JP2016538836A - 細胞機能、遺伝的安定性、及び再生応用を促進するヌクレオシドの添加 - Google Patents
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Abstract
種々の実施形態において、改善された、遺伝的安定性、細胞機能、及び再生能を備えた、幹細胞の培養のための、細胞培養培地、またはヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地が提供される。実例となる培地は、幹細胞の基本の培地を含み、この培地には、1種または複数種のヌクレオシド三リン酸(例えば、dNTP及び/またはNP)または、それらの1種もしくは複数種の前駆体が添加される。実例となるNCT培地は、1種または複数種のヌクレオシド三リン酸(例えば、dNTP及び/またはNP)または、それらの1種または複数種の前駆体を含有する、送達担体(例えばスキンクリームまたは他の担体)を含む。このNCT培地は、とりわけ、再生、美容、及び/または治療的目的のために、ヒトの細胞組織(例えば、皮膚)へヌクレオシド混合物の直接的な送達を提供する。
Description
(関連出願の相互参照)
本願は、2013年10月16日に出願されたUSSN61/891846の利益及びそれに対する優先権を主張するものであり、あらゆる目的のためにその全てが参照することにより組み込まれる。
(政府支援に関する記述)
該当なし
本願は、2013年10月16日に出願されたUSSN61/891846の利益及びそれに対する優先権を主張するものであり、あらゆる目的のためにその全てが参照することにより組み込まれる。
(政府支援に関する記述)
該当なし
人工多能性幹細胞(iPSC)は、胚性幹細胞(ESC)と多くの類似性を共有しているが、iPSCの誘導に用いる体細胞リプログラミング法は、新規の細胞型についての科学的興味と懸念の両方を引き起こしてきた。最適以下で添加された環境条件において、標準以下/副生理学的細胞機能(最適以下の増殖及び分化など)に関する重要な懸念に加えて、iPSCならびにESCにおけるそれらの誘導及び長期にわたる培養の間のゲノムの完全性及び安定性に関する重要なバイオセイフティの懸念が存在する。研究、美容及び治療的/再生応用におけるヒト人工多能性幹細胞(または他の幹細胞もしくは体細胞)の有用性は、それらのゲノムの完全性、安定性、及び機能性に非常に依存する。一定のゲノムまたはエピゲノムの異常は、分化の可能性を損ない得るだけでなく、iPSC系療法のレシピエントに腫瘍形成を起こし得る。ゲノムの異常は、染色体の数及び構造の変化などの核型異常、わずかな核型の(subkarytopic)またはわずかな染色体の(subchromosomal)増幅及び欠損などのコピー数多型(CNV)、後天的な片親性ダイソミーが原因である異型接合性の欠損(LOH)、及びホストのゲノムへの異質なDNAの無作為または部位特異的な、組み込みとして認められている。
現在の手法を用いて誘導した、種々の体細胞及び幹細胞、ならびに本質的に全てのIPSCのクローンは、標準以下の生理機能(細胞増殖の欠陥など)を有することに加え、リプログラミング及びin vitro培養誘発性ストレスの間のゲノム不安定性を得るということが研究によって示されている(Martins−Taylor and Xu (2012) Stem Cells 30: 22−27; Lund et al. (2012) Nat. Rev. Genet., 13: 732−744)。ゲノム不安定性と悪性である形質転換の危険の増大との間に関連が認められていることから、hiPSCのゲノム不安定性の問題は、個別化されたiPSC系再生療法を臨床へ進歩させる最も重大な妨げの1つである(Martins−Taylor and Xu (2012) Stem Cells 30: 22−27 ; Lund et al. (2012) Nat. Rev. Genet., 13: 732−744; Byrne (2013) Gene Therapy and Regulation 7 : 1230002)。
hiPSCのリプログラミング及び培養中の、ゲノム不安定性の原因と細胞の生理機能に欠陥がある原因、ならびに他の多能性幹細胞(ヒト胚性幹細胞など)及び体細胞の幹細胞(神経幹細胞、間葉系幹細胞、及び皮膚幹細胞など)についても実際には、不明瞭であり、そして、この極めて有害な現象の発生を減少させて、最終的に除去する方法はまだ開発されていない。
幹細胞及び体細胞における、ゲノムの完全性、安定性、及び機能性は、ヌクレオシド(例えばデオキシヌクレオシド)の外因性の添加によって増大され得ることを見いだした。こうしたヌクレオシド添加(ヌクレオシド混合物(NC)、または、ある特定の実施形態においてデオキシリボヌクレオシド混合物(DC)というは、細胞培養培地を増強するために用いられてもよく、もしくは、ヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地、またはある特定の実施形態においてはデオキシリボヌクレオシド伝達混合物(DCT)を生成するために、送達担体と組み合わされることもできる。こうした添加は、ゲノム安定性を改善することに加えて、(例えば、細胞の増殖を加速したり、標的である治療用細胞型(肝細胞など)への分化を促進したり、及び/またはヒト細胞組織の再生をしたり(再生のために、in vivoでヒトの皮膚細胞の分裂を刺激するなど)することで、細胞機能を強化することもできる。
さらに、ヒト皮膚線維芽細胞のヌクレオシド混合物への暴露は、顕著に増大した割合で、増殖を刺激することができ、そしてこの現象は、スキンクリームのようなヌクレオシド伝達培地と組み合わせた場合、ヒトの皮膚または他の組織を直接再生する/若返らせる場合に、非常に有用であると証明し得るということが認められた。
このヌクレオシド混合物は、ゲノム安定性を改善するだけでなく、標的細胞型(肝疾患の治療のための肝細胞など)へ多能性幹細胞の分化を増大させることに加えて、幅広い種類の体細胞及び幹細胞の増殖率をも顕著に増大する。
従って、いくつかの実施形態は、体細胞及び幹細胞の基本の培養培地を提供し、その培養培地には、1種または複数種のヌクレオシド三リン酸(例えば、dNTP、及び/またはNTP)または、それらの1種もしくは複数種の前駆体が添加される。その他の実施形態は、1種または複数種のヌクレオシド三リン酸(例えばdNTP及び/またはNTP)または1種もしくは複数種のそれらの前駆体を、1)スキンクリーム、2)外用化粧品、及び/もしくは3)注射剤、摂取、吸入またはその他のような外的な送達機構(EDM)を含むがこれらに限定されない外用及び/もしくは送達機構のin vivoでの使用と、組み合わせる。
それゆえに、種々の態様において、本明細書で企図する発明は、いずれか1つ以上の下記の実施形態を含み得るが、それらに限定される必要はない。
種々の態様において、本明細書で企図する発明は、いずれか1つ以上の下記の実施形態を含み得るが、それらに限定される必要はない。
実施形態1は、改善された遺伝的安定性を備えた幹細胞の培養のための細胞培養培地であって、当該培養培地は、幹細胞の基本の培養培地を含み、当該培養培地には、1種もしくは複数種のヌクレオシド三リン酸、またはそれらの1種もしくは複数種の前駆体が添加される、当該培養培地である。
実施形態2は、体細胞または幹細胞の遺伝的安定性を改善する、ヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地であって、美容または医薬品の送達担体、及び1種または複数種のヌクレオシド三リン酸またはそれらの前駆体を含む、当該培地である。
実施形態3は、当該1種または複数種のヌクレオシド三リン酸が、独立にデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(NCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、デオキシウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、シチジン三リン酸(CTP)、5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)、及びウリジン三リン酸(UTP)からなる群から選択される、実施形態1に記載の細胞培養培地、または実施形態2に記載のヌクレオシド混合物伝達培地である。
実施形態4は、当該1種または複数種のヌクレオシド三リン酸が、独立にデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(NCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、及びデオキシウリジン三リン酸からなる群から選択される、実施形態1に記載の細胞培養培地、または実施形態2に記載のヌクレオシド混合物伝達培地である。
実施形態5は、当該1種または複数種のヌクレオシド三リン酸が、独立にアデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、シチジン三リン酸(CTP)、5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)、及びウリジン三リン酸(UTP)からなる群から選択される、実施形態1に記載の細胞培養培地、または実施形態2に記載のヌクレオシド混合物伝達培地である。
実施形態6は、当該培養培地には、独立にデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(NCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、デオキシウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、シチジン三リン酸(CTP)、5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)、及びウリジン三リン酸(UTP)からなる群から選択される、ヌクレオシド三リン酸の1種または複数種の前駆体が添加される、または当該NCT培地がそれらを含む、実施形態1及び3〜5のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜5のいずれか1つに記載のヌクレオシド混合物伝達培地である。
実施形態7は、ヌクレオシド三リン酸の当該1種または複数種の前駆体が、独立にデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(NCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、及びデオキシウリジン三リン酸からなる群から選択される、実施形態6の細胞培養、またはNCT培地である。
実施形態8は、ヌクレオシド三リン酸の当該1種または複数種の前駆体が、独立にアデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、シチジン三リン酸(CTP)、5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)、及びウリジン三リン酸(UTP)からなる群から選択される、実施形態6の細胞培養、またはNCT培地である。
実施形態9は、実施形態1及び3〜8のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態3〜8のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸(dATP)、またはその前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態10は、実施形態9の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態11は、実施形態9の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸の前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態12は、実施形態11の細胞培養培地またはNCT培地であって、デオキシアデノシン三リン酸の当該前駆体は、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシアデノシン、及びアデニンからなる群から選択される、培地である。
実施形態13は、実施形態1及び3〜12のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜12のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、またはその前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態14は、実施形態13の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該細胞培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態15は、実施形態13の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該細胞培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸の前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態16は、実施形態15の細胞培養またはNCT培地であって、デオキシグアノシン三リン酸の当該前駆体は、デオキシグアノシン二リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン、及びグアニンからなる群から選択される、培地である。
実施形態17は、実施形態1または3〜16のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜16のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該培養培地には、デオキシシチジン三リン酸(NCTP)、またはその前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態18は、実施形態17の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該細胞培養培地には、デオキシシチジン三リン酸が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態19は、実施形態17の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該細胞培養培地には、デオキシシチジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態20は、実施形態19の細胞培養培地またはNCT培地であって、デオキシシチジンの前駆体は、デオキシシチジン二リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン、及びシトシンからなる群から選択される、培地である。
実施形態21は、実施形態1及び3〜20のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜20のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該培養培地には、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、またはその前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態22は、実施形態20の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、デオキシチミジン三リン酸が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態23は、実施形態20の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、デオキシチミジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態24は、実施形態23の細胞培養培地またはNCT培地であって、デオキシチミジン三リン酸の当該前駆体は、デオキシチミジン二リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシチミジン、及びチミンからなる群から選択される、培地である。
実施形態25は、実施形態1及び3〜24のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜24のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該培養またはNCT培地には、デオキシウリジン三リン酸、またはその前駆体が添加される。
実施形態26は、実施形態25の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、デオキシウリジン三リン酸が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態27は、実施形態25の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、デオキシウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態28は、実施形態27の細胞培養培地またはNCT培地であって、デオキシウリジン三リン酸の当該前駆体は、デオキシウリジン二リン酸、デオキシウリジン一リン酸、デオキシウリジン、及びウラシルからなる群から選択される、培地である。
実施形態29は、実施形態1及び3〜28のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜28のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該培養またはNCT培地には、アデノシン三リン酸(ATP)、またはその前駆体が添加される、培地である。
