KR20160062522A - 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

유청 분말과 수용성 아연 또는 칼슘 분말을 혼합한 혼합 분말에 물을 혼합하여 가열처리한 유기태화 아연 강화 유단백질 또는 유기태화 칼슘 강화 유단백질은 단순히 미네랄의 생체 이용율을 증진시킬 뿐만 아니라, 이들 중 하나를 경구 투여함으로써, 혈액 내에서 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 단핵구(monocyte) 등과 같은 병원성 미생물의 침입에 1차적으로 저항하는 면역세포 및 자연살해(NK) 세포의 수를 증대시키고, 혈액 또는 림프절에서 CD4 양성인 TH 세포(helper T-cell)와 CD8 양성인 TC 세포(cytotoxic T-cell)의 수를 증진시키며, 활성화된 대식세포(activated macrophage)에서 분비되는 면역 관련 사이토카인인 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 인터류킨-1β(IL-1β)의 분비를 증진시켜 면역 증강 활성을 나타내므로, 면역 증강용 식품 조성물 또는 면역 증강용 약학 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다

Description

유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물 및 그 제조방법{Composition for enhancing immune activity comprising milk protein with high content of organic zinc or calcium as an active ingredient and preparation method thereof}
본 발명은 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물에 관한 것으로, 상기 면역 증강용 조성물은 면역 증강용 식품 조성물 또는 면역 증강용 약학 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다.
한국등록특허 제1025272호는 가수분해 세리신 및 이와 결합된 미네랄을 포함하는 칼슘, 철분, 셀레늄, 아연 등의 유기태화 미네랄의 생체 이용율이 무기태 미네랄에 비해 현저히 우수함을 개시하고 있다.
또한 한국등록특허 제1306931호는 살균처리되지 않은 유청과 수용성 칼슘을 혼합하여 가열처리한 유기태화 칼슘 강화 유단백질이 생체 이용율이 뛰어나 골다공증 예방 및 치료 효과를 나타냄을 개시하고 있다.
그러나 유청 분말과 수용성 아연 또는 칼슘 분말을 혼합한 후 가열처리하여 제조한 본 발명의 유기태화 아연 강화 유단백질 또는 유기태화 칼슘 강화 유단백질이 단순히 미네랄의 생체 이용율을 증진시키는 것뿐만 아니라, 이들 중 하나를 경구 투여함으로써, 혈액 내에서 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 단핵구(monocyte) 등과 같은 병원성 미생물의 침입에 1차적으로 저항하는 면역세포 및 자연살해(NK) 세포의 수를 증대시키고, 혈액 또는 림프절에서 CD4 양성인 TH 세포(helper T-cell)와 CD8 양성인 TC 세포(cytotoxic T-cell)의 수를 증진시키며, 활성화된 대식세포(activated macrophage)에서 분비되는 면역 관련 사이토카인인 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 인터류킨-1β(IL-1β)의 분비를 증진시켜 면역 증강 활성을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 면역증강 활성을 갖는 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유청 분말과 수용성 아연 또는 칼슘 분말을 혼합한 혼합 분말에 물을 첨가하고 70 내지 100 ℃에서 10 분 내지 40 시간 가열처리하여 제조한 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.
상기 유청 분말은 비탈염 유청 분말 또는 탈염 유청 분말일 수 있다.
상기 수용성 아연 또는 칼슘 분말은 아연 또는 칼슘의 황산염 또는 염화물일 수 있다.
상기 면역 증강용 조성물은 면역 증강용 식품 조성물 또는 면역 증강용 약학 조성물일 수 있다.
