KR20160049096A - 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 풋마름병 방제제 및 이의 제조방법 - Google Patents

노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 풋마름병 방제제 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 풋마름병 방제제에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 추출물은 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 대하여 항균 활성을 나타내므로 상기 병원균에 의해 유발되는 토마토 풋마름병, 고추 풋마름병, 가지 풋마름병, 감자 풋마름병, 파프리카 풋마름병 및 땅콩 풋마름병 등의 식물 풋마름병을 효과적으로 방제할 수 있다.

Description

노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 풋마름병 방제제 및 이의 제조방법{A composition for antimicrobial agent to Ralstonia solanacearum with containing extract of medium cultivated Hericium erinaceum and preparation method of thereof}
본 발명은 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하여 식물병해, 바람직하게는 토마토 풋마름 병원균을 방제할 수 있는 방제 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
농원예 식물 전염성 병해의 발생 원인으로는 주로 사상균(곰팡이), 세균(박테리아) 및 바이러스 등이 있다. 이러한 병해로부터 방제하는 대표적인 방법으로는 살진균제, 살세균제, 항바이러스제 등의 농약을 투여하는 화학적 방법이 있으나, 상기와 같은 방법은 농약의 토양 잔류, 식품 잔류, 병원성 미생물의 약제 저항성 등을 발생시키며, 환경적, 사회적, 농업적으로 많은 문제점을 내포하고 있다.
최근 농약의 오남용에 따른 환경오염과 안전농산물에 대한 관심이 증가하고 있으며, 친환경 농산물의 생산은 지속적으로 성장하여 2020년에는 약 7조 원의 시장으로 확대될 전망이다. 화학농약의 대체 약제 개발, 인축 및 환경 독성 문제를 해결하기 위하여 생물 농약에 대한 국내외 시장이 확대되고 있으나 대부분 식물진균병에 치중되어 있으며 식물병원성 세균병에 대한 생물농약 등 친환경 약제 개발은 매우 미흡한 실정이다.
한편, 토마토는 재배면적이 5,850 ha로 연간 37 만톤을 생산하는 주요 과채류로 토마토 시설 및 노지재배 시 연작으로 인한 세균성 풋마름병 발생이 증가하여 피해면적이 15～25%에 이르고 있으나 현재까지 세균병에 대한 적절한 방제법이 없는 실정이다.
토마토 풋마름병균(Ralstonia solanacearum)은 토양병원균으로 뿌리나 기저부의 줄기에 생긴 상처를 통하여 침입하여 도관을 막아 푸른 채로 말라 죽게하며 우리나라에는 다양한 생리형과 병원형균이 분포하고 있다. 국내 토마토 대부분 비닐하우스에서 재배되기 때문에 발병의 빈도가 높으며 토마토 풋마름병은 토양전염성으로 감염되면 고랑을 따라 급속하게 전이되어 치료가 거의 불가능하다. 방제법으로 효과적인 전문약제가 없고 주로 저항성 품종과 예방에 의존하고 있으며 시중에 판매되는 세균병의 방제전문 농약은 항생제(마이신류)와 구리를 포한 동제로 매우 제한적이고 고가의 수입약제에 의존하며 토양 처리시 약해, 약제내성 및 환경오염 우려가 있다. 따라서 한국등록특허 제0746310호, 제0976060호, 제0995309호, 제0995311호 및 제1183538호에서는 길항 미생물인 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)를 이용한 토마토 풋마름병 방제용 친환경 미생물제제에 관한 특징을 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1330591호에서는 섬기린초 등의 식물추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 토마토 풋마름병의 생물학적으로 방제하는 방법에 관한 특징을 개시하고 있다. 그러나, 미생물농약은 토양환경에 따라 미생물의 정착과 증식이 다르기 때문에 방제효과가 차이를 보일 수 있는 단점이 있으며 식물추출물은 추출비용과 공정설비가 많이 소요되어 경제적 방제가 불가능하다는 문제점을 여전히 내포하고 있다.
본 발명의 목적은 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하여 식물병해, 바람직하게는 토마토 풋마름 병원균에 대하여 항균 활성을 가지는 식물 풋마름병 방제제 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지 유래의 식물 풋마름병 방제제 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 식물 풋마름병 방제제 조성물은 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 풋마름병 방제 조성물은 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum) 병원균에 항균 활성을 나타내므로, 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 의해 유발되는 식물병해, 예를 들어 토마토 풋마름병, 고추 풋마름병, 가지 풋마름병, 감자 풋마름병, 파프리카 풋마름병 또는 땅콩 풋마름병을 방제할 수 있다.
