KR20160028834A

KR20160028834A - 온도감응성 생분해 하이드로겔

Info

Publication number: KR20160028834A
Application number: KR1020140117892A
Authority: KR
Inventors: 전흥재; 양대혁; 유수정; 김현주
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-09-04
Filing date: 2014-09-04
Publication date: 2016-03-14
Also published as: US20170197012A1; US10226549B2; KR101620511B1; WO2016036061A1

Abstract

본 발명은 세포부착성 펩타이드가 결합된 MPEG-PCL 및 MPEG-PCL을 포함하는 온도감응성 생분해 하이드로겔에 관한 것으로,
본 발명에 따른 온도감응성 생분해 하이드로겔은 고분자의 온도감응성은 그대로 유지하면서 세포 부착성이 우수하고 생체 내에서 일정 기간 후에 생분해 될 수 있다.

Description

온도감응성 생분해 하이드로겔{thermo-sensitive biodegradable hydrogel}

본 발명은 온도감응성 생분해 하이드로겔에 관한 것으로, 보다 구체적으로 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 및 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL)을 포함하는 온도감응성 생분해 하이드로겔에 관한 것이다.

조직공학(tissue engineering)은 과학의 발달과 함께 등장한 새로운 분야의 하나로서, 생명과학, 공학, 의학 등의 기본 개념과 과학기술을 통합 응용하는 다학제간 학문이며, 생체조직의 구조와 기능 사이의 상관관계를 이해하고, 나아가 손상된 조직이나 장기를 정상조직으로 대체하거나 재생시키기 위하여 체내에 이식이 가능한 인공 조직을 만들어 인체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 하는 응용학문이다.

하이드로겔(hydrogel)을 이용한 대표적인 조직공학 기법은 다음과 같은 두 가지로 요약된다. 첫 번째 기법은 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하고, 그 조직 편으로부터 세포를 분리한 후, 분리된 세포를 배양을 통해 필요한 양만큼 증식시킨 다음, 이를 주사 주입형 하이드로겔과 혼합하여 즉시 인체 내로 직접 주사하거나, 일정 기간 동안 하이드로겔 안에서 세포를 체외 배양하여 수득된 하이드로겔 배양물을 인체 내에 주사하는 것이다. 이 기법에 따라 졸 상태로 이식된 하이드로겔은 생체 내에서 체온에 의해 겔 상태로 변하고, 체액의 확산에 의해 산소와 영양분이 공급되면서 하이드로겔 주변에 혈관이 형성되어 혈액이 공급되면 세포들이 증식, 분화하여 새로운 조직 및 장기가 형성되고, 일정 기간 후에 하이드로겔은 체내로 배출되거나 분해되어 없어지게 된다.

두 번째 기법은 하이드로겔과 특정 의약품을 섞어 인체 내로 직접 주사하는 방법으로서, 주사한 부위에서 체온에 의하여 졸 상태의 하이드로겔이 겔 상태로 변하고, 이 하이드로겔이 서서히 분해되면서 약물을 적합한 농도로 오랜 시간 동안 방출하는 것이다.

따라서, 이러한 조직공학 연구를 위해서는 우선 체온 근처에서 겔로 변할 수 있는, 생체조직과 유사한 온도감응성 하이드로겔을 제조하는 일이 중요하다. 인체 조직의 재생에 사용되는 하이드로겔은 실온 근처에서는 졸로 유지되지만 체온 근처에서는 겔로 변할 수 있고, 세포가 하이드로겔 내에서 3차원 구조의 조직을 형성할 수 있도록 세포친화성을 가져야 하며, 이식된 세포와 숙주세포 사이에 위치하는 중간 장벽으로서의 역할을 수행할 수 있어야 한다.

