확립된 원발성 표피 성장 인자 수용체, Her2 증폭된 유방암 종양 이종이식편 모델 MAXF-1162에서의, 도 5에 기재된 바와 같은 항-Ly6E ADC의 생체내 효능을 보여준다. 패널 a는 환자 유래 유방암 종양 물질을 이식한 면역결핍 마우스에서 확립된 피하 종양을 제시한다. 종양 부피가 대략 100-250 mm3에 도달하였을 때 (제0일), 동물에게 나타낸 용량의 대조군 ADC (대조군-vc-MMAE) 또는 항-Ly6E ADC의 단일 IV 주사를 제공하였다. 평균 종양 부피와 표준 편차를 군당 10마리 동물로부터 결정하였다 (그래프 상에 나타냄). 패널 b는 이뮤노블롯팅에 의한 다양한 온코테스트 원발성 종양 모델 및 세포 용해물에서의 총 Ly6E 단백질 발현을 비교한다. 총 GAPDH 단백질 수준을 로딩 대조군으로서 역할을 하기 위해 병행하여 측정하였다. 패널 c는 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 면역조직화학에 의한 MAXF-1162 종양에 대한 Ly6E 염색을 제시한다. 다중 종양 샘플의 독립적 염색은 불균질한 염색 패턴을 보여주었다. Ly6E에 대한 1+ 또는 2+ 수준의 종양 세포 염색의 퍼센트가 나타나 있다. 패널 d는 토끼 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1을 사용한 면역조직화학에 의한 MAXF-1162 종양에 대한 강건한 2+ Ly6E 염색 (및 잠재적 저산소 중심 영역에서의 일부 1+ 염색)을 제시한다.
도 10은 온코테스트 게엠베하 (독일 프라이부르크)에서 확립된 원발성 췌장암 종양 이종이식편 모델 PAXF-1657에서의, 도 5에 기재된 바와 같은 항-Ly6E ADC의 생체내 효능을 보여준다. 패널 a는 환자 유래 췌장암 종양 체외이식편을 갖는 면역결핍 마우스에서 확립된 피하 종양을 제시한다. 종양 부피가 대략 100-250 mm3에 도달하였을 때 (제0일), 동물에게 나타낸 용량의 대조군 ADC (대조군-vc-MMAE) 또는 항-Ly6E ADC의 단일 IV 주사를 제공하였다. 평균 종양 부피와 표준 편차를 군당 10마리 동물로부터 결정하였다 (그래프 상에 나타냄). 패널 b는 이뮤노블롯팅에 의한 다양한 원발성 종양 모델 및 세포 용해물에서의 총 Ly6E 단백질 발현을 비교한다. 총 GAPDH 단백질 또는 β-액틴 단백질 수준을 로딩 대조군으로서 역할을 하기 위해 병행하여 측정하였다. 패널 c는 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 면역조직화학에 의한 PAXF-1657 종양에 대한 Ly6E 염색을 제시한다. 다중 종양 샘플의 독립적 염색은 불균질한 염색 패턴을 보여주었다. Ly6E에 대한 매우 약한 (+/-) 수준의 종양 세포 염색의 퍼센트가 나타나 있다. 패널 d는 토끼 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1을 사용한 면역조직화학에 의한 PAXF-1657 종양에 대한 2+ Ly6E 염색을 제시한다.
I. 정의
본원의 목적을 위해 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의되는 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 예시적 및 대표적 실시양태가 하기 기재된다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도의 개선을 발생시키는 변경을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 1개 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 1개 이상의 상기 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "항-Ly6E 항체" 및 "Ly6E에 결합하는 항체"는 항체가 Ly6E의 표적화에 있어 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 Ly6E에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-Ly6E 단백질에 대한 항-Ly6E 항체의 결합의 정도는 예를 들어 방사성면역검정 (RIA) 또는 스캐차드 분석 또는 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 예를 들어 비아코어(Biacore)에 의해 측정 시에 Ly6E에 대한 상기 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, Ly6E에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 상이한 종으로부터의 Ly6E 사이에서 보존된 Ly6E의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "항체 약물 접합체" (ADC)는 용어 "면역접합체"와 동등하다.
"항체 단편"은, 무손상 항체의 일부를 포함하며 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "암" 및 "암성"은, 전형적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 Ly6E를 과다-발현하는 암을 포함하며, 이는 예를 들어 유방암 및/또는 전이성 유방암, 예를 들어 Her2 양성 유방암, Her2 음성 유방암, Her2 음성/호르몬 수용체 양성 (Her2-/ER+/PR+), 및 삼중 음성 유방암, 췌장암 및/또는 전이성 췌장암, 결장암, 결장직장암, 피부암, 흑색종 및/또는 전이성 흑색종, 난소암, 비소세포 폐암 (편평 및/또는 비편평, 예컨대 선암종), 위암, 예를 들어 Her2 양성 위암 및/또는 Her2 음성 위암, 편평세포암, 소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위장암, 신경교종, 자궁경부암, 간암, 방광암, 간세포암, 연부 조직암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 식도암, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함할 수 있다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량으로 필요한 기간 동안 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 분자 상의 특정한 부위를 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4로 나타난다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되며, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택되는 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 배제한다.
"토끼 항체"는 토끼 또는 토끼 세포에 의해 생산되거나, 또는 토끼 항체 레퍼토리 또는 다른 토끼 항체-코딩 서열을 이용하여 비-토끼 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 모든 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)에서 발생한다. (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65 및 H3의 95-102에서 발생한다. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) VH 내의 CDR1을 제외하고는, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR, 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조.) 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 상기 문헌 [Kabat et al.]에 따라 넘버링된다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다. 면역접합체는 용어 "항체 약물 접합체" (ADC)와 동등하다.
"개체" 또는 "환자" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정 시에 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-Ly6E 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 1개 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 1개 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "Ly6E"는 세포에서 Ly6E 전구체 단백질의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 천연, 성숙 Ly6E를 지칭한다. 상기 용어는 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 또는 레서스 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 Ly6E를 포함한다. 상기 용어는 또한 Ly6E의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 신호 서열 (아미노산 1-20=신호 서열)을 갖는 예시적인 인간 Ly6E 전구체 단백질의 아미노산 서열이 서열 1에 제시된다. 예시적인 성숙 인간 Ly6E의 아미노산 서열이 서열 38에 제시된다. 예시적인 시노몰구스 원숭이 Ly6E의 아미노산 1-131에 대한 서열이 서열 2에 제시된다. 예시적인 성숙 시노몰구스 Ly6E의 아미노산 서열이 서열 39에 제시된다. 예시적인 래트 Ly6E 전구체 (신호 서열, 아미노산 1-26을 가짐)에 대한 아미노산 서열 및 성숙 서열이 각각 서열 37 및 42에 제시된다. 예시적인 마우스 Ly6E 전구체 (신호 서열, 아미노산 1-26을 가짐)에 대한 아미노산 서열 및 성숙 서열이 각각 서열 36 및 41에 제시된다. 예시적인 레서스 Ly6E 전구체 (신호 서열, 아미노산 1-20을 가짐)에 대한 아미노산 서열 및 성숙 서열이 각각 서열 35 및 40에 제시된다.
용어 "Ly6E-양성 암"은 표면 상에서 Ly6E를 발현하는 세포를 포함하는 암을 지칭한다. 세포가 표면 상에서 Ly6E를 발현하는지 여부를 결정하는 목적을 위해, Ly6E mRNA 발현은 세포 표면 상에서의 Ly6E 발현과 상관관계가 있는 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, Ly6E mRNA의 발현은 계내 혼성화 및 RT-PCR (정량적 RT-PCR 포함)로부터 선택된 방법에 의해 결정된다. 대안적으로, 세포 표면 상에서의 Ly6E의 발현은 예를 들어 면역조직화학, FACS 등과 같은 방법에서 Ly6E에 대한 항체를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, Ly6E-양성 암은 각 경우에 Ly6E 발현의 검출가능한 수준을 나타내는, 유방암 및 전이성 유방암, 예를 들어 Her2 양성 유방암, Her2 음성 유방암, Her2 음성/호르몬 수용체 양성 (Her2-/ER+/PR+), 및 삼중 음성 유방암, 췌장암, 결장암, 결장직장암, 흑색종, 난소암, 폐암, 비소세포 폐암 폐암 (편평 및/또는 비-편평, 예컨대 선암종), 연부 조직암, 자궁내막암, 식도암, 두경부암, 신장암, 또는 위암, 예를 들어 Her2 양성 위암 및 Her2 음성 위암을 포함한다.
용어 "Ly6E-양성 세포"는 표면 상에서 Ly6E를 발현하는 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 상기 집단을 구성하는 개별 항체는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는, 일반적으로 소량으로 존재하는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불림)에 이어서 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불림)에 이어서 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는, 이러한 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되어 있는 지침서를 지칭하도록 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서, 서열을 정렬시키고 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성이 달성되도록 갭을 도입한 후의, 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야의 기술 내의 다양한 방식으로, 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 통상의 기술자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공중 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에의, 그와의 또는 그에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에의, 그와의 또는 그에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
X/Y의 분율 x 100
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로서 점수화된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임을 인지할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.
용어 "제약 제제"는, 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며 제제를 투여할 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "백금 착물"은 항암 화학요법 약물, 예컨대, 예를 들어 비제한적으로 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 이프로플라틴, 사트라플라틴, CI-973, AZ0473, DWA2114R, 네다플라틴, 및 스프리오플라틴 (DNA에 공유 결합하는 그의 능력에 기초하여 종양에 대해 효능을 발휘함)을 지칭한다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키기 위한 시도로의 임상 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 호전, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환의 발병을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 느리게 하기 위해 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그 벡터가 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 내부로 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그 벡터가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
한 측면에서, 본 발명은 부분적으로 Ly6E에 결합하는 항체 및 이러한 항체를 포함하는 면역접합체에 기초한다. 본 발명의 항체 및 면역접합체는 예를 들어 Ly6E-양성 암의 진단 또는 치료를 위해 유용하다.
