KR20160048342A

KR20160048342A - 신규 버섯재배방법

Info

Publication number: KR20160048342A
Application number: KR1020140144675A
Authority: KR
Inventors: 주성수; 장수길
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단; (주)자연과사람
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2014-10-24
Publication date: 2016-05-04
Also published as: KR101757472B1

Abstract

본 발명은 버섯의 재배방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 라카아제(laccase)를 처리한 톱밥배지에 금속이온을 첨가하고 버섯 종균을 접종한 후 상기 버섯의 자실체가 형성되는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는 버섯 배양방법에 관한 것이다.

Description

신규 버섯재배방법{Novel cultivation method of mushroom}

본 발명은 재배방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 신규 버섯재배방법에 관한 것이다.

꽃송이버섯(Sparassis crispa)은 담자균문(Phylum Basidiomycota) 담자균강(Class Basidiomycetes) 주름버섯아강(Subclass Agaricomycetidae) 구멍장이버섯목(Polyporales) 꽃송이버섯과(Sparassidaceae)에 속하는 근주심재갈색부후균으로 꽃양배추 모양의 자실체를 형성한다(Kirk et al., Anisworth and Bisby's Dictionary of the Fungi 9^th ed., Wallingford, UK; CAB International, 655 pp., 2001). 꽃송이버섯은 담자균류 민주름버섯목 꽃송이버섯과의 버섯으로서, 자실체는 하얀 꽃 모양으로 10~25㎝ 크기의 꽃양배추 모양을 하고 있으며, 식용버섯으로서 씹는 맛이 좋고 송이버섯과 같은 향이 나서 꽃모양을 하고 있는 송이버섯과 같다고 하여 꽃송이버섯이라고 부른다. 또한, 꽃송이버섯은 가을에 소나무, 잣나무, 낙엽송 등 침엽수의 뿌리 부근 땅 위나 그루터기 위에 단생하는 근주심재 갈색 부후성 버섯이며, 베타글루칸이 풍부하여 항암활성이 우수한 것으로 알려져 있고(꽃송이버섯을 식탁으로..., 한국임산버섯연구회·국립산립과학원, 2009.09), 꽃송이버섯 추출물이 지질분해 효과를 통해 비만 치료에 효과적이라는 보고가 있다(이미애 외, 한국식품영양과학회지, 제41권 제12호 pp. 1708-1715, 2012). 꽃송이버섯은 국내를 비롯한 일본, 중국, 북아메리카, 유럽 그리고 오스트레일리아 등에 자생하며, 국내에서는 7월에서 10월경에 발생하는 것으로 알려져 있어 비교적 넓은 분포역과 장기간 자실체가 유지되는 종이다. 그럼에도 불구하고 일반적으로 잘 알려지지 않은 이유는 주로 아고산대에서 자라고, 낙엽송, 전나무, 잣나무와 같은 침엽수의 상처나거나 갈라진 줄기하단부 및 뿌리부로 침투하여 생장할 뿐만 아니라 개체수가 많지 않으며, 인공 재배 조건이 난해하기 때문이다. 게다가 꽃송이버섯은 전형적인 토양 감염성 버섯으로서 목재를 부패시키는 능력이 지극히 약하여 목부가 밖으로 노출되어 심재까지 균사 침투가 가능하지 않으면 발생할 수 없다. 이런 미묘한 생육 환경이 문제가 되어, 자연계에서는 꽃송이버섯의 자실체가 극히 소량밖에 발견되지 않는다. 이에, 생육환경을 규명하기 위한 여러 연구가 수행된 바 있으나 아직까지 명확한 미기후 조건에 대해서는 알려진 바 없다. 상황버섯, 차가버섯, 노루궁뎅이버섯, 영지버섯 등 꽃송이버섯과 같이 약리학적 작용이 높은 목재부후균의 경우 미기후 조건을 파악하여 재배조건을 파악하는 동시에 인공적인 재배조건 구축을 위해 여러 시도가 이루어지고 있으나 종균접종 후 활착까지의 기간이 길고 그 기간 동안 오염의 위험성이 높아 활착기간 단축이 임산버섯 재배 성공의 열쇠이다.

선행문헌을 살펴보면, 한국공개특허 제2003-0110727호는 꽃송이버섯의 인공 재배 방법을 개시하고 있다. 또한 한국공개특허 제2005-0099828호는 보릿가루가 첨가된 침엽수 톱밥을 이용한 실용적인 꽃송이버섯 재배 방법을 개시하고 있다.