또한 본 발명은 유청 분말과 수용성 아연 또는 칼슘 분말을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합 분말에 물을 첨가하여 70 내지 100 ℃에서 10 분 내지 40 시간 가열처리하는 단계;를 포함하는 면역증강 활성을 갖는 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질은 혈액 내에서 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 단핵구(monocyte) 등과 같은 병원성 미생물의 침입에 1차적으로 저항하는 면역세포 및 자연살해(NK) 세포의 수를 증대시키고, 혈액 또는 림프절에서 CD4 양성인 TH 세포(helper T-cell)와 CD8 양성인 TC 세포(cytotoxic T-cell)의 수를 증진시키며, 활성화된 대식세포(activated macrophage)에서 분비되는 면역 관련 사이토카인인 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 인터류킨-1β(IL-1β)의 분비를 증진시켜 면역 증강 활성을 나타낸다.
도 1a는 유기태화 칼슘 강화 유단백질(Ca-WPS)를 투여한 마우스의 혈액에서 대식세포, 호중구 및 단핵구 분포를 유세포분석기(FACS)로 확인한 그래프이다.
도 1b는 유기태화 칼슘 강화 유단백질(Ca-WPS)를 투여한 마우스의 혈액에서 CD8 T세포의 분포를 유세포분석기(FACS)로 확인한 그래프이다.
도 1c는 유기태화 칼슘 강화 유단백질(Ca-WPS)를 투여한 마우스의 혈액에서 CD4 T세포의 분포를 유세포분석기(FACS)로 확인한 그래프이다.
도 1d는 유기태화 칼슘 강화 유단백질(Ca-WPS)를 투여한 마우스의 혈액에서 NK세포 및 NKT세포 분포를 유세포분석기(FACS)로 확인한 그래프이다.
도 1e는 유기태화 칼슘 강화 유단백질(Ca-WPS)를 투여한 마우스의 림프절에서 대식세포, 호중구 및 단핵구 분포를 유세포분석기(FACS)로 확인한 그래프이다.
도 1f는 유기태화 칼슘 강화 유단백질(Ca-WPS)를 투여한 마우스의 대식세포에서 발현하는 사이토카인인 TNF-a와 IL-1b의 분비량을 무기 칼슘 및 유청 분말(WPS)과 비교한 그래프이다.
도 2a는 유기태화 아연 강화 유단백질(Zn-WPS)를 투여한 마우스의 혈액에서 대식세포, 호중구 및 단핵구 분포를 유세포분석기(FACS)로 확인한 그래프이다.
도 2b는 유기태화 아연 강화 유단백질(Zn-WPS)를 투여한 마우스의 혈액에서 NK세포 및 NKT세포 분포를 유세포분석기(FACS)로 확인한 그래프이다.
도 2c는 유기태화 아연 강화 유단백질(Zn-WPS)를 투여한 마우스의 림프절에서 대식세포, 호중구 및 단핵구 분포를 유세포분석기(FACS)로 확인한 그래프이다.
도 2d는 유기태화 아연 강화 유단백질(Zn-WPS)를 투여한 마우스의 림프절에서 CD8 T세포의 분포를 유세포분석기(FACS)로 확인한 그래프이다.
도 2e는 유기태화 아연 강화 유단백질(Zn-WPS)를 투여한 마우스의 림프절에서 CD4 T세포의 분포를 유세포분석기(FACS)로 확인한 그래프이다.
도 2f는 유기태화 아연 강화 유단백질(Zn-WPS)를 투여한 마우스의 대식세포에서 발현하는 사이토카인인 TNF-a와 IL-1b의 분비량을 무기 아연 및 유청 분말(WPS)과 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 유청 분말과 수용성 아연 또는 칼슘 분말을 혼합한 혼합 분말에 물을 첨가하고 70 내지 100 ℃에서 10 분 내지 40 시간 가열처리하여 제조한 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이고, 또한 본 발명은 유청 분말과 수용성 아연 또는 칼슘 분말을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합 분말에 물을 첨가하여 70 내지 100 ℃에서 10 분 내지 40 시간 가열처리하는 단계;를 포함하는 면역증강 활성을 갖는 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질의 제조방법에 관한 것이다.