A. 예시적인 항-Ly6E 항체
일부 실시양태에서, 본 발명은 Ly6E에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 하기 특징 중 적어도 1개 이상을 임의의 조합으로 갖는다:
(a) 서열 1의 아미노산 21-131 내의 에피토프에 결합하는 특성; 및
(b) SPR 또는 스캐차드 분석에 의해 측정 시에 ≤ 7 nM, 또는 ≤ 6 nM, 또는 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM, 및 임의로 ≥ 0.0001 nM, 또는 ≥ 0.001 nM, 또는 ≥ 0.01 nM의 친화도로 Ly6E에 결합하는 특성.
항체 9B12
비제한적 예시적인 항-Ly6E 항체는 뮤린 9B12 및 그의 인간화 변이체, 예컨대 예를 들어 hu9B12.v12이다 (예를 들어 서열 4 및 6; 및 서열 3 및 5에 제시된 가변 영역 서열 참조). 일부 실시양태에서, Ly6E는 인간 Ly6E이다. 일부 실시양태에서, Ly6E는 인간, 시노몰구스 원숭이, 레서스 원숭이, 마우스 또는 래트 Ly6E로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 서열 1의 아미노산 21-131 내의 에피토프에 결합한다. 일부 이러한 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 SPR 또는 스캐차드 분석에 의해 측정 시에 ≤ 7 nM, 또는 ≤ 6 nM, 또는 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM, 및 임의로 ≥ 0.0001 nM, 또는 ≥ 0.001 nM, 또는 ≥ 0.01 nM의 친화도로 Ly6E에 결합한다. 본 발명의 비제한적 예시적인 항체는 뮤린 9B12 및 그의 인간화 변이체, 예컨대 예를 들어 hu9B12.v12이다. 일부 실시양태에서, Ly6E는 인간 Ly6E이다. 일부 실시양태에서, Ly6E는 인간 Ly6E 또는 시노몰구스 원숭이 Ly6E이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-Ly6E 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 12로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 9로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 인간화된다. 한 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 이는 서열 20의 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR2 서열 또는 서열 21의 경쇄 가변 도메인 프레임워크 FR3 또는 서열 23의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 FR1, 또는 서열 24의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 FR2를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-Ly6E 항체는 서열 5의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-Ly6E 항체는 Ly6E에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 5에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-Ly6E 항체는 서열 5의 VH 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-Ly6E 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-Ly6E 항체는 Ly6E에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 3에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-Ly6E 항체는 서열 3의 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-Ly6E 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 각각 서열 5 및 서열 3의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (이들 서열의 번역후 변형 포함).
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-Ly6E 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 5의 VH 서열 및 서열 3의 VL 서열을 포함하는 항-Ly6E 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 1의 아미노산 21-131로 이루어진 Ly6E의 단편 내의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-Ly6E 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-Ly6E 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특색을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
항체 GEN-93-8-1
비제한적 예시적인 항-Ly6E 항체는 도 4에 제시된 바와 같은 토끼 GEN-93-8-1 및 GEN-93-8-1의 1개 이상의 HVR을 포함하는 항체이다. 일부 실시양태에서, Ly6E는 인간 Ly6E이다. 일부 실시양태에서, Ly6E는 인간, 비-인간 영장류, 마우스 또는 래트 Ly6E로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 비-인간 영장류 Ly6E는 시노몰구스 원숭이 또는 레서스 원숭이 Ly6E이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-Ly6E 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 34로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 31로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 인간화된다. 한 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-Ly6E 항체는 서열 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-Ly6E 항체는 Ly6E에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 28에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외부 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-Ly6E 항체는 서열 28의 VH 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-Ly6E 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 대한 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-Ly6E 항체는 Ly6E에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열 27에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 임의로, 항-Ly6E 항체는 서열 27의 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함). 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-Ly6E 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 28 및 서열 27의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그 서열의 번역후 변형 포함).
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-Ly6E 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 28의 VH 서열 및 서열 27의 VL 서열을 포함하는 항-Ly6E 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-Ly6E 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-Ly6E 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특색을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
검정
항-Ly6E 항체가 "서열 1의 아미노산 21-131 내의 에피토프에 결합"하는지 여부를 결정하기 위해 N- 및 C-말단 결실을 갖는 Ly6E 폴리펩티드를 293 세포에서 발현시키고, 말단절단된 폴리펩티드에 대한 항체의 결합을 FACS에 의해 시험하며, 여기서 293 세포에서 발현된 전장 Ly6E에 대한 결합에 비해 말단절단된 폴리펩티드에 대한 항체의 결합의 실질적인 감소 (≥ 70% 감소) 또는 제거는 항체가 그 말단절단된 폴리펩티드에 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
항-Ly6E 항체가 "≤ 6 nM, 또는 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM의 친화도로 결합"하는지 여부는 실시예 4에서 본원에 기재된 바와 같은 스캐차드 분석에 따라 결정된다. 대안적으로, 항-Ly6E 항체 친화도는 예를 들어 비아코어 검정에 따라 결정될 수 있다. 특히, Kd는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 비아코어™ 연구 등급 CM5 칩은 공급업체의 지침에 따라 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 시약으로 활성화된다. 염소 항-인간 Fc IgG는 각각의 유동 세포에서 대략 10,000 반응 단위 (RU)를 달성하도록 칩에 커플링된다. 미반응 커플링 기는 1M 에탄올아민으로 차단된다. 동역학적 측정을 위해, 항-Ly6E 항체는 대략 300 RU를 달성하도록 포획된다. 인간 Ly6E (예를 들어, 바큘로바이러스 시스템에서 발현된 His-Fc에 융합된 아미노산 21-131, 또는 CHO 세포로부터 발현된 Fc에 융합된 아미노산 21-131; 125 nM 내지 0.49 nM)의 2배 연속 희석물을 HBS-P 완충제 (0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 중에 25℃에서 30 μl/분의 유량으로 주사한다. 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)은 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어™ 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의한 온-레이트가 106 M- 1 s-1을 초과하는 경우에, 온-레이트는 분광계, 예컨대 정지 유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-아민코(Aminco)® 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정되는 바와 같은, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS, pH 7.2 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 인간화된다. 한 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 인간 수용자 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 수용자 프레임워크는 인간 VL 카파 IV 컨센서스 (VLKIV) 프레임워크 및/또는 VH 프레임워크 VH1이다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-Ly6E 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 실질적으로 전장 항체, 예를 들어 IgG1 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-Ly6E 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특색을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-Ly6E 항체는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 실질적으로 전장 항체, 예를 들어 IgG2a 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-Ly6E 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특색을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM, 및 임의로 ≥ 10-13 M (예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액-결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단한다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조되면, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 실시예 4에 기재된 바와 같은 스캐차드 분석을 사용하여 측정된다. 또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 ~10 반응 단위 (RU)로 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주입한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 함유하는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합 및 해리 센소그램을 동시에 핏팅시켜 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 온-레이트가 106 M- 1 s-1을 초과하는 경우에, 온-레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반 큐벳이 구비된 8000-시리즈 SLM-아민코™ 분광광도계 (써모스펙트로닉)에서 측정되는 바와 같은, 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS, pH 7.2 중 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 교체된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 부분을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은, 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 검토되어 있고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; 문헌 [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 이식 기재); 문헌 [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("재표면화" 기재); 문헌 [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 문헌 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-피트" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 챌린지에 반응하여 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 또는 동물의 염색체로 무작위로 통합된 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 부분을 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재된 바 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기에 기재된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 목적하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열을 달성함으로써 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공개는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 Ly6E에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 Ly6E에 대한 것이고, 다른 것은 CD3에 대한 것이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,821,337을 참조한다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 Ly6E의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 Ly6E을 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))], WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 Ly6E 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있으며, 단 최종 구축물은 목적 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 표 1에서 "바람직한 치환"의 표제 하에 제시된다. 보다 실질적인 변화는 표 1에서 "예시적인 치환"의 표제 하에 제공되고, 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기에 추가로 기재된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 목적 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
<표 1>
Figure pct00001
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 1개의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 1종의 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에서의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조) 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지정된 접근법을 포함하며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu)을 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 항체의 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 사용하여 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인한다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 목적하는 특성을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 그에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합계에 대한 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체의 부차적 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 내지 300에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 공개의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al., 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된, 이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 1개 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 항체의 생체내 반감기는 중요하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 적용을 위한 바람직한 후보가 되도록 하는, 전부는 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유하는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결여되어 있지만 (따라서, ADCC 활성 결여 가능성이 있음) FcRn 결합 능력은 보유하는 것을 보장하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 시토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)을 참조한다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없으며 따라서 CDC 활성이 결여된 것을 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정을 또한 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 1개 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 발생시키는 변경이 Fc 영역에서 만들어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 역할을 하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 1개 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 1개 이상의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 이를 사용하여 항체를 본원에 추가로 기재된 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 임의의 1개 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 관련 기술분야에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 달라질 수 있고, 1개 초과의 중합체가 부착되는 경우에, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선시킬 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기초로 하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-Ly6E 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 1개 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이것으로 형질감염된다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기에 제공된 바와 같은 항-Ly6E 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 임의로 회수하는 것을 포함하는, 항-Ly6E 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항-Ly6E 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 1개 이상의 벡터 내로 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차를 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우에, 항체는 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 기재하는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 항체는 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예컨대 사상 진균 또는 효모, 예를 들어 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는 진균 및 효모 균주가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인된 바 있다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술 기재)를 참조한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합화된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
C. 검정
본원에 제공된 항-Ly6E 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특징화될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 ELISA, 비아코어®, FACS, 또는 웨스턴 블롯과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 측면에서, 경쟁 검정은 Ly6E에 대한 결합에 대해 본원에 기재된 임의의 항체와 경쟁하는 항체를 확인하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 본원에 기재된 항체가 결합된 것과 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 예시적인 방법의 상세내용은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정화된 Ly6E를 Ly6E에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체), 및 Ly6E에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 시험될 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 Ly6E는 제1 표지된 항체를 포함하나 제2 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션한다. Ly6E에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후에, 잉여량의 미결합 항체를 제거하고, 고정화된 Ly6E와 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 Ly6E와 회합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이는 제2 항체가 Ly6E에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한 1종 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (예를 들어, 방사성접합체)에 접합된 본원의 항-Ly6E 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
미접합 약물의 전신 투여가 정상 세포에 대해 허용되지 않는 수준의 독성을 초래할 수 있는 경우에, 면역접합체는 종양에 대한 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 일부 실시양태에서는 그 내부에서의 세포내 축적을 허용한다 (Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387).