상기 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물은 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 아세톤 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 용매로 추출한 것 일 수 있고,
바람직하게는 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지 1 중량부에 대하여 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급알콜 중에서 선택되는 1종 또는 이들의 혼합 용매를 2 내지 5의 중량부를 첨가하여 추출한 뒤 농축하고, 상기 농축된 농축물을 에틸아세테이트 및 부탄올 중에서 선택되는 1종 이상으로 분배추출하여 얻은 분획물일 수 있으며,
또는 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지 1 중량부에 대하여 물 2 내지 5의 중량부를 첨가하여 열수 추출한 것 일 수 있다.
한편, 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물은 하기 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
1) 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)을 재배한 배지를 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 중에서 선택되는 1종 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 단계; 및
2) 상기 추출된 혼합물을 여과한 뒤 여액을 원심분리하여 상등액을 얻는 단계.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 1) 단계의 추출은 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지 1 중량부에 대하여 용매 2 내지 5 중량부를 첨가한 후, 20 내지 110 ℃에서 2 분 내지 500 분간 교반하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 2) 단계는 상등액의 용매를 제거한 후 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매와 물을 이용하여 극성이 낮은 용매에서 높은 용매 순으로 분배추출하여 분획물을 얻는 단계를 더 포함할 수 있으며,
랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 항균 활성을 나타내는 바람직한 분획물은 에틸아세테이트 또는 부탄올 분획물일 수 있다.
본 발명의 식물 풋마름병 방제 조성물은 노루궁뎅이 버섯을 재배하고 남은 배지(수확 후 배지 또는 폐 배지)로부터 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하여 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 대하여 항균 활성을 나타내므로, 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 의해 유발되는 식물 풋마름병의 방제에 효과적으로 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 식물 풋마름병 방제 조성물은 버섯 재배 후 버려지는 폐 배지를 이용하는 것으로 균 배양시설 및 추출 시스템 등의 복잡한 설비를 필요로 하지 않아 저비용으로 간단하게 제조할 수 있으며, 친환경적이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지(수확 후 배지)와 비교예에 따른 노루궁뎅이 버섯 액체배양여액을 비교한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 식물 풋마름병 방제 조성물의 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 대한 항균활성을 비교한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 식물 풋마름병 방제 조성물의 토마토 풋마름병 방제 효과를 나타낸 도이다.
도 4(A)는 본 발명에 일 실시예에 따라 제조된 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지 추출물의 식물 풋마름병 방제에 유효한 유용성 성분을 추출하기 위하여 분배 추출하는 과정을 도식화한 그래프이다. 도 4(B)는 상기 분배 추출된 분획물의 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 대한 항균활성을 비교한 도이다.
도 5(A)는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지 추출물의 부탄올 분획을 ODS 컬럼을 이용하여 HPLC로 분리하여 분석한 결과이다. 도 5(B)는 각 분획물의 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 대한 항균활성을 비교한 도이다.
도 6(A)는 ODS 컬럼을 사용하여 HPLC로 분리한 활성 분획물을 Sephadex LH-20 컬럼을 사용하여 HPLC로 2차 분리하여 분석한 결과이다. 도 6(B)는 2차 정제한 각 분획물의 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 대한 항균활성을 비교한 도이다.
도 7은 Sephadex LH-20 컬럼을 사용하여 HPLC로 2차 분리한 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 대해 항균활성을 가지는 분획물을 컬럼크로마토 그래피로 정제한 뒤 HPLC로 분석한 결과이다.
국내 버섯 재배는 대규모, 자동화시스템으로 재배되고 있으며, 병 재배와 봉지 재배가 주종을 이루고 있다. 재배된 버섯은 1차 수확한 뒤, 성장에 이용한 배지는 대부분 버려지고 있는데 일부는 퇴비의 용도로 이용되고 있다. 버섯의 재배에 이용된 폐 배지에는 균사체가 밀집되어 있으며, 다양한 효소와 2차 대산물 등이 포함되어 있다. 본 발명의 발명자들은 버섯을 재배한 폐 배지를 이용한 병원성 세균에 대한 항균성에 대하여 예의 노력한 끝에 본 발명에 따른 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하여 식물 풋마름병에 항균 활성을 나타내는 식물 풋마름병 방제 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 풋마름병 방제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, '노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지'은 배지에서 성장한 노루궁뎅이 버섯을 재배하고 남은 수확 후 배지(Spent mushroom substrate)를 의미하는 것으로, 상기 배지는 노루궁뎅이 버섯을 재배할 수 있는 배지이면 특별히 제한은 없다.
