WO2015162589A2 - Procedimiento para la obtención de hidroxiapatita a partir de hueso - Google Patents

Procedimiento para la obtención de hidroxiapatita a partir de hueso Download PDF

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WO2015162589A2
WO2015162589A2 PCT/IB2015/052989 IB2015052989W WO2015162589A2 WO 2015162589 A2 WO2015162589 A2 WO 2015162589A2 IB 2015052989 W IB2015052989 W IB 2015052989W WO 2015162589 A2 WO2015162589 A2 WO 2015162589A2
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Astrid Lorena GIRALDO BETANCUR
Mario Enrique RODRÍGUEZ GARCÍA
Sergio Joaquín JIMÉNEZ SANDOVAL
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Centro De Investigación Y De Estudios Avanzados Del Instituto Politécnico Nacional
Universidad Nacional Autónoma de México
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/12—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite

Definitions

  • the present invention relates to the field of biomaterials of natural origin with medical applications for the replacement or augmentation of tissues of living organisms, for example for implants and prostheses and also for obtaining composites for dental use. More specifically, it refers to obtaining Hydroxyapatite (HAp) Bioceramics from cortical bone.
  • HAp Hydroxyapatite
  • the bone is composed of an organic phase, an inorganic phase and water; the proportions are 20-30%, 60-70% and 5-7%, respectively.
  • the organic matrix is mainly composed of type I collagen and the inorganic phase mainly composed of hydroxyapatite (HAp) whose formula is Ca 10 (PO4) 6 (OH) 2.
  • HAp hydroxyapatite
  • PO4 6 OH
  • the unit cell of the HAp there are 10 atoms that can be classified into two types, such as Cal and Ca2.
  • Cal In a hexagonal arrangement, the positions of the Cal are occupied by four calcium atoms that are placed at the site of polyhedra, and the positions of the other six calcium atoms Ca2 are located at the corners of the hexagonal columns and also surrounding OH ions.
  • the network of groups P0 4 3 provides the skeletal framework that gives the structural stability to the HAp [2-4].
  • the bone mineral base is composed of several calcium phosphates and it is considered that this inorganic phase is mainly composed of HAp, although in the body it does not meet its perfect stoichiometric formula because in its composition it has other minerals that can make ionic exchanges in the structure of the HAp.
  • the biological HAp like the one present in the bones, contains other minerals because, as already mentioned, its structure allows different substitutions, so it is known that the biological HAp can be deficient in calcium (Ca + ) , sodium (Na +), magnesium (Mg 2+), acid phosphate (HP0 4), potassium (K +), carbonates (C0 March 2 "), fluoride (F") and chloride (Cl ”) which are the elements minority associated with the biological apatite, strontium (Sr 2+), barium (Ba 2+) and zinc (Zn ”) among others, are included as trace elements. These minority and trace elements may be linked at some point in the network.
  • HAp biochemical properties of HAp are similar to those of bone, since as mentioned, its molecular structure is also similar; although the exact nature of the compound, minerals and proteins, and their interactions are not completely understood.
  • HAp is considered a bioactive material, which indicates that it can undergo ionization in vivo and that the rate of dissolution in the body depends on many factors, including the degree of crystallinity, crystal and crystallite size, shape, conditions of processing (temperature, pressure, and partial water pressure) and porosity.
  • HAp is soluble in an acid solution, while it is insoluble in an alkaline and slightly soluble in distilled water, which increases by adding electrolytes.
  • the solubility of HAp also depends on the environment, that is, it changes in the presence of amino acids, proteins, enzymes and other organic compounds. These solubility properties are closely related to the biocompatibility properties of HAp with tissue and its chemical reactions with other compounds.
  • biocompatibility which allows direct chemical bonding of it with hard tissues [7].
  • HAp can be obtained synthetically or from biological sources, where the one obtained synthetically is done using different types of reagents and different techniques to obtain them.
  • HAp synthetically produced by HAp synthetically, such as for example Sol-gel, mechanochemical methods, microwave irradiation, precipitation and hydrolysis among others.
  • precursors are used which, when mixed with others and according to the technique, allow to obtain the stoichiometric HAp.
  • precursors that are normally used can be mentioned Ca 3 (P0 4 ) 2 , Ca 2 P 2 0 7 , CaC0 3 Ca (N0 3 ) 2 , (NH 4 ) 2 HP0 4 , Ca (OH) 2 and H 3 P0 4 among others.
  • HAp different sources can be used such as corals, algae, bones (human, bovine, pig, fish, etc.), among others, however in the case of bones, the HAp is present together with collagen fibers which form the bone matrix. For this reason it is necessary to find techniques that allow the elimination of the organic phase without degrading the mineral or inorganic phase (HAp).
  • US4324772 refers to a process for synthesizing hydroxyapatite based on the reaction between calcium oxide and phosphoric acid.
  • Patent application US2009130444 refers to the calcium phosphate composition whose X-ray pattern is characteristic of hydroxyapatite, where up to 10% of the phosphate anions of the crystal is substituted with carbonate anions and at least 90% of the particles They are 10 to 260 microns in size.
  • Patent application EP1000902 refers to obtaining a hydroxyapatite compound on a substrate by dipping the substrate in a solution with calcium ions and then in a solution with P0 4 ions, hydroxyapatite with a defined crystalline structure is obtained.
  • Patent application EP0007767 refers to obtaining hydroxyapatite by heating the brushite mineral to a neutral pH, where it is formed as rosette crystals.
  • Patent FR2678258 refers to a process for the preparation of semi-synthetic natural hydroxyapatite or tricalcium phosphate of natural apatites.
  • Patent JP01224214 refers to obtaining high-purity hydroxyapatite from bone by calcination at a temperature of 1,200 ° C in an oxidative atmosphere and then the powder is immersed in a phosphoric acid ion solution whose source can be H 3 P0 4 , KH 2 P0 4 , K 2 HP0 4 , Na 3 P0 4 or (NH 4 ) 3 P0 4 and then washed with water.
  • the alkali treatment is terminated and the bone component is separated and washed with water to obtain pure hydroxyapatite, then burned in an oxidizing atmosphere at 350-1, 200 ° C and cleaned with an aqueous solution with specific pH and in a defined time, where it is then burned again in an oxidizing atmosphere to obtain hydroxyapatite not eluted by an alkaline component.
  • Japanese patent JP1 1255507 refers to obtaining needle-shaped hydroxyapatite or crystalline filament useful for some biomaterials such as bone and teeth by hydrolyzing TCP tertiary calcium phosphate which is heated to 40-100 ° C in the presence of alcohol as mono aliphatic alcohol or amino alcohol 1-30 C or hydrocarbon, for example aliphatic hydrocarbon 1-30 C in an aqueous phase that is alkalized with ammonia.
  • Japanese patent JP05208044 refers to obtaining hydroxyapatite powder obtained from baked bone mixed with a material such as nylon, polyester or acrylic (which help the formation of pores where gas circulates), where granules are formed and then dried and dried.
  • pores of 10 to 100 mm are formed for the presence of gas and whose opening or diameter is controlled depending on the proportions of the components that mix.
  • US4919931 refers to a method for obtaining a compound of hydroxyapatite and osein (bone collagen) that involves grinding mammalian bone of prenatal age and up to 12 months of age, where the particles are acidified at pH 5 to 5.5, dehydrate and degrease with a hydrophilic and lipophilic solvent and the particles obtained are dried under pressure at 20-80 ° C and then sprayed at 50-300 micrometers and sterilized.
  • hydroxyapatite and osein bone collagen
  • the JP02188415 patent refers to obtaining calcium hydroxyapatite and tertiary calcium phosphate, from calcined bone powder that is dissolved in an acid solution, filtered and the pH modified with an alkali such as NH 4 OH, NaOH or Ca (OH) 2 , thereby depositing calcium hydroxyapatite and tertiary calcium phosphate.
  • Patent application WO / 2012/052035 refers to the process for obtaining hydroxyapatite from bovine cortical bone comprising physical-chemical steps, for example one for cleaning with ionic detergent, where hydrothermal treatments (steam and high pressure) are then alternated and alkalis applied repeatedly to remove the organic component and then cooling, not exceeding 650 ° C in an ionizing atmosphere.
  • the product obtained has a particle size in microns of 2000 to 1000, 1000 to 600 and 6000 to 250 and less than 250 microns to meet the requirements for biomedical applications.
  • HAp obtained HAp from fish bones, washing it with sodium hydroxide and acetone to remove proteins, lipids, oils and other impurities present, and then subject the samples to two treatments, one of alkaline hydrolysis, in which the sample was subjected to a solution of 2M sodium hydroxide at 250 ° C for 5 h and rinsed as many times as necessary until the pH was neutral, and the other procedure consisted of making a treatment of calcination at 900 ° C for 5 h [1 1].
