KR20160053396A - 저온저항성 박 대목 형질전환체 및 이의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성된 애기장대 유래의 저온저항성 증진 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 박 대목 식물 세포에 형질 전환시키는 단계를 포함하는 박 대목 형질 전환체 제조방법과 이를 이용한 저온저항성 형질 전환 박 대목에 관한 것이다.
Description
본 발명은 박 대목를 형질전환 시킨 형질전환체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 저온저항성 성질을 가지는 박 대목에 대한 형질전환체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
우리나라를 포함한 극동아시아 지역에 비해 박과 채소의 접목재배가 확대되지 않은 외국에서는 접목재배 자체에 대한 연구만이 집중적으로 수행되고 있고 대목류의 생명공학적 개량에 관한 연구는 초보적 단계에 머무르고 있다. 박과 채소의 대목 중 박의 형질전환을 통한 개량에 관한 연구는 우리나라가 독보적인 수준을 유지하고 있는 것으로 판단되는데, 우리나라에서는 경북대학교 연구진을 비롯하여 국립원예특작과학원 및 농우바이오(주) 등에서 수행하고 있다. 그러나 내건성과 내한성 등을 발현하는 목표유전자의 동정에 관해서는 선진 각국이 더 활발하게 수행하고 있다고 판단된다. 특히 내건성 형질전환 작물(옥수수, 밀 등)의 경우는 Monsanto 등의 다국적 기업에서 이미 개발 완료하여 시판을 하고 있으나 우리나라에서는 외국에서 동정된 유전자 등에 관한 재산권, LMO 안전성 평가의 경험 미흡, 법규의 엄정성 및 수용에 관한 사회적 보수성 등으로 하여 LM작물의 실용화가 지지부진한 상황이다. 이러한 상황을 고려하면 한편으로는 상대적으로 미흡한 부분을 보완하는 연구를 수행하고 다른 한편으로는 본 연구에서와 같이 우리의 강점인 형질전환 작물의 개발연구를 활발히 진행할 필요가 있다고 판단된다.
학술논문-GFP 유전자를 이용한 대목용 박 형질전환(임미영 외 6명)
본 발명은 애기장대 유래 저온저항성 증진 유전자를 박 대목에 도입하여 다른 특성의 변형없이 저온저항성 박 대목 형질 전환체를 개발하고자 한다.
본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 애기장대 유래의 CBF3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 박 대목 식물 세포에 형질 전환시키는 단계를 포함하는 박 대목 형질 전환체 제조방법을 제공할 수 있다.
또한, 상기 형질 전환은 상기 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 박 대목 박 대목 체세포에 접종하여 수행되는 것인 제조방법을 제공할 수 있다.
또한, 상기 서열번호 1의 CBF3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드인 제조방법을 제공할 수 있다.
또한, 상기 박 대목 형질 전환체는 저온저항성을 나타낼 수 있는 것인 제조방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 애기장대 유래의 CBF3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 발현벡터가 도입되어 저온저항성을 가지는 박 대목 형질전환체를 제공할 수 있다.
또한, 상기 발현벡터는 도 1의 개열지도를 가지는 것인 형질 전환용 벡터를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 저온저항성 박 대목 형질전환체는 저온저항성 박 대목 춤종 개발을 위한 재료로서 활용될 수 있다.
도 1은 저온저항성을 증진시키기 위하여 삽입시킨 pBm P35sGFPHYR벡터를 나타낸 모식도이다.
도 2는 PCR을 통하여 형질전환체를 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 형질전환체의 southern 분석을 한 것이다.
도 4는 저온처리 직후 박의 모습을 나타낸 것이다.
도 5는 박의 저온처리 한 것과 저온처리하지 않은 처리 구의 파종 후50일째 생육모습을 나타낸 것이다. 각각 저온처리 구(A: 형질전환체, B: 비 형질전환체), 저온처리 하지 않은 처리구(C: 형질전환체, D: 비 형질전환체)이다.
도 6은 박의 저온저항성 검정모습을 나타낸 것이다.
도 7은 형질전환체 Nouthern 분석(Lane 1~16 형질전환체)을 한 것이다.
도 2는 PCR을 통하여 형질전환체를 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 형질전환체의 southern 분석을 한 것이다.
도 4는 저온처리 직후 박의 모습을 나타낸 것이다.