항체-약물 접합체 (ADC)는 강력한 세포독성 약물을 항원-발현 종양 세포에 표적화시켜 (Teicher, B.A. (2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004) 효능의 최대화 및 탈표적 독성의 최소화에 의해 치료 지수를 증진시킴으로써 (Carter, P.J. and Senter P.D. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107) 항체 및 세포독성 약물 둘 다의 특성을 조합한 표적화된 화학요법제 분자이다.
본 발명의 ADC 화합물은 항암 활성을 갖는 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, ADC 화합물은 약물 모이어티에 접합된, 즉 공유 부착된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 링커를 통해 약물 모이어티에 공유 부착된다. 본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)는 유효 용량의 약물을 종양 조직에 선택적으로 전달함으로써, 치료 지수 ("치료 범위")를 증가시키면서 보다 큰 선택성, 즉 보다 낮은 유효 용량을 달성할 수 있다.
항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 모이어티 (D)는 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 갖는 임의의 화합물, 모이어티 또는 기를 포함할 수 있다. 약물 모이어티는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 삽입, 및 RNA 폴리머라제, 단백질 합성 및/또는 토포이소머라제의 억제를 포함하나 이에 제한되지는 않은 메카니즘에 의해 그의 세포독성 및 세포증식억제 효과를 전할 수 있다. 예시적인 약물 모이어티는 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 네모루비신 및 그의 유도체, PNU-159682, 안트라시클린, 두오카르마이신, 빈카 알칼로이드, 탁산, 트리코테센, CC1065, 캄프토테신, 엘리나피드, 및 세포독성 활성을 갖는 그의 입체이성질체, 동배체, 유사체 및 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-Ly6E 항체는 생물학적 샘플에서 Ly6E의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. "생물학적 샘플"은, 예를 들어 세포 또는 조직 (예를 들어, 암성 또는 잠재적 암성 결장, 결장직장, 자궁내막, 췌장 또는 난소 조직을 포함하는 생검 물질)을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-Ly6E 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 Ly6E의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항-Ly6E 항체와 Ly6E에 대한 항-Ly6E 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키고, 생물학적 샘플에서 항-Ly6E 항체와 Ly6E 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 예를 들어 Ly6E가 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우에 항-Ly6E 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다. 추가 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 (예를 들어, 암성 또는 잠재적으로 암성 결장, 결장직장, 자궁내막, 췌장 또는 난소 조직을 포함하는 생검 물질)이다.
추가 실시양태에서, 항-Ly6E 항체는 예를 들어 생체내 영상화에 의해 대상체에서의 Ly6E-양성 암을 검출하기 위해, 예를 들어 암을 진단하거나, 예측하거나 또는 병기결정하거나, 요법의 적절한 과정을 결정하거나, 또는 요법에 대한 암의 반응을 모니터링하는 목적을 위해 생체내에서 사용된다. 생체내 검출에 대해 관련 기술분야에 공지된 1종의 방법은, 예를 들어 문헌 [van Dongen et al., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) 및 Verel et al., J. Nucl. Med. 44:1271-1281 (2003)]에 기재된 바와 같은 면역-양전자 방사 단층촬영 (면역-PET)이다. 이러한 실시양태에서, 표지된 항-Ly6E 항체를 Ly6E-양성 암을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하고, 대상체에서 표지된 항-Ly6E 항체를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 표지된 항-Ly6E 항체의 검출은 대상체에서의 Ly6E-양성 암을 나타내는 것인, 대상체에서 Ly6E-양성 암을 검출하는 방법이 제공된다. 특정의 이러한 실시양태에서, 표지된 항-Ly6E 항체는 양전자 방출체, 예컨대 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 및 124I에 접합된 항-Ly6E 항체를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 양전자 방출체는 89Zr이다. 89Zr-표지된 항체의 비제한적 예시적인 제조 방법 및 사용 방법은, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2011/056983에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 표지된 항-Ly6E 항체는 1개 이상의 지르코늄 복합체에 접합된 시스테인 조작된 항체이다. 예를 들어, WO 2011/056983을 참조한다.
추가 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법은 기질에 고정화된 제1 항-Ly6E 항체를 Ly6E의 존재에 대해 시험될 생물학적 샘플과 접촉시키고, 기질을 제2 항-Ly6E 항체에 노출시키고, 제2 항-Ly6E가 생물학적 샘플에서 제1 항-Ly6E 항체와 Ly6E 사이의 복합체에 결합되는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 기질은 임의의 지지체 매질, 예를 들어, 유리, 금속, 세라믹, 중합체 비드, 슬라이드, 칩, 및 다른 기질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 (예를 들어, 암성 또는 잠재적 암성 결장직장, 자궁내막, 췌장 또는 난소 조직을 포함하는 생검 물질)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 또는 제2 항-Ly6E 항체는 본원에 기재된 임의의 항체이다. 이러한 실시양태에서, 제2 항-Ly6E 항체는 본원에 기재된 바와 같은 6D3 또는 7C9; 또는 6D3 또는 7C9로부터 유래된 항체일 수 있다.
임의의 상기 실시양태에 따라 진단 또는 검출될 수 있는 예시적인 장애는 Ly6E-양성 암, 예컨대 Ly6E-양성 유방암 (Her2 양성 유방암, Her2 음성 유방암, Her2 음성/호르몬 수용체 양성 (Her2-/ER+/PR+) 유방암, 삼중 음성 (Her2-/ER-/PR-) 유방암 포함), Ly6E-양성 결장암, Ly6E-양성 결장직장암 (선암종 포함), Ly6E-양성 흑색종, Ly6E-양성 난소암 (난소 장액성 선암종 포함), Ly6E-양성 췌장암 (췌장관 선암종 포함), Ly6E-양성 폐암, Ly6E-양성 비소세포 폐암 (예를 들어, 편평 또는 비-편평, 예컨대 선암종), Ly6E-양성 위암, Ly6E-양성 식도암, Ly6E-양성 두경부암, Ly6E-양성 신장암, Ly6E-양성 연부 조직암, Ly6E-양성 흑색종 및 Ly6E-양성 자궁내막암을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ly6E-양성 암은 >90%의 종양 세포에서의 매우 약한 염색 또는 염색되지 않음에 해당하는 "0" 초과의 항-Ly6E 면역조직화학 (IHC) 또는 계내 혼성화 (ISH) 점수를 받은 암이다. 일부 실시양태에서, Ly6E-양성 암은 실시예 4에서 본원에 기재된 조건 하에 정의된 바와 같은 1+, 2+ 또는 3+ 수준으로 Ly6E를 발현한다. 일부 실시양태에서, 1+, 2+ 및 3+ 면역조직화학 염색은 표 3에 따라 결정된다. 일부 실시양태에서, Ly6E-양성 암은 Ly6E mRNA를 검출하는 역전사효소 PCR (RT-PCR) 검정에 따라 Ly6E를 발현하는 암이다. 일부 실시양태에서, RT-PCR은 정량적 RT-PCR이다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-Ly6E 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자-고밀도, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 또는 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 실시양태에서, 표지는 양전자 방출체이다. 양전자 방출체는 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 및 124I를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정한 실시양태에서, 양전자 방출체는 89Zr이다.
F. 제약 제제
본원에 기재된 바와 같은 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체의 제약 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체 또는 면역접합체를 1종 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다. 제약상 허용되는 담체는 일반적으로, 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 1종 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 또는 면역접합체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 또는 면역접합체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
또한, 본원의 제제는 치료할 특정한 적응증에 필요한 1종 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 예를 들어 Ly6E-양성 암, 예컨대 예를 들어 Ly6E-양성 유방암 (Her2 양성 유방암, Her2 음성 유방암, Her2 음성/호르몬 수용체 양성 (Her2-/ER+/PR+) 유방암, 삼중 음성 (Her2-/ER-/PR-) 유방암 포함), 또는 Ly6E-양성 췌장암 또는 Ly6E-양성 결장암 또는 Ly6E-양성 결장직장암 또는 Ly6E-양성 흑색종 또는 Ly6E-양성 난소암 또는 Ly6E-양성 비소세포 폐암 (예를 들어, 편평 또는 비-편평, 예컨대 선암종) 또는 Ly6E-양성 위암 또는 Ly6E-양성 식도암 또는 Ly6E-양성 두경부암 또는 Ly6E-양성 신장암 또는 Ly6E-양성 연부 조직암 또는 Ly6E-양성 자궁내막암의 치료를 위해 백금 착물을 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
활성 성분은, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)으로 또는 마크로에멀젼으로, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체 또는 면역접합체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성할 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체는 방법, 예를 들어 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본원에 제공된 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체는, Ly6E-양성 세포를 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체에, 세포의 표면 상의 Ly6E에 대한 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체의 결합을 허용하는 조건 하에 노출시켜 세포의 증식을 억제하는 것을 포함하는, Ly6E-양성 세포의 증식을 억제하는 방법에 사용된다. 특정 실시양태에서, 방법은 시험관내 또는 생체내 방법이다. 추가 실시양태에서, 세포는 유방암 세포 (Her2 양성 유방암 세포, Her2 음성 유방암 세포, Her2 음성/호르몬 수용체 양성 (Her2-/ER+/PR+) 유방암 세포, 삼중 음성 (Her2-/ER-/PR-) 유방암 세포 포함) 또는 췌장암 세포 또는 결장암 세포 또는 결장직장암 세포 또는 흑색종 암 세포 또는 난소암 세포 또는 비소세포 폐암 세포 (예를 들어, 편평 또는 비-편평, 예컨대 선암종), 위암 세포 또는 식도암 또는 두경부암 또는 신장암 또는 연부 조직암 또는 자궁내막암 세포이다.
