KR20160062764A - 세포 기능, 유전적 안정성 및 재생적 적용을 촉진하기 위한 뉴클레오시드 보충 - Google Patents

세포 기능, 유전적 안정성 및 재생적 적용을 촉진하기 위한 뉴클레오시드 보충 Download PDF

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제임스 에이 번
카이우스 라두
패트릭 리
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Abstract

다양한 구현예에서, 개선된 유전적 안정성, 세포 기능 및 재생 능력을 가진 줄기 세포의 배양을 위한 세포 배양 배지, 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지가 제공된다. 예시적 배양 배지는 배양 배지에 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 (예, dNTP 및/또는 NP) 또는 이의 하나 이상의 전구체가 보충된, 줄기 세포를 위한 기저 배양 배지이다. 예시적 NCT 배지는 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 (예, dNTP 및/또는 NP) 또는 이의 하나 이상의 전구체를 함유하는 전달 비히클 (예, 피부 크림 또는 기타 비히클) 을 포함한다. NCT 배지는 특히, 재생적, 화장적 및/또는 치료적 목적을 위해 뉴클레오시드 칵테일의 인간 조직 (예컨대 피부) 내로의 직접 전달을 제공한다.

Description

세포 기능, 유전적 안정성 및 재생적 적용을 촉진하기 위한 뉴클레오시드 보충 {NUCLEOSIDE SUPPLEMENTATION TO PROMOTE CELLULAR FUNCTION, GENETIC STABILITY AND REGENERATIVE APPLICATIONS}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 본원에 인용된, 2013 년 10 월 16 일에 출원된 USSN 61/891,846 의 혜택 및 이에 대한 우선권을 주장한다.
정부 지원에 대한 언급
[ 해당사항 없음 ]
비록 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC) 가 배아 줄기 세포 (ESC) 와 큰 유사성을 공유하더라도, iPSC 유도에 사용되는 체세포 재프로그래밍 방법은 과학적 관심 및 새로운 세포 유형에 대한 우려 모두를 야기한다. 최적-이하로 보충된 환경 조건에서 표준-이하 (substandard)/생리학적-이하 (subphysiological) 세포 기능 (예컨대 최적-이하 (suboptimal) 증식 및 분화) 과 관련된 상당한 우려 외에도, 이들의 유도 및 연장된 배양 동안, iPSC 뿐 아니라 ESC 의 게놈 통합성 및 안정성에 대한 중요한 생물학적 안정성 우려가 있다. 연구, 화장적 및 치료적/재생적 적용에서의 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (또는 기타 줄기세포 또는 체세포) 의 유용성은 게놈 통합성, 안정성 및 기능성에 고도로 의존한다. 특정한 게놈 또는 에피게놈 (epigenomic) 비정상은 분화 잠재력을 절출할 뿐 아니라, 또한 iPSC-기반 치료법의 수여자에서 종양생성을 야기할 수 있다. 게놈 비정상은 핵형 이탈 (karyotypic aberration), 예컨대 염색체 수 및 구조에의 변화, 카피 수 변화 (CNV), 예컨대 핵형-이하 (subkaryotypic) 또는 염색체-이하 (subchromosomal) 증폭 및 결실, 습득된 단친 이염색체성으로 인한 이형접합성의 상실 (LOH: Loss Of Heterozygosity), 및 외래 DNA 의 숙주 게놈 내로의 랜덤 또는 부위-특이적 통합으로서 관찰되었다.
연구는 형행의 접근법을 사용하여 유도된 다양한 체세포 및 줄기 세포 및 본질적으로 모든 IPSC 클론이, 표준-이하 생리학 (예컨대 손상된 세포 증식) 을 갖는 것 외에도, 재프로그래밍 및 시험관 내 배양-유도 스트레스 동안 게놈 불안정성을 습득한다는 것을 나타낸다 (Martins-Taylor and Xu (2012) Stem Cells 30: 22-27; Lund et al. (2012) Nat. Rev. Genet., 13: 732-744). hiPSC 게놈 불안정성 논란은, 게놈 불안정성과 악성 변형의 위험 증가 사이에 성립된 연결고리를 제공하여, 개인화된 iPSC-기반 재생적 치료법을 임상으로 진행하기에 가장 중요한 장애물 중 하나이다 (Martins-Taylor and Xu (2012) Stem Cells 30: 22-27; Lund et al. (2012) Nat. Rev. Genet., 13: 732-744; Byrne (2013) Gene Therapy and Regulation 7: 1230002).
hiPSC 재프로그래밍 및 배양 동안, 그리고 게다가 기타 다능성 줄기 세포 (예컨대, 인간 배아 줄기 세포) 및 체성 줄기 세포 (예컨대, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 피부 줄기 세포) 에 대한 게놈 불안정성 및 손상된 세포 생리학의 원인은 불명확하고, 이러한 고도로 유해한 현상의 발생을 감소시키고 결국에는 소멸시키기 위한 접근법은 아직 개발되지 않았다.
줄기 세포 및 체세포의 게놈 통합성, 안정성 및 기능성은 뉴클레오시드 (예, 데옥시리보뉴클레오시드) 의 외인적 보충에 의해 증대될 수 있다는 것으로 밝혀졌다. 이러한 뉴클레오시드 보충 (뉴클레오시드 칵테일 (NC) 또는, 또는 특정 구현예에서 데옥시리보뉴클레오시드칵테일 (DC) 로서 언급됨) 은 세포 배양 배지를 증대시키는데 사용될 수 있고 또는 전달 비히클과 조합하여 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지, 또는 특정 구현예에서 데옥시리보뉴클레오시드 전송 칵테일 (DCT) 을 생성할 수 있다. 이러한 보충은, 게놈 안정성을 향상시키는 것 외에도 세포 기능 (예를 들어, 세포 증식 속도를 높이고, 표적 치료 세포 유형 (예컨대 간세포) 으로의 증식을 촉진하고, 및/또는 인간 조직 재생을 촉진함으로써 (예컨대 재생 목적을 위해 인간 피부 세포의 생체 내 분열을 자극함) 을 향상시킬 수 있다.
게다가 인간 피부 섬유아세포의 뉴클레오시드 칵테일에 대한 노출이 증식을 상당히 증대된 속도로 자극할 수 있고, 상기 현상은, 뉴클레오시드 전송 배지 예컨대 피부 크림과 조합되는 경우, 인간 피부 또는 다른 조직을 직접적으로 재생/회춘시키는데 매우 유용한 것으로 입증될 수 있다는 것이 관찰되었다.
뉴클레오시드 칵테일은 게놈 안정성을 개선할 뿐 아니라, 또한 다양한 종류의 체세포 및 줄기 세포의 증식 속도를 상당히 증대시키고, 다능성 줄기 세포를 표적 세포 유형 (예컨대 간 질환 치료를 위한 간세포) 으로의 분화를 증대한다.
따라서, 일부 구현예는 배양 배지에 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 (예, dNTP 및/또는 NTP) 또는 이의 하나 이상의 전구체가 보충되는, 체세포 및 줄기 세포를 위한 기저 배양 배지를 제공한다. 다른 구현예는 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 (예, dNTP 및/또는 NTP) 또는 이의 하나 이상의 전구체를: 1) 피부 크림, 2) 국소 화장품 및/또는 3) 외인성 전달 메카니즘 (EDM), 예컨대 주사용, 섭취, 흡입 또는 기타를 포함하나, 이에 제한되지 않는 국소 및/또는 전달 메카니즘 생체 내 용도와 조합한다.
따라서, 다양한 양상에서, 본원에서 고려되는 본 발명(들) 은 하기 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다:
다양한 양상에서, 본원에서 고려되는 본 발명(들) 은 하기 구현예 중 임의의 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다:
구현예 1: 배양 배지에 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 하나 이상의 전구체가 보충된, 줄기 세포를 위한 기저 배양 배지를 포함하는, 개선된 유전적 안정성을 가진 줄기 세포의 배양을 위한 세포 배양 배지.
구현예 2: 화장적 또는 약학적 비히클; 및 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체를 포함하는, 체세포 또는 줄기 세포 유전적 안정성을 개선하기 위한 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
구현예 3: 구현예 1 또는 구현예 2 에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트가 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (NCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 데옥시우리딘 트리포스페이트, 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP) 로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 배지.
구현예 4: 구현예 1 또는 구현예 2 에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트가 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (NCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 배지.
구현예 5: 구현예 1 또는 구현예 2 에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트가 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP) 로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 배지.
구현예 6: 구현예 1 내지 구현예 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (NCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 데옥시우리딘 트리포스페이트, 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP) 로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오시드 트리포스페이트의 하나 이상의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 배지.
구현예 7: 구현예 6 에 있어서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 상기 하나 이상의 전구체가 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (NCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 세포 배양 또는 NCT 배지.
구현예 8: 구현예 6 에 있어서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 상기 하나 이상의 전구체가 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP) 로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 세포 배양 또는 NCT 배지.
구현예 9: 구현예 1, 구현예 3 내지 구현예 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 10: 구현예 9 에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시아데노신 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 11: 구현예 9 에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시아데노신 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 12: 구현예 11 에 있어서, 데옥시아데노신 트리포스페이트의 상기 전구체가 데옥시아데노신 디포스페이트, 데옥시아데노신 모노포스페이트, 데옥시아데노신, 및 아데닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 13: 구현예 1 내지 구현예 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 14: 구현예 13 에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 데옥시구아노신 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 15: 구현예 13 에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 데옥시구아노신 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 16: 구현예 15 에 있어서, 데옥시구아노신 트리포스페이트의 상기 전구체가 데옥시구아노신 디포스페이트, 데옥시구아노신 모노포스페이트, 데옥시구아노신, 및 구아닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 또는 NCT 배지.
구현예 17: 구현예 1 내지 구현예 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시시티딘 트리포스페이트 (NCTP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 18: 구현예 17 에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 데옥시시티딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 19: 구현예 17 에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 데옥시시티딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 20: 구현예 19 에 있어서, 데옥시시티딘의 전구체가 데옥시시티딘 디포스페이트, 데옥시시티딘 모노포스페이트, 데옥시시티딘, 및 시토신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 21: 구현예 1 내지 구현예 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 22: 구현예 20 에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시티미딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 23: 구현예 20 에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시티미딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 24: 구현예 23 에 있어서, 데옥시티미딘 트리포스페이트의 상기 전구체가 데옥시티미딘 디포스페이트, 데옥시티미딘 모노포스페이트, 데옥시티미딘, 및 티민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 25: 구현예 1 내지 구현예 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 또는 NCT 배지가 데옥시우리딘 트리포스페이트, 또는 이의 전구체로 보충되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 26: 구현예 25 에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시우리딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 27: 구현예 25 에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시우리딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 28: 구현예 27 에 있어서, 데옥시우리딘 트리포스페이트의 상기 전구체가 데옥시우리딘 디포스페이트, 데옥시우리딘 모노포스페이트, 데옥시우리딘, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 29: 구현예 1 내지 구현예 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 또는 NCT 배지가 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 또는 이의 전구체로 보충되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 30: 구현예 29 에 있어서, 상기 배양 배지가 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 31: 구현예 29 에 있어서, 상기 배양 배지가 아데노신 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 32: 구현예 31 에 있어서, 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 의 상기 전구체가 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, 아데노신, 및 아데닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 33: 구현예 1 내지 구현예 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 구아노신 트리포스페이트 (GTP) 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 34: 구현예 33 에 있어서, 상기 배양 배지가 구아노신 트리포스페이트 (GTP) 로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 35: 구현예 33 에 있어서, 상기 배양 배지가 구아노신 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 36: 구현예 35 에 있어서, 구아노신 트리포스페이트의 상기 전구체가 구아노신 디포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 구아노신, 및 구아닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 37: 구현예 1 내지 구현예 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 38: 구현예 37 에 있어서, 상기 배양 배지가 시티딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 39: 구현예 37 에 있어서, 상기 배양 배지가 시티딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 40: 구현예 39 에 있어서, 시티딘 트리포스페이트의 상기 전구체가 시티딘 디포스페이트, 시티딘 모노포스페이트, 시티딘, 및 시토신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 41: 구현예 1 내지 구현예 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 또는 NCT 배지가 5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 또는 이의 전구체로 보충되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 42: 구현예 41 에 있어서, 상기 배양 배지가 5-메틸우리딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 43: 구현예 41 에 있어서, 상기 배양 배지가 5-메틸우리딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 44: 구현예 43 에 있어서, 5-메틸우리딘 트리포스페이트의 상기 전구체가 5-메틸우리딘 디포스페이트, 5-메틸우리딘 모노포스페이트, 5-메틸우리딘, 및 티민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 45: 구현예 1 내지 구현예 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지가 우리딘 트리포스페이트 (UTP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 46: 구현예 45 에 있어서, 상기 배양 배지가 우리딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 47: 구현예 45 에 있어서, 상기 배양 배지가 우리딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 48: 구현예 47 에 있어서, 우리딘 트리포스페이트의 전구체가 우리딘 디포스페이트, 우리딘 모노포스페이트, 우리딘, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 49: 구현예 2 내지 구현예 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 NCT 배지가 피하 투여, 비경구 투여, 국소 투여, 경구 투여, 비강 또는 흡입 투여, 국부 투여 예컨대 페인트, 에어로졸에 의해, 또는 경피로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경로를 통한 투여를 위해 제형화되는 비히클을 포함하는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
구현예 50: 구현예 2 내지 구현예 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 NCT 배지가 국소 투여, 피하 (subdermal) 투여, 또는 피내 (intradermal) 투여를 위해 제형화되는 비히클을 포함하는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
구현예 51: 구현예 50 에 있어서, 상기 배지가 머드, 허브 혼합물, 지방, 에멀전, 로션, 크림, 젤, 생물학적 제제, 용액, 스프레이, 연고, 폼, 무스, 액체, 현탁액, 분산액, 에어로졸, 비누, 샴푸, 및 컨디셔너로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비히클 내에 제형화되는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
구현예 52: 구현예 50 에 있어서, 상기 배지가 크림 (예, 얼굴용 크림) 으로서 제형화되는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
구현예 53: 구현예 56 내지 구현예 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 배지가 주름 제거 크림, 피부 필러, 흉터-감소 크림, 및 여드름 치료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형을 포함하는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
구현예 54: 구현예 1 내지 구현예 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 상기 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가, 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체에 의한 보충이 없는 동일한 배지에서 배양된 동일한 세포와 비교하여, 줄기 세포의 단기간 및/또는 장기간 유전적 안정성을 개선하기 위해 충분한 농도로 존재하는 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
구현예 55: 구현예 54 에 있어서, 상기 줄기 세포가 체세포 (예, 섬유아세포) 또는 줄기 세포 (예, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 지방 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 탯줄 줄기 세포, 및 유도된 다능성 줄기 세포) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 줄기 세포인 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
구현예 56: 구현예 1 내지 구현예 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 각각의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가 약 1 μM 내지 약 50 μM 이하, 또는 약 1 μM 내지 약 40 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 35 μM 이하, 또는 약 1 μM 내지 약 30 μM 이하의 범위의 농도 (예, 전송 배지에서 및/또는 생체 내에서 표적 세포에 대해 그러한 농도를 산출하는, 예컨대 NCT 배지로서 피부 크림을 사용하는 뉴클레오시드 칵테일의 인간 피부 내로의 외적 전달) 로 존재하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 57: 구현예 1 내지 구현예 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 각각의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가, 약 50 μM 이하, 또는 약 40 μM 이하, 또는 약 30 μM 이하 또는 약 25 μM 이하, 또는 약 20 μM 이하, 또는 약 15 μM 이하, 또는 약 10 μM 이하, 또는 약 5 μM 이하의 출발 (저장액) 또는 최종 (외적 전달) 의 농도인 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 58: 구현예 57 에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 각각의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가 약 5 μM 내지 약 30 μM 의 범위의 출발 (저장액) 또는 최종 (외적 전달) 농도로 존재하는 세포 배양 배지, 또는 NCT 배지.