実施形態30は、実施形態29の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、アデノシン三リン酸(ATP)が添加される、またはNCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態31は、実施形態29の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、アデノシン三リン酸の前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態32は、実施形態31の細胞培養培地またはNCT培地であって、アデノシン三リン酸(ATP)の当該前駆体は、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、及びアデニンからなる群から選択される、培地である。
実施形態33は、実施形態1及び3〜32のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜32のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該培養培地には、グアノシン三リン酸(GTP)、またはその前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態34は、実施形態33の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、グアノシン三リン酸(GTP)が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態35は、実施形態33の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、グアノシン三リン酸の前駆体添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態36は、実施形態35の細胞培養培地またはNCT培地であって、グアノシン三リン酸の当該前駆体は、グアノシン二リン酸、グアノシン一リン酸、グアノシン、及びグアニンからなる群から選択される、培地である。
実施形態37は、実施形態1及び3〜36のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜36のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該細胞培養培地には、シチジン三リン酸(CTP)、またはその前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態38は、実施形態37の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、シチジン三リン酸が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態39は、実施形態37の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、シチジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態40は、実施形態39の細胞培養培地またはNCT培地であって、シチジン三リン酸の当該前駆体は、シチジン二リン酸、シチジン一リン酸、シチジン、及びシトシンからなる群から選択される、培地である。
実施形態41は、実施形態1及び3〜40のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜40のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該培地またはNCT培地には、5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)、またはその前駆体が添加される、培地である。
実施形態42は、実施形態41の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、5−メチルウリジン三リン酸が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態43は、実施形態41の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、5−メチルウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態44は、実施形態43の細胞培養培地またはNCT培地であって、5−メチルウリジン三リン酸の当該前駆体は、5−メチルウリジン二リン酸、5−メチルウリジン一リン酸、5−メチルウリジン、及びチミンからなる群から選択される、培地である。
実施形態45は、実施形態1及び3〜44のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜44のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該培養培地には、ウリジン三リン酸(UTP)、またはその前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態46は、実施形態45の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、ウリジン三リン酸が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態47は、実施形態45の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地には、ウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または当該NCT培地は、それを含む、培地である。
実施形態48は、実施形態47の細胞培養培地またはNCT培地であって、ウリジン三リン酸の前駆体は、ウリジン二リン酸、ウリジン一リン酸、ウリジン、及びウラシルからなる群から選択される、培地である。
実施形態49は、実施形態2〜48のいずれか1つに記載のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地であって、当該NCT培地は、皮下投与、非経口投与、局所的投与、経口投与、経鼻または吸入による投与、塗布、噴霧、または経皮的などの局所的な投与からなる群から選択される経路を経た投与のために作成された担体を含む、培地である。
実施形態50は、実施形態2〜48のいずれか1つに記載のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地であって、当該NCT培地は、局所的投与、皮下投与または皮内投与のために作成された担体を含む、培地である。
実施形態51は、実施形態50のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地であって、当該培地は、泥、ハーブ調合物、油脂、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、及びコンディショナーからなる群から選択される担体中に作成される、培地である。
実施形態52は、実施形態50のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地であって、当該培地は、クリーム(例えば美顔クリーム)として作成される、培地である。
実施形態53は、実施形態56〜58のいずれか1つに記載のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地であって、当該培地は、しわ取りクリーム、皮膚充填剤、瘢痕低減クリーム、及びにきび治療薬からなる群から選択される製剤を含む、培地である。
実施形態54は、実施形態1及び3〜48のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜53のいずれか1つに記載のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地であって、当該培養培地に添加される、または当該NCT培地を含む、当該ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が添加されない同様の培地において培養された同様の細胞と比較すると、短期間及び/または長期間における幹細胞の遺伝的安定性を改善するために十分な濃度で存在している、培地である。
実施形態55は、実施形態54の細胞培養培地またはヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地であって、当該幹細胞は、体細胞(例えば、線維芽細胞)、または幹細胞(例えば、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、胚性幹細胞、臍帯幹細胞、及び人工多能性幹細胞)からなる群から選択される幹細胞である、培地である。
実施形態56は、実施形態1、3〜48、及び54〜55のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜55のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該培養培地に添加される、または当該NCT培地を含む、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、約1μMから約50μMまで、または約1μMから約40μMまで、または約1μMから約35μMまで、または約1μMから約30μMまでの範囲の濃度(例えば、伝達培地中、及び/または、NCT培地としてスキンクリームを用いたヒトの皮膚へヌクレオシド混合物の外因性送達などのin vivo標的細胞上の濃度などをもたらす)で存在する、培地である。
実施形態57は、実施形態1、3〜48、及び54〜55のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜55のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該培養培地に添加される、または当該NCT培地に含まれる、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、約50μM以下、または約40μM以下、または約30μM以下、または約25μM以下、または約20μM以下、または約15μM以下、または約10μM以下、または約5μM以下の、開始(ストック)または最終(外因性送達)濃度である、培地である。
実施形態58は、実施形態57の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培地に添加される、または当該NCT培地に含まれる、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、約5μMから約30μMの範囲の開始(ストック)または最終(外因性送達)濃度で存在している、培地である。
実施形態59は、実施形態57の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地に添加される、または当該NCT培地に含まれる、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、約30μMの開始(ストック)または最終(外因性送達)濃度で存在している、培地である。
実施形態60は、実施形態57の細胞培養培地またはNCT培地であって、当該培養培地に添加される、または当該NCT培地に含まれる、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体は、約5μMの開始(ストック)または最終(外因性送達)濃度で存在している、培地である。
実施形態61は、実施形態1、3〜48、及び54〜60のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜60のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該細胞培養培地はまたは当該NCT培地は、異種の病原体を保有しない。
実施形態62は、実施形態1、3〜48、及び54〜61のいずれか1つに記載の細胞培養培地、または実施形態2〜61のいずれか1つに記載のNCT培地であって、当該細胞培養培地はまたは当該NCT培地は、動物またはヒト由来の血清アルブミンを伴わない。
実施形態63は、実施形態1、3〜48、及び54〜62のいずれか1つに記載の細胞培養培地であって、当該添加された培地は、DMEM(ダルベッコ変法イーグル培地)、MEM(最小必須培地)、BME(イーグル基礎培地)、RPMI 1640、DMEM/F−12(ダルベッコ変法イーグル培地:栄養混合物F−12)、DMEM/F−10(ダルベッコ変法イーグル培地:栄養混合物F−10)、α−MEM(α−最小必須培地)、G−GEM(グラスコー最小必須培地)、IMDM(イスコブ変法ダルベッコ培地)、essential8(E8)培地、及びKnockOut DMEMからなる群から選択される、培地である。
実施形態64は、実施形態63の細胞培養培地であって、基本培地がDMEM/F12である、培地である。
実施形態65は、実施形態2のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地であって、当該NCT培地は、当該担体及び実施形態1、3〜48、55〜64のいずれか1つに記載の細胞培養培地を含む、培地である。
実施形態66は、体細胞培養もしくは幹細胞培養、またはヌクレオシド混合物伝達(NCT)培養であって、当該細胞培養は、実施形態1、3〜48、及び55〜64のいずれか1つに記載の細胞培養培地中の細胞を含む、または実施形態2〜62、及び65のいずれか1つに記載のNCT培地中の細胞を含む、体細胞培養もしくは幹細胞培養、またはヌクレオシド混合物伝達(NCT)培養である。
実施形態67は、実施形態66の細胞培養またはNCT培養であって、当該体細胞または当該幹細胞は、体細胞(例えば、線維芽細胞)、または幹細胞(例えば、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、胚性幹細胞、臍帯幹細胞、人工多能性幹細胞など)からなる群から選択される細胞である、培養である。
実施形態68は、実施形態66の細胞培養またはNCT培養であって、当該細胞は、幹細胞を含む、培養である。
実施形態69は、実施形態68の細胞培養またはNCT培養であって、当該幹細胞は、神経幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、表皮幹細胞、消化管幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞、及び膵臓幹細胞を含むがこれらに限定されない、胚性幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択される、培養である。
実施形態70は、実施形態68の細胞培養またはNCT培養であって、当該細胞は、人工多能性幹細胞(IPSC)(例えば、患者由来の自家hIPSCなど)である、培養である。
実施形態71は、実施形態70の細胞培養またはNCT培養であって、当該IPSCは、線維芽細胞、神経幹細胞、胃の細胞、肝細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、羊膜細胞、血液細胞、β細胞、及び脂肪細胞からなる群から選択される細胞からリプログラミングされる、培養である。
実施形態72は、実施形態70または71の細胞培養またはNCT培養であって、当該IPSCは、KLF4(K)、LIN28(L)、c−MYC(M)、NANOG(N)、OCT4(O)、SOX2(S)、及びバルプロ酸(VPA)からなる群から選択される、2種またはそれ以上の因子をリプログラミングされた細胞を含む、培養である。
実施形態73は、実施形態72の細胞培養またはNCT培養であって、当該IPSCは4つの基準となる山中因子であるKLF4(K)、c−MYC(M)、OCT4(O)、及びSOX2(S)を用いて、リプログラミングされた細胞を含む、培養である。
実施形態74は、実施形態73の細胞培養またはNCT培養であって、当該リプログラミング因子はさらに、LIN28を含む、培養である。
実施形態75は、実施形態70〜74のいずれか1つに記載の細胞培養またはNCT培養であって、当該IPSCは組み込み型ベクター、非組み込み型ベクター、除去が可能なベクター及び、DNA非含有ベクターからなる群から選択されるベクターを用いてリプログラミングされる、培養である。
実施形態76は、幹細胞の遺伝的不安定性を低減する方法であって、実施形態の実施形態のいずれか1つに記載の細胞培養培地で、実施形態1、3〜48、及び55〜64のいずれか1つに記載の培養培地で当該細胞を培養することを含む、方法である。
実施形態77は、自家幹細胞移入を行う方法であって、当該方法は、対象から幹細胞を単離すること、または当該対象からIPSCを作成すること、及び実施形態1、3〜48、及び55〜64のいずれか1つに記載の細胞培養培地中、または、実施形態2〜62、及び65のいずれか1つに記載のNCT培地中において、当該幹細胞またはIPSCを増大する、及び/または培養することを含む、方法である。
実施形態78は、組織の再生及び/または維持を促進するための方法であって、当該方法は、実施形態2〜62、及び65のいずれか1つに記載のNCT培地を対象に投与することを含む、方法である。
実施形態79は、実施形態78の方法であって、当該NCT培地は、皮下投与、非経口投与、局所的投与、経口投与、経鼻または吸入による投与、または、塗布、噴霧、もしくは経皮的などの局所的な投与からなる群から選択される経路を経た投与のために作成された担体を含む、方法である。
実施形態80は、実施形態78に記載の方法であって、当該NCT培地は、局所的投与、皮下投与、または皮内投与のために作成された担体を含む、方法である。
実施形態81は、実施形態80に記載の方法であって、当該NCT培地は、泥、ハーブ調合物、油脂、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、及びコンディショナーからなる群から選択される担体中に作成される、方法である。
実施形態82は、実施形態80に記載の方法であって、当該NCT培地は、クリーム(例えば美顔クリーム)として作成される、方法である。
実施形態83は、実施形態80に記載の方法であって、当該NCT培地は、しわ取りクリーム、皮膚充填剤、瘢痕低減クリーム、及びにきび治療薬からなる群から選択される製剤を含む、方法である。