시험관내 세포 증식의 억제는 프로메가 (위스콘신주 매디슨)로부터 상업적으로 입수가능한 셀타이터-글로™ 발광 세포 생존율 검정을 사용하여 검정될 수 있다. 상기 검정은 대사적 활성 세포의 지표인 ATP 존재의 정량화를 기초로 하여 배양물 중 생존 세포의 수를 결정한다. 문헌 [Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88], 미국 특허 번호 6602677을 참조한다. 상기 검정은 자동화된 고처리량 스크리닝 (HTS)에 적용가능하게 하는 96- 또는 384-웰 포맷으로 수행될 수 있다. 문헌 [Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404]을 참조한다. 검정 절차는 단일 시약 (셀타이터-글로® 시약)을 배양된 세포에 직접 첨가하는 것을 포함한다. 이는 세포 용해, 및 루시페라제 반응에 의해 생산된 발광 신호의 생성을 일으킨다. 발광 신호는 배양물 중에 존재하는 생존 세포 수에 정비례하는 ATP 존재량에 비례한다. 데이터는 발광측정기 또는 CCD 카메라 영상화 장치에 의해 기록될 수 있다. 발광 출력은 상대 광 단위 (RLU)로 표현된다.
또 다른 측면에서, 의약으로 사용하기 위한 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 추가 측면에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 특정 실시양태에서, Ly6E-양성 암을 치료하는데 사용하기 위한 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함하는 Ly6E-양성 암을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체를 제공한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 1종의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약의 제작 또는 제조에서의 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 Ly6E-양성 암의 치료를 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 Ly6E-양성 암을 갖는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는 Ly6E-양성 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 1종의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 Ly6E-양성 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 이러한 Ly6E-양성 암을 갖는 개체에게 유효량의 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체를 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 하기 기재된 바와 같은 1종 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
임의의 상기 실시양태에 따른 Ly6E-양성 암은 예를 들어 Ly6E-양성 유방암 (Her2 양성 유방암, Her2 음성 유방암, Her2 음성/호르몬 수용체 양성 (Her2-/ER+/PR+) 유방암, 삼중 음성 (Her2-/ER-/PR-) 유방암 포함), Ly6E-양성 결장암, Ly6E-양성 결장직장암 (선암종 포함), Ly6E-양성 흑색종, Ly6E-양성 난소암 (난소 장액성 선암종 포함), Ly6E-양성 췌장암 (췌장관 선암종 포함), Ly6E-양성 폐암, Ly6E-양성 비소세포 폐암 (예를 들어, 편평 또는 비-편평, 예컨대 선암종), Ly6E-양성 위암, Ly6E-양성 식도암, Ly6E-양성 두경부암, Ly6E-양성 신장암, Ly6E-양성 연부 조직암, Ly6E-양성 흑색종 및 Ly6E-양성 자궁내막암일 수 있다. 일부 실시양태에서, Ly6E-양성 암은 본원에 기재된 조건 하에 >90%의 종양 세포에서의 매우 약한 염색 또는 염색되지 않음에 해당하는 "0" 초과의 항-Ly6E 면역조직화학 (IHC) 또는 계내 혼성화 (ISH) 점수를 받은 암이다. 또 다른 실시양태에서, Ly6E-양성 암은 본원에 기재된 조건 하에 정의된 바와 같은 1+, 2+ 또는 3+ 수준으로 Ly6E를 발현한다. 일부 실시양태에서, Ly6E-양성 암은 Ly6E mRNA를 검출하는 역전사효소 PCR (RT-PCR) 검정에 따라 Ly6E를 발현하는 암이다. 일부 실시양태에서, RT-PCR은 정량적 RT-PCR이다.
임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-Ly6E 항체 또는 면역접합체 및 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 1종 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 요법에서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 1종 이상의 추가의 치료제와 공-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 예를 들어 Ly6E-양성 암 예컨대 예를 들어 Ly6E-양성 유방암 (Her2 양성 유방암, Her2 음성 유방암, Her2 음성/호르몬 수용체 양성 (Her2-/ER+/PR+) 유방암, 삼중 음성 (Her2-/ER-/PR-) 유방암 포함), Ly6E-양성 결장암, Ly6E-양성 결장직장암 (선암종 포함), Ly6E-양성 흑색종, Ly6E-양성 난소암 (난소 장액성 선암종 포함), Ly6E-양성 췌장암 (췌장관 선암종 포함), Ly6E-양성 폐암, Ly6E-양성 비소세포 폐암 (예를 들어, 편평 또는 비-편평, 예컨대 선암종), Ly6E-양성 위암, Ly6E-양성 식도암, Ly6E-양성 두경부암, Ly6E-양성 신장암, Ly6E-양성 연부 조직암, Ly6E-양성 흑색종 및 Ly6E-양성 자궁내막암의 치료를 위한 백금 착물이다.
상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제는 동일한 제제 또는 개별 제제에 포함됨) 및 개별 투여를 포괄하고, 이 경우에 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 수행될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 면역접합체는 또한 방사선 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 목적하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기적인지 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 이루어질 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체 또는 면역접합체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 1종 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체 또는 면역접합체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 상기 기재된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 면역접합체의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 1종 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 항체 또는 면역접합체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체 또는 면역접합체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체 또는 면역접합체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체 또는 면역접합체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 연속 주입에 의해서든 관계 없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1mg/kg-10mg/kg)의 항체 또는 면역접합체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 항체 또는 면역접합체 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록 투여됨). 보다 높은 초기 부하 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 본 발명의 면역접합체 및 항-Ly6E 항체 둘 다를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
H. 제조 물품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 수용하거나 또는 상기 조성물을 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥 주사액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 적어도 1종의 활성제는 본 발명의 항체 또는 면역접합체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 본 발명의 항체 또는 면역접합체를 포함하는 조성물이 함유되어 있는 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 함유되어 있는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서의 제조 물품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조 물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
I. 본 발명의 서열
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 하기 서열이 제공된다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
III. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 설명을 고려하여 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있음이 이해된다.
실시예 1 - 인간 Ly6E 유전자 발현
진로직 프로파일: 다중 인간 종양 및 정상 생검 샘플에서 Ly6E mRNA 발현의 분석을 위해, 아피메트릭스 데이터를 진 로직 인크.(Gene Logic Inc.)로부터 입수하였다. 프로브 세트 ID 202145_at에 대해 제시된 분석은 3,879개의 정상 인간 조직 샘플 (녹색 기호), 1,605개의 인간 암 조직 샘플 (적색 기호: 1,291개 원발성 및 314개 전이성), 및 3,872개의 인간 비암 질환 조직 샘플 (청색 기호)에 대해 HGU133 플러스 v2 진칩(HGU133 Plus v2 GeneChip)을 사용하여 수행하였다. 마이크로어레이 데이터를 아피메트릭스 MAS (마이크로어레이 어낼러시스 스위트(Microarray Analysis Suite)) 버전 5.0 소프트웨어를 사용하여 정규화하고, 샘플 발현 값을 500의 절사 평균에 대해 규모화하였다.
이 분석은 Ly6E가 특히 유방암, 췌장암, 결장암, 폐암 및 난소암에서 특이적으로 과다-발현된다는 것을 보여주었으며, 정상 조직에서는 Ly6E의 낮은/없는 검출을 보여주었다 (도 2).
계내 혼성화 (ISH): 계내 혼성화는 문헌 [Methods Mol Biol. 2006; 326:255-64]에서 확립된 방법에 따라 Ly6E의 유병률을 평가하기 위해 난소암 조직 마이크로어레이 (TMA) 상에서 수행하였다.
정방향 프라이머 GTG CCT GAT CTG TGC CCT TGG - 서열 45
역방향 프라이머 CCC GGA AGT GGC AGA AAC CC - 서열 46
프로브 서열: GTGCCTGATCTGTGCCCTTGGTCCCAGGTCAGGCCCACCCCCTGCACCTCCACCTGCCCCAGCCCCTGCCTCTGCCCAAGTGGGCCAGCTGCCCTCACTTCTGGGGTGGATGATGTGACCTTCCTTGGGGGACTGCGGAAGGGACGAGGGTTCCCTGGAGTCTTACGGTCCAACATCAGACCAAGTCCCATGGACATGCTGACAGGGTCCCCAGGGAGACCGTGTCAGTAGGGATGTGTGCCTGGCTGTGTACGTGGGTGTGCAGTGCACGTGAGAGCACGTGGCGGCTTCTGGGGGCCATGTTTGGGGAGGGAGGTGTGCCAGCAGCCTGGAGAGCCTCAGTCCCTGTAGCCCCCTGCCCTGGCACAGCTGCATGCACTTCAAGGGCAGCCTTTGGGGGTTGGGGTTTCTGCCACTTCCGGG - 서열 47.
결과는 분석된 난소 종양 중 47/65개 (72%)가 Ly6E 발현을 보여주었다는 것을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음).