구현예 59: 구현예 57 에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 각각의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가 약 30 μM 의 출발 (저장액) 또는 최종 (외적 전달) 농도로 존재하는 세포 배양 배지, 또는 NCT 배지.
구현예 60: 구현예 57 에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 각각의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가 약 5 μM 의 출발 (저장액) 또는 최종 (외적 전달) 농도로 존재하는 세포 배양 배지, 또는 NCT 배지.
구현예 61: 구현예 1 내지 구현예 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양 배지, 또는 상기 NCT 배지에 이종-병원체 (xenopathogen) 가 없는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 62: 구현예 1 내지 구현예 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양 배지, 또는 상기 NCT 배지에 동물 또는 인간 유래 혈청 알부민이 없는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
구현예 63: 구현예 1 내지 구현예 62 중 어느 하나에 있어서, 보충된 배지가 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 필수 8 (E8) 배지, 및 KnockOut DMEM 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지.
구현예 64: 구현예 63 에 있어서, 기저 배지가 DMEM/F12 인 세포 배양 배지.
구현예 65: 구현예 2 에 있어서, 상기 NCT 배지가 상기 비히클 및 구현예 1, 구현예 3 내지 구현예 48, 또는 구현예 55 내지 구현예 64 중 어느 하나에 따른 세포 배양 배지를 포함하는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
구현예 66: 구현예 1, 구현예 3 내지 구현예 48, 또는 구현예 55 내지 구현예 64 중 어느 하나에 따른 세포 배양 배지 내에 세포를 포함하거나, 또는 구현예 2 내지 구현예 62, 또는 구현예 65 중 어느 하나에 따른 NCT 배지 내에 세포를 포함하는, 체세포 또는 줄기 세포 배양물 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배양물.
구현예 67: 구현예 66 에 있어서, 상기 체세포 또는 줄기 세포가 체세포 (예, 섬유아세포) 또는 줄기 세포 (예, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 지방 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 탯줄 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 등) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포인 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
구현예 68: 구현예 66 에 있어서, 상기 세포가 줄기 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
구현예 69: 구현예 68 에 있어서, 상기 줄기 세포가 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 표피 줄기 세포, 위장관 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 및 췌장 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
구현예 70: 구현예 68 에 있어서, 상기 세포가 유도된 다능성 줄기 세포 (IPSC) (예, 예컨대 환자로부터 유래된 자가조직 hIPSC) 인 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
구현예 71: 구현예 70 에 있어서, 상기 IPSC 가 섬유아세포, 신경 줄기 세포, 위 (stomach) 세포, 간 세포, 케라틴세포, 멜라닌세포, 양막 세포, 혈액 세포, β-세포, 및 지방 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포로부터 재프로그래밍되는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
구현예 72: 구현예 70 또는 구현예 71 에 있어서, IPSC 가 KLF4 (K), LIN28 (L), c-MYC (M), NANOG (N); OCT4 (O), SOX2 (S), 및 발프로산 (VPA) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 개 이상의 인자가 재프로그래밍된 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
구현예 73: 구현예 72 에 있어서, ISPC 가 4 개의 정준 Yamanaka 인자 KLF4 (K), c-MYC (M),OCT4 (O), 및 SOX2 (S) 를 사용하여 재프로그래밍된 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
구현예 74: 구현예 73 에 있어서, 재프로그래밍 인자가 LIN28 을 추가로 포함하는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
구현예 75: 구현예 70 내지 구현예 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 IPSC 가 통합 벡터, 비-통합 벡터, 절제가능한 벡터, 및 무-DNA (DNA-free) 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 벡터를 사용하여 재프로그래밍된 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
구현예 76: 줄기 세포를 구현예 에 따른 세포 배양 배지 또는 구현예 1, 구현예 3 내지 구현예 48, 또는 구현예 55 내지 구현예 64 중 어느 하나에 따른 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포의 유전적 불안정성을 감소시키는 방법.
구현예 77: 대상으로부터 줄기 세포를 단리하거나 상기 대상으로부터 IPSC 를 발생시키고, 상기 줄기 세포 또는 IPSC 를 구현예 1, 구현예 3 내지 구현예 48, 또는 구현예 55 내지 구현예 64 중 어느 하나에 따른 세포 배양 배지에서, 또는 구현예 2 내지 구현예 62, 또는 구현예 65 중 어느 하나에 따른 NCT 배지에서 팽창 및/또는 배양하는 것을 포함하는, 자가조직 줄기 세포 전달을 수행하는 방법.
구현예 78: 대상에게, 구현예 2 내지 구현예 62, 또는 구현예 65 중 어느 하나에 따른 NCT 배지를 투여하는 것을 포함하는, 조직의 재생 및/또는 유지를 촉진시키는 방법.
구현예 79: 구현예 78 에 있어서, 상기 NCT 배지가 피하 투여, 비경구 투여, 국소 투여, 경구 투여, 비강 또는 흡입 투여, 국부 투여 예컨대 페인트, 에어로졸에 의해, 또는 경피로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경로를 통한 투여를 위해 제형화된 비히클을 포함하는 방법.
구현예 80: 구현예 78 에 있어서, 상기 NCT 배지가 국소 투여, 피하 (subdermal) 투여, 또는 피내 (intradermal) 투여를 위해 제형화된 비히클을 포함하는 방법.
구현예 81: 구현예 80 에 있어서, 상기 NCT 배지가 머드, 허브 혼합물, 지방, 에멀전, 로션, 크림, 젤, 생물학적 제제, 용액, 스프레이, 연고, 폼, 무스, 액체, 현탁액, 분산액, 에어로졸, 비누, 샴푸, 및 컨디셔너로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비히클에서 제형화되는 방법.
구현예 82: 구현예 80 에 있어서, 상기 NCT 배지가 크림 (예, 얼굴용 크림) 으로서 제형화되는 방법.
구현예 83: 구현예 80 에 있어서, 상기 NCT 배지가 주름 제거 크림, 피부 필러, 흉터-감소 크림, 및 여드름 치료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형을 포함하는 방법.
구현예 84: 구현예 78 내지 구현예 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 NCT 를 인간의 피부에 적용하는 방법.
구현예 85: 구현예 84 에 있어서, 상기 NCT 를 흉터를 감소시키기 위해 적용하는 방법.
구현예 86: 구현예 84 에 있어서, 상기 NCT 를 주름을 감소시키기 위해 적용하는 방법.
구현예 87: 구현예 78 내지 구현예 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 NCT 를 조직 부피를 증가시키기 위해 피내로 또는 피하로 적용하는 방법.
도 1: 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hIPSC) 의 특징분석. (a) 줄기 세포 마커 (삽입물은 DAPI 임) 의 형태학 및 면역세포화학적 검출; (b) 무-이식유전자 (transgene-free) hIPSC-유래 기형종에서 관찰된 3 가지 배엽의 H&E 염색 후 조직학적 특징분석, (c) CC-기반 스트레스 전 후의 무-이식유전자 iPSC 의 핵형 분석. 적색 화살표는 추가의 염색체 12 를 강조한다. 눈금은 100 미크론과 동일하다.
도 2: hIPSC 재프로그래밍 후 dNTP 집단의 상당한 감소. *dNTP 집단의 크기는 본래 피부 섬유아세포에서 관찰되는 수준에 대비해 표준화되었다.
도 3A 및 3B: YH2A.X 양성 병소의 시각화 (도 3A) 및 정량화 (도 3B). 녹색 염색은 yH2A.X 병소를 강조하고, 청색 염색은 DAPI 염색된 핵을 강조한다. HDF 를 hIPSC 로 재프로그래밍한 다음, 데옥시리보뉴클레오시드 (dN) 를 보충하고 및 보충하지 않고 4 일 동안 배양하였다.
도 4: "임상-등급 전환 (clinical-grade conversion)" (CC) 기반 스트레스 후, 이형접합성의, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)-기반 상실 (LOH) 분석.
도 5: 30 μM 의 dN 로의 보충은 hIPSC 증식 속도를 상당히 증가시킨다. 첫번째 실험은 세포를 0 μM, 30 μM, 100 μM, 200 μM dN 으로 5 일 기간에 걸쳐 처리하였다. 200 μM 은 독성인 것으로 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). 두번째 실험: 세포를 0 μM, 30 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM dN 을 5 일 기간에 걸쳐 처리하였다.
도 6 은 hIPSC 재프로그래밍 후 dNTP 집단의 상당한 감소 및 데옥시리보뉴클레오시드 (dN) 배양 배지 보충으로의 dNTP 구제 (rescue) 를 예증한다. dNTP 집단의 크기는 본래 피부 세포에서 관찰된 수준에 대비해 표준화되었다.
도 7 은 γH2A.X 양성 병소 (이중 가닥 파손의 지표) 의 시각화 및 정량화를 보여준다.
도 8 은 데옥시리보뉴클레오시드 칵테일 (DC) 의 사용이 피부 섬유아세포 및 인간 유도된 다능성 줄기 세포 모두를 더욱 빠르게 분열하도록 자극할 수 있다는 것을 보여준다. 보충되고 및 보충되지 않고 성장한 섬유아세포 및 줄기 세포의 세포 계수를 플레이팅-후 0 및 48 시간에 계수하였다. AD1 줄기 세포의 경우, 배양 보충물로 재프로그래밍되었던 하나의 서브클론 (subclone) 을 2 배 속도 실험을 수행하기 위해 일시적으로 보충물에서 빼냈다. 48 시간 플레이팅-후 집단 2 배 시간 (Population Doubling Time: PDT) 을 계산하기 위해 사용된 방정식은 48/(Log(T48)-Log(T0)) 였다. 24 시간 당 2 배 속도를 계산하기 위함: 24/PDT.
도 9 는 뉴클레오시드 칵테일 (NC) 이 hIPSC 에서 dNTP 집단을 상당히 구제할 수 있음을 보여준다.
도 10 은 뉴클레오시드 칵테일의 존재 하에 감소하는 γH2A.X 양성 병소 (이중 가닥 파손의 지표) 의 시각화 및 정량화를 보여준다. DNA 손상 (γH2AX 발현을 통한) 의 지표는 배양 보충물로 감소되었다. DNA 손상 수준을 이중-가닥 손상의 지표인 γH2AX 발현 (녹색) 을 통해 측정하였다. 백분율 손상된 핵을 측정하기 위해 블라인드 계수를 수행하였다. 보충은 2 개의 별도의 줄기 세포주에서 손상을 감소시킨다.
