KR20160040647A

KR20160040647A - 플래너 패치 클램프 장치 및 플래너 패치 클램프 시스템

Info

Publication number: KR20160040647A
Application number: KR1020167005553A
Authority: KR
Inventors: 쯔네오 우리스; 쯔홍 왕; 히데타카 우노; 야스타카 나가오카; 케이 코바야시
Original assignee: 고쿠리츠켄큐카이하츠호진 카가쿠기쥬츠신코키코
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2016-04-14
Also published as: WO2015030201A1; EP3040410B1; JPWO2015030201A1; EP3040410A4; CN105555945B; TW201536915A; US20160209395A1; KR101842069B1; JP6377063B2; DK3040410T3; CN105555945A; US9977009B2; EP3040410A1; SG11201601487XA

Abstract

본 발명은 세포배치영역(4) 내에 세포는 통과하지 않지만 액체는 통과하는 관통구멍(3)을 가지는 전기절연성 기판(2)과, 기판(2)의 제1 표면(2S)측에서 관통구멍(3)과 연통 가능하게 설치되어 제1 도전성 액체를 보유하는 제1 액류부(6)와, 제1 액류부(6)와 전기적 도통 가능하게 배치되는 제1 전극부(7)와, 기판(2)의 제2 표면(2S')측에서 관통구멍(3)과 연통 가능하게 설치되어 제2 도전성 액체를 보유하는 제2 액류부(6')와, 제2 액류부(6')와 전기적 도통 가능하게 배치되는 제2 전극부(7')와, 제2 액류부(6')에 제2 도전성 액체를 송액하는 송액유로(8)와, 제2 액류부(6')로부터 제2 도전성 액체를 배액하는 배액유로(9)와, 송액유로(8) 및/또는 배액유로(9)에 설치되어 제2 도전성 액체의 유통을 허용 또는 정지할 수 있는 동시에, 제2 액류부(6')와 제2 전극부(7')와의 전기적 도통을 허용 또는 정지할 수 있는 밸브(10)를 가지는 플래너 패치 클램프 장치이다.

Description

플래너 패치 클램프 장치 및 플래너 패치 클램프 시스템{Planar Patch Clamp Device and Planar Patch Clamp System}

본 발명은, 세포막의 전기활동에 따르는 전류 등을 계측하는 플래너 패치 클램프 장치 및 플래너 패치 클램프 시스템에 관한 것이다. 또한, 플래너 패치 클램프 장치 또는 플래너 패치 클램프 시스템을 이용한 약제의 스크리닝 방법에도 관한 것이다.

세포막에 매립되어 있는 막단백질인 이온채널은, 생체계의 신호전달에 관한 중요한 단백질이다. 이러한 이온채널의 기능의 계측이나, 그 기능을 이용한 약품개발에 있어서, 이온채널을 흐르는 전류를 계측하는 것이 요구된다. 이러한 요구에 따라, 이온채널 전류를 계측하는 기술로서 개발된 것이, 패치 클램프법이다.

패치 클램프법으로서 최초로 개발된 것은 피펫 패치 클램프법인데, 세포의 이온채널 전류를 단점으로밖에 기록할 수 없어, 다점계측에 의한 하이스루풋 스크리닝에 응용할 수 없다는 과제가 있었다. 이러한 과제를 해결하는 기술로서, 플래너 패치 클램프법이 개발되었다. 플래너 패치 클램프법은, 예를 들어 일본공표특허공보 2003-511668호(특허문헌 1), 일본공표특허공보 2005-536751호(특허문헌 2) 등에 개시되는 바와 같이, 실리콘칩 등의 고체기판에 복수의 미세한 관통구멍을 설치하는 동시에, 각 관통구멍 상에 세포를 배치하고, 전극을 이용하여 각 세포의 이온채널 전류를 계측함으로써, 이온채널 전류의 다점계측을 가능하게 한 것이다. 구체적으로는, 기판 상의 세포의 주위에 배스용액, 기판의 관통구멍의 하부에 피펫용액을 각각 배치하고, 배스용액 및 피펫용액에 각각 전기적으로 도통된 전극(상부전극 및 하부전극)을 배치하여, 전극 사이에 막전위를 인가함으로써, 이온채널 전류가 측정된다.

본 발명자들은 지금까지 플래너 패치 클램프법에 대하여 다양한 개량을 제안하여 왔다. 예를 들어, 일본공개특허공보 2009-204407호(특허문헌 3) 및 Urisu et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, (2008), 391:2703-2709(비특허문헌 1)에는, 기판 관통구멍의 둘레에 세포외 매트릭스 형성물질을 설치함으로써, 관통구멍의 개구부에 배치된 세포의 수명을 연장하고, 세포를 배양하면서 이온채널 전류를 측정하는 것을 가능하게 한 배양형 플래너 패치 클램프 장치가 개시되어 있다. 국제특허공개공보 제2013/094418호 팸플릿(특허문헌 4)에는, 전극용기 말단을 무기다공질 재료로 구성하여, 포화전극용액을 밀폐한 전극부(염교형 전극부)를 이용함으로써, 막전위 변동을 방지하여 노이즈를 저감하고, 전류측정 정밀도를 향상시킨 플래너 패치 클램프 장치가 개시되어 있다. 국제특허출원 제PCT/JP2013/57976호(WO2014/045618: 특허문헌 5)에는, 세포배양 기판의 관통구멍을 포함하는 세포배치영역에, 돌기부로 둘러싸인 세포정착부분을 형성함으로써, 신경세포 이동을 제약하면서 신경 네트워크를 구성하게 하는 것을 가능하게 하여, 전류측정 정밀도를 향상시킨 플래너 패치 클램프 장치가 기재되어 있다.

특허문헌 1: 일본공표특허공보 2003-511668호 특허문헌 2: 일본공표특허공보 2005-536751호 특허문헌 3: 일본공개특허공보 2009-204407호 특허문헌 4: 국제특허공개공보 제2013/094418호 특허문헌 5: 국제특허공개공보 제2014/045618호

비특허문헌 1: Urisu et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, (2008), 391:2703-2709

그런데, 플래너 패치 클램프 장치에서는, 기판 관통구멍 하에 피펫용액 등의 도전성 액체를 보유하는 액류부가 배치되는 동시에, 이러한 액체의 도입이나 교환을 위하여, 액류부에 송배액(送排液)용의 유로가 연결된다. 하부전극은 통상적으로 이러한 유로에 설치된다. 하지만, 이러한 송배액 유로를 통하여 도전성 액체가 누액되기 쉬운 동시에, 비측정시에도 이러한 송배액용 유로를 통하여 하부전극에 전류가 누전되기 쉬어, 전극이 열화하기 쉽다는 과제가 있었다.

또한, 플래너 패치 클램프 장치를 각종 스크리닝에 응용하는 경우, 그 하이스루풋화는 매우 중요하다. 원리적으로는, 단일 채널의 패치 클램프 장치를 다수 배치함으로써, 하이스루풋화가 달성된다. 하지만, 이러한 구성의 패치 클램프 장치에서는, 장치 전체가 대형화되어서 부피가 커져 버리는데다가, 장치마다 전극을 배치하지 않으면 안되므로, 그 보수나 교환의 작업이 필요해진다는 과제가 있었다.

특히, 배양형 플래너 패치 클램프법에서는, 상기 일본공개특허공보 2009-204407호(특허문헌 3)에 기재된 바와 같이, 관통구멍의 둘레에 세포외 매트릭스 형성물질을 부착한 기판이 사용된다. 이로 인하여, 상기 국제특허공개공보 제2013/094418호 팸플릿(특허문헌 4)에 개시되어 있는 바와 같이, 트랩된 세포의 세포막과 기판 표면 사이에 아주 작은 간극이 발생하여, 이에 의하여 씰저항이 저하되며, 또한 이러한 간극을 흐르는 리크전류 때문에, 인가 막전위의 변동에 대하여 노이즈 전류가 커진다는 과제가 있었다. 따라서, 인가 막전위의 변동을 저감하기 위하여, 은선 표면을 클로라이드화한 AgCl/Ag선을 용기에 수납하고, KCl 및 AgCl을 각각 포화상태로 용해시킨 포화전해액으로 용기를 충전한 후, 전극용기 말단을 무기다공질 재료로 구성하고, 포화전극용액을 밀폐한 정밀하고 섬세한 전극부(염교형 전극부)가 사용된다. 전극부는, 단기간(예를 들어, 1일 등) 사용마다, 전극부의 해체나 세정, 포화전해액의 교환, 더욱이는 전극부 자체의 교환 등의 작업이 필요해진다. 염교형 전극부 내의 포화전해액의 교환 시에는, 기포가 들어가지 않도록 세심한 주의를 기울일 필요가 있으며, 그 결과 보수에 소비하는 작업이나 시간이 방대해진다. 다채널에서는 보수다 더욱 힘들어진다.

본 발명자들은 이러한 과제에 감안하여 예의 검토한 결과, 기판의 세포배치면과는 반대측인 액류부와 전극부와의 사이의 송배액 유로에 밸브(바람직하게는 마이크로 밸브)를 배치하고, 그 밸브에 의하여 전해액의 유통 및 전기적 도통의 허용/정지를 제어하는 구성의 플래너 패치 클램프 장치를 창안하고, 이에 따라 상기 과제가 해결되는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명의 주지는 이하에 있다.

[1]

세포배치영역을 가지는 제1 표면 및 그 반대면인 제2 표면을 가지는 동시에, 세포배치영역 내에 세포를 통과시키지 않지만 액체를 통과시킬 수 있는 관통구멍을 가지는 전기절연성 기판과,

전기절연성 기판의 제1 표면측에서 관통구멍과 연통 가능하게 설치되며, 제1 도전성 액체를 보유하기 위한 제1 액류부와,

제1 액류부와 제1 도전성 액체를 통하여 전기적 도통 가능하게 배치되는 제1 전극부와,

전기절연성 기판의 제2 표면측에서 관통구멍과 연통 가능하게 설치되며, 제2 도전성 액체를 보유하기 위한 제2 액류부와,

제2 액류부와 제2 도전성 액체를 통하여 전기적 도통 가능하게 배치되는 제2 전극부와,

제2 액류부에 연결되며, 제2 액류부에 제2 도전성 액체를 송액하는 송액유로와,

제2 액류부에 연결되며, 제2 액류부로부터 제2 도전성 액체를 배액하는 배액유로와,

송액유로 및/또는 배액유로에 설치되며, 제2 도전성 액체의 유통을 허용 또는 정지할 수 있는 동시에, 제2 액류부와 제2 전극부와의 전기적 도통을 허용 또는 정지할 수 있는 밸브를 가지는 플래너 패치 클램프 장치.

[2]

항목 [1]에 있어서,

전기절연성 기판이 세포배치영역 및 그것에 대응하는 관통구멍을 각각 복수 가지는 동시에, 복수의 세포배치영역에 대응하여 제2 액류부가 복수 설치되고,

송액유로가, 송액주유로와, 송액주유로로부터 분기되며, 복수의 제2 액류부에 각각 연결되는 복수의 송액지유로를 가지며,

배액유로가, 복수의 제2 액류부에 각각 연결되는 복수의 배액지유로와,

복수의 배액지유로가 합류하는 배액주유로를 가지고,

제2 전극부가, 송액주유로 및/또는 배액주유로에 설치되며,

밸브가, 각 송액지유로 및/또는 각 배액지유로에 설치되는 플래너 패치 클램프 장치.