이러한 온도감응성의 특징을 갖는 대표적인 하이드로겔로는 플루로닉(Pluronic)(P. Holmqvist 등, Int.J. Pharm. 194: 103, 2000), 폴리나이팜(PNIPAAm)(M. Harmon 등, Macromolecules 36: 1, 2003), 히알루론산(HA)(M. Ogiso 등, J. Biomed. Mater. Res. 39: 3, 1998), 선형 폴리에틸렌글리콜(PEG)-폴리락트산/글리콜산공중합체(PLGA)-폴리에틸렌글리콜(PEG)(B. Jeong 등, J. Biomed. Mater. Res. 50: 2, 2000), 선형 폴리에틸렌글리콜(PEG)-폴리락트산(PLA)-폴리에틸렌글리콜(PEG), 별형 폴리락트산(PLA)-폴리에틸렌글리콜(PEG), 별형 폴리-ε-카프로락톤(PCL)-폴리에틸렌글리콜(PEG)(S. Zhao 등, J. Func. Polym. 15: 1, 2002) 등을 예로 들 수 있다. 그러나 상기에 열거된 하이드로겔은 비교적 기계적 물성이 낮으며, 특히 조직 재생에 사용되기에 충분한 세포 친화성을 가지고 있지 못하다는 단점이 있다.

본 발명의 목적은 고분자의 온도감응성은 그대로 유지하면서 세포 부착성이 우수하고 생체 내에서 일정 기간 후에 생분해 될 수 있는 온도감응성 생분해 하이드로겔을 제공하는데 있다.

본 발명에서는 하기 화학식 1로 표시되는 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체 및 하기 화학식 2로 표시되는 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체를 포함하는 온도감응성 생분해 하이드로겔을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에서, m은 10 내지 20 이고, n은 15 내지 30 이며, A는 세포부착성 펩타이드이다.

또한, 본 발명에서는 상기 화학식 1로 표시되는 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체 및 상기 화학식 2로 표시되는 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체를 혼합하는 단계를 포함하는 온도감응성 생분해 하이드로겔의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 전술한 온도감응성 생분해 하이드로겔을 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.

본 발명에서는 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 및 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL)을 포함하는 온도감응성 생분해 하이드로겔을 제공한다.

본 발명에 따른 온도감응성 생분해 하이드로겔은 고분자의 온도감응성은 그대로 유지하면서 세포 부착성이 우수하고 생체 내에서 일정 기간 후에 생분해 될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 세포부착성 펩타이드가 결합된 MPEG-PCL(MPEG-PCL-RGD)의 제조 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 제조된 MPEG-PCL-RGD의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 3은 온도에 따른 온도감응성 생분해 하이드로겔 및 MPEG-PCL의 졸-겔 변화 양상을 나타내는 그래프이다.
도 4는 온도감응성 생분해 하이드로겔의 37℃에서의 졸-겔 변화 양상을 보이는 사진이다.도 5 내지 10은 MPEG-PCL의 간엽줄기세포와의 부착성을 나타내는 것으로, 도 5는 처리 직 후, 도 6은 3 일 후, 도 7은 7 일 후, 도 8은 14 일 후의 형광현미경 사진이며, 도 9는 7 일 후, 도 10은 14 일 후의 SEM 사진이다.
이때, (a)는 하이드로겔(hydrogel)의 표면에서의 사진이고 (b)는 간엽줄기세포를 포접한 하이드로겔(hydrogel) 내부에서의 사진이다.
도 11 내지 16은 MPEG-PCL-RGD 및 MPEG-PCL의 혼합물과 간엽줄기세포와의 부착성을 나타내는 것으로, 도 11은 처리 직 후, 도 12는 3 일 후, 도 13은 7 일 후, 도 14는 14 일 후의 형광현미경 사진이며, 도 15은 7 일 후, 도 16은 14 일 후의 SEM 사진이다.
이때, (a)는 하이드로겔(hydrogel)의 표면에서의 사진이고 (b)는 간엽줄기세포를 포접한 하이드로겔(hydrogel) 내부에서의 사진이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체(이하, 화학식 1의 공중합체라 한다.) 및 하기 화학식 2로 표시되는 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체(이하, 화학식 2의 공중합체라 한다.)를 포함하는 온도감응성 생분해 하이드로겔 및 상기 온도감응성 생분해 하이드로겔의 용도를 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에서, m은 10 내지 20, 12 내지 18 또는 15 내지 17일 수 있고, n은 15 내지 30, 20 내지 25 또는 21 내지 24일 수 있으며, A는 세포부착성 펩타이드이다.

