CN104585192A - 一种杀菌剂组合物及其在炭疽病菌分离中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杀菌剂组合物及其在炭疽病菌分离中的应用，所述杀菌剂组合物包括啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素或包括啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素。含有所述杀菌剂组合物的培养基具有选择性、准确性、实用快捷和成本低廉、制备简便的特点。利用本发明所述培养基分离炭疽病菌，可解决炭疽病菌等植物病原真菌分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题，且速度快，效率高，省时、省力。

Description

一种杀菌剂组合物及其在炭疽病菌分离中的应用

技术领域

本发明涉及微生物分离领域，具体地说，涉及一种杀菌剂组合物及其在炭疽病菌分离中的应用。

背景技术

炭疽病菌(Colletotrichum spp.)是一种重要的病原菌，其分布广泛，且寄主繁多，能够危害多种作物，树木、观赏植物等，同时也可以引起人体的疾病。引起炭疽病的病原菌有炭疽属内的多个种(Colletotrichum spp.)，其中，胶孢炭疽病菌(C.gloeosporioides)、尖孢炭疽病菌(C.acutatum)、平头炭疽病菌(C.truncatum)是导致我国很多地区多种作物炭疽病发生菌中危害的优势种。该病原菌引起的炭疽病是一种世界范围内的重要病害，其中辣椒炭疽病即是炭疽病菌侵染辣椒后造成的重要病害，在我国各辣椒种植区均有报道，在世界各地均有分布，以亚洲发生最为严重，且我国各辣椒种植区均有报道，通常也是由上述多种炭疽病菌复合侵染所致。其主要危害辣椒叶片和果实，每年都给辣椒生产带来严重的损失，一般减产为10％～20％左右，严重的减产可达50％以上，是影响我国辣椒生产的主要病害之一。

辣椒炭疽病的初侵染来源包括潜伏在种子内的菌丝或附着在种子表面的分生孢子，或在病残体上越冬的分生孢子盘、菌丝体等。病菌多从寄主的伤口侵入，借风雨传播蔓延，进行再侵染。辣椒炭疽病发病初期呈水渍状圆斑，进而发展为中央灰褐色，有同心轮纹，着生小黑点的圆型或不规则型病斑，干燥时呈现出膜状且易破裂。当病菌侵染叶片时，初期病斑呈褪绿水渍状，后慢慢扩大，病斑中间灰白色，周围褐色。在果实上，病斑表面初期为水渍状，逐渐扩展为褐色凹陷，圆形或不规则形状，病斑上生有黑点，为病原菌分生孢子。

辣椒炭疽病初侵染是以种传为主，再侵染主要依靠气流和雨水传播。再侵染过程常与早疫病菌复合侵染，由于早疫病菌生长速率较炭疽病菌快，且其引起的早疫病发病症状与炭疽病较难区分，因此给炭疽病菌的分离造成了较大的干扰。此外，在炭疽病发病后期，发病部位常伴随有镰刀菌等杂菌，因此在炭疽病菌的实际分离过程中经常难以高效、准确地成功分离获得炭疽病菌。为了进一步开展炭疽病菌的致病性和遗传多样性等相关研究，以及准确调查病原菌的越冬菌量和田间发病情况，为做好病害的预测预报提供指导，进一步筛选高效的药剂，最终达到有效防治该病害的目的，分离获得纯化的炭疽病菌是必要的前提条件。

常规的病原菌分离方法是《植病研究方法》介绍的用75％乙醇和0.1％升汞液表面消毒处理。实际工作中，在实验室进行分离的炭疽样本往往不是新鲜样品，而是经田间采样后存放有一定时间的病残体，这些发病组织中就不可避免的常常带有其他杂菌，按常规方法进行分离组织病原菌时，由于这些杂菌尤其是早疫病菌、镰刀病菌等的生长较炭疽病菌迅速，其菌丝常将炭疽病菌覆盖，而快速生长的细菌也会抑制炭疽病菌的生长。因此，利用普通培养基从病组织中分离辣椒炭疽病菌时，病组织仅经过表面消毒处理，达不到分离纯化的目的。若表面消毒时间太长，往往在杀死非目标菌的同时，也会把将目标菌杀死，造成目标菌分离率低或难于分离到目标菌。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种杀菌剂组合物及其在炭疽病菌分离中的应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种杀菌剂组合物，所述杀菌剂组合物包括啶酰菌胺、氰烯菌酯和青霉素。