  • the first was the subcritical water process, in which the milled sample is placed in a reactor with deionized water in a 1: 40 ratio, where the mixture is placed in a Teflon crucible inside the reactor, which was hermetically sealed and heated in a silicon oil bath at 250 ° C for 1 h, then the sample was filtered and washed with distilled water and dried at 80 ° C for 30 min;
  • the second treatment to which the sample was subjected was to an alkaline hydrothermal hydrolysis in which sodium hydroxide was used and a mixture of sample and 25% sodium hydroxide solution was prepared in a 1: 50 ratio, also introduced into the reactor hermetically sealed and heated in a silicon oil bath at a temperature of 250 ° C for 5 h;
  • the last treatment consisted of a thermal decomposition in which using an alumina crucible they subjected the sample to 850 ° C with a heating rate of 10 ° C / min;
  • the techniques used to obtain HAp from bone are extremely variable and correspond to chemical methods, such as for example treatments with acids and bases, also to thermal methods such as calcination and also to the combination of chemical and physical methods that seek to find the HAp with the composition that is needed for the necessary application.
  • chemical methods such as for example treatments with acids and bases
  • thermal methods such as calcination
  • combination of chemical and physical methods seek to find the HAp with the composition that is needed for the necessary application.
  • adequate control of the intervening variables is necessary, since these can affect the purity of the final material obtained and consequently be affected properties that the material must meet to be implanted.
  • FIG. 1 A summary of the physical and mechanical properties of HAp and bone [2] is shown.
  • Figure 3. The techniques for obtaining synthetic HAp are shown.
  • Figure 4 A summary of the characteristics obtained by Tadic et al. for some commercial samples obtained from bone.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the primary cleaning process is shown.
  • FIG 7. A schematic diagram of the process for obtaining BioHAp of the invention is shown.
  • Figure 8. A diffractogram of the samples is shown, a) with primary cleaning, b) degreased, c) deproteinized (upper line) without carbonates (lower line).
  • Figure 9 The comparison of the diffraction patterns of the BioHAp and the NIST sample is shown.
  • FIG. 12 A micrograph of the 5000X sample is shown, a) with primary cleaning, b) degreased and c) deproteinized.
  • FIG. 13 A micrograph of the NIST sample is shown.
  • FIG. 14 The majority mineral content of the samples with degreased, deproteinized treatment and the NIST sample is shown.
  • FIG. 16 Thermograms of the samples a) Bio-HAp of the invention are shown with various procedures, b) commercial HAp and c) weight loss and its derivative of the degreased sample, with alkaline and calcined treatment.
  • FIG. 18 The majority elemental content is shown in samples a) Bio-HAp and b) commercial HAp.
  • FIG. 19 Diffractograms obtained for films made from the blank manufactured with commercial HAp are shown for a) 4h and b) 6h.
  • FIG 20 Micrographs of the films obtained from the blank manufactured with commercial HAp a) HC504, b) HC604, c) HC704, d) HC506, e) HC606 and f) HC706 are shown.
  • Figure 21 Micrographs of the films obtained from the blank manufactured with Bio-HAp are shown a) HR504, b) HR604, c) HR704, d) HR506, e) HR606 and f) HR706.
  • FIG. 22 The elementary composition of the films a) obtained for 4 hours by EDS, b) obtained for 6 hours by EDS and c) obtained from the Bio-HAp blank by WDS is shown.
  • FIG. 23 Graphs of the hardness of the films a) obtained from the commercial HAp blank and b) obtained from the Bio-HAp blank are shown.
  • Figure 24 The percentage of crystallinity of the samples obtained by the various stages of the process of the invention is shown in comparison with commercial samples of hydroxyapatite and NIST, according to example 4.
  • Figure 25 The minor elementary content of the samples obtained by the various steps of the process of the invention is shown in comparison with commercial samples of hydroxyapatite and NIST, according to example 4. Detailed description of the invention.
  • the present invention provides hydroxyapatite (HAp) of natural origin (bone), (so for practical purposes we will call it BioHAp in the present description), with the quality required according to the National Institute for Standards and Technology (NIST) of the United States of America in terms of its crystallinity, phase homogeneity and purity, as it could be established with IR Infrared analysis, X-ray diffraction (DRX), thermogravimetric analysis (TGA), scanning electron microscopy (MEB ) and by analysis of its composition by inductively coupled plasma optical emission spectroscopy (ICP-OES).
  • NIST Ash 1400 sample is obtained from bovine bone by thermal processes, until the ash is obtained, which is used in the present invention to compare it with the BioHAp.
  • the invention also provides the method for obtaining said HAp.
  • the BioHAp of the present invention by its nature, already in use enjoys biocompatibility with good contact in the matrix-tissue interface, promotes vascularization and cell adhesion, has volumetric stability and has an optimal bonding with the tissue that allows stability mechanical, internal cohesion and elasticity that prevent the breakage of the matrix and have good resistance to dynamic mobility and static deformation, has structural anisotropy equivalent to the tissue organization that replaces and promotes surgical implantation such as adequate fluidity in the moment of implantation with subsequent solidification in situ and pressure malleability.
  • the above properties can be obtained if they comply with NIST standards, that is, with the properties of crystallinity, phase purity and composition.
  • the process of the present invention to obtain the mineral part of the bone is summarized in the scheme presented in Figure 5, where from mature animal bone it is first subjected to a stage of tissue and fluid removal, where then it is subjected to a stage of fat removal (degreasing) by changes in temperature, solvent effect and ultrasound, then to a calcination stage and finally and when necessary, to a stage of removal of carbonates, with a treatment with acetic acid.
  • the bone used is 100% cortical bone sliced 2 cm wide in the femur.
  • the process of the present invention comprises the following steps:
  • This cleaning process is possible, for example, using a scalpel of dissection with blades used in surgery, making a first removal of the tissue present on the surface of the bone, and then boiling the bone with deionized water for 30 min to facilitate removal of the bone marrow and the remaining adhered tissue, rinsing with deionized water and boiling the bone in deionized water for 30 min.
  • the flask is filled with petroleum ether (analytical grade) until all bone packages are covered inside and covered with a rubber stopper. It is put on a grill and the temperature is raised to 30 ° C for 9 h, this time starts counting since bubbles begin to appear, every half an hour the gas that forms inside the container is released, filling with petroleum ether when the solvent level was decreased. Finished 9 h is removed from the grill, leaving 15 h at room temperature. Subsequently the temperature is raised to 30 ° C and the procedure is repeated for two more times. That is, this procedure is done for example for 3 days, with periods of heat of 9 h and periods at room temperature of 15 h.
  • petroleum ether analytical grade
  • the excess solvent is removed and dried in a vacuum oven at a pressure of 1.33 Pa 70 ° C for 5 h. Dry the sample, pack again in a 1,000 ml flask and the same 15 packages with 3 g of bone powder but now fill with acetone to cover the entire sample (analytical grade) and cover with a rubber stopper. It is placed in ultrasound for 2 h with half-hour rest intervals, where in this procedure vapors formed are released every 15 min. It is aforesaid with acetone as it evaporates to maintain the solvent level. At the end of 2 h, the remaining acetone is removed and the sample is dried in a vacuum oven at a pressure of 1.33 Pa 70 ° C for 5 h. At the end of this procedure, the fat-free sample is obtained.
  • the first ramp is made to remove the organic material and the second to obtain the hydroxyapatite phase.
  • the ramps become slow in order not to induce the appearance of phases other than HAp.
  • step III A 10% solution of acetic acid (analytical grade) is added to the previously calcined powder (obtained in step III).
  • the ratio used to do the treatment is 30 ml of acetic acid solution for every 10 bone powder,
  • BioHAp hydroxyapatite powders
  • An embodiment of the present invention relates to the process for obtaining said HAp (BioHAp) consisting of steps I, II, III and IV defined above.
  • hydroxyapatite powders BioHAp
  • BioHAp hydroxyapatite powders
  • the analyzes that were performed on the samples at the different stages were, for example, to establish their structure, X-ray diffraction (DRX), to observe the thermal changes that the samples underwent, thermo gravimetric analysis (TGA) was performed, while the Morphological behavior was established by scanning electron microscopy (SEM) and compositional analysis was obtained by inductively coupled plasma optical emission spectroscopy (ICP-OES).