본 발명에 따른 온도감응성 생분해 하이드로겔은 상온에서는 흐름 특성을 갖는 졸 상(sol phase)이나, 30 내지 50℃, 보다 구체적으로, 35 내지 45℃에서는 겔 상을 나타낸다. 이러한 특성에 의해 상온에서는 졸 상이므로 생체 내부로의 주입이 용이하며, 생체 내에서는 겔 상을 나타내어 조직공학용 지지체로 용이하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 화학식 2의 공중합체인 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체는 온도감응성 고분자인 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG) 및 생분해성 고분자인 폴리카프로락톤(PCL)의 공중합체이다.

폴리에틸렌글리콜(PEG)은 약물 전달 분야 및 조직공학에서 많은 장점을 가지고 있어 약물 전달체로서 약물을 쉽게 포접, 방출할 수 있으며, 물과 유기 용매에 높은 용해도를 가지고, 비독성이고 면역 작용에 거부 반응이 없어 뛰어난 생체적합성을 나타낸다. 또한, 인체 내 사용에 있어서 미국 식품 의약 안전청에서 사용이 승인된 재료로서 제약 제제 산업에서 사용되고 있다. 상기 PEG는 친수성 고분자들 중에서 단백질 흡착 억제 효과가 우수하고 혈액 접촉 물질의 생체적합성을 향상시키므로 생체 재료로서 많은 응용이 이루어지고 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 구체적으로 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)을 사용할 수 있다.

메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체는 이미 졸-겔 상전이 특성을 보이는 온도감응성 공중합체로서 조직공학과 약물전달 분야에 생체 재료로 응용되고 있다.

본 발명에서 상기 화학식 2의 공중합체는 실험실 등에서 합성하여 이용하거나, 시판되고 있는 공중합체를 이용할 수 있다.

본 발명에서 화학식 1의 공중합체는 전술한 화학식 2의 공중합체에 세포부착성 펩타이드가 결합된 공중합체로서, 구체적으로 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체이다.

본 발명에서는 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체를 사용함으로써, 생체 내에서의 세포 부착성을 향상시킬 수 있다. 종래, 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체에서 폴리카프로락톤은 소수성(hydrophobic)을 가지므로 체내 세포 또는 단백질 고분자 표면으로의 흡착에 어려움이 있었다. 따라서 본 발명에서는 MPEG-PCL 공중합체에 세포부착성 펩타이드를 결합시킴으로써 공중합체는 친수성을 가지며, 세포에의 결합성을 향상시킬 수 있다.

이러한 세포부착성 펩타이드는 Arg-Gly-Asp(RGD), Arg-Glu-Asp-Val(REDV), Leu-Asp-Val(LDV), Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(YIGSR), Pro-Asp-Ser-Gly-Arg(PDSGR), Ile-Lys-Val-Ala-Val(IKVAV) 및 Arg-Asn-Ile-Ala-Glu-Ile-Ile-Lys-Asp-Ala(RNIAEIIKDA)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 화학식 1의 공중합체는 화학식 2의 공중합체 100 중량% 대비 5 중량% 이하, 4 중량% 이하 또는 3 중량% 이하일 수 있다. 상기 함량에서 온도에 따라 졸-겔 상전이 특성을 보이는데, 함량이 5 중량%를 초과할 경우 온도감응성 생분해 하이드로겔은 온도에 따른 졸-겔 상전이 특성을 보이지 않을 우려가 있다. 상기 공중합체의 하한은 0.001 중량% 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 온도감응성 생분해 하이드로겔은 하기 화학식 1로 표시되는 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체 및 하기 화학식 2로 표시되는 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체를 혼합하는 단계를 통해 제조될 수 있다.

