KR20160032230A - 골형성 유도 인산 칼슘의 제조방법 및 이로부터 제조된 제품 - Google Patents

골형성 유도 인산 칼슘의 제조방법 및 이로부터 제조된 제품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 골형성 유도성 인산 칼슘 물질의 제조방법으로서, 인산 칼슘 입자들로 구성된 표면 지형을 갖는 소결된 인산 칼슘 출발 물질을 제공하는 단계, 상기 소결된 인산 칼슘 출발 물질을 125 ℃-150 ℃의 온도로, 상기 출발 물질의 표면 상에 존재하는 인산 칼슘 입자들을 인산 칼슘 바늘들로 변화시키기에 충분한 시간 동안 수열처리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

골형성 유도 인산 칼슘의 제조방법 및 이로부터 제조된 제품 {Method for producing an osteoinductive calcium phosphate and products thus obtained}
본 발명은 재생 의약에서 골 이식 물질로서 사용되는 인산 칼슘에 대한 표면 처리, 및 상기 처리에 의해서 제조된 골형성 유도 인산 칼슘에 관한 것이다.
합성 골 대체재들은 생체 적합성, 골전도성 (osteoconductive)을 지녀야 하며, 임상적 세팅에서 성공적으로 사용될 수 있기 위해서 천연 골과 기계적으로 호환성을 지녀야 한다. 더욱 신속한 골 내성장 (bone ingrowth), 더 나아가 신체의 골 형성능 또는 골 유도의 촉진에 의해서 상기 물질이 더욱 개선된다. 이식 물질의 이러한 특성은, 이러한 물질이 골형성을 유도할 수 있는 능력, 또는 줄기 세포들이 골-형성 조골세포들 (osteoblasts)로 분화하도록 촉발하는 메커니즘을 의미한다.
골형성 유도는 주로 인산 칼슘 세라믹 재료들의 서브그룹에 대해서 보고된 바 있으며, 이러한 재료들에는 수산화인회석 (hydroxyapatite, HA), β-트리칼슘 포스페이트 (β-tricalcium phosphate, β-TCP), 이상 인산 칼슘 (biphasic calcium phosphate, BCP)이 포함되는 바, 이러한 것들에는 HA 및 TCP의 혼합물, 인산 이칼슘 무수물 (dicalcium phosphate anhydrous, DCPA), 인산 이칼슘 이수화물 (dicalcium phosphate dihydrate, DCPD), 탄산화인회석, 피로인산 칼슘 (calcium pyrophosphates, CPP) 및 HA/탄산칼슘 (CC) 혼합물들이 존재한다. 골형성 유도성을 갖는 것으로서 서술된 물질들을 철저히 분석하였음에도 불구하고, 골형성 유도 물질이 어떻게 정확히 디자인되고 생산되어야 하는가에 대해서 서술하는 것은 아직까지도 불가능하다. 분명한 점은, 골형성 유도 능력은 이소성 이식 (heterotropic implantation), 즉 자연 상태에서는 골이 성장하지 않는 조직 또는 기관들에 이식되는 것, 예를 들어 정상 위치가 아닌 곳에 이식되는 것 (ectopic implantation)에 의해서 가장 잘 결정된다는 점이다 (즉, 근육내 이식 또는 피하 이식).
일반적으로, 특정 다공성 인산 칼슘들은 골형성 유도성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, Yamasaki 등은, Biomaterials 13:308-312 (1992)에서, 다공성 수산화인회석 세라믹 과립들 주변에서는 이소성 골화 (정상적으로는 골화하지 않는 조직 중에서 새로운 골의 형성)가 발생되지만, 조밀한 과립들 주변에서는 그러하지 않음을 보고한 바 있다. 상기 다공성 과립들은 200 내지 600 ㎛의 크기를 가지며, 그 직경이 2 내지 10 ㎛인 기공들이 연속적이고 상호연결된 미세다공성을 갖는다.
미국특허 6,511,510호는 Yamasaki 등에 의한 다공성 수산화인회석 과립들에 비해서 개선된 골형성 유도성을 나타내는 생체적합성 및 생분해성 인산 칼슘을 서술하고 있다. 상기 생분해성 인산 칼슘은 20 내지 90%의 총 기공도를 가지며, 그 크기가 0.05 내지 1.5 mm인 거대기공들 및 그 크기가 0.05 내지 20 ㎛인 미세기공들을 모두 포함한다. 상기 생분해성 인산 칼슘 물질은 몰드 캐스팅 (mould casting)에 의해서 제조되고, 이어서 블럭들을 더 작은 크기의 입자들로 과립화하거나 또는 절단할 수 있다. 상기 물질은, 이식되는 경우에는, (일시적인) 골 대체재로서 기능하기에 적합하다.
전술한 물질들이 이용가능함에도 불구하고, 생체 조직들과 관련하여 사용되는 생물질들이 더욱 우수한 골전도성 및 골형성 유도성을 갖도록 하는 것, 즉 더욱 빠르고 더욱 견고한 골 형성을 야기하는 것이 유리할 것이다. 또한, 그러한 골형성 유도 물질들이 포유류의 체내로 용이하게 도입가능해야 하는 바, 가장 바람직하게는 그러한 물질들이 용이하게 이식가능하고, 골로 이루어진 부위들 및 골로 이루어지지 않은 부위들에서 새로운 골을 생산하기 위한 효과적인 스캐폴드 물질을 제공하는 것이 유리할 것이다. 그러한 물질은 신규 자가조직성 골의 생산을 위해서 훨씬 더 유용하며, 이는 대규모 골 결함을 수리하기 위해서 후속 사용될 수 있을 것이다.
본 발명은 탁월한 골형성 유도 특성을 갖는 인산 칼슘 물질을 제공한다.
특히, 본 발명은 인산 칼슘, 구체적으로는 소결된 인산 칼슘을 처리하는 방법을 제공하며, 이러한 처리 방법에 의해서 물질, 특히 그 표면이 미처리된 물질과 비교할 때 더욱 골형성 유도성을 갖는다.
본 발명은 골형성 유도 인산 칼슘 물질을 제조하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 소결된 이상 인산 칼슘 (biphasic calcium phosphate, BCP) 출발 물질로서 인산 칼슘 입자들로 구성된 표면 지형을 갖는 출발 물질을 제공하는 단계, 상기 소결된 이상 인산 칼슘 출발 물질에 125 ℃ 이상의 온도에서, 상기 출발 물질의 표면 상에 존재하는 인산 칼슘 입자들이 인산 칼슘 바늘들로 변화하기에 충분한 시간 동안 수열처리 (hydrothermal treatment)하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 수열처리 이전의 상기 BCP 출발 물질은 4-20% 함량의 인회석 (apatite)을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 인회석은 수산화인회석이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 수열처리 이전의 상기 인산 칼슘 출발 물질은 0.1-3.0 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.2-2.5 ㎛의 평균 입자 크기를 가지며, 더욱 바람직하게는 약 0.5-2.2 ㎛, 0.75-1.5 ㎛의 중간 입자 크기를 갖는다.
처리 이전 및 처리 이후의 물질은 다공성인 것이 바람직하다.
처리 이전 및 처리 이후의 물질은 거대기공성을 나타내는 것이 또한 바람직하다 (0.1 내지 1.5 mm의 크기를 갖는 기공들).
상기 수열처리는 상기 출발 물질의 표면 상의 상기 인산 칼슘 입자들을 인산 칼슘 바늘들로 변화시키게 된다. 입자형으로부터 바늘형 지형으로 표면 지형 (surface topography)이 변화하는 것은 비표면적 및 총 기공 면적의 증가와 관련이 되며, 결과적으로 전술한 상기 수열처리로 인해서 표면 단백질 흡착 능력이 현저하게 증가하게 된다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 인산 칼슘 출발 물질의 총 기공 면적은, 미처리된 대조군 물질에 비해서 상기 수열처리 이후 적어도 10-65% 증가하게 된다. 총 기공 면적은 수은 침입 (mercury intrusion)에 의해서 측정되며, m2/g로 표현된다.
본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 인산 칼슘 출발 물질의 총 기공 면적은, 미처리된 대조군 물질에 비해서 상기 수열처리 이후 적어도 100% 증가하게 된다.
본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 인산 칼슘 출발 물질의 상기 단백질 흡착 능력은, 미처리된 대조군 물질에 비해서 상기 수열처리 이후 적어도 10-50% 증가하게 된다. 상기 단백질 흡착 능력은 37 ℃에서 배양한 이후에 흡착된 혈청 단백질 또는 알부민의 함량을 측정하고, 미리 정해진 함량의 인산 칼슘 물질을 미리 정해진 시간 동안 배양한 후에 용액 중에 잔류하는 단백질의 함량을 측정함으로써 측정될 수 있다. 단백질들은, 예를 들어 바이신코닉산 (bicinchoninic acid, BCA) 분석법을 사용하여 분광학적으로 측정될 수 있다.
본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 인산 칼슘 출발 물질의 상기 단백질 흡착 능력은, 미처리된 대조군 물질에 비해서 상기 수열처리 이후 적어도 50% 증가하게 된다.
본 발명은 다른 태양에서, 전술한 본 발명에 따른 방법에 의해서 제조된 골형성 유도 인산 칼슘 물질을 제공한다. 상기 골형성 유도 인산 칼슘은, 바람직하게는 미처리된 비교 출발 물질에 비해서 적어도 40% 높은 단백질 흡착 능력을 갖는다. 이와 같이 증가된 단백질 흡착 능력은 상기 처리로부터 기인한 비표면적의 증가와 관련되는 것으로 판단된다. 실제로, 상기 처리는 상기 인산 칼슘 물질의 비표면적을 두 배로 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 전술한 방법에 의해서 제조되는, 바늘형 표면 지형을 갖는 본 발명의 골형성 유도 인산 칼슘은, 비슷한 조성을 갖지만 입자형 표면 지형을 갖는 기존 물질에 비해서 더 큰 비표면적 및 총 기공 면적을 갖는다. 특히, 본 발명의 개선된 골형성 유도 물질은 바람직하게는 적어도 1.8 m2/g의 총 기공 면적을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 개선된 골형성 유도 물질은, 수은 침입에 의해서 측정한 바와 같이, 적어도 1.85 m2/g, 더욱 바람직하게는 1.9 m2/g, 더더욱 바람직하게는 2.0 m2/g, 좀 더 바람직하게는 2.5, 2.8, 3.0, 3.5, 4.0 또는 4.5 m2/g의 총 기공 면적을 갖는다. 특히, 본 발명의 개선된 골형성 유도 물질은 바람직하게는 적어도 0.7 m2/g의 비표면적을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 개선된 골형성 유도 물질은, BET에 의해서 측정한 바와 같이, 0.9 m2/g 이상, 더욱 바람직하게는 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 또는 3.0 m2/g의 비표면적을 갖는다.