도 5는 박의 저온처리 한 것과 저온처리하지 않은 처리 구의 파종 후50일째 생육모습을 나타낸 것이다. 각각 저온처리 구(A: 형질전환체, B: 비 형질전환체), 저온처리 하지 않은 처리구(C: 형질전환체, D: 비 형질전환체)이다.
도 6은 박의 저온저항성 검정모습을 나타낸 것이다.
도 7은 형질전환체 Nouthern 분석(Lane 1~16 형질전환체)을 한 것이다.
본 발명의 일 측면은 국립원예특작과학원에 개발한 G5 순계계통에 CBF3 유전자가 도입된 pBm P35sGFPHYR벡터를 agrobacterium 방법을 이용하여 도입하였다. Southern분석을 실시하였는데, 형질전환체는 9개에서부터 1개까지 다양하게 유전자가 도입된 것을 확인할 수 있었다.
또한, 형질전환체의 저온저항성 실헙조건 8에서 5일간 처리하였을 때 저온에 식물체가 많은 영향을 받는 것을 확인하였다. 그리고 형질전환체의 저온저항성 검정을 위하여 CBF3 유전자가 도입된 형질전환체와 비 형질전환체를 5주를 8에서 5일간 저온처리하고 관찰한 결과 형질전환체는 저온처리 직 후 비형질전환체가 거의 고사한데 반해 살아있었다.
파종 후 59일째 생육상황을 살펴보면 저온처리 구에서 식물체 크기가 109.7cm, 비 형질전환체는 3,8cm였고 저온처리하지 않은 처리구에서는 형질전환체가 159.8cm, 비 형질전환체가 160.6cm로 형질전환체는 정상적인 생육을 보여 저온에 저항성을 가지고 있음을 보여주고 있다.
이하 본 발명에 대해서 보다 상세하게 설명한다.
형질전환 및 식물체 재분화
형질전화에 사용된 CBF3유전자는 C-repeat-binding factor (CBF3)/dehydration-responsiveelement-binding factor (DREB1A)로 애기장대로부터 유래한 유전자로 저온저항성 유전자로 알려져 있다.
박 형질전환을 위해 사용한 방법은 agrobacterium을 이용한 형질전환 방법을 사용하였다. 35S promoter와 35S terminator에 의해 발현이 조절되는 CBF3 유전자와 hygromycin 저항성 유전자를 가진 pBm P35sGFPHYR 벡터를 제작하여 agrobacterium EHA101 strain에 형질전환하였다. 이 균주를 rifampicin 50 mg/L, spectinomycin 50mg/L이 포함된 LB 액체배지 3 ml에 전배양 한다. 하루 동안 28에서 균을 키운 후, rifampicin 50 mg/L, spectinomycin 50mg/L이 들어간 LB 액체배지 100ml에 배양하여 O.D.값이 0.7이 될 때까지 키운다. 형질전환을 하기 위한 박 종자는 70% 에탄올과 1% 락스를 이용하여 잘 소독한 후, 종자를 파종배지 (MS 4.4g/L, sucrose 30g/L, plant agar 8g/L, pH 5.8) 에 치상한다. 파종배지에 치상하여 5일이 지난 후, 준비한 균과 함께 공동배양을 시작한다. 잘 자란 유근을 페트리디쉬에 꺼내 놓고 자엽의 상단부 2/5 정도와 유근 부위를 자른 후 둘로 쪼갠 후 표피를 벗긴다. 표피를 벗긴 절편체를 준비된 균과 함께 교반한다. 이렇게 접종된 절편체를 공동배양 배지(MS 4.4g/L, sucrose 30g/L, MES 0.5g/L, BA 3mg/L, plant agar 8g/L, acetosyringone 50uM, pH5.2) 에 치상하여 7일이 지난 후 선발배지 (MS 4.4g/L, sucrose 30g/L, MES 0.5g/L, BA 3mg/L, plant agar 8g/L, AgNO3 0.5mg/L, cefotaxime 500mg/L, hygromycin 10mg/L, pH5.8) 에 계대배양한다. 공동배양 후 한달 정도가 지난 다음 캘러스에서 shoot가 생성되면 재분화 배지 (MS 4.4g/L, sucrose 30g/L, plant agar 8g/L, cefotaxime 500mg/L, IAA 0.1mg/L, pH5.8) 에 옮겨 뿌리가 자라도록 한다. 이렇게 해서 뿌리가 자란 식물체는 다시 병 배지 (MS 4.4g/L, sucrose 30g/L, GELRITE 8g/L)에 옮겼다.