상기 유청 분말은 비탈염 유청 분말 또는 탈염 유청 분말일 수 있다. 상기 유청 분말의 유단백 함량은 10 내지 20 중량%이다. 예를 들어, 원료의 종류, 제조방법 및 제조사에 따라 유단백 함량은 변화할 수 있으나, 일반적으로 비탈염 유청 분말은 12 내지 15 중량%, 탈염 유청 분말은 14 내지 17 중량%의 유단백을 포함한다.
상기 수용성 아연 또는 칼슘 분말은 아연 또는 칼슘의 황산염 또는 염화물일 수 있다. 예를 들어 수용성 아연 분말은 황산아연 분말, 수용성 칼슘 분말은 염화칼슘 분말일 수 있다.
상기 수용성 아연 또는 칼슘 분말로 염화물 또는 황산염을 사용하는 경우 유기태화 아연 또는 칼슘이 증가함에 따라 염소 이온 또는 황산 이온의 함량이 증가한다. 이러한 증가된 염소 이온 또는 황산 이온은 물로 세척하는 공정으로 간단히 제거될 수 있다. 예를 들어 황산아연를 용해하기 위해 사용된 물의 부피의 0.5 내지 10 배의 물, 바람직하게는 1 내지 2 배의 물을 사용하여 1 내지 5회 반복 세척을 통해 황산 이온의 농도를 무해한 수준으로 낮출 수 있다. 상기 세척은 적절한 양의 물을 첨가한 후 원심분리하여 상등액을 제거하는 방식, 예를 들어 500 내지 50,000 rpm에서 1 내지 60 분 원심분리할 수 있고, 이러한 원심분리과정은 온도 조건 설정없이 실온에서 수행될 수 있으나, 25 ℃ 이하로 온도를 일정하게 설정하여 수행될 수 있다.
상기 유청 분말과 수용성 아연 또는 칼슘 분말의 혼합 비율은 제조하려는 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질에서의 유기태화 아연 또는 유기태화 칼슘의 함량에 따라 그 함량을 조절할 수 있다. 예를 들어 유청 분말 100 중량부에 대하여, 수용성 아연 또는 칼슘 분말을 1 내지 100 중량부 혼합할 수 있다.
상기 유청 분말과 수용성 아연 또는 칼슘 분말의 혼합 분말에 혼합하는 물의 양은 상기 혼합 분말을 용해시키기에 필요한 양으로 조절할 수 있고, 예들 들어 유청 분말 100 중량부에 대하여, 200 내지 1500 중량부를 혼합할 수 있다.
상기 혼합 분말에 물을 첨가한 후 5 내지 60 분 동안 100 내지 500 rpm으로 교반하여 용해시킨 후, 70 내지 100 ℃, 바람직하게는 80 내지 90 ℃에서 10 분 내지 40 시간, 바람직하게는 15 분 내지 60 분 가열하여 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질을 제조한다.
상기 면역 증강용 조성물은 면역 증강용 식품 조성물 또는 면역 증강용 약학 조성물일 수 있다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 유기태화 구리 또는 철 강화 유단백질이 면역 증강 활성을 나타내는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 면역 증강용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 면역 증강용 약학 조성물은 면역요법이 필요한 암질환 치료용 또는 백신용 면역증강제(adjuvant) 등으로 활용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 상기 약학 조성물은 유기태화 구리 또는 철 함량을 기준으로 1일 0.01 내지 200 ㎍/kg으로, 바람직하게는 구리 또는 철의 권장량을 고려하여 1 내지 20 ㎍/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 조성물은 면역 증강 활성이 필요한 노약자를 포함한 일반인은 물론 암질환자의 보조식이를 위한 식품 조성물로 이용될 수 있다.
상기 식품 조성물에서, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
상기 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
음료를 제조하는 경우 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 유기태화 미네랄의 제조
유청 분말은 락토코리아(주)의 비탈염 유청 분말(이하 'WPS'라 함, 단백질 14 중량%)을 이용하였고, 무기 미네랄은 식용이 가능한 것으로 유기태화 칼슘 제조를 위해 염화칼슘(CaCl₂·2H₂O), 유기태화 아연 제조를 위해 황산아연(ZnSO₄·5H₂O)을 이용하였다.