예를 들어, 전술한 방법에 의해서 제조되는, 바늘형 표면 지형을 갖는 본 발명의 골형성 유도 인산 칼슘은, 비슷한 조성을 갖지만 입자형 표면 지형을 갖는 기존 물질에 비해서 더 큰 단백질 흡착 능력을 갖는다. 특히, 본 발명의 개선된 골형성 유도 물질은 바람직하게는 물질 cc 당 적어도 1.0-3.0 mg의 혈청 단백질 (2 ml의 1% FBS로부터), 또는 물질 cc 당 적어도 1000-3500 ㎍의 BSA (2 ml의 400 ㎍/ml BSA)에 대한 단백질 흡착 능력을 갖는다.
본 발명의 방법에 의해서 제조되는 골형성 유도 인산 칼슘 물질은 출발 인산 칼슘 물질에 비해서 더 높거나 또는 더 낮은 함량의 수산화인회석을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 더 높은 함량의 수산화인회석을 포함할 수 있다. 10% 함량의 수산화인회석을 포함하는 이상 인산 칼슘 출발 물질은, 수열처리 이후에 수산화인회석의 함량이 30% 이상일 수 있다.
본 발명의 방법에 의해서 제조되는 골형성 유도 인산 칼슘 물질은, 바람직한 구현예에서, 이상 인산 칼슘 (BCP) 세라믹이고, 바람직하게는, 5 내지 65%, 예를 들어 50%의 수산화인회석 (HA), 및 35 내지 95%, 예를 들어 50%의 β-트리칼슘 포스페이트 (β-TCP)를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해서 제조되는 골형성 유도 인산 칼슘 물질은, 바늘형 표면 지형을 갖는다. 이러한 바늘들은 통상적으로 10-1500 nm의 직경을 갖는다. 상기 물질은 더 나아가 바람직하게는 다공성이다.
본 발명의 방법에 의해서 제조되는 물질은, 생체 조직 내에서 탁월한 골형성 유도 특성을 나타내는 바, 이는 주로 그 우수한 단백질 흡착 능력 때문이다. 본 발명의 물질의 표면에서 골 조직이 형성되기 때문에, 상기 물질로 이루어진 임플란트의 우호적 수용 환경이 조성된다. 더 나아가, 골 조직의 형성은 골 구조에서 발생된 임의의 손상에 대한 회복을 가속시키는 바, 이러한 연유로 임플란트를 적용하게 된다.
본 발명의 골형성 유도 인산 칼슘은, 바람직하게는 약 50 내지 약 1500 ㎛, 더욱 바람직하게는 약 200 내지 약 500 ㎛, 가장 바람직하게는 212-300 ㎛의 입자 크기를 갖는 미세입자들의 형태일 수 있다. 다른 구현예들에서, 본 발명의 인산 칼슘은 바람직하게는 1000-4000 ㎛의 과립 크기를 갖는 과립 (granules)의 형태일 수 있다. 다른 대체적인 구현예에서, 본 발명의 인산 칼슘은 수 세제곱 센티미터 (예를 들어, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 cm3)의 블럭 형태일 수 있는 바, 이러한 블럭은 미리 성형된 것이거나, 또는 메스 (scalpel) 또는 버 (burr)에 의해서 (골) 손상의 크기로 성형될 수 있는 블럭일 수 있다.
본 발명의 골형성 유도 인산 칼슘 세라믹은 통상적으로 수열처리 이전의 대응되는 인산 칼슘 세라믹 출발 물질에 비해서 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 또는 심지어 3배 더 큰 총 기공 면적을 갖는다. 본 발명의 상기 바늘형 표면 지형을 갖는 인산 칼슘 세라믹의, Hg 침입에 의해서 측정된 상기 총 기공 면적은 1.8, 1.9, 2, 2.5, 2.7, 3.0, 3.5, 3,8 또는 4.0 m2/g일 수 있으며, 또는 그보다 더 클 수도 있다.
본 발명의 골형성 유도 인산 칼슘 세라믹은 통상적으로, 수열 처리 이전의 인산 칼슘 세라믹 출발 물질에 비해서 0.5, 1, 1.5 또는 심지어 2배 더 큰 비표면적 (BET)을 갖는다. 본 발명의 상기 바늘형 표면 지형을 갖는 인산 칼슘 세라믹의, BET에 의해서 측정된 상기 비표면적은 1.25, 1.4, 1.5, 2, 2.4, 또는 심지어 2.5 m2/g일 수 있으며, 또는 그보다 더 클 수도 있다.
(미세)입자 또는 과립 형태를 갖는 본 발명의 골형성 유도 물질의 장점은 이러한 물질이 탁월한 유동 특성들을 갖는다는 점이다. 상기 (미세)입자 물질의 모래형 구성으로 인해서, 부가적인 유동성 캐리어 없이도 주입이 가능하다. 따라서, 그러한 구현예로 된 상기 물질은 주사제로서 사용될 수도 있지만, 예를 들어 유동성 캐리어와 함께 혼합물 (admixture)로서 사용될 수도 있다. 다른 한편으로는, 상기 (미세)입자 또는 과립은 고체 또는 반고체 블럭을 형성하기 위해서 복합체 물질로 조합될 수 있으며, 이는 예를 들어 이식용으로 적절히 사용될 수 있다.
본 발명의 물질의 또 다른 구현예에서, 상기 인회석 바늘의 밀도는 0.45/μm2보다 낮을 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 골형성 유도 인산 칼슘을 의료적 이식 물질 또는 조직 스캐폴드 (scaffold)로서 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 골형성 유도 인산 칼슘은 생물 유기체 중 뼈 조직의 형성을 유도하기 위해서 적절히 사용될 수 있으며, 이는 단독 이식 물질 또는 성장 인자들 및/또는 비골성 부위 (non-osseous site) 중에서 자가조직성 골의 생산을 위한 세포들과 조합되어 사용될 수 있다. 또는, 의료 이식물 또는 장치의 생산을 위해서 단독으로 또는 성장 인자들 및/또는 세포들과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 골형성 유도 인산 칼슘은 골 재구축에 적절히 사용될 수 있으며, 예를 들어 턱과 얼굴의 수술, 또는 정형외과적 수술에 사용될 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 인회석 바늘들을 포함하는 외부층 및, 선택적으로 상기 외부층과 접촉하고 있는 내부층을 포함하는 골형성 유도 인산 칼슘 코팅에 관한 것이다. 상기 태양의 바람직한 구현예에서, 상기 골형성 유도 인산 칼슘 코팅은, 인회석 바늘들을 포함하는 층으로 구성되고, 상기 층은 중심 물질 상에서 코팅층을 형성한다. 상기 중심 물질의 표면은 완전히 코팅되지 않고, 바람직하게는 상기 골형성 유도 인산 칼슘 코팅으로 적어도 40-90% 코팅될 수 있다. 상기 중심 물질은 임의의 이식가능한 물질일 수 있으며, 예를 들어 금속 (금, 강철 와이어, 백금, 티타늄), 플라스틱 (폴리에틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌) 또는 세라믹 (세라믹 산화물, 탄소, 인산 칼슘 세라믹, 유리성 세라믹) 물질, 바람직하게는 인산 칼슘, 더욱 바람직하게는 BCP, 또는 이러한 물질들의 조합과 같은 골 지지 또는 골 재구축 물질일 수 있다.
본 발명의 코팅에 대한 바람직한 구현예에서, 상기 인회석은 수산화인회석이다.
본 발명의 코팅에 대한 다른 바람직한 구현예에서, 상기 인회석 바늘은 10-1500 nm의 평균 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 코팅에 대한 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 외부층의 인회석 바늘들의 밀도는 0.45 바늘/㎛2 미만일 수 있다.
본 발명의 코팅에 대한 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 외부층의 두께는 1 내지 1000 ㎛일 수 있다.
본 발명의 코팅에 대한 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 내부층은 BCP를 포함한다.
본 발명의 코팅에 대한 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 BCP는 4-20 중량%의 인회석을 포함한다.
본 발명의 코팅에 대한 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 BCP는 소결된 BCP이다.
본 발명의 코팅에 대한 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 코팅은 0.9 m2/g 이상의 BET 비표면적을 갖는다.
본 발명의 코팅에 대한 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 외부층은 상기 내부층의 BCP를 125 ℃ 이상의 온도에서 수열 처리함으로써 제조된 인회석 결정이다.
본 발명의 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 상기 코팅에 대한 전술한 구현예들 중 어느 하나에 따른 코팅을 포함하는 이식가능한 물체를 제공한다.
본 발명에 따르면, 탁월한 골형성 유도 특성을 갖는 인산 칼슘 물질 및 그 제조방법을 제공할 수 있다.
도 1은 (a) T1050, (b) T1125, (c) T1150, (d) T1050a, (e) T1125a, 및 (f) T1150a에 대한 SEM 영상들을 도시한 것이다. 도 (d) - (f)는 '핫/롱 (hot/long)' 세팅에 의해서 처리된 세라믹들이다. 상기 도면들에서 '콜드/쇼트 (cold/short)' 처리에 의해서 처리된 세라믹들은 도시되지 않았는데, 이는 표면 지형 변화가 발생되지 않았기 때문이다.
도 2 (좌측)는 혈청 단백질 흡착 (cc 당 ㎍) 및 (우측) 알부민 단백질 흡착 (cc 당 ㎍)을 도시한 도면이다.
