KR20160030101A

KR20160030101A - T 세포 에피토프의 면역원성 예측 방법

Info

Publication number: KR20160030101A
Application number: KR1020157035178A
Authority: KR
Inventors: 우구르 사힌; 아라벨 다비드 타드모어; 존 크리스토퍼 카스틀레; 세바스티안 뵈겔; 마르틴 뢰버
Original assignee: 비온테크 아게; 유니버시태츠메디진 데어 요하네스 구텐베르크-유니버시태트 마인츠; 트론-트란슬라셔날레 온콜로기 안 데어 유니버시태츠메디진 데어 요하네스 구텐베르크-유니버시태트 마인츠 게마인뉘치게 게엠베하
Priority date: 2013-05-10
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2016-03-16
Also published as: ES2871384T3; MX2015015511A; LT2994159T; US20160125129A1; SG11201508816RA; JP2016521128A; CN113219179A; US11222711B2; SI2994159T1; PL2994159T3; EP2994159B1; HRP20210773T1; JP2024037890A; CN105451759B; AU2014264943B2; BR112015028126A2; HUE055146T2; ZA201508048B; EP3895727A1; KR102399419B1

Abstract

본 발명은 T 세포 에피토프의 예측 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양-관련 신생항원과 같은 펩타이드 또는 폴리펩타이드에서의 변형이 면역원성인지 아닌지를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 특히환자의 종양에 특이적인 백신을 제공하는데 유용하고,그에 따라, 개별화된 암 백신의 관점에서 특히 유용하다.

Description

T 세포 에피토프의 면역원성 예측 방법{PREDICTING IMMUNOGENICITY OF T CELL EPITOPES}

본 발명은 T 세포 에피토프를 예측하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양-관련 신생항원(neoantigen)과 같은 펩타이드 또는 폴리펩타이드 내의 변형이 면역원성인지 아닌지를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 특히 환자의 종양에 특이적인 백신을 제공하는데 특히 유용하며, 그러한 맥락에서 개별화된 암 백신을 제공하는데 유용하다.

개별화된 암 백신(Personalized 암 vaccines)은 주어진 환자에게 독특한 종양-특이 돌연변이를 표적화하기 위한 맞춤식 치료용 백신이다. 이러한 치료법은 건강한 세포에는 유해하지 않으면서 평생동안 암을 완화시킬 수 있는 잠재능을 제공하므로 암 환자에게 크나큰 희망을 안겨준다. 그러나 종양에 의해 발현되는 모든 돌연변이가 백신의 표적으로 사용될 수 있는 것은 아니다. 실상, 대부분의 암의체세포 돌연변이는, 그에 대한 백신이 접종된 경우, 면역 반응을 이끌어내지 못한다 (J. C. Castle 등, Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). 종양은 무려 100,000여 개의 체세포 돌연변이를 코딩할 수 있는 반면에 (M. R. Stratton, Science Signalling 331, 1553 (2011)), 백신은 다만 얼마간의 에피토프들만을 표적으로 할 뿐이어서, 어떤 돌연변이가 면역원성을 나타낼지를 동정해내는 것이 암 면역치료법의 주요 목적이라는 것은 두말할 필요도 없다.

생물학적 관점에서, 체세포 돌연변이가 면역반응을 생성하기 위해서는 다음과 같은 몇 가지 기준을 만족하여야 한다: 당해 돌연변이를 포함하는 대립유전자(allele)가 당해 세포에 의해 발현되어야 할 것, 당해 돌연변이가 단백질 코딩 영역에 존재하여야 하고 비유사 돌연변이일 것, 번역된 단백질은 프로테아좀에 의해 분해되지 않을 것 및 당해 돌연변이를 함유하는 에피토프는 MHC 복합체에 의해 제시되어야 할 것, 제시된 에피토프는 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 인식되어야 할 것, 그리고 마지막으로 TCR-pMHC 복합체는 T 세포를 활성화하는 시그널 캐스케이드를 개시할 것 등이 그것이다(S. Whelan, N. Goldman, Molecular biology and evolution 18, 691 (2001)). 따라서, 어떤 돌연변이가 이러한 모든 기준을 만족할지를 고도의 확실성으로 예측하게 할 수 있는 알고리듬은 이제까지 제기된 바 없다. 본 발명에서 본 발명자들은 면역원성에 기여하는 몇몇 인자를 검토하고, 이들 인자들을 실험 데이터와 비교하여 면역원성 돌연변이를 동정하기 위한 간단한 모델을 제안하고자 한다.

MHC 결합 예측: 종래기술

지난 20 여년 간, MHC 결합 펩타이드 내에는 다른 위치보다 결합능에 더 많은 기여를 하는 위치들이 존재하리라는 추측이 있어왔다 (예컨대, (A. Sette 등, Proceedings of the National Academy of Sciences 86, 3296 (1989))). 이러한 앵커 위치들의 동정 및 이에 관한 설명에 의해 MHC 결합 펩타이드의 패턴을 발견하는 것이 가능해졌고 따라서 예측방법을 개발하는 바탕이 되었다. 최근 몇 년간 항원 프로세싱 머신(Antigen Processing Machinery)의 인실리코(in silico) 모델 분야는 비약적인 발달하였다. 1990년대 말 개발된 두 가지 선구적인 접근법들인 BIMAS (K. C. Parker, M. A. Bednarek, J. E. Coligan, The Journal of Immunology 152, 163 (1994)) 및 SYFPEITHI (H.-G. Rammensee, J. Bachmann, N. P. N. Emmerich, O. A. Bachor, S. Stevanovic, Immunogenetics 50, 213 (1999))는 앵커 위치 및 파생된 대립유전자-특이적인 모티프에 대한 지식에 기반하는 것이었다. 이용가능한 실험적인 MHC 펩타이드-결합 데이터가 점점 더 많이 쌓여감에 따라, 다양한 통계학적 및 컴퓨터 기술을 이용하여 보다 많은 도구들이 개발되었다 (도 1의 개관 참조). 소위 매트릭스-기반 방법은 어떤 펩타이드 서열이 특정 MHC 대립유전자의 결합 모티프와 맷칭하는지를 알아내기 위해 위치-특이적인 점수 매트릭스를 이용한다. 또 다른 부류의 MHC 결합 예측 방법은 인공신경 네트워크 또는 서포트 벡터 머신과 같은 머신 학습 기술을 이용한다(도 1 참조). 이러한 알고리듬의 성능은 결합에 대한 예측능을 갖는 기저의 패턴/특성들을 "학습"하기 위한, 각각의 대립유전자 모델 (예컨대 "HLA-A*02:01", "H2-Db" 등)에 대한, 이용가능한 훈련 데이터베이스의 품질과 양에 크게 의존한다. 최근, 커다란 훈련 세트를 필요로 하는 애로사항을 우회하는 구조-기반 방법이 출현하였는데, 이 방법은 예컨대 에너지 최소화에 의해, 펩타이드-MHC 상호반응을 예측하기 위해 오로지 펩타이드-MHC 결정 구조 및 스코어링 기능(예컨대 상이한 에너지 기능)에만 의존한다. (도 1 참조). 그러나, 이러한 접근방식의 정확도는 서열-기반 방법에 비해 한참 뒤쳐진다. 벤치마킹 연구 결과 인공 신경 네트워크 기반 도구 NetMHC (C. Lundegaard 등, Nucleic Acids Research 36, W509 (2008)) 및 매트릭스 기반 알고리듬 SMM (B. Peters, A. Sette, BMC bioinformatics 6, 132 (2005))은 테스트된 평가 데이터에 대해 최상의 실적을 나타냈다 (B. Peters, A. Sette, BMC bioinformatics 6, 132 (2005); H. H. Lin, S. Ray, S. Tongchusak, E. L. Reinherz, V. Brusic, BMC immunology 9, 8 (2008)). 두 가지 접근법 모두 면역 에피토프 데이터베이스에서 이용가능한 소위 IEDB 콘센서스 방법에서 통합된다(Y. Kim 등, Nucleic Acids Research 40, W525 (2012)). 펩타이드-MHC II 결합의 모델링 상호반응은 MHC 1에 대한 것보다 훨씬 더 복잡한데, 이는 MHC II 분자들이 각 사이드의 말단이 개방된 결합 그루브를 가짐으로 해서, 서로 다른 길이의 펩타이드들이 결합할 수 있기 때문이다. MHC I에 대한 펩타이드 결합이 주로 8-12 아미노산으로 제한되는데 반해, MHC II 펩타이드에 대해서는 이 길이가 극적으로 달라질 수 있다 (9-30 아미노산). 최근의 벤치마킹 연구는, 이용가능한 MHC II 예측 방법은 MHC I 예측 방법에 비해 제한된 정확도를 나타냄을 보여준다 (H. H. Lin, S. Ray, S. Tongchusak, E. L. Reinherz, V. Brusic, BMC immunology 9, 8 (2008).

T 세포 에피토프를 발견하기 위한 이들 알고리듬의 최초의 대규모 및 시스템적인 사용은 Moutaftsi 등 (M. Moutaftsi 등, Nature Biotechnology 24, 817 (2006))에 의해 이루어졌는데, 이 방법에서는 백시니아 바이러스에 감염된 C57BL76 마우스들의 가능한 백신 후보를 예측하기 위해 여러가지 도구들을 조합하여, 비장세포를 추출하고 예측된 펩타이드의 상위 1%에 대해 CD8+ T 세포 응답을 측정하였다. 이들은 T 세포 반응을 유도해 낸 49개 (2256개 중)의 펩타이드를 동종하였다. 그 이후로 백신, 주로 병원균, 예컨대 큰리슈만편모충(Leishmania major)에 대한 백신의 후보로서 T 세포 에피토프를 찾아내기 위하여 다양한 MHC 결합 예측 도구를 이용한 많은 연구물이 간행되었다 (C. Herrera-Najera, R. Pina-Aguilar, F. Xacur-Garcia, M. J. Ramirez-Sierra, E. Dumonteil, Proteomics 9, 1293 (2009)). 그러나, 면역원성 예측을 위해 MHC I 결합 예측법만을 단독으로 이용하는 것은 잘못된 결과로 이어질 가능성이 큰데, 이는 이들 도구들은, 주어진 펩타이드가 주어진 MHC 대립유전자에 결합할 잠재능이 있는지를 예측하도록 훈련된 것이기 때문이다. 면역원성 예측을 위해 MHC 결합 예측을 이용하는 근거는 대응하는 MHC 대립유전자에 고친화도로 결합하는 펩타이드가 보다 면역원성이 더 크리라는 추측에 근거한다(A. Sette 등, The Journal of Immunology 153, 5586 (1994)). 그러나, 낮은 MHC 결합 친화도를 갖는 경우에도 높은 면역원성을 야기할 수 있으며 (M. C. Feltkamp, M. P. Vierboom, W. M. Kast, C. J. Melief, Molecular Immunology 31, 1391 (1994)) 및 펩타이드-MHC 안정성이 펩타이드 친화도보다 면역원성에 대해 보다 우수한 예측인자일 수 있음(M. Harndahl 등, European Journal of Immunology 42, 1405 (2012))을 가리키는 연구 결과가 많이 존재한다. 이러한 이유로, 면역원성 예측 성공률이 낮은 것으로부터 반영되는 바와 같이, 면역원성 예측은 이제까지 그다지 정확도가 높지 않았다. 그럼에도 불구하고, 펩타이드 결합은 T 세포 에피토프 인식의 충분조건은 아니라 해도 필요조건이며 효과적인 예측법은 실험적으로 테스트하고자 하는 펩타이드의 수를 극적으로 감소시킬 수 있다.

면역원성 예측 모델을 개발하는데, 흉선내 발달 동안 중앙 관용(central tolerance), 즉 T 세포의 음성 및 양성 선택 뿐만 아니라, T 세포 수용체(TCR)의 인식도 고려하여야 할 필요가 있음은 명백하다.

결합 뿐만 아니라, 에피토프의 면역원성을 정확히 예측하기 위해 전술한 측면들을 모두 모델화할 수 있는 예측 모델이 필요한 실정이다.

일 측면에서, 본 발명은 면역원성 아미노산 변형(immunogenic amino acid modifications)을 예측하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 다음 단계들, 즉:

a) 하나 이상의 MHC 분자들에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수를 확인하는 단계, 및

b) 하나 이상의 MHC 분자에 대한 비변형 펩타이드의 결합 점수를 확인하는 단계,

및/또는

c) 변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체 내에 존재할 경우 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 그 변형된 펩타이드의 결합 점수를 확인하는 단계

를 포함한다.

일 구체예에서, 변형된 펩타이드는 변형된 단백질의 단편을 포함하는데, 상기 단편은 그 단백질에 존재하는 변형(들)을 포함한다. 일 구체예에서, 비변형 펩타이드 또는 단백질은 변형된 펩타이드 또는 단백질 내의 변형(들)의 위치(들)에 대응하는 위치(들)에서 생식세포 아미노산(germline amino acid)를 갖는다.

일 구체예에서, 비변형 펩타이드 또는 단백질와 변형된 펩타이드 또는 단백질은 변형(들)을 제외하고는 상호 동일하다. 좋기로는, 비변형 펩타이드 또는 단백질과 변형된 펩타이드 또는 단백질은 동일한 길이 및/또는 서열을 갖는 것이 바람직하다 (변형(들))을 제외하고).

일 구체예에서, 비변형 펩타이드 및 변형된 펩타이드는 길이가 8 내지 15, 좋기로는 8 내지 12개 아미노산이다.

일 구체예에서, 하나 이상의 MHC 분자는 상이한 MHC 분자 유형, 특히 상이한 MHC 대립유전자들을 포함한다. 일 구체예에서, 하나 이상의 MHC 분자는 MHC 클래스 I 분자 및/또는 MHC 클래스 II 분자이다. 일 구체예에서, 하나 이상의 MHC 분자는 어떤 개체의 MHC 대립유전자 세트 또는 그의 서브세트와 같은 MHC 대립유전자 세트를 포함한다.

일 구체예에서, 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 점수는 MHC-결합 모티프의 데이터베이스와의 서열 비교를 포함하는 프로세스에 의해 확인한다.

일 구체예에서, 단계 a)는 상기 점수가 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합의 소정의 역치(threshold)를 만족하는지를 확인하는 것을 포함하고 및/또는 단계 b)는 상기 점수가 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합의 소정의 역치를 만족하는지를 확인하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 단계 a)에 적용되는 역치는 단계 b)에 적용되는 역치와 다르다. 일 구체예에서, 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합의 소정의 역치는 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 가능성을 반영한다.

일 구체예에서, 하나 이상의 T 세포 수용체는 개체의 T 세포 수용체 세트 또는 그의 서브세트와 같은 T 세포 수용체 세트를 포함한다. 일 구체예에서, 단계 c)는 상기 T 세포 수용체 세트가 비변형 펩타이드에 결합하는 T 세포 수용체를, MHC-펩타이드 복합체 내에 존재할 경우, 포함하지 않는 것으로 상정하고 및/또는 비변형 펩타이드에 결합하는 T 세포 수용체를, 고친화도로 MHC-펩타이드 복합체 내에 존재할 경우, 포함하지 않는 것으로 상정하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, 하나 이상의 MHC 분자에 대한 비변형 펩타이드의 결합 점수가, 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합을 가리키는 역치를 만족하고, 하나 이상의 MHC 분자에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수가 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합을 가리키는 역치를 만족하면, 그 변형 또는 변형된 펩타이드는, 만일 당해 비변형 및 변형된 아미노산이 이화학적으로 비유사함을 가리키는 역치를 만족하는 이화학적 유사성 점수를 갖는다면, 면역원성인 것으로 예측된다.

일 구체예에서, 비변형 펩타이드가 하나 이상의 MHC 분자에 결합하거나 또는 하나 이상의 MHC 분자에 결합할 확률이 있고 변형된 펩타이드가 하나 이상의 MHC 분자에 결합하거나 또는 하나 이상의 MHC 분자에 결합할 확률이 있으면, 그 변형 또는 변형된 펩타이드는, 만일 당해 비변형 및 변형된 아미노산이 이화학적으로 비유사하거나 또는 이화학적으로 비유사할 가능성이 있다면, 면역원성인 것으로 예측된다.

일 구체예에서, 변형은 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합을 위한 앵커 위치에서 일어나지 않는다.

일 구체예에서, 만일 하나 이상의 MHC 분자에 대한 비변형 펩타이드의 결합 점수가, 하나 이상의 MHC 분자에 대한 무결합(no binding)을 가리키는 역치를 만족하고 하나 이상의 MHC 분자에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수가 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합을 가리키는 역치를 만족하면, 그 변형 또는 변형된 펩타이드는 면역원성인 것으로 예측된다.

일 구체예에서, 만일 비변형 펩타이드는 하나 이상의 MHC 분자에 결합하지 않거나 하나 이상의 MHC 분자에 대해 결합하지 않을 확률을 갖고 변형된 펩타이드는 하나 이상의 MHC 분자에 결합하거나 또는 하나 이상의 MHC 분자에 대해 결합할 확률을 가지면, 그 변형 또는 변형된 펩타이드는 면역원성인 것으로 예측된다.

일 구체예에서, 변형은 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합을 위한 앵커 위치에서 일어난다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 단계 a)를 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들에 대해 수행하는 것을 포함하되, 상기 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들은 동일한 변형(들)을 포함하는 것이다. 일 구체예에서, 동일한 변형(들)을 포함하는 상기 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들은 변형된 단백질의 상이한 단편들을 포함하되, 상기 상이한 단편들은 그 단백질에 존재하는 동일한 변형(들)을 포함하는 것이다. 일 구체예에서, 동일한 변형(들)을 포함하는 상기 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들은 변형된 단백질의 가능한 모든 MHC 결합 단편들을 포함하되, 상기 단편들은 그 단백질에 존재하는 동일한 변형(들)을 포함하는 것이다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 MHC 분자에 대하여 결합할 확률을 갖거나 또는 가장 높은 확률을 갖는 동일한 변형(들)을 포함하는 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들로부터 (그) 변형된 펩타이드(들)을 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 동일한 변형(들)을 포함하는 상기 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들은 변형(들)의 위치 및/또는 길이를 달리한다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 단계 a) 및 임의로 단계 b) 및 c) 중 한 단계 또는 두 단계 모두를 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들에 대하여 수행하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들은 동일한 변형(들) 및/또는 상이한 변형들을 포함한다. 일 구체예에서, 상이한 변형들은 동일한 단백질 및/또는 상이한 단백질에 존재한다. 단계 a) 및 임의로 단계 b) 및 c) 중 한 단계 또는 두 단계 모두에서 사용되는 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들의 세트는 동일 또는 상이할 수 있다. 일 구체예에서, 단계 b) 및/또는 단계 c)에서 사용되는 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들의 세트는 단계 a)에서 사용되는 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들의 세트의 서브세트이다. 좋기로는, 상기 서브세트는 단계 a)에서 최고의 점수를 낸 펩타이드(들)을 포함하는 것이 바람직하다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 2개 이상의 상기 상이한 변형된 펩타이드들의 점수를 비교하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 2개 이상의 상기 상이한 변형된 펩타이드들의 순위를 정하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 하나 이상의 MHC 분자에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수는, 변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체에 존재할 경우, 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수, 좋기로는 비변형 아미노산과 변형된 아미노산 간의 이화학적 유사성 점수보다 더 높은 비중을 가지며, 변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체에 존재할 경우, 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수, 좋기로는 비변형 아미노산과 변형된 아미노산 간의 이화학적 유사성 점수는 하나 이상의 MHC 분자들에 대한 비변형 펩타이드의 결합 점수보다 더 높은 비중을 갖는다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 단백질-코딩 영역에서 비유사 돌연변이(non-synonymous 돌연변이s)를 동정하는 것을 더 포함한다.

일 구체예에서, 변형은 하나 이상의 암 세포 및 임의로 하나 이상의 비암 세포와 같은 하나 이상의 세포의 게놈 또는 트랜스크립톰(transcriptome)을 부분적으로 또는 완전히 시퀀싱(서열분석)하여 하나 이상의 단백질-코딩 영역 내의 돌연변이를 동정함으로써 동정된다.

일 구체예에서, 상기 돌연변이는 체세포 돌연변이이다. 일 구체예에서, 상기 돌연변이는 암 돌연변이이다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 백신 제조에 이용된다. 일 구체예에서, 상기 백신은 본 발명의 방법에 의해 면역원성인 것으로 예측된 변형(들) 또는 변형된 펩타이드(들)로부터 유래한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 다음 단계, 즉:

본 발명의 방법에 의해 면역원성인 것으로 예측된 변형(들) 또는 변형된 펩타이드(들)을 동정하는 단계

를 포함하는, 백신의 제조 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 상기 방법은 다음 단계, 즉:

면역원성인 것으로 예측된 변형(들) 또는 변형된 펩타이드(들)을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 백신을 제공하는 단계

를 더 포함한다.

추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 수득가능한 백신을 제공한다. 이러한 백신의 바람직한 구체예는 후술된다.

본 발명에 따라 제공된 백신은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있고 임의로 1종 이상의 아쥬반트, 안정화제 등을 포함할 수 있다. 백신은 치료용 백신 또는 예방적 백신의 형태일 수 있다.

또 다른 측면은 환자에게 본 발명에 따라 제공되는 백신을 투여하는 것을 포함하는, 환자에 있어서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면은 다음 단계들, 즉:

(a) 본 발명에 따른 방법에 의한 백신을 제공하는 단계; 및

(b) 환자에게 상기 백신을 투여하는 단계

를 포함하는, 암 환자의 치료 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면은 본 발명에 따른 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 환자의 치료 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 설명된 치료 방법, 특히 암의 치료 또는 예방에 사용되기 위한, 본 명세서에 설명된 백신을 제공한다.

본 명세서에 설명된 암의 치료는 외과학적 절제 및/또는 방사능치료 및/또는 전통적인 화학요법과 조합될 수 있다.

본 발명의 그 밖의 특장점들은 이하의 상세한 설명과 청구범위로부터 자명하다

이하에 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약들로 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 또한 본 명세서에 사용된 용어들은 어디까지나 특정 구체예를 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 해석되어서는 아니되며 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 한정되는 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 통상의 기술자에게 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

이하에서, 본 발명의 요소들을 설명한다. 이 구성 요소들은 특정 구체예와 함께 리스트되지만, 이들은 여하한 방식 및 여하한 횟수로든 조합되어 부가적인 구체예를 생성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양한 실시예와 바람직한 구체예들은 다양하게 설명된 실시예와 바람직한 구체예들은 본 발명을 단지 명시적으로 설명된 구체예들만으로 한정짓는 것으로 해석되어서는 아니된다. 이 설명은 명시적으로 설명된 구체예들과 여하한 수의 개시된 및/또는 바람직한 구성 요소들을 조합하는 구체에들을 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 뿐만 아니라, 이 출원의 모든 설명된 구성요소들의 여하한 순열 및 조합들 역시 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.

좋기로는, 본 명세서에 사용된 용어들은 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 및 H. Koebl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 설명된 바와 같이 정의된다.

본 발명을 실시하는데 있어서는 달리 설명되지 않는 한, 이 기술분야의 문헌 (cf., 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook 외 eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)에서 설명되는 화학, 생화학, 세포생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 상법이 이용될 것이다.

이하의 상세한 설명과 청구범위에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한 "포함하다(comprise)" 및 그의 변형어들 예컨대 "comprises" 및 "comprising"은 명시된 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹을 포괄하되, 비록 몇몇 구체예에서는 다른 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹이 배제될 수도 있지만, 다른 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹이 배제되는 것은 아니다, 즉, 본 발명의 청구대상은 명시된 멤버, 정수 또는 단계 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 그룹들을 포함한다. 본 발명을 설명함에 있어 문맥상 사용된 관사 "a" 및 "an" 및 "the" 그리고 이와 유사한 참조 용어들(특히 청구범위 문맥상)은 달리 언급되거나, 반대 의미를 갖는 것이 명백하지 않은 한, 단복수를 아우르는 것이다.

본 발명의 값들을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위에 속하는 각각의 분리된 값들을 개별적으로 손쉽게 칭하기 위한 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 각각의 개별적인 값은 본 명세서에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 인용된 것으로 간주된다. 본 발명에 설명된 모든 방법들은 달리 언급하거나 문맥상 모순되지 않는 한, 적절한 순서로 실시될 수 있다. 본 명세서에 제공된 여하한 그리고 모든 예시 또는 예시적 언어 (예컨대 "와 같은")는 본 발명을 좀 더 잘 설명하기 위해 의도된 것으로, 본 발명의 범위를 달리 한정지으려는 것이 아니다. 명세서 내의 어떠한 언어도 청구되지 않은 구성요소를 본 발명을 실시하는데 필수적인 것으로 가리키는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 발명의 명세서 전반에 걸쳐 몇 가지 문헌들이 인용된다. 인용된 이들 각각의 상기 또는 하기 문헌들 (모든 특허, 특허출원, 과학간행물, 제조업체의 설명서, 지침서 등)은 모두 그 내용 전체가 본 발명에 참조 병합된다. 이들 언급된 문헌들 중 어느 것도 선행발명임을 이유로, 본 발명이 그러한 개시내용에 선행한다고 하지 못함을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 발명에서, 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 공유적으로 연결된 2 이상, 좋기로는 3 이상, 좋기로는 4 이상, 좋기로는 6 이상, 좋기로는 8 이상, 좋기로는 10 이상, 좋기로는 13 이상, 좋기로는 16 이상, 좋기로는 21 이상 및 좋기로는 최대 8, 10, 20, 30, 40 또는 50, 특히 100 아미노산을 포함하는 물질을 가리킨다. 용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 커다란 펩타이드, 좋기로는 100개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드를 가리키지만, 일반적으로 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 동의어이며 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.

본 발명에서, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질와 관련하여 용어 "변형(modification)"은 야생형 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 서열과 같은 모(parental) 서열과 비교시 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 내의 서열 변화에 관한 것이다. 이 용어는 아미노산 삽입 변이, 아미노산 부가 변이, 아미노산 결실 변이 및 아미노산 치환 변이를 포함하며, 좋기로는 아미노산 치환 변이가 바람직하다. 본 발명에 따른 이들 모든 서열 변화는 잠재적으로 새로운 에피토프를 만들어낼 수 있다.

아미노산 삽입 변이는 특정 아미노산 서열에 단일 또는 2 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다.

아미노산 부가 변이는 1 이상의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 융합을 포함한다.

아미노산 결실 변이는 1 이상의 아미노산, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 아미노산이 그 서열로부터 제거되는 것에 의해 특징지어진다.

아미노산 치환 변이는 서열 중 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입되는 것에 의해 특징지어진다.

본 발명에서, 본 발명의 방법에서 테스트되기 위해 사용되는 변형 또는 변형된 펩타이드는 변형을 포함하는 단백질로부터 유도될 수 있다.

용어 "유래된(derived)"은 본 발명에서 특정 엔터티(entity) 특히 특정 펩타이드 서열이 그것이 유래한 대상 내에 존재하는 것을 의미한다. 아미노산 서열의 경우, 특히, 특정 서열 영역에서, 특히 "유래된"이라는 의미는 당해 아미노산 서열이 그것이 존재하는 아미노산 서열로부터 유래됨을 의미한다.

본 발명의 방법에서 테스트되는데 사용된 변형 또는 변형된 펩타이드가 유래될 수 있는 변형을 포함하는 단백질은 신생항원일 수 있다.

본 발명에서, 용어 "신생항원(neoantigen)"은 모 펩타이드 또는 단백질에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 펩타이드 또는 단백질에 관계된다. 예를 들어, 신생항원은 종양-관련 신생항원일 수 있는데, 여기서 용어 "종양-관련 신생항원"은 종양-특이 돌연변이로 인해 아미노산 변형을 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 포함한다.

본 발명에서, 용어 "종양-특이 돌연변이" 또는 "암-특이 돌연변이"는 종양 또는 암 세포의 핵산에는 존재하나, 대응하는 정상 세포, 즉 비-종양 또는 비-암 세포의 핵산에는 부재하는 체세포 돌연변이에 관계된다. 용어 "종양-특이 돌연변이" 및 "종양 돌연변이" 및 용어 "암-특이 돌연변이" 및 "암 돌연변이"는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.

용어 "면역 반응(immune response)"은 항원과 같은 표적에 대한 통합적인 신체 반응을 가리키며 좋기로는 세포성 면역 반응 또는 세포성 및 체액성 면역 반응을 가리킨다. 면역 반응은 보호적/예방적/진단적 및/또는 치료적일 수 있다.

"면역 반응을 유도하는"이라 함은 유도 전에는 면역 반응이 없었음을 가리킬 수 있으나, 유도 전에 일정 수준의 면역 반응이 있었고 유도 후 상기 면역 반응이 증강된 것을 의미할 수도 있다. 따라서, "면역 반응을 유도하는"은 "면역 반응을 증강하는"의 의미도 포함한다. 좋기로는, 어떤 대상자에서 면역 반응 유도 후, 상기 대상자는 암 질환과 같은 질환의 발병으로부터 보호되거나 또는 면역 반응의 유도에 의해 그 질환 상태가 경감된다. 예를 들어, 종양-발현 항원에 대한 면역 반응이 암 질환에 걸린 환자 또는 암 질환에 걸릴 위험이 있는 대상자에서 유도될 수 있다. 이 경우 면역 반응의 유도는 그 대상자의 질환 상태가 경감되고, 그 대상자에서 전이가 일어나지 않거나 또는 암 질환에 걸릴 위험이 있는 대상자가 암 질환에 걸리지 않음을 의미할 수 있다.