  • DRX X-ray diffraction
  • TGA thermo gravimetric analysis
  • SEM scanning electron microscopy
  • ICP-OES inductively coupled plasma optical emission spectroscopy
  • the sample with primary cleaning presents a diffraction pattern in which it can be observed that not all the HAp's own planes are defined, according to PDF # 09-0432, reference established by ISO 13779 to make the characterization of the characteristic plans of said phase. That not all the planes are defined and also that a high background appears is characteristic of the presence of amorphous material in the sample. This result is associated with the presence of the organic matrix in the bone as can be seen in Figure 8.
  • the percentage of crystallinity was 50.32 +/- 1.23%; This value shows that there is a significant amorphous percentage corresponding to the organic material present (see figure 8a).
  • the percentage of crystallinity obtained was 50.32 +/- 1.23%; This sample value may be part of the organic material present in the sample when compared with the sample with primary cleaning, as can be seen in Figure 8b.
  • Example 2 Thermal analysis by TGA.
  • the thermal study was done in a TGQ500 (TA instruments), where the mass of the samples was 12 +/- 1 mg. The measuring range was made from room temperature to 800 ° C, with a heating rate of 10 ° C / min and were made with a constant flow of N 2 .
  • the analyzes were done using the Universal Analysis 2000 TA Software. With this analysis we found the losses in weight suffered by the samples with primary and degreased cleaning, in which significant losses were observed, associated with the loss of organic material in the sample, a result that is consistent with the results obtained by DRX. These losses can be seen in Figure 10 a) and 10 b). The sample with primary cleaning lost about 29.18%, while the sample with fat removal treatment lost about 29.97%.
  • the morphological analysis of the samples was done in a Jeol JSM 6060 LV device and 20 kV acceleration voltages were used. Before analysis, the samples were mounted on copper sample holders and fixed with carbon tape. Because the samples are insulating, a layer of gold was placed to make them conductive.
  • Figure 12 a shows a micrograph of the sample with primary cleaning, which has a fairly dense surface, even with fibers that correspond to organic material still adhered to the surface; in the case of the degreased sample, in figure 12 b) an equally dense surface is observed.
  • the dense surface shows that the organic component of the bone matrix, that is, the organic and inorganic phases are embedded between them, as established by the literature. This corroborates the result of DRX, in which the presence of organic material is confirmed.
  • Example 3 Elemental analysis by ICP-OES. Thermo ⁇ CAP6500 Duo View equipment was used. For this analysis, 0.1 g of sample was used and digestion in nitric acid (JT Baker 69-70%) was made. These analyzes were done in triplicate to make a statistic, since as initially mentioned, the bone is not homogeneous in composition.
  • the major components are calcium (Ca) and phosphorus (P), which are those that mainly comprise the crystalline structure of HAp, however the bone is not only composed of these two minerals, but in its structure, there are others that help in the different processes that are carried out in the bone system.
  • Ca calcium
  • P phosphorus
  • Mg magnesium
  • Na sodium
  • the differences between the deproteinized sample and the NIST, in Ca and P is not statistically significant. With respect to the differences between Mg and Na, it may be because, as mentioned, the two samples are obtained from bovine bone, but the bone composition depends on different factors.
  • Example 4 Comparison of different hydroxyapatites obtained from bone by different processes with commercial samples of hydroxyapatite. Small pieces of bovine cortical bone were subjected to stage I of the process of the present invention (primary cleaning). The samples obtained were subsequently subjected to 3 different procedures: a) Degreasing, where the sample was submitted only to stage II of the process of the present invention (degreased),
  • samples from different sources were analyzed, such as NIST ash 1400 as standard, certified by NIST (NIST), Sigma Aldrich, synthetic 289936 (sigma), Apafill G of the Center for Biomaterials of the University of the Habana Reg. No. 76LYC, synthetic (apafill G), Coralina of the National Center for Scientific Research of Havana, HAP-200, Reg. No. 47,174.92 of marine corals (coral), and Biograft, human bone powder, Ref. 16140301, SN .806330, LOT.DR-0005-08 (biograft).
  • the particle size of said commercial samples was reduced to 100 mesh (149 ⁇ ) by means of an Agatha mortar.
  • the process of the present invention allows the production of hydroxyapatite with physicochemical characteristics comparable to those of the commercial HAp samples studied in this case. It is also observed that the process of the present invention is an appropriate way to obtain crystalline hydroxyapatite with the smallest and largest elements that appear naturally in bone tissue.
  • Example 5 Use of the hydroxyapatite obtained by the process of the present invention in obtaining coatings by RF magnetro Sputtering. After obtaining the BioHAp, tests were performed to obtain thin films on silicon substrates with said material to compare it with samples obtained using a commercial HAp blank (Sigma). After obtaining the films using power and time as variables of the process, a study of crystallization kinetics was first performed to obtain adequate crystallinity according to IS013779, finding that at 600 ° C a crystallinity above 65% is obtained . The Coatings obtained using both the blank obtained using the BioHAp powder and commercial HAp were heat treated at 600 ° C in an argon controlled atmosphere for 3 h.

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Abstract

La invención describe procedimientos para la obtención de hidroxiapatita a partir de hueso, la cual posee un porcentaje de cristalinidad semejante a muestras estándar certificadas por lo que dicho producto es de gran calidad. El proceso descrito comprende etapas de limpieza primaria del material de partida, desgrasado, desproteinización y opcionalmente eliminación de carbonatas. El proceso de la invención permite la obtención de hidroxiapatita con características físico-químicas comparables a hidroxiapatitas comerciales, teniendo también los elementos que caracterizan naturalmente al tejido óseo.

Description

Procedimiento para la obtención de hidroxiapatita a partir de hueso Campo de la invención.
La presente invención se refiere al campo de los biomateriales de origen natural con aplicaciones médicas para el reemplazo o aumento de tejidos de organismos vivos, por ejemplo para implantes y prótesis y también para obtener composites de uso dental. Más específicamente se refiere a la obtención de la Biocerámica Hidroxiapatita (HAp) a partir de hueso cortical.
Antecedentes de la invención.
El hueso está compuesto por una fase orgánica, una inorgánica y agua; las proporciones son 20- 30%, 60-70% y 5-7%, respectivamente. La matriz orgánica está compuesta principalmente por colágeno tipo I y la fase inorgánica compuesta principalmente por hidroxiapatita (HAp) cuya fórmula es Ca10(PO4)6(OH)2. En general, estos porcentajes se establecen como la composición ósea en promedio, porque esta varía según la función que tenga, la edad, la alimentación e incluso las enfermedades que pudiera tener [1 ,2].
La HAp en general, cristaliza en una estructura cristalina hexagonal, con grupo espacial P63/m y con unos parámetros de celda a=b=9.418 Angstroms y c=6.884 Angstroms [2].
En la celda unitaria de la HAp existen 10 átomos que se pueden clasificar en dos tipos, tales como Cal y Ca2. En una disposición hexagonal, las posiciones de los Cal están ocupadas por cuatro átomos de calcio que se colocan en el sitio de poliedros, y las posiciones de los otros seis átomos de calcio Ca2 están situados en las esquinas de las columnas hexagonales y también rodeando a los iones OH". La red de grupos P04 3" proporciona el marco esquelético que da la estabilidad estructural a la HAp [2-4].
La base mineral de los huesos se compone de varios fosfatos de calcio y se considera que esta fase inorgánica está compuesta principalmente de HAp, aunque en el organismo no se encuentra con su fórmula estequiométrica perfecta debido a que en su composición posee otros minerales que pueden hacer intercambios iónicos en la estructura de la HAp.
La HAp biológica, como la que está presente en los huesos, contiene otros minerales debido a que, como ya se ha mencionado, su estructura permite diferentes sustituciones, por lo que se conoce que la HAp biológica puede ser deficiente en calcio (Ca+), sodio (Na+), magnesio (Mg2 +), fosfato ácido (HP04), potasio (K+), carbonatas (C03 2"), fluoruro (F") y cloruro (CI") que son los elementos minoritarios asociados con las apatitas biológicas; estroncio (Sr2 +), bario (Ba2 +) y zinc (Zn") entre otros, están incluidos como elementos traza. Estos elementos minoritarios y traza pueden estar enlazados en algún punto de la red. Estos minerales, cumplen funciones específicas, especialmente minerales como el Mg y el K, ayudan a mejorar y mantener la densidad ósea y el Zn es un factor importante en la mineralización ósea y la estructura colagenosa. En la figura 1 se establece una comparación en la composición de la parte inorgánica del hueso y la HAp estequiométrica. En la relación Ca/P para el hueso que se establece en dicha figura, pueden encontrarse variaciones debido a la naturaleza anisotrópica y heterogénea del hueso [5,6]. Las diferencias entre la HAp estequiométrica y la HAp del hueso hace que presente diferentes propiedades físicas y mecánicas. En la figura 2 se comparan algunas propiedades físicas y mecánicas de la HAp estequiométrica comparada con las del hueso tanto cortical (o compacto) como trabecular (o esponjoso) [2].