도 3은 (a) T1050, (b) TCP 음대조군, (c) T1050a 및 (d) T1125a에 대한 조직학적 관찰도이다. 물질은 흑색이고, 골은 분홍색으로 염색되어 있으며, 연조직/근육은 보라색으로 염색되어 있다.
도 4는 (a) T1050 (종래기술 물질), (b) T1050a (본 발명) 및 (c) T1125a (본 발명)의 동일한 지점에서 형광 및 광영상을 중첩시킨 도면이다. 밝은 녹색은 골 조직에 대한 칼세인 (calcein) 염색이다 (별 모양으로 표시). TCP 음 대조군은 도시되지 않았는데, 이는 골 형성이 발생되지 않았기 때문이다.
도 5는 본 발명의 물질 또는 코팅에 대한 바늘형 표면 지형을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 물질 또는 코팅에 대한 단면도이다. 도면의 좌측은 분명하게 바늘형 표면 지형을 보여줌에 반해서 (외부층), 도면의 우측은 BCP를 보여준다 (내부층).
"입자 (particle)" 및 "과립 (granule)"이라는 용어는 본 발명에서 상호교환적으로 사용되며, 인산 칼슘 물질의 과립형 또는 분말형 형태를 나타내기 위해서 사용된다. 상기 입자는 0.1 내지 5 mm 범위의 평균 크기를 가질 수 있다. 미세입자는 1 mm 미만의 크기를 갖는 입자이다 (즉, 수 내지 수백 마이크로미터).
"결정 (crystal)"이라는 용어는 개별적으로 식별가능하고, 상호연결된 인산 칼슘 요소들로서 SEM 중에서 관찰가능한 것이며, 인산 칼슘의 연속적 기질을 형성하는 것을 의미한다. "결정"이라는 용어는 일반적으로 침전과 같은 결정화 과정 이후에 인산 칼슘 분자들의 기본적 공간 구조를 의미하는 것이다. 본 발명에서 "결정"이라는 용어는 입자 (grain) 및 바늘 (needle)을 모두 포함한다.
"입자 (grain)" 및 "입자형 (grain-like)"이라는 용어들은 인산 칼슘 결정들이 구형 특성 또는 모폴로지를 가짐으로써 상기 인산 칼슘 물질의 표면 지형을 결정하는 것을 의미한다. 도 1a-c는 인산 칼슘의 입자형 표면 지형, 즉 결정들이 필수적으로 입자들로 구성된 예를 보여준다. 입자들은 일반적으로 0.1-5.0 ㎛ 범위의 평균 크기를 갖는다.
"바늘 (needle)" 및 "바늘형 (needle-like)"이라는 용어는 인산 칼슘 결정들이 가시 특성 또는 모폴로지를 가짐으로써 상기 인산 칼슘 물질의 표면 지형을 결정하는 것을 의미한다. 도 1d-f는 인산 칼슘의 바늘형 표면 지형, 즉 결정들이 필수적으로 바늘들로 구성된 예를 보여준다. 꽃잎형 또는 잎새형 구조들은 바늘형이라는 용어에 포함되지 않는데, 바늘형이라는 용어는 바람직하게는 그 직경 (10-1500 nm)의 1.5, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50 또는 100배 이상의 길이를 갖는 실린더형 또는 다각형 프리즘 구조로만 한정되기 때문이다.
"불규칙한 형태를 갖는 입자들 (particles having irregular shapes)"이라는 용어는 인산 칼슘 분말 (또한 그 자체로도 입자 구조를 가질 수 있음)의 입자들이 구형이 아니라는 것을 의미한다.
"BCP"라는 용어는, β-TCP와 인회석, 바람직하게는 수산화인회석 (Ca/P 비율 1.5 - 1.67)의 복합체를 의미한다. 달리 말하면, "BCP"라는 용어는 β-TCP와 인회석, 바람직하게는 수산화인회석의 복합체를 의미하며, 이는 상기 인산 칼슘의 중량을 기초로 1-99 중량%의 인회석, 바람직하게는 수산화인회석, 및 99-1 중량%의 β-TCP를 포함한다. 따라서, "BCP"라는 용어는, 인회석, 바람직하게는 수산화인회석과, β-TCP가 전술한 중량% 범위 이내에서 이룰 수 있는 가능한 모든 조합들을 포함한다.
"인회석 (apatite)"이라는 용어는 반복 화학양론적 화학식 Ca5(PO4)3(OH)로 표시되는 일군의 인산 칼슘 광물을 의미하며, 또한 OH 기가 예를 들어 F-, Cl-, CO3 2-, HCO3 -, 또는 임의의 다른 음이온에 의해서 부분적으로 치환 및/또는 PO4 기가 예를 들어 HPO4 2-, CO3 2-, HCO3 -, 또는 임의의 다른 음이온에 의해서 부분적으로 치환, 및/또는 Ca2+가 예를 들어 Mg2 +, Sr2 +, Ba2 +, Na+ , 또는 임의의 다른 양이온에 의해서 부분적으로 치환되어 생성된 비화학양론적 및/또는 결손된 인회석을 의미한다 (Elliot, J.C., 1994. Structure and Chemistry of the Apatites and other Calcium Orthophosphates, Amsterdam: Elsevier). 이러한 부분적 치환들로 인해서 Ca/P 비율에 변화가 야기된다.
"비표면적 (specific surface area)"이라는 용어는 BET 분석에 의해서 결정된 CaP 입자들의 표면적을 의미한다. Brunauer, Emmett 및 Teller (BET) 방법 (J. Am. Chem. Soc., 1938, 60, 309)에 의해서, 분말의 표면적은 기체 압력과 관련되어 흡착된 기체의 양으로 계산되며, 이는 보통의 대기압 하에서 액체 기체의 비등 온도에서 측정되고, m2/gram로 표시된다.
"총기공 면적 (total pore area)"이라는 용어는 이식물을 통해서 (즉, CaP 입자들을 통해서) 흐를 수 있는 액체 (예를 들어, 생물학적 유체, 세포들)의 접근가능한 부피를 의미한다. 이러한 총 이용가능한 기공 면적은 수은 침투에 의해서 측정되는 바, 이는 실린더형 기공 모델을 사용하여 측정되고 ("An Introduction to the Physical Characterization of Materials by Mercury Intrusion Porosimetry with Emphasis on Reduction and Presentation of Experimental Data," Paul A. Webb, pp 1-22, Micromeritics Instrument Corporation, Norcross, GA, January 2001에 서술되어 있음), m2/gram로 표시된다.
"단백질 흡착 (protein adsorption)"이라는 용어는 인산 칼슘 1 cc 부피에 의해서 흡착되는 단백질의 양을 의미하는 것으로서, 상기 인산 칼슘을 1% 우태아 혈청 (FBS) 및 25 ppm NaN3, 또는 400 ㎍/ml 우혈청 알부민 (BSA) 및 25 ppm NaN3를 함유하는 수용액 2 ml 중에 침지시키고, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양함으로써, 흡착된 양을 100%에서 용액 중 잔류하는 백분율을 뺀 수치로 표시하고, 단백질 함량은 상기 인산 칼슘과의 접촉 이전 및 이후에, 예를 들어 BCA™ Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정한 양을 의미하는 것이다.
"소결 (sintering)" 및 "소결된 (sintered)"이라는 용어는 CaP를 필수적으로 1000 ℃ 초과, 예를 들어 1000 ℃ 내지 1300 ℃, 바람직하게는 1050 ℃ 내지 1275 ℃의 온도에서 열적 처리하는 과정을 의미한다. 상기 소결 과정에 의해서 인산 칼슘 물질의 조밀화 (densification)가 야기된다. 요구되는 밀도의 증가에 따라서, 상기 소결 과정은 1-10 시간 동안 수행될 수 있다.
"외부층 (outer layer)"이라는 용어는, 인회석 바늘들을 포함하는 골형성 유도 코팅층을 의미하며, 상기 인회석 바늘들은 데포지션 (deposition) 또는 부착 표면으로서 중심 물질 베이스 상에 부착 또는 데포지션되고, 선택적으로 상기 중심 물질 베이스와 상기 외부층 사이에 내부층 (inner layer)이 위치하고, 상기 중심 물질 베이스로부터 반대되는 상기 외부층의 일부가 인체 또는 동물체에 이식되는 경우에 조직에 노출된다. 본 발명의 일구현예에서는 상기 외부층이 상기 중심 물질 베이스 상에 존재하는 유일한 층이며, 따라서 본 발명의 골형성 유도 코팅을 이루는 유일한 물질이다. 골형성 유도 코팅이 상기 외부층과 접촉하는 내부층을 포함하는 것도 가능하다.
"내부층 (inner layer)"이라는 용어는, BCP를 포함하는, 또는 바람직하게는 BCP로 이루어진 골형성 유도 코팅층을 의미하며, 상기 내부층은 외부층과 접촉하고 있다. 상기 내부층은 상기 외부층과 비교할 때에 더욱 상기 세라믹의 중심을 향해서 위치한다. 일부 경우에는, 상기 내부층이 과립 단편화 또는 수열 처리 도중의 물리적 방해 (예를 들어, 유리 접시와 접하고 있는 과립들 중 일부가 인회석 바늘 형성으로 이어지지 않는 것)의 결과로 환경에 노출될 수도 있다.
인산 칼슘 물질의 전처리
본 발명의 태양들에서 유용하고, 본 발명의 방법에 의해서 골형성 유도 능력이 증가하기에 적합한 출발 물질은 필수적으로 인산 칼슘 입자들로 구성된 표면 지형을 갖는 소결된 인산 칼슘이라는 특징을 갖는다. 따라서, 인산 칼슘 기질 자체의 구조는 현미경 관찰 결과, 평탄하지는 않고 입자성 (grainy)을 나타내며, 구조 물질이 패킹된 입자들 (packed grains)의 형태로 구조적으로 조직된 상태이다.