"세포성 면역 반응(cellular immune response)" 및 "세포성 반응(cellular response)" 또는 이와 유사한 용어들은 "헬퍼" 또는 "킬러"로서 작용하는 T 세포 또는 T-림프구와 연관된 클래스 I 또는 클래스 II MHC에 의한 항원의 제시에 의해 특징지어지는 세포에 지향된 면역 반응을 가리킨다. 헬퍼 T 세포(CD4⁺ T 세포라고도 칭해짐)는 면역 반응을 조절하는 중추적 역할을 하고 킬러 세포(세포독성 T 세포, 세포용해 T 세포, CD8⁺ T 세포 또는 CTLs이라고도 칭해짐)는 암 세포와 같은 질병 세포를 살해하여, 보다 질병 상태의 세포의 생성을 방지한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 종양-발현 항원을 발현하는 종양 세포에 대한 항종양 CTL 반응의 자극, 및 좋기로는 클래스 I MHC에 의해 이러한 종양-발현 항원을 제시하는 것을 포함한다.

본 발명에서 "항원"은 항체 또는 T-림프구 (T 세포)와의 특이 반응과 같은 면역 반응의 표적 및 또는 그러한 면역 반응을 유도하는, 여하한 모든 물질, 좋기로는 펩타이드 또는 단백질을 포괄한다. 좋기로는, 항원은 T 세포 에피토프와 같은 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 좋기로는, 본 발명의 관점에서 항원은 임의로 프로세싱 후, 좋기로는 그 항원에 특이적인 면역 반응을 유도하는 분자이다 (항원을 발현하는 세포를 포함함). 항원 또는 그의 T 세포 에피토프는 세포, 좋기로는 질병 세포, 특히 암 세포를 포함하는 항원 제시 세포에 의해 MHC 분자 관점에서 제시되어 항원(항원을 발현하는 세포를 포함)에 대해 면역 반응을 일으키는 것이 좋다.

일 구체예에서, 항원은 종양 항원(본 발명에서 종양-발현 항원이라 칭해짐),즉 세포질, 세포 표면 또는 세포 핵, 특히 종양 세포의 표면 항원으로서 또는 일차로 세포내에서 일어나는 것들로부터 유래될 수 있는. 종양 세포에서 발현되는 단백질 또는 펩타이드와 같은 종양 세포의 일부이다. 예를 들어, 종양 항원은 배아암종 항원, α1-태아단백질, 이소페리틴 및 태아 설포당단백질, α2-H-철단백질 및 γ-태아단백질을 포함한다. 본 발명에 따라, 종양 항원은 좋기로는 종양 또는 암 뿐 아니라 종양 세포 또는 암 세포에서 발현되고 임의로 이들과 관련하여 종류 및/또는 발현 수준이 특징적인 여하한 항원, 즉 종양-관련 항원을 모두 포괄한다. 일 구체예에서, 용어 "종양-관련 항원(tumor-associated antigen)"은 정상 조건 하에서는 제한된 수의 조직 및/또는 장기에서 또는 특별한 발달 단계에서 발현되는 단백질에 관한 것으로서, 예컨대, 종양-관련 항원은 정상 조건 하에서 위 조직, 좋기로는 위점막, 생식기관 예컨대 고환, 영양막 조직 예컨대 태반 또는 생식세포에서 특이적으로 발현되고, 및 1종 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현되는 것이다. 이러한 맥락에서 "제한된 수"는 좋기로는 3 이하, 좋기로는 2 이하를 의미한다. 본 발명의 관점에서 종양 항원의 예로는 분화 항원, 좋기로는 세포 종류 특이 분화 항원, 즉, 정상 조건 하에서는 특정 분화 단계에서 특정 세포 유형으로서 특이적으로 발현되는 단백질, 암/고환 항원, 즉 정상 조건 하에서 고환 및 때로는 태반에서 특이적으로 발현되는 단백질 및 생식세포 특이 항원을 들 수 있다. 좋기로는, 종양 항원 또는 종양 항원의 비정상적인 발현은 암 세포를 동정한다. 본 발명의 문맥 상, 대상자, 예컨대 암 질환에 걸린 환자의 암 세포에 의해 발현되는 종양 항원은 좋기로는 상기 대상자의 자가-단백질(self-protein)이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 문맥 상 종양 항원은 정상 조건 하에서는 비필수적인 조직 또는 장기, 즉 면역계에 의해 손상된 경우에도 대상자의 사망을 초래하지 않는 조직 또는 장기, 또는 면역계에 의해 접근 불가하거나 접근하기 어려운 체내 장기 또는 구조물에서 특이적으로 발현된다.

본 발명에서, 용어 "종양 항원", "종양-발현 항원", "암 항원" 및 "암-발현 항원"은 동등하게 그리고 호환적으로 사용된다.

용어 "면역원성(immunogenicity)"은 좋기로는 암에 대한 치료와 같은 치료와 연관된 면역 반응을 유도하는 상대적 효능에 관한 것이다. 본 발명에서, 용어 "면역원성(immunogenic)"은 면역원성을 갖는 특성에 관한 것이다. 예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 관련한 문맥에서 사용되는 "면역원성 변형(immunogenic modification)"이라는 용어는 상기 변형에 의해 야기되고/야기되거나 상기 변형에 지향된 면역 반응을 유도하는 상기 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 효능에 관한 것이다. 좋기로는, 비변형 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 면역 반응을 유도하지 않고, 다른 면역 반응을 유도하거나 또는 상이한 수준, 좋기로는 낮은 수준으로 면역 반응을 유도하는 것이 바람직하다.

용어 "주조직적합 복합체(major histocompatibility complex)" 및 약어 "MHC"는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함하며 모든 척추동물에서 일어나는 유전자 복합체에 관련된다. MHC 단백질 또는 분자는 면역 반응에서 림프구와 항원 제시 세포 또는 병에 걸린 세포 간의 시그널링에 있어서 중요하며, 여기서 MHC 단백질 또는 분자는 펩타이드와 결합하여 이들을 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 제시한다. MHC에 의해 코딩된 단백질들은 세포 표면에서 발현되어, 자가 항원(그 세포 자체로부터의 펩타이드 단편) 및 비자기 항원(예컨대 침입 미생물로부터의 단편) 두 가지 모두를 T 세포에 대해 나타낸다.

MHC 영역은 3 가지 서브그룹, 즉 클래스 I, 클래스 II , 및 클래스 II I로 구분된다. MHC 클래스 I 단백질은 α-사슬 및 β2-마이크로글로불린(15번 염색체에 의해 코딩된 MHC의 일부가 아님)을 함유한다. 이들은 세포독성 T 세포에 항원 단편을 제시한다. 대부분의 면역계 세포 상에서, 특히 항원-제시 세포 상에서, MHC 클래스 II 단백질은 α- 및 β-사슬을 함유하고 이들은 항원 단편을 T-헬퍼 세포에 제시한다. MHC 클래스 II I 영역은 보체 성분 및 사이토카인을 코딩하는 것들과 같은, 다른 면역 성분을 코딩한다.

MHC는 다유전자성(polygenic) (몇몇 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 유전자들이 있음)이면서 다형성(polymorphic) (각 유전자마다 복수의 대립유전자들이 있음)이다.

본 발명에서, 용어 "일배체형(haplotype)"은 하나의 염색체와 그에 의해 코딩된 단백질 상에서 발견되는 HLA 대립유전자를 가리킨다. 일배체형은 또한 MHC 내의 어떤 여하한 위치에 존재하는 대립유전자를 가리킬 수도 있다. MHC의 각 클래스는 몇몇 위치에 의해 나타내진다: 예컨대, 클래스 I의 경우 HLA-A (Human Leukocyte Antigen-A), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P 및 HLA-V 그리고 클래스 II 의 경우 HLA-DRA, HLA-DRB1-9, HLA-, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1 , HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, 및 HLA-DOB. 용어 "HLA 대립유전자" 및 "MHC 대립유전자"는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다.

MHCs는 매우 강한 다형성을 나타낸다. 인간 집단에서 각 유전자 자리마다, 구별되는 대립유전자를 포함하는 많은 수의 일배체형들이 존재한다. 클래스 I 및 클래스 II 두가지 모두의 상이한 다형성 MHC 대립유전자들은 상이한 펩타이드 특이성을 갖는다: 각 대립유전자는 특정 서열 패턴을 나타내는 펩타이드와 결합하는 단백질을 코딩한다.

본 발명의 모든 측면의 바람직한 일 구체예에서 MHC 분자는 HLA 분자이다.

본 발명의 문맥 상, 용어 "MHC 결합 펩타이드"는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 결합 펩타이드를 생산하도록 프로세싱될 수 있는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 결합 펩타이드 또는 펩타이드를 포함한다. 클래스 I MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합 펩타이드는 일반적으로 8-12, 좋기로는 8-10 아미노산 길이이지만 이보다 길거나 짧은 펩타이드가 효과적일 수도 있다. 클래스 II MHC/펩타이드 복합체의 경우, 결합 펩타이드는 대체로 9-30, 좋기로는 10-25 아미노산 길이, 특히 13-18 아미노산 길이이며, 이보다 길거나 짧은 펩타이드가 효과적일 수도 있다.

만일 펩타이드가 직접 즉 프로세싱 없이, 특히 절단 없이 제시되는 경우, 그 길이는 MHC 분자, 특히 클래스 I MHC 분자에 결합하기에 적당한 길이, 및 좋기로는 7-30 아미노산 길이, 예컨대 7-20 아미노산 길이, 더욱 좋기로는 7-12 아미노산 길이, 더더욱 좋기로는 8-11 아미노산 길이, 특히 9 또는 10 아미노산 길이이다.

만일 펩타이드가 부가적인 서열을 포함하는 보다 큰 엔터티, 예컨대 백신 서열 또는 폴리펩타이드의 일부이고, 프로세싱 특히 절단 후에 제시되는 경우, 프로세싱에 의해 생산되는 그 펩타이드의 길이는 MHC 분자, 특히 클래스 I MHC 분자에 결합하기에 적당한 길이, 및 좋기로는 7-30 아미노산 길이, 예컨대 7-20 아미노산 길이, 더욱 좋기로는 7-12 아미노산 길이, 더더욱 좋기로는 8-11 아미노산 길이, 특히 9 또는 10 아미노산 길이이다. 좋기로는, 프로세싱 후에 제시될 펩타이드의 서열이 백신접종에 사용된 폴리펩타이드나 항원의 아미노산 서열로부터 유래되는 것이 바람직하다. 즉, 그의 서열이 실질적으로 그 항원 또는 폴리펩타이드의 단편에 실질적으로 상응하고, 좋기로는 완전히 동일한 것이 바람직하다.

따라서, 일 구체예에서 MHC 결합 펩타이드는 항원의 단편에 실질적으로 상응하고 좋기로는 완전히 동일한 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

용어 "에피토프"는 항원과 같은 분자 내의 항원 결정기(antigenic determinant), 즉 면역계, 예컨대 T 세포에 의해 인식되는, 특히 MHC 분자 맥락에서 제시될 경우, 면역계에 의해 인식되는 분자의 일부 또는 단편을 가리킨다. 종양 항원과 같은 단백질의 에피토프는 좋기로는 상기 단백질의 연속 또는 불연속 부분을 포함하며 좋기로는 그 길이가 5 내지 100, 좋기로는 5 내지 50, 더욱 좋기로는 8 내지 30, 가장 좋기로는 10 내지 25 아미노산 길이로서, 예컨대 에피토프는 좋기로는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명의 문맥 상 에피토프는 T 세포 에피토프인 것이 특히 바람직하다.

본 발명에서 에피토프는 세포 표면에서 MHC 분자와 같은 MHC 분자에 결합할 수 있으며 따라서, "MHC 결합 펩타이드"일 수 있다/

본 발명에서 용어 "네오-에피토프(neo-epitope)"는 정상적인 비암 세포 또는 생식세포와 같은 레퍼런스에서는 존재하지 않지만 암 세포에서는 발견되는 에피토프를 가리킨다. 여기에는 특히, 정상적인 비암 세포 또는 생식세포에서는 대응하는 에피토프가 발견되지만, 암 세포에서의 1 이상의 돌연변이로 인해, 에피토프의 서열이 변화되어 네오-에피토프가 야기되는 상황도 포함된다.

본 발명에서, "T 세포 에피토프"라는 용어는 T 세포 수용체에 의해 인식되는 배열(configuration)에서 MHC 분자에 결합하는 펩타이드를 가리킨다. 일반적으로, T 세포 에피토프는 항원-제시 세포의 표면에 존재한다.

본 발명에서, "T 세포 에피토프를 예측하다(predicting T cell epitopes)"라는 표현은 어떤 펩타이드가 MHC 분자에 결합하여 T 세포 수용체에 의해 인식될 지를 예측하는 것을 가리킨다. "T 세포 에피토프를 예측하다"라는 표현은 기본적으로 "펩타이드가 면역원성인지를 예측하다"라는 문구와 동의어이다.

본 발명에서, T 세포 에피토프는 백신에서 하나 보다 많은 T 세포 에피토프를 포함하는 백신 서열 및/또는 폴리펩타이드와 같은 보다 큰 엔터티의 일부로서 존재할 수 있다. 제시된 펩타이드 또는 T 세포 에피토프는 적절한 프로세싱 후에 생산된다.

T 세포 에피토프는 TCR 인식 또는 MHC에 대한 결합에 필수적이지 않은 하나 이상의 잔기에서 변형될 수 있다. 이러한 변형된 T 세포 에피토프는 면역적으로 동등한 것으로 고려될 수 있다.

좋기로는, MHC에 의해 제시되어 T 세포 수용체에 의해 인식될 경우 T 세포 에피토프는 적절한 공통-자극 시그널의 존재 하에, 그 펩타이드/MHC 복합체를 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체를 지니는 T 세포의 클론 확장(clonal expansion)을 유도할 수 있는 것이 바람ㄹ직하다.

좋기로는, T 세포 에피토프는 어떤 항원 단편의 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 좋기로는, 상기 항원 단편은 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 제시된 펩타이드인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 T 세포 에피토프는 좋기로는 면역 반응을 자극할 수 있는 항원의 일부 또는 단편, 좋기로는 그 항원의 발현 및 좋기로는 질병 세포 특히 암 세포와 같은 항원의 제시에 의해 특징지어지는 항원이나 세포에 대한 세포 반응을 자극할 수 있는 항원의 일부 또는 단편에 관한다. 좋기로는 T 세포 에피토프는 클래스 I MHC에 의한 항원 제시에 의해 특징지어지는 세포에 대한 세포성 반응을 자극할 수 있는 것이 바람직하고 좋기로는 항원-반응성 세포독성 T-림프구(CTL)을 자극할 수 있는 것이 바람직하다.

"항원 프로세싱" 또는 "프로세싱"은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이 상기 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 단편인 프로세션 산물로 분해되어(예컨대 폴리펩타이드가 펩타이드로 분해되는 것) 이들 단편들의 하나 이상이 (예컨대 결합을 통해) 세포, 좋기로는 항원 제시세포에 의해 특이 T 세포에 제시되도록 MHC분자와 hgl합하는 것을 의미한다.

"항원 제시 세포(Antigen presenting cells)" (APC)는 그의 세포 표면에서 MHC 분자와 회합하여 단백질 항원의 펩타이드 단편을 제시하는 세포이다. 몇몇 APC는 항원 특이 T 세포를 활성화시킬 수 있다.

프로페셔널 항원-제시 세포는 대식작용 또는 수용체-매개된 세포내이입에 의해 항원을 내면화시키는데 매우 효과적이며 이어서 항원의 단편을 제시하여 그의 막 상에서 클래스 II MHC 분자에 결합한다. T 세포는 항원-제시 세포의 막 상에서 항원-클래스 II MHC 분자를 인식하여 상호반응한다. 이어서 항원-제시 세포에 의해 부가적인 공통-자극 시그널이 생성되어, T 세포의 활성화로 이어진다. 공통-자극 분자의 발현은 프로페셔널 항원-제시 세포의 특성을 규정한다.

프로페셔널 항원-제시 세포의 주요 유형은 수지상 세포로서 가장 광범한 항원 제시를 나타내며, 아마도 가장 중요한 항원-제시 세포, 대식세포, B-세포, 및 특정한 활성화된 상피세포이다. 수지상 세포 (DCs)는 말초 조직에서 포획된 항원을 MHC 클래스 II 및 I 항원 제시 경로 두 가지 모두를 경유하여 T 세포에 대해 제시하는 백혈구 모집단이다. 수지상 세포가 면역 반응의 강력한 유도자이고 이들 세포의 활성화가 항종양 면역을 유도하는데 있어 핵심 단계라는 것은 익히 알려져 있다. 수지상 세포는 편의상 "미숙" 및 "성숙" 세포로 분류되는데, 이들은 두 가지 잘 특징화된 표현형을 구별짓는 간단한 방법으로 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 명명법이 분화의 가능한 모든 중간 단계들을 배제하는 것으로 추정되어서는 아니된다. 미숙 수지상 세포는 항원 흡수(uptake) 및 프로세싱 능력이 높은 항원 제시 세포로서 특징지어지며, Fcγ 수용체 및 만노스 수용체의 고발현과 연관된다. 성숙 표현형은 일반적으로 이들 마커들을 보다 낮은 정도로 발현하지만, 클래스 I 및 클래스 II MHC, 부착 분자 (예컨대 CD54 및 CD11) 및 공통자극 분자 (예컨대, CD40, CD80, CD86 및 4-1 BB)와 같은 T 세포 활성화에 책임이 있는 세포 표면 분자는 고발현시킨다는 특징이 있다. 미숙 수지상 세포에 의한 제시는 관용(tolerance)을 야기하는 반면, 수지상 세포 성숙은, 그러한 항원-제시 수지상 세포가 T 세포 프라이밍으로 이끄는 수지상 세포 활성화 상태로서 칭해진다. 수지상 세포 성숙은 주로 선천적인 수용체(박테리아 DNA, 바이러스 RNA, 내독소 등), 전염증성 사이토카인(TNF, IL-1, IFNs), CD40L에 의한 수지상 세포 표면 상의 CD40의 접합 및 스트레스성 세포 사멸을 수행하는 세포로부터 방출된 물질)에 의해 검출되는 미생물 특성을 갖는 바이오분자에 의해 주로 야기된다. 수지상 세포는 골수 세포를 시험관내에서 사이토카인 예컨대 과립구-대식세포 콜로니-자극인자(GM-CSF) 및 종양괴사인자 α와 함께 배양함으로써 파생될 수 있다.

비-프로페셔널 항원-제시 세포는 나이브 T 세포와의 상호반응에 요구되는 MHC 클래스 II 단백질을 구조적으로 발현하지 않는다; 이들은 IFNγ와 같은 특정 사이토카인에 의한 비-프로페셔널 항원-제시 세포의 자극에 의해서만 발현된다.

항원 제시 세포에는 제시하고자 하는 펩타이드 또는 그 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 예컨대 백신접종에 사용되는 폴리펩타이드 또는 항원을 코딩하는 핵산 좋기로는 RNA에 의해 세포를 형질도입함으로써, MHC 클래스 I 제시된 펩타이드가 로딩될 수 있다.

몇몇 구체예에서, 수지상 또는 기타 항원 제시 세포를 표적화하는 핵산 전달 비히클을 포함하는 백신 또는 의약 조성물을 환자에게 투여하여, 생체내에서 일어나는 트랜스펙션을 야기할 수 있다. 수지상 세포의 생체내 트랜스펙션은 예컨대, 일반적으로 공지 방법, 에컨대 WO 97/24447에 개시된 방법, 또는 Mahvi 등의 문헌 [Immunology and Cell Biology 75: 456-460, 1997]에 설명된 유전자 총 접근방식을 이용하여 수행가능하다.

본 발명에서, 용어 "항원 제시 세포(antigen presenting cell)"은 표적 세포도 포함한다.

"표적 세포(target cell)"는 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응에 대한 표적인 세포를 의미한다. 표적 세포는 항원을 제시하는 세포, 즉 항원으로부터 유래된 펩타이드 단편을 포함하고, 암 세포와 같은 바람직하지 못한 여하한 세포를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 표적 세포는 본 발명에서 설명된 항원을 발현하는 세포이며 좋기로는 클래스 I MHC에 의해 상기 항원을 제시하는 것이 바람직하다.

용어 "일부(portion)"은 분획(fraction)을 칭한다. 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 특정 구조에서, 용어 그의 "일부"는 상기 구조의 연속적 또는 불연속적 분획을 가리키는 것일 수 있다. 좋기로는, 아미노산 서열의 일부는 상기 아미노산 서열의 아미노산의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 좋기로는 적어도 40%, 좋기로는 적어도 50%, 더욱 좋기로는 적어도 60%, 더욱 좋기로는 적어도 70%, 더더욱 좋기로는 적어도 80%, 및 가장 좋기로는 적어도 90%를 포함하는 것이 바람직하다. 좋기로는, 만일 상기 일부가 상기 불연속적 분획인 경우, 상기 불연속적 분획은 그 구조의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 부분들로 구성되되, 각각의 부분은 그 구조의 연속적 요소인 것이 바람직하다. 예를 들어, 아미노산 서열의 불연속적 분획은 상기 아미노산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상, 좋기로는 4개 이하의 부분으로 구성될 수 있고, 여기서 각각의 부분은 좋기로는 상기 아미노산 서열의 적어도 5개의 연속 아미노산, 적어도 10개의 연속 아미노산, 좋기로는 적어도 20개의 연속 아미노산, 좋기로는 적어도 30개의 연속 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다.

용어 "부분(part)" 및 "단편(fragment)"은 본 발명에서 호환적으로 사용되며 연속 요소를 가리킨다. 예를 들어, 아미노산 서열 또는 단백질과 같은 구조의 한 부분은 상기 구조의 연속 요소를 가리킨다. 어떤 구조의 일부, 부분 또는 단편은 좋기로는 상기 구조의 하나 이상의 기능적 특성을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 에피토프, 펩타이드 또는 단백질의 일부, 부분 또는 단편은 그것이 유래된 에피토프, 펩타이드 또는 단백질과 면역학적으로 동등한 것이 바람직하다. 본 발명의 문맥 상, 아미노산 서열과 같은 어떤 구조의 "부분"은 좋기로는 전체 구조 또는 아미노산 서열의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 94%, 적어도 96%, 적어도 98%, 적어도 99%를 포함하는 것, 좋기로는 상기로 구성되는 것이 바람직하다.

본 발명의 문맥 상 용어 "면역반응 세포(immunoreactive cell)"는 면역 반응 동안 이펙터 기능을 발휘하는 세포에 관한 것이다. "면역반응 세포"는 좋기로는 항원 또는 그의 펩타이드 단편 (예컨대 T 세포 에피토프)를 제시하여 면역 반응을 매개하는 것에 의해 특징지어지는 항원 또는 세포와 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 이러한 세포는 사이토카인 및/또는 케모카인을 분비하고, 항체를 분비하며, 암 세포를 인식하고 임의로 이러한 세포를 제거한다. 예를 들어, 면역반응 세포는 T 세포 (세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 종양 침윤 T 세포), B 세포, 내츄럴 킬러 세포, 호중구, 대식세포, 및 수지상 세포를 포함한다. 좋기로는, 본 발명의 문맥 상, "면역반응 세포"는 T 세포, 좋기로는 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포인 것이 바람직하다.

좋기로는, "면역반응 세포"는 특히 암 세포와 같은 질환 세포 또는 항원 제시 세포의 표면과 같이 MHC 분자 맥락으로 제시될 경우, 어느 정도의 특이성으로 항원 또는 그의 펩타이드 단편을 인식하는 것이 바람직하다. 좋기로는, 상기 인식은 항원 또는 그의 펩타이드 단편을 인식하는 세포가 응답성 또는 반응성이 되도록 만들어주는 것이 바람직하다. 만일 세포가 MHC 클래스 II 분자 맥락에서 항원 또는 그의 펩타이드 단편을 인식하는 수용체를 산생하는 헬퍼 T 세포 (CD4⁺ T 세포)인 경우, 그러한 응답성 또는 반응성은 사이토카인의 방출 및/또는 CD8⁺ 림프구 (CTLs) 및/또는 B-세포의 활성화와 연관된 것일 수 있다. 만일 세포가 CTL이면 그러한 응답성 또는 반응성은 MHC 클래스 I 분자 맥락에서 제시된 세포, 즉 클래스 I MHC에 의한 항원 제시에 의해 특징지어지는 세포의, 세포자멸사 또는 퍼포린-매개된 세포 용해를 경유한 제거와 연관될 수 있다. 본 발명에서, CTL 응답성은 지속적 칼슘 플럭스, 세포분열, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생산, CD44 및 CD69와 같은 활성화 마커의 상향 조절 및 항원 발현 표적 세포의 특이적인 세포용해성 살해를 포함할 수 있다. CTL 응답성은 또한 CTL 응답성을 정확히 지시하는 인공 리포터를 이용하여 탐지될 수도 있다. 항원 또는 항원 단편을 인식하고 응답성 또는 반응성인 이러한 CTL은 본 명세서에서 "항원-응답성 CTL"이라고도 칭해진다. 만일 세포가 B 세포이면 이러한 응답선은 면역글로불린의 방출과 연관되는 것일 수 있다.

용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며 여기에는 세포용해성 T 세포를 포함하는 세포독성 T 세포 (CTLs, CD8+ T 세포) 및 T 헬퍼 세포 (CD4+ T 세포) 및 세포독성 T 세포 (CTLs, CD8+ T 세포)가 포함된다.

T 세포는 림프구로 알려진 백혈구 세포군에 속하며, 세포-매개된 면역에서 중추적인 역할을 한다. 이들은 T 세포 수용체(TCR)이라 칭해지는 특별한 수용체가 이들의 세포 표면에 존재한다는 측면에서 여타의 림프구 예컨대 B 세포 및 내츄럴 킬러 세포와 구별될 수 있다. 흉선은 T 세포의 성숙화에 책임이 있는 일차 기관이다. 몇몇 상이한 T 세포 서브세트들이 발견된 바 있으며 이들 각각은 독특한 기능을 갖는다.

T 헬퍼 세포는 특히 B 세포의 혈장 세포로의 성숙 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화와 같은, 면역학적 프로세스에서 다른 백혈구 세포를 도와주는 역할을 한다. 이 세포들은 CD4+ T 세포로도 알려져 있는데 이는 이들이 그 표면에서 CD4 단백질을 발현하기 때문이다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포(APC)의 표면에서발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩타이드 항원과 함께 제시된다. 일단 활성화되면, 이들은 급속히 분열하여 활성 면역 반응을 조절하거나 보조하는 사이토카인이라 챙해지는 작은 단백질을 분비한다.

세포독성 T 세포는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고 이식 거부에도 연루된다. 이 세포들은 또한 CD8+ T 세포라고도 알려져 있는데 이는 이들이 그 표면에서 CD8 당단백질을 발현하기 때문이다. 이 세포들은 신체의 거의 모든 세포 표면에 존재하는, MHC 클래스 I과 연관된 항원에 결합함으로써 그들의 표적을 인식한다.

대다수의 T 세포들은 몇몇 단백질의 복합체로서 존재하는 T 세포 수용체 (TCR)을 갖는다. 실제 T 세포 수용체는 독립적인 T 세포 수용체 α 및 β (TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 생성되어 α- 및 β-TCR 사슬로서 칭해지는 2개의 별개 펩타이드 사슬로 구성된다. γδ T 세포 (γ δ T 세포)는 그의 표면에서 독특한 T 세포 수용체 (TCR)를 지니는 T 세포의 작은 서브세트를 나타낸다. 그러나, γδ T 세포에서, TCR은 하나의 γ-사슬 및 하나의 δ-사슬로 구성된다. T 세포의 이 그룹은 αβ T 세포에 비해 훨씬 드물다(총 T 세포의 2%).

T 세포 활성화의 첫 번째 시그널은 T 세포 수용체가 다른 세포 상의 MHC에 의해 제시된 짧은 펩타이드에 결합함으로써 제공된다. 이것은 그 펩타이드에 특이적인 TCR을 갖는 T 세포만이 활성화되도록 해준다. 파트너 세포는 대체로 항원 제시 세포 예컨대 프로페셔널 항원 제시 세포이며, 나이브 반응의 경우 대체로 수지상 세포지만, B 세포 및 대식세포도 중요한 APCs일 수 있다.

본 발명에서, 어떤 분자가 소정의 표적에 대해 유의적인 친화도를 가지고 표준 분석에서 상기 소정의 표적에 결합하면, 그 분자는 그 소정의 표적에 결합할 수 있는 것이다. "친화도(Affinity)" 또는 "결합 친화도(binding affinity)"는 종종 평형 해리 상수 (K_D)에 의해 측정된다. 만일 어떤 분자가 상기 표적에 대해 유의적인 친화도를 갖지 않고 표준 분석에서 상기 표적에 유의적으로 결합하지 않으면 그 분자는 표적에 (실질적으로) 결합하지 못하는 것이다.