도 11 은 다능성 줄기 세포의 치료적 표적 세포 유형 (이 경우 간세포-유사 세포, 간세포 (헤파토사이트: hepatocyte) 로 불림) 으로의 분화를 보여준다.
도 12 는 알파-태아단백질 발현 간세포가 DC 보충이 사용된 경우, 그러나 DC 가 없이 2 주 내에 유도될 수 있는 것을 보여준다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 분해는 데옥시리보뉴클레오시드 (dN) 및/또는 뉴클레오시드 (리보뉴클레오시드) 보충이 배양물 중에 유도된 다능성 줄기 세포 (IPSC) 를 포함하는 줄기 세포에서 유전적 안정성을 증가시킬 수 있다는 발견에 관한 것이다.
본원에서 입증된 바와 같이, 빠르게 분열하는 hIPSC 내의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP) 집단이 세포 (예, 피부 섬유아세포, 이로부터 hIPSC 가 유래됨) 의 dNTP 집단보다 크기가 상당히 작다는 것이 측정되었다 (참조, 예, 도 2 및 6). 또한 hIPSC 가 본래의 섬유아세포보다 이중 가닥 파손 (DSB) 을 좀더 상당히 입증하였음이 측정되었다 (예를 들어, 도 3A 및 3B 참조).
본원에 제시된 데이터는: 1) hIPSC 가 데옥시리보뉴클레오시드 (dN) 의 혼합물의 형태로 hIPSC 배양물 또는 DCT 배지에 첨가된 외인성 NTP 전구체를 이용할 수 있고, 2) 데옥시리보뉴클레오시드 (dN) 및/또는 뉴클레오시드 또는 이의 전구체가 있는 배양 배지 보충이 hIPSC dNTP 집단 결핍을 개선하고 상기 세포에 의해 경험되는 게놈 불안정성을 상당히 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다 (참조, 예, 도 4).
또한 외인성 NTP 전구체가 인간 피부 세포 및 인간 유도된 다능성 줄기 세포 모두의 세포 증식의 증식을 상당히 촉진할 수 있는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지를 형성하기 위해 전달 비히클 (예, 약학적 전달 비히클, 화장적 전달 비히클, 화장품, 등) 내로 도입될 수 있다는 것이 발견되었다 (참조, 예, 도 8). 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 또는 뉴클레오시드 칵테일 전달 (NCD) 배지는 대상 (예, 인간, 비-인간 포유류, 등) 에게 생체 내에서 투여를 위해 제형화된 뉴클레오시드 또는 이의 전구체 또는 데옥시뉴클레오시드 또는 이의 전구체로 보충된 비히클을 포함하는 제형을 말한다. 데옥시뉴클레오시드 칵테일 전송 (DCT) 배지 또는 데옥시뉴클레오시드 칵테일 전달 (DCD) 배지는 대상 (예, 인간, 비-인간 포유류, 등) 에게 생체 내에서 투여를 위해 제형화된 데옥시뉴클레오시드 또는 이의 전구체로 보충된 비히클을 포함하는 제형을 말한다.
뉴클레오시드 칵테일이 또한 시험관 내에서 다른 세포의 세포 증식을 자극할 수 있을 뿐 아니라 생체 내에서 (예컨대 예를 들어, 피부 크림의 형태로의 NCT 의 직접적인 국소 적용 후) 세포 증식 및/또는 조직 회춘/재생을 자극할 수 있다고 여겨진다.
본원에 제시된 데이터는 뉴클레오시드 보충이 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 dNTP 집단을 상당히 구제할 수 있다고 나타나며 (참조, 예, 도 9), 뉴클레오시드 보충이 또한 다양한 범위의 다른 인간 및 비-인간 세포 유형에서 dNTP 집단 크기를 증대시킬 수 있다고 여겨진다.
본원에 제시된 데이터는 뉴클레오시드 보충이 예를 들어, 감마H2A.X 면역세포화학에 의해 측정되는 바와 같이, 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 유전적 손상의 사건을 상당히 감소시킬 수 있다고 나타나며 (참조, 예, 도 10), 뉴클레오시드 보충이 또한 다양한 범위의 다른 인간 및 비-인간 세포 유형에서 유전적 손상의 사건을 감소시킬 수 있다고 여겨진다.
본원에 제시된 데이터는 뉴클레오시드 보충이 hIPSC 의 간세포-유사 세포로의 분화를 상당히 증대시킬 수 있다고 나타나며(참조, 예, 도 11 및 12), 뉴클레오시드 DC 보충이 또한 다양한 범위의 다른 인간 및 비-인간 세포 유형으로의 분화를 증대시킬 수 있다고 여겨진다.
포유류 세포는 2 가지 경로를 통해 dNTP 를 합성한다: 글루코오스 및 아미노산을 사용하는 드 노보 (de novo) 경로 (DNP), 및 세포외 환경으로부터 미리형성된 dN 을 사용하는 뉴클레오시드 구조 경로 (NSP). 특정 이론에 구애됨 없이, 1) DNP 를 통한 dNTP 집단의 불충분한 생성은 빠르게 분열하는 hIPSC (또는 배양 중의 기타 줄기 세포) 에서 복제 스트레스, DNA 손상 및 게놈 불안정성의 중요한 요인이고, 2) 배양 배지에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 기질 또는 이의 전구체를 보충함으로써 NSP 의 hIPSC 세포 (또는 기타 줄기 세포) 에 의한 이용을 가능하게 하는 것이 dNTP 집단을 증가시킬 것이고, 배양 중의 줄기 세포 (iPSC 포함) 에서 복제 스트레스, DNA 손상 및 게놈 불안정성을 경감시킬 것이라고 여겨진다.
유사하게는, 뉴클레오시드 칵테일 전송 배지 (NCT), 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 데옥시뉴클레오시드 또는 이의 전구체를 포함하는 약학적 또는 화장적 제형의 투여가 생체 내에서 줄기 세포 및 체세포 (예, 섬유아세포) 중에서 복제 스트레스, DNA 손상 및 게놈 불안정성을 경감시킬 것이라고 여겨진다.
무-뉴클레오시드 조건 하에서 배양된 hIPSC 는 dNTP 결핍을 입증하였고 (도 2 및 6), 및 특히 "임상적 전환" (CC)-기반 스트레스 하에 놓인 경우 높은 수준의 게놈 불안정성이 밝혀졌다 (도 1). 그러나, 표준 hIPSC 배양 배지에 상이한 농도의 dN 이 보충되었던 경우, 30 μM 의 각각의 dN 이 4-5 일에 걸쳐 hIPSC 증식 속도 및 유전적 안정성을 증가시킬 수 있었다는 것으로 밝혀졌다 (참조, 실시예 1). 또한 적은 용량의 dN (예, 5 μM) 가 더 긴 시간에 걸쳐 hIPSC (또는 다른 줄기 세포) 의 유전적 안정성을 확보할 것인 반면, 또한 여전히 이중 가닥 손상의 감마H2A.X 염색을 통해 어세이되는 바와 같이 게놈 손상의 사건을 상당히 감소시킬 것임을 입증하였다.
본원에 제시된 데이터는 줄기 세포 생물학 및 재생 의약 분야의 일원에 의해 쉽게 실행될 수 있는 간단하고 비용-효율적인 배양 배지 보충 접근법이, 개인화된 hIPSC-기반 세포 치료법의 임상적 잠재력을 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다.
본원에 제시된 데이터는 화장적, 재생적 및 치료적 분야의 일원에 의해 쉽게 실행될 수 있는 간단하고 비용-효율적인 뉴클레오시드 보충 접근법이 인간 조직 (예컨대 피부) 의 재생을 직접적으로 자극시킨다는 것을 보여준다. 구체적으로는, 뉴클레오시드 칵테일의 직접적 국소 적용 (및/또는 기타 생체 내 전달 메카니즘) 이 피부 섬유아세포 (도 8), 중간엽 줄기 세포 및/또는 피부 내 기타 세포의 증식의 촉진을 통해 재생을 유도할 것이다.
뉴클레오시드 (예, dN) 보충된 세포는 개선된 유전적 안정성을 갖고, 현존 기술 (무-뉴클레오시드 (예, 무-dN (dN-free)) 배양 배지를 사용하여 유래된, 배양된 및 분화된 줄기 세포보다, 개인화된 줄기 세포-기반 (예, hIPSC-기반) 치료법 후 신생물 형성의 위험이 상당히 줄어드는 것으로 여겨진다.
따라서, 다양한 구현예에서, 배양 배지는 해당 배지에서 배양되는 줄기 세포 (예, 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 등) 의 단기간 또는 장기간 유전적 안정성을 향상시키도록 제공된다. 배양 배지는 배지에 하나 이상의 데옥시뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 이의 전구체가 보충된, 줄기 세포 (또는 다른 세포) 의 배양을 위해 이용되는 임의의 배양 배지를 본질적으로 포함한다.
유사하게는, 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지는 하나 이상의 데옥시뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 이의 전구체를 함유하는 약학적 또는 화장적 제형 (예, 본원에 기재된 바와 같은) 을 포함한다.
배양 배지.
다양한 구현예에서 배양 배지는 배지에 하나 이상의 데옥시뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 이의 전구체가 보충된, 줄기 세포의 배양을 위해 이용되는 임의의 배양 배지를 본질적으로 포함한다. 특정 구현예에서 배양 배지는 2 가지 상이한 데옥시뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 이의 전구체가 보충된다. 특정 구현예에서 배양 배지는 3 가지 상이한 데옥시뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 이의 전구체가 보충된다. 특정 구현예에서 배양 배지는 4 가지 상이한 데옥시뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 이의 전구체가 보충된다. 특정 구현예에서 배양 배지는 심지어 더 많은 상이한 데옥시뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 이의 전구체가 보충된다.
상기 지시된 바와 같이, 다양한 구현예에서, 기저 배양 배지는 IPSC 를 포함하는 줄기 세포를 팽창, 유지 또는 분화시킬 수 있는 임의의 배양 배지일 수 있다. 특정 구현예에서 기저 배지는 통상의 방법에 따라 수작업으로 제조될 수 있다. 특정 구현예에서 기저 배지는 시판 배지 또는 이의 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 기저 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; GIBCO), MEM (Minimal Essential Medium; GIBCO), BME (Basal Medium Eagle; GIBCO), RPMI 1640 (GIBCO), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12; GIBCO), DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO), α-MEM (α-Minimal essential Medium; GIBCO), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium; GIBCO), IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium; GIBCO), 및 KnockOut DMEM (GIBCO), 필수 8 (E8) 배지 등으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
다양한 구현예에서, 기저 배지는 KnockOut Serum Replacement (GIBCO), KnockOut SR XenoFree (GIBCO), KnockOut SR XenoFree Growth Factor 칵테일 (GIBCO), N2 보충물 (GIBCO), B27 보충물 (GIBCO) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 보충물을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서 기저 배지는 동물 공급원으로부터 유래되는 물질에 의한 임의의 안정성 문제를 피하기 위해, 이종-병원체 (xenopathogen) 가 없는 배지 (즉, 제노-프리 (xeno-free) 배지) 이다. 전형적으로 이러한 제노-프리 배지는 병원체(들), 예컨대 소 혈청 알부민, 및 동물 세포로부터 정제된 재조합 단백질을 포함하지 않는다.
상기 나타낸 바와 같이, 이러한 배지는 실험실에서 정규적으로 제조될 수 있거나, 또는 시판 공급될 수 있다. 비-제한적인 예시로서, DMEM/F12 의 조성이 표 1 에 제시된다.
표 1. DMEM/F12 기저 배지의 조성.
Figure pct00001
Figure pct00002

하기 기저 배양 배지는 예증적인 것이고 비-제한적인 것으로 의도된다. 당업자는 본원에 기재된 보충물이 사실상 임의의 배양 배지로 사용될 수 있거나 또는 임의의 수의 NCT 배지를 형성하기 위한 약학적 또는 화장적 내로 도입될 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다.
뉴클레오시드 칵테일 전송 (전달) 배지.
특정 구현예에서 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지는 하나 이상의 데옥시뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 이의 전구체를 함유하는 전달 비히클 (예, 화장적 제형) 을 포함한다. NCT 배지는 뉴클레오시드(들) 또는 뉴클레오시드 전구체(들) 을 포유류 내 또는 상의 원하는 위치에 전달하고 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 전구체(들) 의 적합한 국부적 농도를 제공하기 위해 제형화된다.
"전달 비히클" 은 본원에 기재된 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 전구체 중 하나 이상이 투여되는 예를 들어, 희석제, 보강제, 부형제, 보조제 또는 담체를 말한다.
NCT 는 예를 들어, 시험관 내에서 줄기 세포 또는 다른 세포의 세포 증식을 자극시킬 뿐 아니라 생체 내에서 세포 증식 및/또는 조직 회춘/재생을 자극시키고/거나 다양한 문맥에서의 도입된 외인성 세포 (예, 줄기 세포), 내인성 줄기 세포, 체세포, 등의 세포성 유지를 개선하기 위해, 피하, 비경구, 국소, 경구, 비강 (또는 다르게는 흡입됨) 을 위해 제형화될 수 있거나, 또는 국부 투여를 위해, 예컨대 에어로졸에 의해 또는 경피로 제형화될 수 있다. 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 용량/농도 형태로 투여될 수 있다. 적합한 단위 용량 형태에는, 분제, 정제, 알약, 캡슐, 마름모꼴정제, 좌약, 패치, 비강 스프레이, 주사제, 이식형 서방성 제형, 지질 복합체 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, NCT 는 국소 투여, 피하 (subdermal) 투여, 또는 피내 (intradermal) 를 위해 제형화된다. 특정 에서 예를 들어, 치유를 촉진하고 흉터를 감소시키기 위해, 예를 들어, 급성 상처 부위, 수술 부위 (sound), 화상 부위를 포함하는 상처 부위에 대한 투여를 위한 제형이 고려된다.