[3]

항목 [1] 또는 [2]에 있어서,

밸브 폐쇄 시에 있어서의 밸브 전후의 전기저항값이 1메가옴 이상인 플래너 패치 클램프 장치.

[4]

항목 [1]~[3] 중 어느 한 항에 기재된 플래너 패치 클램프 장치와,

상기 플래너 패치 클램프 장치의 각 밸브의 개폐를 제어하는 제어부와,

상기 플래너 패치 클램프 장치의 각 전극부에 있어서의 전기신호를 검출하는 전기검출부를 구비하는 플래너 패치 클램프 시스템.

[5]

항목 [4]에 있어서,

상기 플래너 패치 클램프 장치를 복수 구비하는 플래너 패치 클램프 시스템.

[6]

항목 [4] 또는 [5]에 있어서,

상기 플래너 패치 클램프 장치에 배치된 세포에 유래하는 광신호를 검출하는 광검출부를 더 구비하는 플래너 패치 클램프 시스템.

[7]

항목 [1]~[3] 중 어느 한 항에 기재된 플래너 패치 클램프 장치, 또는 항목 [4]~[7] 중 어느 한 항에 기재된 플래너 패치 클램프 시스템을 이용하여, 신경 네트워크에 영향을 주는 약제를 스크리닝하는 방법.

본 발명의 플래너 패치 클램프 장치에 따르면, 기판(2) 하부의 액류부에 연결된 송배액 유로에 있어서의 액체(전해액 등)의 유통 및 전기적 도통을, 밸브에 의하여 함께 제어할 수 있으므로, 송배액 유로를 통한 누액이나 누전을 확실하게 방지하는 것이 가능하게 된다. 이에 따라, 비측정시의 누전에 의한 전극의 열화를 방지할 수 있다. 또한, 기판 하부의 액류부의 액체의 교환도 보다 용이해진다.

또한, 복수의 패치 클램프 장치를 배치한 다채널형 패치 클램프에서도, 전극부를 공통화할 수 있어, 전극부의 보수작업을 간략화·단축할 수 있게 된다. 특히, 전극부의 보수작업이 번잡한 배양형 플래너 패치 클램프 장치에서는, 이러한 전극부의 보수작업의 간략화·단축의 이점은 매우 크며, 장치의 하이스루풋화에 크게 기여한다. 더욱이는, 전극부의 공통화에 의하여, 장치의 소형화도 가능해진다.

더욱이, 본 발명의 플래너 패치 클램프 장치를 복수 설치한 복합형의 플래너 패치 클램프 시스템에 따르면, 플래너 패치 클램프 장치 사이에서도 전극부를 공통화하는 것이 가능해진다. 이에 따라, 하이스루풋화가 더욱 달성된다.

도 1은 단일 채널형 플래너 패치 클램프 장치(1)의 구성의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 2는 염교형 전극부(7, 7')의 구성의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 3a 내지 3c는 마이크로 밸브(31)의 구성의 일례를 나타내는 개략도이다. 도 3a는 마이크로 밸브(31)의 사시도이고, 도 3b는 도 3a의 마이크로 밸브(31)의 상면도이며, 도 3c는 도 3a의 마이크로 밸브(31)의 a-a', 및 b-b' 단면도를 나타낸다. 도 3a 내지 3c에 있어서, 좌측의 도면은 폐쇄 상태의 마이크로 밸브(31)를, 우측의 도면은 개방 상태의 마이크로 밸브(31)를 나타낸다.
도 4a는 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1a)의 구성의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 4b는 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1a)의 구성의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 4c는 전극부를 2개 설치한 경우의 다채널형 플래너 패치 클램프 장치의 구성의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 5의 (a)는 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1a)를 복수 설치한 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)의 구성의 일례를 나타내는 개략도이다. 도 5의 (b)는 도 5의 (a)의 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)가 가지는 유로계의 구성의 일례를 설명하기 위한 개념도이다. 도 5의 (c)는 도 5의 (a)의 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)에 있어서의 4개의 다채널형 플래너 패치 클램프 기판을 배치한 기판배치영역을 나타내는 개략도이다.
도 6은 다채널(5채널)형 플래너 패치 클램프 기판의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 7은 다채널형 플래너 패치 클램프 장치의 밸브(10)의 제어계의 구성의 일례를 나타내는 개념도이다.
도 8a는 도 5에 나타내는 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)의 20채널 내의 1채널을 이용하여 행한 Ca² ⁺ 이미징의 화상을 나타낸다. 도 8b는 도 8a에 나타내는 세포 1에 대하여 2회의 전류주입을 행하였을 때, 도 8a에 나타내는 세포 1~4에서 관찰된 활동전위를 Ca² ⁺ 이미징화하여 얻어진 형광 강도의 경시변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 도 5에 나타내는 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)를 이용한 채널 로돕신(rhodopsins) 발현 세포에 있어서의 채널 전류의 경시변화를 나타내는 그래프이다.
도 10은 세포정착부분에 신경세포를 배치하고, 신경 네트워크를 형성시킨 것을 광학현미경으로 관측한 사진이다.
도 11a는 관통구멍에 배치된 신경세포에 작은 구멍을 뚫고 홀셀 모드를 형성한 경우에, 인가 막전위에 따라서 발생한 채널 전류를 나타낸다. NoNT-n30은, 나이아신을 첨가하지 않아, 홀셀모드가 되지 않은 경우의 채널 전류를 나타내며, 그 경우 전류변화가 거의 발생하지 않는 것이 나타난다.
도 11b는 글루타민산을 첨가한 경우에 있어서의 인가 막전위에 따라서 발생한 채널 전류를 나타낸다.
도 11c는 글루타민산의 첨가 후에, AMPA 수용체 안타고니스트 및 NMDA 수용체 안타고니스트를 첨가한 경우의 채널 전류를 나타낸다.
도 12는 도 11의 인가 막전위 -20mV의 채널 전류에 주목하여, 관측되고 있는 하나하나의 펄스형상 파형의 면적을 계산하여 그래프화한 도면이다. 도 12a 내지 12c에 있어서, 가로축은 각 펄스의 면적, 세로축은 소정의 면적의 펄스수이다. 채널 전류 펄스의 총합을 도 12d에 나타내었다.
도 13은 형성된 신경 네트워크에 있어서의 Ca² ⁺ 이미징의 결과를 나타내는 사진이다. 도 13a는 미첨가 상태에서 Ca² ⁺ 이미징 계측을 행한 결과이고, 도 13b는 그 후에 10μM 농도의 글루타민산을 첨가한 완충용액(500μL)을 첨가한 상태에서 Ca²⁺ 이미징을 행한 결과이며, 도 13c는 글루타민산의 첨가 후에 2.5mM의 D-AP5 및 2.5mM의 CNQX를 첨가한 상태에서 Ca²⁺ 이미징을 행한 결과이다.

[과제]

본 발명의 플래너 패치 클램프 장치는, 기판의 세포배치면과는 반대측의 액류부와 전극부 사이의 유로에 밸브(바람직하게는 마이크로 밸브)를 배치하고, 그 밸브에 의하여 전해액의 유통 및 전기적 도통의 허용/정지를 제어하는 구성을 가진다. 플래너 패치 클램프 장치에 있어서는, 단일 채널 장치마다 송액유로 및 배액유로라고 하는 한쌍의 유로가 설치된다.

본 발명자들은 송액유로 및/또는 배액유로에 밸브, 바람직하게는 마이크로 밸브를 설치함으로써, 전체의 동작시간을 크게 바꾸지 않고, 전극부를 공통화하여, 장치의 소형화 및 보수작업의 간략화·단축을 달성할 수 있는 것을 발견하였다.

즉, 마이크로 밸브가 마이크로 유로를 개폐하는 데에 필요로 하는 시간은, 통상은 몇 초 이하이다. 또한, 전극으로부터의 채널 전류를 기록할 때에, 어느 채널로부터 다른 채널로 전환할 때의 전자회로의 응답속도는, 통상은 마이크로초 정도로 매우 빠르다. 본 발명자들은 이러한 점에 착안하여, 복수(예를 들어, n개)의 단일 채널 장치에 접속된 복수(예를 들어, n개)의 지송액유로 및 배액유로를 각각 1개의 송액주유로 및 배액주유로에 연결하는 동시에, 송액주유로 및/또는 배액주유로 내의 용액에 도통하도록 단일한 전극을 설치하고, 측정대상이 되는 단일 채널 장치의 송액지유로 및/또는 배액지유로만을 마이크로 밸브로 개방 상태로 하여 측정하는 구성을 창안하였다.

이러한 구성에 의하여, 전체의 동작시간을 크게 바꾸지 않고, 전극의 수를(예를 들어 1/n으로) 줄일 수 있게 된다. 또한, 마이크로 밸브는 전극에 비하여 대폭 작으므로, 장치 전체의 치수도 대폭으로 소형화하는 것이 가능해진다.

[단일 채널형 패치 클램프 장치]

우선, 단일 채널형의 플래너 패치 클램프 장치(이것을 적절히 '단일 채널 장치'라고 약칭함)에 대하여 설명한다. 단일 채널 장치는, 플래너 패치 클램프법에 의한 측정이 가능한 단일 구조단위(이것을 '채널'이라고 함)를 가지는 장치이다.

도 1에 본 발명의 일 실시형태에 따른 단일 채널형 플래너 패치 클램프 장치(단일 채널 장치)(1)의 모식단면도를 나타낸다. 단, 본 발명의 플래너 패치 클램프 장치는, 도 1의 단일 채널 장치(1)로 한정되는 것은 아니다.

도 1의 단일 채널 장치(1)는 제1 표면(2S) 및 제2 표면(2S')을 가지는 전기절연성 기판(2)을 가진다. 전기절연성 기판(2)의 제1 표면(2S)에는 세포배치영역(4)이 배치되고, 세포배치영역(4) 내에는 제1 표면(2S)과 제2 표면(2S')을 연통하는 관통구멍(3)이 설치된다. 그 관통구멍(3)의 크기는, 세포배치영역(4)에 배치되는 세포(5)를 통과시키지 않지만, 액체는 통과시킬 수 있는 크기로 설정된다. 따라서, 관통구멍(3)의 내부직경은, 사용하는 세포(5)의 크기에 따라서 적절하게 선택하면 된다. 예를 들어, 신경세포를 사용하는 관점에서는, 관통구멍(3)의 내부직경은 1~3μm 정도가 바람직한데, 이것으로 한정되지 않는다.

