KR20160037361A - 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 - Google Patents

쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 세균성이질의 원인균인 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 본 발명의 DNA 앱타머를 사용하면 시료 및 생물학적 시료 내에서 쉬겔라 소네이 생균의 존재 여부를 확인할 수 있으며, 이를 통해 세균성이질의 진단 용도로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 앱타머를 이용한 진단방법은 신속하고 경제적인 방법이므로 세균성이질의 진단에 사용되고 있는 종래의 세포배양 및 PCR 방법과 같은 분자생물학 기반의 진단 방법을 대체할 수 있다.

Description

쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도{DNA Aptamer Capable of Specifically Binding to Surface of Living Cell of Shigella sonnei and Uses Thereof}
본 발명은 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다.
쉬겔라(Shigella)속 감염에 의해 유발되는 세균성이질은 제1군 법정전염병에 속하는 수인성 전염병으로서 인체 내 감염 시 수 일 간의 잠복기를 거쳐 구토, 복통, 발열, 및 점액성의 혈변 등의 증상이 나타나며, 독성이 강한 이질균에 감염되면 신경증상을 동반하여 라이터증후군, 용혈성 요독 증후군, 패혈증과 같은 합병증을 유발함으로써 사망에까지 이르게 하는 심각한 질환이다. 세균성이질은 일반적으로 환자나 보균자에 의한 직간접적인 분변-경구 전파경로를 통해 전파되지만, 쉬겔라의 강한 내산성 때문에 10-100개의 적은 수로도 감염을 일으킬 수 있어 접촉감염도 흔히 발생할 뿐만 아니라 10-40％의 높은 가구 내 2차 발병률을 나타낸다.
세계적으로 매년 약 1억 6,500만 명의 세균성이질 환자가 발생하는 것으로 보고되고 있으며 특히, 개발도상국에서는 세균성이질 환자의 69％가 5세 미만의 아이들에게서 발생하는 것으로 알려져 있어 심각한 사회적 문제를 유발하고 있다. 또한, 개발도상국에서는 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)가 주로 분리되고, 쉬겔라 디센테리에(Shigella dysenteriae)가 토착적으로 혹은 유행적으로 발생하는 것으로 알려진 반면 선진국에서는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)가 주된 원인균으로 보고되고 있다.
우리나라에서의 세균성이질 발생양상은 1998년 이후 발생빈도가 급격히 증가하여 2003년에는 1,117명 이상의 환자가 발생하였다. 1종 법정전염병으로 지정되어 있는 세균성이질은 최근까지도 해마다 가장 많이 발생하는 전염병 중 하나로 조사되고 있다. 특히, 공식적인 발생건수가 균이 직접 분리된 예만을 집계한 것이므로 10-20％대의 국내 법정 전염병의 신고율을 감안하면 실제 발생 수는 적어도 5배 이상일 것으로 추정되어 그 피해가 매우 심각한 실정이다. 최근 학교와 사회복지시설의 단체급식을 매개로 한 집단발생이 증가하고 있으며, 쉬겔라 소네이가 주된 원인균으로 보고되고 있다. 2007년 이후로는 세균성이질이 300건 미만으로 보고되고 있으나, 지구 온난화 및 극심한 기후변화에 따른 각종 병원성 미생물에 의한 보건 환경성 질환 발생 건수 및 인체 감염 및 공공 환경으로의 전염속도가 급속히 증가함에 따라 대유행을 일으킬 충분한 잠재력을 가지고 있다.
기존 쉬겔라 소네이의 검출을 통한 세균성이질의 진단은 임상 증상을 이용한 추정 진단 이후에 대변 배양 검사 및 병원체 확인을 통한 확진을 통해 이루어지고 있다. 세균성이질의 확진을 위한 검체는 환자의 대변이나 직장 채변한 검체를 수송 배지에 넣어 보건소에 의뢰해 이질균을 분리해내는 방법을 이용해 세균성이질을 진단하고 있다. 그러나 기존의 방법은 검체로부터 원인균을 분리 배양하는 단계를 거쳐야하기 때문에 쉬겔라 소네이를 검출 및 확인하기까지 긴 시간이 소요될 뿐만 아니라 쉬겔라 속의 균체들은 체외에서 24시간 이상 생존할 수 없다는 특징을 가지고 있어 시료 수집과 실험실로의 수송에 상당한 주의 및 기술을 필요로 하여 정확한 검출이 어려운 실정이다. 특히 쉬겔라 속 균주들의 유전자 구조는 대장균(E. coli)과 매우 유사하여 생화학적 검사만으로는 두 균주의 구별이 매우 어려울 뿐만 아니라, 10-100 마리의 균체만으로도 충분히 병원성을 유발할 수 있는 고위험성 병원균이므로, 고도의 민감성을 가지는 진단기법의 개발이 필요한 실정이다.