특정 구현예에서 NCT 는 하나 이상의 약학 작용제로 제형화된다. 예시적인 약학 작용제에는 상처 부위, 화상 부위, 여드름, 및 기타 국소 결함 (예, 다양한 종류의 피부 흉터) 의 치료에 사용되는 작용제가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 약학 작용제에는 예를 들어, 피부 흉터용 국소용 타목시펜, 여드름용 벤조일 퍼옥시드 및 항생제 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적인 NCT 비히클에는 화장용 머드, 허브 혼합물, 지방 (예, 동물 지방), 에멀전, 로션, 크림, 젤, 생물학적 제제, 젤, 용액, 스프레이, 연고, 폼, 무스, 액체, 현탁액, 분산액, 에어로졸, 비누, 샴푸, 컨디셔너, 클린저, 및 일반적인 화장품이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 주름, 및/또는 피부 변색의 감소를 위한 작용제, 및/또는 피부 필러를 포함하는 비히클이 고려된다.
뉴클레오시드(들) 및/또는 뉴클레오시드 전구체(들) 이 첨가될 수 있는 적합한 비히클에는 머드, 허브 혼합물, 동물 지방, 에멀전, 로션, 크림, 젤, 생물학적 제제, 젤, 용액, 스프레이, 연고, 폼, 무스, 액체, 현탁액, 분산액, 에어로졸, 비누, 샴푸, 컨디셔너, 클린저, 및 일반적인 화장품이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 적합한 비히클에는 국소 투여를 위한 크림, 로션, 스프레이, 폼, 젤, 에멀전, 로션 또는 페인트에 대한 기재로서 통상적으로 사용되는 임의의 담체 또는 비히클이 포함된다. 예에는 유화제, 탄화수소 기재를 포함하는 비활성 담체, 유화 기재, 무독성 용매 또는 수용성 기재가 포함된다. 특히 적합한 예에는 플루로닉, HPMC, CMC 및 기타 셀룰로오스-기재 성분, 라놀린, 경질 파라핀, 액체 파라핀, 연질 황색 파라핀 또는 연질 백색 파라핀, 백색 밀랍, 황색 밀랍, 세토스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 디메티콘, 유화 왁스, 이소프로필 미리스테이트, 미세결정 왁스, 올레일 알코올 및 스테아릴 알코올이 포함된다. 또한 고려되는 것은 비이온성 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 (또한 폴록사머로서 언급됨) 이다. 하나의 예시적인 폴록사머는 폴록사머 407 (또한 플루로닉 F-127 로서 공지됨) (BASF) 이다. 부가적인 담체에는, 알기네이트, 폴리비닐 알코올, 셀룰로오스 유도체 및/또는 폴리아크릴산을 함유하는 히드로겔을 포함하는 히드로겔; 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 및 이의 혼합물을 포함하는 셀룰로오스-기반 담체가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 구현예에서 비히클은 로션을 포함한다. 로션은 현탁화제 및 분산제의 사용을 통해 분산 매질에서 불용성인 미분된 물질을 함유할 수 있다. 대안적으로, 로션은 분산된 상으로서, 비히클과 비혼화성이고 유화제 또는 기타 적합한 안정화제에 의해 통상 분산된 액체 물질을 가질 수 있다. 하나의 구현예에서, 로션은 100 내지 1000 센티스토크 (centistoke) 의 점도를 갖는 에멀전의 형태이다. 로션의 유동성은 넓은 표면적에 걸쳐 빠르고 균일한 적용을 가능하게 한다. 로션은 전형적으로 피부 상에서 건조되어 피부의 표면 상에 이들의 의약적 성분의 얇은 코팅막을 남기는 것으로 의도된다.
특정 구현예에서, 비히클은 국소용 크림을 포함한다. 크림은 유화제 및/또는 기타 안정화제를 함유할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제형은 1000 센티스토크 초과의, 전형적으로 20,000-50,000 센티스토크 범위의 점도를 갖는 크림의 형태이다. 크림은 종종 연고보다는 바람직한데, 이들이 일반적으로 펴바르기에 용이하고 제거하기에 용이하기 때문이다. 크림과 로션 사이의 기본적인 차이는 점도이고, 이것은 제형을 제조하는데 사용되는 다양한 오일의 양/용도 및 물의 백분율에 따라 달라진다. 크림은 전형적으로 로션보다 뻑뻑하며, 다양한 용도를 가질 수 있고, 종종 피부에 원하는 효과에 따라 더욱 다양한 오일/버터를 사용한다. 크림 제형에서, 물-기재 백분율은 약 60-75 % 이고, 오일-기재는 총 함량의 약 20-30 % 이며, 이때 100 % 를 총 함량으로 했을때 나머지 백분율은 유화제, 보존제 및 첨가제이다.
다양한 구현예에서 비히클은 연고를 포함한다. 적합한 연고 기재의 예에는 탄화수소 기재 (예, 바셀린, 백색 바셀린, 황색 연고, 및 광유); 흡수 기재 (친수성 바셀린, 무수 라놀린, 라놀린, 및 콜드 크림); 수-제거성 기재 (예, 친수성 연고), 및 수용성 기재 (예, 폴리에틸렌 글리콜 연고) 가 포함된다. 페이스트는, 전형적으로 이들이 더 많은 백분율의 고체를 함유한다는 점에서 연고와 상이하다. 페이스트는 전형적으로 동일한 성분으로 제조된 연고에 비해 더욱 흡수성이고 덜 기름지다.
특정 구현예에서 비히클은 젤을 포함한다. 일부 에멀전은 젤일 수 있거나 또는 젤 성분을 포함할 수 있다. 일부 젤은 그러나, 이들이 불용성인 성분의 균질화된 블렌드를 함유하지 않기 때문에 에멀전은 아니다. 적합한 겔화제에는 개질 셀룰로오스, 예컨대 히드록시프로필 셀룰로오스 및 히드록시에틸 셀룰로오스; 카르보폴 (Carbopol) 단독중합체 및 공중합체; 및 이의 조합. 액체 비히클 내의 적합한 용매에는 디글리콜 모노에틸 에테르; 알킬렌 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 디메틸 이소소르비드; 알코올, 예컨대 이소프로필 알코올 및 에탄올이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 용매는 전형적으로 약물을 용해하는 그들의 능력에 대해 선택된다. 피부 감촉 및/또는 제형의 연화를 개선하기 위한 첨가제가 또한 도입될 수 있다. 이러한 첨가제의 예에는 이소프로필 미리스테이트, 에틸 아세테이트, C12-C15 알킬 벤조에이트, 광유, 스쿠알란, 시클로메티콘, 카프르/카프릴 트리글리세라이드, 및 이의 조합이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서 비히클은 폼 (foam) 을 포함한다. 폼은 기체 추진제와 조합된 에멀전으로 이루어진다. 기체 추진제는 일차적으로 히드로 플루오로알칸 (HFA) 으로 이루어진다. 적합한 추진제에는 HFA, 예컨대 1, 1,1,2-테트라플루오로에탄 (HFA 134a) 및 1, 1, 1,2,3,3, 3-헵타플루오로프로판 (HFA 227) 가 포함되지만, 현재 승인되거나 의료적 용도를 위해 승인되어질 수 있는 이들의 혼합물 및 혼련물 및 기타 HFA 도 적합하다. 추진제는 바람직하게는 분무 동안 인화성 또는 폭팔성 증기를 생성할 수 있는 탄화수소 추진제 기체는 아니다. 게다가, 조성물은 바람직하게는 사용 동안 인화성 또는 폭팔성 증기를 생성할 수 있는 휘발성 알코올은 함유하지 않는다.
다양한 구현예에서 비히클은 예를 들어, 보관 기간을 향상시키고, 생물학적 오염을 감소시키고, 습윤성을 개선하고, 최적 pH, 점도를 유지하고, 색상, 냄새, 텍스처 등을 유지하거나 개선하기 위해, 부가적인 성분을 함유할 수 있다는 것으로 인지될 것이다. 예시적인, 부가적인 성분에는 부형제, 희석제, 연화제, 계면활성제, 유화제, 완충제, 보존제, 침투 향상제, 향, 착색제 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 부형제는 제형의 유형에 따라 선택된다. 표준 부형제에는 젤라틴, 카세인, 레시틴, 아카시아 검, 콜레스테롤, 트라가칸스, 스테아르산, 벤즈알코늄 클로라이드, 칼슘 스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 세토스테아릴 알코올, 세토마크로골 유화 왁스, 소르비탄 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 콜로이드성 실리콘 디옥시드, 포스페이트, 소듐 도데실 술페이트, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시메틸셀룰로오스 소듐, 메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트, 비결정성 셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 트리에탄올아민, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 당, 및 전분이 포함된다.
"희석제" 는 담체를 용해, 분산 또는 다르게는 도입하기 위해 제형 내에 포함될 수 있다. 희석제의 예에는 물, 완충 수용액, 유기 친수성 희석제, 예컨대 1원자가 알코올, 및 저분자량 글리콜 및 폴리올 (예, 프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 부틸렌 글리콜) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
"연화제" 는 피부를 부드럽게 하거나 연화시키도록 외적으로 적용되는 작용제이고, 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 약전, 예컨대 "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 4th Ed., Pharmaceutical Press, 2003 에 나열되어 있다. 여기에는 제한 없이, 아몬드유, 피마자유, 세라토니아 추출물, 세토스테아로일 알코올, 세틸 알코올, 세틸 에스테르 왁스, 콜레스테롤, 면실유, 시클로메티콘, 에틸렌 글리콜 팔미토스테아레이트, 글리세린, 글리세린 모노스테아레이트, 글리세릴 모노올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 라놀린, 레시틴, 경질 광유, 중쇄 트리글리세라이드, 광유 및 라놀린 알코올, 바셀린, 바셀린 및 라놀린 알코올, 대두유, 전분, 스테아릴 알코올, 해바라기유, 자일리톨 및 이의 조합이 포함된다. 하나의 구현예에서, 연화제는 에틸헥실스테아레이트 및 에틸헥실 팔미테이트이다.
"계면활성제" 는 표면 인장력을 저하시키고 이에 의해 생성물의 유화, 발포, 분산, 퍼짐 및 습윤 특성을 증가시키는 표면-활성제이다. 적합한 비-이온성 계면활성제에는 유화 왁스, 글리세릴 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리소르베이트, 소르비탄 에스테르, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 시클로덱스트린, 글리세린 모노스테아레이트, 폴록사머, 포비돈 및 이의 조합이 포함된다. 하나의 구현예에서, 비-이온성 계면활성제는 스테아릴 알코올이다.
"유화제" 는 하나의 액체의 또다른 액체 중의 현탁을 촉진하고, 오일 및 물의, 안정한 혼합물, 또는 에멀전의 형성을 촉진하는 표면 활성 성분이다. 통상의 유화제는 금속성 비누, 특정 동물성 및 식물성 오일, 및 다양한 극성 화합물이다. 적합한 유화제에는 아카시아, 음이온성 유화 왁스, 칼슘 스테아레이트, 카르보머, 세토스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 콜레스테롤, 디에탄올아민, 에틸렌 글리콜 팔미토스테아레이트, 글리세린 모노스테아레이트, 글리세릴 모노올레에이트, 히드록스프로필 셀룰로오스, 히프로멜로오스, 라놀린, 함수 (hydrous), 라놀린 알코올, 레시틴, 중쇄 트리글리세라이드, 메틸셀룰로오스, 광유 및 라놀린 알코올, 1염기성 소듐 포스페이트, 모노에탄올아민, 비이온성 유화 왁스, 올레산, 폴록사머, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 자가-유화 글리세릴 모노스테아레이트, 소듐 시트레이트 탈수화물, 소듐 라우릴 술페이트, 소르비탄 에스테르, 스테아르산, 해바라기유, 트라가칸스, 트리에탄올아민, 잔탄 검 및 이의 조합이 포함된다. 하나의 구현예에서, 유화제는 글리세롤 스테아레이트이다.
"완충제" 는 조성물의 pH 를 통제하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 완충제는 조성물을 약 4 의 pH 내지 약 7.5 의 pH, 더욱 바람직하게는 약 4 의 pH 내지 약 7 의 pH, 가장 바람직하게는 pH 약 5 의 pH 내지 약 7 의 pH 로 완충시킨다. 바람직한 구현예에서, 완충제는 트리에탄올아민이다.