进一步地，所述杀菌剂组合物还包括利福平，所述杀菌剂组合物中啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素的质量比为(10-25)：(5-10)：(50-100)：(50-100)。

作为优选，所述杀菌剂组合物中啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素的质量比为10：5：50：50，或20：7：70：70，或25：10：100：100。

进一步地，所述杀菌剂组合物还包括硫酸新霉素，所述杀菌剂组合物中啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素的质量比为(10-25)：(5-10)：(30-50)：(50-100)。

作为优选，所述杀菌剂组合物中啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素的质量比为10：5：30：50，或20：7：40：70，或25：10：50：100。

本发明还提供了含有前述杀菌剂的培养基，所述培养基为PDA培养基。

本发明还提供了所述培养基在分离炭疽病菌中的应用。

本发明还提供了一种分离炭疽病菌的方法，利用所述培养基培养样本，得到炭疽病菌；其中，所述样本为感染炭疽病菌的植物叶片、果实。

进一步地，所述方法具体为：将感染炭疽病菌的组织使用清水清理干净后充分晾干，切取病健交界处的小块组织接种在权利要求6所述的培养基上，28℃下黑暗培养，至有菌丝长出；挑取菌丝转接到PDA培养基上培养，待长满培养皿后置于28℃黑光灯下培养7d，诱导其产生孢子；加入灭菌水于培养皿中洗脱孢子，并挑单个孢子置于PDA培养基上培养，至长出菌落，得到炭疽病菌。

其中，所述PDA培养基的制备方法为：称取马铃薯200g，削皮切块后置于1L蒸馏水中加热30分钟，用四层纱布过滤收集滤液后再次定容至1L，加入14g琼脂粉和18g葡萄糖煮沸，121℃湿热灭菌20分钟，即得。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的培养基具有可行性、准确性、实用快捷和成本低廉、制备简便的特点。利用本发明所述培养基分离炭疽病菌，可解决炭疽病菌等植物病原真菌分离过程中各种非目标真菌和细菌污染严重的问题，且速度快，效率高，省时、省力。本发明为成功分离其他真菌菌株提供了参考，为进行田间一次性分离以及室内纯化炭疽病菌提供技术支持。本发明所述培养基可用于简便、快捷地从病株组织上一次性分离炭疽病菌以及室内纯化炭疽病菌。

附图说明

图1为两种真菌抑制剂对炭疽病菌、早疫病菌和镰刀病菌的抑制作用。

图2为四种抗生素对植株叶片表面细菌的抑制作用。

图3为四种抗生素对果皮表面的细菌抑制作用。

图4为辣椒炭疽病的发病症状。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

啶酰菌胺原药购自北京明德立达农业科技有限公司，其主要活性成分的化学名称是2-氯-N-(4’-氯二苯-2-基)烟酰胺，通用名称为啶酰菌胺，分子式：C₁₈H₁₂C_l2N₂O。该药中主要活性成分物质的质量百分含量为95.0％。

氰烯菌酯原药由农业部农药检定所提供，其主要活性成分的化学名称是：2-氰基-3-氨基-3-苯基丙烯酸乙酯，通用名称为氰烯菌酯，分子式：C₁₂H₁₂N₂O₂。该药中主要活性成分物质的质量百分含量为93.4％。