최근 중합효소연쇄반응법(Polymerase Chain Reaction, PCR)과 면역학적 방법을 이용한 분자생물학적 검출 방법들이 개발 활용되고 있다. 분자생물학적 검출 방법은 IpaH(Invasjon plasmid antigen H; 침입성 플라스미드 항원 H), 시가독소(Shiga toxin), 쉬겔라 장내독소 1(Shigella enterotoxin 1), 쉬겔라 장내독소 2(Shigella enterotoxin 2)와 같은 쉬겔라 소네이의 병원성 인자를 표적으로 하고 있어 기존의 검체 배양 방법보다 민감하고 빠르게 원인균을 검출할 수 있지만, 검출 효율을 높이기 위해서는 샘플 내 DNA 추출 과정 및 단백질 추출 과정 등의 샘플 전처리 과정이 필요하고 결과를 분석하기 위한 고가의 분석 장비가 필요하기 때문에 현장검사(Point of care testing, POCT)로의 응용이 어렵다는 단점을 가지고 있다. 따라서 대규모의 시료를 정확하고 빠르며 간단하게 처리할 수 있는 쉬겔라 소네이 검출 시스템 개발이 절실히 필요하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
한국공개특허 제10-2012-0135998호 한국등록특허 제10-1100932호
본 발명자들은 세균성이질의 주요 원인균으로 알려진 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)를 생균 상태로 직접 검출하기 위한 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 생균 상태의 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 세포 표면에 높은 특이도로 결합할 수 있는 DNA 앱타머를 성공적으로 합성 및 선별하였고, 이들 DNA 앱타머들이 쉬겔라 소네이 생균을 검출하는데 효과적으로 이용될 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 검출 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 세균성이질의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료에서 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 존재 여부를 검출하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 21의 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 21의 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 DNA 앱타머는 5' 말단 또는 3' 말단에 바이오틴(biotin) 아민기, 티올기, Cy3, Cy5, 플루오레세인(fulorescein), 또는 방사성 물질이 결합된다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 DNA 앱타머는 뉴클레오타이드의 당(sugar) 2번 탄소의 수소기가 불소원자, 아미노기, 또는 메톡시기로 치환된다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 상기 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 검출 방법을 제공한다: (a) 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 상기 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균을 확인하는 단계.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 세균성이질의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료에서 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 존재 여부를 검출하는 방법으로서, (a) 상기 DNA 앱타머와 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균을 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 생물학적 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 세포 배양액, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 또는 세균 발현계이다.
이하에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
쉬겔라 소네이( Shigella sonnei ) 생균 표면에 결합하는 DNA 앱타머
본 발명은 세균성이질의 주요 원인균으로 알려진 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)의 살아있는 세포 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 “DNA 앱타머(aptamer)”는 특정 분자에 고친화성 및 특이성을 갖고 결합할 수 있는 DNA 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에서 “DNA 앱타머”는 “DNA 올리고뉴클레오타이드”와 혼용하여 사용한다.
본 명세서에서 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 일반적으로 길이가 약 200개 미만을 갖는 뉴클레오타이드 중합체를 지칭하며, 이에는 DNA 및 RNA가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 DNA 핵산 분자이다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라아제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드 중합체의 합성 전에 또는 후에 추가될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 합성 후에 형광물질과 같은 표지(label) 물질이 결합될 수 있으며, 안정성 향상을 위해 화학적으로 변형 또는 개질될 수 있다.
DNA 앱타머에는 예를 들어 바이오틴(biotin), 아민기, 티올기, 방사성 물질, Cy3, Cy5, 플루오레세인과 같은 형광물질이 5′말단 또는 3′말단에 결합될 수 있다. 또한, DNA 앱타머의 안정성과 효율성 향상을 위해 뉴클레오타이드의 당(sugar) 2번 탄소에 위치한 수소를 불소원자(-F), 아미노기(-NH2), 또는 메톡시기(-OCH3)로 치환할 수 있다.
본 발명의 DNA 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 표적 분자가 될 수 있다.
앱타머의 선별은 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 본 명세서에서 용어 “SELEX 방법”이란 임의적으로 합성된 DNA의 집합에서 특정 분자에 대해 높은 결합력을 지니는 DNA를 선별하여 증폭시킴으로써 해당 분자의 DNA 결합 서열을 알아내는 방법을 의미한다(Louis et al. 1992. Nature 355, 564-566). DNA 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973(1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726(1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610(1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665(1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
본 발명의 DNA 앱타머는 바람직하게는 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다.
한편, 본 발명의 서열번호 1 내지 21 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머는 본 명세서 도 4a 및 도 4b에 도시된 2차 구조를 형성할 것으로 추정된다.
본 발명의 DNA 앱타머는 쉬겔라 소네이 생균 표면에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하면서, 상기 서열번호 1 내지 21에 개시된 염기서열 중 어느 하나의 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드도 포함하는 것으로 해석된다.
상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90％의 동일성, 보다 바람직하게는 최소 95％의 동일성, 가장 바람직하게는 최소 98％의 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
Cell-SELEX를 통한 쉬겔라 소네이 생균 표면 결합 DNA 앱타머의 선별
본 발명은 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위한 Cell-SELEX 방법에 관한 것이다.
하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 DNA 앱타머는 다음의 단계를 통해 선별된다: (ⅰ) PCR(Polymerase Chain Reaction) 기법을 통해 DNA 앱타머를 증폭하고, 스트렙트아비딘을 이용하여 ssDNA 앱타머를 제작하는 단계; (ⅱ) 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei)를 배양하고 세척하는 단계; 및 (ⅲ) Cell-SELEX 기법을 통해 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계.
(ⅰ) PCR 방법을 이용하여 DNA 앱타머를 증폭하고, 스트렙트아비딘을 이용하여 ssDNA 앱타머를 제작하는 단계:
PCR을 이용하여 랜덤 dsDNA 라이브러리를 증폭한다. 증폭한 PCR 산물은 PCR 정제 키트를 이용하여 순수한 dsDNA만을 회수한 뒤 ssDNA 앱타머를 선별한다. ssDNA 앱타머를 선별하는 방법은 예를 들면, PCR 수행 시 역방향 프라이머에 바이오틴을 부착시켜 dsDNA를 증폭하고, 증폭 산물에 스트렙트아비딘을 처리하여 형성된 바이오틴-스트렙트아비딘 복합체를 선택적으로 제거함으로써 ssDNA 앱타머만을 선별할 수 있다. 제작한 ssDNA 앱타머는 SELEX 방법에 사용하기 위해 ssDNA를 가열하여 변성시킨 후 상온에서 서서히 냉각하여 3차원 구조를 형성시킨다.