세포독성 T 림프구는 생체내에서 항원-제시 세포로 항원 또는 그의 펩타이드 단편이 통합됨으로써 생체내에서 생성될 수 있다. 항원 또는 그의 펩타이드 단편은 단백질로서, DNA (예컨대 벡터 내에서) 또는 RNA로서 나타내질 수 있다. 항원은 MHC 분자에 대한 펩타이드 파트너를 생성하도록 프로세스될 수 있는 반면 그의 단편은 추가 프로세싱을 필요로 함이 없이 제시될 수 있다. 후자는 특히, 만일 이들이 MHC 분자에 결합할 수 있을 경우 그러하다. 일반적으로, 환자에게 피내 주사에 의해 투여하는 것이 가능하다. 그러나, 주사는 림프절 내로 결절내로 행해질 수도 있다(Maloy 등 (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303). 결과적인 세포들은 다양한 흥미거리를 나타내며 자가 세포독성 T 림프구에 의해 인식되며 이어서 증식한다.

CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 특이적인 활성화는 다양한 방식으로 검색가능하다. 특이적인 T 세포 활성화를 검색하는 방법들로는 T 세포의 증식, 사이토카인 (예컨대 림포카인)의 생성, 또는 세포용해 활성의 생성을 검색하는 것을 들 수 있다. CD4+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검출하는 바람직한 방법은 T 세포의 증식을 검색하는 것이다. CD8+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 검색하는 바람직한 방법은 세포용해 활성의 생성을 검색하는 것이다.

"항원의 제시에 의해 특징지어지는 세포" 또는 "항원을 제시하는 세포" 또는 이와 비슷한 표현들은 암세포와 같은 질병 세포 등의 세포, 또는 예컨대 MHC 분자 특히 MHC 클래스 I 분자 관점에서 항원의 프로세싱에 의해 그것이 발현하는 항원 또는 상기 항원으로부터 유래된 단편을 제시하는 항원 제시 세포를 의미한다. 마찬가지로, "항원 제시에 의해 특징지어지는 질환"이라는 용어는 항원, 특히 클래스 I MHC에 의한 항원의 제시에 의해 특징지어지는 세포와 관련된 질환을 의미한다. 세포에 의한 항원의 제시는 항원을 코딩하는 RNA와 같은 핵산으로 그 세포를 트랜스펙션시킴으로써 실행될 수 있다.

"제시되는 항원의 단편" 또는 이와 유사한 표현은 그 단편이 항원 제시 세포에 직접 부가될 때 MHC 클래스 I 또는 클래스 II, 좋기로는 MHC 클래스 I에 의해 제시될 수 있음을 의미한다. 일 구체예에서, 상기 단편은 항원을 발현하는 세포에 의해 자연적으로 제시되는 단편이다.

"면역학적으로 동등한"이라는 용어는 면역학적으로 동등한 아미노산 서열과 같은 면역학적으로 동등한 그 분자가 동일 또는 기본적으로 동일한 면역학적 특성을 나타내고 및/또는 예컨대 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 유도와 같은 면역학적 효과의 종류, 유도된 면역 반응의 강도 및/또는 기간 또는 유도된 면역 반응의 특이성 측면에서 동일 또는 기본적으로 동일한 면역학적 효과를 발휘함을 의미한다. 본 발명의 문맥 상, 용어 "면역학적으로 동등한"은 면역학적 효과 또는 면역화에 이용된 펩타이드의 특성과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 어떤 아미노산 서열이 대상자의 면역계에 노출될 경우 레퍼런스 아미노산 서열과의 반응 특이성을 갖는 면역 반응을 유도한다면, 그 아미노산 서열은 레퍼런스 아미노산 서열과 면역학적으로 동등한 것이다.

본 발명에서 "면역 이펙터 기능(immune effector functions)"이라 함은 예컨대 종양 세포의 살해 또는 종양 성장의 억제 및/또는 종양 전파 및 전이의 억제를 비롯한 종양 발달의 억제를 야기하는, 면역계의 성분들에 의해 매개되는 여하한 기능을 포괄한다. 좋기로는, 본 발명의 문맥 상 면역 이펙터 기능은 T 세포 매개된 이펙터 기능이다. 이러한 기능은 헬퍼 T 세포 (CD4⁺ T 세포)의 경우 MHC 클래스 II 분자의 관점에서 T 세포 수용체에 의한 항원 또는 항원 단편의 인식, 사이토카인의 방출 및/또는 CD8⁺ 림프구 (CTLs) 및/또는 B-세포의 활성화, 그리고 CTL의 경우 MHC 클래스 I 분자의 관점에서 T 세포 수용체에 의한 항원 또는 항원 단편의 인식, MHC 클래스 I 분자의 관점에서 제시된 세포, 즉 예컨대 클래스 I MHC에 의한 항원 제시에 의해 특징지어지는 세포의 예컨대 세포자멸사 또는 퍼포린-매개된 세포 용해를 통한 제거, IFN-γ및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생성, 항원 발현 표적 세포의 특이적인 세포용해성 살해를 포함한다.

본 발명에서, 용어 "점수/스코어(점수)"는 대개 수치로 표시된 어떤 테스트 또는 시험의 결과이다. "더 나은 점수" 또는 "최상의 점수" 등의 표현은 테스트 또는 시험의 결과가 보다 좋거나 가장 좋은 것과 관계된다.

"예측하다(predict)", "예측하는(predicting)" 또는 "예측(prediction)" 등의 표현은 가능성을 알아내는 것과 관계된다.

본 발명에서, 어떤 펩타이드의 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 점수를 확인하는 것은 하나 이상의 MHC 분자에 대한 펩타이드의 결합 가능성을 탐지하는 것을 포함한다.

하나 이상의 MHC 분자에 대한 펩타이드의 결합 점수는 펩타이드:MHC 결합 예측 도구를 이용함으로써 확인가능하다. 예를 들어, 면역 에피토프 데이터베이스 분석 리소스(IEDB-AR: http://tools.iedb.org)를 이용할 수 있다.

예측은 대체로 상이한 MHC 대립유전자들의 세트 예컨대 가능한 모든 MHC 대립유전자들 또는 환자 좋기로는 그의 면역원성이 본 발명에서 탐지되고자 하는 변형(들)을 갖는 환자에서 발견되는 MHC 대립유전자의 세트 또는 서브세트에 대해 행해진다.

본 발명에서, 변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체에 존재하는 경우 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수를 확인하는 것은 T 세포 수용체에 대한 MHC 분자와의 복합체에 펩타이드가 존재할 경우 T 세포 수용체에 대한 그 펩타이드의 결합 가능성을 탐지하는 것을 포함한다.

예측은 어떤 환자에서 발견되는 T 세포 수용체와 같은 하나의 T 세포 수용체 또는 좋기로는 미지의 상이한 T 세포 수용체들의 세트와 같은 T 세포 수용체 세트 또는 어떤 환자 좋기로는 본 발명에 따라 그의 면역원성을 탐지하고자 하는 변형(들)을 갖는 환자에서 발견되는 T 세포 수용체 세트 또는 서브 세트에 대해 행해질 수 있다.

나아가, 예측은 대체로 MHC 분자 세트 예컨대 상이한 MHC 대립유전자 예컨대 가능한 모든 MHC 대립 유전자들의 세트 또는 좋기로는 본 발명에 따라 탐지하고자 하는 면역원성의 변형(들)을 갖는 환자에서 발견되는 MHC 대립유전자의 세트 또는 서브세트에 대해 실시된다.

변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체 내에 존재할 경우 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 상기 변형된 펩타이드의 결합 점수는 주어진 (미지의) T 세포 수용체 레퍼토리에서 T 세포 수용체-펩타이드-MHC 복합체의 결합에 미치는 상기 변형의 효과를 평가함으로써 확인될 수 있다. 변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체 내에 존재할 경우 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 상기 변형된 펩타이드의 결합 점수는 일반적으로 맷칭 T 세포 수용체에 대한 주어진 펩타이드-MHC 분자의 인식에 있어서 일종의 프록시(proxy)로서 정의될 수 있다.

변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체 내에 존재할 경우 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 상기 변형된 펩타이드의 결합 점수는 변형된 아미노산과 비변형 아미노산 간의 이화학적 차이를 확인함으로써 확인가능하다. 예를 들어, 치환 매트릭스를 이용할 수 있다. 이러한 매트릭스들은 어떤 서열 내의 하나의 아미노산이 경시적으로 다른 아미노산으로 변하는 비율을 설명하는 것이다.

예컨대 진화 기반 대수-승산 매트릭스와 같은 대수-승산 매트릭스를 사용할 수 있다: 낮은 대수 승산 점수에 의한 치환이 높은 대수 승산 점수에 의한 치환보다 (미지의) T 세포 수용체 분자의 풀로부터의 맷칭 T 세포 수용체를 발견할 기회가 더 높다 (T 세포 수용체 맷칭 비변형 펩타이드의 네거티브 선택 때문임). 그러나 이 점수를 확인하는 다른 방법도 있다. 예를 들어, 펩타이드 내의 돌연변이 위치를 고려하거나 (어떤 위치들은 다른 위치들보다 결합에 덜 영향을 미칠 수 있음), 치환된 아미노산의 가장 가까운 이웃을 고려하거나 (치환된 아미노산의 2차 구조에 영향을 미칠 수 있음), 전체 펩타이드 서열을 고려하거나, MHC 분자 내의 펩타이드의 완전한 구조 정보를 고려하는 것 등이 그것이다. 점수 확인은 또한 예컨대 NGS를 경유하여 T 세포 수용체 레퍼토리(예컨대 환자 또는 그의 서브세트의 T 세포 수용체 레퍼토리)를 탐지하여 T 세포 수용체-펩타이드-MHC 복합체들의 도킹 시뮬레이션을 수행하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법을 동일한 변형(들) 및/또는 상이한 변형들을 포함하는 여러가지 상이한 펩타이드들에 대해 수행하는 것을 포함할 수 있다.

일 구체예에서 "동일한 변형(들)을 포함하는 상이한 펩타이드들"이라는 표현은 변형된 단백질의 상이한 단편들을 포함하거나 이러한 단편들로 이루어진 펩타이드에 관한 것으로, 상기 상이한 단편들은 그 단백질 내에 존재하는 동일한 변형(들)을 포함하지만 그 변형(들)의 길이 및/또는 위치는 달리하는 것이다. 만일 단백질이 위치 x에서 어떤 변형을 가지면, 상기 위치 x를 커버하는 상기 단백질의 상이한 서열 창을 각기 포함하는 상기 단백질의 2개 이상의 단편들은 동일한 변형(들)을 포함하는 상이한 펩타이드들로 간주된다.

일 구체예에서 "상이한 변형들을 포함하는 상이한 펩타이드들"이라는 표현은 동일 및/또는 상이한 단백질의 상이한 변형들을 포함하는 동일 및/또는 상이한 길이의 펩타이드들에 관한 것이다. 만일 어떤 단백질이 위치 x 및 y에서 변형들을 가지면, 위치 x 또는 위치 y를 커버하는 상기 단백질의 서열 창을 각기 포함하는 상기 단백질의 2개의 단편들은 상이한 변형들을 포함하는 상이한 펩타이드로서 간주된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따라 그의 면역원성을 탐지하고자 하는 변형을 갖는 단백질 서열들을 MHC 결합에 적합한 길이를 갖는 펩타이드로 분해하여 동일 및/또는 상이한 단백질의 동일 및/또는 상이한 변형을 포함하는 상이한 변형된 펩타이드의 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 점수를 확인하는 것도 포함할 수 있다. 결과를 등급 매길 수 있으며 결과는 펩타이드 및 그의 예측된 점수 목록으로 이루어져, 그들의 결합 가능성을 나타낼 수 있다.

이어서 하나 이상의 MHC 분자에 대한 비변형 펩타이드의 결합 점수를 확인하는 단계 및/또는 변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체에 존재할 경우 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수를 확인하는 단계는 동일 및/또는 상이한 변형들을 포함하는 모든 상이한 변형된 펩타이드, 그의 서브세트, 예컨대 하나 이상의 MHC 분자에 대해 최고의 결합 점수를 갖는 동일 및/또는 상이한 변형을 포함하는 변형된 펩타이드에 대해 수행되거나 또는 하나 이상의 MHC 분자에 대해 최고의 결합 점수를 갖는 하나의 변형된 펩타이드에 대해서만 수행될 수 있다.

상기 추가 단계들의 수행 후, 결과를 등급매길 수 있는데 결과는 펩타이드 목록 및 이들의 예측 점수로 이루어질 수 있으며, 이들의 면역원성 가능성을 나타낸다.

좋기로는, 이러한 등급 매기기에서, 하나 이상의 MHC 분자에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수는, 변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체에 존재할 경우, 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수, 좋기로는 비변형 아미노산과 변형된 아미노산 간의 이화학적 유사성 점수보다 더 높은 비중을 가지며, 변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체에 존재할 경우, 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수, 좋기로는 비변형 아미노산과 변형된 아미노산 간의 이화학적 유사성 점수는 하나 이상의 MHC 분자들에 대한 비변형 펩타이드의 결합 점수보다 더 높은 비중을 갖는다.

본 발명에 따라 그의 면역원성을 탐지하고자 하는 아미노산 변형들은 세포 핵산의 돌연변이로부터 야기되는 것일 수 있다. 이러한 돌연변이는 공지의 시퀀싱(서열분석: sequencing) 기술에 의해 동정될 수도 있다.

일 구체예에서, 돌연변이는 비종양 표본의 게놈, 엑솜 및/또는 트랜스크립톰과 종양 표변의 게놈, 엑솜 및/또는 트랜스크립톰 간의 서열 차이점을 동정함으로써 탐지될 수 있는 암 환자의 종양 표본에서의 암 특이 체세포 돌연변이이다.

본 발명에 따라 종양 표본은 종양 또는 암 세포를 함유하거나 함유할 것으로 기대되는 환자로부터 유래한 샘플과 같은 여하한 체성분 샘플에 관계된 것이다. 체성분 샘플(bodily sample)은 혈액과 같은 조직 샘플, 원발성 종양 또는 전이 종양으로부터 수득된 조직 샘플 또는 종양 또는 암 세포를 함유하는 기타 샘플 등 어느 것이든 무방하다. 좋기로는, 체성분 샘플은 혈액이고 암 특이 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 그 혈액에 함유된 1개 이상의 순환 종양 세포(circulating tumor cells: CTCs)에서 탐지된다. 또 다른 구체예에서, 종양 표본은 순환 종양 세포 (CTCs)와 같은 1 이상의 분리된 종양 또는 암 세포이거나 또는 순환 종양 세포 (CTCs)와 같은 1 이상의 분리된 종양 또는 암 세포를 함유하는 샘플에 관계된 것이다.

비종양 표본은 좋기로는 종양 또는 암 세포를 함유하지 않거나 함유하지 않을 것으로 기대되는 환자 또는 그 환자와 동일한 종의 다른 개체로부터 유래된 체성분 세포와 같은 샘플에 관계된 것이다. 체성분 샘플은 혈액 등의 샘플 또는 비종양 조직으로부터의 샘플 등 여하한 샘플일 수 있다.

본 발명은 환자의 암 돌연변이 징후(signature)를 알아내는 것을 포함한다. "암 돌연변이 징후(cancer mutation signature)"이라는 용어는 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 모든 암 돌연변이를 가리킬 수도 있고 또는 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 암 돌연변이의 오직 일부만을 가리키는 것일 수도 있다. 따라서, 본 발명은 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 모든 암 돌연변이의 동정에 관한 것이거나 또는 환자의 하나 이상의 암 세포에 존재하는 암 돌연변이의 오직 일부의 동정에 관한 것일 수도 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 본 발명의 방법에 포함될 충분한 수의 변형 또는 변형된 펩타이드를 제공하는 몇몇 돌연변이를 동정하도록 해준다.

좋기로는, 본 발명에 따라 동정된 돌연변이는 비유사(non-synonymous) 돌연변이, 좋기로는 종양 또는 암 세포에서 발현되는 단백질의 비유사 돌연변이인 것이 바람직하다.

일 구체예에서, 암 특이 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 종양 표본의 게놈, 좋기로는 전체 게놈에서 탐지된다. 따라서, 본 발명은 게놈, 좋기로는 하나 이상의 암 세포의 전체 게놈의 암 돌연변이 징후를 동정하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 암 환자의 종양 표본 중의 암 특이 체세포 돌연변이를 동정하는 단계는 게놈 전반에 걸친(genome-wide) 암 돌연변이 프로파일을 동정하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, 암 특이 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 종양 표본의 엑솜, 좋기로는 전체 엑솜에서 탐지된다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 암 세포의 엑솜, 좋기로는 전체 엑솜의 암 돌연변이 징후를 동정하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 암 환자의 종양 표본 내의 암 특이 체세포 돌연변이를 동정하는 단계는 엑솜 전반에 걸친(exome-wide) 암 돌연변이 프로파일을 동정하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, 암 특이 체세포 돌연변이 또는 서열 차이는 종양 표본의 트랜스크립톰, 좋기로는 전체 트랜스크립톰에서 탐지된다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 암 세포의 트랜스크립톰, 좋기로는 전체 트랜스크립톰의 암 돌연변이 징후를 동정하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 암 환자의 종양 표본 내의 암 특이 체세포 돌연변이를 동정하는 단계는 트랜스크립톰 전반에 걸친(transcriptome-wide) 암 돌연변이 프로파일을 동정하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, the step of identifying 암 특이 체세포 돌연변이를 동정하는 단계 또는 서열 차이를 동정하는 단계는 1개 이상, 좋기로는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 암 세포의 단일 세포 시퀀싱을 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 하나 이상의 암 세포의 암 돌연변이 징후를 동정하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 암 세포는 순환 종양 세포이다. 순환 종양 세포와 같은 암 세포는 단일 세포 시퀀싱을 하기 전에 분리될 수 있다.

일 구체예에서, 암 특이 체세포 돌연변이를 동정하는 단계 또는 서열 차이를 동정하는 단계는 차세대 시퀀싱(next generation sequencing: NGS)을 이용하는 것을 포함한다.

일 구체예에서, 암 특이 체세포 돌연변이를 동정하는 단계 또는 서열 차이를 동정하는 단계는 종양 표본의 게놈 DNA 및/또는 RNA를 시퀀싱하는 것을 포함한다.

암 특이 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 밝히기 위해 종양 표본으로부터 얻은 서열 정보를 좋기로는 그 환자 또는 다른 개체로부터 수득될 수 있는 생식세포 등의 정상적인 비암 세포의 DNA 또는 RNA와 같은 핵산을 시퀀싱하여 얻은 서열 정보 등의 레퍼런스와 비교하는 것이 바람직하다. 일 구체예에서, 정상적인 게놈 생식세포 DNA는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 수득된다.

"게놈(genome)"이라는 용어는 어떤 생명체 또는 세포의 염색체 내의 유전자 정보의 총량에 관계된 것이다.

용어 "엑솜(exome)"은 발현된 유전자의 코딩 부분인, 엑손에 의해 형성된 어떤 생명체의 게놈 부분을 가리키는 것이다. 엑솜은 단백질 및 기타 기능성 유전자 산물의 합성에 사용되는 유전자 청사진을 제공한다. 이것은 게놈의 가장 기능적으로 관련있는 부분이므로, 어떤 생명체의 표현형에 가장 크게 기여할 공산이 높다. 인간 게놈의 엑솜은 총 게놈의 1.5%를 차지하는 것으로 평가된다 (Ng, PC 등, PLoS Gen., 4(8): 1-15, 2008).

용어 "트랜스크립톰"은 하나의 세포 또는 세포 집단에서 생산되는 mRNA, rRNA, tRNA, 및 기타 비-코딩 RNA를 비롯한 모든 RNA 분자의 세트에 관계된 것이다. 본 발명의 문맥 상 트랜스크립톰은 하나의 세포, 세포 집단, 좋기로는 암 세포 집단 또는 특정 시점에서 주어진 개체의 모든 세포에서 생산되는 모든 RNA 분자의 세트를 의미한다.

본 발명에서 "핵산"이라는 용어는 좋기로는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 더욱 좋기로는 RNA, 가장 좋기로는 시험관내 전사된 RNA (IVT RNA) 또는 합성 RNA인 것이 바람직하다. 핵산은 본 발명에 따라 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산된 분자 및 화학 합성된 분자를 포함한다. 본 발명에서, 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥 및 선형 또는 공유적으로 폐환된 분자로서 존재할 수 있다. 핵산은 본 발명에 따라, 분리될 수 있다. 본 발명에서 "분리된 핵산"이라 함은 핵산이 (i) 예컨대 폴리머라제 연쇄반응(PCR)에 의해 시험관내 증폭되었거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되었거나, (iii) 예컨대 절단 및 겔 전기영동에 의한 분리에 의해 정제되었거나, 또는 (iv) 예컨대 화학 합성에 의해 합성되었음을 의미한다. 핵산은 특히 DNA 템플레이트로부터 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있는 RNA 형태로, 세포 내로 도입, 즉 세포를 트랜스펙션하는데 이용될 수 있다. RNA는 서열 안정화, 캡핑(capping), 및 폴리아데닐화에 의해 적용 전에 변형시킬 수 있다.

용어 "유전 물질(genetic material)"이라 함은 DNA이건 또는 RNA이건 분리된 핵산, 이중 나선의 한 섹션, 염색체의 한 섹션 또는 생명체 또는 세포의 전체 게놈 특히 그의 엑소 또는 트랜스크립톰을 가리킨다.

"돌연변이"라는 용어는 레퍼런스에 비해서 핵산 서열에 변화가 있거나 차이가 있는 것 (뉴클레오타이드 치환, 부가 또는 결실)을 가리킨다. "체세포 돌연변이(somatic mutation)"은 생식세포 (정자 및 난자) 이외의 모든 체세포에서 일어날 수 있으므로 아동에게는 전달되지 않는다. 이러한 변경은 (항상 그런 것은 아니지만) 암 또는 기타 질환을 유발한다. 좋기로는 돌연변이는 비유사 돌연변이인 것이 바람직하다. "비유사 돌연변이(non-synonymous mutation)"라는 용어는 번역 산물에서 아미노산 치환과 같은 아미노산 변화는 야기하지 않는 돌연변이, 좋기로는 뉴클레오타이드 치환을 가리킨다.

본 발명에서, "돌연변이"라는 용어는 점 돌연변이, 인델(Indels), 융합, 크로모트립시스(chromothripsis) 및 RNA 에디트(edits)를 포함한다.

본 발명에서, 용어 "인델(Indel)"은 공배치 (colocalized) 삽입 및 결실 그리고 뉴클레오타이드의 순증가(net gain) 또는 순감소(net loss)를 야기하는 돌연변이로서 정의되는 특수한 돌연변이 부류이다. 게놈의 코딩 영역에서는, 인델의 길이가 3의 배수가 아닌 한, 이들은 프레임쉬프트 돌연변이를 일으킨다. 인델은 점 돌연변이와 대조될 수 있는데; 인델이 어떤 서열로부터 뉴클레오타이드들을 삽입 또는 결실하는데 비해, 점 돌연변이는 뉴클레오타이드들 중 하나를 대체시키는 치환의 형태이다.

융합(fusions)은 이전에 분리된 2개의 유전자들로부터 형성된 하이브리드 유전자를 형성할 수 있다. 이것은 전위(translocation), 염색체내 결손(interstitial deletion), 또는 염색체 자리바꿈(chromosomal inversion)의 결과로서 일어날 수 있다. 종종, 융합 유전자는 종양유전자들(oncogenes)이다. 종양발생 융합 유전자는 2개의 융합 파트너들과는 다르거나 새로운 기능을 갖는 유전자 산물을 유도할 수 있다. 다른 한편, 원종양유전자(proto-oncogene)는 강력한 프로모터와 융합됨으로 해서, 종양유전자 기능이 상류의 융합 파트너의 강력한 프로모터에 의해 야기되는 상향조절에 의해 기능하도록 설정된다. 종양유전자 융합 전사체는 트랜스-스플라이싱 또는 리드-쓰루 이벤트에 의해서도 일어날 수 있다.

본 발명에서, "크로모트립시스(chromothripsis)"라는 용어는 게놈의 특정 영역이 산산히 부서진 다음 한번의 극적인 이벤트(devastating event)를 통해 다시 연결되는 유전 현상을 가리킨다.

본 발명에서, 용어 "RNA 에디트(edit)" 또는 "RNA 에디팅(editing)"은 RNA 분자 내의 정보 콘텐트가 베이스 메이크업에서의 화학적 변화를 통해 변경되는 분자 프로세스를 가리킨다. RNA 에디팅은 예컨대 시티딘(C)가 우리딘(U)으로 그리고 아데노신(A)가 이노신(I) 탈아민화와 같은 뉴클레오타이드 변형 뿐만 아니라, 비주형(non-templated) 뉴클레오타이드 부가 및 삽입도 포함한다. mRNAs내 RNA 에디팅은 인코딩된 단백질의 아미노산 서열을 효과적으로 변경시켜 게놈 DNA 서열에 의해 예측되는 것과는 상이하다.

"암 돌연변이 징후(cancer mutation signature)"라는 용어는 비-암 레퍼런스 세포와 비교시 암 세포에 존재하는 돌연변이 세트를 칭한다.

본 발명에서, "레퍼런스"는 종양 표본으로부터 본 발명의 방법에서 수득된 결과를 연관 및 비교하는데 이용될 수 있다. 일반적으로 "레퍼런스"는 하나 이상의 정상적인 표번,특히 한 명 이상의 개체, 좋기로는 건강한 개체, 특히 동일 종의 개체들로부터 수득된, 암 질환에 걸리지 않은 표본에 기초하여 얻이질 수 있다. "레퍼런스"는 충분히 많은 수의 정상 표본들을 테스트함으로써 실험적으로 탐지할 수 있다.

돌연변이 탐지를 위해 본 발명에서는 여느 적합한 시퀀싱 방법이든 사용가능한데, 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing: NGS) 기술이 바람직하다. 시퀀싱 단계의 속도를 높이기 위해 장차 NGS 기술을 3세대 시퀀싱 방법이 대체할 수 있을 것이다. 설명에 명확을 기하기 위해: 본 발명에서 용어 "차세대" 또는 "NGS"는, 전체 게놈을 작은 단편들이 되도록 분해함으로써 전체 게놈을 따라 평형하게 무작위적으로 핵산 템플레이트를 판독하는 생거 화학(Sanger chemistry)으로 알려진 "종래의" 시퀀싱 방법론과 대조적으로, 모든 신규한 고처리능 시퀀싱 기술을 의미한다. 이러한 NGS 기술(대규모 병렬형 시퀀싱 기술(massively parallel sequencing technologies)이라고도 알려짐)은 전체 게놈, 엑솜, 트랜스크립톰 (게놈의 모든 전사된 서열) 또는 메틸롬(게놈의 모든 메틸화된 서열)의 핵산 서열 정보를 매우 단기간 내, 예컨대 1-2주일, 좋기로는 1-7일 또는 가장 좋기로는 24시간 이내에 전달할 수 있으며, 기본적으로 단일 세포 시퀀싱 접근법을 가능케 한다. 상업적으로 구득가능하거나 문헌에 언급된 다중 NGS 플랫폼을 본 발명과 관련하여 사용할 수 있는데, 이들의 예로는 Zhang 등 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics . J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; 또는 in Voelkerding 등 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658에 개시된 것을 들 수 있다. 이러한 NGS 기술/플랫폼의 비제한적인 예로는

1) 예컨대 Roche-관련 회사 454 Life Sciences (Branford, Connecticut)의 GS-FLX 454 Genome Sequencer ^TM에서 실시된 파이로시퀀싱(pyrosequencing)으로 알려진 시퀀싱-바이-합성 기술. Ronaghi 등 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365를 통해 최초로 설명되었음. 이 기술은 단일-가닥 DNA 결합 비드들을 격렬한 보텍싱에 의해 캡슐화하여 에멀젼 PCR 증폭을 위해 오일에 의해 감싸여진 PCR 반응물을 함유하는 수성 미셀들로 만드는 에멀젼 PCR을 이용한다. 파이로시퀀싱 프로세스가 일어나는 동안 폴리머라제가 DNA 스트랜드를 합성함에 따라 뉴클레오타이드 혼입 동안 포스페이트 분자로부터 방출된 빛이 기록된다.

2) 가역 염료-터미네이터에 기반하고 예컨대 Illumina/Solexa Genome Analyzer ^TM 및 Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer^TM에서 실시되는, Solexa(현재 Illumina Inc. 사의 일부가 됨, San Diego, California)사가 개발한 시퀑싱-바이-합성 접근법. 이 기술에서는 4종의 뉴클레오타오타이드 모두가 DNA 폴리머라제와 함께 유동-셀 채널 내의 올리고-프라임된 클러스터 단편에 동시에 첨가된다. 브릿지 증폭은 시퀀싱을 위해 형광 표지된 4종의 뉴클레오타이드 모두와 함께 클러스터 가닥을 연장시킨다.