전기절연성 기판(2)의 재료도 제한되지 않는다. 예를 들어, 유리제, 세라믹제, 플라스틱제 등의 기판을 임의로 선택할 수 있다. 단, 아랫면으로부터의 레이저의 조사나, 현미경에 의한 관찰을 하는 관점에서는, 투명기판인 것이 바람직하다. 또한, 전기절연성 기판(2)은 단일재료로 형성되어도 좋으며, 복수의 재료를 혼합 또는 적층함으로써 형성되어도 좋다. 일례로서, 실리콘 기판을 사용하는 경우, 제1 표면(2S)측의 실리콘층과, 중간의 산화 실리콘층과, 제2 표면(2S')측의 실리콘층이 순차적으로 적층된 구조를 가지는 실리콘 기판(SOI(Silicon on Insulator) 기판)이 바람직하다. 이와 같은 적층구조의 실리콘 기판에 있어서는, 절연성이 매우 높은 중간층이 2개의 실리콘층 사이에 존재하므로, 측정대상세포(5)의 이온채널 폐쇄시에 고저항 상태를 확립할 수 있어, 백그라운드의 노이즈를 저감할 수 있다.

SOI 기판을 사용하는 경우, 중간층의 두께는, 기생용량 저감과 절연저항 증대의 관점에서는 두꺼운 편이 바람직하다. 또한, 중간층의 두께가 충분하지 않으면, 용량이 커지고, 저항이 낮아져서 노이즈가 증대하는 경우가 있다. 따라서, 중간층의 두께는, 예를 들어 5nm 이상, 그 중에서도 10nm 이상, 더욱이는 100nm 이상인 것이 바람직하다. 한편으로, 중간층이 너무 두꺼우면, 천공가공이 간단하지 않게 되는 경우가 있다. 이러한 관점에서 중간층의 두께는 10μm 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1μm 이하, 더욱 바람직하게는 500nm 이하이다.

또한, 기판(2) 표면의 관통구멍(3) 주변부에, 세포(5)가 고체 표면에서 생존하는데에 필요한 세포외 매트릭스 형성물질을 도포하고, 그 위에 세포(5)를 배치하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 세포(5)를 배양하면서 그 채널 이온전류를 계속적·장기적으로 측정하는 것이 가능하게 된다. 이러한 세포외 매트릭스 형성물질을 이용한 배양형 플래너 패치 클램프법의 상세에 대하여는, 본 발명자들에 의한 일본공개특허공보 2009-204407호(특허문헌 3) 및 Urisu et al., Analytical and Bioanalytical Chemistry, (2008), 391:2703-2709(비특허문헌 1)을 참조하길 바란다. 사용될 수 있는 세포외 매트릭스 형성물질로서는, 폴리진, 콜라겐(I형, II형, IV형), 피브로넥틴, 라미닌, 프로테오글리칸(베르시칸, 디코린 등), 프로테오글리칸(아글리칸), 링크단백질, 엔탁틴, 테나신, 프로테오글리칸〔콘드로이틴황산 프로테오글리칸, 헤파란황산 프로테오글리칸(퍼레칸 등), 케라탄황산 프로테오글리칸, 데르마탄황산 프로테오글리칸〕, 히알루론산(글리코사미노글리칸의 일종), 엘라스틴, 피브린 등이 예시되는데, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

또한, 기판(2) 표면의 관통구멍(3) 주변부에, 돌기부(후기 [복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치]에 있어서 설명하는 도 6의 부호(25) 참조)로 둘러싸인 세포정착부분을 형성하는 것도 바람직하다. 이에 따라, 특히 신경세포를 측정대상으로 하는 경우에, 신경세포의 이동을 제약하면서 신경 네트워크를 구성시키는 것이 가능해진다. 이러한 돌기부(25)로 둘러싸인 세포정착부분을 이용한 플래너 패치 클램프법의 상세에 대하여는, 본 발명자들에 의한 국제특허출원 PCT/JP2013/57976호(WO2014/045618)를 참조하길 바란다. 구체적으로는, 기판 표면 상의 관통구멍(3)의 주위에, 복수, 예를 들어 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 돌기부(25)를 설치하여 세포(5)의 이동을 방지할 수 있다. 이러한 돌기부(25) 사이에는, 신경세포의 세포체를 통과시키지 않는 한에 있어서 넓은 간격이 설정되어 있고, 또한 복수의 돌기부(25)에 의하여 규정되는 세포정착부분의 내부직경이, 1~9개의, 바람직하게는 1~5개의 신경세포의 세포체를 수용할 수 있는 크기이다. 돌기부(25) 대신에, 세포(5)보다 큰 폭과 깊이를 가지는 오목부를 형성하고, 세포정착부분으로 할 수도 있다. 더욱이, 이들의 복수의 오목부를 세포체보다 작은 폭의 홈으로 상호 연결함으로써, 신경세포의 이동을 제약하면서 신경 네트워크를 구성시키는 것이 가능해진다.

전기절연성 기판(2)의 제1 표면(2S)측에는, 관통구멍(3)과 연통 가능하게 제1 액류부(6)가 설치된다. 제1 액류부(6)에는, 세포배치영역(4)에 배치되는 세포(5)의 주위에 충전된 제1 도전성 액체(예를 들어, 배스용액으로 불리는 완충액이나 배양액 등)가 보유된다. 제1 액류부(6)는, 예를 들어 주액류부(6a)와 부액류부(6b)가 도입용 통액로(6c)를 통하여 전기적으로 연통된 구성을 가진다. 제1 액류부(6)에는, 도전성 액체를 도입하거나 배출하거나 하기 위한 통액로를 구비하여도 좋고, 또는 덮개부재(13)에 의하여 개폐 가능한 개구부를 구비하여도 좋다.

제1 도전성 액체는, 세포배치영역(4)에 배치한 세포(5)의 배양이나, 패치 클램프법에 의한 전기신호의 검출을 가능하게 하는 액체이다. 예를 들어, 제1 도전성 액체로서, 세포배양액을 사용하여, 세포를 배양한 후, 패치 클램프에 의한 전기신호의 검출을 행하기 위한 배스용액으로 치환하여 사용할 수도 있다. 또한, 배스용액으로 치환하지 않고, 세포배양액 그대로 패치 클램프를 행하여도 좋다. 세포배양액은, 세포종이나 분화단계에 따라서, 임의의 세포배양액이나 분화유도배양액을 적절히 선택할 수 있다. 세포배양액의 예로서, 이글배지, 둘베코 개변 이글배지(DMEM), 햄F10, F12 배지 등의 기초배지에, 염류, 혈청, 항생물질, 성장인자, 미량 영양소 등의 첨가제를 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 세포배치영역(4)에 간세포, 예를 들어 iPS 세포, ES 세포나 신경간세포, 더욱이는 분화 도중의 세포를 파종하고 배양하여, 원하는 세포, 예를 들어 신경세포로 분화시켜, 본 발명의 플래너 패치 클램프 장치에 있어서 전기신호의 검출을 행하여도 좋다. 그 경우, 간세포 배양액, 분화유도 배양액, 신경세포 배양액은 각각 다른 배양액이어도 좋고, 순차적으로 치환하여 사용할 수 있다. 운동 뉴런이나 글리아 세포의 배양액으로는, 상기 세포배양액에, 미량 영양소로서 레티노인산, 소닉헤지호그, cAMP 등이 첨가되어도 좋고, 성장인자로서 인슐린, 트랜스페린, 인슐린양 성장인자(IGF), 뇌유래 신경 영양인자(BDNF), 배양 글리아 세포 유래 신경 영양인자(GDNF)가 첨가되어도 좋다. 배스용액은, 패치 클램프법에 있어서 사용되는 배스용액이라면 임의의 용액이어도 좋다. 제1 도전성 액체에는, 세포에 자극을 주기 위하여, 또는 세포의 이미징을 가능하게 하기 위하여, 각종 시약이 첨가되는 경우도 있다.

또한, 제1 도전성 액체를 통하여 제1 액류부(6)와 전기적으로 도통되도록, 제1 전극부(7)가 배치된다. 이러한 제1 전극부(7)는, 제1 액류부(6)(예를 들어, 그 부액류부(6b)) 내의 제1 도전성 액체에 삽입된 상태로 배치된다. 또한, 제1 전극부(7)에는 어스전위가 인가되고, 이에 따라 제1 액류부(6) 내의 제1 도전성 액체는, 기준전위가 되도록 유지될 수 있다.

한편, 전기절연성 기판(2)의 제2 표면(2S')측에는, 관통구멍(3)과 연통 가능하게 제2 액류부(6')가 설치된다. 제2 액류부(6')에는, 제2 도전성 액체가 보유된다. 제2 도전성 액체는, 세포(5)의 배양이나, 패치 클램프법에 의한 전기신호의 검출을 가능하게 하는 액체이다. 예를 들어, 제2 도전성 액체로서, 세포배양액을 이용하여, 세포(5)를 배양한 후, 배치 클램프에 의한 전기신호의 검출을 행하기 위한 피펫용액 등의 완충액으로 치환하여 이용할 수도 있다. 또한, 관통구멍(3)은 매우 미소한 구멍이므로, 세포배양액을 이용하지 않고, 처음부터 피펫용액을 이용하여 세포(5)를 배양하여도 좋다. 세포배양액은, 제1 도전성 액체에 사용되는 세포배양액과 같아도 좋고, 다른 조성의 배양액이어도 좋다. 피펫용액은, 패치 클램프법에 있어서 사용되는 피펫용액이라면 임의의 용액이어도 좋다. 제2 도전성 용액에는, 이온 채널의 개폐에 관한 화학물질이나, 그 밖의 실험에 이용하는 시약을 용해시켜 이용하여도 좋다. 다른 실시형태에서는, 세포막에 미소한 구멍을 천공하는 목적으로, 세포막 천공성의 항생물질을 첨가한 제2 도전성 액체를 제2 액류부(6')에 도입할 수 있다. 세포막 천공성의 항생물질로는, 폴리엔계의 항생물질, 예를 들어 암포테리신B, 나이스타틴, 나타마이신 등을 들 수 있다.

제1 액류부(6) 및 제2 액류부(6')(이들을 합하여 단순히 '액류부'라고 하는 경우가 있음)는, 도전성 액체를 보유하고, 또한 도전성 액체에 대하여 전극부(7, 7')를 통전 가능하게 배치한다고 하는 요구를 만족시키는 한, 임의의 구성을 취할 수 있다. 예를 들어, 액류부(6, 6')는 웰이어도 좋다. 또한, 기판(2)의 제1 표면(2S)측 및/또는 제2 표면(2S')측에 절연성의 스페이서 부재(11, 11')를 겹치고, 스페이서 부재(11. 11')에는 액류부(6, 6')에 대응하는 위치에 절결부를 설치함으로써, 액류부(6, 6')를 형성하여도 좋다. 제1 표면에 존재하는 스페이서 부재를 제1 스페이서 부재(11)로 하고, 제2 표면에 존재하는 스페이서 부재를 제2 스페이서 부재(11')로 한다. 더욱이, 제1 스페이서 부재(11)의 기판 반대측의 가장 바깥 둘레에 제1 플레이트 부재(12)를 배치하고, 플레이트 부재에 덮개부재(13)를 배치함으로써, 제1 액류부(6)를 폐쇄 공간 또는 액밀하게 구성하여도 좋다. 제2 스페이서 부재(11')의 기판 반대측에 더욱이 제2 플레이트 부재(12')를 배치하여 제2 액류부(6')를 액밀하게 구성하여도 좋다. 제2 플레이트 부재(12')에는 제2 액류부(6')에 연결하는 송액유로(8) 및 배액유로(9)가 관통하고 있다.