(ⅱ) 쉬겔라 소네이를 배양하고 세척하여 준비하는 단계:
쉬겔라 소네이 생균의 표면에 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위해, 쉬겔라 소네이를 Nutrient broth에 배양하여 생균 상태로 유지하고 세척 용액으로 세척한다.
(ⅲ) Cell-SELEX 기법을 통해 쉬겔라 소네이 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하는 단계:
상기 준비한 쉬겔라 소네이 생균과 ssDNA 앱타머를 혼합하여 반응시킨 후, 결합하지 않는 ssDNA 앱타머는 세척하여 제거하고 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머만을 용출시킨다. 이 단계에서 다른 세균 예를 들어 대장균과 결합하는 ssDNA 앱타머를 제거하는 네가티브 선별(Negative selection) 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머가 최대로 용출되는 최적의 SELEX 라운드를 선별하기 위해, 용출된 ssDNA를, (a) 나노드랍을 이용한 ssDNA 농도를 정량하는 방법과, (b) 실시간 PCR 방법을 이용해 정량하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서는 최적 SELEX 라운드 중 쉬겔라 소네이와 최적 결합력을 가지는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 최적 SELEX 라운드 선별과 같은 방법으로 최적 라운드에서 확보한 앱타머의 결합력을 정량한다. 최적 라운드에서 확보한 앱타머 서열 각각을 모두 확보하여 동일한 농도의 ssDNA로 제작한 후 Cell-SELEX를 진행한 뒤 나노드랍을 이용하여 용출된 앱타머 농도를 측정함으로써 최적 쉬겔라 소네이 생균 표면 결합 DNA 앱타머를 선별한다.
쉬겔라 소네이 생균의 표면에 결합하는 앱타머를 이용한 쉬겔라 소네이 생균의 검출 및 세균성이질의 진단
본 발명은 상기 선별된 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 검출용 조성물에 관한 것이다. 하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 DNA 앱타머는 쉬겔라 소네이 생균의 세포 표면에 특이적으로 결합하므로, 시료 내에 살아있는 쉬겔라 소네이의 존재 여부를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상기 선별된 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 검출용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태일 수 있으며, 또는 DNA 앱타머가 기판상에 고정화된 마이크로어레이 형태일 수 있다. DNA 앱타머를 칩이나 기판상에 고정화시키는 것은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 칩 또는 기판을 스트렙트아비딘(streptavidin)으로 개질하고, DNA 앱타머의 5′말단은 바이오티닐화(biotinylation)시킨 후, DNA 앱타머의 바이오틴과 칩 또는 기판상의 스트렙트아비딘과의 결합을 이용하여 고정화한다.
본 명세서에서 용어“마이크로 어레이”는 기판의 특정의 영역에 DNA 핵산 물질이 고밀도로 부착된 어레이(배열)를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “마이크로어레이의 기판”은 적합한 견고성 또는 반-견고성을 갖는 지지체를 의미하며, 예컨대, 유리, 막(membrane), 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, DNA 올리고뉴클레오타이드는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기판에 결합될 수 있다. 본 발명의 DNA 앱타머는 예를 들어, 바이오티닐화(biotinylated)될 수 있고, 이는 스트랩트아비딘이 코팅된 기판상에 성공적으로 결합될 수 있다. 기판 상에 고정화된 본 발명의 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 쉬겔라 소네이와 결합하여 이를 포획할 수 있으며, 이와 같이 포획된 쉬겔라 소네이 생균은 다시 쉬겔라 소네이와 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용하여 포획 유무를 시각화 할 수 있다.
본 발명의 키트는 시료 중의 쉬겔라 소네이 생균 검출에 사용하기 위한 설명서 또는 표지(label)물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 상기 설명된 DNA 앱타머를 접촉시키고, 상기 DNA 앱타머와 결합된 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균을 확인하는 단계를 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 DNA 앱타머는 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하므로 DNA 앱타머를 쉬겔라 소네이 생균을 함유할 것으로 예상되는 시료를 접촉시켜 상기 쉬겔라 소네이 생균을 검출하는 데 사용될 수 있다. 상기 DNA 앱타머에 결합된 쉬겔라 소네이의 검출은 DNA 앱타머와 쉬겔라 소네이 결합 복합체를 검출하는 방법에 기초하여 행할 수 있다. 상기 복합체의 검출을 용이하게 하기 위해 DNA 앱타머가 형광물질, 예를 들어 플루오레세인(fulorescein), Cy3 또는 Cy5; 방사성물질, 또는 화학물질, 예를 들어 바이오틴(biotin)으로 표지되거나 1차 아민(primary amine)으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명은 세균성이질의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료에서 쉬겔라 소네이 생균의 존재 여부를 검출하는 방법으로서, 상기 설명된 DNA 앱타머와 상기 생물학적 시료를 접촉시키고, 상기 DNA 앱타머와 결합된 쉬겔라 소네이 생균을 확인하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 “생물학적 시료”는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 및 체액을 포함할 수 있으며, 세포 배양액 또는 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등도 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 앱타머는 세균성이질의 원인균인 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 본 발명의 DNA 앱타머를 사용하면 시료 및 생물학적 시료내에서 쉬겔라 소네이 생균의 존재 여부를 확인할 수 있으며, 이를 통해 세균성이질의 진단 용도로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 앱타머를 이용한 진단방법은 신속하고 경제적인 방법이므로 세균성이질의 진단에 사용되고 있는 종래의 세포배양 및 PCR 방법과 같은 분자생물학 기반의 진단 방법을 대체할 수 있다.