3) 시퀀싱-바이-라이게이션 접근법, 예컨대 Applied Biosystems (현재는 Life Technologies Corporation, Carlsbad, California)의 SOLid^TM 플랫폼에서 실시되는 접근법. 이 기술에서는 고정된 길이의 가능한 모든 올리고뉴클레오타이드들의 풀을 서열분석된 위치에 따라 표지한다. 올리고뉴클레오타이드들을 어닐링 및 접합시킨다: 맷칭 서열들에 대한 DNA 리가제에 의한 우선적인 라이게이션에 의해 그 위치에서 뉴클레오타이드의 시그널 정보가 얻어진다. 시퀀싱에 앞서, DNA를 에멀젼 PCR에 의해 증폭시킨다. 각기 동일한 DNA 분자의 카피만을 함유하는 결과적인 비드들을 유리 슬라이드 상에 부착한다. 두 번째 예로는, Dover Systems (Salem, New Hampshire)의 Polonator^TM G.007 플랫폼을 들 수 있는데, 여기서도 무작위적으로 어레이된 비드-기반, 에멀젼 PCR에 의한 시퀀싱-바이-라이게이션 접근법을 이용하여, 병렬형 시퀀싱을 위한 DNA 단편들을 증폭시킨다.

4) 예컨대 Pacific Biosciences (Menlo Park, California)의 PacBio RS 시스템 또는 Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts)의 HeliScope^TM 플랫폼에서 실시되는 것과 같은 단일-분자 시퀀싱 기술. 이 기술의 눈에 띠는 특징은 증폭 없이 단일 DNA 또는 RNA 분자를 시퀀싱할 수 있는 그의 능력으로서, Single-Molecule Real Time (SMRT) DNA 시퀀싱으로 정의된다. 예를 들어, HeliScope은 각각의 뉴클레오타이드가 합성되어감에 따라, 각각 뉴클레오타이드를 직접 검출하는 고도로 민감한 형광검출 시스템을 이용한다. 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 기반한 유사한 접근법이 Visigen Biotechnology (Houston, Texas)사에 의해 개발된 바 있다. U.S. Genomics (GeneEngine^TM) 및 Genovoxx (AnyGene^TM)도 기타 형광-기반 단일분자 기술을 이용한다.

5) 복제가 일어나는 동안 단일 가닥 상의 폴리머라제 분자의 움직임을 모니터링하기 위해 예컨대 칩 상에 배열된 다양한 나노구조물들을 이용하는, 단일-분자 시퀀싱을 위한 나노-기술. 나노-기술에 기반한 접근법의 비제한적인 예로는 Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK)의 GridON^TM 플랫폼, Nabsys (Providence, Rhode Island)에 의해 개발된 혼성화-보조 나노-포어 시퀀싱 (HANS^TM) 플랫폼, 및 조합식 프로브-앵커 라이게이션(cPAL^TM)이라 칭해지는 DNA 나노볼(DNA) 기술에 따른 독점 리가제-기반 DNA 시퀀싱 플랫폼을 들 수 있다.

6) 예컨대 LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) 및 Halcyon Molecular (Redwood City, California)에 의해 개발된, 단일-분자 시퀀싱을 위한 전자현미경에 기반한 기술.

7) DNA가 중합되는 동안 방출된 수소 이온들의 검출에 기반한, 이온 반도체 시퀀싱. 예를 들어, Ion Torrent Systems (San Francisco, California)은 대규모 병렬형 방식으로 이 생화학적 프로세스를 수행하기 위해 고밀도 어레이의 마이크로-머신형 웰을 이용한다. 각 웰에는 상이한 DNA 템플레이트가 들어있다. 웰 밑에는 이온-민감성 층이 있고 그 밑에는 독점 이온 센서가 구비되어 있다.

좋기로는 DNA 및 RNA 조제물이 NGS의 출발 물질인 것이 바람직하다. 이러한 핵산들은 신선한, 플래쉬-동결된 또는 포르말린-고정된 파라핀 포매형 종양 조직(FFPE)로부터, 또는 갓 분리된 세포 또는 환자의 말초 혈액에 존재하는 CTC로부터의 생물학적 물질과 같은 샘플로부터 쉽게 수득될 수 있다. 정상적인 돌연변이 되지 않은 게놈 DNA 또는 RNA를 정상적인 체세포 조직으로부터 추출할 수 있으나, 본 발명의 관점에서 생식 세포가 바람직하다. 생식 세포 DNA 또는 RNA는 비-혈액학적 종양이 있는 환자들의 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs)로부터 추출할 수 있다. 갓 분리된 단일 세포 또는 FFPE 조직으로부터 추출된 핵산은 크게 단편화되지만, 이들은 NGS 적용에 적합하다.

엑솜 시퀀싱에 대해 표적화된 몇 가지 NGS 방법들이 문헌에 기재되어 있는데 (예컨대 Teer 및 Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145 -51 참조), 이들 방법들 모두는 본 발명과 연계되어 사용가능하다. 이 방법들 중 다수 (게놈 캡쳐, 게놈 분별, 게놈 강화 등으로서 설명됨)는 혼성화 기술이고 여기에는 어레이-기반 (예컨대 Hodges 등 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527) 및 액체-기반 (예컨대 Choi 등 2009: Proc . Natl . Acad . Sci USA 106, 19096-19101) 혼성화 접근법이 포함된다. DNA 샘플 조제 및 후속적인 엑솜 캡처를 위한 시판 키트 역시도 사용가능하다: 에컨대, Illumina Inc. (San Diego, California)사가 개발한 TruSeq^TM DNA Sample Preparation Kit 및 Exome Enrichment Kit TruSeq^TM Exome Enrichment Kit를 들 수 있다.

예컨대 종양 샘플의 서열과 생식 세포 샘플 서열과 같은 레퍼런스 샘플의 비교시, 암 특이 체세포 돌연변이 또는 서열 차이를 검출함에 있어서 거짓 양성 발견 횟수를 감소시키기 위해서는 이들 샘플 유형의 일방 또는 양방 모두의 복제물 중의 서열을 탐지하는 것이 바람직하다. 따라서, 생식 세포 샘플의 서열과 같은 레퍼런스 샘플의 서열을 2회 이상, 3회 이상 탐지하는 것이 바람직하다. 별법으로 또는 이에 더해, 종양 샘플의 서열은 2회 이상, 3회 이상 탐지한다. 또한 게놈 DNA의 서열을 적어도 1회 탐지하고 상기 레퍼런스 샘플 및/또는 상기 종양 샘플의 RNA의 서열을 적어도 1회 탐지함으로써, 생식 세포 샘플의 서열 및/또는 종양 샘플의 서열을 1회 보다 많이 탐지하는 것도 가능하다. 예컨대, 생식 세포 샘플과 같은 레퍼런스 샘플의 복제물들 간의 변이를 탐지함으로써 통계학적 정량법으로서 거짓 양성 체세포 돌연변이의 예상 비율 (FDR)을 평가할 수 있다. 샘플의 기술 반복에 의해 동일한 결과가 생성되어야 하며 이 "동일 대 동일 비교"에서 검출된 모든 돌연변이는 거짓 양성이다. 특히, 레퍼런스 샘플에 대해 종양 샘플에서 체세포 돌연변이 검출에 대한 거짓 발견 비율을 알아내기 위해, 레퍼런스 샘플의 기술 반복을 레퍼런스로서 사용하여 거짓 양성 횟수를 평가할 수 있다. 뿐만 아니라, 다양한 품질 관련 매트릭스 (예컨대 커버리지 또는 SNP 품질)를 기계학습 접근법을 이용하여 단일 품질 스코어로 통합할 수도 있다. 주어진 체세포 변이에서 과도한 품질 접수를 갖는 다른 모든 변이들을 계수할 수 있는데 이로부터 데이터세트 내의 모든 변이들의등급을 매길 수 있다.

본 발명의 관점에서, "RNA"라는 용어는 적어도 하나의 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함하고 좋기로는 리보뉴클레오타이드 잔기들만으로 이루어지거나 실질적으로 이루어지는 분자에 관계된다. "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보퓨라노실기의 2'-위치에서 히드록실기를 갖는 뉴클레오타이드에 관계된다. 용어 "RNA"는 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 RNA, 분리된 RNA 예컨대 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA, 기본적으로 순수한 RNA, 합성 RNA 및 재조합적으로 생성된 RNA 예컨대 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연발생적인 RNA와 상이한 변형 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 RNA의 말단(들) 또는 내부에, 예컨대 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에, 비뉴클레오타이드 물질을 부가하는 것을 포함할 수 있다. RNA 분자 내의 뉴클레오타이드들은 또한 비-표준 뉴클레오타이드, 예컨대 자연발생적이지 않은 뉴클레오타이드 또는 화학합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드를 포함할 수도 있다. 이들 변경된 RNA들은 유사체 또는 자연발생적인 RNA의 유사체라고도 칭할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "RNA"에는 "mRNA"이 포함되며 좋기로는 이것에 관계된다. "mRNA"라는 용어는 DNA 주형을 이용하여 생성되고 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 "메신저-RNA"를 의미한다. 일반적으로, mRNA는 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 및 3'-UTR을 포함한다. mRNA는 세포와 시험관 내에서 오직 제한적인 반감기만을 갖는다. 본 발명의 관점에서, mRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 상업적으로 구득가능한 다양한 시험관내 전사 키트가 존재한다.

본 발명에서, RNA의 안정성 및 번역 효율은 필요에 따라 변형될 수 있는데, 예컨대, RNA의 효과를 안정화시키고 및/또는 번역 효율을 증가시키는 하나 이상의 변형에 의해, RNA가 안정화되어 그의 번역이 증가될 수 있다. 이러한 변형은 예컨대 본 발명에 참조 병합된 PCT/EP2006/009448에 설명되어 있다. 본 발명에 따라 사용된 RNA의 발현을 증가시키기 위해, 코딩 영역, 즉 발현된 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 서열 내에서, 좋기로는 발현된 펩타이드 또는 단백질의 서열의 변경 없이, 이것을 변형시켜, GC-함량을 증가시켜 mRNA 안정성을 증가시키고 코돈 최적화를 수행하여, 세포 내 번역을 향상시킬 수 있다.

본 발명에서 RNA와 관련한 용어 "변형(modification)"은 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 모두 포괄한다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에서 사용된 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 RNA를 포스파타제로 처리함으로써 달성가능하다.

본 발명에 따른 RNA는 그의 안정성을 증가시키고 및/또는 세포독성을 감소시키기 위해 변형된 리보뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명에서 사용된 RNA에서 5-메틸시티딘이 부분적으로 또는 완전히, 좋기로는 완전히 시티딘을 대신할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 일 구체예에서, 본 발명에서 사용된 RNA에서 슈도우리딘이 부분적으로 또는 전적으로, 좋기로는 전적으로 우리딘을 대신하는 것이 바람직하다.

일 구체예에서, 용어 "변형(modification)"은 RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것에 관한다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 가리키며 일반적으로 흔치 않은 5'에서 5'로의 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오타이드로 이루어져 있다. 일 구체예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 "통상적인 5'-캡"은 자연발생적인 RNA 5'-캡, 좋기로는 7-메틸구아노신 캡(m7G)을 칭한다. 본 발명의 문맥 상, 용어 "5'-캡"에는 RNA 캡 구조와 유사하고 RNA에 결합될 경우, 좋기로는 생체내 및/또는 세포 내에서 RNA를 안정화시키고 및/또는 RNA 번역을 향상시키는 능력을 갖도록 변형된 5'-캡 유사체가 포함된다.

RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재 하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있는데, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥 내로 공-전사적으로 혼입되거나 RNA가 예컨대 시험관내 전사에 의해 생성되고, 5'-캡이 캡핑 효소, 예컨대 백시니아 바이러스의 캡핑 효소를 이용하여 RNA에 후전사적으로 결합될 수 있다.

RNA는 추가 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 RNA의 추가 변형에는 자연발생적인 폴리(A) 테일의 연장 또는 트렁케이션이거나 또는 5'- 또는 3'-미번역 영역 (UTR)의 변형 예컨대 상기 RNA의 코딩 영역에 관련되지 않은 UTR의 도입, 예를 들어 α2-글로빈, α1-글로빈, β-글로빈, 좋기로는 β-글로빈, 더욱 좋기로는 인간 β-글로빈과 같은 글로빈 유전자로부터 유도된 3'-UTR의 하나 이상의 카피 좋기로는 2개의 카피의 삽입 또는 기존의 3'-UTR과의 교환이 포함된다.

마스킹되지 않은 폴리-A 서열을 갖는 RNA는 마스킹된 폴리-A 서열을 갖는 RNA에 비해 더 효과적으로 번역된다. "폴리(A) 테일" 또는 "폴리-A 서열"이라는 용어는 일반적으로 RNA 분자의 3'-말단에 위치하는 아데닐 (A) 잔기의 서열에 관계된 것이고 "마스킹되지 않은 폴리-A 서열"은 폴리-A 서열의 A를 갖는 RNA 분자의 3' 말단의 폴리-A 서열이 3' 말단, 즉 그 폴리-A 서열의 하류에 위치하는 A이외의 다른 뉴클레오타이드를 수반하지 않음을 의미한다. 또한, 길이 약 120 염기쌍의 긴 폴리-A 서열이 RNA의 최적의 전사 안정성 및 번역 효율을 결과시킨다.

따라서, 본 발명에 따라 사용된 RNA의 안정성 및/또는 발현 증가를 위해서, 좋기로는 길이가 10 내지 500, 더욱 좋기로는 30 내지 300, 더더욱 좋기로는 65 내지 200 및 특히 100 내지 150개의 아데노신 잔기를 갖는, 폴리-A 서열과 함께 존재하도록 변형될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 폴리-A 서열은 약 120 아데노신 잔기의 길이를 갖는다. 본 발명에서 사용된 RNA의 안정성 및/또는 발현을 더 증가시키기 위해, 폴리-A 서열로부터 마스크를 벗길 수 있다(언마스킹).

이에 더해, RNA 분자의 3'-비번역 영역으로의 3'-비번역 영역(UTR)의 통합에 의해 번역 효율이 증가될 수 있다. 이러한 3'-비번역 영역을 2개 이상 통합시킴으로써 상승 효과가 얻어질 수 있다. 3'-비번역 영역은 그들이 도입되는 RNA와 동종 또는 이종일 수 있다. 특정한 일 구체예에서, 3'-비번역 영역은 인간의 β-글로빈 유전자로부터 유래된다.

전술한 변형들의 조합, 즉 폴리-A 서열의 통합, 폴리-A 서열의 언마스킹 및 하나 이상의 3'-비번역 영역의 통합을 조합하면 RNA의 안정성에 상승 효과가 미쳐지고 번역 효율도 증가된다.

RNA의 "안정성" 이라는 용어는 RNA의 "반감기"에 관계된다. "반감기"는 당해 분자의 활성, 양 또는 수의 절반을 제거하는데 소요되는 기간에 관계된다. 본 발명의 관점에서, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성의 지표이다. RNA의 반감기는 RNA의 "발현 기간"에 영향을 미칠 수 있다. 반감기가 긴 RNA는 장기간 동안 발현될 것으로 예측할 수 있다.

물론, 만일 본 발명에 따라, RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 감소시키는 것이 요망될 경우, RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 증가시키는 전술한 효소들의 기능을 간섬함으로서 RNA를 변경시키는 것이 가능하다.

본 발명에서 용어 "발현"은 가장 일반적인 의미로, RNA 및/또는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 예컨대 전사 및/또는 번역에 의한 생산을 포함한다. RNA의 경우, 용어 "발현" 또는 "번역"은 특히 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 생산에 관한 것이다. 이것은 또한 헥산의 부분적 발현을 포함하기도 한다. 뿐만 아니라, 발현은 일시적 또는 안정적일 수 있다.

본 발명에 따라, 용어 발현에는 또한 "비정상 발현" 또는 "이상성 발현"도 포함된다. 본 발명에서 "비정상 발현" 또는 "이상 발현"이라 함은 발현이 변경되는 것, 좋기로는 레퍼런스, 예컨대 어떤 단백질, 예컨대 종양 항원의 비정상 또는 이상 발현과 연관된 질병이 없는 대상자의 상태와 같은 레퍼런스에 비해 증가된 rt을 의미한다. 발현이 증가되었다 함은 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100%, 또는 그 이상 증가된 것을 의미한다. 일 구체예에서, 발현은 질병 상태에서만 발견되는 반면 건강한 조직에서의 발현은 억제된다.

용어 "특이적으로 발현되다"라는 것은 단백질이 특이 조직 또는 장기에서만 본질적으로 발현됨을 의미한다. 예를 들어, 위점막에서 특이적으로 발현되는 종양 항원은 상기 단백질이 위점막에서 우선적으로 발현되고 다른 조직에서는 발현되지 않거나 또는 다른 조직이나 장기 종류에서는 유의적인 정도로 발현되지 않음을 의미한다. 따라서, 위점막 세포에만 배타적으로 발현되고 다른 조직 예컨대 고환에서는 유의적으로 훨씬 낮은 정도로 발현되는 단백질은 위점막 세포에서 특이적으로 발현되는 것이다. 몇몇 구체예에서, 종양 항원은 또한 두 개 이상의 조직 종류 또는 장기, 예컨대 2개 또는 3가지 조직 종류 또는 장기에서 그러나 네 가지 이하의 상이한 조직 또는 종양 종류에서 정상 조건 하에 특이적으로 발현될 수도 있다. 이 경우, 종양 항원은 이들 장기에서 특이적으로 발현되는 것이다. 예를 들어, 만일 어떤 종양 항원이 정상 조건 하에서 좋기로는 폐와 위에서 대략 비슷한 정도로 발현될 경우, 상기 종양 항원은 폐와 위에서 특이적으로 발현되는 것이다.

본 발명의 문맥 상, 용어 "전사"는 DNA 서열의 유전자 코드가 RNA로 전사되는 프로세스에 관한 것이다. 후속적으로, RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하는데, 상기 용어 "시험관내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무세포 시스템에서, 좋기로는 적절한 세포 추출물을 이용하여 시험관내 합성되는 프로세스에 관한 것이다. 좋기로는, 전사체 생성에 클로닝 벡터가 응용되는 것이 바람직하다. 이들 클로닝 벡터들은 일반적으로 전사 벡터로서 설계되며 용어 "벡터"에 의해 포괄되는 본 발명에 따른 것들이다. 본 발명에서, 본 발명에서 사용된 RNA는 좋기로는 시험관내 전사된 RNA (in vitro transcribed RNA: IVT-RNA)이며 적절한 DNA 주형을 시험관내 전사시킴으로써 수득가능하다. 전사를 제어하는 프로모터는 여하한 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터일 수 있다. RNA 폴리머라제의 특정 예로는 T7, T3, 및 SP6 RNA 폴리머라제를 들 수 있다. 좋기로는, 본 발명에 따른 시험관내 전사는 T7 또는 SP6 프로모터에 의해 조절되는 것이 바람직하다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA를 클로닝함으로써 수득될 수 있으며 이것을 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터 내로 도입할 수 있다. cDNA는 RNA의 역전사에 의해 수득가능하다.

본 발명에서 용어 "번역"은 메신저 RNA의 한 가닥이 아미노산 서열의 어셈블리를 지시하여 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 만들어내는, 세포의 리보좀 내에서 일어나는 프로세스에 관한 것이다.

본 발명에서 발현 제어 서열 또는 조절 서열은 핵산과 기능적으로 연결될 수 있고, 그 핵산과 동종 또는 이종일 수 있다. 코딩 서열과 조절 서열은 만일 이들이 공유적으로 한데 결합된 경우 "기능적으로 "함께 연결되어, 그 코딩 서열의 전사 또는 번역이 그 조절 서열의 제어하 또는 영양 하에 놓이게 된다. 만일 그 코딩 서열과 조절 서열의 기능적 연결과 함께 코딩 서열이 기능성 단백질로 번역되는 경우, 조절 서열의 유도는 코딩 서열에서의 리딩 프레임 쉬프트를 일으키지 않거나 또는 목적하는 단백질 또는 펩타이드로 번역될 코딩 서열의 무능력 없이 코딩 서열의 전사로 이어진다.

"발현 제어 서열(expression control sequence)" 또는 "조절 서열(regulatory sequence)"은 본 발명에 따라, 핵산의 전사 또는 유래된 DNA의 번역을 제어하는 프로모터, 리보좀-결합 서열 및 기타 제어 요소들을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 조절 서열들은 제어될 수 있다. 조절 서열의 정확한 구조는 종 또는 그 세포 종류에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로, TATA-박스, 캡핑-서열, CAAT-서열 등과 같은 전사 또는 번역의 개시에 관계된 5'-비전사 및 5'- 및 3'-비번역 서열들을 포함한다. 특히, 5'-비전사 조절 서열들은 기능적으로 결합된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함한다. 조절 서열들은 인핸서 서열 또는 상류 활성화제 서열도 포함할 수 있다.

좋기로는, 본 발명에서, 세포에서 발현될 RNA는 상기 세포 내로 도입되는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법의 일 구체예에서, 세포 내로 도입될 RNA는 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 얻어진다.

본 발명에서, "발현할 수 있는 RNA" 및 "...를 인코딩하는 RNA"라는 표현은 호환적으로 사용되며 특정 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여, 만일 그 RNA가 적절한 환경, 좋기로는 세포 내에 존재할 경우, 발현되어 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 생성할 수 있음을 의미한다. 좋기로는, 본 발명에 따른 RNA는 세포의 번역 머시너리와 상호반응하여 그것이 발현시킬 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 제공한다.

"전달(transferring)", "도입(introducing)" 또는 "트랜스펙션(transfecting)" 등의 표현은 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 핵산, 특히 외인성 또는 이질적 핵산, 특히 RNA를 세포 내로 도입하는 것에 관계된다. 본 발명에서, 세포는 장기, 조직 및/또는 생명체의 일부분을 형성할 수 있다. 본 발명에서, 핵산의 투여는 네이키드 핵산으로서 또는 투여 시약과의 조합으로서 달성된다. 좋기로는, 핵산의 투여는 네이키드 핵산의 형태로 이루어지는 것이 바람직하다. 좋기로는, RNA는 RNase 억제제와 같은 안정화 물질과 조합하여 투여된다. 본 발명은 또한 세포 내로 핵산을 반복 도입하여 장기간 동안 지속 발현을 가능케 하는 것도 상정한다.

세포들은 RNA와 회합될 수 있는 담체에 의해 트랜스펙션될 수 있는데, 이것은 예컨대 그 RNA와의 복합체를 형성하거나 또는 그 RNA가 봉입 또는 캡슐화되는 베지클을 형성시킴으로써 수행되며, 이에 의해 네이키드 RNA에 비해 그 RNA의 안정성 증가가 결과될 수 있다. 본 발명에서 유용한 담체의 예로는 지질-함유 담체 예컨대 양이온성 지질, 리포좀, 특히 양이온성 리포좀 및 미셀, 나노입자를 들 수 있다. 양이온성 지질은 음하전된 핵산과의 복합체를 형성할 수 있다. 여하한 모든 양이온성 지질을 본 발명에서 사용할 수 있다.

좋기로는, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 RNA를 세포, 특히 생체내에 존재하는 세포 내로 도입하여, 그 세포에서 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 발현을 결과시키는 것이 바람직하다. 특정 구체예에서, 특정 세포에 대한 핵산의 표적화가 바람직하다. 이러한 구체예에서, 핵산을 세포 (예컨대 레트로바이러스 또는 리포좀)에 투여하는데 적용되는 담체는, 표적화 분자를 나타낸다. 예컨대 표적 세포 상의수용체에 대한 리간드 또는 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체와 같은 분자를 핵산 담체 내로 통합시키거나 그에 결합시킬 수 있다. 핵산이 리포좀에 의해 투여되는 경우, 세포내이입과 연관된 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은 표적화 및/또는 흡수(uptake)를 가능케 하기 위해 리포좀 포뮬레이션 내로 통합될 수 있다. 이러한 단백질은 특정 세포 유형에 특이적인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 그것이 내면화되는 단백질에 대한 항체, 세포내 위치를 표적화하는 단백질 등을 포괄한다.

"세포" 또는 "숙주 세포"라는 용어는 좋기로는 온전한(intact), 세포, 즉 효소, 소기관 도는 유전 물질과 같은 그의 정상적인 세포내 성분들을 방출한 바 없는 온전한 막을 갖는 세포이다. 온전한 세포는 좋기로는 살아있는(viable) 세포, 즉 그의 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포인 것이 바람직하다. 좋기로는, 상기 용어는 본 발명에 따라 외인성 핵산에 의해 형질전환되거나 트랜스펙션될 수 있는 여하한 세포에 관계된다. "세포"라는 용어는 본 발명에서 원핵세포 (예컨대, 대장균 E.　coli) 또는 진핵세포 (예컨대, 수지상 세포, B 세포, CHO 세포, COS 세포, K562 세포, HEK293 세포, HELA 세포, 효모 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 외인성 핵산은 그 세포 내에서 (i) 그 자체로 자유로이 분산되거나, (ii) 재조합 벡터 내에 통합된 상태이거나 또는 (iii) 숙주 세포의 게놈 또는 염색체 DNA 내로 통합된 상태로 발견될 수 있다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 및 영장류와 같은 포유동물 세포가 특히 바람직하다. 세포는 다수의 조직 종류로부터 유래될 수 있고 일차 세포 및 세포주들을 포함한다. 특정 예로는 각질세포, 말초 혈액 백혈구, 골수 줄기세포, 및 배아줄기 세포를 들 수 있다. 추가 구체예에서, 세포는 항원-제시 세포, 특히 수지상 세포, 단핵구 또는 대식세포이다.

핵산 분자를 포함하는 좋기로는 세포는 그 핵산에 의해 인코딩된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 발현한다.

"클론 확장(clonal expansion)"이라는 용어는 특정 엔터티가 배가되는 프로세스를 가리킨다. 본 발명의 관점에서 이 용어는 림프구가 항원에 의해 자극되어 증식하고, 상기 항원을 인식하는 특수한 림프구가 증폭하는, 면역학적 반응 관점에서 사용된다. 좋기로는 클론 확장은 림프구의 분화로 이어진다.

"감소하다" 또는 "억제하다" 등의 용어는 전체적인 감소, 좋기로는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더욱 좋기로는 50% 이상, 및 가장 좋기로는 75% 이상 수준의 전체적인 감소를 일으키는 능력에 관계된다. 용어 "억제하다" 또는 이와 유사한 표현은 완전한 또는 기본적으로 완전한 억제, 즉 0으로의 감소 또는 기본적으로 0으로의 감소를 포함한다.

"증가하다", "증강시키다", "촉진하다", "또는 연장하다" 등의 용어는 좋기로는

약 적어도 10%, 좋기로는 적어도 20%, 좋기로는 적어도 30%, 좋기로는 적어도 40%, 좋기로는 적어도 50%, 좋기로는 적어도 80%, 좋기로는 적어도 100%, 좋기로는 적어도 200% 및 특히 적어도 300% 수준의 증가, 증강, 촉진 또는 연장에 관계된다. 이 용어들은 또한 0 또는 측정불가하거나 또는 검출불가한 수준으로부터 0보다 큰 수준 또는 측정가능하거나 검출가능한 수준으로의 증가, 증강, 촉진 또는 연장에 관계된다.

본 발명은 본 발명의 방법에 의해 면역원성으로 예측되는 아미노산 변형 또는 변형된 펩타이드에 기초하여 설계된 암 백신과 같은 백신을 제공한다.

본 발명에 따라, 용어 "백신"은 투여될 경우 암 세포와 같은 질병 세포 또는 병원균을 인식 및 공격하는, 면역 반응 특히 세포성 면역 반응을 유도하는 의약 조제물(의약 조성물) 또는 생성물에 관계된다. 백신은 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. "개별화된 암 백신(personalized cancer vaccines) 또는 (individualized cancer vaccines)"이라는 용어는 특정한 암 환자에 관계되어 암 백신이 필요에 따라 개별적인 암 환자의 특수 환경에 알맞게 조정되는 것에 관계된다

일 구체예에서, 본 발명에 따라 제공된 백신은 본 발명의 방법에 따라 면역원성으로 예측된 하나 이상의 아미노산 변형를 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 변형된 펩타이드 또는 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 좋기로는 RNA를 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 제공되는 암 백신은 환자에게 투여시 환자의 종양에 특이적인 T 세포를 자극, 프라이밍 및/또는 확장하는데 적합한 하나 이상의 T 세포 에피토프를 제공한다. T 세포는 좋기로는 그 T 세포 에피토프가 유래된 항원을 발현하는 세포에 지향된 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에서 설명된 백신들은 좋기로는 클래스 I MHC에 의해 하나 이상의 종양-관련 신생항원의 제시를 특징으로 하는 암 질환에 대해 세포 반응, 바람직하게는 세포독성 T 세포 활성을 유도 또는 촉진할 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명에서 제공되는 백신은 암 특이 돌연변이를 표적으로 할 것이므로, 당해 환자의 종양에 특이적일 것이다.

본 발명에서 제공되는 백신은 환자에게 투여될 경우 본 발명의 방법에 의해 면역원성으로 에측된 아미노산 변형 또는 변형된 펩타이드들과 연관된 T 세포 에피토프를 하나 이상, 예컨대 2 이상, 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 30 이상 및 좋기로는 60 이하, 55 이하, 50 이하, 45 이하, 40 이하, 35 이하 또는 30개 이하 제공하는 백신에 관한 것이다. 이러한 T 세포 에피토프는 본 발명에서 "네오-에피토프"라고도 칭해진다. 환자의 세포, 특히 항원 제시 세포에 의한 이들 에피토프의 제시는 좋기로는 MHC와 결합시 그 에피토프를 표적화하는 T 세포를 초래하며 따라서, 환자의 종양, 좋기로는 원발성 종양 뿐 아니라 종양 전이도 표적화하고, 그 T 세포 에피토프가 유래된 항원을 발현하며 당해 종양 세포 표면에서 동일한 에피토프를 제시한다.