면역조직화학 (IHC): 면역조직화학을 유리 슬라이드 상에 마운팅한 4 um 두께 포르말린-고정된 파라핀 포매 (FFPE) 조직 절편 상에서 수행하였다. 슬라이드를 크실렌에서 탈파라핀화시키고, 등급별 알콜을 거쳐 증류수로 재수화시켰다. 슬라이드를 표적 복구 용액 (다코(Dako), 미국 캘리포니아주 카핀테리아)으로 99℃에서 20분 동안 전처리하였다. 이어서, 슬라이드를 각각 KPL 차단 용액 (키르케가드 앤 페리 래보러토리즈(Kierkegaard and Perry Laboratories), 미국 메릴랜드주 게이더스버그) 및 아비딘/비오틴 차단 (벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories), 미국 캘리포니아주 벌링게임)으로 처리하였다. 비특이적 IgG 결합을 포스페이트 완충 염수 중 3% 소 혈청 알부민 (로슈(Roche), 스위스 바젤)에서 10% 말 혈청 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스배드)으로 차단시켰다. 1차 항체, 마우스 항-Ly6E, 클론 10G7.7.8을 10μg/mL로 희석하고, 슬라이드 상에서 60분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
슬라이드를 세정하고, 말 항-마우스 IgG 비오티닐화 2차 (벡터 랩스(Vector Labs))와 인큐베이션한 후에 벡타스테인 ABC 엘리트(Vectastain ABC Elite) 시약 (벡터 랩스)에서 인큐베이션하였다. 이어서, 슬라이드를 피어스(Pierce) 금속 증진 DAB (써모 사이언티픽(Thermo Scientific); 캘리포니아주 프리몬트)에서 인큐베이션하고, 대조염색하고, 탈수시키고, 커버슬립으로 덮었다.
마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 IHC 연구로부터, Ly6E의 유병률은 유방암에서 27-36%, 췌장암에서 ~40%, 결장암에서 ~ 26%, 흑색종에서 17-26%, NSCLC에서 ~29%로 검출되었다 (데이터는 제시되지 않음).
마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 정상 조직 상의 면역조직화학: 정상 인간 및 시노몰구스 원숭이 조직의 패널 상에서, 낮은 및 중간 정도의 Ly6E 발현이 인간 및 시노몰구스 원숭이 둘 다의 위 및 타액선에서 검출되고, 낮은 내지 중간 정도의 Ly6E 발현이 시노몰구스 원숭이에서 및 인간 시편에서는 보다 적은 정도로 부신 피질의 세포의 하위집단에서 검출되고, Ly6E의 중간 정도의 발현이 방광의 이행 상피에서 검출되었다 (단지 시노몰구스 원숭이만 검사됨). 하기 표 2는 포괄적 인간 및 시노몰구스 원숭이 정상 조직 패널에서 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용하여 결정된 Ly6E의 면역조직화학적 (IHC) 발현을 표로 제시한다. 낮은 (LOW) 내지 중간 정도 (MOD)의 Ly6E 발현은 회색으로 강조된 조직으로 제한된다 (부신 피질, 자궁경부, 타액선, 위 및 방광). ND = 수행하지 않음. NO = 발현 없음.
<표 2>
Figure pct00006
실시예 2 - 정량적 PCR (QRT PCR)
오리진(Origene) (메릴랜드주 록빌)으로부터의 48개 정상 조직의 패널로부터의 제1 가닥 DNA를 함유하는 인간 주요 조직 qPCR 어레이 (HMRT 102)를 Ly6E RNA 발현에 대해 검정하였다. 선택 암 세포주 및 조직 (유방 및 췌장)의 패널에서의 Ly6E 발현을 병행하여 검정하였다. 택맨(Taqman) 검정을 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (ABI, 캘리포니아주 포스터 시티)로부터의 시약, 장비 및 소프트웨어를 사용하여 셋업하였다. 프라이머-프로브 세트를 리포터 염료 FAM 및 켄처 염료 TAMRA로 이중 표지된 형광 프로브를 플랭킹하는 프라이머로 설계하였다.
RPL19에 대한 프라이머-프로브 세트:
정방향 프라이머 -5' AGC GGA TTC TCA TGG AAC A (서열 48); 역방향 프라이머-5' CTG GTC AGC CAG GAG CTT (서열 49) 및 프로브-5' TCC ACA AGC TGA AGG CAG ACA AGG (서열 50).
Ly6E에 대한 프라이머-프로브 세트:
정방향 프라이머 -5' AGA AGG CGT CAA TGT TGG T (서열 51); 역방향 프라이머-5' CAC TGA AAT TGC ACA GAA AGC (서열 52) 및 프로브-5' TTC CAT GGG CAT CAG CTG CTG (서열 53).
결과는 정상 조직에서의 Ly6E 전사체 발현이 유방암 및 췌장암에서의 Ly6E의 발현에 비해 낮다는 것을 나타낸다 (도 3).
실시예 3 - 토끼 모노클로날 항체 생성
3마리의 토끼를 박테리아 (에스케리키아 콜라이(Escherichia Coli)) 생성된 His 태그부착된 Ly6E (옌짐(YenZym), 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로 면역화하였다. 시험 출혈을 사용하여 Ly6E에 대한 혈청 역가를 표준 프로토콜을 사용하여 평가하였다. 1마리의 토끼가 우수한 면역 반응을 갖는 것으로 확인되었고, 비장절제술 및 모노클로날 융합을 위한 후보로 선택되었다.
항원의 최종 IV 부스트 4일 후, 비장절제술을 수행하였다. 비장세포를 단리하고, 200 x 106개의 림프구 세포를 100 x 106개의 융합 파트너 세포와 융합하고, 20개의 96-웰 플레이트 (에피토믹스(Epitomics), 캘리포니아주 벌링게임) 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 표준 조건 하에 배양하였다.
플레이트를 표준 ELISA 프로토콜을 사용하여 스크리닝하였고, 이 때 플레이트를 웰당 50 ng의 인간 Ly6E로 코팅하였다. 11개의 클론을 선택하고, 24-웰 플레이트 내로 확장시켰다. 클론 중 7개가 항-Ly6E 항체에 대해 양성으로 확인되었다. 7개의 클론 중 3개를 선택하여 제한 세포 희석 방법을 사용하여 서브클로닝하였다. 서브클로닝된 세포주로부터, 클론 GEN-93-8-1을 포함하는 3개의 하이브리도마를 선택하여 확장시키고, 동결시켰다.
추가의 시험 후, GEN-93-8-1을 HEK293 세포에서의 분자 클로닝 및 재조합 발현을 위해 선택하였다. 간략하게, 하이브리도마 세포로부터의 mRNA를 투보캡처(TuboCapture) 키트 (퀴아젠(Qiagen): 카탈로그 #72232)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 단리하고, 이어서 올리고-dT 프라이머를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 중쇄 (VH)의 가변 영역을 PCR 증폭시켰다. 전체 경쇄 (LC)를 PCR하였다. PCR-증폭된 VH 영역을 제한 효소 HindIII 및 Kpnl을 사용하여 소화시켰다. PCR-증폭된 LC를 제한 효소 HindIII 및 NotI를 사용하여 소화시켰다. 소화된 생성물을 퀴아젠 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트 (카탈로그 #28014)를 사용하여 정제하였다. 정제 후, VH 및 LC를 중쇄 또는 경쇄 발현 벡터 내로 라이게이션하고, DH5α 세포 (MC 랩(MC Lab), 카탈로그 #DA-100) 내로 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니를 골라내고, 삽입물을 상응하는 제한 효소를 사용하여 예상된 크기 (VH의 경우 대략 440 bp 및 LC의 경우 740 bp)에 대해 확인하였다. 예상된 크기의 삽입물을 갖는 플라스미드를 TT5 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열은 도 4, 및 각각 서열 28 및 27에 제시된다.
경쇄 및 중쇄 발현 벡터를 6-웰 플레이트에서 293개의 세포 내로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 5일 후에 상청액을 수집하고, 상응하는 항원에 대해 시험하였다. 추가로, IgG 농도를 측정하였다. 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1을 단백질 A를 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다.
실시예 4 - 면역조직화학에 의해 결정된 악성 및 정상 조직에서의 및 원발성 종양 모델에서의 Ly6E 발현
면역조직화학 (IHC)을 벤타나 디스커버리 XT(Ventana Discovery XT) 자동염색기 (벤타나 메디칼 시스템즈(Ventana Medical Systems); 애리조나주 투산) 상에서 수행하였다. 포르말린-고정, 파라핀-포매 전체 조직 및 조직 마이크로어레이 절편을 탈파라핀화하고, CC1 용액 (벤타나 메디칼 시스템즈)으로 60분 동안 전처리하고, 이어서 0.2 μg/mL 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1 또는 미감작 토끼 IgG (클론 DA1E, 셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies); 매사추세츠주 댄버스)와 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 검출을 32-분 옴니맵(OmniMap) 항-토끼 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 인큐베이션 및 디아미노벤지딘 (DAB) (벤타나 메디칼 시스템즈)을 사용하여 수행하고, 이어서 헤마톡실린 II (벤타나 메디칼 시스템즈)로 대조 염색하였다.
염색 강도 점수는 염색의 강도 및 표지된 세포의 비율 둘 다를 고려하였다. 양성 발현은 종양 세포의 50% 초과에서 염색된 것으로 규정하였다. 강도 점수를 표 3에 규정하였다.
<표 3> IHC 점수화
Figure pct00007
인간 종양에 대한 토끼 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1의 반응성을, 인간 유방암 (N = 90, 삼중-음성 유방 종양 (N = 39) 및 Her2-/호르몬 수용체+ (HR+) 유방 종양 (N = 51) 포함), 췌장 선암종 (N = 78), 비소세포 폐암 (N = 276, 선암종 (N = 205) 및 편평 세포 암종 (N = 71) 포함), 난소 암종 (N = 57), 두부/경부 편평세포 암종 (N = 61), 위 선암종 (N = 94), 및 결장직장 선암종 (N = 106) 조직 마이크로어레이에 대해 수행된 IHC에 의해 평가하였다.
Ly6E IHC의 결과를 표 4에 제시하였다. 유방암 샘플에서, TNBC 경우의 94% 및 Her2-/HR+ 경우의 81%가 IHC 염색에 의해 Ly6E에 양성이었으며, TNBC 경우의 79% 및 Her2-/HR+ 경우의 61%가 중간 정도 또는 강한 수준의 염색 (IHC에 의해 2+ 또는 3+)을 나타내었다.