도 1은 랜덤 DNA 앱타머를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 dsDNA와 가열-냉각 기법과 스트렙트아비딘을 이용하여 회수한 ssDNA를 10％ 아크릴아마이드 겔 전기영동을 통하여 비교 확인한 결과이다. 레인 M: 100bp DNA 사이즈 마커, 레인 1: dsDNA, 레인 2: ssDNA이다.
도 2는 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 제작을 위하여 실시한 각 Cell-SELEX 라운드에서 회수된 쉬겔라 소네이 생균 표면 결합 DNA 앱타머의 농도를 나노드랍을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 네가티브 선별(Negative selection) 이후에 실시한 7, 8, 9 라운드로부터 회수된 쉬겔라 소네이 생균 표면 결합 DNA 앱타머를 이용하여 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별을 위한 Cell-SELEX 과정에서 선별된 21개의 쉬겔라 소네이 생균 표면 결합 DNA 앱타머 후보군 SS-1 내지 SS-21의 2차 구조를 나타낸 도면이다.
도 5는 스트렙트아비딘이 코팅된 센서 칩 SA 표면에 쉬겔라 소네이 표면 결합 DNA 앱타머를 고정시키고, 쉬겔라 소네이 생균을 결합시키는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 6은 최적의 쉬겔라 소네이 생균 표면 결합 DNA 앱타머에 대하여 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000을 이용하여 쉬겔라 소네이 검출능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 이용한 세균성이질 진단 키트의 모식도를 나타낸 도면이다. [a]는 쉬겔라 소네이 표면 결합 DNA 앱타머를 내장한 세균성이질 진단 키트의 모식도이며, [b]는 쉬겔라 소네이를 포함하고 있을 것으로 의심되는 시료를 쉬겔라 소네이 생균 표면 결합 DNA 앱타머를 내장하고 있는 세균성이질 진단 키트와 반응하였을 때, 샘플 내 쉬겔라 소네이와 쉬겔라 소네이 생균 표면 결합 DNA 앱타머의 결합에 의해 세균성이질을 진단하는 시스템을 나타낸 모식도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: DNA 앱타머 풀의 준비
1-1. PCR 기법을 활용한 랜덤 DNA 라이브러리 증폭
쉬겔라 소네이에 특이적으로 결합하는 단일 가닥의 DNA 앱타머를 제작하기 위하여 40개의 랜덤 서열을 dA : dG : dC : dT = 1.5 : 1.15 : 1.25 : 1 비율로 포함하고 있는 100 bp의 주형 DNA(5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40- AGATTGCACTTACTATCT-3'; 서열번호 22)와 이를 76 bp로 증폭할 수 있는 세 개의 프라이머를 바이오니어(Korea, Daejeon)로부터 주문하여 제작하였다[정방향 프라이머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'(서열번호 23), 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT -3'(서열번호 24), 바이오티닐화된(biotinylated) 역방향 프라이머: 5'-바이오틴-AGATTGCACTTACTATCT-3'(서열번호 24)]. 임의의 DNA 라이브러리는 PCR 기법을 이용하여 증폭하였으며, 76 bp DNA 라이브러리의 증폭을 위한 PCR 반응 조성은 주형 DNA 1 ㎕, 10X PCR 완충용액 5 ㎕, 각 2.5 mM dNTP 혼합물 4 ㎕, 10 pM 정방향 프라이머 2 ㎕, 10 pM 바이오티닐화된 역방향 프라이머 2 ㎕, Ex Taq 중합효소(Takara, Japan) 0.3 ㎕(1 unit/㎕)와 35.7 ㎕의 증류수로 이루어져 있다. PCR 반응 조건은 우선 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 20주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 추가로 신장시키는 반응을 이용하였다. PCR 반응 후 4 ㎕를 취하여, 2％ 아가로스 겔 전기영동을 통하여 증폭 산물을 확인하였다. PCR을 통하여 확보된 DNA 라이브러리는 PCR 정제 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 정제한 후 증류수 50 ㎕를 이용하여 회수하였다.
1-2. 가열-냉각 (heating-cooling) 기법을 활용한 ssDNA 제작
PCR 기법과 PCR 정제 키트를 이용하여 회수한 DNA 라이브러리 50 ㎕에 증류수 50 ㎕를 첨가하여 부피를 100 ㎕로 조정한 후, 가열-냉각(heating-cooling) 기법을 이용하여 dsDNA를 ssDNA로 변성(denaturation) 시켰다. 보다 구체적으로 설명하면, 상기 실시예에서 획득한 dsDNA를 85℃에서 5분 동안 반응하여 dsDNA를 ssDNA로 변성시킨 후, 반응 종료 후 즉시 반응액을 4℃로 냉각시켜 ssDNA를 제작하였다.