본 발명의 방법은 암 백신접종을 위해 동정된 아미노산 변형 또는 변형된 펩타이드의 유용성을 알아내는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 다음 중 하나 이상의 추가 단계들을 더 포함할 수 있다: 변형이 공지의 또는 예측된 MHC 제시된 에피토프 내에 위치하는지를 평가; (ii) 변형이 MHC 제시된 에피토프 내에 위치하는지를 테스트, 예컨대 변형이 MHC 제시된 에피토프로 프로세스되고 및/또는 MHC 제시된 에피토프로서 제시되는 펩타이드 서열의 일부인지를 테스팅하는 시험관내 및/또는 인실리코 테스팅, 및 (iii) 상정된 변형된 에피토프, 특히 천연 서열 컨텍스트로 존재할 경우, 예컨대 자연발생적인 단백질 내의 상기 에피토프 역시도 플랭킹하는 아미노산 서열에 의해 플랭킹되고, 항원제시 세포에서 발현될 될 경우, 상정된 변형된 에피토프가 소망되는 특이성을 갖는 환자의 T 세포와 같은 T 세포를 자극할 수 있는지를 시험하는 시험관내 테스팅 중 한 가지 이상을 포함할 수 있다. 이러한 플랭킹 서열은 각각 3 이상, 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상 및 좋기로는 50 이하, 45 이하, 40 이하, 35 또는 30 이하의 아미노산을 포함할 수 있고 에피토프 서열을 N-말단적 및/또는 C-말단적으로 플랭크할 수 있다.

본 발명에 따라 탐지된 변형된 펩타이드들은 암 백신접종을위한 에피토프로서의 그들의 유용성에 대해 등급을 매길 수 있다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명의 방법은 동정된 변형된 펩타이드를 분석하고 제공하고자 하는 대응하는 백신에서의 그들의 유용성에 알맞게 펩타이드를 선택하는, 수동식 또는 컴퓨터-기반 분석 프로세스를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 분석 프로세스는 컴퓨터화된 알고리듬-기반 프로세스이다. 좋기로는 상기 분석 프로세스는 그들이 면역원성일 가능성에 대한 예측에 따라 에피토프를 탐지 및/또는 등급 매기는 것을 포함한다.

본 발명에 따라 동정되고 본 발명의 백신에 의해 제공된 네오-에피토프는 좋기로는 상기 네오-에피토프를 포함하는 폴리펩타이드의 형태 예컨대 폴리에피토프 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 특정 RNA와 같은 핵산으로서 존재하는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 네오-에피토프는 백신 서열의 형태로 폴리펩타이드 내에 존재할 수 있다. 즉, 그의 천연 서열 맥락으로, 예컨대 자연 발생적인 단백질에서 상기 에피토프도 플랭킹하는 아미노산 서열에 의해 플랭킹되는 형태로 존재할 수 있다. 이러한 플랭킹 서열은 각각 each 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상 및 좋기로는 50 이하, 45 이하, 40 이하, 35 또는 30 개 이하의 아미노산을 포함할 수 있고 N-말단적으로 및/또는 C-말단 적으로 에피토프 서열을 플랭킹할 수 있다. 따라서, 백신 서열은 20 이상, 25 이상, 30 이상, 35 이상, 40 이상 및 좋기로는 50 이하, 45 이하, 40 이하, 35 또는 30 개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 네오-에피토프 및/또는 백신 서열은 폴리펩타이드 헤드-투-테일로 라인업된다.

일 구체예에서, 네오-에피토프 및/또는 백신 서열은 링커 특히 중성(neutral) 링커에 의해 이격된다. 본 발명에서 "링커"라는 용어는 에피토프 또는 백신 서열과 같은 2개의 펩타이드 도메인 사이에 첨가되어 상기 펩타이드 도메인들을 연결해주는 펩타이드에 관계된다. 링커 서열과 관련하여 특별한 제한은 없다. 그러나, 링커 서열은 2개의 펩타이드 도메인들 사이의 입체구조적 방해를 감소시키고, 잘 번역되며, 에피토프의 프로세싱을 지지 또는 가능케해주는 것이 바람직하다. 뿐만 아니라, 링커는 면역원성 서열 요소를 전혀 또는 거의 갖지 않아야 한다. 링커들은 좋기로는 원치 않는 면역 반응을 일으킬 수도 있는, 인접 네오-에피토프들 간의 정션 결합(junction suture)으로부터 발생하는 것들과 유사한 비-내인성(non-endogenous) 네오-에피토프는 생성하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 폴리에피토프 백신은 좋기로는 원치 않는 MHC 결합 정션 에피토프의 수를 감소시킬 수 있는 링커 서열을 함유하는 것이 바람직하다. Hoyt 등 ( EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006) 및 Zhang 등 (J. Biol . Chem ., 279(10), 8635-41, 2004)은 글리신이 풍부한 서열들이 프로테오좀 프로세싱을 손상시킴에 따라 글리신이 풍부한 링커 서열의 사용이 프로테오좀에 의해 프로세싱될 수 있는 링커-함유된 펩타이드의 수를 최소화시킨다는 것으로 밝혀냈다. 또한, 글리신은 MHC 결합 그루브 위치에서 강력한 결합을 억제하는 것으로 관찰되었다 ( Abastado 등, J. Immunol . 151(7), 3569-75, 1993). Schlessinger 등 (Proteins, 61(1), 115-26, 2005)은 아미노산 서열에 포함된 아미노산들인 글리신 및 세린이 프로테아좀에 의해 보다 효과적으로 번역 및 프로세싱되어, 인코딩된 네오-에피토프에 보다 잘 접근하게 해주는 보다 유연한 단백질을 야기한다는 것을 밝혀냈다. 각각의 링커는 3 이상, 6 이상, 9 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상 및 좋기로는 50 이하, 45 이하, 40 이하, 35 또는 30개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다. 좋기로는 링커는 글리신 및/또는 세린 아미노산이 풍부한 것이 바람직하다. 좋기로는 링커 아미노산의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 글리신 및/또는 세린인 것이 바람직하나. 바람직한 일 구체예에서, 링커는 실제로 아미노산 글리신 및 세린으로 구성된다. 일 구체예에서, 링커는 아미노산 서열 (GGS)_a(GSS)_b(GGG)_c(SSG)_d(GSG)_e로 구성되되, 여기서 a, b, c, d 및 e는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20으로부터 독립적으로 선택된 숫자이고 a + b + c + d + e는 0이 아니며 좋기로는 2 이상, 3 이상, 4 이상 또는 5 이상이다. 일 구체예에서, 링커는 예컨대 서열 GGSGGGGSG와 같이 실시예에 설명된 링커 서열을 포함하는 본 명세서에 설명된 바와 같은 서열을 포함한다.

특히 바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리에피토프 폴리펩타이드와 같은 1 이상의 네오-에피토프가 병합된 폴리펩타이드를 항원 제시 세포와 같은 환자의 세포에서 발현되어 그 폴리펩타이드를 생산하는 핵산, 좋기로는 시험관내 전사되거나 합성된 RNA와 같은 RNA의 형태로 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 목적 상 "폴리에피토프 폴리펩타이드"에 포괄되는 하나 이상의 멀티에피토프 폴리펩타이드를, 좋기로는 항원 제시 세포와 같은 환자의 세포에서 발현되어 하나 이상의 폴리펩타이드를 생산하는 핵산, 좋기로는 시험관내 전사되거나 합성된 RNA와 같은 RNA의 형태로 투여하는 것을 상정한다. 멀티에피토프 폴리펩타이드를 하나 보다 많이 투여할 경우, 상이한 멀티에피토프 폴리펩타이드에 의해 제공되는 네오-에피토프는 상이하거나 부분적으로 중복될 수 있다. 일단 항원 제시 세포와 같은 환자의 세포 내에 존재하면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 본 발명에 따라 동정된 네오-에피토프를 생산하도록 프로세싱된다. 본 발명에 따라 제공된 백신을 투여하면 MHC 제시된 에피토프가 유래되는 항원 발현 세포에 대해 CD4+ 헬퍼 T 세포 응답을 이끌어낼 수 있는 MHC 클래스 II - 제시된 에피토프가 제공될 수 있다. 별법으로 또는 이에 더해, 본 발명에 따라 제공된 백신을 투여하면 MHC 제시된 에피토프가 유래되는 항원 발현 세포에 대해 CD8+ T 세포 응답을 이끌어낼 수 있는 MHC 클래스 I - 제시된 에피토프가 제공될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따라 제공되는 백신을 투여하면 하나 이상의 네오-에피토프 (공지의 네오-에피토프 및 본 발명에 따라 동정된 네오-에피토프를 포함함) 뿐만 아니라, 암 특이 체세포 돌연변이는 함유하지 않지만, 암 세포에 의해 발현되고 좋기로는 암 세포에 대한 면역 반응을 유도하는, 좋기로는 암 특이 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 에피토프가 제공될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 따라 제공되는 백신을 투여하면 MHC 클래스 II - 제시된 에피토프 및/또는 MHC 제시된 에피토프가 유래된 항원 발현 세포에 대해 CD4+ 헬퍼 T 세포 반응을 이끌어낼 수 있고 MHC 클래스 I-제시된 에피토프인 암-특이 체세포 돌연변이를 함유하지 않는 에피토프 및/또는 MHC 제시된 에피토프가 유래된 항원 발현 세포에 대해 CD8+ T 세포 반응을 이끌어낼 수 있는, 네오-에피토프가 제공된다. 일 구체예에서, 암-특이 체세포 돌연변이를 함유하지 않는 에피토프는 종양 항원으로부터 유래된다. 일 구체예에서, 암-특이 체세포 돌연변이를 함유하지 않는 에피토프 및 네오-에피토프는 암 치료시 상승 효과를 나타낸다. 좋기로는 본 발명에 따라 제공되는 백신은 세포독성 및/또는 헬퍼 T 세포 반응의 폴리에피토프 자극에 유용하다.

본 발명에 따라 제공되는 백신은 재조합 백신일 수 있다.

본 발명의 문맥 상 용어 "재조합"은 "재조합 유전자를 통해 만들어진 것"을 의미한다. 좋기로는 본 발명의 문맥 상 재조합 핵산과 같은 "재조합 엔터티(recombinant entity)"는 자연발생적인 것이 아니며, 좋기로는 자연에서는 조합되지 않는 아ㅏ미노산 또는 핵산 서열과 같은 엔터티들의 조합의 결과이다. 예를 들어, 본 발명의 관점에서 재조합 폴리펩타이드는 예컨대 펩타이드 결합 또는 적절한 링커에 의해 한데 융합된 동일합 단백질의 상이한 부분들 또는 상이한 단백질로부터 유래된 네오-에피토프 또는 백신 서열과 같은 몇몇 아미노산 서열을 함유할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "자연발생적인"이라는 표현은 물체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 가리킨다. 예를 들어, 어떤 유기체(바이러스를 포함한다) 내에 존재하고 자연의 소스로부터 분리가능하며 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩타이드 또는 핵산은 자연발생적인 것이다.

본 발명에 설명된 제제, 조성물 및 방법은 질환, 예컨대 항원을 발현하고 그의 단편을 제시하는 질병 세포의 존재에 의해 특징지어지는 질환을 치료하는데 이용될 수있다. 특히 바람직한 질환은 암 질환이다. 본 발명에 설명된 제제, 조성물 및 방법은 본 발명에 설명된 질환의 예방을 위한 면역화 또는 백신접종에도 사용될 수 있다.

본 발명에 따라, "질환"이라는 용어는 암, 특히 본 명세서에 설명된 유형의 암을 비롯하여 모든 병리적 상태를 일컫는다.

"정상(normal)"이라는 용어는 건강한 대상자 또는 조직의 건강한 상태 또는 조건, 즉 비-병리학적 조건을 가리키는 것으로 여기서 "건강한"은 비-암을 의미한다.

본 발명에서 "항원을 발현하는 세포와 관련된 질환"은 본 발명에 따라 병에 걸린 조직 또는 장기의 세포에서 그 항원의 발현이 검출됨을 의미한다. 병에 걸린 조직 또는 장기의 세포에서의 발현은 건강한 조직이나 장기에서의 상태와 비교할 때 증가된 것일 수 있다. 증가란 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 또는 그 이상의 증가를 의미한다. 일 구체예에서, 건강한 조직에서의 발현은 억제되는 반면, 발현은 병에 걸린 조직에서만 발견된다. 본 발명에서, 항원을 발현하는 세포와 관련된 질환에는 암 질환이 포함된다.

본 발명에 따라, 용어 "종양" 또는 "종양 질환"은 좋기로는 팽윤 또는 병변을 형성하는 세포의 비정상적인 성장 (신생 세포, 종양성 세포 또는 종양 세포라 칭해짐)을 가리킨다. "종양 세포"라 함은 급속하게 제어되지 않는 세포 증식에 의해 성장하고 그 새로운 성장을 개시시킨 자극이 멈춘 후에도 지속적으로 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 종양은 정상 조직과의 기능적 연계 및 구조적 조직화가 부분적으로 또는 완전히 결여되어 있으며 대체로 양성, 전악성 또는 악성일 수 있는 원격 조직 덩어리를 형성한다.

암(의학 용어: 악성 신생물)은 일군의 세포들이 조절되지 않은 성장(정상 한계를 넘어선 분열), 침습 (인접 조직으로의 침투 및 파괴) 및 때때로 전이(림프 또는 혈액을 통해 체내 다른 부위로 확산)를 나타내는 질환 부류이다. 암의 이러한 3 가지 악성적인 특성들은, 자가-제한적이고, 침습 또는 전이하지 않는 양성 종양으로부터 이들은 구별짖는다. 대부분의 암은 종양을 형성하지만, 백혈병과 같은 몇몇 암은 그렇지 않다. 악성, 악성 신생물 및 악성 종양은 기본적으로 암과 동의어이다.

신생물(neoplasm)은 신생물 형성(neoplasia)의 결과인 조직의 비정상적인 덩어리이다. 신생물 형성 (그리스어로 새로운 성장)은 세포의 비정상적 증식이다. 세포의 성장이 과도하여, 주변의 정상 조직의 그것과 조화를 이루지 못한다. 성장은 자극 중단 후에도 동일하게 과도한 방식으로 지속된다. 이것은 대체로 덩어리(lump) 또는 종양을 일으킨다. 신생물은 양성, 전악성 또는 악성일 수 있다.

본 발명에서 "종양의 성장" 또는 "종양 성장"은 종양이 그의 크기를 키우려는 경향 및/또는 종양 세포가 증식하려는 경향에 관계된다.

본 발명의 목적 상, "암" 및 "암 질환"이라는 용어는 "종양" 및 "종양 질환"이라는 용어와 호환적으로 사용된다.

암은 종양과 유사한 세포 종류, 따라서 그 종양의 기원으로 추정되는 조직의 종류에 의해 분류된다. 이들은 각각 조직학 및 위치에 대응한다.

본 발명에서 "암"이라는 용어는 암종, 선암종, 모세포종, 백혈병, 정상피종, 흑색종, 기형암종, 림프종, 신경모세포종, 신경아교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌의 암, 자궁경부암, 장암, 간암, 결장암, 위암, 장암, 두경부암, 위장관암, 림프절암, 식도암, 대장암, 췌장암, 귀, 코 및 인후(ENT)암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 이들의 전이암을 포함한다. 이의 예로는 폐암종, 유방암종, 전립선암종, 결장암종, 신장세포암종, 자궁경부암종, 또는 전술한 암이나 종양의 전이암을 들 수 있다. 본 발명에 따른 용어 암은 전이암과 암의 재발 역시도 포괄한다.

"전이(metastasis)"라 함은 암 세포가 그의 원래 자리로부터 체내의 다른 부분으로 확산되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정으로서 종양으로부터 악성 세포의 탈착, 세포외 매트릭스의 침습, 상피기저막의 침입에 의한 체강 및 혈관으로의 유입 및 이어서 혈액에 의한 운반 후 표적 장기내로의 침윤에 의존한다. 마지막으로, 표적 부위에서의 새로운 종양, 즉 2차 종양 또는 전이 종양의 성장은 혈관신생에 의존한다. 종양 전이는 원발성 종양의 제거 후에도 종양 세포 또는 성분들이 남아있을 수 있거나 전이 잠재능을 발달시키기 때문에 종종 발생한다. 일 구체예에서, 본 발명에 따라 "전이"라는 용어는 원발성 종양 및 지역 림프절 시스템으로부터 멀리 떨어진 전이에 관한 것인 "원격전이(distant metastasis)"에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 "전이"라는 용어는 림프절 전이에 관한 것이다. 본 발명의 치료법으로 치료가능한 전이의 한 가지 특별한 형태는 원발 부위로서 위암으로부터 기원하는 전이이다. 바람직한 구체예에서 이러한 위암 전이는 크루켄버그(Krukenberg) 종양, 복강 전이 및/또는 림프절 전이이다.

2차 종양 또는 전이 종양의 세포는 원래의 종양의 세포들과 유사하다. 이것은 예컨대, 만일 난소암이 간으로 전이되면, 그 2차 종양은 비정상적인 간 세포가 아니라 비정상적인 난소 세포로 구성됨을 의미한다. 이러한 간의 종양은 따라서 전이 간암이 아니라 전이 난소암으로 칭해진다.

"순환 종양 세포" 또는 "CTCs"라는 용어는 원발 종양 또는 종양 전이로부터 이탈하려 혈류 내를 순환하는 세포들에 관계된 것이다. CTCs는 상이한 조직 들에서 부가적인 종양(전이)의 후속적인 성장을 위한 종정(seed)를 구성할 수 있다. 순환 종양 세포는 전이 질환에 걸린 환자의 전혈 mL 당 1-10 CTC의 수준의 빈도로 발견된다. CTC를 분리하기 위한 연구 조사방법이 개발되었다. 기술 분야의 몇몇 연구 조사 방법은 상피 세포가 정상적인 혈액 세포에는 존재하지 않는, 세포 부착 단백질 EpCAM을 공통적으로 발현한다는 사실을 이용하는 기술을 이용하여 CTC를 분리한 것으로 설명하고 있다. 면역자석 비드-기반 포획법은 자석 입자들과 컨쥬게이션된 EpCAM에 대한 항체로 혈액 표본을 처리한 다음, 태그된 세포를 자기장에서 분리하는 기술이다. 분리된 세포들은 이어서 다른 상피 마커, 시토케라틴에 대한 항체 및 흔한 백혈구 마커 CD45로 염색하여, 오염된 백혈구 세포로부터 희귀한 CTC를 구별짓는다. 이와 같은 완고하고 반자동화된 접근법은 CTC를 대략 1 CTC/mL의 평균 수율 및 0.1%의 순도로 동정한다 ( Allard 등, 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904). CTCs를 분리하기 위한 두 번째 방법은 EpCAM에 대한 항체로 코팅함으로써 기능성이 부여된 80,000개의 마이크로포스트가 매립된 챔버를 통해 전혈을 흘려보내는 것을 포함하는 마이크로플루이드-기반 CTC 포획 디바이스를 이용한다. 이어서 CTCs를 전립선 암의 경우 PSA, 유방암의 경우 HER2와 같은 조직 특이 마커 또는 시토케라틴에 대한 2차 항체로 염색하고 3차원 좌표를 따라 복수 프레인에서 마이크로포스트를 자동 스캐닝함으로써 가시화한다. CTC-칩들은 환자에서 시토켈라틴-양성 순환 종양 세포를 평균 수율 50 세포/ml 및 1-80%의 순도 범위로 동정할 수 있게 해준다 (Nagrath 등, 2007: Nature 450, 1235-1239). CTCs를 동정하기 위한 또 다른 가능성은 혈액 튜브에서 CTC를 포획, 동정 및 계수하는 Veridex, LLC (Raritan, NJ)사의 CellSearch^TM Circulating Tumor Cell (CTC) Test이다. CellSearch^TM 시스템은 면역자석 표지 및 자동화된 디지털 현미경의 조합에 기반한, 전혈에서 CTC를 계수하기 위한 미국 FDA에 의해 승인된 방법론이다. 문헌에는 그 밖에도 CTC를 분리하기 위한 다른 방법들이 설명되어 있으며 이들 모두 본 발명에 참조 병합되어 사용가능하다.

재발(relapse 또는 recurrence)은 개체가 과거에 걸렸던 질병 상태에 다시 걸리게 되는 경우에 일어난다. 예를 들어, 만일 환자가 종양 질환을 앓고, 상기 질환이 성공적으로 치료되었으나 상기 질환이 다시 발병할 경우 상기 새롭게 발병된 질환은 재발한 것라고 간주할 수 있다. 그러나, 본 발명에서 종양 질환의 재발은 반드시 본래 종양이 일어난 위치에서 다시 나타나리라는 법은 없다. 따라서, 예를 들어, 만일 환자가 난소 종양에 걸렸었고 성공적으로 치료되었으나 종양 재발은 난소가 아닌 다른 부위에서 난소 종양이 일어나거나 종양이 일어날 수 있다. 종양의 재발은 본래의 종양과 동일한 위치 뿐 아니라 본래의 종양과 다른 위치에서 일어나는 상황도 포함한다. 좋기로는 환자가 그에 대한 치료를 받았던 본래의 종양은 원발 종양이고 본래의 종양과 다른 위치에서 일어난 종양은 2차 종양 또는 전이 종양이다.

"치료하다(treat)"라 함은 대상자에서 종양의 크기 또는 종양의 수를 감소시키는 것; 대상자의 질환 진행을 멈추거나 둔화시키는 것; 대상자에서 새로운 질병의 발달을 억제하거나 둔화시키는 것; 현재 질병에 걸려 있거나 이전에 질병에 걸렸었던 대상자에서 증상 및/또는 재발의 빈도나 위중도를 감소시키는 것; 및/또는 대상자의 수명을 연장, 즉 증가시키는 것을 비롯하여, 질병을 예방 또는 제거하기 위해, 대상자에게 본 발명에 설명된 화합물이나 조성물을 투여하는 것을 의미한다.

"위험에 처하다"라는 표현은 일반 집단에 비해, 어떤 대상자, 즉 환자에서 질병, 특히 암이 일어날 정상적인 기회가 더 높은 것으로 동정된 것을 의미한다. 또한, 질병, 특히 암에 걸렸었거나, 현재 걸린 대상자는 질환이 계속적으로 일어날 수 있으므로, 질환에 걸릴 위험성이 큰 대상자이다. 현재 암에 걸려있거나 암에 걸렸던 적이 있는 대상자 역시 암 잔이 위험성이 증가된 대상자이다.

"면역요법(immunotherapy)"이라는 용어는 특이적인 면역 반응의 활성화가 관여하는 치료방법에 관계된다. 본 발명의 관점에서, "보호", "방지", "예방", "방지하는", "보호적인" 등의 용어는 대상자에 있어서 어떤 질병의 발병 및/또는 전파의 예방 또는 치료 또는 양자 모두에 관한 표현으로서, 특히, 대상자에 있어서 질병의 진행 기회를 최소화하거나 질병의 진행을 지연시키는 것과 관련된 표현이다. 예를 들어, 암에 걸릴 위험이 있는 개체는 암 예방 요법의 후보가 된다.

면역요법의 예방적 투여, 예컨대 본 발명의 백신의 예방적 투여는 좋기로는 수혜자(recipient)를 질환의 발달로부터 보호한다. 면역요법의 치료적 투여, 예컨대 본 발명의 백신의 치료적 투여는 그 질환의 진행/성장의 억제로 이어질 수 있다. 이것은 그 질환의 진행/성장의 감속, 특히 그 질환의 진행의 파괴를 포함하며 좋기로는 그 질환의 제거로 이어진다.

면역요법은 본 발명에서 제공되는 제제가 환자로부터의 병에 걸린 세포를 제거하는 기능을 하는, 다양한 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 제거는 항원 또는 항원을 발현하는 세포에 특이적인 면역 반응을 환자에서 유도하거나 증강시킨 결과로서 발생하는 것일 수 있다.

특정 구체예에서, 면역요법은 능동 면역요법일 수 있는데 이 경우 치료는 면역 반응-변형제(예컨대 본 발명에서 제공되는 바와 같은 폴리펩타이드 및 핵산)을 이용하여 질병에 걸린 세포에 대해 반응하기 위한 내인성 숙주 면역계의 생체내 자극에 의존한다.

본 발명에서 제공되는 제제 및 조성물은 단독으로 사용되거나 또는 외과수술, 방사능 요법, 화학요법 및/또는 골수이식(자가, 동계, 동종이계 또는 무관련)과 같은 치료법과 조합적으로 사용될 수도 있다.

용어 "면역화(immunization)" 또는 "백신접종(vaccination)"는 치료 또는 예방학적 이유로 면역반응을 유도할 목적으로 환자를 치료하는 프로세스를 설명한다.

"생체내(in vivo)"라는 용어는 대상자 체내의 상황과 관련된다.

"대상자", "개체", "생명체" 또는 "환자" 등의 용어는 호환적으로 사용되며 척추동물 좋기로는 포유동물에 관계된다. 예를 들어, 본 발명의 문맥 상 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 가축화된 동물 예컨대 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등, 실험실 동물 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그 등 뿐만 아니라 동물원에 포획된 동물을 포괄한다. 본 발명에서 "동물"이라는 용어에는 인간도 포함된다. "대상자"라는 용어는 환자, 즉 동물, 좋기로는 질환, 좋기로는 본 발명에 설명된 질환에 걸린 환자를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "자가(autologous)"는 동일한 대상자로부터 유래하는 것을 설명하는데 사용된다. 예를 들어, "자가이식(autologous transplant)"이라 함은 동일한 대상자로부터 유래하는 조직이나 장기의 이식을 가리킨다. 이러한 절차는 그렇지 않다면 이식거부를 야기할 면역장벽을 극복해주므로 유리하다.

본 발명에서 사용되는 용어 "이종(heterologous)"이라는 표현은 복수개의 서로 다른 요소들로 이루어진 것들을 설명하는데 사용된다. 일례로서, 어떤 개체의 골수를 다른 개체로 전달하는 것은 이종 이식을 구성하는 것이다. 이조오 유전자는 그 대상자와는 다른 소스로부터 유도된 유전자이다.

면역화 또는 백신접종을 위한 조성물의 일부로서, 좋기로는 본 발명에 설명된 1종 이상의 제제를 면역 반응의 유도 또는 면역 반응의 증가를 위한 1종 이상의 아쥬반트와 함께 투여한다. 용어 "아쥬반트(adjuvant)"는 면역반응을 연장, 증강 또는 가속화하는 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 좋기로는 아쥬반트 첨가 없이 그의 효과를 발휘한다. 그러나 본 발명의 조성물은 공지의 아쥬반트를 함유할 수도 있다. 아쥬반트는 오일 에멀젼(예컨대, Freund's 아쥬반트), 미네랄 화합물 (예컨대 명반), 박테리아 생성물(예컨대 Bordetella pertussis 독소), 리포좀 및 면역-자극 복합체와 같은 화합물들의 이종 그룹을 포함한다. 아쥬반트의 예로는 모노포스포릴-지질-A (MPL SmithKline Beecham)을 들 수 있다. 사포닌 예컨대 QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, 및 QS-L1 (So 등, 1997, Mol. Cells 7: 178-186), 불완전 Freund's 아쥬반트, 완전 Freund's 아쥬반트, 비타민 E, 몬타니드, 명반, CpG 올리고뉴클레오타이드 (Krieg 등, 1995, Nature 374: 546-549), 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤과 같은 생물학적으로 분해가능한 오일로부터 제조되는 다양한 유중수형 에멀젼을 들 수 있다.

환자의 면역 반응을 자극하는 기타 물질 역시도 투여할 수 있다. 예컨대, 림프구에 대한 그들의 규칙적인 특성으로 인해, 백신접종에 사이토카인을 이용할 수 있다. 이러한 사이토카인의 예로는, 백신의 보호 활성을 증가시키는 것으로 나타난 인터류킨-12 (IL-12) (cf. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF 및 IL-18을 들 수 있다.

면역 반응을 증강시키고 그에 따라 백신 접종에 이용가능한 화합물들이 몇가지 존재한다. 상기 화합물들은 B7-1 및 B7-2 (각각 CD80 및 CD86)와 같은 핵산 또는 단백질 형태로 제공되는 공-자극 분자를 포함한다.

본 발명에 따라, 체성분 샘플은 체액을 비롯한 조직 샘플, 및/또는 세포성 샘플을 포함할 수 있다. 이러한 체성분 샘플은 펀치 생검을 비롯한 조직 생검 및 혈액, 기관지 흡인물, 가래, 소변, 대변 또는 기타 체액을 채취하는 통상적인 방식으로 수득가능하다. 본 발명에서, "샘플"이라는 용어에는 예컨대 핵산 또는 세포 분리물과 같은 생물학적 샘플의 분획 또는 분리물과 같은 가공된 샘플이 포함된다.