일련의 Her2+ 및 Her2- 유방암 샘플에서, 87% (130개의 경우)가 IHC 염색에 의해 Ly6E에 양성이었다. 발현은 유방암의 65%-68%에서 중간 정도 또는 강한 수준 (2+ 또는 3+)으로 나타났다. 국재화는 사실상 세포질/막성이었다. 약한 내지 중간 정도의 Ly6E 발현이 정상 및 정상 인접-암종 유방 조직 둘 다에서 나타났다. 대조적으로, 상기 나타낸 바와 같이, 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 IHC 연구는 유방암의 단지 27-36%에서 Ly6E를 검출하였다.
Ly6E는 췌장관 선암종에서 고도로 발현되었으며, 샘플의 89% (69개의 경우)가 IHC에 의해 Ly6E에 양성으로 염색되었고, 63%가 중간 정도 또는 강한 수준의 염색 (IHC에 의해 2+ 또는 3+)을 나타내었다. 정상 췌장 샘플 (N = 5) 중 어떤 것도 Ly6E의 발현을 나타내지 않았다. 대조적으로, 상기 나타낸 바와 같이, 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 IHC 연구는 췌장암의 단지 ~40%에서 Ly6E를 검출하였다.
Ly6E는 비소세포 폐암에서 발현되었으며, 선암종의 89% 및 편평 세포 암종의 83%가 IHC에 의해 Ly6E에 양성으로 염색되었고, 선암종의 64% 및 편평 세포 암종의 46%가 중간 정도 또는 강한 수준의 염색 (IHC에 의해 2+ 또는 3+)을 나타내었다. 대조적으로, 상기 나타낸 바와 같이, 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 IHC 연구는 비소세포 폐암의 단지 ~29%에서 Ly6E를 검출하였다.
폐암에서의 우세한 염색은 세포질/막성이었다. 염색은 정상 폐포 대식세포에서 약 1+ (N = 12)로 나타났지만, 염색이 Ly6E 또는 헤모시데린에 특이적인지 여부는 명백하지 않았다. 정상 폐포세포에 대해서는 어떠한 염색도 관찰되지 않았다.
결장직장암 샘플에서, 64% (68개의 경우)가 IHC 염색에 의해 Ly6E에 양성이었으며, 11%의 경우가 중간 정도 또는 강한 수준의 염색 (IHC에 의해 2+ 또는 3+)을 나타내었다. 양성 샘플의 대략 2/3에서, Ly6E 염색은 암종 세포의 정단 표면으로 분극화되었다. 시험된 정상 결장 샘플은 Ly6E의 어떠한 발현도 나타내지 않았다 (N = 2). 대조적으로, 상기 나타낸 바와 같이, 마우스 항-Ly6E 클론 10G7.7.8을 사용한 IHC 연구는 결장암의 단지 ~26%에서 Ly6E를 검출하였다.
난소 암종에서, 77%의 경우가 IHC 염색에 의해 Ly6E에 양성이었으며, 53%의 경우가 중간 정도 또는 강한 수준의 염색 (IHC에 의해 2+ 또는 3+)을 나타내었다. 두경부 편평세포 암종에서, 85%의 경우가 IHC 염색에 의해 Ly6E에 양성이었으며, 42%의 경우가 중간 정도 또는 강한 수준의 염색 (IHC에 의해 2+ 또는 3+)을 나타내었다. 최종적으로, 위 선암종에서, 70%의 경우가 IHC 염색에 의해 Ly6E에 양성이었으며, 31%의 경우가 중간 정도 또는 강한 수준의 염색 (IHC에 의해 2+ 또는 3+)을 나타내었다.
미감작 이소형 대조군은 모든 대조군 샘플에 대해 0.2 μg/mL에서 음성이었다.
<표 4> 다양한 인간 암에서의 Ly6E IHC
Figure pct00008
실시예 5 - IHC 염색에 의한 인간 및 시노몰구스 원숭이 정상 조직에서의 Ly6E의 상대 발현
정상 인간 조직 마이크로어레이 (TMA)를 토끼 항-Ly6E 항체 GEN-93-8-1로 염색하였다. 약한 (1 +) 양성 염색이 비장, 유방, 부신, 타액선, 자궁경부 및 자궁의 자궁내막에서 관찰되었고, 중간 정도 (2 +) 양성 염색이 뇌 피질 및 소뇌에서 관찰되었다. 동일한 항-Ly6E 항체로 염색한 정상 시노몰구스 원숭이 조직은 정상 유방 조직에서 약한 (1 +) 발현 및 비장, 자궁의 자궁내막 및 방광 상피에서 중간 정도 (2 +) 염색을 나타내었다. 표 5를 참조한다.
<표 5> IHC 염색에 의한 인간 및 시노몰구스 원숭이 정상 조직에서의 Ly6E의 발현
Figure pct00009
실시예 6 - 항체 약물 접합체의 생성
보다 대규모 항체 생산을 위해, 항체 hu9B12.v12를 CHO 세포에서 생산하였다. VL 및 VH를 코딩하는 벡터를 CHO 세포 내로 형질감염시키고, 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 배양 배지로부터 IgG를 정제하였다.
vcMMAE ADC의 생성: 항-Ly6E 항체-약물 접합체 (ADC)를 hu9B12.v12를 접합시켜 생산하거나 또는 대조군 항 gD ADC를 본원에 도시된 약물-링커 모이어티 MC-vc-PAB-MMAE에 접합시켰다. 편의를 위해, 약물-링커 모이어티 MC-vc-PAB-MMAE는 때때로 이들 실시예 및 도면에서 "vcMMAE" 또는 "VCE"로 지칭하였다. 접합에 앞서, WO 2004/010957 A2에 기재된 방법론에 따라 표준 방법을 사용하여 TCEP로 항체를 부분적으로 환원시켰다. 부분적으로 환원된 항체를, 예를 들어 문헌 [Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784] 및 US 2005/0238649 A1에 기재된 방법론에 따라 표준 방법을 사용하여 약물-링커 모이어티에 접합시켰다. 간략하게, 부분적으로 환원된 항체를 약물-링커 모이어티와 합하여 약물-링커 모이어티가 항체의 환원된 시스테인 잔기에 접합되도록 하였다. 접합 반응을 켄칭하고, ADC를 정제하였다. 각각의 ADC에 대한 약물 로드 (항체당 약물 모이어티의 평균 수)를 결정하였으며, 항-Ly6E 항체 및 항-gD 대조군 항체의 경우에 3.3 내지 4.0이었다.
실시예 7: 이종이식편 마우스 모델에서의 항-Ly6E ADC의 생체내 효능 및 암 세포주의 IHC 염색
유방암 세포주, HCC1569 (CRL-2330) 및 췌장암 세포주 SU.86.86 (CRL-1837)을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC, 버지니아주 마나사스)으로부터 입수하였다. CHO-K1S는 CHO-K1의 현탁 세포주 유도체이다. HCC1569 X2 세포주는 생체내 성장을 위해 최적화된 모 HCC1569 세포주의 유도체 (ATCC, CRL-2330)이다. 모 HCC1569 세포를 암컷 타코닉(Taconic) NCr 누드 마우스의 우측 측복부에 피하로 주사하고, 1개의 종양을 수확하고, 잘게 자르고, 시험관내에서 성장시켜 HCC1569 X1 세포주를 생성하였다. HCC1569 X1 세포주를 다시 세포주의 성장을 개선시키기 위한 노력으로 암컷 타코닉 NCr 누드 마우스의 우측 측복부에 피하로 주사하였다. 이 연구로부터의 종양을 수집하고, 다시 시험관내 성장에 적합화하여 HCC1569 X2 세포주를 생성하였다. 이 세포주 및 이 세포주로부터 유래된 종양은 Ly6E를 발현한다.
이종이식편 모델: 항-Ly6E 항체 약물 접합체 (ADC)의 효능을 상기 기재된 세포주로부터 유래된 이종이식편 모델에서 또는 원발성 환자 유래 종양 모델에서 평가하였으며, 후자 실험은 온코테스트 (독일 프라이부르크) 및 젠테크 (프랑스 제노폴)에서 수행하였다.
제넨테크 (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)에서 수행된 모든 연구는 실험동물의 관리 및 사용에 대한 지침 (참조: Institute of Laboratory Animal Resources (NIH publication no. 85-23), Washington, DC: National Academies Press; 1996)에 따랐다. 온코테스트에서 수행된 모든 실험은 지방 당국의 승인을 받았으며, 독일 동물복지법(Tierschutzgesetz)의 가이드라인에 따라 수행하였다. 젠테크의 CERFE 시설에서의 동물 사용을 위한 허가는 프랑스 농수산부 수의학 사무국 (승인 번호 A 91-228-107)에 의해 받았다. 동물 관리 및 사육은 유럽 조약 STE 123에 따랐다. 젠테크에서의 모든 실험은 실험 동물의 보호에 관한 프랑스 법률 및 척추 동물에 대한 시험을 위한 현재 유효한 라이센스 (프랑스 농수산부에 의해 트롱-안 트란 박사(Dr. Truong-An TRAN)에게 허여됨) (번호 A 91-541, 일자 2010년 12월 21일; 유효기간: 5년)에 따라 수행될 것이다. 6- 내지 9-주령 암컷 면역결핍 마우스에게 배측 우측 측복부에서 피하로 접종하고, 평균 종양 부피와 SD를 군당 9-10마리 마우스로부터 결정하였다.
세포주로부터 유래된 이종이식편을 사용하는 효능 연구를 위해, 타코닉으로부터의 NCR 누드 마우스에게 매트리겔을 함유하는 HBSS 중 5백만개의 세포를 접종하거나 또는 찰스 리버(Charles River)로부터의 C.B-17 SCID (근교배됨) 마우스에게 매트리겔을 함유하는 HBSS 중 2백만개의 세포를 접종하였다. 0.36mg 에스트로겐 이식물을 HCC1569 X2 이종이식편 모델을 위해 사용하였다. 젠테크 및 온코테스트에서의 종양 체외이식편을 사용하는 효능 연구를 위해, 하를란 또는 찰스 리버로부터의 무흉선 누드 또는 NMRI nu/nu 마우스에게 모델 HBCx-8, HBCx-9, MAXF-1162 및 PAXF-1657로부터의 원발성 유방암 또는 췌장암 환자 유래 물질을 이식하였다. 종양 부피가 대략 80-200 mm3에 도달하였을 때 (제0일), 동물을 각각 9-10개의 군으로 무작위화하고, 적절한 용량의 비히클 대조군 또는 ADC의 단일 정맥내 (IV) 주사를 투여하였다. 종양 부피를 연구 종점까지 1주에 2회 측정하였다.
