KR20160038523A - 시클로포스파미드를 유효성분으로 포함하는 항체의 종양 침투력 증진용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

시클로포스파미드를 유효성분으로 포함하는 항체의 종양 침투력 증진용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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조경득
임상무
김경민
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한국원자력의학원
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Abstract

본 발명은 시클로포스파미드를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 항체의 종양 침투력 증진용 조성물 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명에 따르면, 시클로포스파미드 단독, 및 시클로포스파미드와 아토르바스타틴의 조합은 항체의 종양 침투력을 증진시킴으로써 보다 효율적으로 방사면역치료를 가능하게 한다.

Description

시클로포스파미드를 유효성분으로 포함하는 항체의 종양 침투력 증진용 조성물 및 이의 용도{Compositions for enhancing antibody penetration into a tumor comprising cyclophosphamide as an active ingredient and Uses thereof}
본 발명은 시클로포스파미드를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 항체의 종양 침투력 증진용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
방사면역치료(radioimmunotherapy, RIT)는 베타선을 방출하는 치료용 방사성 동위원소(I-131, Y-90, Lu-177 등)에 종양 에피토프에 특이적인 단일클론항체를 표지하여 항체가 가지는 항암 효과와 세포독성(cytotoxic)을 나타내는 방사선을 조합 사용함으로써 치료 효과를 극대화시킬 수 있는 치료법이다.
현재 임상에서 사용되고 있는 방사면역치료를 위한 의약품으로는, 혈액암 치료를 위하여 토시투모맙(tositumomab, Bexxar), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan, Zevalin) 및 리툭시맙(rituximab, Rituxan)이 사용되고 있고, 고형암 치료를 위해서는 트라스투주맙(trastuzumab, Herceptin), 세툭시맙(cetuximab, Erbitux) 및 파니투무맙(panitumumab, Vectibix) 등이 사용되고 있다.
암의 치료는 방사선을 이용한 치료, 항암제를 이용한 화학요법 및 종양 특이적 항체와 치료용 방사성 동위원소를 결합한 방사면역치료법 등이 있는데, 방사면역치료법은 종양에 대한 표적 치료(targeted therapy), 방사선에 의한 암 치료 효과, 그리고 항체에 의한 암 치료 효과의 시너지 효과를 기대할 수 있다. 그러나, 정상 조직과 달리 종양 조직의 경우에는, 종양 주변에 형성된 콜라겐, 비정상적인 혈관 형성, 및 종양 내부의 증가된 세포와 조직 사이의 압력(interstitial pressure) 등으로 인하여 항체의 종양 내부로의 침투가 어려운 문제가 있다.
특히, 고형암의 경우에는 항체가 종양까지 도달하는데 물리적 장벽과 생리적 장벽이 존재하기 때문에 방사면역치료의 치료 효과가 저하되는 문제가 있다. 즉, 종양 주변에 형성된 콜라겐, 세포 사이의 밀착연접(tight junction), 및 종양 내 증가한 세포와 조직 사이의 압력으로 인하여 항체의 종양 침투가 제한적이어서 방사면역치료의 고형암 임상적용은 비용 대비 치료 효과가 떨어지고, 좋은 치료 성적을 보이지 못하고 있는 실정이다.
나아가, 치료용 방사선 동위원소로 사용하고 있는 Y-90, Lu-177 등의 경우 최대 방사선 조사 범위(maximum radiation range)가 각각 12.9 mm 및 2.1 mm이므로, 항체가 종양 중심부까지 침투하지 못한다면 주변의 정상조직이 피폭을 받게 되는 문제가 있다.