Las propiedades bioquímicas de la HAp son similares a las del hueso, ya que como se mencionó, su estructura molecular también es similar; aunque la naturaleza exacta del compuesto, los minerales y las proteínas, y sus interacciones no están completamente entendidas.
La HAp es considerada un material bioactivo, lo que indica que ésta puede someterse a ionización in vivo y que la velocidad de disolución en el organismo depende de muchos factores, que incluyen el grado de cristalinidad, tamaño de cristal y cristalito, forma, condiciones de procesamiento (temperatura, presión, y presión parcial del agua) y porosidad. La HAp es soluble en una solución ácida, mientras que es insoluble en una alcalina y ligeramente soluble en agua destilada, la cual aumenta al adicionar electrolitos. Por otra parte, la solubilidad de la HAp también depende del ambiente, es decir, cambia en presencia de aminoácidos, proteínas, enzimas y otros compuestos orgánicos. Estas propiedades de solubilidad están muy relacionadas con las propiedades de biocompatibilidad de la HAp con el tejido y sus reacciones químicas con otros compuestos. Una de las propiedades más importantes de este material es la biocompatibilidad, que permite el enlace químico directo de éste con tejidos duros [7].
En cuanto a los métodos para su obtención, la HAp se puede obtener de forma sintética o a partir de fuentes biológicas, donde la obtenida de forma sintética se hace usando diferentes tipos de reactivos y diferentes técnicas para obtenerlas. En la figura 3 se resumen algunas técnicas usadas, teniendo en cuenta que normalmente se utilizan métodos químicos en los que a través de la reacción adecuada de los reactivos indicados, se obtiene el producto de HAp con las condiciones requeridas [6].
Existen otros métodos químicos o físicos que no se mencionan en la figura 3 para producir HAp de forma sintética, tales como por ejemplo Sol-gel, métodos mecano-químicos, irradiación de microondas, precipitación e hidrólisis entre otros. En todos los casos se usan precursores que al mezclarse con otros y de acuerdo a la técnica, permiten obtener la HAp estequiométrica. Entre los precursores que normalmente se usan se pueden mencionar Ca3(P04)2, Ca2P207, CaC03 Ca(N03)2, (NH4)2HP04, Ca(OH)2 y H3P04 entre otros.
Para obtener la HAp biológica se pueden usar diferente fuentes tales como por ejemplo corales, algas, huesos (humano, bovino, porcino, pescado, etc.), entre otras, sin embargo en el caso de los huesos, la HAp está presente junto con las fibras de colágeno las cuales forman la matriz ósea. Por esta razón es necesario encontrar técnicas que permitan eliminar la fase orgánica sin degradar la fase mineral o inorgánica (HAp).
En la literatura existen, por ejemplo, muestras que son distribuidas comercialmente en las que se usa hueso de bovino como material fuente para la extracción de la HAp. Es el caso de PepGenP- 15® que es hueso de bovino calcinado (1 ,100°C) recubierto con pentadecapéptido (P-15, una parte de la secuencia del colágeno); Endobon® y Cerabone®, son materiales de hueso de bovino sinterizado a altas temperaturas (>1 ,200°C); BiOss® que es el componente inorgánico del hueso, es decir, su parte mineral, obtenida al remover el material orgánico paso a paso primero por un proceso de recocido (hasta 300°C), seguido por un tratamiento químico (NaOH); Kieles, un material para injerto de hueso de bovino el cual es tratado químicamente con cloroformo/metanol y peróxido de hidrógeno para remover todo el componente orgánico excepto el colágeno (aún no se usa clínicamente); Tutoplast® proviene de hueso de humano o de bovino y es usado como material para injerto después de hacer diferentes tratamientos químicos (osmosis, NaOH, H202, acetona) [8]. A continuación se citan algunas patentes relacionadas con métodos de obtención de HAp sintética o de origen natural.
La patente US4324772 se refiere a un proceso para sintetizar hidroxiapatita basado en la reacción entre óxido de calcio y ácido fosfórico. La solicitud de patente US2009130444 se refiere a la composición de fosfato de calcio cuyo patrón de rayos X es característico de la hidroxiapatita, donde hasta el 10% de los aniones fosfatos del cristal está sustituido con aniones de carbonato y al menos 90% de las partículas tienen un tamaño de 10 a 260 mieras. La solicitud de patente EP1000902 se refiere a la obtención de compuesto de hidroxiapatita sobre un sustrato sumergiendo el sustrato en una solución con iones de calcio y luego en una solución con iones P04, se obtiene hidroxiapatita con una estructura cristalina definida. La solicitud de patente EP0007767 se refiere a la obtención de hidroxiapatita mediante el calentamiento del mineral brushita a un pH neutro, donde se conforma como cristales en roseta. La patente FR2678258 se refiere a un proceso para la preparación de hidroxiapatita o fosfato tricálcico natural semi-sintética de apatitas naturales. La patente JP01224214 se refiere a la obtención de hidroxiapatita de alta pureza a partir de hueso mediante calcinación a una temperatura de 1 ,200°C en una atmósfera oxidativa y luego el polvo se sumerge en una solución de iones de ácido fosfórico cuya fuente puede ser H3P04, KH2P04, K2HP04, Na3P04 o (NH4)3P04y luego se lava con agua.
La patente JP04198007 se refiere a la obtención de hidroxiapatita de hueso de pescado hervido en agua purificada, utilizando una proteasa a 50-70°C <= 10 % del peso, donde la sustancia obtenida se trata con una solución acuosa alcalina NaOH a 90-98°C, agitándose para descomponer los residuos orgánicos y para suprimir la formación de Ca3(P04)2 durante el proceso de calentamiento. Se termina el tratamiento con álcali y el componente del hueso se separa y se lava con agua para obtener la hidroxiapatita pura, luego se quema en una atmósfera oxidante a 350-1 ,200°C y se limpia con una solución acuosa con pH específico y en un tiempo definido, donde luego se vuelve a quemar en atmósfera oxidante para obtener así hidroxiapatita no eluída por un componente alcalino.
La patente japonesa JP1 1255507 se refiere a la obtención de hidroxiapatita en forma de aguja o de filamento cristalino útil para algunos biomateriales como hueso y dientes mediante la hidrolización de fosfato de calcio terciario TCP el cual se calienta a 40-100°C en presencia de alcohol como mono alcohol alifático o amino alcohol 1-30 C o hidrocarbono, por ejemplo hidrocarbono alifático 1 - 30 C en una fase acuosa que se alcaliniza con amoníaco. La patente japonesa JP05208044 se refiere a la obtención de polvo de hidroxiapatita obtenido de hueso horneado mezclado con un material como nylon, poliéster o acrílico (que ayudan a la formación de poros por donde circule gas), donde se conforman gránulos que luego se secan y se desgrasan mediante sometimiento a 500°C o bien utilizando vapores y luego se calcina a temperatura de 800 a 1400°C, así se forman poros de 10 a 100 mm para presencia de gas y cuya apertura o diámetro se controla dependiendo de las proporciones de los componentes que se mezclan.
La patente US4919931 se refiere a un método para obtener un compuesto de hidroxiapatita y oseína (colágena del hueso) que implica moler hueso de mamífero de edad prenatal y de hasta 12 meses de edad, donde las partículas se acidifican a pH 5 a 5.5, se deshidratan y desgrasan con un solvente hidrofílico y lipofílico y se desecan las partículas obtenidas bajo presión a 20-80°C y luego se pulverizan a 50-300 micrómetros y se esterilizan.
La patente JP02188415 se refiere a la obtención de hidroxiapatita de calcio y fosfato de calcio terciario, a partir de polvo de hueso calcinado que se disuelve en una solución ácida, se filtra y se modifica el pH con un álcali como NH4OH, NaOH o Ca(OH)2, con lo que se deposita hidroxiapatita de calcio y fosfato de calcio terciario.
La solicitud de patente WO/2012/052035 se refiere al proceso para obtener hidroxiapatita de hueso cortical de bovino que comprende pasos físico-químicos, por ejemplo uno de limpieza con detergente iónico, donde luego se alternan tratamientos hidrotermales (vapor y alta presión) y alcalinos aplicados de manera repetitiva para eliminar el componente orgánico y luego enfriamiento, sin exceder de 650°C en una atmósfera ionizante. El producto obtenido tiene un tamaño de partícula en mieras de 2000 a 1000, 1000 a 600 y 6000 a 250 y de menos de 250 mieras para cumplir con los requerimientos para aplicaciones biomédicas.