青霉素、氯霉素、利福平和硫酸新霉素，均购自北京拓英坊科技有限公司。

实施例1杀菌剂

所述杀菌剂包括啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素。

所述杀菌剂中啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素的质量比为10：5：50：50。

实施例2杀菌剂

所述杀菌剂包括啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素。

所述杀菌剂中啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素的质量比为20：7：70：70。

实施例3杀菌剂

所述杀菌剂包括啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素。

所述杀菌剂中啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素的质量比为25：10：100：100。

实施例4杀菌剂

所述杀菌剂包括啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素。

所述杀菌剂中啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素的质量比为10：5：30：50。

实施例5杀菌剂

所述杀菌剂包括啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素。

所述杀菌剂中啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素的质量比为20：7：40：70。

实施例6杀菌剂

所述杀菌剂包括啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素。

所述杀菌剂中啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素的质量比为25：10：50：100。

实施例7含有杀菌剂的培养基

称取马铃薯200g，削皮切块后置于1L蒸馏水中加热30分钟，用四层纱布过滤收集滤液后再次定容至1L，加入14g琼脂粉和18g葡萄糖煮沸，121℃湿热灭菌20分钟，即得PDA培养基。向该PDA培养基中添加实施例1中提到的质量比为10：5：50：50的啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素，即四种药剂在培养基中的终浓度分别为10μg/mL，5μg/mL，5μg/mL和50μg/mL，最终得到含有杀菌剂的培养基。

实施例8-12含有杀菌剂的培养基

同实施例7，区别在于，所述杀菌剂分别为实施例2-6制备的杀菌剂。

实施例13三种真菌抑制剂和五种抗生素对炭疽病菌的抑制作用

一、两种真菌抑制剂对炭疽病菌、早疫病菌和镰刀病菌等的抑制作用

以二甲基甲酰胺为啶酰菌胺和氰烯菌酯的溶剂，分别配制50000μg/mL的啶酰菌胺药剂母液1ml，10000μg/mL的氰烯菌酯药剂母液1ml，两种药剂的称量量依次为52.63mg和10.71mg；将这两种母液分别配制系列浓度为50μg/mL、25μg/mL和10μg/mL的啶酰菌胺含药PDA平板和系列浓度为10μg/mL、5μg/mL和1μg/mL的氰烯菌酯含药PDA平板，以加有溶剂的平板为对照；然后采用菌丝生长速率法测定三种炭疽病菌(胶孢炭疽病菌、尖孢炭疽病菌、平头炭疽病菌)、早疫病菌和镰刀病菌对两种真菌抑制剂的敏感性。将供试的菌株在PDA平板上于28℃预培养3-4d，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含有两种药剂系列浓度的PDA含药平板中央(各浓度含等量有机溶剂)，于28℃下黑暗培养，4d后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径(菌落直径减去菌饼直径5mm)，每处理重复3次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率(％)，抑制率(％)＝[(对照菌落增长直径-处理菌落增长直径)/(对照菌落增长直径)]×100。

测定了供试的两种真菌抑制剂对炭疽病菌、早疫病菌和镰刀病菌的毒力，结果如表1和图1所示，浓度为50μg/mL的啶酰菌胺对三种炭疽病菌抑制率大于15％，25μg/mL和10μg/mL啶酰菌胺对炭疽病菌抑制率小于15％，同时25μg/mL和10μg/mL的浓度对早疫病菌抑制率均大于80％，且对镰刀病菌有一定的抑制作用，因此可以采用10-25μg/mL浓度的啶酰菌胺作为分离炭疽病菌中使用的选择性药剂；不同浓度的氰烯菌酯对三种炭疽病菌的抑制率均低于15％，且从图1可观察到，该药剂在供试浓度下对平头炭疽菌丝生长有一定的促进作用，而5μg/mL和10μg/mL氰烯菌酯对镰刀病菌抑制率均大于80％，因此可以采用5-10μg/mL的氰烯菌酯作为分离炭疽病菌中使用的选择性药剂。

表1两种真菌抑制剂对炭疽病菌、早疫病菌和镰刀病菌的抑制作用

二、不同浓度的四种抗生素对炭疽病菌的抑制作用

用灭菌水将上述四种抗生素分别配制成50000μg/mL的母液，使用四种母液分别配制成浓度为100μg/mL、50μg/mL的青霉素、氯霉素和利福平，100μg/mL、50μg/mL和30μg/mL的硫酸新霉素的含药PDA平板，以加有无菌水的平板为对照。然后采用菌丝生长速率法测定炭疽病菌对这四种抗生素的敏感性。将供试的炭疽病菌菌株在PDA平板上于28℃预培养3-4d，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，将菌饼接种到分别含药剂系列浓度的PDA含药平板中央，于28℃下黑暗培养，4d后用十字交叉法测量各处理的菌落增长直径(菌落直径减去菌饼直径5mm)，每处理重复3次；最后按照下面公式求出各药剂浓度对菌丝生长的抑制百分率(％)，抑制百分率(％)＝[(对照菌落增长直径-处理菌落增长直径)/(对照菌落增长直径)]×100。