본 발명에 설명된 조성물 및 백신과 같은 제제는 조사 또는 주입을 비롯한 통상적인 경로로 투여될 수 있다. 투여는 예컨대 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 경피 경로로 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 투여는 림프절 내로 주사하는 것과 같은 결절내(intranodally)로 수행 가능하다. 기타 투여 형태로는 본 발명에 설명된 핵산으로 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포를 시험관내 트랜스펙션시킨 다음 상기 항원 제시 세포를 투여하는 것을 상정할 수 있다.

본 발명에 설명된 제제는 유효량으로 투여된다. "유효량"이라 함은 그 단독으로 또는 추가 투여량(doses)과 함께 소망되는 반응 또는 소망되는 효과를 내래 수 있는 양이다. 특정 질환 또는 특정 상태를 치료하는 경우, 소망되는 반응은 좋기로는 그 질환의 경과를 억제하는 것에 관한다. 이것은 질병의 진행을 둔화시키는 것, 특히, 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병 또는 상태의 치료시 소망되는 반응은 또한 상기 질병이나 상기 상태의 개시를 둔화시키거나 개시를 방지하는 것일 수도 있다.

본 발명에 설명된 제제는 치료하고자 하는 상태, 질병의 위중도, 환자의 개별적인 변수, 예컨대 연령, 생리적 상태, 크기 및 체중, 치료 기간, 부수되는 치료법의 종류(있을 경우), 특정 투여 경로 및 유사 인자들에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명에 설명된 물질의 투여량은 이러한 다양한 변수에 따라 달라진다. 만일 환자의 반응이 초기 투여량으로 불충분할 경우, 더 많은 투여량(또는 보다 국소적인, 다른 투여 령로에 의해 달성되는 효과적으로 더 높은 투여량)이 사용될 수 있다.

본 발명에 설명된 의약 조성물은 좋기로는 멸균된 것이며 소망되는 반응 또는 소망되는 효과를 생성하기 위해 치료적 활성 물질의 유효량을 함유한다.

본 발명에 설명된 의약 조성물은 일반적으로 약학적으로 적합한 양 및 약학적으로 적합한 조제물로서 투여된다. "약학적으로 적합한 (pharmaceutically compatible)"이라는 용어는 의약 조성물의 활성 성분의 작용과 상호반응하지 않는 비독성 물질을 가리킨다. 이러한 종류의 조제물은 대개 예컨대 염, 완충 물질, 보존제, 담체, 아쥬반트와 같은 보조 면역-증강물질, 예컨대 CpG 올리고뉴클레오타이드, 사이토카인, 케모카인, 사포닌, GM-CSF 및/또는 RNA을 함유하며 적절한 경우 기타 치료 활성 화합물도 함유한다. 의약에 사용될 경우, 염은 약학적으로 적합하여야 한다. 그러나, 약학적으로 적합하지 않은 염들을 이용하여 약학적으로 적합 염을 만들 수 있으며 이들 역시 본 발명에 속한다. 이러한 종류의 약학적 및 약리학적으로 적합한 염에는 다음의 산으로부터 제조되는 것이 포함되나 이에 한정되지 않는다: 염산, 히드로브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등. 약학적으로 적합한 염은 또한 알칼리금속 염이나 알칼리토금속염, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염으로서 제조될 수도 있다.

본 발명에 설명된 의약 조성물은 약학적으로 적합한 담체를 포함할 수 있다. "담체"라는 용어는 활성성분의 적용을 용이화, 증강 또는 가능하게 하기 위해, 활성성분과 조합되는, 천연 또는 합성된 유기 또는 무기 성분을 가리키다. 본 발명에서 "약학적으로 적합한 담체"라는 용어는 환자에게 투여하기에 적합한 1종 이상의 적합한 고상 또는 액상 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함한다. 본 발명의 의약 조성물의 성분들은 대체로 소망되는 약학적 효능을 실질적으로 손상시키는 상호반응이 일어나지 않도록 하는 것들이다.

본 발명에 설명된 의약 조성물은 아세트산 염, 시트르산 염, 붕산염 인산 염과 같은 적절한 완충제를 함유할 수 있다.

의약 조성물은 적절한 경우 벤잘코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살과 같은 적절한 보존제 역시도 함유할 수 있다.

의약 조성물은 대개 단위 투여 형태로 제공되며 그 자체로 공지인 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 캡슐, 정제, 로젠지, 용액, 현탁액, 시럽, 엘릭시르 또는 예컨대 에멀젼의 형태일 수 있다.

비경구 투여에 적합한 조성물은 대체로 수혜자의 혈액과 등장성인, 활성 화합물의 멸균 수성 또는 비수성 제제를 포함한다. 적합한 담체 및 용매의 예로는 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액을 들 수 있다. 이에 더해, 대체로 멸균된 고정 오일을 용액 또는 현탁액 매질로서 이용한다.

이하에 도면과 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 이들은 어디까지나 설명 목적을 위한 것일 뿐 본 발명이 이들 도면과 실시예로 한정되는 것은 아니다. 이러한 설명과 실시예에 기반하여, 통상의 기술자들은 본 명세서에 포함된 것과 유사한 추가의 구체예들도 실시할 수 있다.

도 1. MHC 결합 예측법 개관
도 2. 우선처리된 (prioritized) 52종의 B16F10 돌연변이 및 우선처리된 82종의 CT26 .WT 돌연변이 (총 132가지 돌연변이)에 대한 M _mut 점수의 함수로서의 면역원성 분석 결과, 이 중 30개가 면역원성이었음. 모든 백신 접종은 RNA를 이용하여 수행하였다. B16F10의 경우 BMDC를 RNA로 챌린징하고 비장 세포의 면역 반응을 ELISPOT 및 FACS를 이용하여 측정함으로써 면역원성을 분석하였다. CT26.WT의 경우 BMDCs를 RNA 및 펩타이드로 개별적으로 챌린징한 다음 ELISPOT을 이용하여 비장 세포의 면역 반응을 측정하여 면역원성을 분석하였다; 등록된 펩타이드나 RNA 중 어느 쪽이 면역 반응을 나타내면 돌연변이는 면역원성인 것으로 간주하였다. A M _mut 점수의 함수로서의 면역원성 돌연변이의 누적 분포. 이 그래프는 주어진 M _mut 점수 (적색) 미만의 돌연변이의 총수를 보여주며, 이들 중 면역원성(청색)인 돌연변이의 갯수, 그리고 총합으로부터의 면역원성 돌연변이의 퍼센트(흑색)을 보여준다. B M _mut 결합(bin) 당 면역원성 돌연변이의 퍼센트 히스토그램은 다음 범위로 나타났다: ≤0.3, (0.3, 1], >1. 오차는 표준 오차로 나타냄.
도 3. M _mut . 함수로서의 B16F10 및 CT26 .WT 면역원성 분석
B16 (A) 및 CT26 (C)에 대한 M _mut 점수의 함수로서의 면역원성 돌연변이의 누적 분포. M _mut 결합(bin) 당 면역원성 돌연변이의 퍼센트 히스토그램은 다음 범위로 나타났다: B16 (B) 및 CT26 (D)의 경우 [0.1, 0.3], (0.3, 1], (1,∞). 도 A 및 B는
are based on analysis of B16F10 우선처리된 50 가지 돌연변이의 분석에 기초한 것으로 이들 중 12가지는 면역원성이었다. 도 C 및 D는 B16F10 우선처리된 82가지 돌연변이의 분석에 기초한 것으로, 이들 중 30가지가 면역원성이었다. 보다 상세한 내용은 도 2의 설명을 참조할 것. 오차는 표준 오차이다.
도 4. 면역원성 및 대조군 가설 모델. H_A로 표시된 클래스 I 면역원성은 WT 및 MUT 에피토프 두 가지 모두가 세포에 의해 제시되고 그 돌연변이 충분성이 아미노산의 이화학적 특성을 변경시켜 면역계가 이 변화를 기록하여 면역 반응(번개 표시됨)을 발생시켰다는 추정을 가능케 한다. H_A에 대해 대조군 역할을 하는 H_n 가설은 단순히 역전된 H_A 가설로서, 즉 돌연변이가 아미노산의 이화학적 특성을 유의적으로 변경시키지 않아서 면역계에 의해 "검출/감지(detected)"되어 면역 반응이 일어날 가능성이 낮음을 나타낸다. 클래스 II 면역원성 (H_B U H_C)에서 WT 에피토프는 제시되지 않으나 MUT 에피토프는 제시된다. H_B 및 H_C는 각각 높은 (T>α) 대 낮은 (T≤α) T 점수에 의해 구별된다. α^*=α의 경우, 면역원성 (M_mut<β)에 대한 H_BC1 모델은 4 가지 모든 그룹의 복합체임을 주목할 것: H_BC1=U[H_A,H_B,H_C,H_n].
도 5. 면역원성과 T 점수간의 가설적 관계. 클래스 I 면역원성 모델에 따라, T 세포가 발달되는 동안 야생형 에피토프에 강하게 결합된 TCR들이 결실되었다. 잔존하는 TCRs은 야생형 에피토프에 대해 단지 약한 결합 친화도를 나타내거나 결합 친화도를 나타내지 않을 것이다 (A). 높은 T 점수를 갖는 아미노산 치환을 함유하는 에피토프들은 야생형 아미노산과 유사한 이화학적 특성을 가지므로 잔존 TCR에 대한 결합 친화도에 거의 영향을 미치지 않을 것이다 (B). T 점수를 갖는 아미노산 치환을 함유하는 에피토프들은 잔존 TCR에 대한 결합 친화도를 증가시킬 가능성이 더 크므로 면역원성일 가능성이 더 크다 (C). 이 개략도에서는 T 세포를 맷칭 펩타이드와 쌍을 이루게 하기 위해 컬러 코딩이 사용되었다. 오렌지색/황색 돌연변이는 높은 T 점수를 갖는 돌연변이를 (WT와 유사함), 청색/자주색 돌연변이는 낮은 T 점수를 갖는 돌연변이를 (WT와 비교시 유의적인 이화학적 차이를 보임) 나타낸다.
도 6. M _mut 의 함수로서 면역원성 돌연변이의 누적 분포. A. 베이스라인 대조군 가설

을 만족하는 면역원성 돌연변이 퍼센트를 부분 가설

을 만족하는 면역원성 돌연변이 퍼센트, 부분 가설

및 완전 가설

과 비교한 도면, 여기서

B. 베이스라인 대조군 가설

을 만족하는 면역원성 돌연변이 퍼센트를 역전된 부분 가설

및

을 만족하는 면역원성 돌연변이 퍼센트와 비교한 도면. A 및 B 에 나타난 분석은 132가지 돌연변이를 포함하는 수집된 B16F10 및 CT26.WT 데이터세트에 기초한 것으로, 이 중 30 가지가 면역원성이었다. 그래프에서 각 데이터 포인트는 ≥4 돌연변이에 기초한 것이다.
도 7. M _mut 점수의 함수로서 면역원성 돌연변이의 누적 분포. B16 (A) 및 CT26 (C)에서, 베이스라인 대조군 가설

을 만족하는 면역원성 돌연변이의 퍼센트를, 부분 가설

, 부분 가설

및 완전 가설

을 만족하는 면역원성 돌연변이들의 퍼센트와 비교한 도면.

이다. B16 (B)and CT26 (D)에 있어서, 베이스라인 대조군 가설

을 만족하는 면역원성 돌연변이의 퍼센트를, 역전된 부분 가설:

및

를 만족하는 면역원성 돌연변이의 퍼센트와 비교함.
도 A 및 B는 B16F10 우선처리된 50 가지 돌연변이의 분석에 기초한 것으로, 이 중 12 가지가 면역원성이었다. 도 C 및 D는 B16F10 우선처리된 80 가지 돌연변이의 분석에 기초한 것으로 이 중 30 가지가 면역원성이었다. 그래프에서 각 데이터 포인트는 ≥4 돌연변이에 기초한다.
도 8. WT 면역원성에 대한 제어. 생략 (omitting) MUT+/WT+ 해법이 이러한 발견에 영향을 미치는지를 검토하기 위해, 본 발명자들은 데이터세트로부터 9종의 MUT+/WT+ 돌연변이 및 WT가 측정되지 않은 2종의 돌연변이를 배제시키고, 총 121 종의 돌연변이만을 남겼는데(B16의 경우 43종 및 CT26의 경우 78종) 이 중 19종은 MUT+/WT- 였다 (B16의 경우 5종 및 CT26의 경우 14종). 이번에도 본 발명자들은 완전한 데이터세트에서와 동일한 트렌드, 즉 M_mut 점수의 함수로서의 높은 비선형 반응, 부분 가설에 비해 H_A 가설의 우수성, 및 베이스라인 대조군 H_BC1과 비교시 역전된 가설의 열등성을 발견하였다. A M_mut 점수의 함수로서 면역원성의 누적 분포. B M_mut 결합(bin) 당 면역원성 돌연변이 퍼센트의 히스토그램. C 베이스라인 대조군 가설 H_BC1 을 만족하는 면역원성 돌연변이 퍼센트와 H_A', H_BC2 및 H_A의 퍼센트의 비교. D 베이스라인 대조군 가설 H _BC1 을 만족하는 면역원성 돌연변이 퍼센트와 역전된 가설들과의 비교. 부가적인 상세 내용은 도 5의 설명을 참조할 것.
도 9. RPKM 의 함수로서 면역원성 돌연변이의 분획. 적색: 총 50 가지 B16 돌연변이 및 82 가지 CT26 돌연변이, 필터링 없음 (합계 132 가지 돌연변이). 청색: H _A 가설을 통과한 돌연변이들.

임. B. 상이한 RPKM 범위에 대한 면역원성 돌연변이의 퍼센트, 필터링 없음. RPKM 결합(bins)은: 1=(0,1],2=(1,5],3=(5,50],4=(50,무한대). C. H _A 가설,

하에 상이한 RPKM 범위에 대한 면역원성 돌연변이의 퍼센트. RPKM 결합은: 1=(0,1], 2=(1, 무한대). 오차는 표준 오차임(S.E.)임.
도 10. 앵커 위치 및 비-앵커 위치가 돌연변이된 클래스 II 면역원성 에피토 프. 앵커 위치 모티프를 SYFPEIHI를 이용하여 분석하였다.
도 11. 면역원성 종양-관련 에피토프에 대해 제안된 모델.
도 12. 돌연변이의 등급(rank) 위치를 가늠하기 위한 방법의 예시. 각 돌연변이에 대해 등급이 매겨진 돌연변이 리스트 내에서의 등급 위치를 환자에 대한 HLA 타입들, HLA 타입에 대한 가능한 윈도우 길이 및 에피토프 내에서의 돌연변이 위치의 조합이 낮은 M _mut 를 갖는 해법(solution)을 결과시킨 경우 또는 H _A 및/또는 H _B UH _C 분류를 결과시킨 경우의 해법들의 수에 의해 추가로 칭량할 수 있다. 돌연변이 당 모든 해법들이 병렬적으로 제시되리 가능상이 있으므로, 이러한 칭량 인자는 돌연변이의 등급 위치를 결정하는데 있어서 중요한 기여 요소가 될 수 있다.
도 13. M _mut 및 δ M= M _mut - M _wt 에 대한 CT26으로부터의 돌연변이 chr14_52837882에 있어서 모든 에피토프 해법에 대한 스캐터 플롯의 예시.

실시예

본 발명에서 사용된 기술과 방법들은 본 명세서에 기재되어 있거나 또는 그 자체로 공지인 방법, 예컨대 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기재된 방법에 따라 수행된다. 키트와 시약의 이용을 비롯한 모든 방법은 달리 명시되지 않는 한 제조자의 지침에 따라 수행된다.

실시예 1: T 세포 에피토프의 면역원성을 예측하기 위함 모델의 수립

앞서 본 발명자들은 B16F10 쥐의 흑색종 세포주에서 동정된 50 가지 체세포 돌연변이의 면역원성을 검토하였다 (J. C. Castle 등, Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). 이들 50 가지 돌연변이들은 일차적으로 MHC 클래스 I 발현을 극대화하기 위해 비유사 발현된 563 가지 체세포 돌연변이 풀로부터 선택되었다 (J. C. Castle 등, Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)) (실시예 2도 참조). 각각의 돌연변이에서 본 발명자들은 가능한 모든 MHC 클래스 I 대립유전자의 스페이스, 가능한 에피토프 길이 및 서열 윈도우 (돌연변이의 위치를 구할 곳)를 조사하여, 최소 에피토프(minimal epitopr), 즉 가장 낮은 MHC 클래스 I 콘센서스 점수를 갖는 에피토프 (Y. Kim 등, Nucleic Acids Research 40, W525 (2012))(본 발명에서 M _mut 로서 정의됨)를 예측하였다 (J. C. Castle 등, Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). RNA 백신접종을 이용하여 이들 돌연변이의 면역원성을 측정한 다음 펩타이드 판독을 수행하여 (실시예 2 참조), 펩타이드 백신접종을 이용하여 이전의 발견들을 확인하자(J. C. Castle 등, Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)), 50 가지 돌연변이 중 오직 12 가지(24%) 만이 면역원성인 것으로 나타났으며(표 1), 테스트된 모든 돌연변이에 대해 MUT+/WT- 서열은 단지 10% 였다.

B16F10 쥐의 테스트 결과, 낮은 M _mut 점수 (≤3.9)를 갖는 비유사 발현된 돌연변이를 나이브하게 선택하면 면역원성을 예측하는데 비교적 낮은 성공률을 나타내는 것으로 입증되었다. 따라서 종양-특이 신생항원을 표적화하는 개개인에 대해 개별화된 백신이 효과적인 치료법이 되기 위해서는, 면역원성을 추진하는 메카니즘에 대해 보다 심도있는 이해가 필요하다. 면역원성에 기여하는 부가적인 변수들을 발굴하기 위한 노력의 일환으로, 본 발명자들은 쥐의 대장 세포주 CT26.WT에서 동정된 비유사 발현된 체세포 돌연변이의 면역원성을 검토하였다. 합계 96 종의 돌연변이를, 그들의 M _mut 점수 (low vs. high), 평균 RPKM (low vs. high), 및 세포상 위치(세포내 vs. 세포외)에 기초하여 선발하여 펩타이드 판독값과 RNA 판독값 두 가지 모두로 RNA 백신접종하여 면역원성을 테스트하였다 (추가 상세를 실시예 2 참조). B16F10 세포주와 함께, 본 발명자의 데이터세트는 쥐의 비장세포에 대한 면역원성이 생체외에서 측정된 바 있는 132 종의 에피토프로 구성되었다.

MHC 콘센서스 점수( MHC consensus score). M _mut 에 대한 면역원성의 의존도를 조사하기 위해, 본 발명자들은 M _mut 에 대한 함수로서 면역원성 돌연변이의 누적 퍼센트, 즉 면역원성인 주어진 역치 (β로 표시됨)보다 낮은 M _mut 점수를 갖는 돌연변이의 퍼센트를 플롯팅하였다. 총 132 종의 돌연변이에 대한 B16과 CT26의 조합 데이터베이스에 대한 분석 결과 M _mut 에 대해 면역원성 성공률의 높은 비선형 의존성이 확인되었다 (도 2A). 도 2A는 면역원성 돌연변이에 극히 낮은 M _mut 점수 (≤∼0.2)가 풍부함을 가리킨다. M _mut ≤0.1의 경우, 면역원성 돌연변이 퍼센트는 ∼60%에서 피크를 나타냈고, M _mut 가 증가함에 따라 급격히 낮아져서, M _mut ≥2에서는 ~ 25% 미만으로 급감하였다. M _mut ≤0.3의 면역원성 돌연변이 퍼센트는 44.4%로서 >0.3인 경우인 17.1%와 비교하여 통계적인 유의차를 나타낸다 (P 값 = 0.004, Fisher's exact test, 단측 검정). 3 가지 M _mut 결합(bins): ≤0.3, (0.3, 1] 및 >1에 대한 면역원성 돌연변이 퍼센트의 히스토그램은, M _mut 가 증가할수록 면역원성 돌연변이 퍼센트는 감소함을 보여준다 (도 2B). 도 2B에서 최저 결합(M _mut ≤0.3)의 성공률 44.4% 및, 중간 결합 성공률 20.7%와 최고 결합 (M _mut >1) 성공률 15.8% 간의 차이는 통계적으로 유의하였는데 (P 값 = 각각 0.05 및 0.004, Fisher's exact test, 단측 검정), 이는 M _mut >∼0.3에서는 성공률이 통계적으로 유의한 방식으로 급락함을 나타낸다. B16 및 CT26 뮤타놈을 별도로 분석한 경우에도 유사한 성공률 트렌드가 관찰된다 (도 3).

이제까지 본 발명자들의 돌연변이 선발 기준은 제시(presentation)에 초점이 맞춰져 왔는데, 돌연변이된 에피토프의 MHC 결합 점수를 제한함으로써 최고 60%의 정확도로 면역원성 에피토프를 예측할 수 있음을 발견하였다. 그러나, 제시는 면역원성을 유도하는 필요조건일 뿐 충분조건은 아니다. TCR 인식에 있어서 부가적인 기준을 동정해낼 수 있다면, 본 발명자들의 예측 정확성이 한층 더 향상될 수 있을 것이다. 본 발명자들은 클래스 I 및 클래스 II 면역원성 모델이라 명명한, 면역원성을 추진하는 2 가지 상호 독립적인 메카니즘에 착안하여 가설을 세웠다.

클래스 I 면역원성 (Class I immunogenicity ). 본 발명자들은, TCR 레퍼토리가 돌연변이된 에피토프를 인식하여 면역 반응을 생성하기 위해서는, 3가지 조건이 만족되어야 한다고 가정하였다(H _A 도 4): (i) 당해 생명체의 발달 과정의 어떤 시점에서 야생형 에피토프가 면역계에 제시되어 TCR/pMHC 결합을 통해 맷칭 TCR의 결실로 이어질 것, (ii) 돌연변이된 에피토프가 제시될 것, 및 (iii) 돌연변이된 아미노산의 이화학적 특성이 야생형 아미노산의 그것과 충분히 "상이"하여 (그 척도에 대하여는 이하에 정의할 것임) TCR 레퍼토리가 이 치환을 "검출" 또는 "기록"할 수 있을 것. 조건 (i) 및 (ii)는 면역계가 변화, 즉 돌연변이에 실제로 노출되었음을 확인하는 것이다. 조건 (iii)는 그 돌연변이가 야생형 아미노산의 이화학적 특징을 유의적으로 변화시켜, 잔존(제거되지 않은) TCR에 대한 돌연변이된 에피토프의 결합 친화도가 가능하게 증가함에 따라, 시그널링 캐스케이드를 촉발시켜 면역 반응을 유도할 것을 필요로 하는 조건이다 (도 5).

TCR 인식 점수 ( TCR recognition score). 클래스 I 면역원성 모델은 2 아미노산들 간의 이화학적 차이를 평가하기 위한 측량 척도를 필요로 한다. 분자 진화 과정에서, 빈번히 호환되는 아미노산들은 이화학적 유사성을 갖는 반면 잘 호환되지 않는 아미노산들은 서로 상이한 이화학적 특성을 갖는다는 것이 잘 알려져 있다. 자연에서 어떤 주어진 치환이 일어날 가능성을 이 치환이 우연히 일어날 가능성과 대수 승산 매트릭스(log-odds matrices) 법으로 측정한다. 자연 선택으로 수행된 대수 승산 매트릭스에서 관찰된 패턴은 "단백질의 3차원 배열에서 어떤 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기와 약한 상호반응을 할 경우 당해 아미노산 잔기의 기능의 유사성(similarity)을 반영한다" (M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz, B. C. Orcutt, A model for evolutionary change. MO Dayhoff, ed. Atlas of protein sequence and structure Vol.5, 345 (1978)). 본 발명자들은 따라서 암 관련 아미노산 치환에 대한 효과적인 스코어링 매트릭스로서, 진화에 기반한 대수-승산 매트릭스를 이용하였으며, 본 명세서에서는 이를 TCR 인식을 반영하기 위한 "T 점수"라 칭한다. 포지티브 T 점수들에 의한 치환(즉, 대수-승산, log-odds)은 자연에서 일어날 가능성이 있으므로, 유사한 이화학적 특성을 갖는 2 아미노산에 대응한다. 클래스 I 모델은 포지티브 T 점수를 갖는 치환이 면역원성일 가능성이 더 낮은 것으로 예측한다. 반대로, 네가티브 T 점수를 갖는 치환은 자연에서는 일어날 가능성이 적은 치환을 반영하며 따라서 유의적으로 상이한 이화학적 특성을 갖는 2 아미노산에 대응한다. 본 발명자들의 모델에 따라, 이러한 치환은 면역원성일 가능성이 훨씬 크다고 할 수 있다. 본 발명자들은 대수-승산 매트릭스를 평가하는 여러가지 상이한 방법들을 비교하였는데, 결과들이 선택된 정확한 방법과 대체로 로버스트(largely robust)함을 발견하였다. 250의 PAM (점 수용 돌연변이: point accepted mutation) 거리를 이용하는, WAG(S. Whelan, N. Goldman, Molecular biology and evolution 18, 691 (2001))로 알려진 최대 가능성(ML: maximum likelihood)에 기반한 평가 접근법이, 예측된 면역원성을 비면역원성 돌연변이로부터 가장 잘 구별하는 것으로 나타났으므로, 본 발명자들은 결과를 이 매트릭스를 이용하여 나타내었다 (추가 상세는 실시예 2 참조).

클래스 II 면역원성. 면역원성에 대한 클래스 II 모델에서 본 발명자들은, 만일 면역계가 야생형 에피토프를 조우한 적이 없고, 따라서 그 돌연변이된 에피토프에 의해 챌린지되면, 그 돌연변이는 면역원성일 가능성이 있다고 가정하였다. 따라서 본 발명자들은 이 모델에서 어떤 돌연변이가 면역원성이 되기 위해서는, 다음 2가지 조건을 만족하여야 한다고 가정하였다: (i) 그 야생형 에피토프가 면역계에 제시된 적이 없을 것 (ii) 그 돌연변이된 펩타이드가 제시될 것. 이들 조건은 예컨대, 그 돌연변이가 앵커 위치에서 일어나고 그에 따라 "비결합(nonbinder)" 에피토프를 "바인더(binder)"로 변화시킬 경우, 동시에 만족될 수 있다. 공식적으로, 클래스 II 면역원성은 2가지 하부 가설, 즉: 높은 T 점수 (도 4의 H_B i) 및 낮은 T 점수 (도 4의 H_C)로 나뉠 수 있다. 그러나, 이것은 야생형 에피토프가 제시되지 않는다는 것을 전제로 하므로, 아미노산 치환의 특성이 TCR 인식에 영향을 미치지 않을 것으로 기대됨에 따라 클래스 II 면역원성을 통합 가설: H _B U H _C 와 동일시하여야 할 것이다.

클래스 I 면역원성의 검토. 클래스 I 면역원성 (도 4의 H_A)의 전제는 다음과 같이 수학적으로 풀이될 수 있다: 야생형 에피토프는

, 돌연변이된 에피토프는

, 아미노산 치환은 non-trivial

로 제시되고, 여기서 M_wt은 ehfudsqus이된 아미노산을 야생형 아미노산으로 대체하는 돌연변이된 에피토프(동일한 HLA 대립유전자 및 윈도우길이)의 MHC 콘센서스 점수로서 정의되며, T는 T 점수를 나타낸다. 3 가지 조건 모두가 필요하므로, 본 발명자들은 H _A 분류자(classifier)의 정확도가 M _mut 단독에 기반한 분류자(도 4의 H _BC1 )나 또는 부분 가설:

에 비해 더 높을 것으로 기대한다. 본 발명자들은 따라서 부분 가설 H _A! :

및 부분 가설

에 있어서, 면역원성 돌연변이 퍼센트(참 포지티브 값을 참 보지티브 값과 거짓 포지티브 값의 합으로 나눈 수)를 H _BC1 에 대한 β의 함수로서 계산하였다. 본 발명자들은

0.5 내지 1의 범위의 τ에 대한 보존적 역치가 최고의 수행능을 나타내었음을 발견하였다 (WAG250 매트릭스의 범위는 -5.1 (F↔G 치환) 내지 +5.4 (F↔Y 치환)임. 본 발명자들은 또한 α

1로 설정시 α가 β에 비해 보존적으로 제한되리 수 있음을 발견하였다. 실제로 도 6A는 B16 및 CT26의 수집된 뮤타놈을 고려할 때, H _BC2 , 및 H _A! 에 기반한 분류자들이 베이스라인 대조군 가설 H _BC1 보다 더 큰 정확도를 나타냄을 보여준다. 뿐만 아니라, 완전 가설 H _A 에 기반한 분류자는 부분 가설 H _BC1 , 및 H _BC2 보다 더 큰 정확도를 나타내므로, 부가적인 효과도 입증하는 것이다. B16 및 CT26 데이터세트를 별도로 분석한 경우에도 동일한 결론이 얻어졌다 (도 7).