상기 화학식 2의 공중합체, 즉 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체는 실험실에서 합성하여 사용하거나, 시중에 시판되는 제품을 사용할 수 있다.

상기 화학식 1의 공중합체는 화학식 2의 공중합체(메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체)에 세포부착성 펩타이드를 결합하여 제조할 수 있다.

구체적으로 화학식 1의 공중합체는 화학식 2의 공중합체를 이미다졸 화합물과 반응시키는 단계;

상기 단계의 반응물에 다이아민 화합물을 반응시키는 단계; 및

상기 단계의 반응물에 축합반응제를 사용하여 세포부착성 펩타이드를 반응시키는 단계를 통해 제조할 수 있다.

상기에서 이미다졸 화합물로는 N,N-카보닐디이미다졸(N,N-carbonyldiimidazole)을 사용할 수 있으며, 다이아민 화합물로는 메틸렌다이아민, 에틸렌다이아민 또는 1,4-아미노부탄을 사용할 수 있다.

또한, 축합반응제로는 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-닐)-4-메틸모폴리늄 클로라이드(DMT-MM) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보이미드(EDC)와 N-히드록시석시이미드(NHS)를 함께 사용할 수 있다.

각 단계에서 사용된 화합물의 함량 및 각 단계의 반응시간은 용이하게 조절될 수 있으며, 전술한 단계를 통해 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체가 제조될 수 있다.

본 발명에서 상기 화학식 1의 공중합체는 화학식 2의 공중합체 100 중량% 대비 5 중량% 이하, 4 중량% 이하 또는 3 중량% 이하일 수 있으며, 하한은 0.001 중량% 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 온도감응성 생분해 하이드로겔은 조직공학 및 약물전달시스템 등에서 다양한 응용이 가능하다. 특히, 조직공학에 응용함에 있어서 세포부착성 펩타이드가 결합된 구성을 지니므로, 체내 또는 체외에서 세포와 조직 배양을 위한 여러 형태의 기질로 사용할 수 있고, 세포의 부착과 성장할 수 있는 장소를 제공할 수 있는 지지체로 사용할 수 있으며, 세포를 함유하는 조직공학용 지지체로 응용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 온도감응성 생분해 하이드로겔은 생체 재료로서 인체에 적용 시 생체 온도에서 겔화되는 특성을 보이며, 생체 온도보다 다소 높거나 낮은 온도에서 겔화를 목적으로 하는 용도에도 적용될 수 있다.

실시예

제조예 1. 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체(MPEG-PCL-RGD) 제조

분자량이 3,000 g/mol인 MPEG-PCL 0.4 g(1.3 X 10^-4 mol)을 anhydrous DMSO(anhydrous, dimethyl sulfoxide) 30 ml에 녹인 후, N,N- carbonydiimidazole 0.025 g(1.56 X 10^-4 mol)을 넣고 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다.

그 후, 에틸렌다이아민 0.009 g(1.56 X 10^-4 mol)을 넣고 5 일 동안 상온에서 반응시키고, 삼차 증류수 20 ml을 넣고 RGD 0.054 g(1.56 X 10^-4 mol) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-닐)-4-메틸모폴리늄 클로라이드(DMT-MM) 0.043 g(1.56 X 10^-4 mol)을 넣고 5일 동안 상온에서 반응시켰다.

그 후, MWCO(2K, Spectrum Laboratories, USA)를 이용하여 3일 동안 투석하여 정제한 뒤, 동결건조하였다.

상기 전술한 방법을 도 1에 도식화하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, MPEG-PCL에 N,N-dimethylimidazole, 에틸렌다이아민 및 DMT-MM와 세포부착성 펩타이드(RGD)를 순차 반응시켜 세포부착성 펩타이드가 결합된 MPEG-PCL(MPEG-PCL-RGD)를 제조할 수 있다.

상기 제조예 1에서 제조된 MPEG-PCL-RGD의 ¹H NMR 스펙트럼을 도 2에 나타내었다. 도 2에서는 MPEG-PCL-RGD의 특정 피크를 확인할 수 있다.