그러나 상기 선행기술들의 경우 배지 제작을 위해 많은 종류의 첨가물을 혼합하기 때문에 농가에서 첨가물의 최적 비율을 적용하기 어려울 뿐만 아니라 접종 후 수확까지 최대 6개월 정도까지 소요되는 등, 생산기간이 매우 길다는 단점을 가지고 있다. 본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 보다 신속한 수확을 가능하게 하는 신규 버섯재배방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 라카아제(laccase)를 처리한 톱밥배지에 버섯 종균을 접종한 후 상기 버섯의 자실체가 형성되는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는 버섯 배양방법이 제공된다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 라카아제(laccase)가 처리된 침엽수 톱밥을 포함하는 꽃송이버섯 재배용 고체배지가 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 영지버섯 유래 라카아제를 유전자 기법으로 대량생산하고 이 효소에 의한 목재부 리그닌의 분해 촉진과 금속이온에 의한 균사생장 촉진으로 버섯의 활착과 생장을 용이하게 하여 꽃송이버섯 재배의 근본적 문제점을 해소할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 영지버섯 라카아제(Glac1) 발현 시스템 구축 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 형질전환된 Glac1 유전자 증폭 양상 결과를 나타낸 사진이다. VC: vector control, RCL1 : pPIC-RCL1 형질전환 효모주. (A. LAC_fwd+LAC_rev, B. AOX1+AOX2)
도 3 본 발명의 일실시예에 따라 GLlac의 발현 유도를 위한 pPIC-RCL1 배양 과정을 나타낸 개요도이다.
도 4 본 발명의 일실시예에 따라 SDS-PAGE gel 전기영동에 의한 Glac1 분리. A. 날짜별 배양액 전기영동 결과, B. 15일 배양액 농축 후 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 5 본 발명의 일실시예에 따라 양일 및 반응일에 따른 Glac1 발현 정도 비교를 나타낸 이미지이다(Scale bar = 1 cm).
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 계대배양 후 배지별 균사체 성장 정도 비교한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 FeCl₂첨가 후 배지별 성장 정도 비교 (20일 배양) 결과를 나타낸 사진이다.
도 8 내지 12는 각각 본 발명의 일실시예에 따라 농도를 달리한 FeCl₂, CuCl₂, KCl, CaCl₂, 및 NaCl에 의한 꽃송이버섯 성장 정도 비교 결과를 나타낸 사진이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따라 금속이온(FeCl₂ 및 CuCl₂) 첨가 후 공기주입식 액체배양에 의한 꽃송이버섯 성장 정도 비교한 사진이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따라 종균 접종 후 배양 중인 톱밥 배지를 나타낸 사진이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따라 낙엽송 톱밥 접종 및 250mM 농도의 FeCl₂ 첨가 후 배양일에 따른 자실체 발생 비교를 나타낸 사진이다(scale bar = 2 cm).
도 16은 본 발명의 일실시예에 따라 pPIC-RCL1 배양액에 의한 푸른곰팡이 저해능를 나타낸 사진이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따라 pPIC-RCL1 배양액에 의한 S. aureus 성장 저해 시험 결과를 나타낸 그래프이다.

상기 버섯 배양방법에 있어서, 상기 라카아제는 라카아제를 발현하도록 형질전환된 효모의 배양액의 형태로 처리될 수 있다.

상기 버섯 배양방법에 있어서, 상기 라카아제는 5 내지 12일 간격으로 두 차례 톱밥배지에 처리될 수 있고, 상기 버섯 종균은 상기 두 번째 라카아제 처리 후 5 내지 12일 후에 접종될 수 있다. 상기 라카아제는 5 내지 12일 간격으로 두 차례 톱밥 배지에 처리될 수 있고, 상기 버섯 종균은 상기 두 번째 라카아제 처리 후 5 내지 12일 후에 접종될 수 있다.

상기 버섯 배양방법에 있어서, 상기 버섯은 꽃송이버섯(Sparassis crispa), 상황버섯(Phelinus linteus), 차가버섯(Inonotus obliquus), 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum), 신령버섯(Agaricus blasei), 영지버섯(Ganoderma lucidum), 팽이버섯(Flammulina velutipes), 잎새버섯(Griofora frodonsa), 목이버섯(Auricularia auricula), 만가닥버섯(Lyophyiium ulmarium), 버들송이(Agrocybe aegerita), 애느타리버섯(Pleurotus ostreatus), 새송이버섯(Pleurotus eryngii), 표고버섯(Lentinus edodes) 등 임산버섯 및 목재부후균일 수 있다.

상기 버섯 배양방법에 있어서, 상기 톱밥배지는 침엽수 톱밥 배지일 수 있고, 상기 침엽수는 낙엽송 또는 미송일 수 있다.

상기 버섯 배양방법에 있어서, 상기 톱밥배지에 금속의 염을 추가로 처리할 수 있다. 상기 금속은 철, 구리, 아연, 나트륨 또는 칼슘일 수 있고, 상기 금속의 염은 FeCl₂ 또는 CuCl₂일 수 있으며, 상기 금속의 염은 톱밥 1 g 당 30 μg 내지 300 μg으로 처리될 수 있다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 라카아제(laccase)가 처리된 낙엽송 톱밥을 포함하는 꽃송이버섯 재배용 고체배지가 제공된다.

상기 꽃송이버섯 재배용 고체배지에 있어서, 상기 라카아제는 라카아제를 발현하도록 형질전환된 효모의 배양액의 형태로 처리될 수 있다.