実施形態84は、実施形態78〜83のいずれか1つに記載の方法であって、当該NCTはヒトの皮膚に適用される、方法である。
実施形態85は、実施形態84に記載の方法であって、当該NCTは、瘢痕を減らすために適用される、方法である。
実施形態86は、実施形態84に記載の方法であって、当該NCTはしわを減らすために適用される、方法である。
実施形態87は、実施形態78〜83のいずれか1つに記載の方法であって、当該NCTは組織の量を増大させるために、皮内または皮下に適用される、方法である。
種々の実施形態において、本明細書に記載されている方法及び分解は、デオキシリボヌクレオシド(dN)及び/またはヌクレオシド(リボヌクレオシド)添加は、培養中の人工多能性幹細胞(IPSC)を含む幹細胞の遺伝的安定性を増大させることができるという発見に関連がある。
本明細書に示すように、迅速に分割するhIPSC中のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)プールは、細胞のdNTPプール(例えば、皮膚線維芽細胞などで、hIPSCはこの皮膚線維芽細胞から由来している)よりも顕著に小さい(例えば、図2及び図6を参照のこと)。hIPSCは、本来の線維芽細胞よりもより顕著に二重鎖が分解している(DSB)ことを示しているとも判断された(例えば、図3A及び3Bを参照のこと)。
本明細書に提示したデータは、以下のことを示す。1)hIPSCは、デオキシリボヌクレオシド(dN)混合物の形態で、hIPSC培養またはDCT培地へ加えられた、外因性NTP前駆体を利用することができる、そして、2)デオキシリボヌクレオシド(dN)及び/またはヌクレオシド、またはそれらの前駆体の培養培地への添加は、hIPSC dNTPプール欠損を改善することができ、かつそれらの細胞によって経験されるゲノム不安定性を顕著に軽減することができる(例えば、図4を参照のこと)。
外因性NTP前駆体は、ヒトの皮膚細胞とヒト人工多能性幹細胞の両方について、細胞増殖を顕著に刺激することが可能である、ヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地を形成するために、送達担体(例えば、医薬品の送達担体、美容のための送達担体、化粧品など)に取り込むことができるということも見いだした(例えば、図8を参照のこと)。本明細書で使用される、ヌクレオシド混合物伝達(NCT)またはヌクレオシド混合物送達(NCD)培地という用語は、対象(例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物など)へのin vivo投与のために形成された、ヌクレオシド、もしくはその前駆体、またはデオキシヌクレオシドもしくはその前駆体を添加した、担体を含む製剤を示す。デオキシヌクレオシド混合物伝達(DCT)培地またはデオキシヌクレオシド混合物送達(DCD)培地は、対象(例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物など)へのin vivo投与のために形成された、デオキシヌクレオシドまたはその前駆体を添加した、担体を含む製剤を示す。
ヌクレオシド混合物は、細胞増殖、及び/または組織のin vivo活性化/再生(例えば、スキンクリームの形態でのNCTの直接の局所的な適用に続くことなど)を刺激することと同様に、他のin vitro細胞の細胞増殖も刺激することができると考えられている。
本明細書に提示したデータは、ヌクレオシドの添加が、ヒト人工多能性幹細胞中で、dNTPプールを顕著に救出することができ(例えば、図9を参照のこと)、かつヌクレオシドの添加が、広範囲の他のヒト及びヒト以外の細胞型中で、dNTPプールの大きさを増大させることもできると考えられることを示している。
本明細書に提示したデータは、例えば、γH2A.Xの免疫細胞化学(例えば、図10を参照のこと)によって測定される通り、ヌクレオシドの添加が、ヒト人工多能性幹細胞中で、遺伝子損傷の発生を顕著に低減することができ、ヌクレオシドの添加が、広範囲の他のヒト及びヒト以外の細胞型中で、遺伝子損傷の発生を低減することもできると考えられる。
本明細書に提示したデータは、ヌクレオシドの添加が、肝細胞様の細胞へのhIPSCの分化を顕著に増大することができて(例えば、図11及び12を参照のこと)、そしてヌクレオシドDC添加は、広範囲の他のヒト及びヒト以外の細胞型の中への分化を増大することもできると考えられる。
哺乳類の細胞は、2つの経路、グルコース及びアミノ酸を用いるデノボ経路(DNP)ならびに、細胞外環境から前もって作成されたdNを用いるヌクレオシドサルベージ経路(NSP)を経てdNTPを合成する。特定の理論に束縛されるものではないが、以下のことが考えられる。それは、1)DNPを介したdNTPプールの不十分な生成は、hIPSC(または培養中の他の幹細胞)の迅速な分化中の複製ストレス、DNA損傷、及びゲノム不安定性の重大な原因である、そして、2)1種または複数種のデオキシリボヌクレオチド基質またはその前駆体を培養培地へ添加することによる、NSPのhIPSC細胞(または、他の幹細胞)の利用が可能になることで、dNTPプールが増大し、培養中の幹細胞(iPSCを含む)の複製ストレス、DNA損傷、及びゲノム不安定性を軽減するであろう、ということである。
同様に、ヌクレオシド混合物伝達培地(NCT)の投与、例えば、本明細書に記載されているような、1種または複数種のデオキシヌクレオシドまたはそれらの前駆体を含む、医薬品や化粧品は、in vivo幹細胞及び体細胞(例えば、線維芽細胞)の複製ストレス、DNA損傷、及びゲノム不安定性を軽減するであろうと考えられる。
ヌクレオシド非含有条件下で培養されたhIPSCは、dNTP欠乏(図2及び6)、及び特に「臨床変換」(CC)系ストレス下に置かれた場合の高レベルのゲノム不安定性を示すということが見いだされた(図1)。しかし、標準的なhIPSC培養培地に異なる濃度のdNが添加された場合、30μMの各dNは、4〜5日にわたって、hIPSC増殖率及び遺伝的安定性を増大させることができた、ということがわかった(実施例1参照)。二重鎖の分解のγH2A.X染色によるアッセイをしたところ、ゲノム損傷の発生を顕著に軽減もする一方で、低用量のdN(例えば、5μM)は、hIPSC(または他の幹細胞)の遺伝的安定性をより長期間にわたって、保証するであろうということも示した。
本明細書で提示したデータは、幹細胞生物学及び再生医療分野の一員によって容易に実行され得る、簡素でかつ費用効率の高い培養培地添加法が、個別化されたhIPSC系細胞の治療学の臨床的可能性を増大し得ることを示している。
本明細書で提示したデータは、美容、再生、及び治療の分野の一員によって容易に実行され得る、簡素でかつ費用効率の高いヌクレオシド添加法が、ヒトの組織(皮膚など)の再生を直接刺激するということを示している。具体的にいうと、ヌクレオシド混合物の直接の局所的適用(及び/または他のin vivo送達機構)は、皮膚線維芽細胞(図8)、間葉系幹細胞、及び/または皮膚に存在する他の細胞の増殖への刺激を通して、再生を誘導するであろう。
ヌクレオシド(例えば、dN)を添加した細胞は、従来技術(ヌクレオシド非含有(例えば、dN非含有)培養培地)を用いて、誘導、培養し、分化した幹細胞よりも、遺伝的安定性が改善しそして個別化された幹細胞系(例えば、hIPSC系)治療法に続く、腫瘍の形成の危険性の顕著な低下を引き起こすと考えられる。
従って、種々の実施形態において提供される培養培地は、その培地で培養された、幹細胞(例えば、胚性幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞など)の短期間または長期間における遺伝的安定性を向上する。この培養培地は、実質的に幹細胞(または他の細胞)の培養に利用した任意の培養培地を含み、その培地は、1種または複数種のデオキシリボヌクレオシドまたはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される培地である。
同様に、ヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地は、1種または複数種のデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体を含有する、医薬品または化粧品(例えば、本明細書に記載されている通り)を含む。
培養培地。
種々の実施形態において、当該培養培地は、幹細胞の培養に利用した任意の培養培地を実質的に含み、培地には、1種または複数種のデオキシリボヌクレオシドまたはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培養培地には、2つの異なるデオキシヌクレオシド及び/またはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培地には、3つの異なるデオキシヌクレオシド及び/またはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培地には、4つの異なるデオキシヌクレオシド及び/またはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培地には、さらにいっそう異なるデオキシヌクレオシド及び/またはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される。
種々の実施形態において、当該培養培地は、幹細胞の培養に利用した任意の培養培地を実質的に含み、培地には、1種または複数種のデオキシリボヌクレオシドまたはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培養培地には、2つの異なるデオキシヌクレオシド及び/またはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培地には、3つの異なるデオキシヌクレオシド及び/またはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培地には、4つの異なるデオキシヌクレオシド及び/またはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される。ある特定の実施形態においては、培地には、さらにいっそう異なるデオキシヌクレオシド及び/またはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される。
上述の通り、種々の実施形態において、基本の培養培地は、IPSCを含む幹細胞を増大したり、維持したり、または分化したりすることが可能である任意の培養培地であり得る。ある特定の実施形態において、基本培地は従来の方法によって、手作業で用意されてもよい。ある特定の実施形態において、基本培地は市販の培地またはその混合物であってもよい。例えば、基本の培地は、DMEM(ダルベッコ変法イーグル培地;GIBCO)、MEM(最小必須培地;GIBCO)、BME(イーグル基礎培地;GIBCO)、RPMI 1640(GIBCO)、DMEM/F−12(ダルベッコ変法イーグル培地:栄養混合物F−12;GIBCO)、DMEM/F−10(ダルベッコ変法イーグル培地:栄養混合物F−10;GIBCO)、α−MEM(α−最小必須培地;GIBCO)、G−MEM(グラスコー最小必須培地;GIBCO)、IMDM(イスコブ変法ダルベッコ培地;GIBCO)、及びKnockOut DMEM(GIBCO)、essential8(E8)培地、などからなる群から選択され得る。
種々の実施形態において、基本培地は1種または複数種の添加物を含んでもよく、その添加物は、KnockOut血清リプレースメント(GIBCO)、KnockOut SR ゼノフリー(GIBCO)、KnockOut SR ゼノフリー増殖因子混合物(GIBCO)、N2サプリメント(GIBCO)、B27サプリメント(GIBCO)などを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、基本培地は、動物源由来の物質による任意の安全性の問題を避けるため、異種の病原体を保有しない培地(すなわち、ゼノフリー培地)である。概して、そのようなゼノフリー培地は、ウシの血清アルブミン及び、動物細胞から精製した遺伝子組換えタンパク質などの外来の病原菌を含まない。
上述の通り、そのような培地は、研究室で日常的に用意することができ、または市販され得る。限定されない説明として、DMEM/F−12の組成を表1に示す。
前述の基本の培養培地は、説明のためのものであって、限定するためのものではないことが意図される。本明細書に記載されている添加物が、事実上任意の培養培地で用いることができ、または任意の多くのNCT培地を形成するために、医薬品もしくは化粧品へ取り込まれることができる、ということは、当業者は容易に理解するだろう。
ヌクレオシド混合物伝達(送達)培地。
ある特定の実施形態において、ヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地は、1種または複数種のデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体を含有する、送達担体(例えば化粧品)を含む。NCT培地は、哺乳動物中または哺乳動物上の、所望の位置へヌクレオシドまたはヌクレオシドの前駆体を送達するために、あるいはヌクレオシドまたはヌクレオシドの前駆体の適切な局所濃度を提供するために形成される。
ある特定の実施形態において、ヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地は、1種または複数種のデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体を含有する、送達担体(例えば化粧品)を含む。NCT培地は、哺乳動物中または哺乳動物上の、所望の位置へヌクレオシドまたはヌクレオシドの前駆体を送達するために、あるいはヌクレオシドまたはヌクレオシドの前駆体の適切な局所濃度を提供するために形成される。
「送達担体」は、例えば、希釈剤、補助薬、賦形剤、助剤、または担体を示し、それを用いて、本明細書に記載されている1種または複数種のヌクレオシド及び/またはヌクレオシドの前駆体が投与される。
NCTは、例えば細胞増殖及び/または組織のin vivo活性化/再生を刺激するために、及び/または幹細胞もしくは他のin vitroの細胞の細胞増殖を刺激するために、及び/または、導入された外来性細胞(例えば幹細胞)、内因性幹細胞、体細胞などの細胞性の維持を種々の状況において向上させるために、皮下にある、非経口の、局所的な、経口の、経鼻の(またはそれ以外の吸入の)用途に作成されることができ、または、噴霧もしくは経皮的などの局所的投与のために形成される。この組成物は、投与の方法に依って、種々の剤形/濃度で投与され得る。好適な単位剤形は、散剤、錠剤、丸薬、カプセル、ドロップ、坐剤、パッチ、鼻用スプレー、注射剤、移植可能な徐放性製剤、脂質複合体などを含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、NCTは、局所的投与、皮下投与、または皮内投与用に形成される。傷口、例えば、急性の傷の部位、術後の傷の部位、熱傷部位を含む傷口に、投与するためのある特定の製剤において、例えば回復を進めたり、瘢痕を低減したりすることが、企図される。
ある特定の実施形態において、NCTは、1種または複数種の医薬品を備えて形成される。実例となる医薬品は、例えば、傷口、熱傷部位、にきび、及び他の局所的に美観を損なうもの(例えば、種々の種類の皮膚の瘢痕)の治療のために用いられる薬剤を含むが、これらに限定されない。実例となる薬剤は、例えば皮膚の瘢痕用の局所的なタモキシフェン、にきび用の過酸化ベンゾイル及び抗生物質などを含むが、これらに限定されない。
実例となるNCT担体は、美容のための泥、ハーブ調合物、油脂(例えば、動物性油脂)、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、ゲル、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、コンディショナー、クレンザー、及び一般的な化粧品を含む。ある特定の実施形態においては、しわ、及び/または皮膚のしみを減少させるための薬剤、及び/または皮膚充填剤を含む担体が企図される。
ヌクレオシド及び/またはヌクレオシド前駆体が加えられる、好適な担体は、泥、ハーブ調合物、動物性油脂、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、ゲル、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、コンディショナー、クレンザー、及び一般的な化粧品を含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、好適な担体は一般的に、局所的な投与向けの、クリーム、ローション、スプレー、フォーム、ゲル、エマルション、または化粧品の下地として用いられる、任意のキャリアまたは担体を含む。実施例は、乳化剤、炭化水素の下地を含有する不活性な担体、乳化をする下地、毒性を示さない溶媒、または水溶性下地を含む。特に好適な例は、プルロニック、HPMC、CMC、及び他のセルロース系成分、ラノリン、固形パラフィン、液体パラフィン、ソフトイエローパラフィンまたはソフトホワイトパラフィン、サラシ蜜ろう、蜜ろう、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、ジメチコーン、乳化ろう、ミリスチン酸イソプロピル、ミクロワックス、オレイルアルコール、及びステアリルアルコールを含む。非イオン性のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、ポロクサマーともいわれることも企図される。1つの実例となるポロクサマーは、ポロクサマー407であり、プルロニックF−127(BASF社)としても知られている。さらなる担体は、アルギン酸、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体及び/またはポリアクリル酸を含有するヒドロゲルを含むヒドロゲル、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びそれらの混合物を含有するセルロース系担体を含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、担体はローションを含む。ローションは、懸濁化剤及び分散剤の利用を通して、分散培地中で不溶性である、細かく粉末状にした物質を含み得る。その代わりに、ローションは担体と混和しない、かつ通常乳化剤または他の好適な安定剤を用いて分散される、分散相の液状物質として有することができる。一実施形態では、ローションは、100と1000センチストークの間の粘度を有するエマルションの形態である。ローションの流動性は、広い表面積の上への迅速かつ均一な適用を可能にする。ローションは、概して、皮膚表面にその医薬成分の薄いコートを置いて皮膚上で乾くことを意図している。