제조예 2. 온도감응성 생분해 하이드로겔 제조

상기 제조예 1에서 제조된 MPEG-PCL-RGD와 MPEG-PCL을 혼합하여 온도감응성 생분해 하이드로겔을 제조하였다.

먼저, MPEG-PCL 500 mg 및 MPEG-PCL-RGD 15 mg(MPEG-PCL 100 wt% 대비 3 wt%)을 PBS(pH 7.4, 2.575 ml)에 20% 농도로 첨가한 후, 80℃에서 5초 담근 후, 5 번의 vortexing을 실시한 후 약간 푸른빛의 현탁용액을 만들었다. 그 후, 4℃ 냉장고에서 2틀 동안 안정화 시켰다.

비교예 1.

MPEG-PCL-RGD를 50 mg(MPEG-PCL 100 wt% 대비 10 wt%) 사용한 것을 제외하고는 제조예 2와 동일한 방법으로 졸을 제조하였다.

실험예 1. 온도감응성 생분해 하이드로겔의 졸-겔 변화 양상 확인

상기 제조예 2에서 제조된 온도감응성 생분해 하이드로겔 및 MPEG-PCL의 온도에 따른 졸-겔 변화 양상을 관찰하였다.

본 발명에서 도 3은 상기 온도에 따른 온도감응성 생분해 하이드로겔 및 MPEG-PCL의 졸-겔 변화 양상을 나타내는 그래프이다.

상기 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 온도감응성 생분해 하이드로겔 및 MPEG-PCL은 30℃ 미만 및 50℃ 초과의 온도에서 졸의 양상을 보이나, 30 내지 50℃에서는 겔의 양상을 보이는 것을 확인할 수 있으며, 본 발명에 따른 온도감응성 생분해 하이드로겔은 특히 35 내지 50℃에서 졸-겔 변화 양상을 보이는 것을 확인할 수 있다.

또한, 도 4는 비교예 1에서 제조된 졸(도 4(a)) 및 제조예 2에서 제조된 온도감응성 생분해 하이드로겔의 37℃에서의 졸-겔 변화 양상을 보이는 사진(도 4(b)이다.

상기 도 4에 나타난 바와 같이, MPEG-PCL-RGD를 MPEG-PCL 대비 3 wt% 사용한 온도감응성 생분해 하이드로겔은 37℃에서 겔 상태로 존재하나, 10 wt% 사용한 비교예 1의 경우 37℃에서 졸의 상태인 것을 확인할 수 있다.

실험예 2. 온도감응성 생분해 하이드로겔의 세포 부착성에 대한 확인

제조예 2에서 제조된 온도감응성 생분해 하이드로겔, 즉, MPEG-PCL-RGD와 MPEG-PCL의 혼합물, 및 MPEG-PCL의 간엽줄기세포(MSCs) 생착을 확인하기 위해 형광현미경과 SEM을 이용하여 관찰하였다.

상기 MPEG-PCL-RGD와 MPEG-PCL의 혼합물에서 MPEG-PCL-RGD의 함량은 MPEG-PCL 100 wt% 대비 3 wt%였다.

상기 세포의 생착은 2가지 방법으로 관찰되었다. 하기에서는 MPEG-PCL-RGD와 MPEG-PCL의 혼합물 또는 MPEG-PCL을 하이드로겔로 표현하였다.

(a) 하이드로겔의 표면(surface-hydrogel)

하이드로겔 200 ㎕를 배양접시(culture dish)에 넣은 후, 1 시간 동안 겔화 시킨 후, 5 X 10⁶ cell/ml의 간엽줄기세포(MSC)를 겔 상태의 하이드로겔 위에 뿌려서 배양시켰다.