상기 꽃송이버섯 재배용 고체배지에 있어서, 상기 꽃송이버섯 재배용 고체배지는 금속의 염이 추가로 포함될 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

실시예 1: RCL1 유전자 확보 및 라카아제(laccase) 대량 생산 체계 구축

본 발명에서 종래의 방법(Joo et al., Mol. Cells, 25(1): 112-118, 2008) 통해 영지버섯 라카아제(Glac1)를 순수 분리하여 pPICZ_B vector에 삽입한 후 유전자 재조합 단백질 생산에 유용한 효모주인 Pichia pastoris에 형질전환시켜 영지버섯 라카아제가 지속적으로 발현되는 시스템을 구축하였고, 이를 pPIC-RCL1이라 명명하였다(도 1). Glac1 유전자의 크기는 총 4,357 bp로 9개의 인트론이 존재하였으며, 암호화 지역은 1,560 bp로 확인되었다. 또한, 정렬된 염기서열의 상류(upstream) 방향에서 금속반응인자(MRE, metal responsive element)로 예상되는 CAAT 및 TATA box(Thiele, Nucleic Acids Res., 20(6): 11183-11191, 1992)가 확인되어 라카아제 발현에 금속이온이 자극인자로 작용할 것으로 판단되었다. 유전자의 형질전환 여부를 재검증하는 동시에 원활한 유전자 발현이 이루어지는가를 확인하기 위해 형질전환된 효모주인 pPIC-RCL1을 대상으로 직접 PCR을 수행하였고, 프라이머는 라카아제 서열을 증폭하도록 제작된 조합(LAC_fwd, LAC_rev)과 벡터 상에 위치한 서열을 바탕으로 제작된 조합(5' AOX1, 3' AOX1; K1740-01, Invitrogen, CA, USA)의 두 종류로 수행되었으며, 염기서열은 표 1과 같다. 대조군으로는 유전자 재조합되지 않은 공벡터(vector control)를 형질전환시킨 동일효모주를 사용하였고, PCR을 위해 pPIC-RCL1 및 벡터 대조군(vector control)으로부터 gDNA를 추출하여 사용하였다. Glac1 유전자를 대상으로 제작한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과 pPIC-RCL1에서만 예상되는 크기의 유전자가 증폭된 것을 확인하였다(도 2A). 또한, 벡터 상의 서열을 대상으로 제작한 프라이머로 증폭한 결과 벡터 대조군에서는 324 bp에서 밴드가 확인된 반면 pPIC-RCL1의 경우 1,884 bp에서 밴드가 나타났다(도 2B). 따라서, pPIC-RCL1에 Glac1 유전자가 정상적으로 삽입되어 있으며, Glac1를 대량 확보하기 위한 시스템이 안정적으로 구축되었음을 확인하였다.

본 발명에서 사용된 프라이머 목록

프라이머	핵산서열	서열번호
LAC_fwd	ATGGTGAAATTCCAATCGTTGCTCT	1
LAC_rev	GTGATCATCAGCCGAGAGCGC	2
5' AOX1	GACTGGTTCCAATTGACAAGC	3
3' AOX1	GCAAATGGCATTCTGACATCC	4