ある特定の実施形態において、担体は、外用クリームを含む。クリームは、乳化剤及び/または他の安定化剤を含み得る。一実施形態では、製剤は、1000センチストークより大きい粘度、概して、20000〜50000センチストークの範囲を有するクリームの形態である。多くの場合、クリームが軟膏よりも一般に広げるには容易であり、かつ除去するにもより容易であるため、好まれる。クリームとローションの間の基本的な違いは粘度であり、この粘度は種々のオイルの量/用途、及び薬剤を調整するために用いられる水分の割合に依存する。概して、クリームはローションよりも濃厚であり、種々の用途があり得、そして皮膚上の所望の効果に依り、より多くの種類の油/バターを用いることが多い。クリーム剤において水系の割合は、約60〜75%であり、かつ油系は全体の約20〜30%、他の割合は、乳化剤、防腐剤、及び賦形剤で、合計100%である。
種々の実施形態において、担体は、軟膏を含む。好適な軟膏下地の例は、炭化水素下地(例えば、ワセリン、白色ワセリン、黄色軟膏、及びミネラルオイル)、吸収下地(親水性ワセリン、無水ラノリン、ラノリン、及びコールドクリーム)、水分除去可能な下地(例えば、親水性軟膏)、及び水溶性下地(例えば、ポリエチレングリコール軟膏)を含む。概して、ペースト剤は軟膏とは異なり、ペースト剤のほうが固体の割合が大きい。概して、ペースト剤は、同様の構成成分で調整した軟膏より、吸収力があり、かつ油っぽさが少ない。
ある特定の実施形態において、担体は、ゲルを含む。いくつかのエマルションは、ゲルであってもよく、またはそれ以外のゲル構成成分を含んでもよい。しかし、いくつかのゲルはエマルションではなく、これはそれらが混合できない構成成分の均質化された混合物を含まないためである。好適なゲル化剤は、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースなどの修飾されたセルロース、Cabopolホモポリマー及びコポリマー、ならびにそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。好適な液体担体中の溶媒は、ジグリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールなどのアルキレングリコール、ジメチルイソソルビド、イソプロピルアルコール及びエタノールなどのアルコールを含むが、これらに限定されない。概して溶媒は、薬剤を溶解するための能力のために選ばれる。添加剤は、皮膚の感触及び/または、製剤のエモリエント性を改善し、取り込まれてもよい。当該添加剤の例は、ミリスチン酸イソプロピル、酢酸エチル、C12〜C15安息香酸アルキル、ミネラルオイル、スクアラン、シクロメチコン、カプリン酸/カプリル酸トリグリセリド、及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、担体はフォームを含む。フォームは、ガス状の噴霧剤と組み合わせたエマルションからなる。ガス状の噴霧剤は、主にヒドロフルオロアルカン(HFA)からなる。好適な噴霧剤は、1,1,1,2−テトラフルオロエタン(HFA 134a)及び1,1,1,2,3,3,3−ヘプタフルオロプロパン(HFA 227)などのHFAを含むが、それらと、現在医療用の使用を承認されている、または承認され得る、他のHFAの混合物及び添加物が好適である。好ましくは、噴霧剤は噴霧中に可燃性のまたは爆発性の気化物質を生成し得る、炭化水素噴霧ガスではない。さらに、好ましくは、その組成物は、使用中に可燃性または爆発性の気化物質を生成し得る、揮発性アルコールを含まない。
種々の実施形態において、担体は、例えば保存期間を向上させたり、生物学的汚染を減らしたり、濡れを改善したり、最適pHや粘度を維持したり、色、香り、テクスチャなどを維持したり改善したりするために、さらに付加成分を含んでもよいことは、理解されるであろう。実例となる付加成分は、賦形剤、希釈剤、皮膚軟化剤、表面活性物質、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、浸透促進剤、芳香剤、着色剤、などを含むが、これらに限定されない。
適切な賦形剤は、製剤のタイプに基づき選択される。標準的な賦形剤は、ゼラチン、カゼイン、レシチン、アラビアゴム、コレステロール、トラガントゴム、ステアリン酸、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセリン、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシエチレン、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、非晶質セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、糖、及びデンプンを含む。
「希釈剤」は、担体を溶解したり、分散したり、またはそれ以外に取り込んだりするために、製剤中に含まれ得る。希釈剤の例は、水、緩衝水溶液、1価アルコールと低分子グリコールと低分子ポリオールなどの親水性有機希釈剤(例えば、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ブチレングリコール)を含むが、これらに限定されない。
「皮膚軟化剤」は、外用として適用される、皮膚を滑らかにしたりいやしたりする薬剤であり、当技術分野で一般的に知られており、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」, 4th Ed., Pharmaceutical Press,2003などの概説書に記載されている。これは、アーモンド油、ヒマシ油、イナゴマメエキス、セトステアロイルアルコール、セチルアルコール、セチルエステルワックス、コレステロール、綿実油、シクロメチコン、エチレングリコールパルミトステアリン酸、グリセリン、グリセリンモノステアリン酸エステル、モノオレイン酸グリセリル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ラノリン、レシチン、軽油、中鎖トリグリセリド、ミネラルオイル及びラノリンアルコール、ワセリン、ワセリン及びラノリンアルコール、大豆油、デンプン、ステアリルアルコール、ヒマワリ油、キシリトール及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、皮膚軟化剤は、ステアリン酸エチルヘキシル及びパルミチン酸エチルヘキシルである。
「表面活性物質」は、表面張力を下げる表面活性剤であり、そしてそのために生成物の乳化、泡立ち、分散、拡散及び湿潤の性状が増す。好適な表面活性物質は、乳化ろう、モノオレイン酸グリセリル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリソルベート、ソルビタンエステル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、シクロデキストリン、グリセリンモノステアリン酸エステル、ポロクサマー、ポビドン、及びそれらの混合物を含む。一実施形態において、非イオン性表面活性物質は、ステアリルアルコールである。
「乳化剤」は、別の物質の中にある1つの液体の懸濁を促進する表面活性物質であり、油分と水分の安定した混合物またはエマルションの形成を促進する。一般的な乳化剤は、金属石けん、ある特定の動植物油、及び種々の極性化合物である。好適な乳化剤は、アラビアゴム、アニオン性乳化ろう、ステアリン酸カルシウム、カルボマー、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コレステロール、ジエタノールアミン、エチレングリコールパルミトステアリン酸、モノステアリン酸グリセリン、モノオレイン酸グリセリル、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、ラノリン、含水、ラノリンアルコール、レシチン、中鎖トリグリセリド、メチルセルロース、ミネラルオイル及びラノリンアルコール、第1リン酸ナトリウム、モノエタノールアミン、非イオン性乳化ろう、オレイン酸、ポロクサマー、ポロクサマー類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、アルギン酸プロピレングリコールエステル、自己乳化型モノステアリン酸グリセリル、無水クエン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンエステル、ステアリン酸、ヒマワリ油、トラガカントゴム、トリエタノールアミン、キサンタンガム及びこれらの混合物を含む。一実施形態において、乳化剤はステアリン酸グリセロールである。
「緩衝剤」は、組成物のpHを操作するために用いられる。好ましくは、緩衝剤は、約pH4〜約pH7.5、より好ましくは、約pH4〜約pH7、最も好ましくは、約pH5〜約pH7に組成物を緩衝する。好ましい実施形態において、緩衝剤はトリエタノールアミンである。
「防腐剤」は、真菌及び微生物の増殖を妨げるために用いることができる。好適な抗真菌薬及び抗微生物薬は、安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、チメロサールを含むが、これらに限定されない。
「浸透促進剤」は、皮膚、特に角質層を越えた薬剤の経皮的な送達を促進するためにしばしば用いられる。浸透促進剤は、活性剤が角質層の壁を越えることを可能にするために、加えられ得る。いくつかの浸透促進剤は、皮膚刺激性、皮膚毒性、及び皮膚アレルギーを起こす。しかし、より一般的に使用される物は、尿素、(カルボニルジアミド)、イミド尿素、N,N−ジエチルホルムアミド、N−メチル1−2−ピロリジン、1−ドデカル−アザシクロヘプタン−2−オン、カルシウムチオグリケート、2−ピロリジン、N,N−ジエチル−m−トルアミド、オレイン酸及び、そのメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ビニル、グリセルモノオレートなどのエステル誘導体、ソルビタンモノラウレート及びソルビタンモノオレートなどのソルビタンエステル、イソプロピルラウレート、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル、プロピレングリコールモノラウレート、プロピレングリコールモノオレートなどの他の脂肪酸エステル、及び、例えばBRIJ(登録商標)76(ステアリルポリ(10オキシエチレンエーテル)、BRIJ(登録商標)78(ステアリルポリ(20)オキシエチレンエーテル)、BRIJ(登録商標)96(オレイルポリ(10)オキシエチレンエーテル)、及びBRIJ(登録商標)721(ステアリルポリ(21)オキシエチレンエーテル)(ICI Americas Inc. Corp.)などの非イオン性洗剤を含む。
送達担体の組成が、投与の様式、適用する部位などに伴い変化することは、理解されるであろう。医薬品及び化粧品の担体を調製する方法については、当業者によく知られている(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990; Barel, Handbook of Cosmetic Science and Technology, 3rd Ed., CRC Press; and Rosen, Delivery System Handbook for Personal Care and Cosmetic Products: Technology, Applications and Formulations , Elsevier Science (2005))などを参照のこと)。
前述の製剤及び投与の方法は、説明のためのものであって、限定するためのものではないことが意図される。本明細書に提供された教示を用いると、他の好適な製剤及び投与の方法を容易に考案することができることは理解されるであろう。
ヌクレオシド添加。
種々の実施形態において、培養培地には、1種または複数種のデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される、あるいはNCT培地はそれらを含む。実例となるデオキシリボヌクレオシド三リン酸は、デオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、及びデオキシウリジン三リン酸(dUTP)を含むが、これらに限定されない。当該dNTPの実例となる前駆体は、以下を含むが、これらに限定されない。
種々の実施形態において、培養培地には、1種または複数種のデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド(三リン酸)及び/またはそれらの前駆体が添加される、あるいはNCT培地はそれらを含む。実例となるデオキシリボヌクレオシド三リン酸は、デオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、及びデオキシウリジン三リン酸(dUTP)を含むが、これらに限定されない。当該dNTPの実例となる前駆体は、以下を含むが、これらに限定されない。
デオキシアデノシン三リン酸(dATP)向けには、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン、アデニン、などがある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシアデノシン一リン酸、及び、デオキシアデノシン、または任意のそれらの混合物からなる群から選択される、1種または複数種の前駆体を含む。
デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)向けには、デオキシグアノシン二リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン、グアニン、などがある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、デオキシグアノシン二リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、及びデオキシグアノシン、または任意のそれらの混合物からなる群から選択される、1種または複数種の前駆体を含む。
デオキシシチジン三リン酸(dCTP)向けには、デオキシシチジン二リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン、シトシン、などがある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、デオキシシチジン二リン酸、デオキシシチジン一リン酸、及びデオキシシチジン、または任意のそれらの混合物からなる群から選択される、1種または複数種の前駆体を含む。
デオキシチミジン三リン酸(dTTP)向けには、デオキシチミジン二リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシチミジン、チミン、などがある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、デオキシチミジン二リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシチミジン、または任意のそれらの混合物からなる群から選択される、1種または複数種の前駆体を含む。
デオキシウリジン三リン酸向けには、デオキシウリジン二リン酸、デオキシウリジン一リン酸、デオキシウリジン、ウラシル、などがある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、デオキシウリジン二リン酸、デオキシウリジン一リン酸、及びデオキシウリジン、または任意のそれらの混合物からなる群から選択される、1種または複数種の前駆体を含む。
種々の実施形態において、基本の培養培地には、さらにまたは代わりに、1種または複数種のヌクレオシド三リン酸及び/またはそれらの前駆体が添加され、あるいはNCTはそれらを含む。実例となるヌクレオシド三リン酸は、アデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、シチジン三リン酸(CTP)、5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)、ウリジン三リン酸(UTP)、などを含むが、これらに限定される必要はない。ある特定の実施形態において、ATPが存在する場合、他の少なくとも1つのヌクレオシド及び/またはデオキシヌクレオシド三リン酸またはそれらの前駆体も、添加物として存在する。実例となるNTPの前駆体は、以下を含むが、これらに限定されない。
アデノシン三リン酸(ATP)向けには、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、アデニンなど、またはそれらの任意の混合物がある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、及びアデノシンからなる群から選択される、1種または複数種の前駆体を含む。
グアノシン三リン酸(GTP)向けには、グアノシン二リン酸、グアノシン一リン酸、グアノシン、グアニンなど、またはそれらの任意の混合物がある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、グアノシン二リン酸、グアノシン一リン酸、及びグアノシンからなる群から選択される、1種または複数種の前駆体を含む。
シチジン三リン酸(CTP)向けには、シチジン二リン酸、シチジン一リン酸、シチジン、シトシンなど、またはそれらの任意の混合物がある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、シチジン二リン酸、シチジン一リン酸、シチジンからなる群から選択される、1種または複数種の前駆体を含む。