본 발명자들은 치료용 방사선 동위원소로 표지된 항체를 활용한 방사면역치료 시, 항체를 종양 중심부로 침투시킴으로써 종양 치료 효과를 극대화 할 뿐만 아니라, 방사선 동위원소로부터 정상 조직을 보호할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 시클로포스파미드가 암 치료용 항체의 종양 침투력을 증진시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 암 치료용 항체의 종양 침투력 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 방사면역치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 항체의 종양 침투력 증진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 표현, "항체의 종양 침투력 증진"은 암을 타겟팅 하는 항체가 종양 주변에 존재하는 물리적 장벽 및/또는 생리적 장벽을 뚫고 종양 조직의 중심부로 보다 더 가까이 이동할 수 있음을 의미한다. 종양 조직의 경우에는, 종양 주변에 형성된 콜라겐, 비정상적인 혈관 형성, 및 종양 내부의 증가된 세포 및 조직 사이의 압력 등으로 인하여 항체의 종양 내부로의 침투가 어려운 문제가 있는데, 본 발명의 조성물은 이러한 문제를 개선하여 항체가 보다 더 종양의 내부로 침투할 수 있게 한다는 의미이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 암 치료용 항체의 종양 침투력을 증진시키는 시클로포스파미드를 유효성분으로 포함하는 항암치료 보조용 약제학적 조성물이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 방사면역치료 시 암 치료용 항체와 병용 사용되어 상기 항체의 종양 침투력을 증진시키는 시클로포스파미드를 유효성분으로 포함하는 방사면역치료 보조용 약제학적 조성물이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암은 혈액암 또는 고형암이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 혈액암은 림프종 또는 림프구성 백혈병이다. 상기 림프종은 여포성 림프종(follicular lymphoma), 미만성 B형 대세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B-CLL/SLL, 면역종(immunocytoma/Waldenstrom's), 말트 림프종(MALT-type/ monocytoid B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt'f s lymphoma), 소아 림프종(pediatric lymphoma) 및 역형성 대세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma)과 같은 B 세포 림프종을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 고형암은 유방암 또는 위암이다.
본 발명에서 사용된 용어, '암 치료용 항체'는 암화, 암의 진행, 발전 또는 사멸 등과 관련된 암 관련 항원에 결합하여 항암 활성을 나타내는 항체를 의미한다. 당해 기술분야에는 이러한 암 관련 항원(예컨대, CD20, HER2, EGFR 등)과 이를 표적으로 하는 항체, 공지된 항원에 대한 항체의 제조방법이 잘 알려져 있다. 아토르바스타틴은 이러한 암 치료용 항체와 병용 사용(동시 또는 순차적으로)되어 암의 종양 침투력을 증진시킨다.
상기 암 치료용 항체의 범위에는 완전한 항체 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 항원 결합 단편(항체 단편)도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항체는 단일클론항체이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항체는 항-CD20 항체 또는 항-HER2 항체이다. 상기 항-CD20 항체 및 항-HER2 항체는 각각 CD20 항원 및 HER2에 결합하여 이를 불활성화시킴으로써 이들 항원이 발현된 종양 세포(각각 림프종과 림프구성 백혈병 세포; 유방암과 위암 세포)의 사멸을 유도한다.
상기 항-CD20 항체의 예로는 리툭시맙(rituximab), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan) 및 토시투모맙(tositumomab) 등을 들 수 있으며, 상기 항-HER2 항체의 예로는 허셉틴(Herceptin)을 들 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에는 아토르바스타틴이 더 포함된다. 하기 실시예에서 확인된 바와 같이, 시클로포스파미드와 아토르바스타틴의 병용 투여는 우수한 항체 침투력 증진 효과를 나타내었고, 이를 통하여 향상된 항암 효과 역시 나타내었다(도 1 내지 4 참조).
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 암을 타겟팅 하는 항체; 및 (ⅱ) 본 발명의 암 치료용 항체의 종양 침투력 증진용 조성물을 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 방사성 동위원소로 표지된, 암을 타겟팅 하는 항체; 및 (ⅱ) 상기 항체의 종양 침투력 증진제로서, 본 발명의 암 치료용 항체의 종양 침투력 증진용 조성물을 포함하는 방사면역치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
시클로포스파미드는 암 치료용 항체의 종양 침투력을 증진시키므로, 암을 타겟팅 하는 항체와 함께 암의 치료(예컨대, 방사면역치료)에 사용가능하다.
본 명세서에서 사용된 용어, '치료'는 암의 발전의 억제, 암의 경감 또는 암의 제거를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암은 혈액암 또는 고형암이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 혈액암은 림프종 또는 림프구성 백혈병이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 고형암은 유방암 또는 위암이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암을 타겟팅 하는 항체는 항-CD20 항체 또는 항-HER2 항체이며, 이에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방사성 동위원소는 177Lu, 211At, 213Bi, 212Bi, 212Pb, 225Ac, 227Th, 90Y, 186Re, 188Re, 199Au, 194Ir, 166Ho, 159Gd, 153Sm, 149Pm, 142Pr, 111Ag, 109Pd, 77As, 67Cu 및 47Sc로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명은 시클로포스파미드를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 항체의 종양 침투력 증진용 조성물 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명에 따르면, 시클로포스파미드 단독, 및 시클로포스파미드와 아토르바스타틴의 조합은 항체의 종양 침투력을 증진시킴으로써 보다 효율적으로 방사면역치료를 가능하게 한다.