반드시 한정되는 것은 아니지만, 스페이서 부재(11, 11')는 절연성 부재라면 임의의 부재여도 좋고, 절연성 기판(2)과 같은 재료여도 좋으며, 달라도 좋다. 레이저 여기에 의한 산란광을 억제하는 관점에서, 제1 표면(2S)측의 제1 스페이서 부재(11)는 광불투과성의 재료로 이루어지는 것이 바람직한 한편으로, 현미경 관찰을 행하는 관점에서, 제2 표면(2S')측의 제2 스페이서 부재(11')는 광투과성의 재료로 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 제2 액류부(6')에는, 제2 액류부(6')에 제2 도전성 액체를 송액하는 송액유로(8)와, 제2 액류부(6')로부터 제2 도전성 액체를 배액하는 배액유로(9)가 연결된다. 송액유로(8) 및 배액유로(9)의 소재는 임의이며, 테프론(등록상표)이나 염화비닐 등의 튜브로 구성하는 것도 가능한데, 후술하는 밸브(10)를 설치하는 관점에서는, 실리콘 기판의 표면에 포토리소그래피에 의하여 레지스트 패턴을 형성한 몰드 등을 사용하여, PDMS(폴리디메틸실록산)나 RTV(room temperature vulacanizing: 실온경화형) 고무 등의 실리콘 고무에 전사하여 형성되는 마이크로 유로 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 마이크로 유로를 사용함으로써, 플래너 패치 클램프 장치의 조립이 매우 용이해져, 유로가 어긋나는 등의 불량을 피할 수 있게 된다. 송액유로(8) 및 배액유로(9)의 크기도 임의인데, 예를 들어 폭 100μm, 높이 약 50μm이다. 송액유로(8)는 제2 도전성 액체를 저장하는 저액조와 연결되어 있고, 유로의 임의의 부분에 배치된 펌프에 의하여 유로 내로 송액된다. 송액된 제2 도전성 액체는, 배액유로(9)를 통하여 배액된다. 펌프는 압력 인가 구동식이어도 좋고, 흡인 구동식이어도 좋다. 바람직하게는, 펌프는 배액유로(9)에 배치된 액체 흡인 디바이스이며, 제2 액류부(6')에 음압(陰壓)을 부가할 수 있다. 음압의 부가에 의하여, 관통구멍(3)에 존재하는 세포(5)에 의한 관통구멍(3)의 밀봉을 보다 강고한 것으로 할 수 있다. 이에 따라, 세포(5)와 전기절연성 기판(2) 사이의 씰저항을 높일 수 있다. 한편으로, 다른 실시형태에서는, 세포막을 천공하는 목적으로 보다 강한 음압을 부가할 수도 있으며, 홀셀 모드를 달성할 수도 있다.

또한, 제2 도전성 액체를 통하여 제2 액류부(6')와 전기적으로 도통되도록, 제2 전극부(7')가 배치된다. 이러한 제2 전극부(7')는 통상은 송액유로(8) 또는 배액유로(9)에 설치되고, 그 유로 내에 제2 도전성 액체를 도입한 경우에 제2 도전성 액체에 접촉하도록 배치된다. 이에 따라, 제2 액류부(6') 및 각 유로 내의 제2 도전성 액체의 전위를, 제2 전극부(7')를 통하여 측정할 수 있도록 구성된다. 또한, 제2 전극부(7')를 통하여, 제2 액류부(6') 및 각 유로 내의 제2 도전성 액체에, 임의의 전압을 인가할 수도 있도록 구성된다.

한편, 제1 전극부(7) 및 제2 전극부(7')(이들을 합하여 단순히 '전극부'라고 하는 경우가 있음)로는, 종래의 플래너 패치 클램프 장치에 사용되는 주지의 각종 전극부를 사용하는 것이 가능하다. 단, 상술한 배양형의 플래너 패치 클램프 장치에서는, 피펫 패치 클램프 장치나 비배양형의 플래너 패치 클램프 장치와 비교하여, 매우 씰저항이 낮고, 전극의 계면전위 변동에 따른 잡음 전류가 발생하기 쉬운 것이 알려져 있다. 따라서, 전극의 계면전위 변동을 최대한 방지하고, 잡음 전류를 저감하는 관점에서, 본 발명에서는 전극부로서, 본 발명자들이 국제특허공개공보 제2013/094418호 팸플릿(특허문헌 4) 등에서 보고한 염교형 전극부를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 염교형 전극부의 구성의 일례를 도 2에 모식적으로 나타낸다. 도 2의 염교형 전극부(7, 7')는 은선 표면을 클로라이드화한 Ag/AgCl 전극(16)을, KCl 포화용액인 전극용액(15)으로 충전한 전극용기(14) 내에 수납하고, 피펫용액과 접하는 전극용기(14) 선단을 무기 다공질 재료(17)로 밀봉한 구성을 가진다. Ag/AgCl 전극(16)은 전극핀(18)을 통하여 도선에 연결되어 있다. 이러한 구성에 의하여, 피펫용액의 염농도에 변동이 있어도, Ag/AgCl 전극(16)과 그것에 접하는 전극용액(15) 사이의 계면전위에 거의 전위 변동을 유기하지 않으므로, 잡음 전류를 매우 낮게 유지할 수 있다.

더욱이, 도 1의 단일 채널 장치(1)에 있어서는, 송액유로(8) 및/또는 배액유로(9)에 밸브(10)가 설치된다. 이러한 밸브(10)는, 제2 도전성 액체의 유통을 허용 또는 정지할 수 있는 동시에, 제2 액류부(6')와 제2 전극부(7')의 전기적 도통을 허용 또는 정지할 수 있도록 구성된다. 즉, 밸브(10)가 개방된 경우, 제2 도전성 액체의 유통이 허용되는 동시에, 제2 도전성 액체를 통하여 전기적 도통이 허용되는 한편으로, 밸브(10)가 폐쇄된 경우, 밸브(10)에 의하여 제2 도전성 액체가 분리되는 동시에, 밸브(10) 전후의 저항값에 의하여 전기적 도통이 차단된다. 여기에서, 송액유로(8) 및 배액유로(9)의 양쪽에 밸브(10)를 배치하여도 좋다. 이러한 경우, 이들 밸브(10)는 일괄적으로 개폐를 제어하여도 좋고, 개별적으로 개폐를 제어하여도 좋다. 한편으로, 송액유로(8) 또는 배액유로(9) 중 어느 한쪽에만 밸브(10)를 배치하여도 좋다. 이러한 경우, 밸브(10)가 배치된 유로에 대하여 제2 전극부(7')를 설치하면 좋다.

따라서, 밸브(10)는 비전도성 또는 절연성 밸브이다. 구체적으로는, 폐쇄 시의 전기저항값이, 예를 들어 1메가Ω 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3메가Ω 이상, 더욱 바람직하게는 5메가Ω 이상, 보다 한층 바람직하게는 10메가Ω 이상이다. 전기저항값의 상한값에 대하여는 특별히 제한은 없다.

밸브(10)의 종류는 제한되지 않지만, 예로서는, 마이크로 유로를 개폐 가능한 마이크로 밸브를 들 수 있다. 마이크로 밸브는, 마이크로 유로 내의 액체의 유통을 허용·정지하는 밸브로서, 통상은 가요성의 재료로 형성된 마이크로 유로와, 마이크로 유로에 인접하여 배치된 가동밸브와, 가동밸브를 구동 가능한 구동계를 가진다. 마이크로 밸브의 개방 시에는, 가동밸브는 마이크로 유로를 실질적으로 압박하지 않는 위치에 존재하여, 유로 내의 액체의 유통을 허용한다. 마이크로 밸브의 폐쇄 시에는, 구동계에 의하여 가동밸브가 마이크로 유로를 압박하는 위치로 변위하여, 마이크로 유로를 변형시켜서 유로 내 구멍을 폐지하여서, 유로 내의 액체의 유통을 정지한다. 구동계로서는, 구동원으로서 압축공기(압공)나 액체 등의 유체 압력을 이용한 압력구동계나, 피에조 소자 등에 의한 기계 구동계 등을 들 수 있다. 이러한 마이크로 밸브는 다양하게 알려져 있고, 본 발명에서는 어떤 것을 사용하는 것도 가능한데, 일례로서는, Stephen Quake 등이 개시하는 액압제어 마이크로 밸브(Journal of Applied Physics, vol95, (2004) 393-398) 등을 들 수 있다.

여기에서, 본 발명의 플래너 패치 클램프 장치에 있어서의 마이크로 밸브의 구성의 일례를, 도 3a 내지 3c를 참조하면서 설명한다. 단, 본 발명에서 사용 가능한 마이크로 밸브는, 결코 이것으로 한정되는 것은 아니다. 도 3a는 마이크로 밸브(31)의 사시도이고, 도 3b는 도 3a의 마이크로 밸브(31)의 상면도이며, 도 3c는 도 3a의 마이크로 밸브(31)의 A-A' 및 B-B' 단면도를 나타낸다. 도 3a 내지 3c에 나타내는 마이크로 밸브(31)는, 압축공기(압공) 구동형의 마이크로 밸브(31)로서, 가요성의 재료로 이루어지는 마이크로 유로(32)(송액유로(8) 또는 배액유로(9)에 상당함)와, 마이크로 유로(32) 아래쪽에 배치된 팽창·수축 가능한 공압패드(33)(가동밸브)와, 공압패드(33)에 연결되는 압공라인(21)을 구비한다. 압공라인(21)은, 압축공기를 공압패드(33) 내로 도입하거나, 또는 공압패드(33)로부터 배출함으로써, 압축공기의 압력을 통하여 공압패드(33)를 팽창·수축시키는 공압구동계를 구성한다. 이러한 마이크로 밸브(31)에 있어서, 마이크로 유로(32)와 공압패드(33)는 상호 고정되는 동시에, 공압패드(33)가 팽창하면, 마이크로 유로(32) 하면에 인접하는 공압패드(33) 상면이 위쪽으로 변위하여 마이크로 유로(32) 하면을 압박하며, 마이크로 유로(32)의 내부구멍을 변형시켜서 변형부(34)를 형성하여 폐지하도록 구성된다. 이에 따라, 마이크로 밸브(31)의 개방 상태(도 6a 내지 6c의 좌측 도면)에서는, 공압패드(33)는 수축상태에 있으며, 마이크로 유로(32)의 내부구멍은 개방되어 있으므로, 내부의 액체의 유통은 허용된 상태에 있다. 한편, 마이크로 밸브(31)의 폐쇄 상태(도 6a 내지 6c의 우측 도면)에서는, 압공라인(21)(공압구동계)으로부터 공압패드(33)에 압축공기가 도입되어 이것을 팽창시키고, 마이크로 유로(32)를 변형시켜 이것을 폐지함으로써, 내부의 액체의 유통이 정지되는 상태에 있다. 그 후, 마이크로 밸브(31)를 다시 개방 상태(도 6a 내지 6c의 좌측의 도면)로 하면, 압공라인(21)(공압구동계)에 의하여 공압패드(33)로부터 압축공기가 배출되어 이것을 수축시키고, 마이크로 유로(32)의 변형을 회복시켜, 내부의 액체의 유통이 재개된다. 이렇게 하여, 마이크로 밸브(31)에 의하여 마이크로 유로(32)(송액유로(8) 또는 배액유로(9)) 내의 액체(제2 도전성 액체)의 유통을 제어하는 것이 가능해진다.