출발 물질은 바람직하게는 거대기공을 포함한다. 상기 출발 물질은 바람직하게는 필수적으로 개방된, 다공성 구조를 가지며, 여기에서 각각의 기공들은 개구 또는 공동에 의해서 상호 연결되어 있다. 본 발명의 물질 또는 코팅은 바람직하게는, 수열처리 이전 및 이후 모두에 다공성이다. 수열처리 이전에 세척 (예를 들어, 음파처리)을 수행하는 것이 바람직하다. 상기 출발 소결된 인산 칼슘 물질은 바람직하게는 다공성이다. 상기 출발 소결된 다공성 인산 칼슘 물질은 일부 구현예들에서 거대기공을 포함할 수 있지만, 바람직한 구현예들에서는 미세기공들 (5 ㎛ 미만의 기공들)을 포함하지 않는다.
상기 인회석은 바람직하게는 수산화인회석, 플루오로-인회석, 클로로-인회석, 탄산화 인회석 또는 칼슘이 결여된 인회석이다. 상기 인회석은 수산화인회석, 플루오로-인회석, 클로로-인회석, 탄산화 인회석, 칼슘이 결여된 인회석 및 비-화학양론적 (non-stoichiometric) 인회석으로부터 선택된 적어도 두 가지 인회석들의 조합일 수도 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 인회석은 필수적으로 수산화인회석이다. 이는, 상기 인회석이, 예를 들어 X-선 회절에 의해서 측정하였을 때, 상기 인회석의 총중량을 기준으로, 적어도 50 중량%의 수산화인회석, 더욱 바람직하게는 70-90 중량%의 수산화인회석, 가장 바람직하게는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 중량%의 인회석으로 구성된다는 것을 의미한다.
통상의 기술자라면, 예를 들어 칼슘 및 수산화 이온들의 함량이 낮거나, 또는 심지어 결여되고, 치환 불순물들이 풍부하여 불완전한 인회석일 수도 있다는 사실을 인지할 것이다. 이러한 관점에서, "수산화인회석"이라는 용어가 사용되는 경우에는, 이는 필수적으로 수산화인회석이지만, 불순물이 포함될 수 있다는 것을 의미한다. 그러한 불순물의 예로는, 수산화인회석 중의 하나 또는 그 이상의 플루오로 및/또는 클로로기들의 존재를 들 수 있다. 따라서, 본 발명에서 "수산화인회석"이라는 용어는 필수적으로 수산화인회석인 것을 포함하지만, 또한, 하나 또는 그 이상의 플루오로-인회석, 클로로-인회석, 탄산화 인회석, 비-화학양론적 인회석 및/또는 칼슘-결여 인회석을 포함한다.
본 발명에서 출발 물질은, 바람직하게는 60 중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 70 중량%, 더더욱 바람직하게는 적어도 80 중량%의 β-TCP를 포함하는 인산 칼슘이다. 상기 인산 칼슘 출발 물질은 바람직하게는, 상기 인산 칼슘의 중량을 기준으로, 약 4-20 중량%의 인회석, 바람직하게는 수산화인회석을 포함한다. 출발 물질로서 유용한 BCP는 적당하게는 저온 수용액으로부터 침전에 의해서 제조되거나 또는 고온 (열적) 공정에 의해서 제조된 BCP일 수 있다.
CaP 출발 물질을 제조하는 방법은, 물 중의 인산 칼슘 분말, 발포제 및 선택적으로 기공 형성제 (porogenic agent)의 수성 슬러리를 제공하는 단계; 상기 슬러리에 상기 슬러리의 발포를 야기하는 조건을 가해주는 단계; 결과물인 발포된 슬러리를 건조하고, 선택적으로 상기 기공 형성제를 제거하는 단계, 및 상기 건조 및 발포된 슬러리를 소결하여 선택적으로 다공성인 소결된 인산 칼슘 세라믹을 제조하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 선택적으로 상기 소결된 인산 칼슘 세라믹을 입자들로 밀링 (milling)하고, 원하는 입자 크기를 갖는 상기 입자들을 수득하는 단계를 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 방법에서 사용되기 위한 상기 CaP 출발 물질 소결된 물질인 바, 이는 이러한 물질들에 바람직하게는 1000 ℃ 이상의 온도를 가해준다는 것을 의미한다.
적당한 CaP 출발 물질들은, 예를 들어, 질산 칼슘 테트라-수화물 및 디 암모늄 하이드로겐 포스페이트의 수성 혼합물을 상승된 pH에서 숙성시킨 다음, 결과 침전물을 분말화하고, 과산화수소와 같은 기포 생성제의 존재 하에서 기공을 생성하고, 결과물인 녹색체를 소결함으로써 제조할 수 있다. 그러한 방법들은, 예를 들어, US 6,511,510에 서술되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 인산 칼슘은 미소결된 인산 칼슘 (녹색체)을 800 ℃ 내지 1300 ℃, 바람직하게는 1000 ℃ 내지 1275 ℃, 더욱 바람직하게는 1050 ℃ 내지 1200 ℃의 온도에서, 선택적으로 가압 하에서, 소결하는 과정에 의해서 제조될 수 있다. 바람직하게는, 상기 소결은 1075 ℃ 내지 1175 ℃, 1100 ℃ 내지 1150 ℃의 온도에서 수행될 수 있다. 상기 소결 단계의 지속시간은 수열처리 이후에 최적의 바늘형 구조 지형을 야기할 수 있도록 적절하게 선택 및 최적화될 수 있는 바, 바람직하게는 예를 들어 4 내지 10 시간, 더욱 바람직하게는 6 내지 9 시간 동안 수행될 수 있다.
상기 CaP 출발 물질의 특성은 온도, 압력 및 인산 칼슘 출발 물질의 특정 조합을 선택함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, 순수한 HA는 1.67의 Ca/P 비율을 갖는 인회석을 사용함으로써 제조될 수 있는 반면에, TCP는 1.5의 Ca/P 비율을 갖는 인회석을 사용함으로써 제조될 수 있다. 그러나, 본 발명은 1.51 내지 1.66 (경계 수치 포함)의 Ca/P 비율을 가짐으로써, 조합된 인회석-TCP, 바람직하게는 수산화인회석-TCP를 제조하는 것에 관한 것으로서, 이는 BCP로 명명된 세라믹이며, 소결됨으로써, 예를 들어, 다른 함량의 인회석, 바람직하게는 수산화인회석 및 TCP를 함유하는 소결된 CaP 세라믹이 될 수 있다.
상기 소결 패러미터는 상기 출발 물질의 거대기공성을 조절하기 위해서 선택될 수 있다. 상기 세라믹의 거대기공성은, 그 제조를 위한 방법의 일부 구현예들에서, 상기 소결된 입자들 사이의 간격들로 인해서 결정될 수 있으며, 이러한 간격은, 상기 CaP의 결정화 또는 사용되는 기공 발생제에 의해서 영향을 받을 수 있다. 상기 소결 패러미터들은 또한 상기 출발 물질의 입자 크기를 조절하도록 선택될 수 있다. 그 제조를 위한 방법의 일부 구현예들에서, 상기 세라믹의 입자 크기는 소결로 인한 녹색체의 상전이로 인해서 결정될 수 있으며, 이는 다시 소결 시간 및 소결 온도에 의해서 영향을 받을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 CaP 출발 물질은 상호연결된 결정들 또는 입자들로 이루어진 것일 수 있다. 상기 입자들의 크기는, 바람직한 일 구현예에서, 바람직하게는 50 내지 3000 nm, 또는 0.05 내지 3 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 2 ㎛, 더더욱 바람직하게는 0.1 내지 1.5 ㎛, 심지어 더더욱 바람직하게는 0.5 내지 2.5 ㎛일 수 있다. 상기 출발 물질은 바람직하게는 BCP이다. 상기 BCP 출발 물질은 바람직하게는, 50 내지 약 5500 ㎛, 바람직하게는 500-1500 ㎛, 또는 1000-4000 ㎛ 범위의 과립 또는 입자 크기를 갖는 분말의 형태일 수 있다.
수열처리 과정
요약하면, 향상된 골형성 유도 성능을 가지며, 바늘형 표면 지형에 기초한 소결된 인산 칼슘 세라믹을 제조하기 위한 방법은 하기와 같이 수행될 수 있다:
소결된 인산 칼슘에 대한 매우 바람직한 구현예에서, 첫 번째 단계는 출발 물질로서, 소결된 인산 칼슘 세라믹을 제공하는 단계이다. 그러한 바람직한 구현예에서, 인산 칼슘 분말, 발포제, 및 기공 생성제의 수성 슬러리는 용매 중에 제공될 수 있다. 이어서, 상기 슬러리에 상기 슬러리의 발포를 야기하는 조건을 가해줄 수 있다. 다음으로, 결과물인 발포된 슬러리를 선-건조하고, 상기 기포 생성제를 선-소결에 의해서 제거할 수 있다. 이어서, 상기 선-건조 및 발포된 녹색체를 소결함으로써 소결된 인산 칼슘 세라믹을 제조할 수 있으며, 선택적으로는, 상기 녹색체를 밀링 또는 더 작은 입자들로 분쇄한 이후에 소결을 진행할 수도 있다. 최종적으로, 상기 소결된 인산 칼슘 세라믹 출발 물질 (선택적으로 밀링 또는 더 작은 입자들로 분쇄될 수도 있음)에 수열처리를 수행함으로써 상기 세라믹의 표면 상에 CaP 바늘들을 형성할 수 있고, 이에 의해서 바늘형 표면을 갖는 소결된 인산 칼슘 세라믹을 제조할 수 있다. 전술한 바와 같이, 만약 밀링되지 않은 녹색체에 소결 및 수열처리를 수행하게 되면, 상기 방법은 상기 인산 칼슘 세라믹을 밀링함으로써 과립들을 제조한 다음 상기 과립들을 수집하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이러한 수집은 선택적으로는 다양한 과립 크기를 갖는 분획들로 수집될 수도 있다. 상기 수열처리는 필수적으로 상기 소결된 인산 칼슘의 표면을 처리하는 것이므로, 만약 향상된 골형성 유도성을 갖는 입자들을 제조하고자 하는 경우에는, 상기 입자들의 표면을 변형시키기 위해서, 원하는 입자 크기를 갖는 입자들을 상기 수열처리 과정 이전에 제공함으로써 본 발명의 입자들을 제공하는 것이 바람직하다.