조건

는 면역원성에 있어서 필요조건으로 가정되었기 때문에, 조건

또는 조건

중 어느 하나에 기초한 분류자 (즉, 제2 조건을 무시)는 H _BC1 보다 더 낮은 수행능을 나타낼 것으로 예측될 것이다. 실제로 본 발명자들은 B16과 CT26을 함께(도 6B) 또는 따로(도 7) 분석한 경우 이러한 예측 결과를 얻었다. 따라서, 본 발명자들은 B16 및 CT26 데이터세트는 함께 또는 별도로 H _A 가설을 뒷받침하는 것으로 결론지었다. WT RNA 역시도 반응성을 나타낸 생략 돌연변이는 이러한 결론에 영향을 미치지 않았다 (도 8).

H _A 가설의 제어 (Controlling for the H _A hypothesis). 높은 T 점수를 갖는 돌연변이가 여전히 면역원성일 가능성이 있지만, 이러한 돌연변이가 풍부한 가설은 비면역원성 돌연변이도 통계적으로 풍부화시켜야 한다. 따라서, H _A 가설

을 그의 역가설

(도 4에서 Hn)과 비교하면, 면역원성 돌연변이의 통계적으로 유의한 고갈(depletion)을 관찰할 수 있을 것이다. 표 2는 실제로 M _mut _≤β =0.5, M _wt _≤α =1, 및 T≤τ=1인 경우 H _A 가 H _n 보다 더 우수한 수행능을 나타냈음을 보여준다 (성공률 각각 52.5% (n=21) 및 21.4% (n=14; P=0.068, 단측 검정 Fisher!s exact test).

41.2% (n=35)를 달성한 H _A 역시도 베이스라인 대조군 H _BC2 보다 성공률이 더 높다. β를 감소시킬수록 H _A 및 H _n 의 성공률 간의 차이는 더 커지는데, 이는 β에 대한 조건이 엄격해질수록, H _A 그룹으로부터 거짓 양성이 더 많이 제거되기 때문이다. 예를 들어, β = 0.25의 경우 H _A 그룹의 성공률 67% (n=14)는 그룹 H _n 의 성공률 17% (n=6)와 대조적이다 (P=0.066, 단측 검정 Fisher's exact test) - 표 3 참조.

표 3.

기본 대조군 가설 H _BC1 (M _mut _≤ 0.25)을 만족하는 133가지 측정된 B16F10/CT26.WT 돌연변이의 등급 리스트로서, 다음의 3 가지 분리합(disjoint) 가설 클래스로 세분됨: 면역원성 돌연변이에 대한 H _A 가설 (M _wt ≤0.8, T≤0.5), 비면역원성 돌연변이가 풍부한 H _n /역H _A 가설 (M _wt ≤0.8, T>0.5) 및 면역원성 돌연변이에 대한 H _B UH _C 가설 (M _wt >0.8), H _A 및 H _B UH _C 후보들은 차별화 변수들의 상대적인 중요성에 기초하여 등급을 매기도록 제안된다. H _A 의 경우 제안된 순위는: M _mut (내림차순) → T 점수 (내림차순) → M _WT 내림차순. H _B UH _C 의 경우 제안된 순위는: M _mut (내림차순) → M _WT (오름차순). 오차는 표준 오차이다.

실시예 3에 주어진 면역원성 등급화를 더 개선시킬 수 있는 부가적인 비중 인자의 예시.

보다 일반적으로 H _BC1 (M _mut ≤β)를 만족하는 돌연변이들의 리스트를 다음의 3 가지 카테고리로 나눌 수 있다: H _A , H _n , 및 H _B UH _C (표 3), 여기서 H _A 는 면역원성 돌연변이가 풍부하고, H _n 는 비-면역원성 돌연변이가 풍부하다. B16 및 CT26의 경우, H _B UH _C 그룹의 세가지 후보 모두는 우리의 기대와 달리 비-면역원성이었다. 그러나, α*>>α와 같이, 만일 보다 현실적인 역치 α*가 M _wt 에 대해 선택된다면, H _B UH _C 에 대해 테스트될 수 있는 예측은 없을 것이다.

면역원성 분류자의 최대 정확도(Maximal precision of immunogenicity classifiers). 표 1에 따르면 조합된 B16 및 CT26 데이터세트들에서 면역원성 예측의 평균 성공률은 22.7% (=30/132)였다. M _mut 점수에 가장 가혹한 역치를 적용시킴으로써 (β = 0.1), 면역원성 분류자의 정확도는 60% (=6/10; H _BC1 , 표 2)로 증가한다. H _BC1 을

조건 또는

조건

과 조합시키면, 정확도는 66.7% (=6/9)로 증가한다. 두 가지 기준을 모두 조합한 H _A 기반 분류자는 부가적인 반응을 야기하여, 정확도를 75% (=6/8)로 증가시킨다 (표 2).

B16 에피토프 MUT33 . 수집된 B16/CT26 데이터세트에서 모든 진화 모델 (PAM 매트릭스는 제외)dptj 가장 높은 등급을 받은 H _A -클래스 에피토프는 B16's MUT33이었다 (표 3 참조). 추가적인 분석 결과 MUT33은 실제로 MHC 클래스 I 제한된 CD8+ 반응을 나타냈고 최소 예측된 에피토프에 대해 세포외 면역원성을 나타낸 것으로 밝혀졌다 (데이터 나타내지 않음).

유전자 발현의 역할. B16 및 CT26에 대한 RPKM 값의 함수로서 면역원성 돌연변이의 분획을 플로팅하자 (면역원성 돌연변이의 총 no.에 대한 주어진 역치 미만의 RPKM을 갖는 면역원성 돌연변이의 no.) 이 비율이 매우 낮은 RPKM 값에서는 다소 정체적인 것으로 나타났다(도 9A). 이 효과는 H _A 기준이 적용되건 적용되지 않건 관찰된다. 상이한 RPKM 결합에 대한 면역원성 돌연변이 퍼센트를 플로팅하자 (도 9B 및 C) RPKM 값이 ≤ ∼1이면 다소 낮은 성공률을 나타내는 것으로 시사되었는데 (H _A 필터링 가설 적용시와 미적용시 모두의 경우에서), 그러하더라도 이러한 결과가 오차 범위 내에 있음을 상기하여야 한다.

공개된 CD8 + 에피토프의 조사. 다음으로 본 발명자들은, CD8+ 제한된 반응을 이끌어내는 단일 아미노산 치환된, 공개된 T 세포-정의된 종양 항원이 면역원성에 대한 본 발명의 모델을 만족하는지를 규명하고자 하였다. 공개된 17 종의 에피토프 중(P. Van der Bruggen, V. Stroobant, N. Vigneron, B. Van den Eynde. (Cancer Immun, http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 2013)) (표 4), 5가지는 H _A (α=0.7, β=0.2, α=0.5) 기준을 만족하였고, 4가지는 H _C UH _B (α=2.2, β=0.4) 기준을 만족하였으며, 2가지는 H _n 기준 (α=0.6, β=0.3, α=1.7)을 만족하였다.

표 4. CD8 + 반응을 생성하는 단일 아미노산 치환된 공개된 에피토프 . 목록의 레퍼런스 내용은 실시예 2를 참조할 것. H _B UH _C 그룹 내의 앵커 위치 돌연변이는 적색으로 강조되어 있다.

따라서, H _A 가설과 H _C UH _B 가설은 함께 공개된 에피토프의 대략 50%를 커버한다. 흥미롭게도, H _C UH _B 조건을 만족하는 공개된 4개의 에피토프 중 3개 (표 4에서 적색 박스)는 앵커 위치 돌연변이로 인해 10 보다 큰 M _wt 점수를 나타냈다(도 10). H _C UH _B 가설의 요구사항은 당해 생명체의 발달과정에서 야생형 에피토프를 제시하는 여하한 세포의 확률이 무시할 정도로 작게 유지되어야 하는 것이므로 M _wt 에 대한 역치는 높게, 즉

유지되어야 할 것으로 예상된다. 실제로 α를 0.8에서 >3으로 증가시키면 표 3에서 B16/CT26에 대한 거짓 양성은 사라진다. 따라서, H _C UH _B 가설 하에서 보다 현실적인 M _wt 의 역치는 3 내지 10 중 어느 값일 수 있다.

MZ7 - MEL 세포주. 인간 종양 모델 세팅에서 면역원성 에피토프를 예측하기 위한 본 발명의 면역원성 모델의 능력을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 악성 흑색종에 걸린 환자의 비장 전이암으로부터 1988년도에 수립된 MZ7-MEL 세포주(V. Lennerz 등, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 16013 (2005))를 이용하여 검사하였다. 자가(autologous) 종양-반응성 T 세포가 있는 MZ7-MEL 세포들로부터의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하자 CD8+ 응답을 발생시킬 수 있는 신생항원이 적어도 5개 동정되었다(V. Lennerz 등, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 16013 (2005)). 이것은 오늘날까지 한 명의 환자로부터 유래된 CD8+ 신생항원 세트 중 가장 큰 세트이다. 이들 에피토프에 본 발명의 면역원성 모델을 적용시키자, 3개의 신생항원은 H _A 에피토프로, 한 개의 신생항원, 한 개의 앵커 위치 돌연변이는 H _B UH _C 에피토프 (표 4의 화살표, 및 도 10)로 분류되었다. 따라서, 5개의 에피토프 중 4개는 본 발명의 면역원성 모델로 설명할 수 있다.

MZ7-MEL 세포주에서 이들 에피토프를 드 노보 예측하는 본 발명의 능력을 테스트하기 위해, MZ7-MEL 세포주의 엑솜을 시퀀싱하였다 (방법란 참조). 발현된 총 743개의 비유사 돌연변이가 동정되었다. Lennerz 등 (V. Lennerz 등, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 16013 (2005))에 의해 앞서 동정된 5가지 모든 돌연변이들이 발견되었다. 이어서 각 돌연변이에 대해 T 점수, M _mut 및 M _wt 를 계산하고, 주어진 돌연변이에서 최소의 MHC 콘센서스 점수를 야기한 HLA 대립유전자 및 에피토프도 보고하였다. 역치

(플러스 조건 RPKM >0.2)를 이용하여 돌연변이들을 다음의 3 그룹 중 하나로 분류하고: H _A , H _B UH _C , 및 H _n , 표 3에 설명된 바와 같이 면역원성이 될 이들의 가능성에 기초하여 등급을 매겼다. 743 개의 돌연변이들 중, 32 가지 돌연변이가 H _A 기준을 만족하고 (표 5), 12 가지는 H _B UH _C 기준을 만족하며 (표 6) 및 15 가지는 H _n 기준을 만족한 것으로 나타났다.

표 5. H _A -분류된 MZ7 - MEL 세포 돌연변이.

역치

를 이용하자 MZ7-MEL에서 발현된 743 가지 비유사 돌연변이들 중 32 가지가 H _A -면역원성인 것으로 분류되었다. 등급은 M _mut (내림차순) → T 점수 (내림차순) 소팅 계획에 따라 매겼다. Lennerz 등에 의해 동정된 면역원성 신생항원은 황색으로 강조되어 있다. 이에 더해 RPKM은 0.2 보다 클 것이 요구되었다.

표 6. H _B U H _C -분류된 MZ7 - MEL 세포 돌연변이.

및 RPKM > 2를 이용시 MZ7-MEL에서 743개의 발현된 비유사 돌연변이들 중 12 가지가 H _B UH _C -면역원성인 것으로 분류되었다. 등급은 M _mut (내림차순) → M _wt (오름차순) 소팅 계획에 따라 매겼다. Lennerz 등에 의해 동정된 면역원성 신생항원은 황색으로 강조되어 있다.

H _A 로 분류된 32 가지 돌연변이들 중 Lennerz 등 (SIRT2, SNRPD1 및 RBAF600)에 의해 동종된 3 가지 H _A -클래스 돌연변이들은 M _mut _→ T 점수 등급표에 따라, 18 가지 등급 클래스 중 2위, 4위 및 13위로 랭크되었다 (표 3 참조). H _B UH _C 로 분류된 12 가지 돌연변이들 중 4번째 Lennerz 등의 돌연변이 (SNRP116)가 3위에 랭크되었다. 이에 더해, 만일 M _wt 에 대해 더 높은 (보다 현실적인) 역치가 사용되면 (예컨대 α* ~ 5), 4번째 Lennerz 등의 돌연변이는 1위로 랭크된다 (하나의 부가적인 앵커 위치 돌연변이와 함께 - 표 7). 마지막으로, 이들 4개의 Lennerz 등의 돌연변이들은 저자들에 의해 보고된 바와 같이, 정확한 HLA 대립유전자, 에피토프 길이 및 돌연변이 위치를 갖는 것으로 예측되었다.

표 7. H _B U H _C -분류된 MZ7 - MEL 세포 돌연변이. 역치:

및 RPKM > 2를 이용하자 MZ7-MEL에서 743 가지 비유사 돌연변이 중 2가지가 H _B UH _C -면역원성인 것으로 분류되었다. 랭크는 M _mut (내림차순) → M _wt (오름차순) 소팅 계획에 기반하였다. Lennerz 등에 의해 동정된 면역원성 신생항원들은 황색으로 강조되어 있다.

결론

B16 및 CT26 데이터세트들의 분석 결과는 다음 3가지 조건이 만족되면 면역원성이 추정되는 모델을 뒷받침해준다: 야생형 펩타이드가 제시되고, 돌연변이된 펩타이드가 제시되며, 아미노산 치환이 충분히 낮은 대수-승산 점수를 가질 것 (도 11A). 본 발명에서 클래스 I 면역원성이라 칭해진 이 면역원성 모델은 인간 흑색종 세포주 모델, MZ7-MEL에 의해 더 뒷받침된다. MZ7-MEL 모델 및 공개된 CD8+ 제한된 신생항원은, 야생형 에피토프는 제시되지 않으나, 어떤 치환(예컨대 앵커 위치에서의 치환)이 MHC 콘센서스 점수를 유의하게 증가시켜 (>5 에서 10), 신규하고 이전에는 관찰된 바 없는 에피토프를 야기하는, 우리가 클래스 II 면역원성이라 칭한 제2의 모델을 뒷받침해준다 (도 11B). 면역원성을 규정하는 이 프레임워크는 3-변수 분류 계획(M _mut , M _wt , T 점수)로 일괄 통합된다. 이 분류 계획을 이용하여 본 발명자들은 MZ7-MEL의 743가지 돌연변이를 34가지 돌연변이 리스트로 압축할 수 있었는데, 여기서 5 가지 Lennerz 등의 에피토프 중 3가지가 톱 5 클래스에 들었다.

표 7은 클래스 II 면역원성 돌연변이가 드물다는 것을 입증한다. 743 돌연변이 중 오직 2개만이 클래스 II 면역원성으로 분류되었는데 (M _wt 에 대해 현실적인 역치를 이용), 이는 30개가 클래스 I 면역원성 돌연변이로 분류된 것과 대조적이다. H _B UH _C -클래스 돌연변이의 수량 부족은 마우스의 흑색종 모델에서도 관찰되었다 (표 8). 이러한 관찰 결과는 백신 접종에 사용될 수 있는 환자 샘플에서 발견되는 대다수 유형의 돌연변이가 될 것으로 예상되는, 개별 맞춤식 백신에 대한 돌연변이들의 클래스 I 면역원성의 중요성을 강조해주는 것이다. 이와 동시에, Lennerz 등에 의해 발견된 5가지 에피토프들 중 하나가 클래스 II 면역원성이었다는 사실은 클래스 II 면역원성 돌연변이가 보다 강력하거나 또는 어쨌든간에 면역계에 의해 선택되었음을 가리키는 것이다.

실시예 2: 재료 및 방법

실시예 1에서 사용된 재료와 방법을 이하에 설명한다:

동물

University of Mainz에서 연방정부정책에 따라 C57BL/6J 및 Balb/cJ 마우스(CRL)들을 사육하였다.

흑색종 및 쥐의 직장 종양 모델의 세포

B16F10 흑색종 세포주 (Product: ATCC CRL-6475, Lot Number: 58078645) 및 CT26.WT 결장암종 세포주 (Product: ATCC CRL-2638, Lot Number: 58494154)를 2010년도에 American Type Culture Collection로부터 구입하였다. 세포의 초기 계대물 (3세대, 4세대)을 이용하여 시퀀싱하였다. 세포들을 미코플라즈마에 대해 일상적으로 테스트하였다. 구입 이래 세포의 재인증은 수행하지 않았다. MZ7-MEL 세포주 (1988년 1월에 수립됨) 및 자가(autologous) 엡스타인-바 바이러스-형질전환된 B 세포주를 Dr. Thomas Woelfel (Department of Medicine, Hematology Oncology, Johannes Gutenberg University)로부터 구득하였다.

합성 펩타이드

펩타이드들을 Jerini Peptide Technologies (Berlin, Germany)로부터 구입하거나 TRON 펩타이드 합성 설비를 이용하여 합성하였다. 합성 펩타이드들은 27 아미노산 길이였고 14 위치가 돌연변이된 아미노산 (MUT) 또는(WT) 아미노산이었다.

마우스의 면역화(Immunization of mice)

연령대를 맞춘 암컷 C57BL/6 또는 Balb/c 마우스들에게 PBS 중 20 μl Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen)와 함께 조성된, 시험관내 전사된 mRNA 20 ㎍을, 총 주사 부피 200 μl로 하여 정맥 주사하였다 (그룹 당 마우스 3 마리임). 마우스들을 제0, 3, 7, 14 및 18일에 면역화시켰다. 최초 주사한지 23일 후 마우스들을 희생시키고 면역학적 테스트를 위해 비장세포를 분리하였다(ELISPOT 분석란 참조). 1개 (모노에피토프) 또는 2개의 돌연변이 (바이에피토프)를 나타내는 DNA-서열들을 14번 위치가 돌연변이된 27 아미노산 (aa) 길이의 서열을 이용하여 구축하고 pST1-2BgUTR-A120 백본 내로 클로닝하였다 (S. Holtkamp 등, Blood 108, 4009 (2006)). 이 주형으로부터의 시험관내 전사 및 정제는 앞서 설명된 바 있다(S. Kreiter 등, Cancer Immunology, Immunotherapy 56, 1577 (2007)).

효소-결합 면역스팟 분석법(Enzyme-linked immunospot assay)

효소-결합 면역스팟(ELISPOT) 분석법 (S. Kreiter 등, Cancer Research 70, 9031 (2010)) 및 자극인자로서의 동계 골수 유래 수지상 세포(BMDCs)의 생성은 앞서 설명한 바 있다 (L. MB 등, J. Immunol. Methods 223, 77 (1999)). B16F10 모델의 경우 펩타이드 펄스시키고 (6 ㎍/ml), BMDC를 표시된 돌연변이, 대응하는 야생형 또는 대조군 펩타이드 (VSV-NP). CT26 모델의 경우, 펩타이드에 의한 재자극에 더해 BMDCs를 대응하는 시험관내 전사된 mRNA로 트랜스펙션시키고 재자극에도 이용하였다. 분석을 위해, 5 x 10⁴ BMDCs를 항-IFN-γ 항체 (10 ㎍/mL, 클론 AN18; Mabtech)로 코팅한 마이크로타이터 플레이트에서 5 x 10⁵개의 갓 분리한 비장세포와 함께 인큐베이션시켰다. 37℃에서 18시간 후, 항-IFN-γ 항체 (클론 R4-6A2; Mabtech)로 사이토카인 분비를 검출하였다. 스팟 갯수를 세고 ImmunoSpot

S5 Versa ELISPOT Analyzer, ImmunoCaptureTM Image Acquisition 소프트웨어 및 ImmunoSpot

Analysis 소프트웨어 Version 5를 이용하여 분석하였다. student's t-검정법 및 Mann-Whitney 검정법 (비모수 검정법)을 이용하여 통계학적 분석을 실시하였다. p-값 < 0.05이면 그 반응이 유의적인 것으로 간주하였다.

세포내 사이토카인 분석

ELISPOT 분석을 위해 준비한 비장세포 분주액들에 대해, 세포내 유세포측정법을 이용하여 사이토카인 생산에 관해 분석하였다. 이를 위해 샘플 당 2 x 10⁶ 개의 비장세포들을 96-웰 플레이트 내 Golgi 억제제 Brefeldin A (10㎍/mL)가 보강된 배양 배지 (RPMI + 10% FCS)에 도말하였다. 각 동물로부터 얻은 세포들을 2 x 10⁵ 펩타이드 펄스하거나 또는 RNA-트랜스펙션된 BMDC를 이용하여 37℃에서 5 시간 재자극하였다. 인큐베이션 후 세포들을 PBS로 세척한 다음, 50μl PBS에 재현탁하고 및 다음의 항-마우스 항체들로 4℃에서 20분간 세포외 염색하였다: 항-CD4 FITC, 항-CD8 APC-Cy7 (BD Pharmingen). 인큐베이션 후 세포들을 PBS로 세척한 다음 4℃ 100μL Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience) 용액에 20분간 재현탁하여 외막을 투과가능하게 하였다. 막투과 가능케한 후 세포들을 Perm/Wash-Buffer (BD Bioscience)로 세척하고, Perm/Wash-Buffer 중 50μL/샘플로 재현탁하고 다음의 항-마우스 항체들로 4℃에서 30분간 세포내 염색하였다: 항-IFN-γ PE, 항-TNF-α PE-Cy7, 항-IL2 APC (BD Pharmingen). Perm/Wash-Buffer를 이용하여 세척한 후 세포들을 유세포분석을 위해 1% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS에 재현탁하였다. 샘플들을 BD FACSCanto™ II 세포측정기 및 FlowJo (Version 7.6.3)를 이용하여 분석하였다.

차세대 서열분석(Next generation sequencing)

핵산 추출: 벌크 세포로부터의 DNA 및 RNA 그리고 마우스 조직으로부터의 DNA를 Qiagen DNeasy Blood 및 Tissue 키트 (DNA의 경우) 및 Qiagen RNeasy Micro kit (RNA의 경우)를 이용하여 추출하였다.

DNA 엑솜 시퀀싱: B16F10, C57BL/6J 및 CT26.WT에 대한 엑솜 포획 및 Balb/cJ에 대한 DNA 재-시퀀싱(re-sequencing)을 앞서 설명한 바와 같이 3회 실시하였다(J. C. Castle 등, Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). MZ7-MEL/EBV-B DNA re-sequencing에 대한 엑솜 포획을 모든 단백질 코딩 영역을 포획하도록 고안된 Agilent XT Human all Exon 50 Mb 솔루션-기반 포획 분석법을 이용하여 2회 실시하였다. 3 ㎍의 정제된 게놈 DNA (gDNA)를 Covaris S2 초음파 기기를 이용하여 150-200 bp로 단편화시켰다. 단편들을 말단 복구시키고, 제조자 지침에 따라 5' 인산화 및 3' 아데닐화 처리하였다. 애질런트 인덱싱 특이적으로 쌍을 이룬 말단 어댑터들을 어댑터 대 gDNA의 몰 비율을 10:1로 하여 gDNAdp 접합시켰다. Agilent's InPE 1.0 및 SureSelect 인덱싱 포획전(pre-capture) PCR 프라이머 및 HerculaseII 폴리머라제를 이용하여 4 사이클 포획전 증폭을 실시하였다. 65℃에서 24시간에 걸쳐, 500 ng의 어댑터 접합되고, PCR 부화된 gDNA 단편들을 Agilent's 엑솜 포획 베이트에 혼성화시켰다. 혼성화된 gDNA/RNA 베이트 복합체를 스트렙트아비딘 코팅된 자석 비드를 이용하여 제거하고, 세척한 다음 SureSelect 용리 완충액에서 용리시키는 동안 RNA 베이트를 절단하였다. 용리된 gDNA 단편들을 PCR amplified post-capture for 10 cycles using SureSelect Indexing Post-Capture PCR 및 index PCR 프라이머 및 HerculaseII 폴리머라제를 이용하여 10 사이클 동안 포획후 PCR 증폭시켰다. 1.8배 부피의 Agencourt AMPure XP 자석 비드를 이용하여 모든 클린업을 수행하였다. Invitrogen's Qubit HS 분석법을 이용하여 모든 품질 제어를 실시하고 단편 크기는Agilent's 2100 Bioanalyzer HS DNA 분석법으로 측정하였다. 엑솜이 풍부한 gDNA 라이브러리를 7 pM library를 이용하여 Truseq SR cluster kit v2.5를 이용한 cBot 상에서 클러스터화하고 Truseq SBS 키트를 이용하여 Illumina HiSeq2000 상에서 시퀀싱하였다.

RNA 유전자 발현 프로파일링 (RNA- Seq ): 5 ㎍의 총 RNA (변형된 Illumina mRNA-seq 프로토콜, NEB 시약 이용)으로부터 바코드형 mRNA-seq cDNA 라이브러리를 이중으로 제작하였다. Seramag Oligo(dT) 자석 비드 (Thermo Scientific)를 이용하여 mRNA를 분리하고 이가 양이온과 열을 이용하여 단편화시켰다. 결과적인 단편들(160-220 bp)을 랜덤 프라이머 및 SuperScriptII (Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 전환한 다음 DNA 폴리머라제 I 및 RNaseH를 이용하여 제2 스트랜드 합성을 실시하였다. NEB RNA 라이브러리 키트 지침에 따라 cDNA 말단을 복구하고 5' 인산화 및 3' 아데닐화 처리하였다. 3' 단일 T-오버행 Illumina 멀티플렉스 특이적인 어댑터들을 어댑터 대 cDNA 삽입물의 몰 비율을 10:1로 하여, T4 DNA 리가제와 접합시켰다. cDNA 라이브러리를 정제하고 300 bp로 크기를 선택하였다 (E-Gel 2% SizeSelect gel, Invitrogen). 부화(Enrichment), Phusion DNA 폴리머라제 및 Illumina 특이적인 PCR 프라이머를 이용하여 PCR에 의해, Illumina 6염기 인덱스 및 유세포 특이 서역을 첨가하였다. 1.8배 부피의 Agencourt AMPure XP 자석 비드를 이용하여 이 단계까지의 모든 클린업을 수행하였다. Invitrogen's Qubit HS 분석법을 이용하여 모든 품질 제어를 실시하고 단편 크기는Agilent's 2100 Bioanalyzer HS DNA 분석법으로 측정하였다. 바코드형 RNA-Seq 라이브러리를 클러스터화하고 50 bps를 전술한 바와 같이 시퀀싱하였다.

NGS 데이터 분석, 유전자 발현: RNA 샘플로부터의 아웃풋 서열 판독값(reads) Illumina 표준 프로토콜에 따라 예비 프로세싱하되, 낮은 품질 판독값은 필터링하였다. 보우타이(version 0.12.5)를 이용하여, 서열 판독값을 mm9 (A. T. Chinwalla 등, Nature 420, 520 (2002)) 또는 hg18 (F. Collins, E. Lander, J. Rogers, R. Waterston, I. Conso, Nature 431, 931 (2004)) 레퍼런스 게놈 서열과 정렬시켰다(B. Langmead, C. Trapnell, M. Pop, S. L. Salzberg, Genome Biol 10, R25 (2009)). 게놈 정렬을 위해 2개의 미스맷치는 허용되었고 최고의 정렬("-v2 -best")만을 보고하였다. 전사 정렬 디폴트 파라미터들을 사용하였다. 게놈 서열과정렬불가능한 판독값들은 UCSC 공지 게놈의 가능한 모든 엑손-엑손 정션 서열의 데이터베이스와 정렬시켰다(F. Hsu 등, Bioinformatics 22, 1036 (2006)). 판독값 좌표(read coordinates)를 RefSeq 전사체의 그것과 교차시켜 발현 값들을 구하고, 중복적인 엑손과 정션 판독값을 계수하여, RPKM 발현 유닛(Reads which map per Kilobase of exon model per million mapped reads)으로 정규화시켰다 (A. Mortazavi, B. A. Williams, K. McCue, L. Schaeffer, B. Wold, Nature methods 5, 621 (2008)).

NGS 데이터 분석, 체세포 돌연변이 발견: 체세포 돌연변이들을 전술한 바와 같이 동정하였다(J. C. Castle 등, Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). bwa (디폴트 옵션, 버젼 0.5.8c) (H. Li, R. Durbin, Bioinformatics 25, 1754 (2009))를 이용하여 서열 판독값들을 mm9 또는 hg18 레퍼런스 게놈에 대해 정렬시켰다. 게놈의 다중 위치에 대한 맵핑 판독값이 애매한 것은 제거하였다. 2가지 소프트웨어 프로그램, 즉: 샘툴(samtools)(version 0.1.8) (H. Li, Bioinformatics 27, 1157 (2011)) 및 SomaticSniper (A. McKenna 등, Genome Research 20, 1297 (2010))의 콘센서스를 이용하여 돌연변이들을 동정하였다. B16F10 및 C57BL/6J의 경우, GATK 역시도 포함시켰다(A. McKenna 등, Genome Research 20, 1297 (2010)). 대응하는 모든 복제물에서 동정된 가능한 체세포 변이들을 "거짓 발견 비율:false discovery rate" (FDR) 신뢰값 (M. Loewer 등, PLoS computational biology 8, e1002714 (2012))으로 배정하였다 (CT26 및 MZ7-MEL의 경우만).