(b) 간엽줄기세포가 포접된 하이드로겔의 내부(encapsulation-hydrogel)

5 X 10⁶ cell/ml의 간엽줄기세포(MSC)를 하이드로겔 200 ㎕에 섞은 후 1 시간 동안 겔화(gelation) 시킨 후 시간 조건에 맞추어 배양시켰다.

간엽줄기세포를 상기 하이드로겔에 (a) surface 또는 (b) encapsulation 배양하여 3,7,14 일 동안 관찰하였다. Live한 상태로 형광현미경으로 관찰 후, 배지를 제거하고 PBS로 3회 워싱 한 후, 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 고정, 액체질소로 급속냉동 후 동결건조 한 후, SEM을 이용하여 하이드로겔에 키운 세포의 morphology(형태)를 확인하였다.

본 발명에서 도 5 내지 10은 MPEG-PCL을 사용했을 경우의 간엽줄기세포와의 부착성을 나타낸다.

먼저, MPEG-PCL의 (a) 하이드로겔의 표면(surface-hydrogel)을 살펴보면, surface에 세포를 뿌린 후 바로 형광현미경 사진을 보면, 세포가 부착하지 않은 상태임을 보였고(도 5 (a)), 3 일 후(도 6 (a)), 7 일 후(도 7 (a)) 및 14 일 후(도 8 (a)) 역시 surface에 부착된 세포는 관찰되지 않았다.

SEM 사진을 살펴보면, 7 일 후에는 세포는 부착되었으나 뻗어나가는 모양은 관찰되지 않았으며(도 9 (a)), 14 일 후에는 뻗어 나가지 못한 세포가 응축되어 apoptosis가 일어난 것을 확인할 수 있다(도 10 (a)).

즉, MPEG-PCL을 사용할 경우 (a) 하이드로겔의 표면(surface-hydrogel)에서는 세포의 부착 및 분화가 용이하게 일어나지 못함을 알 수 있다.

또한, MPEG-PCL의 (b) 간엽줄기세포가 포접된 하이드로겔의 내부(encapsulation-hydrogel)을 살펴보면, 도 5 (b)는 세포를 encapsulation한 직후의 형광현미경 사진이고, 3 일 후(도 6 (b)), 7 일 후(도 7 (b)) 및 14 일 후(도 8 (b))의 형광현미경 사진을 보면 세포의 변화가 없는 것을 확인할 수 있다.

SEM 사진을 살펴보면, 7 일 후에는 세포끼리는 부착되었으나 하이드로겔에 뻗어나가는 모양은 관찰되지 않았으며(도 9 (b)), 14 일 후에는 (a) surface와 마찬가지로 세포가 응축되어 apoptosis가 일어난 것을 확인할 수 있다(도 10 (b)).

즉, MPEG-PCL을 사용할 경우 (a) 간엽줄기세포가 포접된 하이드로겔의 내부(encapsulation-hydrogel)에서는 세포의 분화가 용이하게 일어나지 못함을 알 수 있다.

도 11 내지 16는 MPEG-PCL-RGD와 MPEG-PCL의 혼합물을 사용했을 경우의 간엽줄기세포와의 부착성을 나타낸다.

먼저, MPEG-PCL-RGD와 MPEG-PCL의 혼합물의 (a) 하이드로겔의 표면(surface-hydrogel)을 살펴보면, surface에 세포를 뿌린 후 바로 형광현미경 사진을 보면 아직 세포가 부착하지는 않았으나(도 11 (a)), 3 일 후의 형광현미경 사진을 보면 세포가 하이드로겔 표면에 부착되어 가는 것을 확인할 수 있다(도 12 (a)). 7 일 후에는 많은 세포들이 군집되어 있고 더 뻗어나가며(도 13 (a)), 14 일 후에는 세포들이 뻗어나가 주위 세포와 커뮤니케이션을 이루는 것을 확인할 수 있다(도 14 (a)).

SEM 사진을 살펴보면, 7 일 후에는 표면에 있는 세포들은 하이드로겔에 잘 부착되어 있고, 일부 세포들은 하이드로겔 안으로 이동(migration)한 것을 확인 할 수 있다(도 15 (a)).

즉, MPEG-PCL-RGD와 MPEG-PCL의 혼합물을 사용할 경우 (a) 하이드로겔의 표면(surface-hydrogel)에서는 세포의 부착 및 분화가 용이하게 수행되는 것을 확인할 수 있다.