실시예 2: pPIC-RCL1 배양 조건 확립 및 Glac1 활성에 대한 정량적 검증

본 발명에서 형질전환에 사용된 P. pastoris 발현시스템의 경우 일정 온도조건하에서 메탄올을 이용하여 대사가 유도되며, 그에 따른 산물로 형질전환시킨 라카아제가 발현 및 분비됨을 확인하였다. 이에 Glac1의 최적 발현 조건을 확립하기 위해 배양일, 배양액, 첨가물 농도 등을 조정하여 단백질 생산 정도를 비교하였다. P. pastoris 효모주의 배양에는 YPD(yeast extract peptone dextrose medium), BMGY(buffered glycerol-complex medium), BMMY(buffered methanol-complex medium) 세 종류의 배지가 이용되는데 이 중 형질전환된 단백질의 발현을 위해서는 BMMY 배지상에서 배양 및 유도하였다. 한편, pPIC-RCL1 보관주로부터 BMMY 배지에 직접 접종할 경우 충분한 생물량을 확보하는데 필요한 시간이 요구되기 때문에 이상의 세 종류 배지상에서 단계적으로 배양함으로써 빠르게 생물량을 확보하는 동시에 상대적으로 단기간에 다량의 Glac1을 확보할 수 있는 조건을 구축하였다(도 3). 즉, YPD 한천 배지에 도말되어 있는 효모주를 YPD 액체배지에서 2일간 키운 후 25 mL의 BMGY 액체배지에서 1차적으로 배양한 뒤 300 mL로 용량을 늘려 생물량을 확보하였고, BMGY 300 mL에서 2일정도 배양하면 배양액의 탁도는 600 nm의 파장에서 약 1.5를 보였으며, 효모주만을 분리하여 BMMY 액체배지로 옮긴 후 15일 동안 배양한 후 상층액만을 여과하여 냉장보관하여 연구에 사용하였다. BMMY 배지 배양 시 Glac1 분비를 유도하기 위해 0.5%(v/v) 비율의 메탄올을 매일 첨가하였다. BMMY 배지 1L에 접종된 pPIC-RCL1을 총 15일간 배양하는 동안 Glac1 발현을 1차적으로 검증하기 위해 5, 10, 15일차에 각각 300 ml의 배지를 수거하였고, SDS-PAGE gel 상에서 동량(30 μL)을 전기영동 후 쿠마시(Coomassie) 염색법을 이용하여 확인하였다. Glac1은 약 56kDa(Joo et al., 2008)으로 5일차 배양액에서는 밴드가 확인되지 않았으나 15일차 배양액에서는 해당 크기에서 단백질이 분리되었으며(도 4A), 15일차 배양액을 증발농축기를 이용하여 농축하였을 때 상대적으로 분명한 패턴을 보였다(도 4B). 따라서 pPIC-RCL1의 BMMY 배양액상에 Glac1 함유되어 있음이 검증되었고, pPIC-RCL1에서 발현되어 BMMY 배지상으로 분비되는 Glac1의 활성 정도를 확인하기 위해 라카아제의 기질인 구아이아콜(guaiacol, G5502, Sigma-aldrich, St. Louis, USA)이 함유된 MM(minimal methanol) 평판배지를 이용하였다. 구아이아콜은 퍼옥시다제(peroxidase), 라카아제 등과 반응하여 발색반응을 일으키는 대표적인 기질 중 하나로 색의 농도와 범위로 상대적인 비교가 가능하다. 총 15일동안 1 L의 BMMY 배지에서 배양하였으며, 메탄올은 0.5 % 비율로 매일 첨가하였고, 3일 간격으로 0.5 mL을 수거하여 상층액을 분리한 뒤 50 μL를 MM 평판배지 위에 떨어뜨린 후 15일동안 반응 정도를 관찰하였다. 대조군으로 유전자 재조합되지 않은 공벡터를 형질전환시킨 동일효모주를 동일한 조건에서 배양한 후 얻은 배양액을 사용하였다. 대조군의 경우 배양일 및 반응일에 무관하게 발색반응이 나타나지 않았으나 pPIC-RCL1 배양액의 경우 배양기간과 반응기간에 의존적으로 라카아제와 구아이아콜과의 발색반응이 증가하는 경향을 나타냈다(도 5). Glac1의 활성 정도는 BMMY 배양 9일차 까지는 큰 변화를 보이지 않았으나 12일차부터 상대적으로 높은 활성을 보이는 것으로 나타났으며, 15일차에서 가장 높은 활성 수준이 관찰되었다. 각 실험군별 최대 발색범위는 모두 15일동안 반응했을 때 나타났으며, 배양 6일차 배지에서 4.00±0.30 cm, 9일차에서 4.60±0.22, 12일차에서는 5.83±0.10, 15일차에서 6.28±0.25 cm로 확인되었다. 한편, 배양액을 떨어뜨린 후 발색되는 면적을 상대적으로 비교해본 결과 9~10일차까지는 발색면적이 빠르게 확장되는 반면 반응 10일 이후에는 뚜렷한 면적의 증가는 보이지 않았다(표 2). 따라서 pPIC-RCL1로부터 분비된 Glac1은 최소 9~10일까지 지속적인 활성을 보일 것으로 예상되며, 톱밥 부숙 시 10일 이후에는 추가적인 pPIC-RCL1 배양액을 첨가해주어야 할 것으로 판단된다. 한편, 관찰 결과 15일 이상 배양할 경우 제한된 공간 내에 생물량이 과도하게 늘어나 효모주의 색이 탁해지거나 서로 뭉쳐져 덩어리를 형성하는 등 정상적인 대사가 이루어지지 않는 것으로 판단되어 배양 기간은 최대 15일로 제한하는 것이 타당할 것으로 사료된다. 또한 pPIC-RCL1 배양 후 확보된 배양액 내에 함유되어 있는 Glac1을 정량적으로 검출하기 위해 15일 동안 배양한 BMMY 배지에서 상층액만을 분리한 뒤 동결건조하였고, 동결건조를 통해 배양액 분말을 총 46.57 g/L 확보하였다. Glac1-FDP 50 mg/mL을 증류수에 녹인 후 활성탄(161551, Sigma-aldrich)을 이용하여 탈색과정을 거친 뒤 0.1% 구아이아콜이 함유된 0.1 M 초산나트륨 완충액(sodium acetate buffer)와 반응하여 나타나는 발색 정도를 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 표준과 비교하여 정량하기 위해 구름버섯 라카아제(53739, Sigma-aldrich)를 25~3.12 μg/mL(22.4 U/mg)의 농도로 순차 희석하여 상대적인 흡광도 값을 비교하였으며, 이에 따른 배지 내 Glac1 함량을 산출하였다. 0.1% 구아이아콜이 함유된 0.1 M 초산나트륨 완충액 100 μL와 각 샘플 100 μL를 혼합하여 30℃에서 1시간동안 반응한 뒤 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배양액 분말 내 Glac1은 2.25±0.09 μg/mg이 함유되어 있는 것으로 확인되었으며, 1 L 배양 시 확보되는 총량은 104.71±4.35 mg으로 산출되었다. 또한, Glac1의 활성정도는 배양액 분말 기준으로 0.05±0.01 U/mg으로 나타났으며, 1 L 배양 시 확보되는 Glac1에 의한 예상 총활성정도는 2345.53±97.37 U으로 확인하였다.