DNA 추출 및 PCR 분석
식물체가 형질전환체임을 확인하기 위하여 genomic DNA를 분리하여 PCR을 통해 확인하였다. 형질전환식물체의 잎 조직 100 mg을 액체질소를 이용하여 곱게 간 후 CTAB buffer를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다. 이렇게 추출한 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 2X TB premix (Inclone)를 사용하였으며 CBF3 specific forward primer (5`- TGT TTG GCT CCG ATT ACG AG -3`), CBF3 specific reverse primer (5`- AAA AGC ATC CCT TCT GCC AT -3`)를 사용하였다. PCR 수행조건은 94에서 7분, 94에서 30초, 58에서 45초, 72에서 45초로 40주기를 수행한 후, 추가적으로 72에서 15분 동안 반응시켜준 후 종결하였다.
Sourthern 분석
각 샘플당 40ug의 DNA를 사용하였고, 100units의 EcoRI으로 자른 후 DNA를 1% agarose gel에 0.5X TBE 용액에 30V로 17시간 running하였다. DNA는 nylon HybondTM-N+ membrane(Amersham Life science, UK)에 capillary transfer 방법으로 블롯팅하였다. 30ng의 CBF3 유전자로부터 유래한 PCR 산물 DNA는 RedyprimeIITM Random Prime labeling System(Amersham Life science, UK)을 사용하여 labeling 하였다. Hybridization과 blot 세척은 표준화된 방법에 따랐다(Sambrook et al. 1989). 표지인식을 위해서는 BAS-1800II Bio-Imaging analyzer(FUJIFILM)을 사용하였다.
Nourthern 분석
RNA 추출은 Trizol(Invitrogen)을 이용하여 박 잎으로부터 추출하였다. RNA농도는 NanoVue(GE healthcare)로 측정하였고, 각 샘플당 30ug의 RNA를 1X MOPS buffer와 6.3%(w/v) formaldehyde가 포함된 1%(w/v) agarose gel에서 100V로 40분 간 전개시켰다. RNA는 nylon HybondTM-N+ membrane(Amersham Life science, UK)에 capillary transfer 방법으로 블롯팅하였다. 이후 실험 방법은 서던 분석 방법과 동일하다.
저온저항성 검정
저온저항성 검정조건을 확립하기 위하여 박대목을 본엽이 1매가 되었을때 12시간 일장, 3, 000Lux 광조건, 8에서 1일부터 7일간 처리하였다.
형질전환체의 저온저항성 검정을 위하여 CBF3 유전자가 도입된 형질전환체와 비 형질전환체를 5주를 8에서 5일간 저온처리하고 격리온실에 재배하고 형질전환체와 비 형질전환체 5 주를 저온처리하지 않고 격리온실에 재배한 후 생육상황을 관찰하였다.
형질전환을 통한 CBF3유전자 도입
국립원예특작과학원에 개발한 G5 순계계통에 CBF3 유전자가 도입된 pBm P35sGFPHYR벡터를 사용하여 agrobacterium 방법을 이용하여 도입하였다. 형질전환체의 확인을 위해서 기내 식물체를 CBF3 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 먼저 선발하였다. 이를 도 1에 나타내었다. 선발된 식물체는 순화과정을 거쳐서 격리온실에서 재배하였으며, 유전자 도입 copy 수를 확인하기 위하여 southern분석을 실시하였는데, 형질전환체는 9개에서부터 1개 까지 다양하게 유전자가 도입된 것을 확인할 수 있었다. 이를 도 3에 나타내었다.
형질전환체의 저온저항성 정도를 조사하기 위하여 먼저 저온저항성 조건을 ?기 위한 실험을 실시하였는데, 8에서 실험한 결과 5일간 처리하였을 때 저온에 식물체가 많은 영향을 받는 것을 확인하였다. 이를 도 6에 나타내었다.
형질전환체의 저온저항성 검정을 위하여 CBF3 유전자가 도입된 형질전환체와 비 형질전환체를 5 주를 8에서 5일간 저온처리하고 관찰한 결과 형질전환체는 저온처리 직후 비 형질전환체가 거의 고사한데 반해 살아있었다. 이를 도 4를 통해 확인할 수 있다.
하기 표 1에서 보듯이 파종 후 59일째 생육상황을 살펴보면 저온처리 구에서 식물체 크기가 109.7cm, 비 형질전환체는 3,8cm였고 저온처리하지 않은 처리구에서는 형질전환체가 159.8cm, 비 형질전환체가 160.6cm로 형질전환체는 정상적인 생육을 보여 저온에 저항성을 가지고 있음을 보여주고 있다.