따라서, 녹색체의 제조는 적당하게는 인산 칼슘 (CaP)의 슬러리를 제조하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 CaP는 바람직하게는, 발포제를 함유하는 용액 중에 분산된 분말의 형태이다. 상기 발포제 용액 중 상기 발포제 (예를 들어, H2O2)의 농도는 적절하게는 0.1% 내지 10.0%일 수 있으며, 상기 용매는 적절하게는 물이다. 발포제 용액 (예를 들어, H2O2, 0.1-10.0% 수용액) 및 인산 칼슘이 혼합되어 상기 슬러리를 형성하는 경우의 비율은, 적절하게는 CaP 100 g 당 1 내지 300 mL의 발포제 용액일 수 있다. 기포 생성제 (예를 들어, 나프탈렌 또는 왁스 과립들, <2000 ㎛)의 함량은 적절하게는 CaP 100 g 당 0-150 g이다. 상기 기포 생성제는 용매 중에 현탁될 수 있다. 상기 용매 및 인산 칼슘의 혼합 비율은 적절하게는 CaP 100 g 당 0 내지 100 mL의 용매이거나, 또는 물 중의 상기 용매의 함량 비율은 적절하게는 부피 기준으로 0 내지 50%이다. 이어서, 상기 슬러리는 발포되고, 예를 들어 50-120 ℃의 온도에서 건조될 수 있으며, 다음으로, 예를 들어 800-1100 ℃에서, 1-6 시간 동안 선-소결됨으로써 녹색체를 형성할 수 있고, 이러한 녹색체는, 예를 들어 1000-1300 ℃에서 3-12 시간 동안 소결된다. 이러한 세라믹의 조성은: HA 4-18% 및 beta-TCP: 96-82%이다. 상기 소결된 인산 칼슘 세라믹은, 다음으로 물 중, 135 ℃에서, 99분 및 2-4 bar 조건으로 수열처리되며, 40-100 ℃에서 건조되고, 밀링되어 과립들을 형성한 다음, 다양한 크기들을 갖도록 수집 (및 제공)될 수 있다.
전술한 바와 같이 정의된 상기 CaP 출발 물질에 대해서는 수열처리가 가해짐으로써, CaP 표면 지형의 변화가 야기된다.
상기 방법은 상기 인산 칼슘 물질에 대해서, 125 ℃ 이상, 바람직하게는 125-300 ℃, 더욱 바람직하게는 125-200 ℃, 가장 바람직하게는 125-150 ℃의 온도에서, 상기 물질의 표면 상에 존재하는 인산 칼슘 입자들을 인산 칼슘 바늘들로 변화시키기에 충분한 시간 동안 수열처리를 가해주는 단계를 포함한다. 특히 바람직하게는, 상기 수열처리의 온도를 130-140 ℃, 더욱 바람직하게는 135 (+/- 2) ℃로 해주는 것이 좋다.
상기 수열처리는 상기 인산 칼슘 출발 물질을 물에 접촉, 바람직하게는 물 중에 담그어 주는 과정을 포함하며, 상기 인산 칼슘이 물과 접촉하고 있는 동안, 상기 인산 칼슘 세라믹 출발 물질에 대해서 125-150 ℃, 바람직하게는 130-140 ℃, 더욱 바람직하게는 135 (+/- 2) ℃로, 바람직하게는 2-4 bar에서 적어도 30분 동안, 또는 다른 압력들에서 균등한 시간 동안 처리해 주는 과정을 포함한다. 바람직하게는, 가열되지 않은 물 중에 담그어 주는 과정은 본 발명에서 정의한 수열처리를 구성하는 것은 아니다. 또한, 인산 칼슘을 증기와 접촉시키는 것도, 바람직하게는 본 발명에서 정의한 수열처리를 구성하는 것은 아니다. 수열처리는, 바람직하게는, 상기 인산 칼슘이 물과 접촉, 바람직하게는 물에 담그어 진 동안, 상기 인산 칼슘을 오토클레이빙 (autoclaving)하는 과정을 포함한다. 바람직하게는, 상기 수열처리의 지속시간은, 2-4 bar에서, 적어도 40, 50, 60, 75, 100, 200, 300, 또는 400분이거나, 또는 그 이상이거나, 다른 압력들에서 균등한 시간이다. 더욱 바람직하게는, 상기 처리는 상기 물질을, 2-4 bar에서 약 100분 동안, 전술한 온도로 처리하는 것을 포함한다.
전술한 수열처리 이후에, 상기 출발 CaP 물질의 입자성 표면 특성은 바늘형 표면 특성으로 변화되며, 이는 상기 입자의 표면 전체를 덮는 견인된 나노-바늘들 (tethered nano-needles)로 구성된다. 이러한 나노-바늘들의 직경은 10-1500 nm의 범위 내에서 변화될 수 있다. 더 작은 입자 크기의 CaP들로부터는 약 10 내지 600 nm의 더 작은 직경을 갖는 나노-바늘들이 제조되는 반면, 더 큰 입자 크기의 CaP들로부터는 약 400 내지 1500 nm의 더 큰 크기의 바늘이 제조된다. 바람직하게는, 상기 바늘 직경은 800 nm 미만, 더욱 바람직하게는 100 내지 750 nm, 가장 바람직하게는 200 내지 700 nm이다. 본 발명에서 T1125a로 명명된 물질의 경우, 600-680 nm의 평균 바늘 직경이 통상적으로 관찰된다.
도 2 및 표 3으로부터, 상기 입자 크기는 소결 온도에 의존한다는 것을 알 수 있다. 또한, 도 2 및 표 3은, 상기 수열처리의 패러미터들이 일정한 경우, 소결 온도가 더 높은 경우에는 더 큰 바늘 직경이 관찰된다는 것을 보여준다. 상기 수열처리의 세팅을 조절하는 경우, T1150 세라믹을 (하기 표 3 참조) 더 높은 온도에서 더 긴 시간 동안 수열처리하게 되면, T1125a 세라믹 (하기 표 3 참조)의 크기 정도로 바늘 크기 직경을 얻는 것이 가능하다는 사실도 알 수 있었다. 달리 말하면, 소결된 출발 물질의 입자 크기가 그 자체만으로, 수열처리 이후에 본 발명의 골형성 유도성 물질 또는 코팅이 얻어지는가에 대한 문제를 결정하는 것은 아니다. 본 발명에서는, 본 발명의 물질 및 코팅을 출발 물질로 하여, 이를 1125 ℃ 이상의 온도에서 소결한 다음, 전술한 바와 같은 바람직한 바늘 크기 직경을 갖는 본 발명의 물질 또는 코팅을 얻기에 충분한 시간 및 온도로 수열처리를 가해주게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예들에서, 상기 출발 물질은 상기 수열처리 동안 수용액 (바람직하게는 물) 중에 완전히 담그어지게 된다. 다른 한편으로, 본 발명의 방법은 약 100%의 상대 습도 수준 하에서 수행될 수 있다.
바람직하게는, 상기 수열처리는 상기 인산 칼슘 세라믹 물질을 130-140 ℃, 더욱 바람직하게는 135 (+/- 2) ℃ 근방에서 처리하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 수열처리는 상기 인산 칼슘 세라믹 물질을 적어도 10 분 동안, 바람직하게는 적어도 40, 50, 60, 75, 100, 200, 300, 또는 400 분 또는 그 이상의 시간 동안 상승된 온도로 처리하는 것을 포함한다. 상기 수열처리의 지속시간은 필수적으로 상기 물질 표면 상의 인산 칼슘 입자들을 인산 칼슘 바늘들로 변화시키기에 충분한 시간이다. 이러한 변화는 SEM에 의해서 결정될 수 있다.
바람직하게는, 상기 수열처리는 상기 인산 칼슘 세라믹 물질을 물에 담근 상태에서 상승된 온도로 처리하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 수열처리는, 상기 물질이 바람직하게는 2-4 bar인 상태에서, 상기 인산 칼슘 세라믹 물질을 정해진 시간 동안 상승된 온도로 처리하는 것을 포함한다. 다른 압력들이 사용될 수도 있지만, 상기 인산 칼슘 세라믹의 표면 변형을 최적화하기 위해서 지속시간을 조절할 수 있다. 바람직하게는, 상기 수열처리 시간 동안, 상기 물질의 압력은 2-4 bar일 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 수열처리는 상기 물질을 2-4 bar에서 약 100분 동안 전술한 온도로 처리하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 표면 지형을 변화시킴으로써, 인산 칼슘 표면의 골형성 유도 능력을 변화시키는 것에 관한 것이다. 바람직한 구현예들에서, 상기 "표면"이라는 용어는 상기 CaP 물질의 외부로부터 측정하였을 때, 상단 0-1.0 mm를 의미한다.
향상된 골형성 유도성을 갖는 인산 칼슘 물질
전술한 수열처리 이후에, 상기 출발 물질의 입자성 표면 특성은 바늘형 표면 특성으로 변화하며, 이는 상기 과립들의 표면을 덮는 견인된 나노-바늘들 (tethered nano-needles)로 구성된다. 이러한 나노-바늘들의 직경은 10-1500 nm의 범위 내에서 변화될 수 있다. 더 작은 입자 크기의 CaP들로부터는 약 50 내지 400 nm의 더 작은 직경들이 얻어지는 반면, 더 큰 입자 크기의 CaP들로부터는 약 350 내지 1100 nm의 더 큰 바늘 크기들이 얻어진다.
본 발명의 방법에 의해서 제조된 인산 칼슘 물질에서, 상기 물질의 표면은 현저하게 변화하는 반면, 기저 (더 깊은) 물질은 필수적으로 변화하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 향상된 인산 칼슘 세라믹 물질에서, 상기 물질 내의 80%의 입자들이 변화하지 않을 수 있지만, 이는 주로 표면 아래 입자들 (> 표면으로부터 1.0 mm-1 cm보다 더 깊음)로 인한 것이다.