"보존제" 는 진균 및 미생물의 성장을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 항진균제 및 항생제에는 벤조산, 부틸파라벤, 에틸 파라벤, 메틸 파라벤, 프로필파라벤, 소듐 벤조에이트, 소듐 프로피오네이트, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 및 티메로살이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
"침투 향상제" 는 종종 피부를 가로지르는, 특히 각질층을 가로지르는 약물의 경피 전달을 촉진하기 위해 사용된다. 침투 향상제는 활성제를 각질층의 장벽을 가로지르게 하도록 첨가될 수 있다. 일부 침투 향상제는 피부 자극, 피부 독성 및 피부 알러지를 유발한다. 그러나, 좀더 통상적으로 사용되는 침투 향상제에는 우레아, (카르보닐디아미드), 이미드우레아, N, N-디에틸포름아미드, N-메틸-2-피롤리딘, 1-도데칼-아자시클로펩탄-2-온, 칼슘 티오글리케이트, 2-피롤리딘, N,N-디에틸-m-툴루아미드, 올레산 및 이의 에스테르 유도체, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 비닐 및 글리세릴모노올레에이트, 소르비탄 에스테르, 예컨대 소르비탄 모노라우레이트 및 소르비탄 모노올레에이트, 기타 지방산 에스테르, 예컨대 이소프로필 라우레이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 디이소프로필 아디페이트, 프로필렌 글리콜 모노라우레이트, 프로필렌 글리콜 모노올레에이트a 및 비-이온성 세제, 예컨대 BRIJ® 76 (스테아릴 폴리(10 옥시 에틸렌 에테르), BRIJ® 78 (스테아릴 폴리(20)옥시에틸렌 에테르), BRIJ® 96 (올레일 폴리(10)옥시 에틸렌 에테르), 및 BRIJ® 721 (스테아릴 폴리(21) 옥시에틸렌 에테르) (ICI Americas Inc. Corp.) 이 포함된다.
전달 비히클의 조성이 투여 양식, 적용 부위 등에 따라 달라질 것임이 인지될 것이다. 약학적 및 화장적 비히클의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다 (참조, 예, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990; Barel, Handbook of Cosmetic Science and Technology, 3rd Ed., CRC Press; and Rosen, Delivery System Handbook for Personal Care and Cosmetic Products: Technology, Applications and Formulations, Elsevier Science (2005)).
하기 제형 및 투여 방법은 예시적인 것으로 의도되고 제한적인 것은 아니다. 본원에 제공된 교시를 사용하여, 다른 적합한 제형 및 투여 방식이 쉽게 고안될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
뉴클레오시드 보충.
다양한 구현예에서, 배양 배지는 하나 이상의 데옥시뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 NCT 배지는 이를 포함한다. 예시적 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트에는 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP), 및 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. dNTP 의 예시적 전구체에는 하기가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다:
데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP) 의 경우: 데옥시아데노신 디포스페이트, 데옥시아데노신 모노포스페이트, 데옥시아데노신, 아데닌 등. 일부 구현예에서 전구체에는 데옥시아데노신 디포스페이트, 데옥시아데노신 모노포스페이트, 및 데옥시아데노신, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전구체가 포함된다.
데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP) 의 경우: 데옥시구아노신 디포스페이트, 데옥시구아노신 모노포스페이트, 데옥시구아노신, 구아닌 등. 일부 구현예에서 전구체에는 데옥시구아노신 디포스페이트, 데옥시구아노신 모노포스페이트, 및 데옥시구아노신, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전구체가 포함된다.
데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP) 의 경우: 데옥시시티딘 디포스페이트, 데옥시시티딘 모노포스페이트, 데옥시시티딘, 시토신 등. 일부 구현예에서 전구체에는 데옥시시티딘 디포스페이트, 데옥시시티딘 모노포스페이트, 및 데옥시시티딘, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전구체가 포함된다.
데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 의 경우: 데옥시티미딘 디포스페이트, 데옥시티미딘 모노포스페이트, 데옥시티미딘, 티민 등. 일부 구현예에서 전구체에는 데옥시티미딘 디포스페이트, 데옥시티미딘 모노포스페이트, 및 데옥시티미딘, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전구체가 포함된다.
데옥시우리딘 트리포스페이트 데옥시우리딘 디포스페이트, 데옥시우리딘 모노포스페이트, 데옥시우리딘, 우라실 등의 경우. 일부 구현예에서 전구체에는 데옥시우리딘 디포스페이트, 데옥시우리딘 모노포스페이트, 및 데옥시우리딘, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전구체가 포함된다.
다양한 구현예에서, 기저 배양 배지는 부가적으로 또는 대안적으로, 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 및/또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 NCT 는 이것을 포함한다. 예시적 뉴클레오시드 트리포스페이트에는 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 우리딘 트리포스페이트 (UTP) 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서 ATP 가 존재하는 경우, 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 및/또는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가 또한 보충물로서 존재한다. NTP 의 예시적 전구체에는 하기가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다:
아데노신 트리포스페이트 (ATP) 의 경우: 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, 아데노신, 아데닌, 등, 또는 이의 임의의 조합. 일부 구현예에서 전구체에는 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, 및 아데노신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전구체가 포함된다.
구아노신 트리포스페이트 (GTP) 의 경우: 구아노신 디포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 구아노신, 구아닌, 등, 또는 이의 임의의 조합. 일부 구현예에서 전구체에는 구아노신 디포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 및 구아노신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전구체가 포함된다.
시티딘 트리포스페이트 (CTP) 의 경우: 시티딘 디포스페이트, 시티딘 모노포스페이트, 시티딘, 시토신, 등, 또는 이의 임의의 조합. 일부 구현예에서 전구체에는 시티딘 디포스페이트, 시티딘 모노포스페이트, 및 시티딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전구체가 포함된다.
5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP) 의 경우: 5-메틸우리딘 디포스페이트, 5-메틸우리딘 모노포스페이트, 5-메틸우리딘, 티민, 등, 또는 이의 임의의 조합. 일부 구현예에서 전구체에는 5-메틸우리딘 디포스페이트, 5-메틸우리딘 모노포스페이트, 및 5-메틸우리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전구체가 포함된다.
우리딘 트리포스페이트 (UTP) 의 경우: 우리딘 디포스페이트, 우리딘 모노포스페이트, 우리딘, 우라실, 등, 또는 이의 임의의 조합. 일부 구현예에서 전구체에는 우리딘 디포스페이트, 우리딘 모노포스페이트, 및 우리딘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전구체가 포함된다.
특정 구현예에서 전구체는 염기를 단독으로 포함하지 않는다.
특정 구현예에서 배양 배지는 2 가지 상이한 데옥시뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 이의 전구체, 또는 3 가지 상이한 데옥시뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 이의 전구체, 또는 4 가지 (또는 그 이상) 상이한 데옥시뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 (트리포스페이트) 및/또는 전구체로 보충되거나, 또는 NCT 배지는 이들을 포함한다. 특정 구현예에서, 배양 배지는 적어도, 퓨린 및 피라미딘 (또는 이의 전구체) 으로 보충되거나, 또는 DCT 배지는 이들을 포함한다. 특정 구현예에서 배양 배지는 적어도, 2 개의 퓨린 (또는 이의 전구체) 으로 보충되거나, 또는 DCT 배지는 이들을 포함한다. 특정 구현예에서 배양 배지는 적어도, 2 개의 피라미딘 (또는 이의 전구체) 으로 보충되거나, 또는 NCT 배지는 이들을 포함한다. 특정 구현예에서 배양 배지는 적어도, 2 개의 퓨린 (또는 이의 전구체) 및 적어도 피라미딘 (또는 이의 전구체) 으로 보충되거나, 또는 NCT 배지는 이들을 포함한다. 특정 구현예에서 배양 배지는 적어도, 2 개의 피라미딘 (또는 이의 전구체) 및 퓨린 (또는 이의 전구체) 으로 보충되거나, 또는 NCT 배지는 이들을 포함한다. 특정 구현예에서 배양 배지는 적어도, 2 개의 퓨린 (또는 이의 전구체) 및 2 개의 피라미딘 (또는 이의 전구체) 으로 보충되거나, 또는 NCT 배지는 이들을 포함한다.
예로서, 일부 구현예에서 보충물 (예, 배양 배지에 도입되거나 NCT 배지에 포함됨) 은 하기 중 하나 이상을 포함하거나 이것으로 이루어진다:
1) dATP (또는 이의 전구체);
2) dGTP (또는 이의 전구체);
3) dCTP (또는 이의 전구체);
4) dTTP (또는 이의 전구체);
5) dUTP (또는 이의 전구체) ;
6) dATP (또는 이의 전구체) 및 dGTP (또는 이의 전구체);
7) dATP (또는 이의 전구체) 및 dCTP (또는 이의 전구체);
8) dATP (또는 이의 전구체) 및 dTTP (또는 이의 전구체);
9) dATP (또는 이의 전구체) 및 dUTP (또는 이의 전구체);
10) dGTP (또는 이의 전구체) 및 dCTP (또는 이의 전구체);
11) dGTP (또는 이의 전구체) 및 dTTP (또는 이의 전구체);
12) dGTP (또는 이의 전구체) 및 dUTP (또는 이의 전구체);
13) dCTP (또는 이의 전구체) 및 dTTP (또는 이의 전구체);
14) dCTP (또는 이의 전구체) 및 dUTP (또는 이의 전구체);
15) dTTP (또는 이의 전구체) 및 dUTP (또는 이의 전구체);
16) dATP (또는 이의 전구체), dGTP (또는 이의 전구체), 및 dCTP (또는 이의 전구체) ;
17) dATP (또는 이의 전구체), dGTP (또는 이의 전구체), 및 dTTP (또는 이의 전구체);
18) dATP (또는 이의 전구체), dCTP (또는 이의 전구체), 및 dTTP (또는 이의 전구체);
19) dGTP (또는 이의 전구체), dCTP (또는 이의 전구체), 및 dTTP (또는 이의 전구체);
20) dATP (또는 이의 전구체), dGTP (또는 이의 전구체), 및 dCTP (또는 이의 전구체) ;
21) dATP (또는 이의 전구체), dGTP (또는 이의 전구체), 및 dUTP (또는 이의 전구체);
22) dATP (또는 이의 전구체), dCTP (또는 이의 전구체), 및 dUTP (또는 이의 전구체);
23) dGTP (또는 이의 전구체), dCTP (또는 이의 전구체), 및 dUTP (또는 이의 전구체);
24) dATP (또는 이의 전구체), dGTP (또는 이의 전구체), dCTP (또는 이의 전구체), 및 dTTP (또는 이의 전구체);
25) dATP (또는 이의 전구체), dGTP (또는 이의 전구체), dCTP (또는 이의 전구체), 및 dUTP (또는 이의 전구체);
상기 보충물 중 임의의 것에서, 데옥시뉴클레오시드가 뉴클레오시드 또는 이의 전구체일 수 있다는 것으로 인지될 것이다. 상기 보충물은 예시적인 것이고 비-제한적인 것으로 의도된다.
전형적으로, dNTP 및/또는 NTP 는 배양물 또는 NCT 배지에, 동일한 배양 배지에서 배양되거나 또는 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가 보충되지 않은 NCT 배지에 노출된 동일한 세포와 비교하여, 줄기 세포의 단기간 및/또는 장기간 유전적 안정성을 개선하기에 및/또는 증식 속도를 개선하기에, 및/또는 생존력을 개선하기에 적합한 양으로 존재한다.
특정 구현예에서 NTP 및/또는 dNTP 또는 이의 전구체(들) 을 보충한 배양물 또는 DCT 배지는 각각 독립적으로, 약 1 μM 내지 약 50 μM 이하, 또는 약 1 μM 내지 약 40 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 35 μM 이하, 또는 약 1 μM 내지 약 30 μM 이하의 범위의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서 NTP 및/또는 dNTP 또는 이의 전구체(들) 을 보충한 배양물 또는 DCT 배지는 각각, 독립적으로, 약 50 μM 이하, 또는 약 40 μM 이하, 또는 약 35 μM 이하, 또는 약 30 μM 이하 또는 약 25 μM 이하, 또는 약 20 μM 이하, 또는 약 15 μM 이하, 또는 약 10 μM 이하, 또는 약 5 μM 이하 (적어도 0.1 μM 의 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체는, "이하" 라는 말이 모든 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체의 부재로서 해석되는 것을 의미하지는 않는 식으로 존재한다고 이해됨) 의 농도로 존재한다.
특정 구현예에서 NTP 및/또는 dNTP 또는 이의 전구체(들) 을 보충한 배양 배지 또는 이들을 포함하는 NCT 배지는 각각 독립적으로 약 5 μM 내지 약 30 μM 의 범위의 농도로 존재한다.
특정 구현예에서 NTP 및/또는 dNTP 또는 이의 전구체(들) 을 보충한 배양 배지 또는 이들을 포함하는 NCT 배지는 각각 독립적으로 약 1 μM, 또는 약 2 μM, 또는 약 3 μM, 또는 약 4 μM, 또는 약 5 μM, 또는 약 6 μM, 또는 약 7 μM, 또는 약 8 μM, 또는 약 9 μM, 또는 약 10 μM, 또는 약 11 μM, 또는 약 12 μM, 또는 약 13 μM, 또는 약 14 μM, 또는 약 15 μM, 또는 약 16 μM, 또는 약 17 μM, 또는 약 18 μM, 또는 약 19 μM, 또는 약 20 μM, 또는 약 21 μM, 또는 약 22 μM, 또는 약 23 μM, 또는 약 24 μM, 또는 약 25 μM, 또는 약 26 μM, 또는 약 27 μM, 또는 약 28 μM, 또는 약 29 μM, 또는 약 30 μM, 또는 약 31 μM, 또는 약 32 μM, 또는 약 33 μM, 또는 약 34 μM, 또는 약 35 μM, 또는 약 36 μM, 또는 약 37 μM, 또는 약 38 μM, 또는 약 39 μM, 또는 약 40 μM, 또는 약 41 μM, 또는 약 42 μM, 또는 약 43 μM, 또는 약 44 μM, 또는 약 45 μM, 또는 약 46 μM, 또는 약 47 μM, 또는 약 48 μM, 또는 약 49 μM, 또는 약 50 μM 의 농도로 존재한다.