돌연변이 선발 및 검정 (Mutation selection and validation)

면역원성 테스팅을 위한 50가지 B16F10 돌연변이의 선발 기준에 대하여는 앞서 설명한 바 있다(J. C. Castle 등, Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). 돌연변이에 대한 이들 기준에는 다음이 포함된다: (i) 세 가지 모든 B16F10 복제물에서 존재할 것 및 모든 C57BL/6 트리플리케이트에는 부재할 것, (ii) RefSeq 전사체에서 발생할 것, (iii) 비유사 변화를 일으킬 것, (iv) occurrence in B16F10-발현된 유전자 (복제물에 대한 메디안 RPKM >10, 엑손 발현 > 0) 및 (v) 각 돌연변이에 있어서 M _mut 점수 (후술 참조)는 < 5일 것. 나머지 59 가지 돌연변이들 중, MHC 클래스 I 점수, MHC 클래스 II 점수 및 전사 발현의 변위치(quantile) 랭킹 생성물을 형성하고, 첫번째 50 돌연변이 (0.1≤M _mut≤ 3.9)를 PCR에 의한 확인을 위해 선발하였다 (추가 상세는(J. C. Castle 등, Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012))를 참조할 것). 면역원성 테스팅을 위해 선발된 96 CT26.WT 돌연변이들의 기준은 보다 정교하며 다음을 포함하였다: (i) CT26.WT 세가지 모든 복제물에서 존재할 것 및 모든 Balb/cJ 복제물에서는 부재할 것, (ii) FDR ≤ 0.05, (iii) UCSC 공지의 유전자 전사체에서 발생할 것, (iv) 비유사 변화를 일으킬 것, (v) dbSNP 데이터베이스에는 부재할 것 (vi) 게놈의 반복 구간에서가 아닐 것. 나머지 493 돌연변이 중, 8개의 12-원 그룹이 이러한 3 가지 특성에 따라 정의되었다: M _mut 점수 (최저 - [0.1,1.9] 대 최고 - [3.9-20.3]), 단백질 성분 (세포외, 세포내) 및 유전자 발현 (7.1 RPKM의 메디안 값 하회 대 상회), 그리디(greedy) 알고리듬에 따른 돌연변이 선택, 및 그에 따른 역치 조정. 결과적인 96 돌연변이들 중 94개를 PCR로 확인한 후 Sanger 시퀀싱하였다.

분석을 위해 MZ7-ML 돌연변이를 선발하는 기준에는 다음이 포함된다: (i) MZ7-MEL 복제물 2개 중에 존재하고 2개의 자가 EBV-B 복제물에는 부재할 것, 이어서 단계 (ii) 내지 (vi)는 CT26.WT에 대해 설명된 것과 같다. 단계 (i)-(vi)를 적용하면 최초 ∼8000 돌연변이들을 743개로 감축할 수 있다.

MHC 결합 예측 및 M _mut 점수의 계산

MHC 결합 예측은 IEDB 분석 리소스 컨센서스 도구 (http://tools.immune 에피토프 .org/analyze/html/mhc_binding.html) (Y. Kim 등, Nucleic Acids Research 40, W525 (2012))를 이용하여 실시하였으며, 이것은 ANN (C. Lundegaard 등, Nucleic Acids Research 36, W509 (2008); M. Nielsen 등, Protein Science 12, 1007 (2009)), SMM (B. Peters, A. Sette, BMC bioinformatics 6, 132 (2005)) 및 몇몇 대립유전자 모델의 경우 comblib (J. Sidney 등, Immunome Research 4, 2 (2008))로부터의 벤치마킹 연구들(H. H. Lin, S. Ray, S. Tongchusak, E. L. Reinherz, V. Brusic, BMC immunology 9, 8 (2008); B. Peters 등, PLoS computational biology 2, e65 (2006))에 기반하여 최상의 수행능을 나타낸 예측방법들을 조합한 것이다.

from ANN (C. Lundegaard 등, Nucleic Acids Research 36, W509 (2008); M. Nielsen 등, Protein Science 12, 1007 (2009)), SMM (B. Peters, A. Sette, BMC bioinformatics 6, 132 (2005)). 콘센서스 접근법은 SWISSPROT로부터의 5백만가지의 무작위 펩타이드의 펩타이드 점수에 대한 주어진 펩타이드의 결합 예측 점수를 반영하는, 백분위수 랭크를 생성함으로써, 모든 툴의 예측 점수를 조합한다.

각 돌연변이에 대해 본 발명자들은 가능한 모든 (i) 서열 윈도우 (어느 위치에서 돌연변이를 찾을지), (ii) 에피토프 길이 및 (iii) 가능한 쥐의 MHC 클래스 I 대립유전자에 대해 예측된 MHC 콘센서스 점수를 계산하였다. 모든 MHC 콘센서스 점수들의 최소값을 M _mut 점수라 정의하였다.

대수-승산 매트릭스 및 T 점수의 계산

대수-승산 매트릭스는 대규모 단백질 데이터베이스의 서열 정렬 비교로부터 평가할 수 있다. 초기 대수-승산 매트릭스들은 쌍을 이룬 서열 비교법(BLOSUM62 (S. Kreiter 등, Cancer Immunology, Immunotherapy 56, 1577 (2007))) 및 최대절약원리 (maximum parsimony: MP) 평가법(예컨대, PAM250 (M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz, B. C. Orcutt, A model for evolutionary change. MO Dayhoff, ed. Atlas of protein sequence and structure Vol.5, 345 (1978)), JTT250 (S. Q. Le, O. Gascuel, Molecular biology and evolution 25, 1307 (2008)), 및 고네트(Gonnet) 매트릭스 (C. C. Dang, V. Lefort, V. S. Le, Q. S. Le, O. Gascuel, Bioinformatics 27, 2758 (2011)))에 기초하였다. 이보다 최근에, 최대 가능성(ML)에 기반한 방법이 개발되었다 (예컨대, VT160 (P. G. Higgs, T. K. Attwood, Bioinformatics and molecular evolution. (Wiley-Blackwell, 2009)), WAG (S. Whelan, N. Goldman, Molecular biology and evolution 18, 691 (2001)) 및 LG (V. Lennerz 등, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 16013 (2005))). MP 기반 접근법의 경우에서처럼 ML은 밀접하게 연관된 서열을 비교하는 것으로 국한되지 않으므로, 이 평가법은 가장 정확할 것으로 기대된다.

대수-승산 매트릭스의 계산은 다른 문헌에도 상세히 설명되어 있다 (C. C. Dang, V. Lefort, V. S. Le, Q. S. Le, O. Gascuel, Bioinformatics 27, 2758 (2011)). 간단히 설명하면, 아미노산 치환의 표준 모델은 Markovian, 시간-연속식, 시간-가역적 모델로서, 20 x 20 레이트(rate) 매트릭스 Q_ij로 표시되는데, 여기서 q_ij(i≠j)는 단위 시간 당, 아미노산 i에서 j로의 치환 횟수를 나타내고, 사선 요소는

을 만족하도록 선택된다. Q는 i≠j의 경우

이 되도록 분해될 수 있고, 여기서

는 대칭 교환가능 매트릭스이며, π_i는 아미노산의 관찰 확률이다. i (C. C. Dang, V. Lefort, V. S. Le, Q. S. Le, O. Gascuel, Bioinformatics 27, 2758 (2011)). 마지막으로, Q는

이 되도록 정규화되어, 시간 단위

이 위치 당 1.0개 치환으로 기대되는 것에 대응되거나 또는 위치 당 "허용되는 점 돌연변이"에 대응하도록 한다. PAM 거리는 100 (M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz, B. C. Orcutt, A 모델 for evolutionary change. MO Dayhoff, ed. Atlas of 단백질 서열 및 structure Vol.5, 345 (1978); S. Q. Le, O. Gascuel, Molecular biology 및 evolution 25, 1307 (2008); C. C. Dang, V. Lefort, V. S. Le, Q. S. Le, O. Gascuel, Bioinformatics 27, 2758 (2011)). )). 시간 t 경과 후 아미노산 i가 아미노산 j로 대체될 확률

은 20 x 20 확률 매트릭스

로 주어진다. (매트릭스 누승법에 따름). 시간 t 에 대해 계산된 대수-승산 매트릭스는 대수-승산 20 x 20 매트릭스

에 의해 주어진다( M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz, B. C. Orcutt, A model for evolutionary change. MO Dayhoff, ed. Atlas of protein sequence and structure Vol.5, 345 (1978, 1978)). 시간-가역적(time-reversible)이란

을 의미하므로,

는 대칭적이다 (P. G. Higgs, T. K. Attwood, Bioinformatics and molecular evolution. (Wiley-Blackwell, 2009)).

치환

에 대한 T 점수는 본 발명에서

로 정의되며, 진화 모델 및 시간 t에 의존한다. 본 발명자들은 PAM, BLOSUM62, JTT, VT160, Gonnet, WAG, WAG*, 및 LG를 비롯하여, T 점수에 대한 다양한 모델과 PAM 거리를 탐구하였다 (하기 레퍼런스 참조). 본 명세서의 도면들은 WAG 모델 및 PAM 거리 250에 기초하여 작성되었다. 이러한 큰 PAM 거리는 아미노산이 변화할 확률이 실제로 있다는 것과 (P. G. Higgs, T. K. Attwood, Bioinformatics and molecular evolution. (Wiley-Blackwell, 2009)), 아미노산 잔기들이 동일하지 않지만 그의 이화학적 특성이 보존된 서열들 간의 원거리 관계를 탐지하는데 유용함을 의미한다(M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz, B. C. Orcutt, A 모델 for evolutionary change. MO Dayhoff, ed. Atlas of 단백질 서열 및 structure Vol.5, 345 (1978); P. G. Higgs, T. K. Attwood, Bioinformatics 및 molecular evolution. (Wiley-Blackwell, 2009)).

t-분포 테스트 검정 통계법을 이용하여, 다양한 PAM 점수(1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 및 250)를 이용하여 WAG 매트릭스에 대해 본 발명자들은 표 3의 면역원성 에피토프 대 비면역원성 에피토프들의 평균 T 점수를 비교하였다. 테스트 통계학 분석 결과 P값은 PAM 거리에 따라 단순히(monotonically) 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 250이라는 PAM 거리가 예상된 바와 같이 최적 해법(solution)이었음을 가리키는 것이었다 (데이터 나타내지 않음). H _A 및 H _n 로의 분류는 모든 진화 모델에서 정확성이 가장 낮은 PAM 매트릭스를 제외한 모든 매트릭스에서 동일하였다. 모든 진화 모델에서, WAG250 모델은 테스트 통계학으로 측정시 표 3의 H _A 와 H _n 에피토프 사이에서 최대의 이격을 야기하였다: [최대 T 점수(H _A )-최소 T 점수(H _n )]/σ(T 점수(H _A ), (데이터 나타내지 않음). 동일한 테스트 통계학은 보다 짧은 거리에 비해 PAM 거리 250에서 역시 최대였다.

공개된 CD8 + 에피토프

단일 돌연변이된 아미노산을 갖는 CD8+ 에피토프를 Cancer Immunity Journal (P. Van der Bruggen, V. Stroobant, N. Vigneron, B. Van den Eynde. (Cancer Immun, http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 2013) (http://cancerimmunity.org/peptide/mutations/). 에 의해 간행된 돌연변이로부터 야기된 종양 항원 리스트로부터 수집하였다. 간행된 표 또는 본래의 논문(후자가 더 정확하다면)으로부터 HLA 대립유전자를 취하였다. 표 4에 수록된 레퍼런스들은 다음과 같다: (1) Lennerz 등 PNAS 102 (44), pp. 16013-16018 (2005); (2) Karanikas 등 Cancer Res 61 (9), pp. 3718-3724 (2001); (3) Sensi 등 Cancer Res 65 (2), pp. 632-640 (2005); (4) Linard 등 J. Immunol 168 (9), pp. 4802-4808 (2002); (5) Zorn 등 Eur . J. Immunol 29 (2), pp. 592-601 (1999); (6) Graf 등 Blood 109 (7), pp. 2985-2988 (2007); (7) Robbins 등 J. Exp . Med 183 (3), pp. 1185-1192 (1996); (8) Vigneron 등 Cancer Immun 2, pp. 9 (2002); (9) Echchakir 등 Cancer Res 61 (10), pp. 4078-4083 (2001); (10) Hogan 등 Cancer Res 58 (22), pp. 5144-5150 (1998); (11) Ito 등 Int . J. Cancer 120 (12), pp. 2618-2624 (2007); (12) Woelfel 등 Science 269 (5228), pp. 1281-1284 (1995); (13) Gjertsen 등 Int . J. Cancer 72 (5), pp. 784-790 (1997).

실시예 3: 면역원성 돌연변이의 우선순위를 향상시키기 위하여 돌연변이 점수에 비중을 두는 계획의 예시

세포 내로 주입된 RNA는 일단 번역되어 짧은 펩타이드로 절단되면, 그 세포 내에서 상이한 HLA 유형들 상에 제시될 수 있다. 따라서, 이것은 낮은 MHC 콘센서스 (또는 유사한) 점수를 가질 것으로 예측된 HLA 유형이 많을수록, 주어진 돌연변이가 면역원성일 가능성이 더 많으리라는 근거가 되는데, 이는 이것이 두 개 이상의 HLA 유형에서 병렬적으로 디스프레이될 가능성이 있기 때문이다. 따라서, 해당 돌연변이가 H _A 및/또는 H _B UH _C 로 분류된 HLA 유형의에 의해 돌연변이를 고려하거나 또는 심지어 낮은 M _mut 점수를 갖는 HLA 유형의 수에 의해 단순히 각각의 돌연변이를 고려하는 것은 면역원성 랭킹을 개선시킬 수도 있다. 가장 일반적인 해법으로서, 27mer RNA 또는 펩타이드를 세포 내로 주입하는 경우, HLA 유형을 선택할 자유 뿐만 아니라 이 펩타이드 내의 돌연변이의 위치와 펩타이드의 길이를 선택할 자유도 있다. 따라서, 가능한 모든 HLA 유형, 가능한 모든 윈도우 길이 및 주어진 윈도우 내 가능한 모든 돌연변이 위치를 스캔하여 H _A 및/또는 H _B UH _C 로서 분류되는 해법의 갯수 (주어진 돌연변이 당)를 계산할 수 있다 (도 12). 이것은 백신접종에 있어서 가장 효과적인 에피토프를 선발하기 위한 돌연변이 우선순위화에 있어서 가장 중요한 고려 인자가 될 수도 있다. M _mut 및 ΔM= M _mut - M _wt 의 함수로서 이들 모든 해법의 스캐터 플롯의 일례를 도 13에 나타내었다.

SEQUENCE LISTING <110> BioNTech AG et al. <120> PREDICTING IMMUNOGENICITY OF T CELL EPITOPES <130> 674-99 PCT <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <220> <221> REPEAT <222> (1)..(3) <223> Portion of sequence repeated a times, wherein a is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> a + b + c + d + e are different from 0 and preferably are 2 or more, 3 or more, 4 or more or 5 or more <220> <221> REPEAT <222> (4)..(6) <223> Portion of sequence repeated b times, wherein b is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (7)..(9) <223> Portion of sequence repeated c times, wherein c is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (10)..(12) <223> Portion of sequence repeated d times, wherein d is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <220> <221> REPEAT <222> (13)..(15) <223> Portion of sequence repeated e times, wherein e is independently a number selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 <400> 1 Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 2 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 3 Ala Ala Val Ile Leu Arg Asp Ala Leu His Met 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 4 Ala Ala Val Ile Leu Arg Val Ala Leu His Met 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 5 Gly Gly Pro Gly Ser Glu Lys Ser Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 6 Gly Gly Pro Gly Ser Gly Lys Ser Leu 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 7 Leu Ala Leu Pro Asn Asn Tyr Cys Asp Val 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 8 Leu Ala Leu Pro Asn Asn Tyr Cys Asp Phe 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 9 Ser His Leu Asn Asn Asp Val Trp Gln Ile 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 10 Ser His Leu Asn Asn Asp Phe Trp Gln Ile 1 5 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 11 Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile Ala Ile 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 12 Tyr Tyr Met Arg Asp Val Thr Ala Ile 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 13 Thr Tyr Leu Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 14 Ile Tyr Leu Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met 1 5 10 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 15 Gln Ser Leu Gly Phe Thr Tyr Leu 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 16 Gln Arg Leu Gly Phe Thr Tyr Leu 1 5 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 17 Glu Tyr Trp Ala Ser Arg Ala Leu Asp Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 18 Glu Tyr Trp Ala Ser Arg Ala Leu Gly Ser 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 19 Gly Tyr Leu Gln Phe Ala Tyr Glu Gly Cys 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 20 Gly Tyr Leu Gln Phe Ala Tyr Glu Gly Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 21 Val Thr Phe Gln Ala Phe Ile Asp Val Met Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 22 Val Thr Phe Gln Ala Phe Ile Asp Phe Met Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 23 Pro Tyr Leu Thr Ala Leu Asp Asp Leu Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 24 Pro Tyr Leu Thr Ala Leu Gly Asp Leu Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 25 Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 26 Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Glu Ile 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 27 Val Gly Ile Asn Phe Leu Gln Ser Tyr Gln 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 28 Val Gly Ile Asn Ser Leu Gln Ser Tyr Gln 1 5 10 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 29 Thr Arg Pro Ala Arg Asp Gly Thr Phe 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 30 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 31 Glu Pro Gln Ile Ala Met Asp Asp Met 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 32 Glu Pro Gln Ile Asp Met Asp Asp Met 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 33 Ile Ala Met Gln Asn Thr Thr Gln Leu 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 34 Ile Ala Ile Gln Asn Thr Thr Gln Leu 1 5 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 35 Ala Ile Tyr His His Ala Ser Arg Ala Ile 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 36 Ala Ile Tyr Tyr His Ala Ser Arg Ala Ile 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 37 Ser Tyr Ile Ala Leu Val Asp Lys Asn Ile 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 38 Ser Tyr Leu Ala Leu Val Asp Lys Asn Ile 1 5 10 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 39 Val Ile Pro Ile Leu Glu Met Gln Phe 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 40 Val Ile Pro Ile Leu Glu Val Gln Phe 1 5 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 41 Gly Tyr Leu Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Arg 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 42 Gly Tyr Leu Gln Phe Ala Tyr Glu Gly Arg 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 43 Val Tyr Leu Asn Leu Leu Leu Lys Phe Thr 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 44 Val Tyr Leu Asn Leu Phe Leu Lys Phe Thr 1 5 10 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 45 Lys Ile Phe Ser Glu Val Thr Leu Lys 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 46 Lys Ile Phe Ser Glu Val Thr Pro Lys 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 47 Ser His Glu Thr Val Ile Ile Glu Leu 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 48 Ser His Glu Thr Val Thr Ile Glu Leu 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 49 Phe Leu Asp Glu Phe Met Glu Gly Val 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 50 Phe Leu Asp Glu Phe Met Glu Ala Val 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 51 Arg Pro His Val Pro Glu Ser Ala Phe 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 52 Gly Pro His Val Pro Glu Ser Ala Phe 1 5 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 53 Leu Leu Leu Asp Asp Leu Leu Val Ser Ile 1 5 10 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 54 Leu Leu Leu Asp Asp Ser Leu Val Ser Ile 1 5 10 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 55 Ile Leu Asp Thr Ala Gly Arg Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 56 Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 57 Glu Thr Val Ser Glu Gln Ser Asn Val 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 58 Glu Thr Val Ser Glu Glu Ser Asn Val 1 5 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 59 Lys Ile Leu Asp Ala Val Val Ala Gln Lys 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 60 Lys Ile Leu Asp Ala Val Val Ala Gln Glu 1 5 10 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 61 Lys Ile Asn Lys Asn Pro Lys Tyr Lys 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 62 Glu Ile Asn Lys Asn Pro Lys Tyr Lys 1 5 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 63 Tyr Val Asp Phe Arg Glu Tyr Glu Tyr Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 64 Tyr Val Asp Phe Arg Glu Tyr Glu Tyr Asp 1 5 10 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 65 Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Ile His Phe 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 66 Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Ile His Ser 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 67 Lys Glu Leu Glu Gly Ile Leu Leu Leu 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 68 Lys Glu Leu Glu Gly Ile Leu Leu Pro 1 5 <210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 69 Thr Leu Asp Trp Leu Leu Gln Thr Pro Lys 1 5 10 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 70 Thr Leu Gly Trp Leu Leu Gln Thr Pro Lys 1 5 10 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 71 Phe Ile Ala Ser Asn Gly Val Lys Leu Val 1 5 10 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 72 Phe Ile Ala Ser Lys Gly Val Lys Leu Val 1 5 10 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 73 Val Val Pro Cys Glu Pro Pro Glu Val 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 74 Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val 1 5 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 75 Ala Cys Asp Pro His Ser Gly His Phe Val 1 5 10 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 76 Ala Arg Asp Pro His Ser Gly His Phe Val 1 5 10 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 77 Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 78 Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 79 Gly Leu Ala Gly Gly Leu Leu Ala Leu 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 80 Val Leu Phe Trp Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 81 Gly Ile Leu Gly Trp Val Leu Tyr Leu 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 82 Val Leu Phe Trp Gly Leu Leu Phe Tyr 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 83 Gly Leu Ala Gly Gly Leu Leu Ala Tyr 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 84 Val Ile Phe Trp Gly Leu Leu Val Leu 1 5 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 85 Lys Ile Leu Asp Ala Val Val Ala Gln Glu 1 5 10 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 86 Lys Ile Leu Asp Ala Val Val Ala Gln Lys 1 5 10 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 87 Gln His Ser Ala Ala Pro Gly Pro Pro 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 88 Gln His Ser Ala Ala Pro Gly Pro Leu 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 89 Glu Ile Asn Lys Asn Pro Lys Tyr Lys 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 90 Lys Ile Asn Lys Asn Pro Lys Tyr Lys 1 5 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 91 Tyr Val Asp Phe Arg Glu Tyr Glu Tyr Asp 1 5 10 <210> 92 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 92 Tyr Val Asp Phe Arg Glu Tyr Glu Tyr Tyr 1 5 10 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 93 Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Ile His Ser 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope <400> 94 Ser Tyr Leu Asp Ser Gly Ile His Phe 1 5

Claims

면역원성 아미노산 변형을 예측하는 방법으로서:
a) 하나 이상의 MHC 분자들에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수를 확인하는 단계, 및
b) 하나 이상의 MHC 분자에 대한 비변형 펩타이드의 결합 점수를 확인하는 단계,
및/또는
c) 변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체 내에 존재할 경우 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 상기 변형된 펩타이드의 결합 점수를 확인하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 변형된 펩타이드는 변형된 단백질의 단편을 포함하되, 상기 단편은 상기 단백질에 존재하는 변형(들)을 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 비변형 펩타이드는 변형된 펩타이드 내의 변형(들)의 위치에 대응하는 위치(들)에서 생식세포 아미노산을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비변형 펩타이드 및 변형된 펩타이드는 변형(들)을 제외하고는 서로 동일한 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비변형 펩타이드 및 변형된 펩타이드는 길이가 8 내지 15 아미노산, 좋기로는 8 내지 12 아미노산인 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 MHC 분자는 상이한 MHC 분자 유형들, 특히 상이한 MHC 대립유전자들을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 MHC 분자들은 MHC 클래스 I 분자 및/또는 MHC 클래스 II 분자인 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 점수는 서열을 MHC-결합 모티프의 데이터베이스와 비교하는 것을 포함하는 방법에 의해 확인되는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 a)는 상기 점수가 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합의 소정의 역치를 만족하는지를 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 b)는 상기 점수가 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합의 소정의 역치를 만족하는지를 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 a)에 적용된 역치는 단계 b)에 적용된 역치와 상이한 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 MHC 분자에 결합 결합의 상기 소정의 역치는 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 확률을 반영하는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 c)는 비변형 아미노산과 변형된 아미노산 간의 이화학적 유사성에 대한 점수를 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 c)는 상기 점수가 아미노산들 간의 이화학적 유사성에 대한 소정의 역치를 만족하는지를 확인하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이화학적 유사성에 대한 점수는 자연에서 호환되는 아미노산의 확률에 기반하여 확인되는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 자연에서 아미노산들이 더 빈번하게 호환될수록 그 아미노산들은 더 유사한 것으로 간주되는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이화학적 유사성은 진화 기반 대수-승산 매트릭스를 이용하여 구하는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 만일 비변형 펩타이드가 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합을 가리키는 역치를 만족하는 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 점수를 가지고, 변형된 펩타이드는 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합을 가리키는 역치를 만족하는 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 점수를 가지면, 변형 또는 변형된 펩타이드는, 만일 비변형 아미노산과 변형된 아미노산이 이화학적 비유사성을 가리키는 역치를 만족하는 이화학적 유사성 점수를 가질 경우, 면역원성인 것으로 예측되는 것인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 만일 비변형 펩타이드가 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 확률을 갖는 하나 이상의 MHC 분자에 결합하고, 변형된 펩타이드는 하나 이상의 MHC 분자에 결합하거나 또는 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 확률을 가지면, 변형 또는 변형된 펩타이드는, 만일 비변형 아미노산과 변형된 아미노산이 이화학적으로 비유사하거나 또는 이화학적으로 비유사할 확률을 가질 경우, 면역원성인 것으로 에측되는 것인 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 변형은 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합을 위한 앵커 위치에 존재하는 것이 아닌 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 만일 비변형 펩타이드가 하나 이상의 MHC 분자에 대해 결합되지 않음을 가리키는 역치를 만족하는 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 점수를 가지고, 변형된 펩타이드는 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합을 가리키는 역치를 만족하는 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합 점수를 가지면, 변형 또는 변형된 펩타이드는 면역원성인 것으로 예측되는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 및 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 만일 비변형 펩타이드가 하나 이상의 MHC 분자에 결합하지 않거나 또는 하나 이상의 MHC 분자에 대해 결합하지 않을 확률을 가지고, 변형된 펩타이드는 하나 이상의 MHC 분자에 결합하거나 또는 하나 이상의 MHC 분자에 결합할 확률을 가지면, 변형 또는 변형된 펩타이드는 면역원성인 것으로 예측되는 것인 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 변형은 하나 이상의 MHC 분자에 대한 결합을 위한 앵커 위치에 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 a)를 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들에 대해 수행하되, 상기 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들은 상기 변형(들)을 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 동일한 변형(들)을 포함하는 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들은 변형된 단백질의 상이한 단편들을 포함하고, 상기 상이한 단편들은 상기 단백질에 존재하는 동일한 변형(들)을 포함하는 것인 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서, 동일한 변형(들)을 포함하는 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들은 변형된 단백질의 가능한 모든 MHC 결합 단편들을 포함하고, 상기 단편들은 상기 단백질 내에 존재하는 동일한 변형(들)을 포함하는 것인 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 MHC 분자에 결합할 확률 또는 하나 이상의 MHC 분자에 결합할 가장 높은 확률을 갖는 동일한 변형(들)을 포함하는 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들로부터 변형된 펩타이드(들)을 선택하는 것을 포함하는 것을 더 포함하는 방법.
제24항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서 동일한 변형(들)을 포함하는 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들은 변형(들)의 길이 및/또는 위치를 달리하는 것인 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 a) 및 임의로 단계 b) 및 c) 중 일방 또는 양방을 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들에 대해 수행하는 것을 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 두 개 이상의 상이한 변형된 펩타이드들은 동일한 변형(들)을 포함하고 및/또는 상이한 변형들을 포함하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 상이한 변형들은 동일한 단백질 및/또는 상이한 단백질에 존재하는 것인 방법.
제24항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 상이한 변형된 펩타이드들 중 2개 이상의 점수를 비교하는 것을 포함하는 방법.
제32항에 있어서, 하나 이상의 MHC 분자에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수는, 변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체에 존재할 경우, 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수, 좋기로는 비변형 아미노산과 변형된 아미노산 간의 이화학적 유사성 점수보다 더 높은 비중으로 고려되고, 변형된 펩타이드가 MHC-펩타이드 복합체에 존재할 경우, 하나 이상의 T 세포 수용체에 대한 변형된 펩타이드의 결합 점수, 좋기로는 비변형 아미노산과 변형된 아미노산 간의 이화학적 유사성 점수는 하나 이상의 MHC 분자들에 대한 비변형 펩타이드의 결합 점수보다 더 높은 비중으로 고려되는 것인 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 단백질-코딩 영역에서 비유사 돌연변이를 동정하는 것을 더 포함하는 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 변형은 하나 이상의 세포 예컨대 하나 이상의 암세포 및 임의로 하나 이상의 비-암 세포의 게놈 또는 트랜스크립톰을 부분적으로 또는 완전히 서열분석하고 하나 이상의 단백질-코딩 영역 내의 돌연변이를 동정함으로써 동정되는 것인 방법.
제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 돌연변이는 체세포 돌연변이인 것인 방법.
제34항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 돌연변이는 암 돌연변이인 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 백신 제조에 이용되는 방법.
제38항에 있어서, 상기 백신은 상기 방법에 의해 면역원성일 것으로 예측된 변형된 변형(들) 또는 변형된 펩타이드(들)로부터 유래되는 것인 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의해 면역원성일 것으로 예측된 변형(들) 또는 변형된 펩타이드(들)을 동정하는 단계를 포함하는 백신의 제공 방법.
제40항에 있어서, 면역원성일 것으로 예측된 변형(들) 또는 변형된 펩타이드(들)을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 또는 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함하는 방법.
제38항 내지 제41항 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 백신.