본 발명의 향상된 인산 칼슘 세라믹은 바람직하게는, 0.01-1.50 ㎛, 더욱 바람직하게는 50-1250 nm의 직경을 갖는 바늘형 결정들로 이루어진 표면 지형을 갖는다.
본 발명의 인산 칼슘 물질들 및 코팅들은, 바람직하게는 0.45/㎛2 보다 더 낮은 바늘 밀도, 더욱 바람직하게는 0.10/㎛2 내지 0.40/㎛2, 더더욱 바람직하게는 0.25/㎛2 내지 0.39/㎛2, 또한 이보다 더 바람직하게는 0.28/㎛2, 0.29/㎛2, 0.30/㎛2, 0.31/㎛2, 0.32/㎛2, 0.33/㎛2, 0.34/㎛2, 0,35/㎛2, 0.36/㎛2, 0.37/㎛2 또는 0.38/㎛2의 바늘 밀도를 갖는다.
본 발명의 물질의 비표면적 및 총기공 영역은 수열처리 이전의 소결된 인산 칼슘의 대응되는 수치들에 비해서 현저하게 높다. 일반적으로, 바늘 형성으로 인한 비표면적 및 총기공 영역의 증가는, 각각 BET 분석 또는 수은 침투에 의해서 분석하였을 경우, 50, 80, 또는 심지어 100%, 즉 초기 비표면적 및 총기공 영역에 있어서 두 배 증가가 관찰될 수 있다.
본 발명의 물질의 총기공 영역은, Hg 침투에 의해서 측정하였을 때, 통상적으로 1.8 m2/g 이상이다.
본 발명의 물질의 비표면적은, BET에 의해서 측정하였을 때, 통상적으로 1.25 m2/g 이상, 또는 심지어 1.4 m2/g 이상이다.
바람직한 결정들의 바늘 직경, 거대기공의 크기, 비표면적 및 총기공 영역에 의해서 상기 세라믹 상으로 높은 농도의 단백질 흡착이 이루어지며, 높은 골 형성 능력 (비골성 부위에서 골 형성 유도)이 달성된다.
본 발명의 향상된 소결된 인산 칼슘은, 전술한 바와 같이 측정한 경우, 24 시간 이내에, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 더더욱 바람직하게는 75% (40-80%) 이상의 표면 단백질 흡착도를 나타낸다. 특히, 본 발명의 향상된 소결된 인산 칼슘은, 400 ㎍ BSA/ml의 BSA 용액 2 ml로부터 1 ml의 인산 칼슘 물질의 표면에, 바람직하게는 250 ㎍, 바람직하게는 300 ㎍, 더더욱 바람직하게는 500 ㎍, 더더욱 바람직하게는 1000 ㎍, 더더욱 바람직하게는 1500 ㎍ 또는 그 이상의 BSA가 흡착된다.
본 발명의 태양들에서, 상기 향상된 골형성 유도능력을 갖는 인산 칼슘은 인산 칼슘 코팅, 즉 골형성 유도성 인산 칼슘 코팅의 형태를 가질 수 있다. 상기 코팅은 본 발명에서 서술된 방법에 의해서 제조될 수 있으며, 외부층을 포함하고, 내부층을 포함할 수도 있다. 상기 코팅은 수 마이크로미터 내지 수 밀리미터 또는 심지어 센티미터의 두께를 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 코팅의 상기 외부층의 두께는 1 내지 1000 ㎛, 바람직하게는 1 내지 500 ㎛, 더욱 바람직하게는 1 내지 200 ㎛, 가장 바람직하게는 1 내지 100 ㎛이다. 상기 외부층의 두께는 통상의 기술자에 알려진 방법에 의해서 측정될 수 있으며, 본 발명의 물질의 단면을 제공한 이후에 상기 외부층을 측정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 물질 중에 인회석 바늘들을 포함하는 층의 두께는, 따라서 바람직하게는 1 내지 1000 ㎛, 바람직하게는 1 내지 500 ㎛, 더욱 바람직하게는 1 내지 200 ㎛, 가장 바람직하게는 1 내지 100 ㎛이다. 상기 인산 칼슘 코팅은 그 골형성 유도 능력의 향상을 필요로 하는 다른 물질들 (예를 들어, 비-골형성 유도성)의 표면 상에서 개선된 표면으로서 사용될 수 있는 바, 이러한 물질들에는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다른 인산 칼슘, 금속, 세라믹, 유리, 폴리머 또는 복합체 물질들이 포함된다. 향상된 골형성 유도성 코팅은, 골형성 유도성을 개선하고자 하는 물질의 표면을 전술한 바와 같이 인산 칼슘 출발 물질로 코팅한 다음, 상기 코팅된 물질에, 전술한 바와 같은 향상된 골형성 유도 능력을 위한 방법을 적용함으로써 제조될 수 있다. 결과물인 코팅된 산물은 개선된 골형성 유도 특성을 갖는다. 다른 한편으로, 본 발명에 따라서 향상된 바늘형 표면 지형을 갖는 상기 개선된 골형성 유도성 인산 칼슘은, 예를 들어 글루잉 (gluing), 몰딩 또는 프레싱에 의해서, 적절하게는 골형성 유도성을 개선시키고자 하는 물질, 즉 코어-물질 베이스의 표면에 부착 또는 결합될 수도 있다. 본 발명의 코팅의 외부층은, 적절하게는 본 발명의 코팅의 내부층의 침전일 수 있는 바, 상기 내부층은 본 발명의 방법을 사용하여 수열처리될 수 있다. 다른 한편으로, 상기 본 발명에 따라서 개선된 바늘형 표면 지형을 갖는 상기 향상된 골형성 유도성 인산 칼슘은, 적절하게는 "분말" 형태로 단독으로, 또는 페이스트 또는 세멘트의 형태로 액체 캐리어와 조합되어, 주사가능한 형태로 제공될 수 있으며, 골형성 유도성을 개선시키고자 하는 물지르이 표면에 적용될 수도 있다.
본 발명의 향상된 인산 칼슘 세라믹은 바람직하게는 불규칙한 형태들을 갖는 오븐 건조된 밀링된 인산 칼슘 분말들을 사용하는 과정에 의해서 제조된다. 그러한 물질이, 규칙적인 구형 입자들을 갖는 스프레이 건조된 인산 칼슘 분말들을 사용하는 것에 비해서 선호된다. 부가하여, 소결 온도는 바람직하게는 800 내지 1200 ℃이다. 개별적인 인산 칼슘들에서, 소결 온도는 더욱 최적화될 수도 있다.
본 발명의 물질은, 예를 들어 생물 유기체 중 골 조직의 형성을 유도하기 위해서 사용될 수 있다.
본 발명의 물질은, 적절하게는 비골성 부위 (non-osseous site) 중에서 자가조직성 골 (autologous bone)의 생산을 위해서, 이식 물질, 즉 스캐폴드로서 사용될 수도 있다. 이러한 능력은 상기 물질이 고도로 골형성 유도성을 갖기 때문이다.
따라서, 본 발명의 물질은 인산 칼슘으로 이루어진 의료 이식물 또는 의료 장치로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 물질을 다른 물질의 의료 이식물과 함께 조합하여 사용하는 것도 가능한데, 예를 들어 이러한 다른 물질에는 금속 또는 폴리머 물질이 있으며, 상기 물질들 상에 본 발명에 따른 골형성 유도성 물질이 코팅의 형태로 존재한다.
본 발명의 물질에 대한 다양한 용도들에는, 치과 또는 정형외과 수술에 있어서 응용들 뿐만 아니라, 골 치료에 있어서 일반적인 근골격 외과적 응용도 포함된다는 점을 염두에 두어야 할 것이다.
이하, 비제한적인 실시예들을 통해서 본 발명을 설명하기로 한다. 하기 실시예들은 인산 칼슘 세라믹들 (즉, 소결된 인산 칼슘들)의 골 형성 능력을 향상시키기 위한 방법들을 서술하며, 여기에서 상기 인산 칼슘은 BCP이다.
실시예
실시예 1. 바늘 형성에 대한 오토클레이브 세팅의 영향
1.1. 이상 인산 칼슘 세라믹의 제조
Ca(OH)2 and H3PO4를 수용액 중에서 혼합하여 CaP 침전을 야기함으로써 이상 인산 칼슘 (BCP) 분말 (92-96% β-TCP 및 8-4% HA)을 제조하였다. Ca/P 비율을 조절하여 다양한 TCP 및 HA 함량을 갖는 최종 CaP를 제조하였다. 하기 Ca/P 비율들을 얻었다: 1.500 (~100% TCP의 경우), 1.509 (~5% HA/95% TCP의 경우), 1.518 (~10% HA/90% TCP의 경우), 1,534 (~20% HA/80% TCP의 경우) , 1,568 (~40% HA/60% TCP의 경우), 또는 1.636 (~80% HA/20% TCP의 경우). 상기 CaP 침전을 여과하고, CaP 분말로 건조하였다. 상기 CaP 분말을 사용하여, H2O2 (1-2%), 0-500 ㎛ 왁스 입자들 (40-60-g / 100 g 분말) 및 에탄올 (8-10%)을 함유하는 탈염수 중에서 슬러리를 제조하였다. 이어서, 상기 슬러리를 40-80 ℃에서 발포하고, 1000 ℃에서 전소결하였다. 왁스가 완전히 연소되었을 때, 다공성 케이크를 입자들로 분쇄하고 (0-5 mm), 다양한 온도들, 즉 1050 ℃, 1125 ℃ 및 1150 ℃에서 소결함으로써 다양한 표면 지형을 갖지만, 동일한 화학 조성을 갖는 다공성 인산 칼슘 세라믹들을 제조하였다.
1.2. 이상 인산 칼슘 세라믹들의 특성화
X-선 회절기를 사용하여 상기 세라믹들의 HA/TCP 함량 비율에 관한 특성화를 수행하였다 (XRD, Table 1). 상기 결과들은 상기 세라믹들이 소결 온도와는 관계 없이 상당한 HA/TCP 함량 비율을 갖는 이상 인산 칼슘들이라는 점을 보여준다. 주사 전자 현미경 (SEM) 영상들을 통해서, 소결 온도가 표면 구조에 영향을 미친다는 점을 알 수 있었는 바, 더 높은 소결 온도일 수록 다공성은 감소하면서 더 큰 입자 크기가 야기된다는 점을 알 수 있었다 (도 1a-c).