한편, 본 발명에서 사용되는 마이크로 밸브(31)는 송액유로(8) 또는 배액유로(9) 내의 제2 도전성 액체의 유통을 허용·정지할 수 있는 것 뿐만 아니라, 제2 도전성 액체를 통한 제2 액류부(6')와 제2 전극부(7')와의 전기적 도통도 허용·정지할 수 있도록 구성된다. 이러한 마이크로 밸브(31)를 달성하기 위하여, 적어도 마이크로 밸브(31) 부분의 마이크로 유로(32)(송액유로(8) 또는 배액유로(9))를, 전기절연성을 가지며, 또한 가요성이 뛰어난 재료로 형성하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 가동밸브에 의하여 마이크로 유로(32)를 압박·변형하였을 때, 마이크로 유로(32) 내부구멍이 충분히 변형하여 그 내부구멍의 틈이 절연성 재료에 의하여 충분히 폐지되어, 전기적 도통을 차단하는 것이 가능해진다. 이러한 전기절연성을 가지며, 또한 가요성이 뛰어난 재료로서는, 예를 들어 PDMS(폴리디메틸실록산)나 RTV(room temperature vulcanizing: 실온경화형) 고무 등의 실리콘 고무를 들 수 있다.

더욱이, 마이크로 밸브(31)에 의하여 마이크로 유로(32)의 전기적 도통을 차단하기 위하여는, 액체의 유통을 정지하는 경우와 비교하여, 가동밸브에 의하여 마이크로 유로(32)를 보다 강하게 압박하고, 그 내부구멍을 보다 확실하게 폐지할 필요가 있다. 이를 위하여 필요한 가동밸브의 변위량이나 압력 등은, 마이크로 밸브(31)의 구성에 따라서 다르므로 일괄적으로 규정할 수는 없는데, 마이크로 밸브(31)의 구성을 고려하여, 충분한 전기저항값(예를 들어, 바람직하게는 1메가Ω 이상, 보다 바람직하게는 3메가Ω 이상, 더욱 바람직하게는 5메가Ω 이상, 보다 한층 바람직하게는 10메가Ω 이상)이 달성되도록, 당업자라면 쉽게 결정할 수 있다.

이러한 구성을 가지는 도 1의 단일 채널 장치(1)를 이용한 세포의 이온채널 전류의 측정은, 이하의 순서로 행하여진다.

우선, 전기절연성 기판(2)의 제1 표면(2S)의 세포배치영역(4)에, 관통구멍(3)을 덮도록 측정대상의 세포(5)를 배치한다. 또한, 제1 액류부(6)에는 제2 도전성 액체(예를 들어, 배스용액 등)가 제2 액류부(6')에는 제2 도전성 액체(예를 들어, 피펫용액 등)가 각각 충전된 상태로 한다.

이어서, 관통구멍(3)과 접하는 세포막의 표면에 미세한 구멍을 뚫고, 세포(5) 내부와 제2 액류부(6')의 제2 도전성 액체(피펫용액 등)를 전기적으로 도통한 상태(통상적으로 '홀셀' 상태라고 함)로 한다. 세포(5)를 홀셀 상태로 하는 수법은 제한되지 않지만, 예로서 특정한 항생물질(예를 들어, 나이스타틴 또는 암포테리신 등)을 제2 도전성 액체에 용해한 용액을 조제하고, 이러한 항생물질용액을 전류측정 직전에 제2 액류부(6')에 도입하여 세포막에 접촉시켜, 세포막에 미세한 구멍을 형성하는 수법을 들 수 있다(이 경우, 홀셀 상태의 달성 후, 전류측정 전에, 제2 액류부(6') 내의 용액을 다시 항생물질을 포함하지 않는 제2 도전성 액체로 치환함).

그 후, 제1 전극부와 제2 전극부 사이에, 소정의 전압(막전위라고 함)을 인가한다. 이에 따라, 세포막의 이온채널을 통과하는 전류를 채널 전류로서 기록할 수 있다.

한편, 이상 설명한 단일 채널 장치(1)에 있어서, 제1 액류부(6)는 통상은 절연성 기판(2)의 상측에 배치되는데, 그 윗벽을 개폐 가능하게 구성하여도 좋다. 여기에서부터 세포배치영역(4)으로의 세포의 배치, 세포배치영역(4)으로부터의 세포의 채취, 제1 도전성 액체의 충전이나 교환, 그 밖의 각종 처리(예를 들어, 이온채널의 블로커나 세포의 약제응답을 조사하기 위한 약제용액의 첨가 등)를 행할 수 있다. 단, 제2 액류부(6')와 마찬가지로, 제1 액류부(6)에도 송액유로(8) 및 배액유로(9)를 설치하고, 이들을 이용하여 제1 도전성 액체의 충전이나 교환 등을 행하여도 좋다.

한편, 제2 액류부(6') 내의 제2 도전성 액체의 충전이나 교환은, 송액유로(8) 및 배액유로(9)를 통하여 행하여진다. 즉, 외부의 공급원(미도시)으로부터, 송액유로(8)를 통하여 제2 도전성 액체를 송액하여, 제2 액류부(6') 내로 충전한다. 액체의 구동은, 통상은 송액유로(8) 또는 배액유로(9)에 펌프 등의 구동부(미도시)를 설치하여 행한다. 또한, 제2 액류부(6') 내에 액체가 이미 존재하는 경우에는, 배액유로(9)를 통하여 외부로 배출되며, 이에 따라 제2 액류부(6') 내의 액체가 교환된다.

여기에서, 도 1의 단일 채널 장치(1)에서는, 송액유로(8) 및/또는 배액유로(9)에 설치된 밸브(10)를 조작함으로써, 제2 도전성 액체의 유통·정지를 제어하는 동시에, 제2 액류부(6')와 제2 전극부와의 전기적 도통의 형성·절연을 제어하는 것이 가능하다. 이에 따라, 송액유로(8) 및/또는 배액유로(9)를 통하여 누액이나 누전을 확실하게 방지하는 것이 가능해진다. 나아가서는, 비측정 시의 누전에 의한 전극의 열화를 방지할 수 있다. 또한, 제2 액류부(6')에 있어서의 제2 도전성 액체의 교환도 보다 용이해진다.

배양형 패치 클램프 장치의 경우에는, 세포(5)의 배치 후에 장치를 인큐베이터 등에 넣고, 세포를 배양하여도 좋다. 이 경우, 장치를 인큐베이터 등에 넣을 때의 취급성이나 크기 제한 등을 고려하면, 기판을 포함하는 장치의 일부(예를 들어, 전원이나 액체원 등을 포함하지 않는 부분)를 절취 가능한 구성으로 하여도 좋다. 이에 따라, 장치의 일부만을 절취하여, 인큐베이터에 넣는 것이 가능해진다. 특히, 절취 부분의 말단에 밸브(10)를 배치함으로써, 절취 시에 밸브(10)를 폐쇄로 하고, 유로로부터의 액체의 유출을 방지하는 것이 가능해진다. 전류의 측정 시에 있어서는, 제1 액류부(6)에는 제1 도전성 액체(예를 들어, 배스용액 등)가, 제2 액류부(6')에는 제2 도전성 액체(예를 들어, 피펫용액 등)가 각각 충전된 상태로 한다.

[다채널형 플래너 패치 클램프 장치]

다음으로, 단일 채널 장치를 복수 조합한 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(이것을 적절히 '다채널 장치'라고 약칭함)에 대하여 설명한다. 다채널형 플래너 패치 클램프 장치는, 플래너 패치 클램프법에 의한 측정이 가능한 구조 단위(채널)를 복수 가지는 장치이다.

도 4a에, 본 발명의 일 실시형태에 따른 다채널형 장치(1a)의 모식단면도를 나타낸다. 단, 본 발명의 플래너 패치 클램프 장치는, 도 4a의 다채널 장치(1a)로 한정되는 것이 아니다. 예를 들어, 도 4b에 나타내는 바와 같이, 제1 액류부(6)에 있어서 세포배치영역이 연속하고 있고, 측정대상의 세포 사이에서 신경 네트워크를 형성시킬 수도 있다. 더욱이, 도 4c에 나타내는 바와 같이 제2 전극부를 구비하는 송배액계를 2개 이상 설치하여도 좋다. 송배액 유로에 설치된 밸브에 의하여, 측정대상의 세포를 각각의 송배액계에서 선택할 수 있다. 그에 따라, 세포 네트워크를 형성하고 있는 세포에 있어서의 전류 변화 또는 전위 변화를 2개 이상의 측정점에서 측정할 수 있으며, 밸브에 의하여 측정대상세포를 전환할 수도 있다.

도 4a 내지 4c의 다채널형 장치(1a)는, 전기절연성 기판(2)이, 세포배치영역(4) 및 그것에 대응하는 관통구멍(3)을 각각 복수 가진다. 또한, 복수의 세포배치영역(4)에 대응하여, 제2 액류부(6')도 복수 설치된다.

또한, 송액유로(8)는 송액주유로(8a)와, 송액주유로(8a)로부터 분기되는 복수의 송액지유로(8b)로 구성되고, 복수의 송액지유로(8b)는 복수의 제2 액류부(6')에 각각 연결된다.

그리고, 배액유로(9)도 배액주유로(9a)와, 배액주유로(9a)로부터 분기되는 복수의 배액지유로(9b)로 구성되고, 복수의 배액지유로(9b)는 복수의 제2 액류부(6')에 각각 연결된다.

또한, 제2 전극부(7')는 송액주유로(8a) 및/또는 배액주유로(9a)에 설치된다.

그리고, 복수의 제2 액류부(6')의 각각에 연결되는 송액지유로(8b) 및/또는 배액지유로(9b)에 밸브(10)가 설치된다.

제2 전극이 배치되어 있지 않은 유로에 대하여는, 지유로가 합류하여 주유로를 형성하지 않아도 좋다. 예를 들어, 송액주유로(8a)에 제2 전극부(7')가 배치된 경우, 배액지유로(8b)는 배액주유로를 형성하지 않고, 그대로 배액되어도 좋다.

그 밖의 구성 등은, 도 1의 다채널형 장치(1)와 마찬가지이다.

이러한 구성을 가지는 도 4a 내지 4c의 다채널형 장치(1a)를 이용한 세포(5)의 이온채널 전류의 측정은, 이하의 순서로 행하여진다.

우선, 전기절연성 기판(2)의 제1 표면(2S)의 복수의 세포배치영역(4)의 각각에, 관통구멍(3)을 덮도록 측정대상의 세포(5)를 배치한다. 또한, 제1 액류부(6)에는 제1 도전성 액체(예를 들어, 배스용액 등)가 제2 액류부(6')에는 제2 도전성 액체(예를 들어, 피펫용액 등)가 각각 충전된 상태로 한다.

이어서, 관통구멍(3)과 접하는 세포막의 표면에 미세한 구멍을 뚫고, 세포 내부와 제2 액류부(6')의 제2 도전성 액체(피펫용액 등)를 전기적으로 도통한 상태(홀셀 상태)로 한다.