También existen reportes de procedimientos para obtener la HAp de hueso de bovino aplicándole diferentes tratamientos que no son comerciales. Por ejemplo, Kusrini y col. usan el fémur del bovino (con una edad de 2 años 9 meses), al cual se remueve todo el tejido visible y las sustancias que están en la superficie del hueso, donde luego se hace un proceso de desgrasado en agua hirviendo seguida por un secado al sol, por último la muestra, después de ser cortada en formas rectangulares, se sinteriza en vacío con temperaturas entre los 500-1400°C, rampas de 5°C /min durante 2-4 h y se deja enfriar en vacío y lentamente, y por último se convierte en polvo [9]. Ruksudjarit y col. obtienen la HAp mediante procesos térmicos secuenciales, por ejemplo, iniciando por el corte del hueso en pequeñas piezas y limpiándolo de manera que no queden impurezas macroscópicas adheridas a la superficie, luego se hierve en agua destilada durante 8 h para remover fácilmente la médula y los tendones, posterior a esto se hace un proceso de desproteinización al hervir de manera continua el hueso en agua, donde luego el hueso se seca toda la noche a una temperatura de 200°C y por último el hueso se calcina a 800°C por 3 h, donde al final se vuelve polvo en un molino de bolas [10]. Jayachandran y col. obtuvieron HAp a partir de huesos de pescado, lavándolo con hidróxido de sodio y acetona para remover proteínas, lípidos, aceites y otras impurezas presentes, para posteriormente someter las muestras a dos tratamientos, uno de hidrólisis alcalina, en el que la muestra se sometió a una solución de hidróxido de sodio 2M a 250°C durante 5 h y se enjuagó tantas veces como fueran necesarias hasta que el pH fuera neutro, y el otro procedimiento consistió en hacer un tratamiento de calcinación a 900°C durante 5 h [1 1].
Barakat y col. obtuvieron HAp a partir de hueso de bovino sometidos a tres tratamientos diferentes, pero haciendo una limpieza previa a dichos tratamientos, que consistió en lavar cuidadosamente con agua y acetona para remover impurezas, donde luego se secó a 160°C durante 48 h y se molió. A dicha muestra se le hicieron tres tratamientos diferentes, el primero fue el proceso de agua subcrítica, en el cual la muestra molida se mete en un reactor con agua desionizada en una relación 1 :40, donde la mezcla se pone en un crisol de teflón dentro del reactor, el cual se cerró herméticamente y se calentó en un baño de aceite de silicio a 250°C por 1 h, luego se filtró la muestra y se lavó con agua destilada y se secó a 80°C durante 30 min; el segundo tratamiento al que se sometió la muestra fue a una hidrólisis hidrotérmica alcalina en el que se usó hidróxido de sodio y se preparó una mezcla de muestra y solución de hidróxido de sodio al 25% en una relación 1 :50, igualmente se introdujo en el reactor sellado herméticamente y se calentó en un baño de aceite de silicio a una temperatura de 250°C durante 5 h; el último tratamiento consistió en una descomposición térmica en el que usando un crisol de alúmina sometieron la muestra a 850°C con una razón de calentamiento de 10°C/min; existen otras instrucciones que usan algunos pasos mencionados en estos procedimientos. En el caso de muestras comerciales, el estudio hecho por Tadic y col. muestra que Endobon® y Cerabone® presentan óxido de calcio (CaO) al hacerles análisis de rayos X, BiOss® una baja cristalinidad y en el caso de Tutoplast® existe la presencia de fosfatos de calcio. En la figura 4 se resumen algunas de las propiedades de cada una de estas muestras después de ser analizadas [8].
Por su parte, Kusrini y col. después de hacer varios experimentos a diferentes temperaturas, encontraron que con el proceso de calcinación a 1 ,000°C durante 3 h se obtienen los mejores resultados, pero no establecen valores de cristalinidad. En este caso, presentan valores de los anchos medios de los picos muy altos, tanto que en la zona donde se presenta la mayor intensidad de los planos difractados, el plano (1 12) se traslapa con el plano (21 1 ). En el caso de Ruksudjarit y col. reportan que la HAp obtenida con las condiciones reportadas no tiene fases diferentes a las HAp presentes en la muestra. En el caso de Jayachandran y col. y Barakat y col. encontraron que el proceso térmico tenía mayor efecto en el componente orgánico de la muestra, y por ende mayor porcentaje de cristalinidad en las muestras [9-1 1 ].
El procesamiento de HAp a partir de hueso por el proceso de liofilización no es muy usado en aplicaciones médicas debido a que no presenta los resultados con las propiedades adecuadas para tal fin.
Se puede observar entonces, que las técnicas usadas para obtener HAp a partir de hueso son extremadamente variables y corresponden a métodos químicos, tales como por ejemplo tratamientos con ácidos y bases, también a métodos térmicos como por ejemplo la calcinación y también a la combinación de métodos químicos y físicos en los que se busca encontrar la HAp con la composición que se necesite para la aplicación necesaria. Sin embargo, en cada una de las técnicas usadas es necesario el control adecuado de las variables que intervienen, ya que estas pueden afectar la pureza del material final que se obtenga y en consecuencia verse afectadas propiedades que debe cumplir el material para ser implantado.
Descripción breve de las figuras.
Figura 1. Se muestra la comparación entre la composición de la parte inorgánica del hueso y la HAp estequiométrica [5,6].
Figura 2. Se muestra un resumen de las propiedades físicas y mecánicas de la HAp y del hueso [2]. Figura 3. Se muestran las técnicas para obtener HAp sintética.
Figura 4. Se muestra un resumen de las características obtenidas por Tadic y col. para algunas muestras comerciales obtenidas a partir de hueso.
Figura 5. Se muestra la metodología seguida acorde a la presente invención para obtener la BioHAp.
Figura 6. Se muestra un diagrama esquemático del proceso de limpieza primaria.
Figura 7. Se muestra un diagrama esquemático del proceso para obtener BioHAp de la invención. Figura 8. Se muestra un difractograma de las muestras, a) con limpieza primaria, b) desgrasada, c) desproteinizada (línea superior) sin carbonatas (línea inferior).
Figura 9. Se muestra la comparación de los patrones de difracción de la BioHAp y la muestra NIST. Figura 10. Se muestran termogramas de la muestra, a) con limpieza primaria, b) desgrasada, y c) desproteinizada.
Figura 11. Se muestra un termograma de la muestra NIST.
Figura 12. Se muestra una micrografía de la muestra 5000X, a) con limpieza primaria, b) desgrasada y c) desproteinizada.
Figura 13. Se muestra una micrografía de la muestra NIST.
Figura 14. Se muestra el contenido mineral mayoritario de las muestras con tratamiento desgrasado, desproteinizado y la muestra NIST.
Figura 15. Se muestra el contenido mineral minoritario presente en las muestras desgrasada, desproteinizada y NIST.
Figura 16. Se muestran termogramas de las muestras a) Bio-HAp de la invención con varios procedimientos, b) HAp comercial y c) pérdida en peso y su deriva de la muestra desgrasada, con tratamiento alcalino y calcinada.
Figura 17. Se muestran patrones de difracción para a) Bio-HAp y b) HAp comercial.
Figura 18. Se muestra el contenido elemental mayoritario en las muestras a) Bio-HAp y b) HAp comercial.
Figura 19. Se muestran difractogramas obtenidos para las películas fabricadas a partir del blanco fabricado con HAp comercial durante a) 4h y b) 6h.
Figura 20. Se muestran micrografías de las películas obtenidas a partir del blanco fabricado con HAp comercial a) HC504, b) HC604, c) HC704, d) HC506, e) HC606 y f) HC706. Figura 21. Se muestran micrografías de las películas obtenidas a partir del blanco fabricado con Bio-HAp a) HR504, b) HR604, c) HR704, d) HR506, e) HR606 y f) HR706.
Figura 22. Se muestra la composición elemental de las películas a) obtenidas durante 4 horas mediante EDS, b) obtenidas durante 6 horas mediante EDS y c) obtenidas a partir del blanco de Bio-HAp mediante WDS.
Figura 23. Se muestran gráficos de la dureza de las películas a) obtenidas a partir del blanco de HAp comercial y b) obtenidas a partir del blanco de Bio-HAp.
Figura 24. Se muestra el porcentaje de cristalinidad de las muestras obtenidas mediante las diversas etapas del proceso de la invención en comparación con muestras comerciales de hidroxiapatita y NIST, conforme al ejemplo 4.