본 발명에 있어서, 식물 풋마름병이란 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum) 병원균의 감염에 의해 유발되는 질병으로, 예를 들어 토마토 풋마름병, 고추 풋마름병, 가지 풋마름병, 감자 풋마름병, 파프리카 풋마름병 및 땅콩 풋마름병 등이 있다.
본 발명에 따른 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물은 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 대하여 항균 활성을 나타냄으로 랄스토니아 솔라나세럼 병원균의 감염에 의해 유발되는 식물 병해 구체적으로 식물 풋마름병의 방제에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물은 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 아세톤 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 용매로 추출한 것 일 수 있으며,
바람직하게는 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합용매로 추출한 추출물일 수 있다.
본 발명에 의하면, 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지 1 중량부에 대하여 상기 용매 2 내지 5 중량부를 혼합하여 20 내지 110 ℃로 추출한 추출물이 좀 더 바람직할 수 있는데,
더욱 바람직하게는 열수추출하거나 20 내지 90 부피%의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 수용액으로 추출된 추출물은 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 대한 항균활성이 더욱 우수하므로, 상기 병원균에 의해 유발되는 식물 풋마름병의 방제에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 열수추출 또는 알콜 수용액으로 추출한 추출물을 농축하여 용매를 제거한 뒤, 상기 농축된 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매와 물을 이용하여 극성이 낮은 용매에서 높은 용매 순으로 분배추출하면, 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 항균활성 더욱 향상된 분획물을 얻을 수 있다.
본 발명에 의하면 상기 분배추출된 분획물 중에서 특히 에틸아세테이트 또는 부탄올 분획물은 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 대하여 항균활성이 매우 우수하므로 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 의해 유발되는 식물 풋마름병 방제에 보다 유용하게 활용될 수 있다.
한편, 본 발명은 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 풋마름병 방제 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 제조하기 위해서는 먼저, 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)을 재배한 배지(폐 배지)를 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 중에서 선택되는 1종 또는 이들의 혼합 용매로 추출한다.
상기 혼합 용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 20 내지 80 부피%의 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 이소프로판올 수용액일 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지 1 중량부에 대하여 용매 2 내지 5 중량부를 사용하는 것이 바람직한데, 추출 시 배지(폐 배지)와 용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 랄스토니아 플라나세럼 병원균에 항균 활성을 나타내는 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 추출은 20 내지 110 ℃에서 2 분 내지 500 분간 교반하여 수행될 수 있다.
추출 온도가 상기 온도 범위 미만이면, 온도를 내리기 위한 장치를 필요로 하며, 추출 수율이 낮아지므로 경제적이지 않고, 상기 온도 범위를 초과하면 고온에 식물 풋마름병 방제에 효과적인 물질이 파괴되거나 식물 풋마름병 방제에 효과적이지 않은 물질이 함께 추출될 수 있으므로 바람직하지 않다.
상기 추출 시간이 2 분 미만이면 추출시간이 너무 짧아 유용성 성분이 충분히 추출되기 어려우며, 추출 시간이 500 분을 초과하면 경제적이지 않다.
또한, 본 발명에 의하면, 상기 배지(폐 배지)는 추출 전 분쇄하여 이용하는 것이 추출 수율을 높일 수 있어 바람직하다.
다음으로 상기 추출된 혼합물을 여과한 뒤 여액을 8000 내지 12000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 얻음으로써 목적하는 노루궁뎅이 버섯을 배양한 배지에서 추출한 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 얻어진 추출물을 그대로 이용할 수도 있으나, 식물 풋마름병 방제에 특히 우수한 성분을 얻기 위해서 상기 방법으로 제조된 추출물의 용매를 제거한 후, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매와 물을 이용하여 극성이 낮은 용매에서 높은 용매 순으로 분배추출하여 분획물을 얻는 단계를 더 수행할 수 있다.