배양일에 따른 배양액의 MM plate 반응 후 guaiacol 발색 면적 비교.

배양기간(일)	반응기간(일)
배양기간(일)	3	6	9	15
6	2.63±0.15^*	3.00±0.15	3.47±0.25	4.00±0.30
9	3.08±0.10	3.27±0.20	4.50±0.26	4.60±0.22
12	3.55±0.13	3.77±0.18	5.63±0.15	5.83±0.10
15	4.42±0.40	4.62±0.08	6.12±0.16	6.28±0.25

실시예 3: 꽃송이버섯 배양 최적 배지 선별

본 발명에서 버섯 배양 시 주요 영양원 공급을 위해 첨가하는 일반적인 첨가물인 감자(potato), 덱스트로스(dextrose), 펩톤(peptone), 효모추출물(yeast extract), 맥아추출물(malt extract) 등이 선택적으로 함유된 평판배지를 제작하여 1차 배양을 실시하였다. 1차 배양을 위해 MA(malt extract agar), MYA(malt extract and yeast extract agar), PDA(potato dextrose agar), PDYA(potato, dextrose and yeast extract agar)를 제작하여 버섯종균을 접종하였으며, 이 중 MA 평판배지 배양군에서 성장한 균사 중 가장 바깥부분을 5×5 mm²로 잘라 2차 계대배양을 실시하였다. 2차 배양은 YA(yeast extract agar), YPDA(yeast extract, peptone, dextrose agar)를 포함하여 총 6개 배지를 대상으로 하였으며, 각 배지간의 균사 성장 정도를 비교하였다. 2차 계대배양 20일 경과 후 6개 배지 중 가장 빠른 성장 속도를 보인 것은 MA 배지였으며, PDA 및 MYA 배지에서도 상대적으로 빠른 성장을 보였다. 3차 계대배양은 2차 계대배양 시 상대적으로 느린 성장을 보인 YA, YPDA 배지를 제외하고 NUT(nutrient agar), SAB(sabouraud agar), SOY(Soy sgar), YM(YM agar)를 추가하였다. 균사의 성장은 2차 계대배양과 마찬가지로 MA, MYA, PDA, YM 등에서 상대적으로 빠른 속도를 보였으나 PDA의 경우 다른 배지에 비해 균사체의 밀도가 높을 뿐만 아니라 자실체의 형성 시기도 10일 정도 빨라 꽃송이버섯 배양용 한천 평판배지로 최종 선별하였다. 도 6은 계대배양 후 배지별 균사체 성장 정도 비교한 사진이며, 표 3은 2차 계대배양 20일 경과 후 균사 성장 정도 비교를 나타낸 결과이다.

2차 계대배양 20일 경과 후 균사 성장 정도 비교

배지	MA	MYA	PDA	PDYA	YM	YPDA
지름(mm)	36.44	26.99	29.75	23.50	20.38	19.27
표준편차	±2.55	±3.57	±1.56	±2.21	±4.13	±2.73

실시예 4: 금속염 첨가 후 배지별 성장 정도 비교

본 발명자들은 금속 이온이 꽃송이버섯 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해, FeCl₂를 75~500 μM로 첨가하여 20일간 배양 결과 세 종류의 배지 모두 농도의존적으로 균사의 성장이 촉진되는 것이 확인되었으며, 특히 PDB에 FeCl₂를 500 μM 첨가하였을 때 배지 전체에 걸쳐 균사체가 생장할 정도로 빠른 속도가 관찰되었다(도 7). 상기 결과로부터 FeCl₂를 첨가에 따른 성장 촉진 가능성이 확인됨에 따라 철 이온 이외에 다른 금속이온에 대한 성장 유도 효과를 검토하였으며, 금속이온의 농도는 62.5~1500 μM로 설정하여 수행하였고, 꽃송이버섯 균사는 PDA 배양군으로부터 채취한 균사를 균질화 과정을 거친 뒤 동량을 접종하였다.