또한, MPEG-PCL-RGD와 MPEG-PCL의 혼합물의 (b) 간엽줄기세포가 포접된 하이드로겔의 내부(encapsulation-hydrogel)을 살펴보면, 도 11 (b)는 세포를 encapsulation한 직후의 형광현미경 사진이고, 3 일 후의 형광현미경 사진을 보면 하이드로겔 안의 세포가 조금씩 뻗어 나가는 것을 확인할 수 있다(도 12 (b)). 7 일 후에는 많은 세포들이 부착되고 있으며(도 13 (b)), 14 일 후에는 하이드로겔 안의 많은 세포들이 뻗어나가는 것을 확인할 수 있다(도 14 (b)).

SEM 사진을 살펴보면, 7 일 후에는 많은 세포들이 서로 군집되어 자라고 주위 세포간 커뮤니케이션을 형성하고 있으며(도 15 (b)), 14 일 후에는 많은 세포들이 서로 연접되어 자라고 있는 것을 확인할 수 있다(도 16 (b)).

즉, MPEG-PCL-RGD와 MPEG-PCL의 혼합물을 사용할 경우 (b) 간엽줄기세포가 포접된 하이드로겔의 내부(encapsulation-hydrogel)에서는 세포의 결합 및 분화가 용이하게 수행되는 것을 확인할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체 및 하기 화학식 2로 표시되는 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체를 포함하는 온도감응성 생분해 하이드로겔;
[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에서, m은 10 내지 20 이고, n은 15 내지 30 이며, A는 세포부착성 펩타이드이다.
제 1 항에 있어서,
상온에서는 졸 상(sol phase)이나 30 내지 50℃에서는 겔 상(gel phase)인 온도감응성 생분해 하이드로겔.
제 1 항에 있어서,
세포부착성 펩타이드는 Arg-Gly-Asp(RGD), Arg-Glu-Asp-Val(REDV), Leu-Asp-Val(LDV), Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(YIGSR), Pro-Asp-Ser-Gly-Arg(PDSGR), Ile-Lys-Val-Ala-Val(IKVAV) 및 Arg-Asn-Ile-Ala-Glu-Ile-Ile-Lys-Asp-Ala(RNIAEIIKDA)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 온도감응성 생분해 하이드로겔.
제 1 항에 있어서,
화학식 1로 표시되는 공중합체의 함량은 화학식 2로 표시되는 공중합체 100 중량% 대비 0.001 내지 5 중량% 이하인 온도감응성 생분해 하이드로겔.
하기 화학식 1로 표시되는 세포부착성 펩타이드가 결합된 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체 및 하기 화학식 2로 표시되는 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체를 혼합하는 단계를 포함하는 온도감응성 생분해 하이드로겔의 제조 방법;
[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에서, m은 10 내지 20 이고, n은 15 내지 30이며, A는 세포부착성 펩타이드이다.
제 5 항에 있어서,
화학식 1로 표시되는 공중합체는 화학식 2로 표시되는 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤(MPEG-PCL) 공중합체를 이미다졸 화합물과 반응시키는 단계;
상기 단계의 반응물에 다이아민 화합물을 반응시키는 단계; 및
상기 단계의 반응물에 축합반응제를 사용하여 세포부착성 펩타이드를 반응시키는 단계를 통해 제조되는 온도감응성 생분해 하이드로겔의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
축합반응제는 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-닐)-4-메틸모폴리늄 클로라이드(DMT-MM) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보이미드(EDC)와 N-히드록시석시이미드(NHS)를 사용하는 온도감응성 생분해 하이드로겔의 제조 방법.
제 5 항에 있어서,
화학식 1로 표시되는 공중합체의 함량은 화학식 2로 표시되는 공중합체 100 중량% 대비 0.001 내지 5 중량% 이하인 온도감응성 생분해 하이드로겔의 제조 방법.
제 1 항에 따른 온도감응성 생분해 하이드로겔을 포함하는 조직공학용 지지체.