상기 WPS와 무기 미네랄은 5:1 중량비로 잘 섞이도록 혼합하였다. 이후 WPS 중량의 2배 중량의 증류수를 4회에 걸쳐 투입하며 격렬히 30분간 반응 후 80 ℃로 가온시켜 다시 30분간 150rpm에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 상온에서 냉각시킨 후 25 ℃에서 20분 동안 4000rpm으로 원심분리하고 상등액을 제거한 후 침전물의 약 3배 부피의 물을 투입하여 침전물을 세척하는 것을 3회 반복하였다. 세척된 침전물은 분무건조하여 분말화하였다. 각각 제조된 유기태화 칼슘 강화 유단백질은 Ca-WPS, 유기태화 아연 강화 유단백질은 Zn-WPS로 명명하였다.
실험예 1: 유기태화 미네랄 강화 유단백질의 미네랄 분석
제조예 1의 미네랄 함량을 ICP 방법을 통해 분석하여 표 1에 나타내었다.
구분 WPS Ca-WPS Zn-WPS
칼슘(ppm) 3,111 38,880 12,560
구리(ppm) ND 0.44 5.53
철(ppm) 1.3 25 12
아연(ppm) ND 3.55 15,190
셀렌(ppm) ND ND ND
*ND는 불검출
실험예 2: 동물실험을 통한 면역증강 효과 확인
1. 실험동물의 사육 및 군의 분류
5주령 Balb/C 수컷생쥐(ORIENTBIO Inc., Korea)를 구입하여 1주일간 순화시킨 후 체중을 측정하고 사용하였으며, 평균체중이 균등하도록 군당 5마리씩 WPS군 및 유기태화 미네랄 강화 유단백질 군으로 나누었다. 유기태화 미네랄 강화 유단백질 군은 농도별로 고농도, 중농도, 저농도로 나누었다. 사육조건으로는 3~4마리씩 사육하였으며, 온도는 20.0~25.0℃, 상대습도는 41.2~58.5%, 조도는 150~300Lux로 오전 7시부터 오후 7시까지 12시간 명암주기(조명시간)로 사육하였으며, 전남대학교 의과대학 사육가이드라인을 준수하여 사육하였다.
2. 유기태 미네랄 강화 유단백질 투여량 결정
식품의약품안전처 고시 기준에 따른 1일 미네랄 섭취량을 표 2에 나타내었다.
구분 성인(60kg 기준) 마우스(20g 기준)
칼슘 210-800 mg 70-266 ㎍
아연 3.6-12 mg 1.2-4 ㎍
상기 식약처 고시 기준을 초과하지 않는 범위에서 표 1의 유기태화 미네랄 강화 유단백질의 미네랄 함량을 고려하여 각각 고농도, 중농도, 저농도를 계산하고, 마우스 1일 섭취량은 60kg인 사람을 기준으로 kg당 섭취량을 산정한 후 마우스의 몸무게 20g을 기준으로 하루 섭취량을 역계산하여 마우스의 1일 투여량을 표 3과 같이 결정하였다.
구분 WPS Ca-WPS Zn-WPS
고농도 260 ㎍ 260 ㎍ 4 ㎍
중농도 - 168 ㎍ 2.4 ㎍
저농도 - 70 ㎍ 0.85 ㎍
3. 실험방법
1) 사료
사료는 실험동물용 고형사료(Rodent diet 2918C; Harlan Teklad, Indianapolis, IN, USA)으며, 식이와 음료는 자유급식을 하였다. 체중측정은 투여시작전과 6주 투여 후 2회 측정하였다.
2) 혈액채취 및 조직적출
각 군별로 isoflurane으로 마취하고 개복하여 복대정맥으로부터 혈액을 채취하였다. 혈액을 채취한 후 림프절을 채취하였다.