구체적으로, FeCl₂, CuCl₂, KCl, CaCl₂ 및 NaCl₂를 첨가한 뒤 오염을 최소화하기위해 밀폐하여 33일간 배양하였으며, 최초 10일간 배양 결과 모든 금속이온에 대해 균사 성장이 촉진되는 경향이 나타났으며, 대부분 250~1000 μM 수준에서 양호한 생육 상태를 보였고, FeCl₂ 첨가군에서는 500~1500 μM 처리군에서 상대적으로 많은 균사가 확인되었다(도 8 내지 12). 20일간 배양한 결과 다른 금속이온 첨가군에 비해 FeCl₂과 CuCl₂를 넣어준 시험군에서 많은 균사가 성장되었는데 FeCl₂는 125~1500μM 범위에서 촉진되었으며, CuCl₂는 125~500 μM 범위에서 빠른 성장을 보였다. 한편, FeCl₂ 1000 μM 이상 고농도 처리군에서는 균사의 색변화가 나타났으며, CuCl₂의 경우 1500 μM에서는 오히려 성장 저해가 나타났다. 이와 같은 경향성은 30일 동안 동일하게 관찰되었다.

이어 본 발명자들은 시험관 배양을 통한 비교 실험에서 검증된 철과 구리를 공기주입식 액체배양 시 첨가하여 최종적인 액체배양 시스템을 구축하고자 하였다. 구체적으로 PDA 배지 배양군에서 채취한 균사를 액체배지에 넣은 후 FeCl₂ 500 μM을 첨가하여 1차 배양을 실시하였으며(도 13), 약 25일간 배양 후 확보된 1차 배양 균사를 이용하여 2차 계대배양을 하는 동시에 최종 액체배양 시스템을 확립하였다. FeCl₂과 CuCl₂를 각각 500 μM씩 첨가하여 2차 액체배양을 실시한 결과 배양 7일차까지는 눈에 띠는 차이가 확인되지 않았으나 14일 경과 시 구리보다 철을 넣은 시험군에서 상대적으로 많은 균사가 성장하였을 뿐만아니라 배지의 탁도도 증가하였음 (도 13).

따라서, 철과 구리를 포함한 금속은 꽃송이버섯 균사체 성장에 긍정적인 촉매로써 작용할 것으로 판단되고, 철은 성장 초기에 빠른 촉진을 야기하며, 구리는 배양일이 지속될수록 성장을 촉진하는 것으로 판단된다. 그러나 과도한 농도를 처리할 경우 오히려 균사체의 변색 또는 노화를 촉진하거나 성장을 저해하는 것으로 확인되어 적정 농도는 250~500 μM로 설정하는 것이 타당할 것으로 사료된다.

진핵생물에서 아연, 카드뮴, 구리 등과 같은 금속이온들이 필수 보조인자로 작용하여 대사과정에 관여하는 것으로 알려져 있는데, 상기 연구결과를 바탕으로 철 이온에 의한 대사 촉진이 야기된 것으로 생각되며, 금속이온에 의한 생장 촉진 여부는 최초로 확인된 것으로 타 임산버섯에 적용할 수 있을 것이다.