Figura 25. Se muestra el contenido elemental minoritario de las muestras obtenidas mediante las diversas etapas del proceso de la invención en comparación con muestras comerciales de hidroxiapatita y NIST, conforme al ejemplo 4. Descripción detallada de la invención.
La presente invención provee de hidroxiapatita (HAp) de origen natural (hueso), (por lo que para fines prácticos la denominaremos BioHAp en la presente descripción), con la calidad requerida de acuerdo con el National Institute for Standards and Technology (NIST) de los Estados Unidos de Norteamérica en cuanto a su cristalinidad, homogeneidad de fase y pureza, tal y como se pudo establecer con los análisis de Infrarrojo IR, difracción de rayos X (DRX), análisis termogravimétrico (TGA), microscopía electrónica de barrido (MEB) y por análisis de su composición mediante espectroscopia de emisión óptica por plasma acoplado inductivamente (ICP-OES). La muestra NIST Ash 1400 es obtenida de hueso de bovino mediante procesos térmicos, hasta obtener la ceniza, la cual se usa en la presente invención para compararla con la BioHAp. La invención también provee del procedimiento para obtener dicha HAp.
La BioHAp de la presente invención por su naturaleza, ya en su uso goza de biocompatibilidad con un buen contacto en la interfase matriz-tejido, favorece la vascularización y la adhesión celular, posee estabilidad volumétrica y tiene un óptimo enlazamiento con el tejido que permite estabilidad mecánica, cohesión interna y elasticidad adecuadas que prevengan la rotura de la matriz y tenga buena resistencia frente a la movilidad dinámica y a la deformación estática, posee anisotropía estructural equivalente a la organización tisular que reemplaza y favorece la implantación quirúrgica como son la fluidez adecuada en el momento de la implantación con la posterior solidificación in situ y maleabilidad por presión. Las propiedades anteriores es posible obtenerlas si cumplen con las normas NIST, es decir con las propiedades de cristalinidad, pureza de la fase y composición.
El proceso de la presente invención para obtener la parte mineral del hueso se resume en el esquema que se presenta en la figura 5, en donde a partir de hueso de animal maduro éste se somete primero a una etapa de eliminación de tejido y fluidos, donde luego se somete a una etapa de eliminación de grasa (desgrasado) mediante cambios de temperatura, efecto de solventes y ultrasonido, luego a una etapa de calcinación y finalmente y cuando es necesario, a una etapa de eliminación de carbonatas, con un tratamiento con ácido acético. El hueso usado es 100% hueso cortical seccionado en rodajas de 2 cm de ancho del fémur.
El proceso de la presente invención comprende las siguientes etapas:
I. Limpieza primaria. En esta etapa, ya cortado el hueso en rodajas, se eliminaron tanto el tejido blando como los fluidos presentes en el hueso, donde este proceso se esquematiza en la figura 6.
Este proceso de limpieza es posible hacerlo por ejemplo usando un bisturí de disección con cuchillas usadas en cirugía, haciendo una primera eliminación del tejido presente en la superficie del hueso, para posteriormente someter el hueso a ebullición con agua desionizada durante 30 min para facilitar la eliminación de la médula y el restante tejido adherido, enjuagándose con agua desionizada y volviéndose a poner a ebullición el hueso en agua desionizada durante 30 min. más para terminar de quitar el tejido adherido a la superficie del hueso y los fluidos presentes, para después secar los huesos en un horno de vacío a una presión de 1 .33 Pa a 70°C durante 5 horas para eliminar toda la humedad presente en ellos, para luego someterlos a un proceso de molienda mecánica con una licuadora de acero inoxidable hasta que el polvo pase por una malla o tamiz 100 (149 μηη) para finalmente eliminar la humedad que hubiera podido adquirir en el proceso de molienda secando el polvo durante 5 horas a una temperatura de 70°C en un horno de vacío a una presión de 1 .33 Pa. En este momento se obtiene la muestra control.
II. Proceso de desgrasado. Después de tener el polvo de hueso, se somete a un tratamiento con solventes. Para esto, se envuelven 3 g de polvo de hueso en papel filtro y se colocan 15 paquetes debidamente empaquetados en un matraz de 1 ,000 mi. Continúan los siguientes pasos:
Se llena el matraz con éter de petróleo (grado analítico) hasta cubrir todos los paquetes de hueso dentro y se tapa con un tapón de caucho. Se pone en una parrilla y se sube la temperatura a 30°C durante 9 h, este tiempo se empieza a contar desde que empiezan a verse burbujas, cada media hora se libera el gas que se forma dentro del envase, aforando con éter de petróleo cuando se disminuía el nivel del solvente. Terminadas 9 h se retira de la parrilla, dejándose 15 h a temperatura ambiente. Posteriormente se eleva la temperatura a 30°C y se repite el procedimiento por dos veces más. Es decir, este procedimiento se hace por ejemplo durante 3 días, con periodos de calor de 9 h y periodos a temperatura ambiente de 15 h. Al final del tercer día, se elimina el exceso de solvente y se seca en un horno de vacío a una presión de 1.33 Pa 70°C durante 5 h. Seca la muestra se empacan nuevamente en un matraz de 1 ,000 mi los mismos 15 paquetes con 3 g de polvo de hueso pero ahora se llena con acetona hasta cubrir toda la muestra (grado analítico) y se tapa con un tapón de caucho. Se coloca en ultrasonido durante 2 h con intervalos de reposo de media hora, donde en este procedimiento se liberan vapores formados cada 15 min. Se afora con acetona en la medida que se vaya evaporando para mantener el nivel del solvente. Al término de las 2 h, se elimina la acetona restante y se seca la muestra en un horno de vacío a una presión de 1.33 Pa 70°C durante 5 h. Al finalizar este procedimiento se obtiene la muestra libre de grasa.
III. Proceso de desproteinización. Con la muestra libre de grasa, durante el desarrollo de la invención se implemento la manera de eliminar las proteínas en la muestra. Para ello se pone la muestra en crisoles cerámicos y se ponen en una mufla con la siguiente rampa: a) de temperatura ambiente hasta 400°C a una razón de 0.4°C /min y se deja 3 h;
b) luego que incrementa de 400°C a 900°C a una razón 1.4°C /min; en 900°C se deja 3 h; permitiendo que regrese a temperatura ambiente por inercia.
La primera rampa se hace para eliminar el material orgánico y la segunda para obtener la fase de la hidroxiapatita. En general, las rampas se hacen lentas con el fin de no inducir aparición de fases diferentes a la HAp.
Con este procedimiento se obtiene una alta calidad de HAp, que es comparable con muestras de la NIST en cuanto a su cristalinidad, y al analizar su patrón de difracción aparentemente no hay otras fases presentes en las muestras diferentes a la hidroxiapatita.
Durante el desarrollo de la presente invención se observó que algunas muestras analizadas por infrarrojo (IR), presentaron la aparición de las bandas correspondientes a los carbonatas, que se deben a la transformación que sufre el material orgánico remanente durante el proceso térmico al que es sometida la muestra. La aparición o no de carbonatas en la muestra se debe a que, como se mencionó inicialmente, la composición de los huesos es variable ya que depende de diferentes condiciones a la que haya estado expuesto el animal durante su vida. Por esta razón, el análisis por IR es fundamental para establecer la presencia de las bandas características en las muestras. En el caso que aparezca las bandas correspondientes a carbonatas, se continúa con el siguiente paso:
IV. Proceso de eliminación de carbonatas. Después de que la muestra se calcina y se analiza por IR estableciéndose la presencia de las bandas propias de los carbonatas, se realiza el siguiente tratamiento:
a) Se agrega al polvo previamente calcinado (obtenido en el paso III) una solución de ácido acético (grado analítico) al 10%. La relación que se usa para hacer el tratamiento es 30 mi de solución de ácido acético por cada 10 de polvo de hueso,
b) En seguida se coloca la muestra en una parrilla para que permanezca en agitación constante usando una barra magnética durante 3 h, donde se regula la agitación de tal forma que no se forme vórtice.
c) Luego se saca la muestra y se pone a secar en un horno de vacío a una presión de 1 .33 Pa 70°C durante 5 h, hasta obtener la fase de la HAp libre de carbonatas.
Cuando se garantiza que se tiene la muestra libre de fases diferentes a la HAp, se dice que se obtiene el producto final, que llamamos BioHAp en la presente invención. Este procedimiento se esquematiza en la figura 7.
Es un objetivo principal de la presente invención proporcionar un procedimiento para obtener polvos de hidroxiapatita (BioHAp) que comprende los pasos I, II y III definidos anteriormente. Una modalidad de la presente invención se refiere al procedimiento para obtener dicha HAp (BioHAp) que consiste en los pasos I, II, III y IV definidos anteriormente.