3) 혈액의 면역세포학적 분석
채취된 혈액은 500 x g에서 5분간 원심분리함으로써 혈청을 분리하고, hemacytometer를 이용하여 각각 1x106세포씩 나누어 염색하지 않은 대조군, CD3, CD122, CD8a, CD4 마커 항체로 염색하고 유세포분석기(FACSAria)를 이용하여 면역세포학적 분석을 실시하였다. 유세포분석 시 살아있는 세포를 gating하여 살아있는 세포 내 마커 항체로 염색된 세포를 측정하였다. 대식세포, 호중구 및 단핵구 분포는 염색하지 않은 시료(unstained)에서 붉은색 화살표로 나타낸 부위이다.
또한 NK세포 및 NKT세포는 염색하지 않은 시료(unstained)에 표시된 P4를 gate하여 분석하였다. NK세포는 좌측 상부면에 분포하고, NKT세포는 우측 상부면에 분포한다.
4) 림프절의 면역세포학적 분석
채취된 림프절은 100 pore size의 mesh에서 조심스럽게 으깨어 세포를 분리하였다. 분리된 세포는 원심분리 후 hemacytometer로 세포수를 확인하고 각각 1x106세포씩 나누어 염색하지 않은 대조군, CD3, CD122, CD8a, CD4 마커 항체로 염색하고 유세포분석기(FACSAria)를 이용하여 면역세포학적 분석을 실시하였다.유세포분석 시 살아있는 세포를 gating하여 살아있는 세포 내 마커 항체로 염색된 세포를 측정하였다.
5) 사이토카인 분비능 측정
무기 미네랄, WPS 및 유기태화 미네랄 강화 유단백질을 각각 경구 투여한 마우스의 복강 내 대식세포를 추출하여 배양시킨 다음 배양 상층액으로부터 분비되는 사이토카인 (IL-1β,TNF-α) 분비량을 각각 측정하였다. 비부착성 세포를 제거하고 부착성 세포만을 얻은 후, 10%-FBS RPMI 1640, 37℃, 5% CO2 incubator (Sanyo)에서 48시간 배양하였다. 배양 상층액을 분리하여 배양액에 축적된 IL-1β, TNF-α의 양을 ELISA 사이토카인 kit (R&Dsystem, USA)를 이용하여 측정하였다.
4. 실험결과
1) 혈액의 대식세포, 호중구 및 단핵구 분포
유기태화 칼슘 강화 유단백질(Ca-WPS)을 투여한 마우스의 혈액에서 macrophage, neutrophil, monocyte population을 조사한 결과 WPS만을 투여한 마우스에 비해 현저한 차이를 나타내지 않았으며, 농도별로도 차이가 없었다(도 1a).
유기태화 아연 강화 유단백질(Zn-WPS)을 투여한 마우스의 혈액에서 macrophage, neutrophil, monocyte population 을 조사한 결과 WPS만을 투여한 마우스에 비해 현저한 차이를 나타내었으며, 0.85 ㎍ 투여군보다 4 ㎍과 2.4 ㎍ 투여군에서 높게 나타났다(도 2a).
2) 혈액의 CD8 및 CD4 양성 T세포의 분포
유기태화 칼슘 강화 유단백질(Ca-WPS)을 투여한 마우스의 혈액에서 CD8+ T cell population을 조사한 결과 WPS만을 투여한 마우스에 비해 현저히 증가하였고, 다만 고농도와 저농도 투여군에서 차이는 나타나지 않았다(도 1b), CD4+ cell population을 조사한 결과에서도 WPS만을 투여한 마우스에 비해 CD4+ T cell population에서는 증가하였다(도 1c).
2) 혈액의 NK세포 분포
유기태화 칼슘 강화 유단백질(Ca-WPS)을 투여한 마우스의 혈액에서 NK세포 및 NKT세포의 분포를 조사한 결과 WPS만을 투여한 마우스에 비해 현저한 차이를 나타내지 않았으며, 농도별로도 차이가 없었다(도 1d).