실시예 5: 톱밥배양 자실체 발생 시기 단축 및 첨가물의 간소화

본 발명에서 톱밥배양에 사용된 톱밥은 낙엽송, 미송, 포플러, 참나무 4종류를 사용하였으며, 별도의 영양원을 첨가하지 않고, pPIC-RCL1 배양액만을 사용하여 부숙하였다. 부숙기간동안 톱밥에서 푸른곰팡이 등의 진균류가 자라는 것을 최소화하기 위해 밀폐용기를 사용하였으며, 종균 접종 후 배양에 사용된 봉지는 일반적인 폴리에틸렌 재질의 것을 사용하였다. 톱밥 부숙을 위해 90분간 고압멸균을 실시하여 완전히 식힌 톱밥 200 g에 pPIC-RCL1 배양액 200 mL을 섞은 후 밀폐용기에 담아 상온에서 보관하였고, 배양액 1차 첨가 후 7일 동안 12시간 간격으로 교반하였으며, 7일 후 pPIC-RCL1 배양액 200 mL를 2차 첨가하여 다시 7일 동안 부숙을 실시하였다. 이 때 60% 이상의 수분을 유지하였으며, 부족할 경우 멸균수로 수분을 보충하였다. 부숙된 톱밥은 90분 동안 고압멸균을 실시한 뒤 완전히 식힌 후 전라북도농업기술원에서 분양받은 화이트블루밍 품종(White blooming)의 꽃송이버섯 톱밥종균 약 20 g을 접종하였으며, FeCl₂의 자실체 성장에 미치는 영향을 확인하기 위해, 접종 전 주사기 여과를 거친 250 mM FeCl₂ 500 또는 1000 μL(각각 톱밥 1g 당 79.2 및 158.4 μg)를 첨가하여 균사의 성장 촉진을 유도하였다. 대조군에는 FeCl₂를 처리하지 않았다. 접종된 톱밥은 온도 25~29℃, 습도 60% 이상의 조건에서 90일동안 배양하였다(도 14 및 도 15). 배양 결과 접종 후 낙엽송 톱밥에서 30일만에 자실체가 관찰되었고, FeCl₂ 첨가군에서 상대적으로 많은 자실체가 나타났으며, 특히 500 μL 용량을 섞은 배양군이 가장 많은 자실체 발생을 보였다. 이후 60일이 경과하면서 2~3 cm이상의 자실체가 발생하였으며, 일부 개체의 경우 80일 경과 시 7 cm이상의 갓 직경을 보이기도 하였다. 한편, 미송의 경우 40~50일 경과 시부터 작은 자실체가 확인되었으나 뚜렷한 성장은 보이지 않았으며, 포플러의 경우 발이는 되었으나 자실체 형성이 원활하지 않았고, 참나무에서는 균사의 성장이 관찰되지 않았다. 종래의 보고에 따르면 톱밥에 종균을 접종한 후 꽃송이버섯의 자실체 생산에 요구되는 기간은 개발자에 따라 다소 차이를 보이고 있다. 한국공개특허 제2005-0099828호(출원인: 대한민국)은 80~100일, 한국공개특허 제2003-0010727호(출원인: 대한민국)은 80일만에 자실체를 생산한 것으로 보고하고 있다(표 4). 또한, 국립산림과학원에서 수행한 꽃송이버섯 재배 실용화 기술 개발을 위한 연구에서 12개 균주에 대한 재배 특성을 시험한 결과 균사배양 기간은 61~94일이 소요되었으며, 자실체 발생기간은 균사배양 이후 29~63일이 추가적으로 소요되는 것으로 확인되어 배양기간이 빠른 균주의 개발 또는 자실체 성숙을 촉진하는 방법의 필요성이 제기된 바 있다(가강현 외, 국립산림과학원 연구자료 제295호, 2009). 상기 종래의 연구에는 종균을 톱밥배지에 접종 후 짧게는 47일부터 길게는 90일까지 배양기간이 필요한 것으로 알려져 있으나 본 발명에서는 톱밥종균 접종 후 30일만에 자실체의 형성이 관찰되었으며, 약 2개월이 경과한 시점에서 완전한 형태의 꽃송이버섯을 확인할 수 있었다.

꽃송이버섯 재배법에 대한 특허 비교

구분	한국공개특허 제2003-0010727호	한국공개특허 제2005-0099828호	본 발명
톱밥	침엽수와 활엽수 혼합	침엽수	침엽수
첨가물	탄소원, 질소원, 무기염류, 수소이온농도 조정제 등	보릿가루, 설탕, 밀기울 등	pPIC-RCL1 배양액, FeCl₂
자실체 수확시기 (일)	80	80~100	80

본원발명의 경우 상기 선행기술과 자실체 수확시기는 유사하였으나, 상기 선행기술들은 배지에 포함되는 첨가물이 매우 많고 광조사를 하는 등 재배조건이 매우 까다로운 반면, 본원발명의 경우 단순 톱밥배지와, 라카아제 발현 효모 배양액만을 사용하였을 뿐 특수 첨가제를 사용하지 않았고, 광조사와 같은 복잡한 공정 없이도 종래기술과 유사한 정도로 수확시기 앞당길 수 있었다는 점에서 진일보한 꽃송이버섯 재배방법을 확립한 것으로 볼 수 있다.