Es otro objetivo principal de la invención proveer de polvos de hidroxiapatita (BioHAp) con un grado de cristalinidad, homogeneidad y pureza adecuados de acuerdo con la NIST, y que se obtiene al llevar a cabo el procedimiento de la invención descrito con los pasos I, II, III y el opcional IV. Los análisis que se realizaron a las muestras en las diferentes etapas fueron por ejemplo, para establecer su estructura, difracción de rayos X (DRX), para observar los cambios térmicos que sufrían las muestras se realizó análisis termo gravimétrico (TGA), mientras que el comportamiento morfológico se estableció mediante microscopía electrónica de barrido (MEB) y el análisis de composición se obtuvo mediante espectroscopia de emisión óptica por plasma acoplado inductivamente (ICP-OES). Los análisis hechos a las muestras en los diferentes estados de limpieza se hicieron con el fin de establecer las diferencias y las transformaciones que iban sufriendo a medida que se realizaban los tratamientos, por lo que se garantiza la calidad del producto final que se describe en la presente invención.
Los siguientes ejemplos describen de manera detallada cómo se puede llevar a cabo la invención, teniendo un propósito solo ilustrativo y nunca limitativo del alcance que puede tener la invención, ya que en algunos pasos existe la posibilidad de que un técnico con conocimientos medios en el campo de la invención decida establecer cambios en algunos parámetros dentro de un rango razonable, por lo que estas variaciones están dentro del alcance de la invención y se consideran modalidades de la misma.
Ejemplo 1. Análisis estructural mediante DRX. Las medidas de difracción de rayos X se hicieron en un porta muestras de aluminio, donde los espectros se tomaron en un equipo Rigaku Miniflex operado a 35 kV y 15 mA con radiación Cu Ka (lambda=1 .5405 Angstroms). Los difractogramas se obtuvieron en un rango de 10 a 70° en la escala 2 con un tamaño de paso de 0.02°. Se hicieron análisis del porcentaje de cristalinidad en el software MDI JADE, que lo hace eliminando el background y teniendo en cuenta las áreas de los picos presentes.
En general, la muestra con limpieza primaria presenta un patrón de difracción en la que se puede observar que no se definen todos los planos propios de la HAp, según el PDF#09-0432, referencia establecida por la norma ISO 13779 para hacer la caracterización de los planos característicos de dicha fase. Que no se definan todos los planos y además que aparezca un background alto es característico de la presencia de material amorfo en la muestra. Este resultado está asociado con la presencia de la matriz orgánica en el hueso como puede verse en la figura 8.
En este caso, el porcentaje de cristalinidad fue de 50.32 +/- 1.23%; este valor muestra que hay un porcentaje amorfo significativo correspondiente al material orgánico presente (ver figura 8a). En el caso de la muestra después del proceso de desgrasado, se ve una apariencia similar a la muestra con limpieza primaria, solo que más limpia. En este caso, se observa que el tratamiento hecho con los solventes eliminó las grasas presentes; en este caso, el porcentaje de cristalinidad obtenido fue de 50.32 +/- 1.23%; este valor de muestra es posible que sea parte del material orgánico presente en la muestra al compararla con la muestra con limpieza primaria, como puede observarse en la figura 8b.
Ahora bien, la muestra sometida al tratamiento térmico, después de haber pasado por los tratamientos de limpieza primaria y desgrasado, presenta todos los planos característicos de la HAp (ver figura 8c, línea negra). Esto muestra que se eliminó por completo el material orgánico presente en la muestra, porque además no hay aumento en la línea base, lo que muestra alto porcentaje de cristalinidad con respecto a las otras muestras, establecido en 66.81 +/- 1.85%. En esta misma figura, se puede observar que existe la presencia de otros planos que no corresponden con la HAp, marcados con *, siendo en este caso carbonatas producidos durante el tratamiento térmico, debido a la transformación del material orgánico presente durante las altas temperaturas alcanzadas. Estos carbonatas son eliminados, cuando aparecen, tratando la muestra con ácido acético como se describió anteriormente, como puede observarse en la figura 8c) (espectro inferior, "sin carbonatas"), en la que solo aparecen los planos correspondientes a la fase de la HAp.
La presencia de estos carbonatas puede verse también en la muestra NIST (Ash 1400-hueso de bovino calcinado) como se observa en la figura 9. La comparación de estas muestras, permite establecer qué la calidad de la BioHAp obtenida con el proceso de la presente invención es comparable a la del estándar NIST; de hecho, si analizamos el porcentaje de cristalinidad, el de la muestra BioHAp es superior al de la muestra NIST, obteniéndose valores de 88.35 +/- 2.81 % y 83.72 +/- 2.13% respectivamente.
Ejemplo 2. Análisis térmico mediante TGA. El estudio térmico se hizo en un equipo TGQ500 (TA instruments), donde la masa de las muestras fue 12 +/- 1 mg. El rango de medida se hizo desde temperatura ambiente hasta 800°C, con una razón de calentamiento de 10°C /min y se hicieron con flujo constante de N2. Los análisis se hicieron usando el Software Universal Analysis 2000 TA. Con este análisis se encontraron las pérdidas en peso que sufrieron las muestras con limpieza primaria y desgrasada, en las que se observaron pérdidas significativas, asociadas con la pérdida de material orgánico en la muestra, resultado que concuerda con los resultados obtenidos mediante DRX. Estas pérdidas se pueden ver en la figura 10 a) y 10 b). La muestra con limpieza primaria perdió alrededor de 29.18%, mientras que la muestra con tratamiento para quitar la grasa perdió alrededor de 29.97%. Estos porcentajes corresponden a humedad, grasas y proteínas. En ambos casos, las pérdidas que se dan entre 188°C y 566°C se deben a la combustión del colágeno. Para la muestra desproteinizada (figura 10c), solo se observa una pérdida de aproximadamente el 1 % que corresponde a remanentes de humedad en la muestra, situación que pasa con la muestra NIST, en la que también se da una pequeña pérdida debida a la humedad presente (figura 1 1 ). Este resultado corrobora que en estas dos muestras no existe presencia de material orgánico, corroborando los resultados encontrados por DRX.
El análisis morfológico de las muestras se hizo en un equipo Jeol JSM 6060 LV y se usaron voltajes de aceleración de 20 kV. Antes del análisis, las muestras se montaron en porta muestras de cobre y se fijaron con cinta de carbón. Debido a que las muestras son aislantes, se les colocó una capa de oro para hacerlas conductoras.
En la figura 12 a) se observa una micrografía de la muestra con limpieza primaria, la cual presenta una superficie bastante densa, incluso con fibras que corresponden a material orgánico aún adherido a la superficie; en el caso de la muestra desgrasada, en la figura 12 b) se observa una superficie igualmente densa. Lo denso de la superficie muestra que no se ha atacado totalmente la componente orgánica de la matriz ósea, es decir, las fases orgánica e inorgánica están embebidas entre ellas, como lo establece la literatura. Esto corrobora el resultado de DRX, en el que se confirma la presencia de material orgánico.
En el caso de la muestra desproteinizada, en la figura 12 c) se observa una superficie porosa que da idea de una red porosa interconectada, que establece la literatura como la superficie que se debe observar cuando se ha eliminado el material orgánico del tejido óseo [12].
Al comparar la micrografía de la muestra desproteinizada con la micrografía de la muestra estándar (NIST), se observa que en el caso de la muestra NIST también se observa una superficie porosa, (figura 13) solo que en este caso, el tamaño de los poros es más pequeño.
Ejemplo 3. Análisis elemental mediante ICP-OES. Se usó el equipo Thermo ¡CAP6500 Dúo View. Para dicho análisis se usó 0.1 g de muestra y se hizo una digestión en ácido nítrico (JT Baker 69- 70%). Estos análisis se hicieron por triplicado para hacer una estadística, ya que como se mencionó inicialmente, el hueso no es homogéneo en composición.
Como se observa en la figura 14, los componentes mayoritarios son calcio (Ca) y fósforo (P), que son los que componen principalmente la estructura cristalina de la HAp, sin embargo el hueso no solo está compuesto de estos dos minerales, sino que en su estructura tiene presente otros que ayudan en los diferentes procesos que se llevan a cabo en el sistema óseo. Dentro de los elementos mayoritarios en la estructura, existe el magnesio (Mg) y el sodio (Na), que aunque en proporciones menores con respecto a sus dos elementos principales, debido a su presencia, están dentro de este componente mayoritario. Las diferencias entre la muestra desproteinizada y la NIST, en Ca y P no es estadísticamente significativa. Con respecto a las diferencias que existen entre el Mg y Na, pueden deberse a que, como se ha mencionado, las dos muestras son obtenidas de hueso de bovino, pero la composición ósea depende de diferentes factores.