测定了不同浓度的四种抗生素对炭疽病菌的抑制作用，结果见表2，浓度为100和50μg/mL的青霉素、利福平和氯霉素对三种炭疽病菌均没有明显的抑制作用；而浓度为100μg/mL的硫酸新霉素对尖孢炭疽病菌具有一定的抑制作用，抑制率可以达到24.0％，而50μg/mL和30μg/mL浓度的抑制率比较低，最高为14.2％。因此，可以在分离炭疽病菌时使用30-50μg/mL的硫酸新霉素。综上所述，初步明确可以使用50-100μg/mL浓度的青霉素、利福平和氯霉素，30-50μg/mL的硫酸新霉素作为分离纯化炭疽病菌选择性培养基中的抗生素成份。并拟进一步测定四种抗生素对环境中带菌土壤和辣椒组织上携带的细菌的抑制作用。

表2四种抗生素对炭疽病菌的抑制作用

实施例14四种抗生素对环境中细菌的抑制作用

供试植株：将感病辣椒品种栽培于ф15cm，高12cm的育苗钵内，置于中国农业大学科学园辣椒试验田培养，植株长到6叶期后随机采集30片叶片和10个病果，用于菌悬液制备。

试验方法：此试验是在实施例1结果的基础上检测所选择的四种浓度抗生素是否可有效抑制环境中的细菌。对于环境中细菌的检测，主要针对来自植株叶片以及发病果实果皮上的细菌，这是根据炭疽病菌的分离部位主要是病叶、病果决定的。首先，是对辣椒叶片表面细菌的抑制作用，采30片辣椒叶片，剪碎后采用四分法将样本随机分成4份，取出其中1份放入50ml离心管中，加入30ml灭菌水，200r/min振荡2分钟，过滤取滤液，使用无菌水稀释100×，分别取100μl涂布在分别含有100μg/mL、50μg/mL的利福平、青霉素和氯霉素，50μg/mL和30μg/mL的硫酸新霉素的含药PDA平板上，以不含药平板为对照，每处理3个重复，2天后观察其抑菌作用。然后从辣椒炭疽病发病严重的田间取10个病果，剥取果皮放入三角瓶中加入100ml灭菌水，200r/min振荡20min，取上清100μl涂布在分别含有100μg/mL、50μg/mL的利福平、青霉素和氯霉素，50μg/mL和30μg/mL的硫酸新霉素的含药PDA平板上，以不带药平板为对照，每处理3个重复，2天后观察上面的细菌形态以及菌落数的多少，以判断抗生素对环境中细菌的抑制作用。

本研究在表2结果的基础之上，分别测定了初步选择可用的四种抗生素对叶片和果实上细菌的抑制作用，两个研究的结果一致。从图2和图3看出，氯霉素抑菌活性差，在其浓度达到100μg/mL时，与对照相比，抑菌效果不明显。青霉素、利福平和硫酸新霉素的抑菌活性较强，可以达到抑菌的作用。由于环境中细菌种类的多样性，青霉素主要对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，所以如图2和图3所示，青霉素平板中有少许零星革兰氏阴性菌菌落。而对于利福平和硫酸新霉素，由图2和图3可知平板中只有少许革兰氏阳性细菌以及真菌菌落。因此，利福平可以配合青霉素，或是硫酸新霉素配合青霉素使用，以达到对革兰氏染色阴性和阳性细菌更好的综合抑菌作用。

综上所述，本发明筛选药剂的原则是对炭疽病菌抑制率小于15％的前提下，尽可能选择高浓度的药剂，以提高对非目标菌的抑菌活性。根据以上所有的试验结果可以看出，应用于从田间一次性分离炭疽病菌的选择性培养基，可以选择的真菌抑制剂为啶酰菌胺和氰烯菌酯，浓度分别为10-25μg/mL、5-10μg/mL；可以选择的抗生素类为青霉素和利福平，浓度采用50-100μg/mL，硫酸新霉素，浓度采用30-50μg/mL。