실시예 6: 라카아제 의한 항균활성 검증

종래의 보고에 따르면, 라카아제가 가지고 있는 항균력에 대한 보고가 있으며(미국등록특허 제6,228,128호), 페놀 화합물이 라카아제에 의해 분해된 뒤 항균성이 높아지는 것이 확인된 바 있어(Pei et al., BioResources, 8(1): 515-529, 2013) 꽃송이버섯의 실내 배양 시 라카아제를 처리함에 따라 배지의 목재 성분들이 분해되는 동시에 버섯의 성장을 저해하는 진균 및 세균에 대한 항균 작용을 통해 균사체의 활착능이 향상됨을 확인하였다. pPIC-RCL1 배양액의 푸른곰팡이 억제능을 확인하기 위해 꽃송이버섯 배양 중에 오염된 균주에서 푸른곰팡이(Penicillin sp.)를 분리하여 배양한 뒤 실험에 사용하였다. pPIC-RCL1 배양액을 PDB 배지와 50~3.1%(v/v) 비율로 혼합한 후 푸른곰팡이를 접종한 결과 50%의 비율이 함유된 실험군에서 푸른곰팡이의 성장 억제가 확인되었다(도 16). 증발농축기를 이용해 용매를 제거한 결과 처리된 배양액 내에 용해되어 있는 Glac1 및 영양배지 성분은 약 81.9 mg/ml이었으며, 이 중 Glac1은 18.41 μg(0.4 U/mg)으로 산출되었다. 따라서 푸른곰팡이 오염을 방지하기 위해서는 pPIC-RCL1 배양액은 건중량을 약 80 mg/ml, Glac1은 약 18 μg이 첨가되어야 할 것으로 판단하였다. pPIC-RCL1 배양 후 상층액을 분리하여 항균 효능을 검증하기 위해 배지에 30, 15, 7.5%(v/v)의 비율이 되도록 pPIC-RCL1 배양액을 혼합한 뒤 Stephylococcus aureus(황색포도상구균)을 대상으로 최소성장억제농도(MIC, minimal inhibitory concentration) 측정법을 수행하였다. 이때 대조군으로는 암피실린(ampicillin)을 사용하였다. 그 결과 30%의 비율로 첨가한 실험군에서 황생포도상구균의 성장을 저해하였으며, 처리된 배양액 내에 용해되어 있는 Glac1 및 영양배지 성분은 약 49.9 mg/ml이었으며, Glac1은 11.22 μg(0.24 U/mg)로 나타났다(도 17). 따라서 충분한 pPIC-RCL1 배양액을 톱밥부숙시 첨가했을 때 항진균 및 항균 효과를 동시에 얻을 수 있을 것으로 예상되어 꽃송이버섯 재배 시 큰 문제로 부각되는 오염의 우려를 감소시킬 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 꽃송이버섯의 속성재배를 위한 라카아제 처리 톱밥배지에 관한 내용을 위주로 기술되어 있으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 버섯 재배방법은 종래에 톱밥배지를 이용하여 배양되던 다른 버섯들 예컨대, 상황버섯(Phelinus linteus), 차가버섯(Inonotus obliquus), 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum), 신령버섯(Agaricus blasei), 영지버섯(Ganoderma lucidum), 팽이버섯(Flammulina velutipes), 잎새버섯(Griofora frodonsa), 목이버섯(Auricularia auricula), 만가닥버섯(Lyophyiium ulmarium), 버들송이(Agrocybe aegerita), 애느타리버섯(Pleurotus ostreatus), 새송이버섯(Pleurotus eryngii), 표고버섯(Lentinus edodes) 등 임산버섯(목재부후균)의 재배에도 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구 범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> GANGNEUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP <120> Novel cultivation method of mushroom <130> PD14-5101 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAC_fwd primer <400> 1 atggtgaaat tccaatcgtt gctct 25 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAC_rev primer <400> 2 gtgatcatca gccgagagcg c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' AOX1 primer <400> 3 gactggttcc aattgacaag c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' AOX1 primer <400> 4 gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims

라카아제(laccase)를 처리한 톱밥배지에 버섯 종균을 접종한 후 상기 버섯의 자실체가 형성되는 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는 버섯 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 라카아제는 라카아제를 발현하도록 형질전환된 효모의 배양액의 형태로 처리되는, 버섯 재배방법.
제1항에 있어서,
상기 라카아제는 톱밥 1 g 당 1 내지 10 U으로 처리되는, 버섯 재배방법.
제1항에 있어서,
상기 라카아제는 5 내지 12일 간격으로 두 차례 처리되는, 버섯 재배방법.
제4항에 있어서,
상기 버섯 종균은 두 번째 라카아제 처리 후 5 내지 12일 후에 접종되는, 버섯 재배방법.
제1항에 있어서,
상기 버섯은 꽃송이버섯(Sparassis crispa), 상황버섯(Phelinus linteus), 차가버섯(Inonotus obliquus), 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum), 신령버섯(Agaricus blasei), 영지버섯(Ganoderma lucidum), 팽이버섯(Flammulina velutipes), 잎새버섯(Griofora frodonsa), 목이버섯(Auricularia auricula), 만가닥버섯(Lyophyiium ulmarium), 버들송이(Agrocybe aegerita), 애느타리버섯(Pleurotus ostreatus), 새송이버섯(Pleurotus eryngii), 표고버섯(Lentinus edodes) 등 임산버섯(목재부후균)인, 버섯 재배방법.
제1항에 있어서,
상기 톱밥배지는 침엽수 톱밥 배지인, 버섯 재배방법.
제7항에 있어서,
상기 침엽수는 낙엽송 또는 미송인, 버섯 재배방법.
제1항에 있어서,
상기 톱밥배지에 금속의 염을 추가로 처리하는, 버섯 재배방법.
제9항에 있어서,
상기 금속은 철, 구리, 아연, 나트륨 또는 칼슘인, 버섯 재배방법.
제9항에 있어서,
상기 금속의 염은 CuCl₂ 또는 FeCl₂인, 버섯 재배방법.
제9항에 있어서,
상기 금속의 염은 톱밥 1g 당 30 내지 300 μg으로 처리되는, 버섯 재배방법.
라카아제(laccase)가 처리된 침엽수 톱밥을 포함하는 꽃송이버섯 재배용 고체배지.
제13항에 있어서,
상기 라카아제는 라카아제를 발현하도록 형질전환된 효모의 배양액의 형태로 처리되는, 꽃송이버섯 재배용 고체배지.
제13항에 있어서,
금속의 염이 추가로 포함되는, 꽃송이버섯 재배용 고체배지.