En cuanto al contenido mineral minoritario presente en las muestras (figura 15), se observan diferencias, que a nivel de trazas, tienen que ver con los diferentes factores que afectan la composición del hueso como ya se mencionó. En términos generales, se observa que la muestra BioHAp con el proceso de desproteinización, presenta características similares, e incluso mejores que la muestra estándar NIST Ash 1400, como se observó en los resultados obtenidos.
Ejemplo 4. Comparación de diferentes hidroxiapatitas obtenidas de hueso mediante diferentes procesos con muestras comerciales de hidroxiapatita. Pequeñas piezas de hueso cortical de bovino se sometieron a la etapa I del proceso de la presente invención (limpieza primaria). Las muestras obtenidas fueron sometidas posteriormente a 3 procedimientos diferentes: a) Desgrasado, donde la muestra se sometió únicamente a la etapa II del proceso de la presente invención (desgrasada),
b) Tratamiento alcalino, donde la muestra obtenida mediante la etapa II del proceso de la presente invención se sometió posteriormente a tratamiento alcalino con una solución al 8% p/v de hidróxido de sodio para posteriormente secar al vacío el polvo resultante en un horno a 1.33 Pa y 70°C por 5 hrs (alcalina), o
c) Calcinación, donde la muestra obtenida mediante la etapa II del proceso de la presente invención se sometió posteriormente a la etapa III del proceso de la presente invención (calcinada).
Respecto a las muestras comerciales de hidroxiapatita, se analizaron muestras de diferentes fuentes, tales como NIST ash 1400 como estándar, certificada por NIST (NIST), Sigma Aldrich, sintética 289936 (sigma), Apafill G del Centro de Biomateriales de la Universidad de la Habana Reg. no. 76LYC, sintética (apafill G), Coralina del Centro Nacional de Investigaciones Científicas de la Habana, HAP-200, Reg. No. 47.174.92 de corales marinos (coralina), y Biograft, polvo de hueso humano, Ref. 16140301 , SN.806330, LOT.DR-0005-08 (biograft). El tamaño de partícula de dichas muestras comerciales se redujo a malla 100 (149 μηη) mediante un mortero Agatha.
Al realizar comparaciones de las muestras anteriores mediante diferentes técnicas se encontró que mediante análisis termogravimétrico (figura 16) la muestra biograft presentaba un alto porcentaje de material orgánico al igual que la muestra desgrasada. Así mismo se estableció la calidad cristalina de las muestras y las fases presentes en cada una de ellas, encontrándose que las muestras desgrasada y alcalina presentaban un alto porcentaje de material amorfo, al igual que la muestra biograft, tal como se observa en la figura 17. Por otro lado, se estableció el porcentaje de cristalinidad presente en las muestras, obteniéndose los resultados que se muestran en la figura 24, donde se observa que la muestra sometida al proceso de la presente invención muestra un porcentaje similar de cristalinidad e incluso superior a la muestra NIST. Respecto a los resultados obtenidos de los análisis por microscopía, se encontró que las muestras desgrasada y biograft presentaban superficies bastante densas que corroboran la presencia de material orgánico en la superficie, mientras que las muestras NIST y calcinada presentan porosidad, siendo mayor en la muestra calcinada como se observa en las figuras 12 y 13. Respecto a la composición elemental de las muestras analizadas, se observó la presencia de minerales propios del hueso en casi todos los casos (figura 18 y figura 25).
Como puede observarse, el proceso de la presente invención permite la obtención de hidroxiapatita con características físico-químicas comparables a las de las muestras de HAp comerciales estudiadas en este caso. Así mismo se observa que el proceso de la presente invención resulta una manera apropiada para obtener hidroxiapatita cristalina con los menores y mayores elementos que aparecen naturalmente en el tejido óseo.
Ejemplo 5. Uso de la hidroxiapatita obtenida mediante el proceso de la presente invención en la obtención de recubrimientos por RF magnetro Sputtering. Después de obtener la BioHAp se realizaron pruebas para obtener películas delgadas sobre sustratos de silicio con dicho material para compararlo con muestras obtenidas usando un blanco de HAp comercial (Sigma). Después de obtener las películas usando como variables del proceso la potencia y el tiempo, primero se realizó un estudio de la cinética de cristalización para obtener la cristalinidad adecuada según la norma IS013779, encontrando que a 600°C se obtiene una cristalinidad arriba del 65%. Los recubrimientos obtenidos usando tanto el blanco obtenido usando el polvo de BioHAp y de HAp comercial fueron tratados térmicamente a 600°C en atmosfera controlada de argón durante 3 h. Posterior a esto se estudiaron diferentes propiedades tales como cristalinidad (figura 19); los cambios estructurales en las películas mostraron un porcentaje del volumen orientado preferencialmente en el plano (002) que parece estar relacionado con el sustrato usado, pero que calca el crecimiento del hueso longitudinalmente. Por otra parte se realizó un estudio del comportamiento morfológico, en el que se encontró que a nivel morfológico se observan aglomerados nanométricos en la superficie en algunos casos en forma de hojuela y en otros en forma de aguja (figuras 20 y 21 ). En el caso del análisis elemental (figura 22), se encontró para las películas crecidas a partir del blanco de Bio-HAp, la presencia de Mg y Na además de Ca, P y O. La presencia de estos elementos muestra que mediante la técnica usada y usando estos parámetros, se logra obtener en la superficie los minerales mayoritarios naturalmente presentes en el hueso. Se realizó también un estudio de las propiedades mecánicas y se encontró que el comportamiento de los valores de dureza de las películas no tiene una tendencia clara (figura 23), pero en muchos casos está por encima de los valores reportados para este material y pueden estar relacionados con el crecimiento preferencial que se dio debido al sustrato, pero que replica el crecimiento preferencial del hueso longitudinalmente.
Referencias.
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Claims

Reivindicaciones.
1. Un proceso para la obtención de hidroxiapatita a partir de hueso, caracterizado porque comprende las etapas de:
I) Eliminar tejidos blandos y fluidos de la muestra de hueso, hasta obtener hueso en polvo,
II) Desgrasar el hueso en polvo mediante las subetapas de:
a) Empaquetar el hueso en polvo en papel filtro, agregar éter de petróleo y someterlo a calentamiento a 30°C durante 9 horas,
b) Dejar el hueso en polvo a temperatura ambiente por 15 horas y someterlo a calentamiento a 30°C durante 9 horas, repitiendo el procedimiento dos veces más,
c) Eliminar el exceso de solvente, secar a 70°C a una presión de 1 .33 Pa durante 5 horas, empaquetar el polvo obtenido en papel filtro y agregar acetona,
d) Someter á ultrasonido durante 2 horas con intervalos de reposo de media hora, y
e) Eliminar la acetona y secar a 70°C a una presión de 1.33 Pa durante 5 horas; y
III) Desproteinizar el hueso en polvo mediante las subetapas de:
a) Someter a calentamiento el hueso en polvo a partir de temperatura ambiente hasta 400°C a una razón de 0.4°C /min e incubar por 3 horas a la temperatura final, e
b) Incrementar la temperatura de 400°C a 900°C a una razón 1.4°C /min, incubar por 3 horas a la temperatura final y permitir enfriar a temperatura ambiente.
2. El proceso de la reivindicación 1 , caracterizado porque comprende adicionalmente la etapa de: IV) Eliminar carbonatas del hueso en polvo mediante las subetapas de:
a) Agregar al hueso en polvo ácido acético al 10% en una proporción de 30 mi de solución de ácido acético por cada 10 g de hueso en polvo, agitando suavemente durante 3 horas, y b) Secar,
donde dicha etapa de realiza únicamente cuando el polvo de hueso resultante del proceso de la reivindicación 1 presenta carbonatas.
3. El proceso de la reivindicación 1 , caracterizado porque la etapa I) comprende las subetapas de: a) Eliminar mecánicamente el tejido blando de la superficie del hueso y someterlo a ebullición en agua durante 30 min para eliminar el tejido blando restante, enjuagar con agua y someter el hueso nuevamente a ebullición en agua durante 30 min,
b) Secar el hueso a 70°C a una presión de 1 .33 Pa durante 5 horas,
c) Moler el hueso hasta obtener un polvo de tamaño de partícula malla 100 o de 149 μηη, y d) Eliminar la humedad restante del hueso en polvo secando a 70°C a una presión de 1.33 Pa durante 5 horas.
4. La hidroxiapatita obtenida mediante el proceso de la reivindicación 1.
5. La hidroxiapatita obtenida mediante el proceso de la reivindicación 2.
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