1-3. ssDNA의 회수 및 확인
가열-냉각 기법을 이용하여 확보된 ssDNA 산물 중 바이오틴이 결합되어 있는 ssDNA와 프라이머(primer)를 제거하고, 순수한 정방향의 ssDNA만을 확보하기 위하여, 상기 실시예에서 획득한 100 ㎕의 반응액에 스트렙트아비딘(Pierce, USA) 50 ㎕를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 스트렙트아비딘 반응액에서 순수한 ssDNA 앱타머 풀을 회수하기 위하여 통상적으로 사용하는 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 활용하였다. 실험 방법을 보다 구체적으로 설명하면, 반응액을 4℃, 13,000 rpm의 원심분리기를 이용하여 15분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 동일 부피의 PCI(phenol : chloroform : isoamylalcohol = 25 : 24 : 1) 용액을 처리하고 강하게 교반한 뒤, 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액만을 회수하였다. 상층액에 1/100 부피의 tRNA(sigma aldrich, USA), 1/10 부피의 3 M 소듐 아세테이트(sodium acetate, pH 4.5)와 3 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 1시간 이상 반응시켰다. 반응 후에는 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 ssDNA만을 회수하였다. 회수한 ssDNA는 65℃에서 건조시킨 후, 50 ㎕의 증류수에 녹였다. 회수한 ssDNA 중 10 ㎕를 취하여 10% 아크릴아마이드 겔을 이용하여 dsDNA와 비교하여 정확한 크기의 밴드가 나타나는지 확인하였다 (도 1 참고).
1-4. ssDNA의 구조 제작
쉬겔라 소네이에 특이적으로 결합하는 쉬겔라 소네이 표면 결합 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 상기 실시예 1-3을 통하여 확보한 ssDNA 40 ㎕에 증류수 10 ㎕를 첨가하고, 2X Nutrient broth 50 ㎕를 첨가하여 전체 반응 부피를 100 ㎕로 조정한 후 85℃에서 5분간 끓여 변성시킨 후, 상온에서 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성하였다.
실시예 2: Cell-SELEX 기법을 활용한 쉬겔라 소네이와 특이적으로 결합하는 쉬겔라 소네이 표면 결합 ssDNA 앱타머의 선별
2-1. 쉬겔라 소네이( S. sonnei )의 배양 및 준비
쉬겔라 소네이 표면 결합 DNA 앱타머의 선별을 위하여, 배양을 통해 쉬겔라 소네이를 확보하였다. 먼저 쉬겔라 소네이(ATCC 25931)를 Nutrient broth(Dicfo, USA) 5 ㎖에 접종한 뒤 37℃ 교반배양기에서 15시간 동안 배양하여 쉬겔라 소네이를 확보하였다. 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 10분)를 통하여 쉬겔라 소네이를 침전시킨 후 배양 배지를 완전히 제거하고 세척 용액(Tris base 10 mmol/L, NaCl 0.85％, pH 8.0) 200 ㎕를 첨가하여 재현탁을 통해 쉬겔라 소네이의 표면을 세척한 뒤 원심분리를 통하여 상층액을 제거하였다. 상기의 과정을 3번 반복함으로써 쉬겔라 소네이 생균 표면에 잔여물이 없도록 하였다.
2-2. Cell-SELEX 기법을 활용한 쉬겔라 소네이 표면 결합 DNA 앱타머의 선별
쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 상기 실시예 1-4에서 구조를 형성한 ssDNA 앱타머 100 ㎕를 실시예 2-1에서 확보한 쉬겔라 소네이 생균에 넣고 재현탁한 뒤, Thermo mixer(Eppendorf, USA) 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 10분)를 통하여 쉬겔라 소네이와 결합하지 않은 앱타머 풀이 포함되어 있는 상층액을 제거한 뒤, 세척 용액을 이용하여 3회 세척함으로써 쉬겔라 소네이 표면에 비특이적으로 결합한 ssDNA 앱타머를 모두 제거하였다. 쉬겔라 소네이 표면에 특이적으로 결합한 ssDNA 앱타머는 DNA 앱타머 용출 용액[10 mM Tris(pH 7.5), 1 mM EDTA] 50 ㎕를 첨가하여 85℃에서 5분간 반응시켜 변성시킨 뒤, 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 10분)를 통해 회수하였다. 회수한 쉬겔라 소네이 특이 결합 DNA 앱타머 용출 용액으로부터 순수한 DNA 앱타머 풀을 회수하기 위하여 실시예 1-3과 같이 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 수행한 뒤, 50 ㎕의 증류수에 회수하였다.
2-3. 대장균( E. coli )의 배양 및 준비
쉬겔라 소네이에 특이적으로 결합하는 쉬겔라 소네이 생균 특이 결합 DNA 앱타머 풀 중에서 다른 균주에 결합하는 비특이적인 앱타머를 제거하기 위하여 네가티브 선별(Negative selection)을 수행하였다. 네가티브 선별을 위한 균주로는 쉬겔라 소네이와 유전학적으로 유사한 대장균(E. coli)를 이용하였다.
네가티브 선별을 위한 대장균은 Luria-Bertini(LB) broth 5 ㎖에 접종한 뒤 37℃ 교반배양기에서 15시간 동안 배양하여 확보하였다. 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 10분)를 통하여 대장균을 침전시킨 후 배양 배지를 완전히 제거하고 세척 용액(Tris base 10 mmol/L, NaCl 0.85%, pH 8.0) 200 ㎕를 첨가하여 재현탁을 통해 대장균의 표면을 세척한 뒤 원심분리를 통하여 상층액을 제거하였다. 상기의 과정을 3번 반복함으로써 대장균 생균 표면에 잔여물이 없도록 하였다.