구체적으로 상기 분배추출은 용매를 제거한 추출물을 헥산과 물을 이용하여 추출하여 헥산층과 물층으로 분리한 다음, 상기 물층에 클로로포름을 첨가하여 다시 추출하여 클로로포름층과 물층으로 재분리한다. 상기 재분리된 물층에 에틸아세테이트를 첨가하여 추출하여 에틸아세테이트층 및 물층으로 분리하고, 분리된 물층에 마지막으로 부탄올을 첨가하여 추출하여 부탄올층 및 물층으로 분리하는 것 일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 분배추출에 의해 얻어진 분획물 중 식물 풋마름병 방제에 특히 효과적인 분획물은 에틸아세테이트층 및 부탄올층일 수 있다.
상기 누루궁뎅이 버섯을 재배한 배지 추출물을 분배추출하여 얻어진 분획물을 그대로 이용할 수도 있으며, 또는 통상의 정제방법을 통해 정제하여 이용할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지를 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 중에서 선택되는 1종 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 단계를 수행하지 않고, 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지를 바로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매와 물을 이용하여 분배추출하는 경우에는 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 항균활성이 낮거나 항균활성을 가지지 않는 물질이 다량으로 함께 추출될 수 있어, 식물 풋마름병 방제효과가 저하된 추출물을 얻을 수 있고, 얻어진 분획물의 정제가 용이하지 않을 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예
제조예
노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지는 도 1에 나타낸 바와 같이 봉지 재배된 노루궁뎅이 버섯을 수확하고 남은 배지(폐 배지)를 이용하였다. 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지는 추출 수율을 향상시키기 위하여 잘 분쇄하여 준비하였다.
실시예 1.
제조예에서 준비한 분쇄된 폐 배지 100 g에 물 300g을 첨가하여 잘 혼합한 후 2 시간 동안 정치배양 추출하였다. 이후, 여과하여 불순물을 제거하고, 1000 rpm의 속도로 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 노루궁뎅이 버섯을 배양한 배지로부터 추출된 추출물을 제조하였다.
실시예 2.
제조예에서 준비한 분쇄된 폐 배지 100 g에 70 부피% 메탄올 수용액 300 g을 첨가하여 28 ℃로 2시간 동안 추출한 뒤, 실시예 1의 방법으로 여과 및 원심분리하여 노루궁뎅이 버섯을 배양한 배지로부터 추출된 추출물을 제조하였다.
실시예 3.
분쇄된 폐 배지 100 g에 물 300g을 첨가하여 칼날이 부착된 호모게나이저(믹서기)에 넣고 2000 rpm의 속도로 2분간 가동하여 추출한 뒤, 실시예 1의 방법으로 여과 및 원심분리하여 노루궁뎅이 버섯을 배양한 배지로부터 추출된 추출물을 제조하였다.
실시예 4.
분쇄된 폐 배지 100 g에 70 부피% 메탄올 수용액 300 g을 첨가하여 칼날이 부착된 호모게나이저(믹서기)에 넣고 2000 rpm의 속도로 2분간 가동하여 추출한 뒤, 실시예 1의 방법으로 여과 및 원심분리하여 노루궁뎅이 버섯을 배양한 배지로부터 추출된 추출물을 제조하였다.
실시예 5
제조예에서 준비한 분쇄된 폐 배지 100 g에 물 300g을 첨가하여 잘 혼합한 후 100 ℃로 20 분간 열수 추출한 뒤, 실시예 1의 방법으로 여과 및 원심분리하여 노루궁뎅이 버섯을 배양한 배지로부터 추출된 추출물을 제조하였다.
비교예 1.
노루궁뎅이 버섯을 배양한 배지 대신에 노루궁뎅이버섯 액체배양체를 이용하였다. 노루궁뎅이 액체배양체는 YGM 액체배지 300 ml에서 노루궁뎅이 버섯을 20일 동안 배양한 뒤, 여과하여 얻어진 배양여액을 이용하였다.
대조구 1.
노루궁뎅이 버섯 균사체를 배양하지 않은 원배지를 대조군으로 준비하였다. 원배지 100 g에 70 부피% 메탄올 수용액 300 g을 첨가하여 칼날이 부착된 호모게나이저(믹서기)에 넣고 2000 rpm의 속도로 2분간 가동하여 추출하였다.