다음으로, 계측하고자 하는 채널의 송액유로(8) 및/또는 배액유로(9)의 밸브(10)를 개방하고, 다른 밸브(10)를 모두 폐쇄함으로써, 계측하고자 하는 채널의 세포(5)만을 제2 도전성 액체를 통하여 제2 전극부(7')와 도통시킨다.

그 후, 제1 전극부(7)와 제2 전극부(7')의 사이에, 소정의 전압(막전위라고 함)을 인가한다. 이에 따라, 원하는 채널에 존재하는 세포(5)의 이온채널 전류를 기록할 수 있다.

한편, 도 4a 내지 4c의 다채널형 장치에서는, 제1 액류부(6)에 복수의 세포배치영역(4)이 존재하고, 세포배치영역(4)에 대응한 수의 관통구멍(3)이 존재한다. 여기에서, 세포배치영역(4) 사이에 칸막이를 부가할 수도 있으며, 그에 따라 제1 액류부(6)의 복수의 액류구획(22)으로 구분할 수 있다. 이러한 칸막이는, 파티션 부재(23)에 의하여 형성되어도 좋다. 예를 들어, 기판(2)의 제1 표면(2S)측에, 제1 스페이서 부재(11)를 중첩할 때, 제1 스페이서 부재(11)의 절결부에 파티션 부재(23)를 배치함으로써, 액류구획(22)으로 구분할 수 있다. 복수의 액류구획(22)이 존재하는 경우, 제1 전극부(7)를 각각의 액류구획(22) 내에 설치하여도 좋다. 단, 이들 복수의 액류구획(22) 사이에서 전기적 도통을 허용함으로써, 1개의 제1 전극부(7)에서 모든 액류구획(22)의 세포배치영역(4)의 세포(5)에 대하여 전기신호를 측정할 수 있게 된다. 따라서, 이러한 경우, 파티션 부재(23)로서 전기전도성의 부재, 예를 들어 금속이나 다공질 재료를 사용하여도 좋으며, 절연성의 부재를 이용하고, 더욱이 액체의 왕래는 거의 없는 충분히 좁은 통로에서 연결함으로써, 액류구획(22) 사이에서 전기적 도통을 달성할 수 있다. 제1 액류부(6)를 복수의 액류구획(22)으로 구분함으로써, 각 액류구획에 첨가된 약제의 세포에 대한 효과나 이온채널의 응답 등에 대하여, 마이크로 밸브(31)의 개폐에 의하여 계측하는 채널, 즉 계측하는 제1 액류부(6)의 액류구획(22)을 선택하여 계측할 수 있으므로, 복수의 약제의 효과를 단시간으로 측정할 수 있게 되어, 하이스루풋 스크리닝에 사용할 수 있다. 또한, 기판(2) 상에 배치된 파티션 부재(23)는, 덮개부재(13), 예를 들어 커버글라스 등에서의 윗쪽으로부터의 압력에서 기판(2)의 세포배치영역(4)에 형성된 복수의 기둥 형상의 돌기부(25)로 구성되는 세포정착부분(24)을 보호할 수도 있다.

[복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치]

다채널형 플래너 패치 클램프 장치를 복수 조합함으로써, 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치를 구성할 수 있다. 도 5는 이러한 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)의 일례를 나타내고, 구체적으로는, 5채널의 배양형 플래너 패치 클램프 장치를 4개 조합한 합계 20채널의 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)를 나타낸다. 도 5의 (a)는 이러한 장치(1b)의 상면도이고, 중앙의 원형부에 4개의 정방형의 다채널 기판(D1~D4)이 배치되며, 이러한 다채널 기판(D1~D4)에 있어서의 5개의 액류구획(22)에 있어서 전기신호를 측정할 수 있다. 더욱이, 원형부의 주위에, 4개의 유로분기판(M1~M4)과, 4개의 전치증폭기(P1~P4)가 배치되어 있다. 각 유로분기판에는, 밸브(10)의 제어를 가능하게 하는 5개의 압공(압축공기)라인(21)이 연결되어 있고, 각 전치증폭기는, 한쪽에서 유로분기판(M1~M4) 내에 배치된 제2 전극부(7')와 접속되고, 또 다른 한쪽에서 채널 전류계측용 기기에 접속된다. 도 5의 (b)는 유로분기판(M1~M4)의 확대도이고, 송액주유로 단자(19a)로부터 연결되는 송액주유로(8a), 그리고 송액주유로(8a)로부터 분기하는 송액지유로(8b)로 이루어지는 송액계와, 배액주유로 단자(20a)로부터 연장되는 배액주유로(9a), 그리고 배액주유로로부터 분기하는 배액지유로(9b)로 이루어지는 배액계, 그리고 그들의 액체의 유통 및 전기적 도통을 허용 또는 정지하는 밸브(10), 그리고 제2 전극부(7')가 배치되어 있다. 도 5의 (b)에 있어서, 밸브(10)에 접속하고 있는 압공라인(21)은 도시하고 있지 않으며, 2쌍의 송액지유로(8b) 및 배액지유로(9b)만을 도시하고 있고, 다른 3쌍의 송액지유로(8b) 및 배액지유로(9b)는 도면을 복잡하게 하지 않기 위하여 생략하고 있다. 도 5의 (c)는 도 5의 (a)의 중앙의 원형부의 확대도이고, 도 5의 (b)의 송액지유로(8b)와 배액지유로(9b)가 송액지유로 단자(19b) 및 배액지유로 단자(20b)를 통하여 기판 상의 1개의 액류구획(22)에 접속되어 있다. 제2 전극부(7')는 각각의 유로분기판(M1~M4)에 1개 설치하고 있다. 5쌍의 밸브(10) 중 소정의 1쌍의 밸브(10)를 개방하고, 기판 상의 소정의 액류구획(22)에 존재하는 세포(5)의 전기적 특성을 동시에 최대 4채널에서 측정 가능하다.

도 6은 도 5로 나타난 복합 다채널 배양형 플래너 패치 클램프 장치(1b)에 있어서 다채널 기판(D1~D4)으로서 사용되는 5채널 기판(D)의 일례를 나타내는 상면도이다. 이 기판은, PMMA(폴리메틸메타크릴레이트)로 이루어지고, 두께 200μm, 한 변이 60mm인 정방형상을 가진다. 이 기판에는 한 변이 20mm인 정방형상의 세포배치영역(4)이 5개 배치되어 있고, 그 밖의 영역에는 스페이서가 존재하며, 액체의 이동을 제한하고 있다. 각 세포배치영역(4)의 중앙부에, 직경 1.5~2μm의 관통구멍(3)이 존재하고, 이 관통구멍(3)의 하부에 직경 150μm의 제2 액류부(6')가 형성되어 있으며, 그 부분의 기판의 두께는 15μm이다. 세포배치영역(4)에는 다수의 세포정착부분(24)이 형성되어 있고, 각 세포정착부분은 직경 30μm, 높이 약 10μm의 원주 형상의 돌기부(25)로 둘러싸고 있으며, 세포(5)가 이 세포정착부분(24)으로부터 나오지 않도록, 원주(25)와 원주(25)의 간격은 10미크론 이하로 제한되어 있다. 관통구멍(3)의 위치에 배치된 세포정착부분(24) 이외에도 세포정착부분(24)을 제작함으로써, 이러한 기판을 신경세포 네트워크 형성에 이용할 수 있다. 관통구멍(3)의 아래의 제2 액류부(6')에는 한쌍의 송액유로(8) 및 배액유로(9)가 마이크로 유로로서 형성되어 있다.

[플래너 패치 클램프 시스템]

본 발명의 패치 클램프 장치는, 유로제어 시스템과, 채널 전류계측 시스템에 접속되어 제어된다. 도 7은 다채널형 플래너 패치 클램프 장치의 밸브의 제어계의 구성의 일례를 나타내는 개념도이다. 유로제어 시스템은, 유로에 배치된 펌프에 의하여 제2 도전성 액체의 액류를 발생시키고, 더욱이 밸브(10)의 개폐에 대한 제어신호를 출력하는 시퀀서(26)를 작동시켜 밸브(10)를 개폐시킴으로써, 제2 도전성 액체의 유통 및 전기적 도통의 허용 또는 정지를 제어할 수 있다. 밸브(10)의 개폐가 압축공기에 의하여 제어되는 경우, 시퀀서(26)에 의한 출력된 제어신호를, 밸브(10)를 제어하는 공기압으로 변환하는 전자밸브(29)가 사용된다. 시퀀서(26)와 전자밸브(29)는 접속라인(28)을 통하여 접속되어 있고, 전자밸브(29)에 전달된 전기신호는, 공기압으로 변환된다. 전자밸브 접속단자(30)에 접속된 압공라인(21)을 통하여, 공기압은 밸브(10)로 전달되어, 유로를 개폐한다. 시퀀서(26)는 유로제어용의 제어 PC(27)에 접속라인(28)을 통하여 접속하고 있고, 제어 PC(27)에 의하여 조작할 수 있다. 채널 전류계측 시스템은, 플래너 패치 클램프의 통상의 시스템을 이용할 수 있으며, 예를 들어 전류증폭기, 로우패스 필터, 및 아날로그 디지털 컨버터를 제어하는 전류계측용의 PC를 포함한다. 유로제어용의 PC(27)와 전류계측용의 PC는 각각 협동하여 작동하여도 좋고, 단일한 PC로 제어가 이루어져도 좋다.

[스크리닝 방법]

본 발명의 플래너 패치 클램프 장치, 다채널형 플래너 패치 클램프 장치, 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치, 그리고 플래너 패치 클램프 시스템을 이용하여, 신경세포 네트워크에 영향을 주는 후보약제의 하이스루풋 스크리닝을 행할 수 있다. 후보약제를 스크리닝하기 위한 조건으로서, 본 발명의 장치에 의하여 측정한 채널 전류가, (1) 건강상태, (2) 질환상태를 표현할 수 있는 것이며, 또한 (3) 질환상태에 후보약제를 작용시켜 건강상태로 되돌아갈 수 있는 것을 실증할 수 있는 구조로 되어 있는 것이 필요하다. 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 플래너 패치 클램프 장치는, 상기 (1), (2) 및 (3)의 상태를 각각 측정할 수 있고어, 약제의 스크리닝이 가능하다는 것이 나타난다. 장치구성으로서는, 도 1에 나타나는 바와 같은 단일 채널 장치를 많이 준비하면 가능하지만, 전극부의 메인터넌스가 크게 변하므로, 도 4a 내지 4c로 나타나는 다채널형 장치를 이용하는 것이 바람직하고, 더욱이는 도 5의 장치와 같이, 다채널형 기판(D1~D4)을 복수 포함하는 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치를 사용하여, 밸브의 제어에 의하여 각 액류구획의 채널 전류를 순차 측정함으로써, 효율적으로 스크리닝을 행할 수 있게 된다.