도 5 내지 10에 나타낸 바와 같이, 토끼 항-Ly6E 항체 클론 GEN-93-8-1은 이전의 면역조직화학 항체, 마우스 항-Ly6E 항체 클론 10G7.7.8보다 더 감수성이었다.
HCC1569 X2 유방암 이종이식편 모델에서, GEN-93-8-1을 사용한 면역조직화학은 3+ 염색을 나타낸 반면, 10G7.7.8은 보다 낮은 1+/2+ 염색을 나타내었다. 각각 도 5, 패널 e 및 d를 참조한다. HCC1569 X2 유방암 세포는 Her2/neu+ 및 ER-/PR-/p53-였다. HCC1569 X2 유방암 이종이식편 모델은 2 mg/kg 및 4 mg/kg에서 인간화 항-Ly6E (hu9B12 v12) ADC (MC-vc-PAB-MMAE)에 감수성이었다. 도 5, 패널 a를 참조한다.
SU.86.86 췌장암 이종이식편 모델에서, GEN-93-8-1을 사용한 면역조직화학은 2+ 염색을 나타낸 반면, 10G7.7.8은 보다 낮은 1+/2+ 염색을 나타내었다. 각각 도 6, 패널 e 및 c를 참조한다. SU.86.86 췌장암 이종이식편 모델은 1 mg/kg 및 3 mg/kg에서 인간화 항-Ly6E (hu9B12 v12) ADC (MC-vc-PAB-MMAE)에 감수성이었다. 도 6, 패널 A를 참조한다.
HBCx-9 유방암 이종이식편 모델에서, GEN-93-8-1을 사용한 면역조직화학은 2+ 염색을 나타낸 반면, 10G7.7.8은 보다 낮은 1+ 염색을 나타내었다. 각각 도 7, 패널 d 및 c를 참조한다. HBCx-9 유방암 세포는 삼중 음성 (Her2-/ER-/PR-)이었다. HBCx-9 유방암 이종이식편 모델은 8 mg/kg 및 12 mg/kg에서 인간화 항-Ly6E (hu9B12 v12) ADC (MC-vc-PAB-MMAE)에 감수성이었다. 도 7, 패널 a를 참조한다.
HBCx-8 유방암 이종이식편 모델에서, GEN-93-8-1 및 10G7.7.8을 사용한 면역조직화학은 1+/2+ 염색을 나타내었으나; GEN-93-8-1을 사용한 염색은 10G7.7.8을 사용한 염색과 비교하여 보다 강건하고 균질하였다. 각각 도 8, 패널 d 및 c를 참조한다. HBCx-8 유방암 세포는 삼중 음성 (Her2-/ER-/PR-)이었다. HBCx-8 유방암 이종이식편 모델은 12 mg/kg에서 인간화 항-Ly6E (hu9B12 v12) ADC (MC-vc-PAB-MMAE)에 감수성이었다. 도 8, 패널 a를 참조한다.
MAXF-1162 유방암 이종이식편 모델에서, GEN-93-8-1을 사용한 면역조직화학은 강건한 2+ 염색 (중심 저산소 부위에서 일부 1+ 염색)을 나타낸 반면, 10G7.7.8은 보다 덜 균질한 1+/2+ 염색을 나타내었다. 각각 도 9, 패널 d 및 c를 참조한다. MAXF-1162 유방암 세포는 Her2 증폭을 갖는다. MAXF-1162 유방암 이종이식편 모델은 4 mg/kg, 8 mg/kg 및 12 mg/kg에서 인간화 항-Ly6E (hu9B12 v12) ADC (MC-vc-PAB-MMAE)에 감수성이었다. 도 9, 패널 a를 참조한다.
PAXF-1657 췌장암 이종이식편 모델에서, GEN-93-8-1을 사용한 면역조직화학은 강건한 2+ 염색을 나타낸 반면, 10G7.7.8은 약한 +/- 염색을 나타내었다. 각각 도 10, 패널 d 및 c를 참조한다. PAXF-1657 췌장암 이종이식편 모델은 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg 및 12 mg/kg에서 인간화 항-Ly6E (hu9B12 v12) ADC (MC-vc-PAB-MMAE)에 감수성이었다. 도 10, 패널 a를 참조한다.
전체적으로, GEN-93-8-1은 10G7.7.8과 비교하여 IHC에 의해 보다 강건하고 균질한 염색을 나타내었다.
상기 본 발명은 이해의 명확성의 목적을 위해 예시 및 예의 방식으로 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> ANTI-Ly6E ANTIBODIES METHODS OF USE <130> GENE-33455/WO-1/ORD <150> US 61/893,553 <151> 2013-10-21 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Ile Phe Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gly Val Glu 1 5 10 15 Arg Ala Ser Ser Leu Met Cys Phe Ser Cys Leu Asn Gln Lys Ser Asn 20 25 30 Leu Tyr Cys Leu Lys Pro Thr Ile Cys Ser Asp Gln Asp Asn Tyr Cys 35 40 45 Val Thr Val Ser Ala Ser Ala Gly Ile Gly Asn Leu Val Thr Phe Gly 50 55 60 His Ser Leu Ser Lys Thr Cys Ser Pro Ala Cys Pro Ile Pro Glu Gly 65 70 75 80 Val Asn Val Gly Val Ala Ser Met Gly Ile Ser Cys Cys Gln Ser Phe 85 90 95 Leu Cys Asn Phe Ser Ala Ala Asp Gly Gly Leu Arg Ala Ser Val Thr 100 105 110 Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ala Leu Leu Arg 115 120 125 Phe Gly Pro 130 <210> 2 <211> 131 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 2 Met Lys Ile Phe Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gly Val Glu 1 5 10 15 Arg Ala Ser Ser Leu 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Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Ala Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ala Leu Thr Ile Ser Asp Leu 65 70 75 80 Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gly Gly Tyr Pro Gly 85 90 95 Ser Leu Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 28 <211> 113 <212> PRT <213> Lepus curpaeums <400> 28 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Ala Thr Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ile Tyr Asp 20 25 30 Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Val Ile Tyr Thr Ser Gly Gly Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Arg Met Thr 65 70 75 80 Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Asn Trp 85 90 95 Ala His Gly Ser Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 Val Gly Gly Tyr Pro Gly Ser Leu Asn Val 1 5 10 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 Ile Tyr Asp Met Thr 1 5 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 Val Ile Tyr Thr Ser Gly Gly Ala Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala 1 5 10 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 Asn Trp Ala His Gly Ser Asp Leu 1 5 <210> 35 <211> 131 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 35 Met Lys Ile Phe Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gly Val Glu 1 5 10 15 Arg Ala Ser Ser Leu Met Cys Phe Ser Cys Leu Asn Gln Lys Ser Asn 20 25 30 Leu Tyr Cys Leu Lys Pro Thr Ile Cys Ser Asp Gln Asp Asn Tyr Cys 35 40 45 Val Thr Val Ser Thr Ser Ala Gly Ile Gly Asn Leu Val Thr Phe Gly 50 55 60 His Ser Leu Ser Lys Thr Cys Ser Pro Ala Cys Pro Leu Pro Glu Gly 65 70 75 80 Ile Asn Val Gly Val Ala Ser Met Gly Ile Ser Cys Cys Gln Ser Phe 85 90 95 Leu Cys Asn Phe Ser Ala Ala Asp Gly Gly Leu Arg Ala Ser Ala Thr 100 105 110 Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ala Leu Leu Arg 115 120 125 Phe Gly Pro 130 <210> 36 <211> 136 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Met Ser Ala Thr Ser Asn Met Arg Val Phe Leu Pro Val Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gly Met Glu Gln Val His Ser Leu Met Cys Phe Ser Cys 20 25 30 Thr Asp Gln Lys Asn Asn Ile Asn Cys Leu Trp Pro Val Ser Cys Gln 35 40 45 Glu Lys Asp His Tyr Cys Ile Thr Leu Ser Ala Ala Ala Gly Phe Gly 50 55 60 Asn Val Asn Leu Gly Tyr Thr Leu Asn Lys Gly Cys Ser Pro Ile Cys 65 70 75 80 Pro Ser Glu Asn Val Asn Leu Asn Leu Gly Val Ala Ser Val Asn Ser 85 90 95 Tyr Cys Cys Gln Ser Ser Phe Cys Asn Phe Ser Ala Ala Gly Leu Gly 100 105 110 Leu Arg Ala Ser Ile Pro Leu Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Ser Leu 115 120 125 Leu Ala Leu Leu Gln Leu Ser Pro 130 135 <210> 37 <211> 136 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 37 Met Ser Ala Ala Ser Ser Met Arg Val Phe Leu Pro Val Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Leu Gly Val Glu Gln Val His Ser Leu Met Cys Phe Ser Cys 20 25 30 Thr Asp Gln Lys Asn Asn Ile Asn Cys Leu Trp Pro Val Ser Cys Ser 35 40 45 Ser Thr Asp Asn Tyr Cys Ile Thr Leu Ser Ala Ala Ala Gly Phe Gly 50 55 60 Asn Val Asn Leu Gly Tyr Thr Leu Asn Lys Gly Cys Ser Pro Thr Cys 65 70 75 80 Pro Arg Glu Asn Ile Asn Ile Asn Leu Gly Val Ala Ser Val Asn Ser 85 90 95 Tyr Cys Cys Gln Ser Ser Phe Cys Asn Phe Ser Thr Ala Gly Leu Gly 100 105 110 Leu Arg Ala Ser Ile Pro Leu Leu Gly Leu Gly Leu Leu Leu Ser Leu 115 120 125 Leu Ala Val Leu Arg Leu Ser Pro 130 135 <210> 38 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Leu Met Cys Phe Ser Cys Leu Asn Gln Lys Ser Asn Leu Tyr Cys Leu 1 5 10 15 Lys Pro Thr Ile Cys Ser Asp Gln Asp Asn Tyr Cys Val Thr Val Ser 20 25 30 Ala Ser Ala Gly Ile Gly Asn Leu Val Thr Phe Gly His Ser Leu Ser 35 40 45 Lys Thr Cys Ser Pro Ala Cys Pro Ile Pro Glu Gly Val Asn Val Gly 50 55 60 Val Ala Ser Met Gly Ile Ser Cys Cys Gln Ser Phe Leu Cys Asn Phe 65 70 75 80 Ser Ala Ala Asp Gly Gly Leu Arg Ala Ser Val Thr Leu Leu Gly Ala 85 90 95 Gly Leu Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ala Leu Leu Arg Phe Gly Pro 100 105 110 <210> 39 <211> 111 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 39 Leu Met Cys Phe Ser Cys Leu Asn Gln Lys Ser Asn Leu Tyr Cys Leu 1 5 10 15 Lys Pro Thr Ile Cys Ser Asp Gln Asp Asn Tyr Cys Val Thr Val Ser 20 25 30 Thr Ser Ala Gly Ile Gly Asn Leu Val Thr Phe Gly His Ser Leu Ser 35 40 45 