유기태화 아연 강화 유단백질(Zn-WPS)를 투여한 군에서는 WPS만을 투여한 마우스에 비해 NKT cell에서는 현저한 차이를 나타내지 않았으나, NK cell population에서는 증가하였다(도 2b).
3) 림프절의 대식세포, 호중구 및 단핵구 분포
유기태화 칼슘 강화 유단백질(Ca-WPS)을 투여한 마우스의 림프절에서도 혈액과 마찬가지로 macrophage, neutrophil, monocyte population 을 조사한 결과 WPS만을 투여한 마우스에 비해 현저한 차이를 나타내지 않았다(도 1e).
유기태화 아연 강화 유단백질(Zn-WPS)를 투여한 군에서는 WPS만을 투여한 마우스에 비해 증가하였다(도 2c).
4) 림프절의 CD8 및 CD4 양성 T세포의 분포
유기태화 아연 강화 유단백질(Zn-WPS)를 투여한 군에서는 CD8+ T cell population은 WPS만을 투여한 마우스와 큰 차이가 없었으나(도 2d), CD4+ T cell population은 증가하여(도 2e), CD4/CD8 비율이 증가하였다.
5) 대식세포의 IL-1β 및 TNF-α 분비량
유기태화 칼슘 강화 유단백질(Ca-WPS)을 투여한 마우스의 대식세포에서 발현하는 사이토카인인 TNF-a와 IL-1b의 분비량을 조사한 결과, 유기태화 칼슘 강화 유단백질을 투여한 마우스가 무기 칼슘이나 WPS만을 투여한 마우스보다 사이토카인의 분비량이 증가하는 경향을 보였다(도 1f).
유기태화 아연 강화 유단백질(Zn-WPS)를 투여한 군에서 무기 아연이나 WPS만을 투여한 마우스보다 사이토카인 TNF-a와 IL-1b의 분비량이 현저히 증가하였다(도 2f).
아래에 본 발명의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하기 위한 것이다.
<제제예 1> 약학적 제제의 제조
1-1. 산제의 제조
제조예 1의 유기태화 아연 강화 유단백질 500 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
제조예 1의 유기태화 칼슘 강화 유단백질 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캅셀제의 제조
제조예 1의 유기태화 아연 강화 유단백질 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제조예2: 건강기능식품(분말형)의 제조
제조예 1의 유기태화 칼슘 강화 유단백질 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎎
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제조예 3: 건강기능식품(음료형)의 제조
제조예 1의 유기태화 아연 강화 유단백질 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
제조예 4: 건강기능식품(츄잉검)의 제조
껌베이스 20 %
설탕 76.36~76.76 %
제조예 1의 유기태화 칼슘 강화 유단백질 0.24~0.64 %
후르츠향 1 %
물 2 %
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.
제조예 5: 건강기능식품(밀가루 식품)의 제조
제조예 1의 유기태화 아연 강화 유단백질 0.5 내지 5 중량부를 밀가루 100 중량부에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제조예 6: 건강기능식품(유제품)의 제조
제조예 1의 유기태화 칼슘 강화 유단백질 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

Claims (5)

  1. 유청 분말과 수용성 아연 또는 칼슘 분말을 혼합한 혼합 분말에 물을 첨가하고 70 내지 100 ℃에서 10 분 내지 40 시간 가열처리하여 제조한 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질을 유효성분으로 하는 면역 증강용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유청 분말은 비탈염 유청 분말 또는 탈염 유청 분말인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 수용성 아연 또는 칼슘 분말은 아연 또는 칼슘의 황산염 또는 염화물인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 면역 증강용 조성물은 면역 증강용 식품 조성물 또는 면역 증강용 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 면역 증강용 조성물.
  5. 유청 분말과 수용성 아연 또는 칼슘 분말을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합 분말에 물을 첨가하여 70 내지 100 ℃에서 10 분 내지 40 시간 가열처리하는 단계;를 포함하는 면역증강 활성을 갖는 유기태화 아연 또는 칼슘 강화 유단백질의 제조방법.
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