5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)向けには、5−メチルウリジン二リン酸、5−メチルウリジン一リン酸、5−メチルウリジン、チミンなど、またはそれらの任意の混合物がある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、5−メチルウリジン二リン酸、5−メチルウリジン一リン酸、及び5−メチルウリジンからなる群から選択される、1種または複数種の前駆体を含む。
ウリジン三リン酸(UTP)向けには、ウリジン二リン酸、ウリジン一リン酸、ウリジン、ウラシルなど、またはそれらの任意の混合物がある。いくつかの実施形態において、当該前駆体は、ウリジン二リン酸、ウリジン一リン酸、及びウリジンからなる群から選択される、1種または複数種の前駆体を含む。
ある特定の実施形態において、当該前駆体は、単独で塩基を含まない。
ある特定の実施形態において、培養培地に、2つの異なるデオキシヌクレオシド、またはヌクレオシド(三リン酸)、及び/またはそれらの前駆体、あるいは、3つの異なるデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド(三リン酸)、及び/またはそれらの前駆体、あるいは、4つ(またはそれ以上)の異なるデオキシヌクレオシドまたはヌクレオシド(三リン酸)及び/または前駆体が添加される、またはNCT培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地に、少なくとも1種のプリン及び1種のピリミジン(またはそれらの前駆体)が添加される、またはDCT培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地には、少なくとも2種のプリン(またはそれらの前駆体)が添加される、またはDCT培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地には、少なくとも2種のピラミジン(またはそれらの前駆体)が添加される、またはNCT培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地には、少なくとも2種のプリン(またはそれらの前駆体)及び少なくとも1種のピラミジン(またはそれらの前駆体)が添加される、またはNCT培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地には、少なくとも2種のピラミジン(またはそれらの前駆体)及び1種のプリン(またはそれらの前駆体)が添加される、またはNCT培地はそれらを含む。ある特定の実施形態において、培養培地には、少なくとも2種のプリン(またはそれらの前駆体)及び2種のピリミジン(またはそれらの前駆体)が添加される、またはNCT培地はそれらを含む。
説明として、いくつかの実施形態において、添加(例えば、培養培地を取り込むこと、またはNCT培地を含むこと)は、以下の1種または複数種を含む、または、からなる。
1)dATP(またはそれらの前駆体)、
2)dGTP(またはそれらの前駆体)、
3)dCTP(またはそれらの前駆体)、
4)dTTP(またはそれらの前駆体)、
5)dUTP(またはそれらの前駆体)、
6)dATP(またはそれらの前駆体)及びdGTP(またはそれらの前駆体)、
7)dATP(またはそれらの前駆体)及びdCTP(またはそれらの前駆体)、
8)dATP(またはそれらの前駆体)及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
9)dATP(またはそれらの前駆体)及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
10)dGTP(またはそれらの前駆体)及びdCTP(またはそれらの前駆体)、
11)dGTP(またはそれらの前駆体)及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
12)dGTP(またはそれらの前駆体)及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
13)dCTP(またはそれらの前駆体)及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
14)dCTP(またはそれらの前駆体)及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
15)dTTP(またはそれらの前駆体)及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
16)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)及びdCTP(またはそれらの前駆体)、
17)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)、及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
18)dATP(またはそれらの前駆体)、dCTP(またはそれらの前駆体)、及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
19)dGTP(またはそれらの前駆体)、dCTP(またはそれらの前駆体)、及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
20)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)、及びdCTP(またはそれらの前駆体)、
21)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)、及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
22)dATP(またはそれらの前駆体)、dCTP(またはそれらの前駆体)、及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
23)dGTP(またはそれらの前駆体)、dCTP(またはそれらの前駆体)、及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
24)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)、及びdCTP(またはそれらの前駆体)、及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
25)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)、dCTP(またはそれらの前駆体)、及びdUTP(またはそれらの前駆体)
1)dATP(またはそれらの前駆体)、
2)dGTP(またはそれらの前駆体)、
3)dCTP(またはそれらの前駆体)、
4)dTTP(またはそれらの前駆体)、
5)dUTP(またはそれらの前駆体)、
6)dATP(またはそれらの前駆体)及びdGTP(またはそれらの前駆体)、
7)dATP(またはそれらの前駆体)及びdCTP(またはそれらの前駆体)、
8)dATP(またはそれらの前駆体)及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
9)dATP(またはそれらの前駆体)及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
10)dGTP(またはそれらの前駆体)及びdCTP(またはそれらの前駆体)、
11)dGTP(またはそれらの前駆体)及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
12)dGTP(またはそれらの前駆体)及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
13)dCTP(またはそれらの前駆体)及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
14)dCTP(またはそれらの前駆体)及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
15)dTTP(またはそれらの前駆体)及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
16)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)及びdCTP(またはそれらの前駆体)、
17)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)、及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
18)dATP(またはそれらの前駆体)、dCTP(またはそれらの前駆体)、及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
19)dGTP(またはそれらの前駆体)、dCTP(またはそれらの前駆体)、及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
20)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)、及びdCTP(またはそれらの前駆体)、
21)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)、及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
22)dATP(またはそれらの前駆体)、dCTP(またはそれらの前駆体)、及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
23)dGTP(またはそれらの前駆体)、dCTP(またはそれらの前駆体)、及びdUTP(またはそれらの前駆体)、
24)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)、及びdCTP(またはそれらの前駆体)、及びdTTP(またはそれらの前駆体)、
25)dATP(またはそれらの前駆体)、dGTP(またはそれらの前駆体)、dCTP(またはそれらの前駆体)、及びdUTP(またはそれらの前駆体)
前述の任意の添加物中において、デオキシヌクレオシドは、ヌクレオシド、またはその前駆体であってもよいことは、理解されるであろう。これら添加物は、説明のためのものであって、限定するためのものではない。
概して、dNTP及び/またはNTPは、同様の培養培地で培養された、またはヌクレオシド三リン酸もしくはその前駆体を添加しないNCT培地へ曝した同様の細胞と比較して、短期間及び/または長期間の、幹細胞の遺伝的安定性を改善するために、及び/または増殖率を改善するために、及び/または生存率を改善するために、十分な量で培養中にまたはNCT培地中に存在する。
ある特定の実施形態において、培養またはDCT培地に添加される、NTP及び/またはdNTPまたはそれらの前駆体は、それぞれ独立に、約1μMから約50μMまで、または約1μMから約40μMまで、または約1μMから約35μMまで、または約1μMから約30μMまでの範囲の濃度で存在する。ある特定の実施形態において、培養またはDCT培地に添加される、NTP及び/またはdNTPまたはそれらの前駆体は、それぞれ独立に、約50μM以下、または約40μM以下、または約35μM以下、または約30μM以下、または約25μM以下、または約20μM以下、または約15μM以下、または約10μM以下、または約5μM以下の濃度で存在する(少なくとも1種のヌクレオシド三リン酸またはそれらの前駆体について少なくとも0.1μMが、「以下」は全てのヌクレオシド三リン酸またはそれらの前駆体が存在しないと解釈されるように意図されないよう、存在していると理解の上で)。
ある特定の実施形態において、培養培地に添加されるまたはNCT培地を構成する、NTP及び/またはdNTPまたはそれらの前駆体は、それぞれ独立して約5μMから約30μMの範囲の濃度で存在する。
ある特定の実施形態において、培養培地に添加される、またはNCT培地を構成する、NTP及び/またはdNTPまたはそれらの前駆体は、それぞれ独立して、約1μM、または約2μM、または約3μM、または約4μM、または約5μM、または約6μM、または約7μM、または約8μM、または約9μM、または約10μM、または約11μM、または約12μM、または約13μM、または約14μM、または約15μM、または約16μM、または約17μM、または約18μM、または約19μM、または約20μM、または約21μM、または約22μM、または約23μM、または約24μM、または約25μM、または約26μM、または約27μM、または約28μM、または約29μM、または約30μM、または約31μM、または約32μM、または約33μM、または約34μM、または約35μM、または約36μM、または約37μM、または約38μM、または約39μM、または約40μM、または約41μM、または約42μM、または約43μM、または約44μM、または約45μM、または約46μM、または約47μM、または約48μM、または約49μM、または約50μMの濃度で存在する。
ある特定の実施形態において、培養培地に添加されるまたはNCT培地を構成する、NTP及び/またはdNTPまたはそれらの前駆体は、それぞれ約1μMから、または約2μMから、または約3μMから、または約4μMから、または約5μMから、約50μMまで、または約40μMまで、または約30μMまで、または約25μMまで、または約20μMまで、または約15μMまでの範囲の濃度で存在する。
ある特定の実施形態において、培養培地に添加されるまたはNCT培地を構成する、全てのNTP及び/またはdNTPまたはそれらの前駆体は、約1μMから、または約2μMから、または約3μMから、または約4μMから、または約5μMから、または約6μMから、または約7μMから、または約8μMから、または約9μMから、または約10μMから、または約11μMから、または約12μMから、または約13μMから、または約14μMから、または約15μMから、または約16μMから、または約17μMから、または約18μMから、または約19μMから、または約20μMから、約200μMまで、または約180μMまで、または約150μMまで、または約145μMまで、または約140μMまで、または約135μMまで、または約130μMまで、または約125μMまで、または約120μMまで、または約115μMまで、または約110μMまで、または約105μMまで、または約100μMまでの範囲の濃度で存在する。
ある特定の実施形態において、幹細胞培養も本明細書で提供され、幹細胞培養は、本明細書に記載される1種または複数種のdNTP及び/またはNTPを添加した培養培地中の幹細胞を含む。ある特定の実施形態においては、幹細胞は、in vivoで存在することができ、本明細書に記載されているようにNCTに曝すこともできる。種々の実施形態において、幹細胞は、神経幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、表皮幹細胞、消化管幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞、及び膵臓幹細胞などを含むがこれらに限定されない、胚性幹細胞または成体幹細胞であってもよい。ある特定の実施形態において、幹細胞は、人工多能性幹細胞、特にヒトIPSCを含む。幹細胞(IPSCを含む)は、ヒトではない動物の幹細胞、またはヒトの幹細胞であり得る。
ある特定の実施形態において、幹細胞は、人工多能性幹細胞、特にヒトIPSCである。実例となる幹細胞は、神経幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、表皮幹細胞、消化管幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞、及び膵臓幹細胞を含むがこれらに限定されない、胚性幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択される幹細胞を含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、幹細胞はIPSCであり、このIPSCは、線維芽細胞、神経幹細胞、胃の細胞、肝細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、羊膜細胞、血液細胞、β細胞、及び脂肪細胞からなる群から選択される細胞からリプログラミングされる。ある特定の実施形態において、IPSCは、KLF4(K)、LIN28(L)、c−MYC(M)、NANOG(N)、OCT4(O)、SOX2(S)、及びバルプロ酸(VPA)からなる群から選択される、2種またはそれ以上の因子をリプログラミングされた細胞を含む。ある特定の実施形態において、IPSCは、4つの基準となる山中因子であるKLF4(K)、c−MYC(M)、OCT4(O)、及びSOX2(S)を用いてリプログラミングされた細胞を含む。
IPSCを生成するために細胞をリプログラミングする方法は、当業者にはよく知られている。ある特定の実施形態において、リプログラミングは、例えば、組み込み型ベクター(例えばレント(lent)ウイルスベクター、誘導型レンチウイルスベクターなど)、除去可能ベクター(例えば、トランスポゾンベクター、loxP隣接レンチウイルスベクターなど)、非組み込み型ベクター(例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクターなど)、DNA非含有ベクター(例えば、センダイウイルス、タンパク質ベクター、修飾mRNAベクター、マイクロRNAベクター、など)を用いて達成され得る。多数のリプログラミングキットが、市販されていることを示しておく(例えば、ライフテクノロジーズ社のEpi5(商標)エピソームiPSCリプログラミングキット、及びCytoTune(登録商標)iPSセンダイリプログラミングキットなど)。
種々の実施形態において、人工幹細胞(多能性幹細胞を含む)のゲノム不安定性を軽減する方法であって、この方法は、本明細書に記載されているような、NTP及び/またはdNTP及び/またはそれらの前駆体を添加した細胞培養培地中の細胞を培養すること、あるいは、例えば本明細書に記載されているような、1種または複数種のNTP及び/またはdNTP及び/またはそれらの前駆体を含むNCT培地と細胞をin vivoで接触させること、を含む方法を提供する。