도 1은 시클로포스파미드에 의하여 항-CD20 항체(리툭시맙)의 림프종 내부로의 침투력이 증진되었음을 보여주는 조직 이미징 사진이다.
도 2는 항-CD20 항체(리툭시맙)와 시클로포스파미드의 병용 투여에 의하여 림프종의 종양 크기가 감소하였음을 보여주는 그래프이다.
도 3은 시클로포스파미드에 의하여 항-HER2 항체(트라스투주맙)의 유방암 내부로의 침투력이 증진되었음을 보여주는 조직 이미징 사진이다.
도 4는 항-HER2 항체(트라스투주맙)와 시클로포스파미드의 병용 투여에 의하여 유방암의 종양 크기가 감소하였음을 보여주는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 혈액암에서 시클로포스파미드의 항체의 종양 침투력 증진 효과
1.1. 실험재료 및 실험방법
세포 배양
인 비트로에서 단일 세포 또는 작은 덩어리를 형성하며 자라는 인간 림프종 세포(Raji; ATCC)를 10% 열-불활성화 소 태아 혈청(heat-inactivated fetal bovine serum, FBS; GIBCO, Island)과 항생제가 포함된 RPMI1640 배지(GIBCO, Island)에서 5% CO2, 37℃의 조건으로 3-4일 간격으로 계대 배양하였다.
실험동물
SCID 마우스는 중앙 실험동물에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 마우스는 생후 6-8 주령으로서 실험군과 대조군은 동성 마우스를 사용하였으며, 이들 동물에는 멸균한 수돗물과 펠렛 사료를 공급하였고, 항온(26℃), 항습 (55%), 항균 환경조절 제어장치 하에서 사육하였다.
시약 및 항체
시클로포스파미드(Cyclophosphamide; Cytoxan)는 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하여 물에 녹여 사용하였다. 아토르바스타틴(Atorvastatin)은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하여 DMSO에 녹여서 사용하였다. CD20 특이적인 항체인 리툭시맙은 Roche Pharma (Schweiz) AG에서 획득하였고, 항체에 형광(Alexa Fluor 488)을 접합시켜 마우스 꼬리 혈관을 통해 주사하였다.
항체에 형광 접합
Alexa Fluor 488은 1% 아세트산이 포함된 DMSO에 녹인 후에 리툭시맙과 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 1시간 동안의 반응 후에 PD-10 컬럼(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)에서 용출 버퍼(PBS)를 이용하여 정제하였다.
암 이종이식 및 시험물질의 투여
CD20 양성인 Raji 세포(1 X 107)를 피하 주사를 통해 6-8주령의 SCID 마우스의 옆구리에 이식하였으며, 암세포의 크기가 적정 크기(200 mm3)에 도달했을 때, 마우스를 하기의 그룹으로 나누고(Day 0), 표 1과 같이 각 시험물질을 투여하였다.
그룹 투여
대조군(n=3) Alexa 488-리툭시맙 150 μg 투여(꼬리 혈관으로 IV; Day 0)
절개(Day 5)
시클로포스파미드투여군(n=3) Alexa 488-리툭시맙 150 μg 투여(꼬리 혈관으로 IV; Day 0)
시클로포스파미드 70 mg/kg(IP; day 1)
절개(Day 5)
아토르바스타틴 투여군(n=4) Alexa 488-리툭시맙 150 μg 투여(꼬리 혈관으로 IV; Day 0)
아토르바스타틴 20 mg/kg/d 투여(IP; Day 0-4)
절개(Day 5)
시클로포스파미드/아토르바스타틴 투여군(n=4) Alexa 488-리툭시맙 150 μg 투여(꼬리 혈관으로 IV; Day 0)
시클로포스파미드 70 mg/kg(IP; day 1)
아토르바스타틴 20 mg/kg/d 투여(IP; Day 0-4)
절개(Day 5)
형광 염색
마우스에서 이종이식 된 암 조직을 떼어내기 전에 혈관 염색을 위하여 로다민(Rhodamine) 1 mg을 혈관 주사하고, 5분 후에 암세포를 떼어내었다. 떼어진 암 조직을 4% 파라포름알데하이드에 담가서 4℃에서 1 시간 동안 세포를 고정시켰다. 세포 고정이 완료된 암세포를 30% 수크로오스 용액에 담가 가라앉을 때까지 4℃에서 반응시키고, 드라이아이스 위에서 OCT와 함께 얼려서 블록(Block)을 형성하였다. 얼려진 암 조직은 저온 유지장치(cryostat)를 이용하여 전체 암 조직이 보이도록 8 ㎛로 잘라내고, SuperFrost Plus 슬라이드에 얹어서 -70℃의 온도로 보관하였다. -70℃로 보관된 암 조직을 DAPI 염색을 위하여 1 시간 동안 실온에서 녹이고, 3분간 PBS로 2번 재수화 시켰다. 이후, 4% 파라포름알데하이드에 20분간 고정 과정을 거치고, 다시 3분간 PBS로 3번 세척한 후에 DAPI로 염색하고, 커버글라스로 덮어서 건조시켰다.