实施例15用于分离炭疽病菌的PDA选择性培养基

一、分离方法

于2011至2013年从河北、山东、北京、广东、宁夏、陕西和福建等辣椒炭疽病发病严重地区采集病样，用于炭疽病菌分离。田间辣椒炭疽病的发病情况如图4所示。A：在叶片上，初期病斑呈褪绿水渍状，随后慢慢扩大，病斑中间灰白色，周围褐色。B：在果实上，病斑表面初期为水渍状，逐渐扩展为褐色凹陷，圆形或不规则形状，病斑上生有黑点，为病原菌分生孢子

炭疽病菌的分离方法按下述方法进行：在同一地区选择不同的田块，根据当地的发病严重程度采集炭疽病发病样品(叶片、果实)进行分离。

分离步骤：将发病组织使用清水清理干净后充分晾干，切取病健交界处的小块组织接种在本发明的选择性培养基上，28℃下黑暗培养，至有菌丝长出；挑取菌丝转接到PDA培养基上培养，待长满皿后置于28℃黑光灯下培养7d左右，诱导其产生孢子；加入灭菌水于培养皿中洗脱孢子，并挑单个孢子置于普通PDA培养基上培养，至长出菌落，得到炭疽病菌。对得到的炭疽病菌进行鉴定，将真正的炭疽病菌菌落保存在PDA试管斜面上，加适量的灭菌石蜡油置于14℃保存备用。

根据现有的炭疽病菌鉴定方法形态学观察和分子生物学技术进行鉴定。

二、分离使用的培养基：

(一)马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200g，琼脂粉14g，葡萄糖18g，蒸馏水定容至1L，121℃湿热灭菌20分钟。

(二)PDA选择性培养基

PDA选择培养基Ⅰ：向未冷却的PDA培养基中添加啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素，并用未冷却的PDA培养基定容至1升；啶酰菌胺在PDA选择培养基Ⅰ中的浓度为10μg/mL，氰烯菌酯在PDA选择培养基Ⅰ中的浓度为5μg/mL，利福平在PDA选择培养基Ⅰ中的浓度为50μg/mL，青霉素在PDA选择培养基Ⅰ中的浓度为50μg/mL。

PDA选择培养基Ⅱ：与PDA选择培养基Ⅰ基本相同，不同之处在于啶酰菌胺在PDA选择培养基Ⅱ中的浓度为20μg/mL，氰烯菌酯在PDA选择培养基Ⅱ中的浓度为7μg/mL，利福平在PDA选择培养基Ⅱ中的浓度为70μg/mL，青霉素在PDA选择培养基Ⅱ中的浓度为70μg/mL。

PDA选择培养基Ⅲ：与PDA选择培养基Ⅰ基本相同，不同之处在于啶酰菌胺在PDA选择培养基Ⅲ中的浓度为25μg/mL，氰烯菌酯在PDA选择培养基Ⅲ中的浓度为10μg/mL，利福平在PDA选择培养基Ⅲ中的浓度100μg/mL，青霉素在PDA选择培养基Ⅲ中的浓度为100μg/mL。

PDA选择培养基Ⅳ：向未冷却的PDA培养基中添加啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素，并用未冷却的PDA培养基定容至1升；啶酰菌胺在PDA选择培养基Ⅳ中的浓度为10μg/mL，氰烯菌酯在PDA选择培养基Ⅳ中的浓度为5μg/mL，硫酸新霉素在PDA选择培养基Ⅳ中的浓度为30μg/mL，青霉素在PDA选择培养基Ⅳ中的浓度为50μg/mL。

PDA选择培养基Ⅴ：与PDA选择培养基Ⅳ基本相同，不同之处在于啶酰菌胺在PDA选择培养基Ⅴ中的浓度为20μg/mL，氰烯菌酯在PDA选择培养基Ⅴ中的浓度为7μg/mL，硫酸新霉素在PDA选择培养基Ⅴ中的浓度为40μg/mL，青霉素在PDA选择培养基Ⅴ中的浓度为70μg/mL。