種々の実施形態において、あるいは本明細書に記載されているような、NTP及び/またはdNTP及び/またはそれらの前駆体が添加された細胞培養培地中に存在する、またはそれらを含むNCT培地と接触した細胞培養培地中に存在する、幹細胞(例えば、人工多能性幹細胞)が提供される。
自家幹細胞移入を実現する方法も提供される。概して、この方法は、対象から単離した幹細胞または対象から作成したIPSC、及び本明細書に記載されているような、NTP及び/またはdNTP及び/またはそれらの前駆体を添加した細胞培養培地またはNCT培地中で、当該幹細胞またはIPSCを増大すること、及び/または培養することを提供することを含む。
本明細書に記載されているそれぞれの実施形態において、目的物(すなわち、細胞培養、DCT培地、細胞、方法、など)は、放射標識された任意のNTP及び/またはdNTP及び/またはそれらの前駆体を含まなくてもよい。従って、いくつかの実施形態において、そのような実施形態で用いられる、このNTP及び/またはdNTP及び/またはそれらの前駆体は、任意の放射標識(例えば、3H、51Crまたは32Pなど)と連結されたり、結合したりしていない。従って、この実施形態では、例えば、3H−dTTPまたは3H−TTPまたはそれらの任意の前駆体を含み得ない。
本明細書に記載されている実施形態は、説明のためのものであって、限定するためのものではないことが意図される。本明細書で提供された教示を用いて、本明細書に記載されている、組成物及び方法の多数の変形が、当技術分野の当業者に利用可能であろう。
以下の実施例は、特許請求された発明を限定するためではなく、説明するために提供される。
実施例1
ゲノム安定性の促進、細胞機能の向上、再生の向上のための、hIPSC培養中または、ヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地へのヌクレオシド添加
意義
ヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)は、有意な治療可能性を有している(Byrne (2008) Human Molecular Genetics 17:R37−41)。しかし、我々の発見は、(図1、予備データ)及び他のデータ(Martins−Taylor and Xu (2012) Stem Cells 30: 22−27; Lund et al (2012) Nat. Rev. Genet., 13: 732−744)が、実質的に現在の手法を用いて誘導された、全てのiPSCクローンが、リプログラミング及びin vitro培養で誘発されたストレスの間に、ゲノム不安定性を得ていることを示している。ゲノム不安定性と悪性である形質転換の危険の増大との間に関連が認められていることから、hIPSCのゲノム不安定性の問題は、個別化されたiPSC系再生療法を臨床へ進歩させる最も重大な妨げの1つである(Martins−Taylor and Xu (2012) Stem Cell 30: 22−27; Lund et al (2012) Nat. Rev. Genet., 13: 732−744; Byrne (2013) Gene Therapy and Regulation 7: 1230002)。
ゲノム安定性の促進、細胞機能の向上、再生の向上のための、hIPSC培養中または、ヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地へのヌクレオシド添加
意義
ヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)は、有意な治療可能性を有している(Byrne (2008) Human Molecular Genetics 17:R37−41)。しかし、我々の発見は、(図1、予備データ)及び他のデータ(Martins−Taylor and Xu (2012) Stem Cells 30: 22−27; Lund et al (2012) Nat. Rev. Genet., 13: 732−744)が、実質的に現在の手法を用いて誘導された、全てのiPSCクローンが、リプログラミング及びin vitro培養で誘発されたストレスの間に、ゲノム不安定性を得ていることを示している。ゲノム不安定性と悪性である形質転換の危険の増大との間に関連が認められていることから、hIPSCのゲノム不安定性の問題は、個別化されたiPSC系再生療法を臨床へ進歩させる最も重大な妨げの1つである(Martins−Taylor and Xu (2012) Stem Cell 30: 22−27; Lund et al (2012) Nat. Rev. Genet., 13: 732−744; Byrne (2013) Gene Therapy and Regulation 7: 1230002)。
hIPSCリプログラミング中及び培養中のゲノム不安定性の原因はまだ不明のままであり、そしてこの非常に有害な減少の発生を軽減して、最後には除去するための方法は、まだ開発されていない。継続中の実験において、我々は、迅速に分割するhIPSC中のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)プールは、hIPSCが由来する、皮膚線維芽細胞のdNTPプールよりも顕著に小さいということを見いだした(図2)。hIPSCは、本来の線維芽細胞よりもより顕著に多く二重鎖が分解している(DSB)ことを示しているとも判断された(例えば、図3A及び3B)。hIPSC中のdNTPプールの減少及びDNA損傷の増大に対する我々の検証は、hIPSCのゲノム不安定性の原因への新たな機構の洞察を提供し得るものであり、かつ、この現象を防ぐ方法を示すかもしれない。従って、我々のデータは、以下のことを示す。1)hIPSCは、デオキシリボヌクレオシドの混合物(dN)の形態で、hIPSC培養培地へ加えられた、外因性dNTP前駆体を利用することができる、そして、2)dNを添加した培養培地は、hIPSC dNTPプール欠損を改善することができ、かつそれらの細胞によって経験されるゲノム不安定性を顕著に軽減することができる(図4)。
仮説及び理論的根拠
哺乳類の細胞は、2つの経路、グルコース及びアミノ酸を用いるデノボ経路(DNP)ならびに、細胞外環境から前もって作成されたdNを用いるヌクレオシドサルベージ経路(NSP)を経てdNTPを合成する。特定の理論で束縛されるものではないが、我々は以下のことを仮定する。それは、1)DNPを介したdNTPプールの不十分な生成は、hIPSCを迅速に分化する、複製ストレス、DNA損傷、及びゲノム不安定性の重大な原因である、そして、2)NSPのdN基質の合成された混合物を培養培地へ添加することによって、NSPのhIPSC細胞の利用が可能になることで、dNTPプールが増大し、複製ストレス、DNA損傷、及びゲノム不安定性を軽減するであろう、ということである。
仮説及び理論的根拠
哺乳類の細胞は、2つの経路、グルコース及びアミノ酸を用いるデノボ経路(DNP)ならびに、細胞外環境から前もって作成されたdNを用いるヌクレオシドサルベージ経路(NSP)を経てdNTPを合成する。特定の理論で束縛されるものではないが、我々は以下のことを仮定する。それは、1)DNPを介したdNTPプールの不十分な生成は、hIPSCを迅速に分化する、複製ストレス、DNA損傷、及びゲノム不安定性の重大な原因である、そして、2)NSPのdN基質の合成された混合物を培養培地へ添加することによって、NSPのhIPSC細胞の利用が可能になることで、dNTPプールが増大し、複製ストレス、DNA損傷、及びゲノム不安定性を軽減するであろう、ということである。
特定の理論で束縛されるものではないが、我々は以下のことを仮定する。1)デノボ経路(DNP)を介した、グルコース及びアミノ酸からのdNTPプールの不十分な生成は、hIPSC中の複製ストレス、DNA損傷、及びゲノム不安定性の重大な原因である、そして2)hIPSCがDNPに加えて、第2のdNTP生合成回路、ヌクレオシドサルベージ経路(NSP)を用いることも可能にすることで、複製ストレス、DNA損傷、及びゲノム不安定性を軽減するであろう、ということである。実例となる実施形態において、NSPの利用を可能にすることが、NSPのデオキシヌクレオシド(dN)基質の混合物をhIPSC培養培地に添加することで、達成された。
要約すると、ゲノム不安定性の問題に対する、簡素で、効率的である、一般的に適用可能な、かつ費用効率の高い解決手段を提供し、それは現在の方法論を用いて、生成されたhIPSCに有効である。具体的にいうと、幹細胞及びhIPSCにおけるゲノム不安定性の発生は、それらの細胞がNSPを介したdNTPの合成を可能にすることで、防ぐことができることも示している。これは、NSPのdN基質の最適化された混合物を培養培地に添加することで、達成することができる。
ヒト人工多能性幹細胞の誘導及びキャラクタリゼーション
我々は、LoxP隣接多シストロン性のリプログラミングベクター(次いで、Creリコンビナーゼを用いてゲノムから取り出した)(Sommer et al. (2010) Stem Cells 28:64−74)、または、合成mRNAを基にした手法(Warren et al. (2010) Cell Stem Cell,7:618−630)を用いて、ヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)へ成人ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)をリプログラミングした。リプログラミング後の培養は全て、現在の標準的な手法により標準的なhIPSC培養培地で実施し、任意のヌクレオシドを添加しなかった(www.stemgent.com/products/show/69. NUTRISTEM(商標) XF/FF 培養培地)。前述の通り、2つの導入遺伝子非含有のhIPSC株が、標準的なキャラクタリゼーションのパラメータを示した。(Byrne et al. (2009) PloS One 4 e7118)これらのパラメータは、胚性幹細胞(ESC)様の形態、重要な多能性マーカー(NANOG、OCT4、SSEA3、SSEA4、Tra−1−60、及びTra−1−81)の顕著な発現を含み、これは本来の皮膚線維芽細胞では検出されず(図1、パネルA)、また重症複合型免疫不全症(SCID)マウスにおいて、テラトーマ形成に続き3つの全ての胚葉について、その代表への分化を含む(図1、パネルB)。次いで、我々は前述の通り、研究用の条件(動物由来のエピトープを含む:培養培地を含むマトリゲル基質及びKnockOut血清リプレースメント、KSR)から、導入遺伝子非含有のhIPSC株を推定上の臨床グレードの動物エピトープ非含有「ゼノフリー」合成条件(CellStart(商標)基質及び、最適化されたゼノフリー培地、50%mTeSRI(商標)、Stemcell Technologies社、及び50% Nutristem、Stemgent社)へ転換した。(Karumbayaram et al. (2012) Stem Cells Trans. Med. 1: 36−43)前述の通り、2つのhIPSC株で、「臨床グレード変換」(CC)の前後両方について、核型を決定した(Byrne et al (2009) PloS One 4:e7118)。
ヒト人工多能性幹細胞の誘導及びキャラクタリゼーション
我々は、LoxP隣接多シストロン性のリプログラミングベクター(次いで、Creリコンビナーゼを用いてゲノムから取り出した)(Sommer et al. (2010) Stem Cells 28:64−74)、または、合成mRNAを基にした手法(Warren et al. (2010) Cell Stem Cell,7:618−630)を用いて、ヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)へ成人ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)をリプログラミングした。リプログラミング後の培養は全て、現在の標準的な手法により標準的なhIPSC培養培地で実施し、任意のヌクレオシドを添加しなかった(www.stemgent.com/products/show/69. NUTRISTEM(商標) XF/FF 培養培地)。前述の通り、2つの導入遺伝子非含有のhIPSC株が、標準的なキャラクタリゼーションのパラメータを示した。(Byrne et al. (2009) PloS One 4 e7118)これらのパラメータは、胚性幹細胞(ESC)様の形態、重要な多能性マーカー(NANOG、OCT4、SSEA3、SSEA4、Tra−1−60、及びTra−1−81)の顕著な発現を含み、これは本来の皮膚線維芽細胞では検出されず(図1、パネルA)、また重症複合型免疫不全症(SCID)マウスにおいて、テラトーマ形成に続き3つの全ての胚葉について、その代表への分化を含む(図1、パネルB)。次いで、我々は前述の通り、研究用の条件(動物由来のエピトープを含む:培養培地を含むマトリゲル基質及びKnockOut血清リプレースメント、KSR)から、導入遺伝子非含有のhIPSC株を推定上の臨床グレードの動物エピトープ非含有「ゼノフリー」合成条件(CellStart(商標)基質及び、最適化されたゼノフリー培地、50%mTeSRI(商標)、Stemcell Technologies社、及び50% Nutristem、Stemgent社)へ転換した。(Karumbayaram et al. (2012) Stem Cells Trans. Med. 1: 36−43)前述の通り、2つのhIPSC株で、「臨床グレード変換」(CC)の前後両方について、核型を決定した(Byrne et al (2009) PloS One 4:e7118)。
CC誘発性ストレス及び2つの株の伸長に続き、核型的に正常な状態(46XY)から、過剰染色体12を所有する状態に進んだ(図1、パネルC)。認められたゲノム不安定性は、hIPSCは特に外因性のストレス条件下に置かれた場合、遺伝子的に不安定である(Nagaria et al. (2013) Biochimica et Biophysica Acta, 1830: 2345−2353)、そして、優先的に染色体12を複製する(Draper et al. (2004) Nat. Biotechnol. 22: 53−54)ことを示した、複数の発表されている研究と密接な相関がある。以前より、hIPSCの全ての染色体は、染色体の翻訳及び複製について、同じ初期発生率を有するが、染色体12の複製は、それが起きたときに選択の過程を通して、延長されたin vitro培養に続いたhIPSC個体群の全体にわたった、優先的な伸長をもたらすということが示唆された(同上)。我々は、CC系ストレスがより長期間培養(6〜12カ月超)誘発ストレスの有用なモデルとなると考察しており、これはhIPSC及びhESC中に、特に染色体12の核型異常の蓄積を引き起こす傾向もあるものであり、我々は2カ月間にわたって下記のCC系ストレスを観察した。
hIPSC中 対 本来のHDFs中のより小さいdNTPプール
hIPSC中 対 本来のHDFs中のより小さいdNTPプール
我々は、前述の通り、本来のHDF及び初期継代の(非CCストレスの)hIPSCにおけるデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)プールを定量化した(Austin et al. (2012) J. Exp. Med., 209: 2215−2228)。我々は、hIPSCリプログラミングの後、4つの全てのdNTPのレベルにおいて、顕著な低下(32〜52%)を認めた(図2)。
dNTP生合成に含まれる遺伝子は、迅速に分裂するhIPSC及びHDFと同様のレベルで、かつ細胞分裂より遅い速度で発現する
dNTP生合成に含まれる遺伝子は、迅速に分裂するhIPSC及びHDFと同様のレベルで、かつ細胞分裂より遅い速度で発現する
HDFのアフィメトリクス社による全体的転写分析及び、誘導した初期継代hIPSC(前述の通りに実施した(Awe et al.(2013) Stem Cell Res. & Theap.,4:15))は、重要な多能性特異的マーカーの重大な増加を示し、重要な線維芽細胞特異的マーカーの発現は、hIPSCリプログラミングに伴い、減少した(表2)。ゲノム不安定性の誘発に以前関連づけられた遺伝子の増加も認めた(CCNE1、E2F2、E2F35)。しかし、重要なdNTP生合成遺伝子の発現に、有意な差異は認めなかった(表2)。hIPSCは、HDFよりも速い平均個体数倍加時間(PDT)を有しているので(18時間 対 48時間)、それらのデータは、hIPSC中の小さなdNTPプールは、1)DNA複製においてdNTPの利用を増大させるより速い速度の細胞増殖、そして2)dNTP生合成に関与する遺伝子の発現を増加させることは不可能であるということ、に起因し得るという、我々の仮説を支持するものである。
hIPSC 対 HDF中のDNA損傷の上昇値:dN添加は、hIPSC中のDNA損傷を軽減する
我々は、前述の通りHDF中及び初期継代のhIPSCの二重鎖の分解(DSB)数を見積もるために、ガンマ−ヒストン2A.X(γH2A.X)染色を利用した (Bester et al. (2011) Cell, 145: 435−446)。γH2A.X陽性巣が、本来のHDF中よりもhIPSC中でより顕著に多く検出された。我々は、4日間のdN添加後に、より顕著に減少したγH2A.X陽性巣も認めた(図3A、中央と下のパネルの比較)。この発見は、hIPSCは、皮膚線維芽細胞より高レベルなゲノム不安定性を示し、ゲノム不安定性は、細胞培養培地のdN添加により妨げられ得る、という仮説へのさらなる支持を提供するものである。我々は、hIPSC個体群の中に、γH2A.X陽性巣の数において、顕著な不均質性も認め、ゲノム不安定性の発生率は、hIPSC個体群で一様でなく、hIPSCの亜個体群は、γH2A.X染色でアッセイされるように、さらなるゲノムのDNA損傷を招く傾向が強く、従って、核型異常の発生に最も影響されやすい細胞を示す、という我々の仮説も認めるものである。