구 분 | 식물체 길이(cm) | 잎 넓이(cm) | 줄기두께(mm) |
저온처리 구 | |||
형질전환체 | 109.7 30.5z | 14.4 1.6 | 5.6 0.76 |
비형질전환체 | 3.8 5.4 | 2.0 2.7 | 1.5 2.15 |
무처리 구 | |||
형질전환체 | 159.8 13.2 | 16 1.3 | 6.5 0.94 |
비형질전환체 | 160.6 18.3 | 16 1.3 | 6.6 0.9 |
<110> Republic of Korea
<120> Low temperature resistance transgenic gourd and method of
producing thereof
<130> 14-0158
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 216
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBF3 protein
<400> 1
Met Ala Ser Pro Thr Ala Pro Ser Gly Met Pro Gly Ser Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ser Ser Val Ser Ser Gly Gly Ala Thr Ile Pro Thr Leu Ala Ser Ser
20 25 30
Cys Pro Leu Leu Pro Ala Gly Ala Leu Leu Pro Ala Gly Thr Ala His
35 40 45
Pro Ile Thr Ala Gly Val Ala Ala Ala Ala Ser Gly Leu Thr Val Cys
50 55 60
Gly Val Ala Gly Pro Ala Leu Leu Thr Ala Ile Thr Leu Gly Thr Pro
65 70 75 80
Gly Thr Ala Gly Met Ala Ala Ala Ala His Ala Val Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Ala Gly Ala Ser Ala Cys Leu Ala Pro Ala Ala Ser Ala Thr Ala
100 105 110
Leu Ala Ile Pro Gly Ser Thr Cys Ala Leu Ala Ile Gly Leu Ala Val
115 120 125
Ala Gly Ala Ala Leu Ala Pro Gly Ala Gly Met Cys Ala Ala Thr Thr
130 135 140
Ala His Gly Pro Ala Met Gly Gly Thr Leu Val Gly Ala Ile Thr Thr
145 150 155 160
Ala Gly Gly Ser Gly Ala Ala Pro Thr Met His Ala Gly Ala Met Pro
165 170 175
Gly Met Pro Ser Leu Leu Ala Ala Met Ala Gly Gly Met Leu Leu Pro
180 185 190
Leu Pro Ser Val Gly Thr Ala His Ala His Gly Val Ala Gly Ala Ala
195 200 205
Ala Ala Val Ser Leu Thr Ser Thr
210 215
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBF3 forward
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tgtttggctc cgattacgag 20
<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBF3 reverse
<400> 3
aaaagcatcc cttctgccat 20
Claims (6)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 애기장대 유래의 CBF3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 박 대목 식물 세포에 형질 전환시키는 단계를 포함하는 박 대목 형질 전환체 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 형질 전환은 상기 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 박 대목 체세포배에 접종하여 수행되는 것인 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 CBF3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드인 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 박 대목 형질 전환체는 저온저항성을 나타낼 수 있는 것인 제조방법. - 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 애기장대 유래의 CBF3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 발현벡터가 도입되어 저온저항성을 가지는 박 대목 형질전환체.
- 제5항에 있어서,
상기 발현벡터는 도 1의 개열지도를 가지는 것인 형질 전환용 벡터.
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KR1020140152013A KR101660383B1 (ko) | 2014-11-04 | 2014-11-04 | 저온저항성 박 대목 형질전환체 및 이의 제조 방법 |
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KR101869779B1 (ko) | 2016-10-25 | 2018-06-21 | 대한민국 | 선충저항성 박 대목 및 이의 제조방법 |
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KR100742193B1 (ko) * | 2005-06-17 | 2007-07-25 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 신규한 환경 스트레스 저항성 전사인자 및 이를 이용하여식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법 |
KR100933320B1 (ko) * | 2007-11-05 | 2009-12-22 | 주식회사 에프앤피 | AtBG1 유전자가 도입되어 환경 스트레스 저항성이향상된 형질전환 식물체 |
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KR100933320B1 (ko) * | 2007-11-05 | 2009-12-22 | 주식회사 에프앤피 | AtBG1 유전자가 도입되어 환경 스트레스 저항성이향상된 형질전환 식물체 |
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학술논문-GFP 유전자를 이용한 대목용 박 형질전환(임미영 외 6명) |
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