2-4. 네가티브 선별을 통한 비특이적 ssDNA 제거
쉬겔라 소네이의 표면이 아닌 배양 배지 내 타 성분에 결합하는 ssDNA를 제거하고, 쉬겔라 소네이에만 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 제작하기 위하여 Cell-SELEX 7 라운드 후에 대장균을 이용한 네가티브 선별을 진행하였다. 상기 실시예 1-4를 통해 확보한 ssDNA 앱타머 100 ㎕를 상기 실시예 2-3에서 확보한 대장균 생균에 넣고 재현탁한 뒤, 4℃의 Thermo mixer(Eppendorf, USA)에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 10분)를 통하여 대장균과 결합하지 않은 앱타머 풀이 포함되어 있는 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액으로부터 순수한 DNA 앱타머 풀을 회수하기 위하여 실시예 1-3과 같이 PCI 추출 및 에탄올 침전법을 수행한 뒤, 50 ㎕의 증류수에 회수하여 다음 라운드의 주형 DNA로 사용하였다. 이후 SELEX는 총 10 라운드까지 진행하였으며, SELEX 결합 조건은 라운드를 진행할수록 반응 조건을 엄격하게 하여 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 더욱 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 얻고자 하였다.
실시예 3: 쉬겔라 소네이의 표면에 특이적으로 결합하는 최적 SELEX 라운드 선별을 위한 친화성 테스트
3-1. 나노드랍(Nano-drop)을 이용한 쉬겔라 소네이 표면 결합 DNA 앱타머 후보군의 친화성 테스트
SELEX를 10회까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 ssDNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 각 라운드에서 용리된 ssDNA의 농도를 나노드랍을 이용하여 측정하였다. 먼저 1 라운드부터 10 라운드에서 용출된 ssDNA 앱타머를 PCR을 통하여 증폭하고, 스트렙트아비딘을 이용하여 ssDNA를 제작하였다. 각 라운드의 ssDNA의 농도를 동일하게 조정하여 109 CFU의 쉬겔라 소네이와 각각 1시간 동안 반응시켰다. 그리고 세척 용액으로 3회 세척한 뒤 DNA 앱타머 용출 용액에 용출하였다. 용리한 각 라운드의 ssDNA 앱타머 각각을 나노드랍을 이용하여 농도를 측정하였다. 나노드랍을 활용하여 각 라운드의 농도를 측정한 결과, 8 라운드의 농도가 766.3 ng/㎕로 가장 높았으며, 9 라운드의 농도는 628.1 ng/㎕, 10 라운드의 농도는 454.2 ng/㎕로 8 라운드의 결과 보다 농도가 떨어지는 것으로 보아 8 라운드가 최적의 쉬겔라 소네이 결합 DNA 앱타머가 형성된 라운드임을 확인할 수 있었다. 이와 같이 나노드랍을 통해 정량적인 농도를 확보한 결과를 토대로 8 라운드에서 획득한 ssDNA가 쉬겔라 소네이 결합 효율이 가장 높다는 것을 확인할 수 있었다 (도 2 참고).
3-2. 실시간(Real-time) PCR을 통한 SELEX 라운드의 선별
SELEX를 10회까지 마친 후 SELEX 진행 여부 및 각 라운드에서 용리된 DNA 앱타머의 친화성을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다. 먼저 초기 DNA 라이브러리와 네가티브 선별 이후인 7라운드, 8라운드, 9라운드에서 용리된 각각의 ssDNA 앱타머들을 PCR을 통하여 증폭하고, 가열-냉각 기법 및 스트렙트아비딘을 이용하여 ssDNA를 확보하였다. 각 0, 7, 8, 9 라운드에서 확보된 ssDNA 앱타머 풀은 동일한 농도로 준비한 후, Cell-SELEX를 다시 한 번 진행하여 쉬겔라 소네이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머만을 회수하였다. 이후, 회수된 각 라운드의 ssDNA는 각각 100, 10-1, 10-2로 희석하여 실시간 PCR의 주형 DNA로 사용하였다. 실시간 PCR은 Biorad사의 iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 실시간 PCR 반응 조건은 94℃에서 5분 변성 이후, 94℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20초간 반응하는 과정을 40주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 반응 조건으로 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 결과는 10-2로 희석된 샘플을 주형 DNA로 이용한 실험에서 결과를 획득할 수 있었다. 실시간 PCR 효율은 각 라운드별로 각각 76.97％, 79.35％, 73.44％ 이었으며, 9라운드에서 획득한 실시간 PCR 효율은 73.44％로 8 라운드의 결과보다 효율이 떨어지는 것으로 보아 더 이상 SELEX를 진행할 필요가 없음을 확인할 수 있었다. 또한, C(t)값은 각각 14.33, 13.66, 13.85로, 8 라운드의 C(t)값이 가장 낮아 8 라운드의 주형 DNA의 농도가 가장 높음을 확인할 수 있었다 (표 1 및 도 3 참고).