본 발명에 있어서, 스크리닝 방법은, 본 발명의 플래너 패치 클램프 장치, 바람직하게는 다채널형 플래너 패치 클램프 장치, 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치에 대하여, 세포를 파종하고, 신경세포 네트워크를 형성하는 공정이 필요하다. 신경 네트워크 형성 후에, 신경세포의 채널 전류를 측정하고, 후보약제를 제1 액류부에 첨가한 후에 다시 채널 전류를 측정하여, 채널 전류의 변화에 근거하여 후보약제를 선택할 수 있다. 바람직한 실시형태에서는, 질환형의 채널 전류의 파형으로부터, 건강형의 채널 전류의 파형으로 변화시키는 후보약제를 치료에 유효한 약제로서 선택할 수 있다. 사용하는 세포로서는, 사람 또는 동물로부터 취득한 신경세포를 사용하여도 좋고, 간세포, 예를 들어 iPS 세포, ES 세포를 파종하고, 분화유도를 하여 신경 네트워크를 형성하여도 좋다. 신경세포 네트워크를 형성시키는 신경세포로서, 질환모델의 신경세포를 사용할 수 있다. 질환모델의 신경세포는, 시판의 것을 사용할 수 있고, 질환유도제를 첨가하여 유도하여도 좋다. 약제를 스크리닝하는 관점에서, ALS, 알츠하이머병, 파키슨병 등의 질환모델의 신경세포를 이용하는 것이 바람직하다. 건강한 신경세포를 파종한 후에, 더욱이 질환유도약제를 첨가하고, 질환상태를 만들어 내서, 질환상태의 신경 네트워크에 있어서의 채널 전류를 측정하는 공정을 포함하여도 좋다. 그 경우, 질환상태에서 통상상태로 채널 전류를 변화시키는 약제를 스크리닝함으로써, 질환에 대하여 효과를 가지는 약제를 선택할 수 있다.

이상, 본 발명에 대하여 구체적인 실시형태에 입각하여 설명하였는데, 본 발명은 이상의 실시형태로 한정되는 것이 아니며, 임의의 변형을 가하여 실시할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시예로도 한정되는 것이 아니며, 임의의 변형을 가하여 실시하는 것이 가능하다.

실시예 1: 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)를 이용한 신경세포의 Ca ²⁺ 이미징

도 5에 나타내는 구성의 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)를 준비하였다. 그 장치가 가지는 20채널 중, 관찰을 하지 않는 19채널에 대응하는 19쌍의 마이크로 밸브(31)를 압공에 의하여 폐쇄 상태로 하고, 관찰을 행하는 채널에 대응하는 1쌍의 밸브를 개방 상태로 하여, 제2 전극부(7')에 전압을 인가하여서 전류를 주입함으로써 Ca² ⁺ 이미징을 행하였다. 보다 구체적으로, 본 실시예에서는, 미리 신경세포용 배지를 충전한 35mm 디시(dish) 내에 기판을 설치하고, 세포배치영역(4)에 래트 대뇌피질 신경세포를 파종하여, 세포정착부분에 세포를 정착시켰다. 뒤이어, 이 배지에 Ca² ⁺ 이미징용의 형광색소, Oregon Green BAPTA1(인비트로젠)을 400nM의 농도로 용해하고 37℃, 5% CO₂ 환경 하의 배양용기 내에서 약 1시간 방치하였다. 그 후 기판만을 디시로부터 취출하고, 그 관찰을 행하는 채널에 관통구멍(3)의 위치를 맞추어 설치하였다. 그리고 우선, 제1 액류부(6)에 배스용액으로서 2.5mM CaCl₂, 1.25mM MgCl₂, 10mM d-글루코오스, 140mM NaCl, 3mM KCl 및 10mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)(pH7.4)의 용액을 충전하였다. 다음으로, 제2 액류부(6')에 배액유로(9)를 통하여 약 10kPa의 음압을 인가한 상태로 송액유로(8)로부터 배스용액과 동일한 용액을 도입하였다. 이어서, 제2 전극부(7')로부터 피크값 10μA 폭 100μs의 전류를 주입하여 전기자극을 행하였다. 전기자극에 따라서 상승한 세포 내의 Ca² ⁺의 농도에 따라서 발생되는 형광을 CCD 카메라가 장착된 형광현미경(니콘사 제품 정립현미경 NikonLV100)으로 관찰하여 촬영하였다. 얻어진 형광관찰상을 도 8a에 나타낸다. 세포 1, 2, 3, 4로 번호가 붙어져 있고, 세포 1이 미세관통구멍(3) 상에 존재한다. 세포 1로의 2회의 전류주입에 따라서, 세포 1~4의 활동전위발생에 따라서 세포 내에 Ca² ⁺가 유입되고, 형광의 발광이 관찰되었다. 얻어진 형광 강도의 경시변화의 그래프를 도 8b에 나타낸다. 세포 1에 발생한 활동전위가 주위의 세포 2~4에도 전파되고 있는 것이 관찰되었다.

실시예 2: 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)를 이용한 채널 로 돕신 발현 세포에 있어서의 채널 전류 기록

도 5에 나타내는 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)의 20채널 중 관찰을 행하지 않는 19채널에 대응하는 19쌍의 밸브를 압공에 의하여 폐쇄 상태로 하고, 관찰을 행하는 채널에 대응하는 1쌍의 밸브를 개방 상태로 하여, 채널 로돕신 발현 세포에 있어서의 채널 전류를 기록하였다. 보다 구체적으로는 플래너 패치 클램프 장치의 세포배치영역(4)에 채널 로돕신 ChRWR 플라스미드를 유전자 도입하여 얻은 채널 로돕신 발현 HEK293 세포를 파종하고, 세포정착부분에 세포를 정착시켰다. 제1 도전성 액체 및 제2 도전성 액체에는, 세포배양약으로서 기초배지 DMEM(Gibco)에 10% FBS(Gibco), 1% 글루타맥스(Gibco), 0.5% 페니실린 스트렙토마이신 및 500μg/ml G418을 첨가한 배지를 이용하여, 37℃, 5% Co₂ 분위기 하에서 배양기 내에서 5일간 배양하였다. 그리고, 플래너 패치 클램프 장치를 배양기로부터 취출하여, 형광현미경(Nikon Eclipse 80i)의 시료대에 설치하고, 피펫을 이용하여 제1 도전성 액체를 배스용액으로 치환하였다. 이어서, 배액유로(9)로부터 -10kPa의 음압을 인가하고, 제2 도전성 액체로서 피펫용액을 송액유로(8)로부터 도입하였다. 그리고, 마찬가지로 -10kPa의 음압을 인가한 후, 나이스타틴 첨가(100μg/ml) 피펫용액을 송액유로(8)로부터 도입하였다. 이에 따라, 관통구멍(3)부의 세포막에 나이스타틴을 매립하여 세포 내와 하부액류부가 전기적으로 도통 상태가 되도록 하고, 이른바 홀셀 상태를 실현하였다. 다음으로, 파장 473nm의 레이저광(파워 1.5mW)(스미토모오사카시멘트(주), LD473-F5)을 조사하고, 홀셀 모드에서 얻어진 채널 전류 출력을 전치증폭기(P)에서 증폭하여, 2kHz의 로우패스 필터를 통과한 후, A-D 컨버터로 변환한 신호를 기록하였다. 얻어진 전류의 경시변화의 그래프를 도 9에 나타낸다. 사용한 배스용액은 실시예 1과 같다. 피펫용액으로서 100mM I-글루타민, 120mM CsOH, 50mM HEPES, 2.5mM MgCl₂, 및 1.25mM Na₂EGTA(pH7.4)의 용액을 사용하였다.

실시예 3: 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)를 이용한 스크리닝 방법

약제의 투여에 따른 채널 전류변화의 측정

본 발명의 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)를 이용하여, 신경 네트워크에 작용하는 약제의 하이스루풋 스크리닝이 가능한 것을 나타내는 실험을 행하였다. 도 5에 나타내는 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)의 약 2미크론 직경의 관통구멍(3)을 가지는 Si 기판 표면(2S)의 세포정착부분(24)에 태어난 지 17일된 래트의 대뇌피질을 해부하여 얻은 신경세포(5)를 파종하였다. 시판의 신경세포배지(스미토모 베이크라이트 주식회사)를 첨가하고, 디시 내에서 11일간 배양하여, 신경세포 네트워크를 형성시키고, 광학현미경으로 관측하였다(도 10). 다음으로, 그 신경세포(5)가 배치된 Si 기판(2)을 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)에 세트하고, 제1 액류부(6)의 각 액류구획(22)에 배스용액(145mM NaCl+3mM KCl+10mM HEPES+2mM CaCl₂+8mM Glucose+1mM MgCl₂·6H₂O, pH7.3)을 첨가하여 충전하였다. 다음으로, 송액지유로 및 배액지유로에 설치된 밸브를 개방 상태로 하고, 송액지유로로부터 제2 액류부에 피펫용액(140mM KCl+10mM HEPES+2mM CaCl₂+5mM EGTA+2mM Mg-ATP, pH7.3)을 도입하였다. 다음으로, 20채널 중 관찰을 행하지 않는 19채널에 대응하는 19쌍의 밸브를 압공에 의하여 폐쇄 상태로 하고, 관찰을 행하는 채널에 대응하는 1쌍의 밸브를 개방 상태로 하여, 제1 전극부(7) 및 제2 전극부(7') 사이에 30mV의 전압을 인가하여 전류를 측정하였다. 홀셀 모드를 형성하기 이전에는 채널 전류는 관측되지 않고, 인가 막전위에 관계없이 평평한 베이스 라인이 기록되었다. 다음으로, 제2 액류부에 나이스타틴 용액(100μg/mL)을 도입하고, 관통구멍에 접촉하고 있는 세포막에 작은구멍을 뚫어, 홀셀 모드를 형성하였다. 홀셀 모드를 형성하면, 인가 막전위에 의존하여 진폭하는 채널 전류가 관측되었다(도 11a). 인가 막전위는, 각각 +10mV, +20mV, +30mV, +40mV, +50mV, -10mV, -20mV, -30mV, -40mV 및 -50mV이었다. 이 상태로 제1 액류부에 글루타민산을 최종 농도가 20μM이 되도록 첨가하였다. 이에 따라, 채널 전류에 변화가 보였다(도 11b). 60분 정도 계측을 행한 후, 제1 액류부의 1개의 액류구획(22)에, AMPA 수용체 안타고니스트인 6-시아노-7-니트로퀴녹살린-2,3-디온(CNQX)(200μM) 및 NMDA 수용체 아타고니스트인 D-(-)-2-아미노-5-포스포노펜탄산(D-AP5)(200μM)을 용해한 배스용액을 도입하고, 다시 채널 전류를 계측하였다(도 11c). 도 11a, 11b 및 11c의 사이에서 명료한 차이가 보이며, 각각 건강상태, 글루타민 독성에 의한 질환상태 및 약품으로 글루타민 독성을 완화한 상태에 상당한다. 이 상태를 보다 명료하게 표시하는 목적으로, 인가 막전위 -20mV의 채널 전류에 착안하여, 관측되고 있는 하나하나의 펄스형상 파형의 면적을 계산하였다. 결과를 도 12a, 12b, 12c에 그래프로 나타내었다. 가로축은 각 펄스의 면적, 세로축은 소정 면적의 펄스의 수이다. 글루타민산 독성 상태 하에서는, 큰 면적의 펄스의 채널 전류가 증가하고(도 12b), 이러한 증가는 AMPA 수용체 안타고니스트인 CNQX 및 NMDA 수용체 안타고니스트인 D-AP5를 첨가함으로써, 거의 증가가 소실되었다. 채널 전류 펄스의 총합을 도 12d에 나타내었는데, 이러한 건강상태, 글루타민 독성의 상태, 안타고니스트 첨가에 의한 독성의 소실 또는 완화의 모습을 보다 명료하게 관찰할 수 있었다. 다른 액류구획(22)에, 다른 후보약제를 도입하고, 계측하는 구획에 대응하는 송액지유로(8b) 및 배액지유로(9b)의 밸브(10)를 개방 상태로 하고, 그 밖의 밸브(10)를 폐쇄 상태로 하여, 마찬가지로 채널 전류를 측정함으로써, 후보약제의 신경세포 네트워크에 미치는 영향을 측정할 수 있으며, 이에 따라 후보약제의 하이스루풋 스크리닝이 가능해진다.