조직 이미징
조직 이미징(Tissue imaging)은 Tissue Fax를 이용하여 20x 배율로 이미지를 획득하였다. 세 가지 다른 채널을 이용하여 DAPI로 핵 염색, 로다민으로 혈관 염색, 그리고 Alexa Fluor 488로 리툭시맙의 염색을 확인하였다.
1.2. 실험결과
항체의 종양 침투력 변화
도 1에 나타난 바와 같이, 시클로포스파미드 단독, 또는 시클로포스파미드와 아트로바스타틴을 함께 투여하였을 때, Alexa Fluor 488 표지된 리툭시맙이 종양 표면에서 최대 1.5 mm까지 내부로 침투하였음을 확인하였다(도 1).
종양 크기 변화
각 시험물질을 투여한 후 5일째에 마우스를 절개하여 종양 크기를 측정하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군의 종양 크기는 475 ± 51 mm3이었으나, 시클로포스파미드 투여군의 종양 크기는 301 ± 35 mm3로서 대조군에 비하여 현저히 작았다. 또한, 시클로포스파미드와 아토르바스타틴 투여군의 종양 크기는 297 ± 44 mm3로서, 가장 작은 종양 크기를 나타내었다(도 2).
이러한 결과는, 혈액암에서의 방사면역치료에 있어서, 시클로포스파미드가 항체의 종양 중심부로의 침투력을 향상시킴으로써 항암 효과 역시 증진되었음을 보여준다.
실시예 2. 고형암에서 시클로포스파미드의 항체의 종양 침투력 증진 효과
2.1. 실험재료 및 실험방법
세포 배양
HER2(human epidermal growth factor receptor 2)를 발현해서 유방암 모델로 사용되는 인간 위암 세포(NCI-N87;(ATCC) 를 10% 열-불활성화 소 태아 혈청(heat-inactivated fetal bovine serum, FBS; GIBCO, Island)과 항생제가 포함된 RPMI1640 배지(GIBCO, Island)에서 5% CO2, 37℃의 조건으로 3-4일 간격으로 계대 배양하였다.
실험동물
누드마우스는 중앙 실험동물에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 마우스는 생후 6-8 주령으로서 실험군과 대조군은 동성 마우스를 사용하였으며, 이들 동물에는 멸균한 수돗물과 펠렛 사료를 공급하였고, 항온(26℃), 항습 (55%), 항균 환경조절 제어장치 하에서 사육하였다.
시약 및 항체
시클로포스파미드(Cyclophosphamide; Cytoxan)는 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하여 물에 녹여서 사용하였다. 아토르바스타틴(Atorvastatin)은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하여 DMSO에 녹여서 사용하였다. 트라스투주맙(150 ㎍/마우스)은 Roche Pharma (Schweiz) AG에서 획득하였고, 항체에 형광(Alexa Fluor 488)을 접합시켜 마우스 꼬리 혈관을 통해 주사하였다.
항체에 형광 접합
Alexa Fluor 488은 1% 아세트산이 포함된 DMSO에 녹인 후에 리툭시맙과 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 1시간 동안의 반응 후에 PD-10 컬럼(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)에서 용출 버퍼(PBS)를 이용하여 정제하였다.
암 이종이식 및 시험물질 투여
NCI-N87 세포(5 X 106)를 피하 주사를 통해 6-8주령의 누드마우스의 옆구리에 이식하였으며, 암세포의 크기가 적정 크기(200 mm3)에 도달했을 때, 마우스를 하기의 그룹으로 나누고(Day 0), 표 2와 같이 각 시험물질을 투여하였다.