我々は、前述の通りHDF中及び初期継代のhIPSCの二重鎖の分解(DSB)数を見積もるために、ガンマ−ヒストン2A.X(γH2A.X)染色を利用した (Bester et al. (2011) Cell, 145: 435−446)。γH2A.X陽性巣が、本来のHDF中よりもhIPSC中でより顕著に多く検出された。我々は、4日間のdN添加後に、より顕著に減少したγH2A.X陽性巣も認めた(図3A、中央と下のパネルの比較)。この発見は、hIPSCは、皮膚線維芽細胞より高レベルなゲノム不安定性を示し、ゲノム不安定性は、細胞培養培地のdN添加により妨げられ得る、という仮説へのさらなる支持を提供するものである。我々は、hIPSC個体群の中に、γH2A.X陽性巣の数において、顕著な不均質性も認め、ゲノム不安定性の発生率は、hIPSC個体群で一様でなく、hIPSCの亜個体群は、γH2A.X染色でアッセイされるように、さらなるゲノムのDNA損傷を招く傾向が強く、従って、核型異常の発生に最も影響されやすい細胞を示す、という我々の仮説も認めるものである。
dN添加は、CC系ストレス後のhIPSCゲノム安定性を促進する
我々は、dN添加がCC系ストレス中にゲノム不安定性が認められることを防ぐことができるかどうかを調査するために、dN有り無し両方の条件下でhIPSCを培養した。hIPSCは、培養がリプログラムしたり、延長されたりする間に、ゲノム損傷を蓄積していることを示している(Ben−David et al. (2010) Cell Cycle (Georgetown, Tex.) 9: 4603−4604)一方、我々は、CCを実施した細胞にストレスを加えたときに、2つの独立したhIPSC株中に、最も激しいゲノム損傷(核型異常)を認めた、ということに注目するべきである。この観察は、比較的短期間(2カ月)にわたる重大なゲノム損傷を誘導するために、迅速かつ一貫した実験的試みを提供する。ヒトiPSCは、初めにmTeSRI(Stemcell Technologies社)及びNutriStem(Stemgent社)を組み合わせたマトリゲルで培養された。次いで、細胞培養培地に外因的に供給されたdNの有無で成長させた、2つのグループに分割した(各dNを30μM)。1週間添加後、ゼノフリー条件への変換工程を開始した、この変換工程は、基底膜及びNutriStem培地のみのものとして、CellStartへの切り替えを伴うものである。2週間の培養後、ゲノムDNA(gDNA)は、一塩基多型(SNP)系の異型接合性の欠損(LOH)分析のために抽出し、これはDSB系のゲノム不安定性の正確な指標であることが、前に示されている(Bester et al. (2011) Cell, 145: 435−446)。2つの条件(+/−dN)間のLOHのレベルを判定するために、前述の通り、アフィメトリクス社のSNP 6.0 アレイを用いて分析を実施した(同上)。dNの添加により、ゲノム不安定性の発生率が、LOHでアッセイしたところ、添加していない培地上で認められるものの20%に低減した(図4)。4日間のdN添加後のγH2A.X陽性巣の顕著な減少に加えて(図3A及び3B)、LOHの減少は、dN添加がhIPSCリプログラミング及び培養における、複製ストレス及びそれに関連するゲノム不安定性を軽減する、という我々の仮説を支持する証拠を提供する。
我々は、dN添加がCC系ストレス中にゲノム不安定性が認められることを防ぐことができるかどうかを調査するために、dN有り無し両方の条件下でhIPSCを培養した。hIPSCは、培養がリプログラムしたり、延長されたりする間に、ゲノム損傷を蓄積していることを示している(Ben−David et al. (2010) Cell Cycle (Georgetown, Tex.) 9: 4603−4604)一方、我々は、CCを実施した細胞にストレスを加えたときに、2つの独立したhIPSC株中に、最も激しいゲノム損傷(核型異常)を認めた、ということに注目するべきである。この観察は、比較的短期間(2カ月)にわたる重大なゲノム損傷を誘導するために、迅速かつ一貫した実験的試みを提供する。ヒトiPSCは、初めにmTeSRI(Stemcell Technologies社)及びNutriStem(Stemgent社)を組み合わせたマトリゲルで培養された。次いで、細胞培養培地に外因的に供給されたdNの有無で成長させた、2つのグループに分割した(各dNを30μM)。1週間添加後、ゼノフリー条件への変換工程を開始した、この変換工程は、基底膜及びNutriStem培地のみのものとして、CellStartへの切り替えを伴うものである。2週間の培養後、ゲノムDNA(gDNA)は、一塩基多型(SNP)系の異型接合性の欠損(LOH)分析のために抽出し、これはDSB系のゲノム不安定性の正確な指標であることが、前に示されている(Bester et al. (2011) Cell, 145: 435−446)。2つの条件(+/−dN)間のLOHのレベルを判定するために、前述の通り、アフィメトリクス社のSNP 6.0 アレイを用いて分析を実施した(同上)。dNの添加により、ゲノム不安定性の発生率が、LOHでアッセイしたところ、添加していない培地上で認められるものの20%に低減した(図4)。4日間のdN添加後のγH2A.X陽性巣の顕著な減少に加えて(図3A及び3B)、LOHの減少は、dN添加がhIPSCリプログラミング及び培養における、複製ストレス及びそれに関連するゲノム不安定性を軽減する、という我々の仮説を支持する証拠を提供する。
これまでの研究で、ゲノム不安定性をアッセイする定量化できる方法として、SNP系LOH測定の価値を強調する、DSBの発生とヒトがん細胞(同上)におけるLOHの相関関係を証明してきたことに、留意すべきである。dN添加有りと無しでのCCストレスのhIPSCにおける我々の研究において、CC誘発性ストレスに続く、LOHの軽減によってアッセイしたところ、ゲノム安定性が5倍増大したことを認めた。このことは、図4で見ることができ、12LOH染色体座が、CC系ストレス後に確認された。dN処理をしたhIPSC(赤の矢印で確認される)で認められたものより、ゲノム損傷を示す5倍のLOH遺伝子座が、未処理のhIPSC(緑の矢印で確認される)で認められた。このことは、dN添加がhIPSCにおけるCC誘発性のゲノム不安定性を改善することができる、という我々の仮説を支持する、強力な証拠を提供するものである。しかし、LOH遺伝子座(青の矢印で確認される通り)の半分が、dN処理と未処理の両方のサンプル中で、依然として不安定なままであった。
有効性が証明された一方で、dN添加の手順は、さらに最適化され得ると考えられる。これまでに生成されたデータは、我々及び他の研究者らが、一般的な培養及び導入ストレス後にhIPSC中に観察してきたゲノム不安定性において、dNTPプールの欠乏が重要な意味を担う、という仮説を支持する。
また、我々の予備的データは、臨床グレードのhIPSC及びその誘導体のゲノム安定性を向上するために、簡素かつ一般的に適用可能な培養培地のデオキシリボヌクレオシド添加の手順も提案する。
要約すると、遺伝子的に安定な幹細胞及びhIPSC及び誘導体を維持することが可能な、当該最適化された培地システムを確立することが、安全性に役立ち、個別化された多能性幹細胞系治療学の有望な将来を患者のために開くであろう。
実施例2
安定した幹dN濃度の入手
我々は、複数の異なるSTABLESTEM(商標)濃度、1つは短期間培養(各dNを30μM)向け、1つは長期間培養(各dNを5μM)向け、ならびにゲノム安定性を向上し、細胞機能を増大し、多細胞型を超えた分化の可能性の改善に強力であることを証明してきた好適な30:30:5:5混合物も、獲得してきた(例えば、表3を参照のこと)。
安定した幹dN濃度の入手
我々は、複数の異なるSTABLESTEM(商標)濃度、1つは短期間培養(各dNを30μM)向け、1つは長期間培養(各dNを5μM)向け、ならびにゲノム安定性を向上し、細胞機能を増大し、多細胞型を超えた分化の可能性の改善に強力であることを証明してきた好適な30:30:5:5混合物も、獲得してきた(例えば、表3を参照のこと)。
長期間のSTABLESTEM(商標)培養培地添加は、ヒトiPS細胞が、少なくとも3週間分化することを可能にし、一方では、細胞が暴露されるゲノム損傷の量を劇的に軽減する(図7)。これは、γH2A.X陽性の二重鎖の分解によって測定される。hIPSCリプログラミング及び培養の間のゲノム不安定性の原因は、不明瞭なままである。しかし、我々は迅速に分割するhIPSC中のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)プールは、hIPSCが由来する、皮膚細胞のdNTPプールよりも顕著に小さいということを最近見いだした。さらに、我々はデオキシリボヌクレオシド(dN)を幹細胞培養培地に添加することは、dNTPプールを顕著に救出することが可能である、ということを見いだした(図6)。
本明細書に記載されている実施例及び実施形態は、例証に過ぎず、その範囲内での種々の改良または変更は、当業者に対して示唆され、また、本出願の趣旨及び範囲内に、そして、添付された請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが、理解される。本明細書に引用した全ての出版物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のためにそれらの全てを参照することにより組み込まれる。
Claims (87)
- 改善された遺伝的安定性を備えた幹細胞の培養のための細胞培養培地であって、前記培養培地は、
幹細胞用の基本の培養培地を含み、前記培養培地には、1種もしくは複数種のヌクレオシド三リン酸、またはそれらの1種もしくは複数種の前駆体が添加される、培養培地。 - 体細胞または幹細胞の遺伝的安定性を改善する、ヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地であって、前記培地は、
美容または医薬品の送達担体、及び
1種または複数種のヌクレオシド三リン酸またはそれらの前駆体を含む、培地。 - 前記1種または複数種のヌクレオシド三リン酸が、独立にデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(NCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、デオキシウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、シチジン三リン酸(CTP)、5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)、及びウリジン三リン酸(UTP)からなる群から選択される、請求項1に記載の細胞培養培地、または請求項2に記載のヌクレオシド混合物伝達培地。
- 前記1種または複数種のヌクレオシド三リン酸は、独立にデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(NCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、及びデオキシウリジン三リン酸からなる群から選択される、請求項1に記載の細胞培養培地、または請求項2に記載のヌクレオシド混合物伝達培地。
- 前記1種または複数種のヌクレオシド三リン酸は、独立にアデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、シチジン三リン酸(CTP)、5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)、及びウリジン三リン酸(UTP)からなる群から選択される、請求項1に記載の細胞培養培地、または請求項2に記載のヌクレオシド混合物伝達培地。
- 前記培養培地には、独立にデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(NCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、デオキシウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、シチジン三リン酸(CTP)、5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)、及びウリジン三リン酸(UTP)からなる群から選択される、ヌクレオシド三リン酸の前記1種または複数種の前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれらを含む、請求項1及び3〜5のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜5のいずれか1項に記載のヌクレオシド混合物伝達培地。
- ヌクレオシド三リン酸の前記1種または複数種の前駆体が、独立にデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(NCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、及びデオキシウリジン三リン酸からなる群から選択される、請求項6に記載の細胞培養またはNCT培地。
- ヌクレオシド三リン酸の前記1種または複数種の前駆体が、独立にアデノシン三リン酸(ATP)、グアノシン三リン酸(GTP)、シチジン三リン酸(CTP)、5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)、及びウリジン三リン酸(UTP)からなる群から選択される、請求項6に記載の細胞培養またはNCT培地。
- 前記培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸(dATP)、またはその前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項1及び3〜8のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項3〜8のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項9に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、デオキシアデノシン三リン酸の前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項9に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- デオキシアデノシン三リン酸の前記前駆体が、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシアデノシン、及びアデニンからなる群から選択される、請求項11に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)またはその前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項1及び3〜12のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜12のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記細胞培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項13に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記細胞培養培地には、デオキシグアノシン三リン酸の前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項13の細胞培養培地またはNCT培地。
- デオキシグアノシン三リン酸の前記前駆体が、デオキシグアノシン二リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシグアノシン、及びグアニンからなる群から選択される、請求項15に記載の細胞培養またはNCT培地。