PDA选择培养基Ⅵ：与PDA选择培养基Ⅳ基本相同，不同之处在于啶酰菌胺在PDA选择培养基Ⅵ中的浓度为25μg/mL，氰烯菌酯在PDA选择培养基Ⅵ中的浓度为10μg/mL，硫酸新霉素在PDA选择培养基Ⅵ中的浓度为50μg/mL，青霉素在PDA选择培养基Ⅵ中的浓度为100μg/mL。

四、分离及鉴定结果

在使用不同的本发明选择培养基进行分离的过程中，PDA选择培养基中均没有杂菌长出，只有炭疽病菌能生长，说明本发明的PDA选择培养基抑制了杂菌生长，使炭疽病菌的分离更容易。本发明方法从开始将病变组织接种至选择性培养基上至有炭疽病菌菌丝长出，一般只需要3-4天，大大缩短了分离时间，提高了分离效率。分离时间缩短，主要是因为本发明的选择培养基有效的抑制了其它真菌和细菌的生长，使炭疽病菌在培养基中成为优势菌群，生长速度提高，从而加快了分离进程。

从上述河北、山东、北京、广东、宁夏、陕西和福建等六个省市的辣椒炭疽病发病严重地区的病组织中共分离得到169株炭疽病菌菌株，169株炭疽病菌均鉴定正确。

本发明针对目前不易直接从病残体中分离获得纯化的炭疽病菌，而传统病原菌分离纯化方法的过程繁琐，消毒时间难以控制，分离率低以及现有方法由于采用药剂杀菌谱范围小及药剂浓度不合适的问题，研发出了可一次性从田间分离炭疽病菌的杀菌剂组合物，根据炭疽病菌分离部位和病样新鲜程度的不同，用于炭疽病菌分离培养的杀菌剂组合物中以真菌抑制剂啶酰菌胺和氰烯菌酯以及细菌抑制剂利福平或硫酸新霉素为主，加入的其它细菌抑制剂(抗生素)可以有不同的组合，可以选择的抗生素类细菌抑制剂为青霉素，浓度为50-100μg/mL。

将上述该含有不同杀菌谱的真菌抑制剂和抗生素类杀细菌剂的杀菌剂组合物添加至PDA培养基中，制备成炭疽病菌的选择性培养基。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种杀菌剂组合物，其特征在于，所述杀菌剂组合物包括啶酰菌胺、氰烯菌酯和青霉素。

2.根据权利要求1所述的杀菌剂组合物，其特征在于，所述杀菌剂组合物还包括利福平，所述杀菌剂组合物中啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素的质量比为(10-25)：(5-10)：(50-100)：(50-100)。

3.根据权利要求2所述的杀菌剂组合物，其特征在于，所述杀菌剂组合物中啶酰菌胺、氰烯菌酯、利福平和青霉素的质量比为10：5：50：50，或20：7：70：70，或25：10：100：100。

4.根据权利要求1所述的杀菌剂组合物，其特征在于，所述杀菌剂组合物还包括硫酸新霉素，所述杀菌剂组合物中啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素的质量比为(10-25)：(5-10)：(30-50)：(50-100)。

5.根据权利要求4所述的杀菌剂组合物，其特征在于，所述杀菌剂组合物中啶酰菌胺、氰烯菌酯、硫酸新霉素和青霉素的质量比为10：5：30：50，或20：7：40：70，或25：10：50：100。

6.含有权利要求1-5任一项所述杀菌剂组合物的培养基，其特征在于，所述培养基为PDA培养基。

7.权利要求6所述培养基在分离炭疽病菌中的应用。

8.一种分离炭疽病菌的方法，其特征在于，利用权利要求6所述的培养基培养样本，得到炭疽病菌；所述样本为感染炭疽病菌的植物叶片、果实。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法具体为：将感染炭疽病菌的组织使用清水清理干净后充分晾干，切取病健交界处的小块组织接种在权利要求6所述的培养基上，28℃下黑暗培养，至有菌丝长出；挑取菌丝转接到PDA培养基上培养，待长满培养皿后置于28℃黑光灯下培养7d，诱导其产生孢子；加入灭菌水于培养皿中洗脱孢子，并挑单个孢子置于PDA培养基上培养，至长出菌落，得到炭疽病菌。