특정 구현예에서 NTP 및/또는 dNTP 또는 이의 전구체(들) 을 보충한 배양 배지 또는 이들을 포함하는 NCT 배지는 각각 약 μ 1 μM, 또는 약 2 μM, 또는 약 3 μM, 또는 약 4 μM, 또는 약 5 μM 내지 약 50 μM 이하, 또는 약 40 μM 이하, 또는 약 30 μM 이하, 또는 약 25 μM 이하, 또는 약 20 μM 이하, 또는 약 15 μM 이하의 범위의 농도로 존재한다.
특정 구현예에서 총 NTP 및/또는 dNTP 또는 이의 전구체(들) 을 보충한 배양 배지 또는 이들을 포함하는 NCT 배지는 약 1 μM, 또는 약 2 μM, 또는 약 3 μM, 또는 약 4 μM, 또는 약 5 μM, 또는 약 6 μM, 또는 약 7 μM, 또는 약 8 μM, 또는 약 9 μM, 또는 약 10 μM, 또는 약 11 μM, 또는 약 12 μM, 또는 약 13 μM, 또는 약 14 μM, 또는 약 15 μM, 또는 약 16 μM, 또는 약 17 μM, 또는 약 18 μM, 또는 약 19 μM, 또는 약 20 μM 또는 약 200 μM 이하, 또는 약 180 μM 이하, 또는 약 150 μM 이하, 또는 약 145 μM 이하, 또는 약 140 μM 이하, 또는 약 135 μM 이하, 또는 약 130 μM 이하, 또는 약 125 μM 이하, 또는 약 120 μM 이하, 또는 약 115 μM 이하, 또는 약 110 μM 이하, 또는 약 105 μM 이하, 또는 약 100 μM 이하의 범위의 농도로 존재한다.
특정 구현예에서, 줄기 세포 배양물이 또한 본원에 제공되는데, 줄기 세포 배양물은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 dNTP 및/또는 NTP 가 보충된 배양 배지 내의 줄기 세포를 포함한다. 특정 구현예에서 줄기 세포는 생체 내에 있을 수 있고 본원에 기재된 바와 같이 NCT 에 노출될 수 있다. 다양한 구현예에서, 줄기 세포는 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 표피 줄기 세포, 위장관 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 췌장 줄기 세포 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 배아 줄기 세포 또는 성체 줄기 세포일 수 있다. 특정 구현예에서 줄기 세포에는 유도된 다능성 줄기 세포, 특히 인간 IPSC 가 포함되다. 줄기 세포 (IPSC 포함) 는 비-인간 동물 줄기 세포 또는 인간 줄기 세포일 수 있다.
특정 구현예에서 줄기 세포는 유도된 다능성 줄기 세포, 특히 인간 IPSC 이다. 예시적 줄기 세포에는 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 표피 줄기 세포, 위장관 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 및 췌장 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 줄기 세포가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 줄기 세포가 IPSC 인 경우 IPSC 는 섬유아세포, 신경 줄기 세포, 위 세포, 간 세포, 케라틴세포, 멜라닌세포, 양막 세포, 혈액 세포, β-세포, 및 지방 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포로부터 재프로그래밍된다. 특정 구현예에서 IPSC 는 KLF4 (K), LIN28 (L), c-MYC (M), NANOG (N); OCT4 (O), SOX2 (S), 및 발프로산 (VPA) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 개 이상의 인자로 재프로그래밍된 세포를 포함한다. 특정 구현예에서 ISPC 는 4 개의 정준 Yamanaka 인자 KLF4 (K), c-MYC (M),OCT4 (O), 및 SOX2 (S) 를 사용하여 재프로그래밍된 세포를 포함한다.
IPSC 를 생성하기 위한 세포의 재프로그래밍 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 구현예에서 재프로그래밍은 예를 들어 통합 벡터 (예, 렌트 바이러스 벡터, 유도성 렌티바이러스 벡터, 등), 절제가능한 벡터 (예, 트랜스포손 벡터, loxP-측면 렌티바이러스 벡터, 등), 비-통합 벡터 (예, 아데노바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 등), 무-DNA (DNA free) 벡터 (예, Sendai 바이러스, 단백질 벡터, 개질 mRNA 벡터, microRNA 벡터, 등) 를 사용하여 달성될 수 있다. 다수의 재프로그래밍 키트가 시판된다고 명시된다 (예, (Epi5™ Episomal iPSC Reprogramming Kit 및 CytoTune®-iPS Sendai Reprogramming Kit (Life Technologies) 등).
다양한 구현예에서, 유도된 줄기 세포 (다능성 줄기 세포 포함) 의 유전적 불안정성 감소 방법은, 본원에 기재된 NTP 및/또는 dNTP 및/또는 이의 전구체(들) 이 보충된 세포 배양 배지에서 세포를 배양하거나 또는 본원에 기재된 하나 이상의 NTP 및/또는 dNTP 및/또는 이의 전구체(들) 을 포함하는 NCT 배지로, 예를 들어 생체 내에서 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 방법으로 제공된다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 NTP 및/또는 dNTP 및/또는 이의 전구체(들) 이 보충된 세포 배양 배지에 존재하는, 또는 이를 포함하는 NCT 배지와 접촉되는 줄기 세포 (예, 유도된 다능성 줄기 세포) 가 제공된다.
또한 제공되는 것은 자가조직 줄기 세포를 수송하는 것을 제공하는 방법이다. 방법은 전형적으로 대상으로부터 단리된 줄기 세포 또는 대상으로부터 발생된 IPSC 를 제공하고, 상기 줄기 세포 또는 IPSC 를 본원에 기재된 NTP 및/또는 dNTP 및/또는 이의 전구체(들) 이 보충된 세포 배양 배지 또는 NCT 배지에서 팽창 및/또는 배양하는 것을 수반한다.
본원에 기재된 구현예 각각에서, 주제 물질 (즉, 세포 배양물, DCT 배지, 세포, 방법 등) 에는 방사능표지되었던 임의의 NTP 및/또는 dNTP 및/또는 이의 전구체(들) 가 없을 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이러한 구현예에서 사용되는 NTP 및/또는 dNTP 및/또는 이의 전구체(들) 은 임의의 방사능표지 (예컨대, 예를 들어, 3H, 51Cr, 또는 32P, 등) 가 연결되지 않거나 또는 도입되지 않는다. 따라서, 구현예에는 예를 들어, 3H-dTTP 또는 3H-TTP 또는 이의 임의의 전구체가 없을 수 있다.
본원에 기재된 구현예는 예시적이고 비-제한적인 것으로 의도된다. 본원에 제공된 교시를 사용하여, 본원에 기재된 조성물 및 방법의 수 많은 변형이 당업자에게 이용가능할 것이다.
실시예
하기 실시예는 예시를 위해 제공되나, 청구된 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
유전적 안정성을 촉진하고, 세포 기능을 향상시키고, 재생을 향상시키기 위한, hIPSC 배양물 내 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지 내의 뉴클레오시드 보충
의의
인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hIPSC) 는 상당한 치료적 잠재력을 갖는다 (Byrne (2008) Human Molecular Genetics 17: R37-41). 그러나, 본 발명의 발견 (도 1, 예비 데이터), 및 다른 이들의 발견 (Martins-Taylor and Xu (2012) Stem Cells 30: 22-27; Lund et al. (2012) Nat. Rev. Genet., 13: 732-744) 은, 현행의 접근법을 사용하여 유래된 본질적으로 모든 iPSC 클론은 재프로그래밍 및 시험관 내 배양-유도 스트레스 동안 게놈 불안정성을 습득한다는 것을 나타낸다. hIPSC 게놈 불안정성의 논란은, 게놈 불안정성과 악성 변형의 위험 증가 사이에 성립된 연결고리를 제공하여, 개인화된 iPSC-기반 재생적 치료법을 임상으로 진행하기에 가장 중요한 장애물 중 하나이다 (Martins-Taylor and Xu (2012) Stem Cells 30: 22-27; Lund et al. (2012) Nat. Rev. Genet., 13: 732-744; Byrne (2013) Gene Therapy and Regulation 7: 1230002).
hiPSC 재프로그래밍 및 배양 동안 게놈 불안정성의 원인, 및 이러한 고도로 유해한 현상의 발생을 감소시키고 결국에는 소멸시키기 위한 접근법은 아직 개발되지 않았다. 진행중인 실험에서, 빠르게 분열하는 hIPSC 내의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP) 집단이 피부 섬유아세포 (이로부터 hIPSC 가 유래됨) 의 dNTP 집단보다 크기가 상당히 작다는 것을 발견하였다 (도 2). 또한 hIPSC 가 기원의 섬유아세포보다 상당히 많은 이중 가닥 손상 (DSB) 을 나타낸다는 것을 발견하였다 (도 3A 및 3B). hIPSC 에서의 감소된 dNTP 집단 및 증가된 DNA 손상의 본 발명의 관찰은 hIPSC 의 게놈 불안정성의 병인학으로의 새로운 기계론적 통찰력을 제공할 수 있고, 상기 현상을 방지하기 위한 방법을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 데이터는: 1) hIPSC 가 데옥시리보뉴클레오시드 (dN) 의 혼합물의 형태로 hIPSC 배양 배지에 첨가되는 외인성 dNTP 전구체를 이용할 수 있고, 2) dN 으로의 배양 배지 보충이 hIPSC dNTP 집단 결핍을 경감시키고 상기 세포에 의해 경험되는 게놈 불안정성을 상당히 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다 (도 4).
가설 및 근거.
포유류 세포는 2 가지 경로를 통해 dNTP 를 합성한다: 글루코오스 및 아미노산을 사용하는 드 노보 (de novo) 경로 (DNP), 및 세포외 환경으로부터 미리형성된 dN 을 사용하는 뉴클레오시드 구조 경로 (NSP). 특정 이론에 구애됨 없이, 1) DNP 를 통한 dNTP 집단의 불충분한 생성은 빠르게 분열하는 hIPSC 에서 복제 스트레스, DNA 손상 및 게놈 불안정성의 중요한 요인이고, 2) 배양 배지에 NSP 의 dN 기질의 규정된 혼합물을 보충함으로써 NSP 의 hIPSC 세포에 의한 이용을 가능하게 하는 것이 dNTP 집단을 증가시킬 것이고, 복제 스트레스, DNA 손상 및 게놈 불안정성을 경감시킬 것이라고 여겨진다.
특정 이론에 구애됨 없이, 1) 드 노보 (de novo) 경로 (DNP) 를 통한 글루코오스 및 아미노산으로부터의 dNTP 집단의 불충분한 생성은 hIPSC 에서 복제 스트레스, DNA 손상 및 게놈 불안정성의 중요한 요인이고, 2) hIPSC 가 또한 DNP 에 더해 두번째 dNTP 생합성 경로인 뉴클레오시드 구제 경로 (NSP) 를 사용하도록 하는 것이 복제 스트레스, DNA 손상, 및 게놈 불안정성을 경감시킬 것이라고 가정하였다. 예시적 구현예에서, NSP 의 사용을 가능하게 하는 것은 hIPSC 배양 배지에 NSP 의 데옥시리보뉴클레오시드 (dN) 기질의 혼합물을 보충함으로써 달성되었다.
요약하면, 게놈 불안정성 문제에 대해 단순하고, 효과적이고, 일반적으로 이용가능하며, 비용-효율적인 해법은 현행의 방법론을 사용하여 생성된 hIPSC 에 대해 유용하도록 제공된다. 구체적으로는, 줄기 세포 및 hIPSC 내의 게놈 불안정성의 발생은 상기 세포가 NSP 를 통해 dNTP 를 합성하게 함으로써 방지될 수 있다는 것이 제시된다. 이것은 배양 배지에 NSP 의 dN 기질의 최적화된 혼합물을 보충함으로써 달성될 수 있다.