시험예 1. 항균활성 검정
항균활성 검정방법은 paper disk 검정방법을 사용하였다. 기본 배지를 NA(nutrient agar)배지로 하였으며, 도말 배지로는 0.8%의 agar를 포함한 NB(nutrient Broth)에 랄스토니아 솔라나세럼 병원균의 세포 현탁액을 2×106으로 첨가하여 NA 배지에 도말하였다. 실시예 1 내지 4 및 비교예 1에 따른 추출물을 paper disk에 30 ㎕씩 올려놓고 3일 후에 paper disk 주변에 형성된 clear zone의 크기로 항균활성 정도를 결정하였으며, 이를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 paper disk 1 내지 4는 실시예 1 내지 4의 추출물의 항균활성 결과이며, paper disk 5는 대조군 1의 항균활성 결과이고, paper disk 6은 실시예 5의 항균활성 결과이며, paper disk 7은 비교예 1의 항균활성 결과이고, paper disk 8은 물을 처리한 항균활성 결과이다.
도 2를 참고로 하면, paper disk 7의 비교예 1은 clear zone이 거의 형성되지 않아 항균활성을 나타낸다고 보기 어려웠으나, 이에 반해 paper disk 1 내지 4 및 6에서는 clear zone이 형성되어 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 paper disk 2 및 6에서 강한 항균 활성을 나타내어 열수 추출 또는 알콜 수용액으로 추출하는 것이 랄스토니아 플라나세럼 병원균에 의해 유발되는 식물 풋마름병 방제에 우수한 방제에 효과적일 것으로 판단된다.
시험예 2. 토마토 풋마름병 방제 효과 검증
실시예 5의 추출물을 이용하여 토마토 풋마름 병균 방제제로 사용하였다. 토마토 묘종은 파종 후 20일 된 것을 사용하였으며, 처리 방법은 1차로 실시예 5의 추출물 50 ml을 토마토 묘종에 관주하였다. 병원균 접종은 토마토 묘종의 뿌리를 가위로 일부 절단하여 상처를 준 후, 랄스토니아 솔라나세럼 병원균의 세포 현탁액 2×106를 침적하였다. 접종 후, 3일 후에 실시예 5의 추출물 50 ml을 2차로 관주 처리하고, 5일 후에 실시예 5의 추출물 50 ml을 3차 관주한 뒤, 최종처리 7일 후에 풋마름병 방제효과를 관찰하였다.
대조군(무처리구)으로 토마토 묘종에 묘종의 뿌리를 가위로 일부 절단하여 상처를 준 후, 랄스토니아 솔라나세럼 병원균의 세포 현탁액 2×106를 침적한 뒤 토마토 성장을 관찰하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물로 처리한 구(A)에서는 정상적으로 토마토 식물이 성장하였으나, 무처리구(B)에서는 병원균 접종 후 14 일 후부터 시들기 시작하여 20일 이후에는 대부분의 토마토 식물체가 풋마름 병징을 보였다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명에 따른 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 랄스토니아 솔라나세럼 병원균에 의해 유발되는 식물 풋마름병의 방제에 효과적으로 작용할 수 있을 것으로 판단된다.
시험예 3. 항균 활성 물질의 정제
가. 항균활성 물질의 정제 1
노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물로부터 식물 풋마름병의 방제에 특히 유용한 성분을 분리해내기 위하여 실시예 2에 따른 추출물을 이용하였다.
실시예 2에 따른 메탄올 수용액 추출물을 농축하여 메탄올을 제거 한 후, 다양한 유기용매와 물을 이용하여 극성이 낮은 용매에서 높은 용매 순으로 순차적으로 분배 추출하였다. 본 발명에서는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 순으로 분배 추출하였으며, 이를 도식화하여 도 4(A)에 나타내었다.
분배 추출된 각각의 유기 분획물은 마그네슘 설페이트와 같은 건조제를 이용하여 수분을 제거하였고, 얻어진 4종의 유기층(유기 분획물) 및 1종의 물층(물 분획물)은 농축하여 고체화하였다. 상기 얻어진 고체 200 ㎍을 물 1 ml에 용해시킨 뒤, 30 ㎕를 취하여 paper disk 법으로 항균활성을 검정하였으며, 이를 도 4(B)에 나타내었다. 상기 도 4(B)에서 1은 대조구로 분획물 대신에 물을 이용하여 검정한 것이다.
도 4를 참고로 하면, 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에서 강한 항균 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
나. 항균활성 물질의 정제 2
상기 도 4에서 가장 강한 항균활성을 나타내는 부탄올 분획물을 농축한 후, ODS 컬럼을 이용하여 HPLC로 1차 정제하였다. 용출용매는 10-100% 메탄올을 사용하였고, 총 11개의 분획물로 분리하였다. 상기 분획물에 대한 HPLC 분석 및 랄스토니아 플라나세럼 병원균에 대한 항균활성을 하기 도 5(B)에 나타내었다.