1.3. 세라믹의 수열처리
과립들을 유리 접시 상에 놓았다. 상기 층을 탈염수에 담그어 주었는 바, 상기 물의 수표면이 상기 과립층의 표면보다 적어도 2 cm 위에 위치하도록 하였다. 과립들을 함유하는 접시를 오토클레이브 중에 위치시켰다 (Astell, AVX 040). 표 2에 나타낸 것처럼 두 가지 다른 세팅들을 가하였다. 처리가 종료되었을 때, 상기 물질을 꺼내서 냉각시키고 80 ± 10 ℃에서 건조하였다.
1.4. 수열처리된 세라믹들의 특성화
출발 과립들의 표면 지형을 평가하기 위해서 2차 전자 모드의 주사 전자 현미경 (SEM; JEOL)을 사용하였으며, 각 물질에 대한 ~500 결정들의 크기를 측정하였다. 출발 물질의 입자 크기를 측정하였으며, 중간 값들을 계산하였다. 수열처리 이후에, 새로이 생성된 바늘들의 직경을 측정하였으며, 중간 값들을 계산하였다. 모든 측정들은 SEM 축적을 기준으로 사용하여 ImageJ 중 '길이 측정' 도구로 수행하였다 (v1.43u, NIH, USA). 이러한 상에서, 출발 물질의 세부사항 및 성공적인 표면 변형을 위한 수열처리 세팅을 확립하였다.
SEM 영상들을 통해서, '핫/롱' 세팅의 수열처리만이 전형적인 입자 세라믹 표면의 소멸을 야기하고 바늘형 구조들의 성장을 야기하는 반면에 (도 1d-f), '콜드/쇼트' 세팅은 고려된 세라믹들 중 어느 것에 대해서 바늘 형성을 야기하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 측정들을 통해서, 이러한 바늘형 성분들이 출발 세라믹의 입자 크기가 증가함에 따라서 증가하는 직경을 갖는다는 것을 알 수 있었다 (표 3).
샘플들의 비표면적 (SSA)은, 단일 지점 B.E.T. 표면적의 측정을 위해서, MonosorbTM 분석기 (Quantachrom Instruments, USA)를 사용하여 흡착 및 탈착이 진행됨에 따른 N2/He (30/70) 기체의 농도 변화에 의해서 측정하였다. 1.0000 ± 0.0001 그램 중량의 건조 샘플을 4.8 cm3 셀 부피에 위치시켰다. N2/He (30/70) 기체를 140 kPa의 압력으로 가하고, ~ 30 분 동안 탈착시켰다. 이러한 과정을 3배 반복하였다.
샘플의 총기공 면적은 Micromeritics 수은 다공도계 (AutoPore)를 사용하여 수은 침투에 의해서 측정하였다. 0.4 - 0.7 그램 중량의 샘플을 3 cm3 전구 부피 침입도계 내에 1.1 - 1.2 ml의 스템 부피 (stem volume)로 위치시킴으로써 대략 50-90% 스템 부피 사용을 달성하였다. 채워진 침입도계를 수은 침투를 위해서 장치 내로 삽입하였다 (Hg 접촉각 130.000 도, Hg 밀도 13.5310 g/mL). 배출은 50 ㎛ Hg를 사용하여 5분 동안 구현한 다음, 0.22 psia에서 10초 동안 평형화된 수은 충전을 수행하였다.
BET 및 수은 침투 측정에 의해서, 고려된 세라믹들 중 어떤 것에서도 각각 비표면적 및 총기공 면적이 증가하였다는 사실을 알 수 있었다 (표 3).
과립들 상의 단백질 흡착은 두 가지 용액에 대해서 수행하였다:
- 1% 부피의 우태아 혈청 (FBS) 및 25 ppm NaN 3 를 함유하는 수성 용액.
- 400 ㎍/mL의 우혈청 알부민 (BSA) 및 25 ppm NaN 3 를 함유하는 수성 용액.
과립들 상의 바늘 밀도는 x5000 SEM 영상들 상에서 관찰되는 바늘들의 개수를 계수함으로써 측정하였다 (윈도우 크기 424,6528 ㎛2). 밀도는 ㎛2 당 계산하였다.
세라믹의 살균 과립들 (0.2 cc)을 2 mL의 단백질 용액들 (5 개)에 넣었다. 이들을 37 ± 0.5 ℃ 및 5% CO 2 로 일주일 동안 배양하였다. 흡착된 단백질들 (즉, 혈청 단백질 및 알부민)을 12 시간, 1 일, 4 일 및 7 일 경과 후에 마이크로 BCA 분석 키트 및 595 nm의 흡광 필터를 구비한 스펙트로포토미터를 사용하여 측정하였다. 샘플들에 의해서 흡착된 단백질 (FBS에 대해서 cc 당 ㎍으로 표시, BSA에 대해서 cc 당 ㎍으로 표시)을 FBS 및 BSA에 대한 내부 보정 단백질 곡선을 통해서 계산하였다. 분석들은 처리 이전 및 이후의 물질들에 대해서 수행하였다.
도 2는, 출발 물질의 종류에 관계 없이 (즉, TCP1050 또는 TCP1125), 수열 처리에 의해서 단백질 흡착 능력이 현저하게 증가하였음을 보여주며, 이는 표면적의 증가에 기인한 것이다.
1.5. 결론
본 발명에서 테스트된 BCP 세라믹의 수열처리 (예를 들어, 135 ℃, 99 분, 2-4 bar)에 의해서, 상기 세라믹 상에 바늘형 표면들이 생성되었으며, 이는 소결 온도와 관련이 없었는 바, 바늘 직경은 테스트된 세라믹의 입자 크기에 따라서 증가하였다. 바늘들의 생성에 의해서 비표면적, 총기공 면적 및 이어서 총 단백질 흡착이 증가하였다.
T1050 T1125 T1150
HA [ % ]
TCP [ % ] 		8
92		 6
94		 9
93
실시예 1에서 제조된 세라믹들의 HA/TCP 함량 비율
세팅 '콜드/쇼트' '핫/롱'
T [℃] 121 135
시간 [분] 30 99
압력 [bar] 2-4 2-4
수열처리 세팅 (Astell autoclave, AVX 040)
T1050 T1125 T1150 T1050a T1125a T1150a
평균 입자 크기

중간 값 범위 		0.73±0.21
0.60-0.67		 1.85±0.45
1.53-1.60		 2.29±0.69

2.20-2.27		 n/a n/a n/a
평균 바늘 직경 [ nm]
중간 직경 범위 [nm] 		n/a n/a n/a 341±171

300-312		 579±198

540-562		 801±201

828-840
바늘 밀도/ ㎛ 2

최소-최대 수치/㎛ 2 		n/a n/a n/a 0.36±0.08
0.26-0.51		 0.32
 0.46±0.07
0.39-0.62
BET에 의한 비표면적 [m 2 /g] 1.2 0.6
0.5		 0.6
0.5		 2.5 1.0
1.4		 0.9
0.7
Hg 침투에 의한 총기공 면적 [m 2 /g] 1.8
1.5		 1.3 NM2 4.4 2.7 NM2
수열처리 이전 및 이후의 물질의 표면 특성1
1두 가지 수치는 두 개의 개별적인 측정들을 의미함;
2NM: 측정되지 않음 (not measured)
실시예 2. 결정 형성에 대한 HA/TCP 비율의 영향
2.1. 이상 인산 칼슘 세라믹의 제조
상기 실시예 1.1에서 서술된 과정에 따라서 세라믹들을 제조하기 위해서, 다양한 HA/TCP 함량 비율을 갖는 BCP 분말들을 사용하였다. XRD 결과, 그 제조에 사용되는 출발 분말과 비교할 때, 최종 세라믹들의 HA/TCP 함량 비율이 변화하지 않았음을 알 수 있었다.
2.2. 수열처리
상기 실시예 1.3에 서술된 프로토콜에 따라서, '핫/롱' 세팅으로 모든 세라믹들을 수열처리하였다.
2.3 수열처리된 세라믹들의 특성화
SEM 분석 결과, 출발 인산 칼슘 세라믹의 HA/TCP 함량 비율이 바늘들의 성장을 결정하는데 중요한 역할을 한다는 사실을 알 수 있었다 (표 4). 바늘 크기 및 형태는 실시예 1에서 관찰된 것들에 필적하였다. 따라서, 성공적인 바늘 생성을 위해서는 좁은 범위의 HA 함량을 필요로 한다. 바늘-생성은 단지 BCP 세라믹들의 표면 상에서만 발생된다는 일반적인 결론은, 수열처리 이후에 100 중량% β-TCP를 갖는 인산 칼슘 세라믹의 표면 상에서는 바늘-생성이 발생하지 않는다는 관찰로부터 입증되었다. 또한, 수열처리 이후에 100 중량% HA 세라믹들 상에서도 바늘 생성이 관찰되지 않았다.
2.4 결론
본 실시예 및 실시예 1의 결과들을 고려하면, 입자-구조화된 이상 인산 칼슘 세라믹들의 수열처리에 의해서, 출발 세라믹의 HA 함량이 5 내지 20%인 경우, 그러한 세라믹들 상에 바늘형 표면들이 생성된다는 것을 알 수 있다.
HA [%]
TCP [%]		 1
99		 2
98		 7
93		 18
82		 35
65		 79
21
바늘 생성 미생성 미생성 생성 생성 미생성 미생성
실시예 2에서 제조된 세라믹들의 HA/TCP 함량 비율 및 수열처리 이후의 결과
실시예 3. 골형성 유도능력
3.1. 실험 셋업
T1050, T1050a 및 T1125a (실시예 1로부터 제조) 과립들 (1-2 mm) 1 cc를, 8마리의 골격적으로 성숙한 잡종견들 (수컷, 1-4세, 10-15 kg)의 척추인접 근육들에 12주 동안 이식하고, 새로운 CaP 세라믹들의 조직 반응 및 골형성 유도 특성을 평가하였다. 바늘이 없는 음대조군 TCP 세라믹을 사용하여 이러한 실험들의 결과들을 입증하였다 (TCP 음대조군).