인간 유도된 다능성 줄기 세포의 유도 및 특징분석
LoxP-측면 폴리시스트론성 재프로그래밍 벡터 (이것은 이후 Cre recombinase 를 사용하여 게놈으로부터 제거되었음 (Sommer et al. (2010) Stem Cells 28: 64-74)) 를 사용하여, 또는 합성 mRNA 기반 접근법 (Warren et al. (2010) Cell Stem Cell, 7: 618-630) 을 사용함으로써, 성체 인간 피부 섬유아세포 (HDF) 를 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hIPSC) 로 재프로그래밍하였다. 모든 재프로그래밍 및 후속 배양은, 현행의 표준 실시에 따라, 임의의 뉴클레오시드가 보충되지 않은 표준 hIPSC 배양 배지에서 수행하였다 (www.stemgent.com/products/show/69. NUTRISTEM™ XF/FF Culture Medium). 두 무-이식유전자 hIPSC 계통은, 이전에 기재된 바와 같이 (Byrne et al. (2009) PloS One 4: e7118), 표준 특징분석 파라미터를 나타냈다. 이들 파라미터에는 배아 줄기 세포 (ESC)-유사 형태학, 핵심 전분화능 마커 (NANOG, OCT4, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60 및 Tra-1-81) 의 상당한 발현 (이것은 기원 피부 섬유아세포에서는 검출되지 않았음) (도 1, 패널 A), 및 중증 복합형 면역결핍 (Severe Combined Immunodeficiency: SCID) 마우스에서 기형종 형성에 이은 모든 3 가지 배엽의 대표물로의 분화 (도 1, 패널 B) 가 포함되었다. 이후 연구-등급 조건 (동물-유래 에피토프 함유: Matrigel 기질 및 Knockout Serum Replacement, KSR, 배양 배지 함유) 으로부터의 본 발명의 무-이식유전자 hIPSC 계통을, 추정적 임상-등급 동물 무-에피토프 (epitope-free) "제노-프리 (xeno-free)" 규정된 조건 (CellStart 기질 및 최적화된 제노-프리 배지, 50% mTeSRI, Stemcell Technologies, 및 50% NutriStem, Stemgent) 로, 이전에 기재된 바와 같이 (Karumbayaram et al. (2012) Stem Cells Trans. Med. 1: 36-43), 전환시켰다. 두 hIPSC 계통은 "임상-등급 전환" (CC) 전 후 모두에서 이전에 기재된 바와 같이 (Byrne et al. (2009) PloS One 4: e7118), 핵형화되었다.
CC-유도된 스트레스 및 발현 후 두 계통은 핵형적으로 정상 (46XY) 인 것에서 추가의 염색체 12 를 소유하는 것으로 진행하였다 (도 1, 패널 C). 관찰된 게놈 불안정성은, 특히 외인성 스트레스 조건 하에 놓인 경우, hIPSC 가 유전적으로 불안정하고 (Nagaria et al. (2013) Biochimica et Biophysica Acta, 1830: 2345-2353), 염색체 12 를 우선적으로 복제한다는 것을 보여주는 (Draper et al. (2004) Nat. Biotechnol. 22: 53-54) 여러 공개된 연구와 밀접하게 관련이 있다. hIPSC 중의 모든 염색체가 염색체 전위 및 복제의 동일한 초기 발생을 갖지만, 염색체 12 의 복제는, 이것이 일어나는 경우, 선택 과정을 통해 시험관 내 배양물에서 팽창된 후 hIPSC 집단 전반적으로 우선적인 팽창을 산출한다는 것이 이전에 제안되었다 (Id.). CC-기반 스트레스가 장기간 배양 (>6-12 개월) 유도된 스트레스에 대한 유용한 모델인 것으로 고려하고, 이것이 또한 2 개월 기간에 걸친 CC-기반 스트레스 후에 관찰한 바와 같이, 핵형 비정상, 특히 염색체 12 를 축적하는 hIPSC 및 hESC 를 산출하는 경향이 있다는 것을 주지해야만 한다.
기원의 hIPSC 대 HDF 중의 더 작은 dNTP 집단
이전에 기재된 바와 같이 (Austin et al. (2012) J. Exp. Med., 209: 2215-2228), 기원 HDF 및 초기 계대 (비-CC-스트레스받음) hIPSC 에서의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP) 집단을 정량하였다. hIPSC 재프로그래밍 후 모든 4 개의 dNTP 수준에서 상당한 감소 (32 내지 52%) 를 관찰하였다 (도 2).
dNTP 생합성에 관련된 유전자는 빠르게 분열하는 hIPSC 및 보다 느린 속도의 세포 분열이 있는 HDF 에서 유사한 수준으로 발현된다
HDF 및 유도된 초기 계대 hIPSC 에 대한 Affymetrix 포괄적 전사 분석 (이전에 기재된 바와 같이 수행됨 (Awe et al. (2013) Stem Cell Res. & Theap., 4: 15)) 은 핵심 다능성-특이적 마커의 상당한 상향조절을 보여주었다; 핵심 섬유아세포-특이적 마커의 발현은 hIPSC 재프로그래밍 후에 감소하였다 (표 2). 또한 게놈 불안정성의 유도와 이전에 연관된 유전자 (CCNE1, E2F2, E2F35) 의 상향조절도 관찰되었다. 그러나, 핵심 dNTP 생합성 유전자의 발현에서의 임의의 상당한 차이는 관찰되지 않았다 (표 2). hIPSC 가 HDF 보다 빠른 평균 집단 2 배 시간 (Population Doubling Time: PDT) (18 시간 대 48 시간) 을 갖기 때문에, 이들 데이터는 hIPSC 내의 작은 dNTP 집단이 1) DNA 복제를 위한 dNTP 의 사용을 증가시키는 세포 증식의 빠른 속도, 및 2) dNTP 생합성에 관여하는 유전자의 발현을 상향조절하는 불능으로부터 기인할 것이라는 본 가설을 지지한다.
표 2. hIPSC 재프로그래밍 후 유전자 발현에서의 변화.
Figure pct00003

hIPSC 대 HDF 에서 상승된 DNA 손상 수준: dN 보충은 hIPSC 에서 DNA 손상을 감소시킨다
HDF 및 초기 계대 hIPSC 중의 이중 가닥 파손 (DSB) 의 수를 추정하기 위해, 이전에 기재된 바와 같이 (Bester et al. (2011) Cell, 145: 435-446), 감마-히스톤 2A.X (yH2A.X) 염색을 이용하였다. 상당히 더 많은 yH2A.X 양성 병소가 기원의 HDF 에서보다 hIPSC 에서 검출되었다. 또한 4 일의 dN 보충 후 yH2A.X 양성 병소가 상당히 덜 관찰되었다 (도 3A, 중간 및 하부 패널을 비교함). 본 발견은 hIPSC 가 피부 섬유아세포보다 높은 수준의 게놈 불안정성을 나타내고, 게놈 불안정성은 세포 배양 배지의 dN 보충으로 방지될 수 있을 것이라는 가설에 대한 부가적인 지지를 제공한다. 또한 hIPSC 집단 내에서 yH2A.X 양성 병소의 수에 있어 상당한 이종성이 관찰되어, 게놈 불안정성의 발생이 hIPSC 집단에 걸쳐 불균일하고, hIPSC 의 하위집단이 yH2A.X 염색에 의해 어세이되는 바와 같이, 부가적인 게놈 DNA 손상을 일으킬 것 같고, 핵형 비정상을 발달시키기에 가장 쉬운 세포를 나타내는 본 가설을 지지한다.
dN 보충은 CC-기반 스트레스 후 hIPSC 게놈 안정성을 촉진한다
dN 보충이 CC-기반 스트레스 동안 관찰되는 게놈 불안정성을 방지할 수 있을 것인지를 조사하기 위해, dN 이 있는 및 없는 조건 하에서 hIPSC 를 배양하였다. hIPSC 는 재프로그래밍 및 팽창된 배양 동안 게놈 손상을 축적하는 것으로 입증된 반면 (Ben-David et al. (2010) Cell Cycle (Georgetown, Tex.) 9: 4603-4604), CC 를 수행함으로써 세포에 스트레스를 주었을 때, 2 개의 독립적 hIPSC 계통에서 가장 극도의 게놈 손상 (핵형 비정상) 이 관찰되었다는 것을 유념해야만 한다. 본 관찰은 비교적 단시간 (2 개월) 에 걸쳐 심각한 게놈 손상을 유도하기 위한 빠르고 일관적인 실험 어세이를 제공한다. 인간 iPSC 를 먼저 mTeSRI (Stemcell Technologies) 및 NutriStem (Stemgent) 와 함께, Matrigel 상에서 배양하였다. 이들을 이후 세포 배양 배지 중에 외인성으로 공급된 dN 의 존재 또는 부재 하에 (30 μM 의 각각의 dN) 성장된 2 개의 그룹으로 나누었다. 1 주의 보충 후, 제노-프리 조건으로의 전환 과정을 시작하였는데, 이것은 기저 멤브레인으로서 CellStart 및 오직 NutriStem 배지로의 전환을 수반하였다. 2 주의 배양 후, 게놈 DNA (gDNA) 를 이형접합성의, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)-기반 상실 (LOH) 분석을 위해 추출하였는데, 이것은 DSB-기반 게놈 불안정성의 정확한 측정인 것으로 이전에 제시되었다 (Bester et al. (2011) Cell, 145: 435-446). 2 가지 조건 사이의 LOH 의 수준을 측정하기 위해 (+/- dN), 이전에 기재된 바와 같이 Affymetrix's SNP 6.0 어레이를 사용하여 분석을 수행하였다 (Id.). dN 을 보충하는 것은 게놈 불안정성의 발생을, LOH 에 의해 어세이된 바와 같이, 비보충된 배지에서 관찰되는 것의 20% 감소시켰다 (도 4). 4 일의 dN 보충 후 yH2A.X 양성 병소에서의 상당한 감소와 함께 (도 3A 및 3B), LOH 에서의 감소는 dN 보충이 hIPSC 재프로그래밍 및 배양에서의 복제 스트레스 및 연관된 게놈 불안정성을 감소시킨다는 본 가설을 지지하는 증거를 제공한다.
이전의 연구가 게놈 불안정성을 어세이하기 위한 정량화가능한 방법으로서 SNP-기반 LOH 측정 값을 강조하는, 인간 암 세포에서의 LOH 로의 DSB 의 발생과 연관이 있다 (Id.) 는 것을 명시하는 것이 중요하다. 본 발명의 dN 보충된 및 보충되지 않은 CC-스트레스받은 hIPSC 의 연구에서, CC-유도된 스트레스 후, LOH 에서의 감소에 의해 어세이되는 바와 같이, 게놈 안정성에서의 5 배 증가가 관찰되었다. 이것은 12 개의 LOH 염색체 병소가 CC-기반 스트레스 후 확인되었던, 도 4 에서 관찰될 수 있다. 게놈 손상의 지표인, 5 배 많은 LOH 병소가, dN-처리된 hIPSC 에서 관찰되었던 것보다 (적색 화살표에 의해 확인됨), 미처리된 hIPSC (녹색 화살표에 의해 확인됨) 에서 관찰되었다. 이것은 dN 보충이 hIPSC 에서 CC-유도된 게놈 불안정성을 개선시킬 수 있는 본 가설을 지지하는 강력한 증거를 제공한다. 그러나, LOH 병소의 절반이 (청색 화살표에 의해 나타낸 바와 같은) dN 처리된 및 미처리된 샘플 모두에서 여전히 불안정하였다는 것을 명시하는 것이 중요하다.
효능은 입증되었지만, dN 보충 절차가 추가로 최적화될 수 있다고 여겨진다. 따라서 지금까지 발생된 데이터는 dNTP 집단 결핍이 게놈 불안정성에 중요한 역할을 하고, 본 발명 및 다른 연구에서 일반적인 배양 및 유도된 스트레스 후 hIPSC 에서 관찰되었던 가설을 지지한다.
게다가, 본 예비 데이터는 또한 임상 등급 hIPSC 및 이들의 유도체의 게놈 안정성을 향상하기 위한 간단하고 일반적으로 이용가능한 배양 배지 데옥시리보뉴클레오시드 보충 절차를 제시한다.
요약하면, 유전적으로 안정한 줄기 세포 및 hIPSC 및 유도체를 유지할 수 있는 그러한 최적화된 배지 시스템을 성립하는 것은 환자에 대해 개인화된 다능성 줄기 세포-기반 치료법에 대한 장래를 안전하게 풀어내는 도구가 될 것이라고 제안한다.
실시예 2
안정한 줄기 dN 농도의 수득
복합적 세포 유형에 걸쳐 게놈 안정성을 향상시키고, 세포 기능을 증가시키고 분화 잠재력을 향상시키는 데 있어 강력한 것으로 입증된, 복합적 상이한 STABLESTEM™ 농도, 단기간 배양의 경우 하나 (30μM 의 각각의 dN), 장기간 배양의 경우 하나 (5μM 의 각각의 dN) 뿐 아니라 적합한 30:30:5:5 칵테일을 수득하였다 (참고, 예, 표 3).
표 3. dN 농도.
Figure pct00004

장기간 STABLESTEM™ 배양 배지 보충은 인간 iPS 세포가 적어도 3 주 동안 증식하게 하는 반면, γH2A.X-양성 이중 가닥 파손에 의해 측정된 바와 같이, 이에 노출된 세포의 게놈 손상 양이 현저하게 감소시켰다 (도 7). hiPSC 재프로그래밍 및 배양 동안 게놈 불안정성의 원인은 불명확하다. 그러나, 최근에, 빠르게 분열하는 hIPSC 내의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP) 집단은 hIPSC 가 유래된 피부 세포의 dNTP 집단보다 크기가 상당히 작다는 것을 발견하였다. 게다가, 데옥시리보뉴클레오시드 (dN) 로 줄기 세포 배양 배지를 보충하면 dNTP 집단을 상당히 구제할 수 있다는 것을 발견하였다 (도 6).