HPLC 분석 조건은 다음과 같다;
ODS column 4.6 (I. D.) x 150 mm,
flow rate 1ml/min, 10~100% methanol,
Detector UV 260 nm.
도 5(B)를 참고로 하면, 10%(ODS 10M) 및 20% methanol(ODS 20M) 분획에서 가장 강한 활성을 나타내었다.
다. 항균활성 물질의 정제 3
ODS 컬럼을 이용한 HPLC 분리에서 활성을 나타내는 분획을 포집 및 농축하여 50% 메탄올을 용출 용매로 하고, Sephadex LH-20 컬럼을 이용하여 HPLC로 2차 정제하였으며, 12개의 분획물을 얻었다. 각각의 2차 정제 분획물에 대한 HPLC 분석 및 랄스토니아 플라나세럼 병원균에 대한 항균활성을 하기 도 6(B)에 나타내었다.
도 6(B)를 참고로 하면 3번 및 11번 분획에서 강한 활성을 가지면서 단일로 보이는 피크가 관찰되었다.
라. 항균활성 물질의 정제 4
강한 활성을 나타내면서 단일로 보이는 3번 및 11번 분획을 각각 농축한 뒤, 크로마토그래피법으로 정제하였다. 3번 분획은 실리카겔 컬럼크로마토그래피 법을 이용하여 용출용매로 클로로포름:메탄올=30:1⇒1:1인 조건을 사용하여 정제하였으며, 11번 분획은 실리카겔 박막크로마토그래피 법을 이용하여 클로로포름:메탄올=5:1인 전개용매를 이용하여 분리하였다(rf=0.6). 이를 각각 도 7 상단 및 도 7 하단에 나타내었다.

Claims (11)

  1. 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)을 재배한 배지에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 풋마름병 방제 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 식물 풋마름병 방제 조성물은 식물 풋마름병을 유발하는 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum) 병원균에 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 식물 풋마름병 방제 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 식물 풋마름병은 토마토 풋마름병, 고추 풋마름병, 가지 풋마름병, 감자 풋마름병, 파프리카 풋마름병 및 땅콩 풋마름병 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 식물 풋마름병 방제 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물은 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 아세톤 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 식물 풋마름병 방제 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물은 노루궁뎅이 버섯 을 재배한 배지 1 중량부에 대하여 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급알콜 중에서 선택되는 1종 또는 이들의 혼합 용매를 2 내지 5의 중량부를 첨가하여 추출한 뒤 농축하고, 상기 농축된 농축물을 에틸아세테이트 및 부탄올 중에서 선택되는 1종 이상으로 추출한 분획물인 것을 특징으로 하는 식물 풋마름병 방제 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지에서 추출한 추출물은 열수 추출물인 것을 특징으로 하는 식물 풋마름병 방제 조성물.
  7. 1) 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)을 재배한 배지를 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 중에서 선택되는 1종 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 단계; 및
    2) 상기 추출된 혼합물을 여과한 뒤 여액을 원심분리하여 상등액을 얻는 단계;를 포함하는 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물 풋마름병 방제 조성물의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 추출은 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)을 재배한 배지 1 중량부에 대하여 용매 2 내지 5 중량부를 첨가한 후, 20 내지 110 ℃에서 2 분 내지 500 분간 교반하여 수행되는 것을 특징으로 하는 식물 풋마름병 방제 조성물의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 노루궁뎅이 버섯을 재배한 배지 추출물의 용매를 제거한 후 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매와 물을 이용하여 극성이 낮은 용매에서 높은 용매 순으로 분배추출하여 분획물을 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 풋마름병 방제 조성물의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 분획물은 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물 중에서 선택되는 어느 하나 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 식물 풋마름병 방제 조성물의 제조방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 식물 풋마름병은 랄스토니아 솔라나세럼(Ralstonia solanacearum) 병원균에 의해 유발되며,
    토마토 풋마름병, 고추 풋마름병, 가지 풋마름병, 감자 풋마름병, 파프리카 풋마름병 및 땅콩 풋마름병 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 식물 풋마름병 방제 조성물의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181865A (zh) * 2021-12-21 2022-03-15 海南师范大学 一种对茄雷尔氏菌有高效拮抗作用的芽孢菌及其应用

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