그룹 투여
대조군(n=5) Alexa 488-트라스투주맙 150 μg 투여(꼬리 혈관으로 IV; Day 0)
절개(Day 3)
시클로포스파미드투여군(n=5) Alexa 488-트라스투주맙 150 μg 투여(꼬리 혈관으로 IV; Day 0)
시클로포스파미드 70 mg/kg(IP; day 1)
절개(Day 3)
아토르바스타틴 투여군(n=5) Alexa 488-트라스투주맙 150 μg 투여(꼬리 혈관으로 IV; Day 0)
아토르바스타틴 12 μg/일 매일 경구 투여
절개(Day 5)
시클로포스파미드/아토르바스타틴 투여군(n=5) Alexa 488-트라스투주맙 150 μg 투여(꼬리 혈관으로 IV; Day 0)
시클로포스파미드 70 mg/kg(IP; day 1)
아토르바스타틴 12 μg/일 매일 경구 투여
절개(Day 3)
형광 염색
마우스에서 이종이식 된 암 조직을 떼어내기 전에 혈관 염색을 위하여 로다민(Rhodamine) 1 mg을 혈관 주사하고, 5분 후에 암세포를 떼어내었다. 떼어진 암 조직을 4% 파라포름알데하이드에 담가서 4℃에서 1 시간 동안 세포를 고정시켰다. 세포 고정이 완료된 암세포를 30% 수크로오스 용액에 담가 가라앉을 때까지 4℃에서 반응시키고, 드라이아이스 위에서 OCT와 함께 얼려서 블록(Block)을 형성하였다. 얼려진 암 조직은 저온 유지장치(cryostat)를 이용하여 전체 암 조직이 보이도록 8 ㎛로 잘라내고, SuperFrost Plus 슬라이드에 얹어서 -70℃의 온도로 보관하였다. -70℃로 보관된 암 조직을 DAPI 염색을 위하여 1 시간 동안 실온에서 녹이고, 3분간 PBS로 2번 재수화 시켰다. 이후, 4% 파라포름알데하이드에 20분간 고정 과정을 거치고, 다시 3분간 PBS로 3번 세척한 후에 DAPI로 염색하고, 커버글라스로 덮어서 건조시켰다.
조직 이미징
조직 이미징(Tissue imaging)은 Tissue Fax를 이용하여 20x 배율로 이미지를 획득하였다. 세 가지 다른 채널을 이용하여 DAPI로 핵 염색, 로다민으로 혈관 염색, 그리고 Alexa Fluor 488로 트라스투주맙의 염색을 확인하였다.
2.2. 실험결과
항체의 종양 침투력 변화
도 3에 나타난 바와 같이, 유방암 조직 내부에서 시클로포스파미드 단독 또는 아토르바스타틴 단독을 주사하였을 때, Alexa Fluor 488 표지된 트라스투주맙의 종양 침투가 최대 100% 증진되었음을 확인하였다(도 3).
종양 크기 변화
각 시험물질을 투여한 후 3일째에 마우스를 절개하여 종양 크기를 측정하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군의 종양 크기는 252 ± 14 mm3이었으나, 시클로포스파미드 투여군의 종양 크기는 246 ± 42 mm3로서, 대조군 보다 작은 종양 크기를 나타내었다. 또한, 시클로포스파미드와 아토르바스타틴 투여군의 종양 크기는 235 ± 10 mm3로서, 가장 작은 종양 크기를 나타내었다(도 4).
이러한 결과는, 고형암에서의 방사면역치료에 있어서, 시클로포스파미드가 항체의 종양 중심부로의 침투력을 향상시킴으로써 항암 효과 역시 증진되었음을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 항체의 종양 침투력 증진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 항암치료 보조용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 방사면역치료(Radioimmunotherapy) 보조용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 혈액암 또는 고형암인 것을 특징으로 하는 조성물.

  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 혈액암은 림프종 또는 림프구성 백혈병인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 고형암은 유방암 또는 위암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 항-CD20 항체 또는 항-HER2 항체인 것을 특징으로 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 아토르바스타틴(Atorvastatin)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. (ⅰ) 암을 타겟팅 하는 항체; 및
    (ⅱ) 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물.
  10. (ⅰ) 방사성 동위원소로 표지된, 암을 타겟팅 하는 항체; 및
    (ⅱ) 상기 항체의 종양 침투력 증진제로서 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 방사면역치료용 약제학적 조성물.
KR1020140131703A 2014-09-30 2014-09-30 시클로포스파미드를 유효성분으로 포함하는 항체의 종양 침투력 증진용 조성물 및 이의 용도 KR20160038523A (ko)

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