Lys Thr Cys Ser Pro Ala Cys Pro Leu Pro Glu Gly Ile Asn Val Gly 50 55 60 Val Ala Ser Met Gly Ile Ser Cys Cys Gln Ser Phe Leu Cys Asn Phe 65 70 75 80 Ser Ala Ala Asp Gly Gly Leu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Leu Gly Ala 85 90 95 Gly Leu Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ala Leu Leu Arg Phe Gly Pro 100 105 110 <210> 40 <211> 111 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 40 Leu Met Cys Phe Ser Cys Leu Asn Gln Lys Ser Asn Leu Tyr Cys Leu 1 5 10 15 Lys Pro Thr Ile Cys Ser Asp Gln Asp Asn Tyr Cys Val Thr Val Ser 20 25 30 Thr Ser Ala Gly Ile Gly Asn Leu Val Thr Phe Gly His Ser Leu Ser 35 40 45 Lys Thr Cys Ser Pro Ala Cys Pro Leu Pro Glu Gly Ile Asn Val Gly 50 55 60 Val Ala Ser Met Gly Ile Ser Cys Cys Gln Ser Phe Leu Cys Asn Phe 65 70 75 80 Ser Ala Ala Asp Gly Gly Leu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Leu Gly Ala 85 90 95 Gly Leu Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ala Leu Leu Arg Phe Gly Pro 100 105 110 <210> 41 <211> 110 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Leu Met Cys Phe Ser Cys Thr Asp Gln Lys Asn Asn Ile Asn Cys Leu 1 5 10 15 Trp Pro Val Ser Cys Gln Glu Lys Asp His Tyr Cys Ile Thr Leu Ser 20 25 30 Ala Ala Ala Gly Phe Gly Asn Val Asn Leu Gly Tyr Thr Leu Asn Lys 35 40 45 Gly Cys Ser Pro Ile Cys Pro Ser Glu Asn Val Asn Leu Asn Leu Gly 50 55 60 Val Ala Ser Val Asn Ser Tyr Cys Cys Gln Ser Ser Phe Cys Asn Phe 65 70 75 80 Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Arg Ala Ser Ile Pro Leu Leu Gly Leu 85 90 95 Gly Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Ser Pro 100 105 110 <210> 42 <211> 110 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 42 Leu Met Cys Phe Ser Cys Thr Asp Gln Lys Asn Asn Ile Asn Cys Leu 1 5 10 15 Trp Pro Val Ser Cys Ser Ser Thr Asp Asn Tyr Cys Ile Thr Leu Ser 20 25 30 Ala Ala Ala Gly Phe Gly Asn Val Asn Leu Gly Tyr Thr Leu Asn Lys 35 40 45 Gly Cys Ser Pro Thr Cys Pro Arg Glu Asn Ile Asn Ile Asn Leu Gly 50 55 60 Val Ala Ser Val Asn Ser Tyr Cys Cys Gln Ser Ser Phe Cys Asn Phe 65 70 75 80 Ser Thr Ala Gly Leu Gly Leu Arg Ala Ser Ile Pro Leu Leu Gly Leu 85 90 95 Gly Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ala Val Leu Arg Leu Ser Pro 100 105 110 <210> 43 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Ser Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 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Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 cccggaagtg gcagaaaccc 20 <210> 47 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 gtgcctgatc tgtgcccttg gtcccaggtc aggcccaccc cctgcacctc cacctgcccc 60 agcccctgcc tctgcccaag tgggccagct gccctcactt ctggggtgga tgatgtgacc 120 ttccttgggg gactgcggaa gggacgaggg ttccctggag tcttacggtc caacatcaga 180 ccaagtccca tggacatgct gacagggtcc ccagggagac cgtgtcagta gggatgtgtg 240 cctggctgtg tacgtgggtg tgcagtgcac gtgagagcac gtggcggctt ctgggggcca 300 tgtttgggga gggaggtgtg ccagcagcct ggagagcctc agtccctgta gccccctgcc 360 ctggcacagc tgcatgcact tcaagggcag cctttggggg ttggggtttc tgccacttcc 420 ggg 423 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 agcggattct catggaaca 19 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 ctggtcagcc aggagctt 18 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 tccacaagct gaaggcagac aagg 24 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 51 agaaggcgtc aatgttggt 19 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 52 cactgaaatt gcacagaaag c 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <400> 53 ttccatgggc atcagctgct g 21

Claims (35)

  1. (a) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는, Ly6E에 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, (a) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, (a) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 서열 28의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열; (b) 서열 27의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) (a)에서와 같은 VH 서열 및 (b)에서와 같은 VL 서열을 포함하는 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 28의 VH 서열을 포함하는 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 27의 VL 서열을 포함하는 항체.
  7. 서열 28의 VH 서열 및 서열 27의 VL 서열을 포함하는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  9. 제8항에 있어서, 마우스, 토끼, 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 및 IgG4로부터 선택된 IgG인 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  12. 제11항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  13. 항체가 생산되도록 제13항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
  15. 제14항의 면역접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 표지에 접합된 항체.
  17. 제16항에 있어서, 표지가 양전자 방출체인 항체.
  18. 제17항에 있어서, 양전자 방출체가 89Zr인 항체.
  19. 생물학적 샘플을 제1항 내지 제10항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E에 대한 항-Ly6E 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키고, 생물학적 샘플에서 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 인간 Ly6E를 검출하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 항-Ly6E 항체가 제7항의 항체인 방법.
  21. 제20항 또는 제21항에 있어서, 생물학적 샘플이 유방암 샘플, 췌장암 샘플, 결장암 샘플, 결장직장암 샘플, 흑색종 암 샘플, 난소암 샘플, 비소세포 폐암 샘플, 식도암 샘플, 두경부암 샘플, 신장암 샘플, 연부 조직암 샘플, 자궁내막암 샘플 또는 위암 샘플인 방법.
  22. (i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항-Ly6E 항체를 포함하는 표지된 항-Ly6E 항체를 Ly6E-양성 암을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하고, (ii) 대상체에서 표지된 항-Ly6E 항체를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 표지된 항-Ly6E 항체의 검출은 대상체에서의 Ly6E-양성 암을 나타내는 것인, Ly6E-양성 암을 검출하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 표지된 항-Ly6E 항체가 표지된 제7항의 항체인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 표지된 항-Ly6E 항체가 양전자 방출체에 접합된 항-Ly6E 항체를 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 양전자 방출체가 89Zr인 방법.
  26. 암 환자로부터의 암 샘플을 제1항 내지 제10항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E에 대한 항-Ly6E 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키고, 암 샘플에서 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함하는, 암 환자를 Ly6E-양성 암을 갖는 것으로서 확인하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 암 생검 샘플에서 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E 사이의 복합체가 검출된 경우에 암 환자를 Ly6E-양성 암을 갖는 것으로서 확인하는 것인 방법.
  28. 암 환자로부터의 암 샘플을 제1항 내지 제10항 및 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E에 대한 항-Ly6E 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 접촉시키고, 암 샘플에서 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 것을 포함하는, 면역접합체를 사용한 치료를 위해 암 환자를 선택하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 암 생검 샘플에서 항-Ly6E 항체와 자연 발생 인간 Ly6E 사이의 복합체가 검출된 경우에 암 환자를 선택하는 것인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 면역접합체가 (a) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항-Ly6E 항체를 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 항-Ly6E 항체가 서열 5의 VH 서열 및 서열 3의 VL 서열을 포함하는 것인 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 면역접합체가 세포독성제에 접합된 항-Ly6E 항체를 포함하는 것인 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 암 샘플이 유방암 샘플, 췌장암 샘플, 결장암 샘플, 결장직장암 샘플, 흑색종 암 샘플, 난소암 샘플, 비소세포 폐암 샘플, 식도암 샘플, 두경부암 샘플, 신장암 샘플, 연부 조직암 샘플, 자궁내막암 샘플 또는 위암 샘플인 방법.
  34. 제21항 또는 제33항에 있어서, 유방암 샘플이 Her2 양성 유방암, Her2 음성 유방암, Her2 음성/호르몬 수용체 양성 (Her2-/ER+/PR+) 유방암 또는 삼중 음성 (Her2-/ER-/PR-) 유방암으로부터의 것인 방법.
  35. 제21항 또는 제33항에 있어서, 위암 샘플이 Her2 양성 위암 또는 Her2 음성 위암으로부터의 것인 방법.
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