- 前記培養培地には、デオキシシチジン三リン酸(NCTP)、またはその前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項1または3〜16のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜16のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記細胞培養培地には、デオキシシチジン三リン酸が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項17に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記細胞培養培地には、デオキシシチジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項17に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- デオキシシチジンの前駆体が、デオキシシチジン二リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン、及びシトシンからなる群から選択される、請求項19に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)、またはその前駆体が添加される、または前記NCTがそれを含む、請求項1及び3〜20のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜20のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記培養培地には、デオキシチミジン三リン酸が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項20に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、デオキシチミジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項20に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- デオキシチミジン三リン酸の前記前駆体が、デオキシチミジン二リン酸、デオキシチミジン一リン酸、デオキシチミジン、及びチミンからなる群から選択される、請求項23に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養またはNCT培地には、デオキシウリジン三リン酸、またはその前駆体が添加される、請求項1及び3〜24のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜24のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記培養培地には、デオキシウリジン三リン酸が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項25に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、デオキシウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項25に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- デオキシウリジン三リン酸の前記前駆体が、デオキシウリジン二リン酸、デオキシウリジン一リン酸、デオキシウリジン、及びウラシルからなる群から選択される、請求項27に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養またはNCT培地には、アデノシン三リン酸(ATP)、またはその前駆体が添加される、請求項1及び3〜28のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜28のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記培養培地には、アデノシン三リン酸(ATP)が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項29に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、アデノシン三リン酸の前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項29に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- アデノシン三リン酸(ATP)の前記前駆体が、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸、アデノシン、及びアデニンからなる群から選択される、請求項31に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、グアノシン三リン酸(GTP)、またはその前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項1及び3〜32のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜32のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記培養培地には、グアノシン三リン酸(GTP)が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項33に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、グアノシン三リン酸の前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項33に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- グアノシン三リン酸の前記前駆体が、グアノシン二リン酸、グアノシン一リン酸、グアノシン、及びグアニンからなる群から選択される、請求項35に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記細胞培養培地には、シチジン三リン酸(CTP)またはその前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項1及び3〜36のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜36のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記培養培地には、シチジン三リン酸が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項37に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、シチジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項37に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- シチジン三リン酸の前記前駆体が、シチジン二リン酸、シチジン一リン酸、シチジン、及びシトシンからなる群から選択される、請求項39に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養またはNCT培地には、5−メチルウリジン三リン酸(m5UTP)またはその前駆体が添加される、請求項1及び3〜40のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜40のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記培養培地には、5−メチルウリジン三リン酸が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項41に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、5−メチルウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項41に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 5−メチルウリジン三リン酸の前記前駆体が、5−メチルウリジン二リン酸、5−メチルウリジン一リン酸、5−メチルウリジン、及びチミンからなる群から選択される、請求項43に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、ウリジン三リン酸(UTP)、またはその前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項1及び3〜44のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜44のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記培養培地には、ウリジン三リン酸が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項45に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地には、ウリジン三リン酸の前駆体が添加される、または前記NCT培地がそれを含む、請求項45に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- ウリジン三リン酸の前駆体が、ウリジン二リン酸、ウリジン一リン酸、ウリジン、及びウラシルからなる群から選択される、請求項47に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記NCT培地が、皮下投与、非経口投与、局所的投与、経口投与、経鼻または吸入による投与、塗布、噴霧、または経皮的などの局所的な投与からなる群から選択される経路を経た投与のために作成された担体を含む、請求項2〜48のいずれか1項に記載のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地。
- 前記NCT培地が、局所的投与、皮下投与または皮内投与のために作成された担体を含む、請求項2〜48のいずれか1項に記載のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地。
- 前記培地が、泥、ハーブ調合物、油脂、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、及びコンディショナーからなる群から選択される担体中に作成される、請求項50に記載のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地。
- 前記培地が、クリーム(例えば美顔クリーム)として作成される、請求項50に記載のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地。
- 前記培地が、しわ取りクリーム、皮膚充填剤、瘢痕低減クリーム、及びにきび治療薬からなる群から選択される製剤を含む、請求項56〜58のいずれか1項に記載のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地。
- 前記培養培地に添加される、または前記NCT培地を構成する、前記ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体によって添加されない同様の培地において培養された同様の細胞と比較すると、短期間及び/または長期間における幹細胞の遺伝的安定性を改善するために十分な濃度で存在している、請求項1及び3〜48のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜53のいずれか1項に記載のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地。
- 前記幹細胞が、体細胞からなる群から選択される幹細胞である、請求項54に記載の細胞培養培地またはヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地。
- 前記培養培地に添加される、または前記NCT培地を構成する、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、約1μMから約50μMまで、または約1μMから約40μMまで、または約1μMから約35μMまで、または約1μMから約30μMまでの範囲の濃度で存在する、請求項1、3〜48、及び54〜55のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜55のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記培養培地に添加される、または前記NCT培地を構成する、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、約50μM以下、または約40μM、または約30μM以下、または約25μM以下、または約20μM以下、または約15μM以下、または約10μM以下、または約5μM以下の、開始(ストック)または最終(外因性送達)濃度である、請求項1、3〜48、及び54〜55のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜55のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記培養培地に添加される、または前記NCT培地を構成する、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、約5μMから約30μMの範囲の、開始(ストック)または最終(外因性送達)濃度で存在している、請求項57に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地に添加される、または前記NCT培地を構成する、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、約30μMの開始(ストック)または最終(外因性送達)濃度で存在している、請求項57に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記培養培地に添加される、または前記NCT培地を構成する、各ヌクレオシド三リン酸またはその前駆体が、約5μMの開始(ストック)または最終(外因性送達)濃度で存在している、請求項57に記載の細胞培養培地またはNCT培地。
- 前記細胞培養培地または前記NCT培地が、異種の病原体を保有しない、請求項1、3〜48、及び54〜60のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜60のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記細胞培養培地または前記NCT培地が、動物またはヒト由来の血清アルブミンを備えない、請求項1、3〜48、及び54〜61のいずれか1項に記載の細胞培養培地、または請求項2〜61のいずれか1項に記載のNCT培地。
- 前記添加された培地が、DMEM(ダルベッコ変法イーグル培地)、MEM(最小必須培地)、BME(イーグル基礎培地)、RPMI 1640、DMEM/F−12(ダルベッコ変法イーグル培地:栄養混合物F−12)、DMEM/F−10(ダルベッコ変法イーグル培地:栄養混合物F−10)、α−MEM(α−最小必須培地)、G−GEM(グラスコー最小必須培地)、IMDM(イスコブ変法ダルベッコ培地)、essential8(E8)培地、及びKnockOut DMEMからなる群から選択される、請求項1、3〜48、及び54〜62のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
- 前記基本培地がDMEM/F12である、請求項63に記載の細胞培養培地。
- 前記NCT培地が、前記担体及び請求項1、3〜48、55〜64のいずれか1項に記載の細胞培養培地を含む、請求項2に記載のヌクレオシド混合物伝達(NCT)培地。
- 体細胞培養もしくは幹細胞培養、またはヌクレオシド混合物伝達(NCT)培養であって、前記細胞培養が、請求項1、3〜48、及び55〜64のいずれか1項に記載の細胞培養培地中の細胞を含む、または請求項2〜62、及び65のいずれか1項に記載のNCT培地中の細胞を含む、体細胞培養もしくは幹細胞培養、またはヌクレオシド混合物伝達(NCT)培養。
- 前記体細胞または前記幹細胞が、体細胞または幹細胞からなる群から選択される細胞である、請求項66に記載の細胞培養またはNCT培養。
- 前記細胞が幹細胞を含む、請求項66に記載の細胞培養またはNCT培養。
- 前記幹細胞が、神経幹細胞、肝幹細胞、造血幹細胞、臍帯血幹細胞、表皮幹細胞、消化管幹細胞、内皮幹細胞、筋肉幹細胞、間葉幹細胞、及び膵臓幹細胞を含むがこれらに限定されない、胚性幹細胞及び成体幹細胞からなる群から選択される、請求項68に記載の細胞培養またはNCT培養。
- 前記細胞が、人工多能性幹細胞(IPSC)である、請求項68に記載の細胞培養またはNCT培養。
- 前記IPSCが、線維芽細胞、神経幹細胞、胃の細胞、肝細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、羊膜細胞、血液細胞、β細胞、及び脂肪細胞からなる群から選択される細胞からリプログラミングされる、請求項70に記載の細胞培養またはNCT培養。
- 前記IPSCが、KLF4(K)、LIN28(L)、c−MYC(M)、NANOG(N)、OCT4(O)、SOX2(S)、及びバルプロ酸(VPA)からなる群から選択される、2種またはそれ以上の因子をリプログラミングされた細胞を含む、請求項70または71に記載の細胞培養またはNCT培養。
- 前記IPSCが、4つの基準となる山中因子であるKLF4(K)、c−MYC(M)、OCT4(O)、及びSOX2(S)を用いてリプログラミングされた細胞を含む、請求項72に記載の細胞培養またはNCT培養。
- 前記リプログラミング因子が、さらにLIN28を含む、請求項73に記載の細胞培養またはNCT培養。
- 前記IPSCが、組み込み型ベクター、非組み込み型ベクター、除去可能ベクター及び、DNA非含有ベクターからなる群から選択されるベクターを用いてリプログラミングされる、請求項70〜74のいずれか1項に記載の細胞培養またはNCT培養。
- 幹細胞の遺伝的不安定性を低減させる方法であって、前記方法は、請求項の請求項のいずれか1項に記載の細胞培養培地中で、請求項1、3〜48、及び55〜64のいずれか1項に記載の培養培地中で前記細胞を培養することを含む、方法。
- 自家幹細胞移入を行う方法であって、前記方法は、対象から幹細胞を単離すること、または前記対象からIPSCを作成すること、及び実施形態1、3〜48、及び55〜64のいずれか1項に記載の細胞培養培地中、または、実施形態2〜62、及び65のいずれか1項に記載のNCT培地中において、前記幹細胞またはIPSCを増大すること及び/または培養することを含む、方法。
- 組織の再生及び/または維持を促進するための方法であって、前記方法は、請求項2〜62、及び65のいずれか1項に記載のNCT培地を、対象に投与することを含む、方法。
- 前記NCT培地が、皮下投与、非経口投与、局所的投与、経口投与、経鼻または吸入による投与、塗布、噴霧、または経皮的などの局所的な投与からなる群から選択される経路を経た投与のために作成された担体を含む、請求項78に記載の方法。
- 前記NCT培地が、局所的投与、皮下投与、または皮内投与のために作成された担体を含む、請求項78に記載の方法。
- 前記NCT培地が、泥、ハーブ調合物、油脂、エマルション、ローション、クリーム、ゲル、生物製剤、溶液、スプレー、軟膏、フォーム、ムース、液体、懸濁液、分散剤、噴霧剤、石けん、シャンプー、及びコンディショナーからなる群から選択される担体中に作成される、請求項80に記載の方法。
- 前記NCT培地が、クリーム(例えば美顔クリーム)として作成される、請求項80に記載の方法。
- 前記NCT培地が、しわ取りクリーム、皮膚充填剤、瘢痕低減クリーム、及びにきび治療薬からなる群から選択される製剤を含む、請求項80に記載の方法。
- 前記NCTが、ヒトの皮膚に適用される、請求項78〜83のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NCTが、瘢痕を減らすために適用される、請求項84に記載の方法。
- 前記NCTが、しわを減らすために適用される、請求項84に記載の方法。
- 前記NCTが、細胞組織の量を増大させるために、皮内または皮下に適用される、請求項78〜83のいずれか1項に記載の方法。
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