약제의 투여에 의한 Ca ² ⁺ 이미징의 변화의 측정

채널 전류의 변화의 측정결과(도 12a 내지 12d)가, 건강상태, 글루타민산 첨가에 의한 질환상태, 및 약제 첨가에 의한 회복상태를 표시하고 있는 것을 나타내기 위하여, 이하에 서술하는 Ca² ⁺ 이미징을 행하였다. Ca² ⁺ 이미징에 의하여, 글루타민산 독성의 영향인 세포 내의 Ca² ⁺의 농도의 변조를 측정할 수 있다.

35mm 디시(a) 내에 도 6의 기판(PLL 코팅제)을 놓고, 산소 트립신으로 단리한 태어난 지 17일째의인 래트의 대뇌피질세포를 시판의 신경세포배지(스미토모 베이크라이트 주식회사)에서 2.5×10⁵ cells/mL가 되도록 현탁하였다. 이러한 세포 현탁액 2mL(=5.0×10⁵ cells)를 디시(a)에 첨가하였다. 5% CO₂ 존재 하, 37℃에서 17일간 배양하였다. 신경세포 네트워크 형성 후, 그 기판을 다른 디시(b) 내로 이동하였다. 이 디시(b)에 신경세포배지(2mL)를 첨가하고, 이 배지에 BAPTA-1(1μL) 및 Cremophor(10μL)를 첨가하여 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 배양상청을 버리고, 완충용액(145mM NaCl+10mM HEPES+8mM Glucose+3mM KCl+2mM CaCl₂+1mM MgCl₂, pH7.3) 2mL를 첨가하였다. 사용 직전까지 차광하여 실온에서 보관하고, Ca² ⁺의 형광강도계측(Ca²⁺ 이미징 계측)을 행하였다(도 13a). 이후, 10μM 농도의 글루타민산을 첨가한 완충용액(500μL)을 첨가하고, 2.5분 후에 Ca² ⁺ 이미징의 타임랩스(time lapse) 계측을 개시하였다(도 13b). 9.5분 후에 이것에 2.5mM의 D-AP5 및 2.5mM의 CNQX를 포함하는 안타고니스트 혼합액 10μL을 첨가하였다. 더욱이, 10.5분 후에 Ca²⁺ 이미징의 타임랩스 계측을 행하였다(도 13c).

척수손상, 알츠하이머병, 근위축성 측삭경화증(ALS) 등의 병태의 하나로서, 글루타민산 독성이 알려져 있고, 도 13b는 신경세포 네트워크가 글루타민산 독성의 환경 하에 놓여진 경우의 Ca² ⁺ 이미징을 나타내고 있다. 글루타민산 독성의 영향으로 관찰하고 있는 세포 내의 Ca² ⁺의 농도가 진동적으로 상승하고 있는 상태가 관찰되고 있다. 한편으로, 도 13c는 안타고니스트 혼합용액의 첨가에 의하여, 세포 내 Ca²⁺ 농도가 글루타민산 첨가 전의 상태로 복귀한 것, 즉 독성의 영향을 받지 않는 상태를 실현할 수 있었던 것을 의미한다.

Ca² ⁺ 이미징에 의하여 글루타민산 독성을 검출할 수 있는 이유는, 글루타민산의 영향으로 대사형 수용체가 활성화되고, 세포 내부에서 세컨드 메신저인 이노시톨 3인산(IP3)이 형성되며, 이에 따라 세포 내 소포체 표면의 IP3 수용체가 활성화되고, 이어서 리아노딘 수용체(RyR)가 활성화되며, 세포 내 Ca² ⁺ 농도가 증대하기 때문이다. 이러한 과정에서, 경우에 따라서는 Ca² ⁺ 진동이 발생한다. 이러한 세포 내 Ca² ⁺의 증대에 의하여, 시냅스 앞단 막으로부터의 신경전달물질인 글루타민산의 펄스 상의 방출(엑소사이토시스) 빈도가 증대하며, 이에 따라 시냅스 뒷단 막의 AMPA 수용체나 NMDA 수용체가 자극되어 활성화되며, 펄스 형상의 채널 전류가 증대한다. 이러한 증대는, AMPA 수용체나 NMDA 수용체의 안타고니스트 CNQX 및 D-AP5의 첨가에 의하여 소실 또는 감쇄할 수 있다.

채널 전류계측과 Ca² ⁺ 이미징의 양쪽 결과를 참조하면, 글루타민산 첨가 배지에서 배양한 경우의 글루타민산 독성의 영향을 양 실험으로 측정할 수 있다는 것이 나타났다. 더욱이, AMPA 수용체 안타고니스트인 CNQX 및 NMDA 수용체 안타고니스트인 D-AP5를 첨가함으로써, 글루타민산 독성의 영향을 억제할 수 있다는 것이 양 실험으로 나타났다. 이에 따라, 플래너 패치 클램프 장치를 이용한 채널 전류계측에 의하여, 얻어진 전류 변화의 결과가, 글루타민산 독성과, CNQX 및 D-AP5에 의한 글루타민산 독성의 완화를 가리키는 것이 나타났다. 이에 따라, 복합 다채널형 플래너 패치 클램프 장치(1b)를 이용하여, 글루타민산 독성을 완화하는 약제의 하이스루풋 스크리닝이 가능해지는 것이 나타났다.

또한, 이와 같이 채널 전류의 계측과 Ca² ⁺ 이미징의 계측을 함께 행함으로써 신경세포 네트워크의 상황을 보다 정밀하게 이해할 수 있는 동시에, 채널 전류파형은 본 실시예에서 해석한 이외에 매우 풍부한 정보를 포함하고 있어, 건강, 질환, 회복의 보다 상세한 마커를 제공하는 것으로 생각된다.

산업상의 이용가능성

본 발명의 플래너 패치 클램프 장치에 의하여, 신경세포에 있어서의 전기신호의 다점관찰을 행하는 것이 가능해지며, 신경세포에 대한 약제 스크리닝이나 뉴럴 네트워크에 있어서의 신호해석 분야에 있어서 이용하는 것이 가능하다.

1: 단일 채널 장치
1a: 다채널 장치
1b: 복합 다채널형 패치 클램프 장치
2: 전기절연성 기판
2S: 제1 표면
2S': 제2 표면
3: 관통구멍
4: 세포배치영역
5: 세포
6: 제2 액류부
6a: 주액류부
6b: 부액류부
6c: 도입용 통액로
6': 제2 액류부
7: 제1 전극부
7': 제2 전극부
8: 송액유로
9: 배액유로
8a: 송액주유로
9a: 배액주유로
8b: 송액지유로
9b: 배액지유로
10: 밸브
11: 제1 스페이서 부재
11': 제2 스페이서 부재
12: 제1 플레이트 부재
12': 제2 플레이트 부재
13: 덮개부재
14: 전극용기
15: 전극용액
16: Ag/AgCl 전극
17: 무수다공질 재료
18: 전극핀
D, D1~D4: 다채널형 기판
P1~P4: 전치증폭기
M1~M4: 마이크로 유로분기판
19a: 송액주유로 단자
20a: 배액주유로 단자
19b: 송액지유로 단자
20b: 배액지유로 단자
21: 압공라인
22: 액류구획
23: 파티션 부재
24: 세포정착부분
25: 돌기부
26: 시퀀서
27: 제어 PC
28: 접속라인
29: 전자밸브
30: 전자밸브 접속단자
31: 마이크로 밸브
32: 마이크로 유로
33: 공압패드
34: 변형부

Claims

세포배치영역을 가지는 제1 표면 및 그 반대면인 제2 표면을 가지는 동시에, 세포배치영역 내에 세포를 통과시키지 않지만 액체를 통과시킬 수 있는 관통구멍을 가지는 전기절연성 기판과,
전기절연성 기판의 제1 표면측에서 관통구멍과 연통 가능하게 설치되며, 제1 도전성 액체를 보유하기 위한 제1 액류부와,
제1 액류부와 제1 도전성 액체를 통하여 전기적 도통 가능하게 배치되는 제1 전극부와,
전기절연성 기판의 제2 표면측에서 관통구멍과 연통 가능하게 설치되며, 제2 도전성 액체를 보유하기 위한 제2 액류부와,
제2 액류부와 제2 도전성 액체를 통하여 전기적 도통 가능하게 배치되는 제2 전극부와,
제2 액류부에 연결되며, 제2 액류부에 제2 도전성 액체를 송액하는 송액유로와,
제2 액류부에 연결되며, 제2 액류부로부터 제2 도전성 액체를 배액하는 배액유로와,
송액유로 및/또는 배액유로에 설치되며, 제2 도전성 액체의 유통을 허용 또는 정지할 수 있는 동시에, 제2 액류부와 제2 전극부와의 전기적 도통을 허용 또는 정지할 수 있는 밸브를 가지는 플래너 패치 클램프 장치.
제 1 항에 있어서,
전기절연성 기판이 세포배치영역 및 그것에 대응하는 관통구멍을 각각 복수 가지는 동시에, 복수의 세포배치영역에 대응하여 제2 액류부가 복수 설치되고,
송액유로가, 송액주유로와, 송액주유로로부터 분기되며, 복수의 제2 액류부에 각각 연결되는 복수의 송액지유로를 가지고,
배액유로가, 복수의 제2 액류부에 각각 연결되는 복수의 배액지유로와, 복수의 배액지유로가 합류하는 배액주유로를 가지며,
제2 전극부가, 송액주유로 및/또는 배액주유로에 설치되고,
밸브가, 각 송액지유로 및/또는 각 배액지유로에 설치되는 플래너 패치 클램프 장치.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
밸브 폐쇄 시에 있어서의 밸브 전후의 전기저항값이 1메가옴 이상인 플래너 패치 클램프 장치.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 플래너 패치 클램프 장치와,
상기 플래너 패치 클램프 장치의 각 밸브의 개폐를 제어하는 제어부와,
상기 플래너 패치 클램프 장치의 각 전극부에 있어서의 전기신호를 검출하는 전기검출부를 구비하는 플래너 패치 클램프 시스템.
제 4 항에 있어서,
상기 플래너 패치 클램프 장치를 복수 구비하는 플래너 패치 클램프 시스템.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
상기 플래너 패치 클램프 장치에 배치된 세포에 유래하는 광신호를 검출하는 광검출부를 더 구비하는 플래너 패치 클램프 시스템.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 플래너 패치 클램프 장치, 또는 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 플래너 패치 클램프 시스템을 이용하여, 신경 네트워크에 영향을 주는 약제를 스크리닝하는 방법.