본원에 기재된 실시예 및 구현예는 오로지 예시 목적을 위한 것이고, 이의 견지에서 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고, 본 출원의 취지 및 권한 및 첨부된 청구항의 범주 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에 언급된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 인용된다.

Claims (87)

  1. 배양 배지에 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 하나 이상의 전구체가 보충된, 줄기 세포를 위한 기저 배양 배지
    를 포함하는, 개선된 유전적 안정성을 가진 줄기 세포의 배양을 위한 세포 배양 배지.
  2. 화장적 또는 약학적 전달 비히클; 및
    하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체
    를 포함하는, 체세포 또는 줄기 세포 유전적 안정성을 개선하기 위한 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT: Nucleoside Cocktail Transmission) 배지.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트가 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (NCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 데옥시우리딘 트리포스페이트, 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP) 로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 배지.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트가 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (NCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 배지.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 하나 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트가 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP) 로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 배지.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (NCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 데옥시우리딘 트리포스페이트, 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP) 로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오시드 트리포스페이트의 하나 이상의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 배지.
  7. 제 6 항에 있어서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 상기 하나 이상의 전구체가 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (NCTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 세포 배양 또는 NCT 배지.
  8. 제 6 항에 있어서, 뉴클레오시드 트리포스페이트의 상기 하나 이상의 전구체가 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 및 우리딘 트리포스페이트 (UTP) 로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 세포 배양 또는 NCT 배지.
  9. 제 1 항, 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시아데노신 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시아데노신 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  12. 제 11 항에 있어서, 데옥시아데노신 트리포스페이트의 상기 전구체가 데옥시아데노신 디포스페이트, 데옥시아데노신 모노포스페이트, 데옥시아데노신, 및 아데닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 데옥시구아노신 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 데옥시구아노신 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  16. 제 15 항에 있어서, 데옥시구아노신 트리포스페이트의 상기 전구체가 데옥시구아노신 디포스페이트, 데옥시구아노신 모노포스페이트, 데옥시구아노신, 및 구아닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 또는 NCT 배지.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시시티딘 트리포스페이트 (NCTP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 데옥시시티딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 데옥시시티딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  20. 제 19 항에 있어서, 데옥시시티딘의 전구체가 데옥시시티딘 디포스페이트, 데옥시시티딘 모노포스페이트, 데옥시시티딘, 및 시토신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시티미딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  23. 제 20 항에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시티미딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  24. 제 23 항에 있어서, 데옥시티미딘 트리포스페이트의 상기 전구체가 데옥시티미딘 디포스페이트, 데옥시티미딘 모노포스페이트, 데옥시티미딘, 및 티민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 또는 NCT 배지가 데옥시우리딘 트리포스페이트, 또는 이의 전구체로 보충되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시우리딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  27. 제 25 항에 있어서, 상기 배양 배지가 데옥시우리딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  28. 제 27 항에 있어서, 데옥시우리딘 트리포스페이트의 상기 전구체가 데옥시우리딘 디포스페이트, 데옥시우리딘 모노포스페이트, 데옥시우리딘, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 또는 NCT 배지가 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 또는 이의 전구체로 보충되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 배양 배지가 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  31. 제 29 항에 있어서, 상기 배양 배지가 아데노신 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  32. 제 31 항에 있어서, 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 의 상기 전구체가 아데노신 디포스페이트, 아데노신 모노포스페이트, 아데노신, 및 아데닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 구아노신 트리포스페이트 (GTP) 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 배양 배지가 구아노신 트리포스페이트 (GTP) 로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  35. 제 33 항에 있어서, 상기 배양 배지가 구아노신 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  36. 제 35 항에 있어서, 구아노신 트리포스페이트의 상기 전구체가 구아노신 디포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 구아노신, 및 구아닌으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 배양 배지가 시티딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  39. 제 37 항에 있어서, 상기 배양 배지가 시티딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  40. 제 39 항에 있어서, 시티딘 트리포스페이트의 상기 전구체가 시티딘 디포스페이트, 시티딘 모노포스페이트, 시티딘, 및 시토신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 또는 NCT 배지가 5-메틸우리딘 트리포스페이트 (m5UTP), 또는 이의 전구체로 보충되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 배양 배지가 5-메틸우리딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  43. 제 41 항에 있어서, 상기 배양 배지가 5-메틸우리딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  44. 제 43 항에 있어서, 5-메틸우리딘 트리포스페이트의 상기 전구체가 5-메틸우리딘 디포스페이트, 5-메틸우리딘 모노포스페이트, 5-메틸우리딘, 및 티민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 우리딘 트리포스페이트 (UTP), 또는 이의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 배양 배지가 우리딘 트리포스페이트로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  47. 제 45 항에 있어서, 상기 배양 배지가 우리딘 트리포스페이트의 전구체로 보충되거나, 또는 상기 NCT 배지가 이것을 포함하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  48. 제 47 항에 있어서, 우리딘 트리포스페이트의 전구체가 우리딘 디포스페이트, 우리딘 모노포스페이트, 우리딘, 및 우라실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  49. 제 2 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NCT 배지가 피하 투여, 비경구 투여, 국소 투여, 경구 투여, 비강 또는 흡입 투여, 국부 투여 예컨대 페인트, 에어로졸에 의해, 또는 경피로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경로를 통한 투여를 위해 제형화되는 비히클을 포함하는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
  50. 제 2 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NCT 배지가 국소 투여, 피하 (subdermal) 투여, 또는 피내 (intradermal) 투여를 위해 제형화되는 비히클을 포함하는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 배지가 머드, 허브 혼합물, 지방, 에멀전, 로션, 크림, 젤, 생물학적 제제, 용액, 스프레이, 연고, 폼, 무스, 액체, 현탁액, 분산액, 에어로졸, 비누, 샴푸, 및 컨디셔너로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비히클 내에 제형화되는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
  52. 제 50 항에 있어서, 상기 배지가 크림 (예, 얼굴용 크림) 으로서 제형화되는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
  53. 제 56 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 주름 제거 크림, 피부 필러, 흉터-감소 크림, 및 여드름 치료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형을 포함하는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
  54. 제 1 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 상기 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가, 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체에 의한 보충이 없는 동일한 배지에서 배양된 동일한 세포와 비교하여, 줄기 세포의 단기간 및/또는 장기간 유전적 안정성을 개선하기 위해 충분한 농도로 존재하는 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 체세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 줄기 세포인 세포 배양 배지 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
  56. 제 1 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 각각의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가 약 1 μM 내지 약 50 μM 이하, 또는 약 1 μM 내지 약 40 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 35 μM 이하, 또는 약 1 μM 내지 약 30 μM 이하의 범위의 농도로 존재하는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  57. 제 1 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 각각의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가, 약 50 μM 이하, 또는 약 40 μM 이하, 또는 약 30 μM 이하 또는 약 25 μM 이하, 또는 약 20 μM 이하, 또는 약 15 μM 이하, 또는 약 10 μM 이하, 또는 약 5 μM 이하의 출발 (저장액) 또는 최종 (외적 전달) 의 농도인 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 각각의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가 약 5 μM 내지 약 30 μM 의 범위의 출발 (저장액) 또는 최종 (외적 전달) 농도로 존재하는 세포 배양 배지, 또는 NCT 배지.
  59. 제 57 항에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 각각의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가 약 30 μM 의 출발 (저장액) 또는 최종 (외적 전달) 농도로 존재하는 세포 배양 배지, 또는 NCT 배지.
  60. 제 57 항에 있어서, 상기 배양 배지에 보충된, 또는 상기 NCT 배지가 포함하는 각각의 뉴클레오시드 트리포스페이트 또는 이의 전구체가 약 5 μM 의 출발 (저장액) 또는 최종 (외적 전달) 농도로 존재하는 세포 배양 배지, 또는 NCT 배지.
  61. 제 1 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지, 또는 상기 NCT 배지에 이종-병원체 (xenopathogen) 가 없는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  62. 제 1 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지, 또는 상기 NCT 배지에 동물 또는 인간 유래 혈청 알부민이 없는 세포 배양 배지 또는 NCT 배지.
  63. 제 1 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 보충된 배지가 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 필수 8 (E8) 배지, 및 KnockOut DMEM 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양 배지.
  64. 제 63 항에 있어서, 기저 배지가 DMEM/F12 인 세포 배양 배지.
  65. 제 2 항에 있어서, 상기 NCT 가 상기 비히클 및 제 1 항, 제 3 항 내지 제 48 항, 또는 제 55 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지를 포함하는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배지.
  66. 제 1 항, 제 3 항 내지 제 48 항, 또는 제 55 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지 내에 세포를 포함하거나, 또는 제 2 항 내지 제 62 항, 또는 제 65 항 중 어느 한 항에 따른 NCT 배지 내에 세포를 포함하는, 체세포 또는 줄기 세포 배양물 또는 뉴클레오시드 칵테일 전송 (NCT) 배양물.
  67. 제 66 항에 있어서, 상기 체세포 또는 줄기 세포가 체세포 또는 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포인 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
  68. 제 66 항에 있어서, 상기 세포가 줄기 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
  69. 제 68 항에 있어서, 상기 줄기 세포가 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 표피 줄기 세포, 위장관 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 및 췌장 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
  70. 제 68 항에 있어서, 상기 세포가 유도된 다능성 줄기 세포 (IPSC) 인 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
  71. 제 70 항에 있어서, 상기 IPSC 가 섬유아세포, 신경 줄기 세포, 위 (stomach) 세포, 간 세포, 케라틴세포, 멜라닌세포, 양막 세포, 혈액 세포, β-세포, 및 지방 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포로부터 재프로그래밍되는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
  72. 제 70 항 또는 제 71 항에 있어서, IPSC 가 KLF4 (K), LIN28 (L), c-MYC (M), NANOG (N); OCT4 (O), SOX2 (S), 및 발프로산 (VPA) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2 개 이상의 인자가 재프로그래밍된 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
  73. 제 72 항에 있어서, ISPC 가 4 개의 정준 Yamanaka 인자 KLF4 (K), c-MYC (M),OCT4 (O), 및 SOX2 (S) 를 사용하여 재프로그래밍된 세포를 포함하는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
  74. 제 73 항에 있어서, 재프로그래밍 인자가 LIN28 을 추가로 포함하는 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
  75. 제 70 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IPSC 가 통합 벡터, 비-통합 벡터, 절제가능한 벡터, 및 무-DNA (DNA-free) 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 벡터를 사용하여 재프로그래밍된 세포 배양물 또는 NCT 배양물.
  76. 줄기 세포를 제 항에 따른 세포 배양 배지 또는 제 1 항, 제 3 항 내지 제 48 항, 또는 제 55 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 따른 배양 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 줄기 세포의 유전적 불안정성을 감소시키는 방법.
  77. 대상으로부터 줄기 세포를 단리하거나 상기 대상으로부터 IPSC 를 발생시키고, 상기 줄기 세포 또는 IPSC 를 제 1 항, 제 3 항 내지 제 48 항, 또는 제 55 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지에서, 또는 제 2 항 내지 제 62 항, 또는 제 65 항 중 어느 한 항에 따른 NCT 배지에서 팽창 및/또는 배양하는 것을 포함하는, 자가조직 줄기 세포 전달을 수행하는 방법.
  78. 대상에게, 제 2 항 내지 제 62 항, 또는 제 65 항 중 어느 한 항에 따른 NCT 배지를 투여하는 것을 포함하는, 조직의 재생 및/또는 유지를 촉진시키는 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, 상기 NCT 배지가 피하 투여, 비경구 투여, 국소 투여, 경구 투여, 비강 또는 흡입 투여, 국부 투여 예컨대 페인트, 에어로졸에 의해, 또는 경피로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경로를 통한 투여를 위해 제형화된 비히클을 포함하는 방법.
  80. 제 78 항에 있어서, 상기 NCT 배지가 국소 투여, 피하 (subdermal) 투여, 또는 피내 (intradermal) 투여를 위해 제형화된 비히클을 포함하는 방법.
  81. 제 80 항에 있어서, 상기 NCT 배지가 머드, 허브 혼합물, 지방, 에멀전, 로션, 크림, 젤, 생물학적 제제, 용액, 스프레이, 연고, 폼, 무스, 액체, 현탁액, 분산액, 에어로졸, 비누, 샴푸, 및 컨디셔너로 이루어지는 군으로부터 선택되는 비히클에서 제형화되는 방법.
  82. 제 80 항에 있어서, 상기 NCT 배지가 크림 (예, 얼굴용 크림) 으로서 제형화되는 방법.
  83. 제 80 항에 있어서, 상기 NCT 배지가 주름 제거 크림, 피부 필러, 흉터-감소 크림, 및 여드름 치료로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형을 포함하는 방법.
  84. 제 78 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NCT 를 인간의 피부에 적용하는 방법.
  85. 제 84 항에 있어서, 상기 NCT 를 흉터를 감소시키기 위해 적용하는 방법.
  86. 제 84 항에 있어서, 상기 NCT 를 주름을 감소시키기 위해 적용하는 방법.
  87. 제 78 항 내지 제 83 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NCT 를 조직 부피를 증가시키기 위해 피내로 또는 피하로 적용하는 방법.
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