3.2. 이식 프로토콜
일반적인 마취 (펜토바르비탈 소듐, Organon, 네덜란드; 30 mg kg-1 체중) 및 살균 조건 하에서 외과수술을 수행하였다. 개들의 등을 면도하고, 피부를 요오드로 세척하였다. 길이 방향 절개를 행하고, 척추인접 근육을 블런트 분리 (blunt separation)에 의해서 노출시켰다. 이어서, 메스로 길이 방향 근육 절개를 행하고, 블런트 분리에 의해서 분리된 근육 파우치 (pouches)를 생성하였다. 이어서, 복합체 과립들을 상기 파우치 내에 넣고, 실크 봉합을 사용하여 상처를 층들로 봉합하였다. 수술 이후에, 동물들에 3일 연속으로 페니실린을 근육내 주사함으로써 감염을 예방하였다. 6주 이후에, 모든 동물들에 형광 염료 칼세인 (2 mg kg-1 체중)을 주사하여 칼세인 표지에 의한 골 형성의 개시 시점을 조사하였다.
3.3 수거 및 조직학적 처리
이식 12주 후에, 상기 동물들을 희생시키고, 주변 조직들과 함께 샘플들을 수거한 다음, 4 ℃에서 1 주일 동안 4% 완충 포름알데히드 용액 (pH=7.4) 중에서 고정하였다. 인산 완충 식염수 (PBS, Invitrogen)로 린스한 후에, 샘플들을 주변 연조직들로부터 잘라내고, 일련의 에탄올 용액들 중에서 탈수시킨 다음 (70%, 80%, 90%, 95% 및 100% ×2), 메틸 메타크릴레이트 중에 함침시켰다 (MMA, LTI Nederland, 네덜란드). 다이아몬드 톱 마이크로톰 (Leica SP1600, Leica Microsystems, 독일)을 사용하여, 석회질이 제거되지 않은 (non-decalcified) 조직학적 단면들 (10-20 mm 두께)을 제조하였다. 단면들을 1% 메틸렌 블루 (Sigma-Aldrich) 및 0.3% 염기성 푹신 (fuchsin) (Sigma-Aldrich) 용액들을 사용하여 염색하였다.
3.4. 조직학적 분석
상기 단면들을 광현미경 (Nikon Eclipse E200, 일본)을 사용하여 관찰함으로써, 조직 반응 및 골 형성을 상세하게 분석하였다. 염색된 단면들을 슬라이드 스캐너 (Dimage Scan Elite 5400II, Konica Minolta Photo Imaging Inc, Tokyo, 일본)를 사용하여 스캐닝함으로써, 개략적인 히스토모포메트리컬 (histomorphometrical) 분석 결과를 얻었다. 상기 스캐닝된 영상들에 대해서 Photoshop CS5 소프트웨어 (v12, Adobe Systems Benelux BV)를 사용하여 히스토모포메트리를 수행하였다. 먼저, 전체 샘플들을 관심이 되는 영역으로서 선택하고, 픽셀들의 개수를 ROI로서 판독하였다. 이어서, 물질 및 광물화된 골에 대해서 유사-색상화하고 (pseudo-coloured), 그 픽셀들을 각각 M 및 B로 판독하였다. 외식편 (explants, Bp)의 이용가능한 공간 중 골의 백분율을 하기와 같이 결정하였다.
Bp = 100 × B / (ROI - M)
미염색된 조직학적 단면들은 형광 마이크로스코피 (Nikon Eclipse E600, 일본; camera Nikon FDX-35)에서 관찰함으로써, 칼세인 표지에 의한 골 형성의 개시 시점을 연구하였다. 영상들을 노출 시간 40-80 ms로 얻었다. 골 영역 중 형광 염색의 발생을 기록하고, 샘플들 중 형광 지점들을 계수하였다. 대략 초기 골 생성 확률을 나타내는 정량적 지수 (Cfluor)는 하기와 같이 계산하였다.
Cfluor = Σ (지점들)m / (발생)m
상기 식에서, 'm'은 고려된 물질을 나타내는 바, 즉 m=(T1050, T1050a, T1125a, TCP 음대조군).
3.5. 결과
물질 당 총 8개의 샘플들을 8 마리의 개들에 근육내 이식하였다. 12주 이후에, 물질 당 8개의 샘플들을 그 주변 조직과 함께 회수하였다. 외식편 중 어떠한 것에서도 염증이 관찰되지 않았다. T1050, T1050a , T1125a 및 T1150a 이식물들에서는 골이 생성되었지만, TCP 음대조군에서는 골이 생성되지 않았다 (표 5, 도 3). 12주 시점에서 생성된 골의 양은 T1050, T1050a, T1125a에서 비슷하였으며, T1150에서 현저하게 많았다. T1050, T1050a 및 T1125a에 대한 형광 관찰을 통해서, T1125a가 대부분의 외식편들에서 6주보다 더 빨리 골 형성을 유도할 수 있지만, T1050 및 T1050a는 주로 6주 이후에 골 형성을 유도한다는 사실을 알 수 있었다 (도 4, 표 5). 동시에, 대조군 (즉, T1050)에 비해서 오토클레이브된 군들 (즉, T1050a 및 T1125a)에서 6주 시점에 더욱 많은 골이 생성되었다 (표 5). 특히, T1125a는 T1050a에 비해서 6주 시점에 더 많은 골 생성을 보였다 (표 5). 히스토모포메트리 결과들을 또한 표 5에 요약하였으며, 12주 시점에서는 수열처리된 물질과 대조군 사이에서 어떠한 유의미한 차이점도 관찰되지 않았다.
3.6. 결론
바늘 구조 (및 높은 표면적)는 통상적인 입자 구조의 인산 칼슘 세라믹에 비해서 골 생성을 가속화한다.
물질 골 생성 골 [% por.] 칼세인 발생 Σ(지점들)m Cfluor
T1050 8/8 23±10 2/8 2 1
T1050a 8/8 23.7±10.1 4/8 12 3
T1125a 8/8 22.8±13.3 5/8 21 4.2
T1150a 4/4 2.0±2.0 NM NM NM
TCP 음대조군 0/8 n/a 0/8 0 n/a
추가 특성화를 위해서 선택된 물질들에 대한 검토. Cfluor는 TCP 음대조군에 대해서는 계산되지 않음.

Claims (26)

  1. 골형성 유도성 인산 칼슘 물질의 제조방법으로서,
    인산 칼슘 입자들로 구성된 표면 지형을 갖는 소결된 이상 인산 칼슘 (BCP) 출발 물질을 제공하는 단계, 상기 소결된 이상 인산 칼슘 출발 물질을 125 ℃ 이상의 온도로, 상기 출발 물질의 표면 상에 존재하는 인산 칼슘 입자들을 인산 칼슘 바늘들로 변화시키기에 충분한 시간 동안 수열처리하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 BCP는 4-20 중량%의 인회석을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인회석은 수산화인회석인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소결된 인산 칼슘 출발 물질은 0.1 - 3.0 ㎛의 평균 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소결된 인산 칼슘 출발 물질은 다공성인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소결된 인산 칼슘 출발 물질은 50-1500 ㎛ 크기 범위의 거대기공을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골형성 유도성 인산 칼슘 물질의 비표면적은, 상기 소결된 인산 칼슘 출발 물질의 비표면적에 비해서 적어도 10-50% 이상, 더욱 바람직하게는 80-100% 더 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골형성 유도성 인산 칼슘 물질의 단백질 흡착 능력은, 상기 소결된 인산 칼슘 출발 물질의 단백질 흡착 능력에 비해서 적어도 10-50% 이상, 더욱 바람직하게는 80-100% 더 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 제조된 골형성 유도성 인산 칼슘 물질.
  10. 제9항에 있어서, 바늘형 표면 지형, 바람직하게는 직경 10-1500 nm의 바늘들을 갖는 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 물질.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 인산 칼슘은 재흡수가능한 (resorbable) 이상 인산 칼슘 (BCP)인 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 물질.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인산 칼슘은 0.9 m2/g 이상의 BET 비표면적을 갖는 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 물질.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인회석 바늘들의 밀도는 0.45/㎛2 미만인 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 물질.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 의료 이식 물질 또는 조직 스캐폴드로서 사용되는 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 물질.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 인산 칼슘의 용도로서,
    - 생물 유기체, 또는 치과 수술에 있어서, 골 조직의 형성을 유도,
    - 단독으로 또는 성장 인자들 및/또는 비골성 부위 (non-osseous site) 중에서 자가조직성 골의 생산을 위한 세포들과 조합되어 이식 물질로서의 용도, 및/또는
    - 단독으로 또는 성장 인자들 및/또는 세포들과 조합되어 의료 이식물 또는 장치의 생산을 위한 용도.
  16. 인회석 바늘들을 포함하는 외부층 및, 선택적으로, 상기 외부층과 접촉하는 내부층을 포함하는 골형성 유도성 인산 칼슘 코팅.
  17. 제16항에 있어서, 상기 인회석은 수산화인회석인 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 코팅.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 인회석 바늘들은 10-1500 nm의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 코팅.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외부층 상의 인회석 바늘들의 밀도는 0.45/㎛2 미만인 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 코팅.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외부층의 두께는 1 내지 1000 ㎛인 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 코팅.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부층은 BCP를 포함하는 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 코팅.
  22. 제21항에 있어서, 상기 BCP는 4-20 중량%의 인회석을 포함하는 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 코팅.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 BCP는 소결된 BCP인 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 코팅.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코팅은 0.9 m2/g 이상의 BET 비표면적을 갖는 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 코팅.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외부층은 상기 내부층의 상기 BCP로부터의 인회석의 침전 이후, 상기 침전을 125 ℃ 이상의 온도에서 수열처리하여 제조된 것을 특징으로 하는 골형성 유도성 인산 칼슘 코팅.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 코팅을 포함하는 이식가능한 물체.
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