7R (1 X 10-2) 8R (1 X 10-2) 9R (1 X 10-2)
Efficiency (%) 76.97 79.35 73.44
C(t) 14.33 13.66 13.85
실시예 4: 쉬겔라 소네이 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군의 클로닝
나노드랍과 실시간 PCR을 통해 쉬겔라 소네이 결합 효율이 가장 높은 것으로 판단된 8 라운드의 ssDNA 앱타머 풀에 대해 정방향 프라이머: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT -3'(서열번호 23)와 역방향 프라이머: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3' (서열번호 24)를 이용한 PCR 수행으로 dsDNA를 획득하였다. 이렇게 획득한 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트(Solgent, Korea)를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 클로닝은 T-벡터(10 ng/㎕) 1 ㎕와 PCR 산물 4 ㎕, 6 X T-블런트 버퍼 1 ㎕를 섞어서 25℃에서 5분 동안 반응시키는 조건을 이용하였다. T-블런트 클로닝 반응액 6 ㎕는 100 ㎕의 DH5α와 섞은 후 42℃에서 30초 동안 열충격(heat shock)을 가하여 형질전환시킨 후, 2분 동안 얼음에서 반응시켰다. 여기에 900 ㎕의 SOC 배지[2％ 트립톤(tryptone), 0.5％ 효모추출물(yeast extract), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM 글루코오스(glucose)]를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린(ampicillin, 50 ㎍/ml), 카나마이신(kanamycin, 50 ㎍/ml), X-gal(50 ㎍/ml), IPTG(5 ㎍/ml)가 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 스프레딩하고, 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후, 40개의 흰색 콜로니만을 선별하여 플라스미드 DNA 정제 키트(Intron biotechnology, Korea)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 확보한 각 콜로니의 플라스미드를 이용하여 앱타머의 염기서열을 결정하였으며(Solgent, Korea), 서열분석을 통하여 비정상적인 서열과 중복되는 서열을 제외하고 21개의 쉬겔라 소네이 결합 DNA 앱타머를 확보할 수 있었다. 아래 표 2는 Cell-SELEX 기법을 활용하여 획득한 쉬겔라 소네이 결합 DNA 앱타머 후보군 21개에 대한 서열을 나타낸 것이다.
클론 명칭 서열번호 선별된 DNA 앱타머 클론의 염기 서열 서열크기 (bp)
SS-1 서열번호 1 GGGCATGTGGACCTGCGATTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGG 40
SS-2 서열번호 2 CCCCATGTCTGTTTCTTTTAACAGGTAATCCGCCTTATGC 40
SS-3 서열번호 3 CCATGGTCCCTCGTGTTTATTATGTTGTCTGAACTGGCTG 40
SS-4 서열번호 4 CCACACATACCAAAAACACAGCACACTTCATCAATTTCACG 41
SS-5 서열번호 5 CAGGACAAAAATTCGGGAAGGCGGCCTTCCACTCTTTCTG 40
SS-6 서열번호 6 ATACAGTGAAGGCCCAGGAGGCAAATTCTAGGACGAAAGC 40
SS-7 서열번호 7 CACCAAGTCGCCTCCTCTGCCCCCATGTAAATCGTTACAT 40
SS-8 서열번호 8 GAACAATTTCACGCACACCGCGTAGATACCACCTCGTGCA 40
SS-9 서열번호 9 CGACGAACTACACCACAGGCCCTTAACACATCTACTTGTA 40
SS-10 서열번호 10 CATGCTAACTGCCATCACCACTATTTATGATTCCATCCAT 40
SS-11 서열번호 11 CGCAACACAGAAACACCCGTACACAAACAGTTTCAGCCCG 40
SS-12 서열번호 12 TGCGTAGTTCTCTTAACAACCATTCAGCGTATTTTCGTGG 40
SS-13 서열번호 13 CAGGCACGAGTTCATCACACACCATACACAGTTCGTTACT 40
SS-14 서열번호 14 CCACACCACACACTACACGCATAAAACCACGAAACTACAC 40
SS-15 서열번호 15 GGGTATGTGGACTTGCGATTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGG 40
SS-16 서열번호 16 CATACAGTGGCCAGATTTACCAACACACCTTTCCATACGC 40
SS-17 서열번호 17 CCACTCACATATTAACAACACCACATGAATATATTTCG 38
SS-18 서열번호 18 ACAGGGCATGTCTTCATCAACGCTTACCACACACCGCTCG 40
SS-19 서열번호 19 CACTCATGCGCACCGCGTCGCACTTAATCAGTGTTGTGC 39
SS-20 서열번호 20 GGGCATGTGGACTTGCGATTTCGGTTTGGTGTGGTTGGGG 40
SS-21 서열번호 21 CAGACACACCAACGCACGGGCACACGCTACAAATGTAAGT 40
실시예 5: 쉬겔라 소네이 생균 표면 결합 DNA 앱타머 후보군들의 구조 결정
쉬겔라 소네이 생균과 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 후보군들의 구조는 Rensselear polytechnic institute에서 제공하는 DNA mfold 프로그램을 활용하여 이미지화 할 수 있었다.
실시예 6: 나노드랍을 이용한 쉬겔라 소네이 생균 표면 결합 DNA 후보군의 친화도 테스트
쉬겔라 소네이 생균의 표면에 최적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여 상기 실시예 4를 통해 확보한 앱타머 서열을 가지는 클론을 이용하여 ssDNA 앱타머를 제작하였다. 각각의 서열을 가지는 앱타머는 동일한 농도로 제작하여 cell-SELEX를 재진행하여 회수된 앱타머의 농도를 나노드랍을 이용하여 측정하였다 (표 3 참고).
클론 명칭 회수된 앱타머
(ng/㎕) 		클론 명칭 회수된 앱타머
(ng/㎕) 		클론 명칭 회수된 앱타머
(ng/㎕)
SS-1 378.8 SS-8 453.7 SS-15 492.9
SS-2 216.9 SS-9 534.1 SS-16 474.4
SS-3 300.4 SS-10 497.9 SS-17 524.1
SS-4 337.4 SS-11 631.0 SS-18 586.9
SS-5 465.9 SS-12 310.6 SS-19 393.7
SS-6 647.1 SS-13 613.3 SS-20 472.0
SS-7 446.8 SS-14 500.6 SS-21 478.5
실시예 7: SPR을 통한 쉬겔라 소네이 생균 결합 DNA 앱타머의 검출능 테스트
7-1. 쉬겔라 소네이 생균 결합 DNA 앱타머의 검출능을 확인하기 위한 앱타머 고정칩 제작
상기 실시예 6에서 쉬겔라 소네이와 친화도가 높은 것으로 확인된 쉬겔라 소네이 생균 결합 앱타머 SS-6 및 SS-11에 대하여 쉬겔라 소네이 검출능을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 SPR 검출 시스템 기기인 BIAcore 3000(BIACORE)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 실험을 실시하였다. SPR 실험을 위하여 표면이 스트렙트아비딘으로 코팅된 센서 칩 SA(GE Healthcare)를 이용하였다. 우선 스트렙트아비딘이 고정된 센서칩에 앱타머를 고정시키기 위하여 SS-6 및 SS-11 앱타머의 5′- 말단에 바이오틴을 표지하여 ssDNA를 제작하였다. 센서칩 SA의 표면은 HBSEP 버퍼(GE Healthcare)를 10 ㎕/min으로 흘려주어 표면을 활성화시킨 후에 기제작한 바이오틴이 표지된 앱타머를 10 ㎕/min으로 6분 동안 3회 흘려줌으로써 센서 칩 SA에 스트렙트아비딘-바이오틴 결합을 통해 앱타머를 고정시켰다. 센서 칩에 고정되지 않은 앱타머를 제거하기 위하여 HBSEP 버퍼를 10 ㎕/min로 흘려준 뒤 쉬겔라 소네이 배양액을 10분 동안 처리하여 각 앱타머의 검출능을 확인하였다. 센소그램(Sensogram)을 이용하여 분석한 결과, 쉬겔라 소네이 배양액을 흘려준 뒤 SS-6은 약 100 RU(Response unit), SS-11은 약 470 RU가 증가한 것으로 확인되었다. 이를 통해 쉬겔라 소네이 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 앱타머의 쉬겔라 소네이 생균에 대한 검출능을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> DNA Aptamer Capable of Specifically Binding to Surface of Living Cell of Shigella sonnei and Uses Thereof <130> PN140478 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 1 gggcatgtgg acctgcgatt tcggtttggt gtggttgggg 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 2 ccccatgtct gtttctttta acaggtaatc cgccttatgc 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 3 ccatggtccc tcgtgtttat tatgttgtct gaactggctg 40 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 4 ccacacatac caaaaacaca gcacacttca tcaatttcac g 41 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 5 caggacaaaa attcgggaag gcggccttcc actctttctg 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 6 atacagtgaa ggcccaggag gcaaattcta ggacgaaagc 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 7 caccaagtcg cctcctctgc ccccatgtaa atcgttacat 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 8 gaacaatttc acgcacaccg cgtagatacc acctcgtgca 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 9 cgacgaacta caccacaggc ccttaacaca tctacttgta 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 10 catgctaact gccatcacca ctatttatga ttccatccat 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 11 cgcaacacag aaacacccgt acacaaacag tttcagcccg 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 12 tgcgtagttc tcttaacaac cattcagcgt attttcgtgg 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 13 caggcacgag ttcatcacac accatacaca gttcgttact 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 14 ccacaccaca cactacacgc ataaaaccac gaaactacac 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 15 gggtatgtgg acttgcgatt tcggtttggt gtggttgggg 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 16 catacagtgg ccagatttac caacacacct ttccatacgc 40 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 17 ccactcacat attaacaaca ccacatgaat atatttcg 38 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 18 acagggcatg tcttcatcaa cgcttaccac acaccgctcg 40 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 19 cactcatgcg caccgcgtcg cacttaatca gtgttgtgc 39 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 20 gggcatgtgg acttgcgatt tcggtttggt gtggttgggg 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA aptamer <400> 21 cagacacacc aacgcacggg cacacgctac aaatgtaagt 40 <210> 22 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Template for PCR <400> 22 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagattgca cttactatct 100 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer for PCR <400> 23 ataccagctt attcaatt 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for PCR <400> 24 agattgcact tactatct 18

Claims (11)

  1. 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균 표면에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 21의 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열과 90％ 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 21 서열 중 어느 하나에 개시된 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 5' 말단 또는 3' 말단에 바이오틴(biotin) 아민기, 티올기, Cy3, Cy5, 플루오레세인(fulorescein), 또는 방사성 물질이 결합된 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 앱타머는 뉴클레오타이드의 당(sugar) 2번 탄소의 수소기가 불소원자, 아미노기, 또는 메톡시기로 치환된 것을 특징으로 하는 DNA 앱타머.
  6. 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 검출용 조성물.
  7. 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 검출용 키트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 키트는 DNA 앱타머가 칩상에 고정화된 칩 형태인 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 다음의 단계를 포함하는 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 검출 방법:
    (a) 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균을 함유하는 것으로 예상되는 시료와 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균을 확인하는 단계.
  10. 세균성이질의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 환자의 생물학적 시료에서 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균의 존재 여부를 검출하는 방법으로서, (a) 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 DNA 앱타머와 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 DNA 앱타머와 결합된 쉬겔라 소네이(Shigella sonnei) 생균을 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 세포 배양액, 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 또는 세균 발현계인 것을 특징으로 하는 방법.
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